تاريخ الاستلام: 2 يونيو 2023
تم القبول: 30 يناير 2024
نُشر على الإنترنت: 15 فبراير 2024
(أ) التحقق من التحديثات

تم تكريس جهود كبيرة لاكتشاف وهندسة إنزيمات تحلل PET على مدى العقدين الماضيين، مما ساهم في تطوير تحلل PET الحيوي من الكشف عن كميات ضئيلة من المنتجات المنبعثة إلى تحقيق تحويل عالي. عند مواجهة التحديات التي تطرحها إعادة تدوير PET باستخدام الإنزيمات، يجب أخذ المعايير الرئيسية بعين الاعتبار لتحقيق عملية صناعية قابلة للتطبيق اقتصاديًا، وخاصة تحميل المواد الصلبة. ) وعائد المنتج ( . ومع ذلك، فإن معظم الدراسات تحقق عوائد تحلل كبيرة عند تحميل المواد الصلبة أقل من وهو ما يقل بكثير عن المستوى ذي الصلة بالصناعة عند زيادة تحميل المواد الصلبة إلى مستوى عالٍ، يُلاحظ عادةً انخفاض في معدل التحلل المائي والتحويل (يشار إليه باسم “أثر المواد الصلبة”)، كما هو موضح في تفاعلات غير متجانسة أخرى مثل عملية تحويل الكتلة الحيوية. .

تم تحقيق تقدم مع نوع معدل من LCC (LCC ) التي عرضت تحلل البوليمر للمواد البلاستيكية المعالجة مسبقًا من PET
عند تحميل المواد الصلبة بشكل ذي صلة صناعيًا . ومع ذلك، تبقى 10% من PET غير القابلة للتحلل ووصلت إلى مستوى عالٍ من البلورية بسبب الشيخوخة الفيزيائية، مما يعيق إعادة الاستخدام الفوري لتحلل PET. أشار تقرير صادر عن الجمعية الوطنية لموارد حاويات PET إلى أن زجاجات PET التي تم جمعها من المستهلكين لإعادة التدوير بلغت 800 كيلوطن في الولايات المتحدة. ، وسيؤدي ذلك إلى توليد أكثر من 80 كيلوطن من نفايات PET غير القابلة للتحلل سنويًا إذا تم استخدام استراتيجية التحلل الحيوي الحالية، مما يشكل تهديدًا كبيرًا لاقتصاد إعادة تدوير PET. زيادة مدى التحويل من إلى سيقوم بتخفيض الحد الأدنى لسعر البيع (MSP) لـ TPA بمقدار (الولايات المتحدة وفقًا لنموذج TEA المقترح من قبل مختبر الطاقة المتجددة الوطني في الولايات المتحدة؛ وبالتالي، فإن مستوى التحويل هو العامل الأكبر الذي يؤثر على MSP في عملية التحلل البوليمري بعد تحميل المواد الصلبة. لقد أثارت كل من القضايا البيئية والاجتماعية الاقتصادية اهتمامًا كبيرًا في تحسين مستوى التدهور لتسريع الانتقال نحو الاقتصاد الدائري.

وفقًا للنتائج الحركية لتبلور PET (الشكل التكميلي 1)، يمكن تقليل الشيخوخة الفيزيائية بشكل كبير عن طريق خفض درجة حرارة التفاعل، ولكن كفاءة التحفيز لإنزيمات هيدرولاز PET الحرارية تتعرض للتضحية في الوقت نفسه. ، مما يزيد من الطلب على المحفزات الحيوية ذات كفاءة التحلل العالي عند درجات حرارة منخفضة لتشوه سلاسل PET غير المتبلورة.

شهدت السنوات القليلة الماضية تقدمًا ملحوظًا في تخصيص الإنزيمات الطبيعية من خلال استراتيجيات إعادة التصميم الحاسوبية. استلهمنا من الإنجازات في الذكاء الاصطناعي لمعالجة مشهد ملاءمة البروتين لاستكشاف المعلومات التطورية المخفية، حيث استخدمنا استراتيجية حسابية تتضمن نموذج لغة البروتين وخوارزميات قائمة على مجالات القوة لتصميم إنزيمات هيدراز PET تتمتع بتوازن بين الثبات الحراري والقدرة التحليلية. وقد تفوق المتغير المعاد تصميمه (TurboPETase) الناتج عن هذه الحملة على أكثر إنزيمات هيدراز PET كفاءة المعترف بها حاليًا في هذا المجال. بهرPETase فاست بيتيز هوتبيتيز ديبوبيتيز CaPETase ، و PES-H1 ) على مدى مجموعة من درجات الحرارة ( ). الأداء الاستثنائي في التحلل الذي توفره TurboPETase سمح بتحلل شبه كامل لزجاجات PET بعد الاستهلاك في 8 ساعات عند تحميل ركيزة عالي ذي صلة صناعيًا من بمعدل إنتاج أقصى يبلغ 61.3 جرام من PET المحلل ، معالجة التحدي المتعلق بالنفايات المتبقية من PET غير القابلة للتحلل.

تنتمي إنزيمات التحلل المائي للبولي إيثيلين تيرفثالات (PET) إلى عائلة إنزيمات التحلل المائي السيرينية، وهي مجموعة منتشرة على نطاق واسع معروفة بخصوصيتها المنخفضة نسبيًا تجاه الركائز. يُعتقد أن وظيفة التحلل لإنزيمات PET كانت موجودة مسبقًا كوظيفة غير محددة، ثم تطورت لتصبح وظيفة أساسية. . نظرًا لمعرفتنا المحدودة بكيفية ترميز تسلسل الوظائف التحفيزية في إنزيمات تحلل البوليمر معالجة التحدي من خلال استغلال إعادة التصميم الحسابية المعتمدة على الفيزياء وطرق التصميم العقلاني هي مهمة صعبة. بدلاً من ذلك، تتضمن الطريقة الناجحة استخدام نماذج التعلم العميق لرسم العملية من تسلسل البروتين إلى الوظيفة، كما تم إثباته في العديد من الحالات. . يمكن أن تلتقط هذه النماذج المعلومات المخفية التي تشير إلى تحسين تحلل البوليمر على طول مسار التطور من الملاءمة النسبية لمتغيرات البروتين. لهذا الغرض، استخدمنا نموذج لغة تم تدريبه على مجموعتين من البيانات تضمان حوالي 26,000 تسلسل متجانس من إنزيمات هيدراز PET عبر التطور، للتنبؤ باحتمالية تغير الأحماض الأمينية من المشهد التطوري (الشكل 1A). لاختيار إنزيم النموذج، قمنا بمقارنة نشاط LCC، LCC بروتين BhrPETase وFastPETase وHotPETase باستخدام أفلام PET غير المتبلورة (Gf-PET، من المورد Goodfellow) عبر مجموعة من درجات الحرارة (الشكل التوضيحي التكميلي 2). يشارك BhrPETase هوية تسلسلية عالية من مع LCC، في حين أن LCC يمثل نوعًا من LCC يتميز بأربعة بدائل من الأحماض الأمينية (F243I / D238C / S283C / Y127G). كل من FastPETase و HotPETase هما مشتقات تم هندستها من IsPETase (الشكل التكميلي 3). في بهرPETase و LCC أظهرت أعلى أداء تحفيزي من بين جميع إنزيمات هيدرولاز PET ودرجات الحرارة المختبرة وتم اختيارها كمدخلات. تم استخدام مشفر Transformer لمعالجة تسلسلات الأحماض الأمينية المدخلة مع تضمين الموقع المطلق. تم فرز مواقع البقايا حسب متوسط لوغاريتمات 19 طفرة تم تعيينها للأحماض الأمينية من النوع البري في كل موقع. تم اختيار أعلى عشرة مواقع للأحماض الأمينية ذات أعلى درجات متوسطة من كل نموذج. بعد إزالة مواقع الأحماض الأمينية المكررة، تم الحصول على 18 موقعًا للأحماض الأمينية حيث كانت بقايا النوع البري تتناسب بشكل أقل من البدائل المحتملة (الجدول التكميلي 1).

وفقًا للهياكل البلورية لبروتين BhrPETase (رمز PDB: 7EOA) و LCC S165A في مركب مع MHET (رمز PDB: 7VVE )، تم اقتراح أن 7 من 18 موضعًا للأحماض الأمينية المتولدة (W104، H164، M166، W190، H191، H218، وF/I243) تكون مدمجة في تجويف ربط PET. نظرًا لدرجة الاستقرار الحراري الأعلى نسبيًا لـ

قمنا بتعريض BhrPETase لسبع مواضع على هذا الإنزيم لتوليد 34 متغيرًا. أفاد تشين وآخرون أن الطفرات المزدوجة Ser214/Ile218 لعدة إنزيمات متجانسة لـ IsPETase أظهرت نشاطًا معززًا في تحلل PET (بزيادة لا تقل عن 1.3 مرة) ولكنها انخفضت بشكل كبير. القيم (بنحو . نظرًا لأن His 218 (المقابل لـ Ser214 في IsPETase) كان متورطًا في مرشحينا المتوقعين، تم استكشاف الأداء التحللي لمتغير H218S/F222I أيضًا (الجدول التكميلي 2). من بين المتغيرات، BhrPETase (المشار إليه باسم BhrPETase M2) أدى إلى أعلى تحسينات مع زيادة بمقدار 1.7 مرة في النشاط الهيدروليتيكي لـ PET عند ، مما يجعل هذه السلالة القالب الجديد لتراكم الطفرات في الجولات الثانية في المواقع الستة المتبقية. خلال مرحلة التراكم الثانية، أظهرت الطفرات فقط في مواقع W104 و F243 (W104L، W104S، W104H، W104G، F243I، F243T، و F243G) على M2 أنشطة تحليل مائي محسّنة (عن طريق إلى )، على الرغم من الانخفاض الكبير في استقرار درجة الحرارة (الجدول التكميلي 3).

تشير البيانات التجريبية إلى أن أعلى من ضروري لطول عمر المحفز . ومن ثم، فإن إنزيم الهيدراز PET مع على الأقل أكثر من يفضل من أجل تحلل PET الفعال. ومن الجدير بالذكر أن المتغير M2 أظهر درجة انصهار تبلغ الذي كان أقل من ذلك من إنزيم النوع البري. أدت الطفرات النشطة في مواضع W104 على M2 إلى تقليل الاستقرار بشكل أكبر، مع قيم تتراوح من إلى إن الانخفاض غير القابل للتجاهل في الاستقرار حد من المزيد من التوليف، وكان من الضروري إدخال طفرات تعويضية أولاً لتقليل الآثار الضارة. لذلك، طبقنا استراتيجيتنا السابقة التي وضعناها والمعروفة باسم GRAPE. التي تستخدم أربعة خوارزميات تكاملية، وهي، Fold (دالة طاقة حقل القوة)، روزيتا_كارتيسيان_ddg (دالة طاقة حقل القوة)، ABACUS (دالة الطاقة الإحصائية) و DDD (دالة طاقة حقل القوة) ، لتصميم طفرات مستقرة لتعويض وتخفيف الطفرات غير المستقرة (الشكل 1B). بعد التحقق التجريبي، أسفرت 3 طفرات مفيدة (A209R، D238K، وA251C-A281C) عن تحسين الاستقرار الحراري دون التأثير على النشاط (الجدول التكميلي 4). أضفنا الطفرات المستقرة إلى متغير M2 باستخدام استراتيجية دمج تدريجية وأسفرت عن متغير BhrPETase M6 (BhrPETase )، الذي أظهر درجة انصهار مستعادة من دون التضحية بالنشاط. بعد ذلك، تم تجميع الطفرات النشطة في مواضع W104 و F243 بشكل تركيبي وتراكمها على المتغير M6 المستقر حرارياً، مما أدى إلى توليد 12 متغيراً جديداً (الشكل 1C والجدول التكميلي 5). بعد النظر في كل من أداء التحلل الحراري والثبات الحراري، كان أفضل متغير تركيبي هو BhrPETase. A209R/D238K/A251C/A281C/W104L/F243T (المشار إليه باسم TurboPETase) تم اختياره مع من وتحسين بمقدار 3.4 مرة في النشاط المحدد لـ PET تجاه أفلام GF-PET مقارنة بـ BhrPETase من النوع البري (الشكل 1D). في السيناريوهات الصناعية، يتم عادةً إجراء التحلل المائي الإنزيمي في الماء بدلاً من نظام مخفف مخصص لتبسيط المعالجة اللاحقة. تماشيًا مع التفضيلات الصناعية، قمنا أيضًا بتقييم 12 متغيرًا تحت تركيز منخفض من المخفف. كشفت النتائج أنه باستثناء احتفظت جميع المتغيرات إلى حد كبير بنشاطها التحللي في محلول فوسفات البوتاسيوم بتركيز 100 مللي مول (الشكل التوضيحي 4 والجدول التوضيحي 6). كان TurboPETase يتفوق باستمرار على المتغيرات الأخرى تحت تركيزات منخفضة وعالية من المحلول، مما يجعله المتغير الأكثر فعالية لمزيد من التحقيق.

تم تقييم أداء التحلل البوليمري لـ TurboPETase بعد ذلك عبر نطاق درجات حرارة فيما يتعلق بالهيدرازات الأخرى للبولي إيثيلين تيريفثاليت (الشكل 2A وB، والشكل التوضيحي 5). عند أظهرت TurboPETase أعلى معدل تحلل إجمالي بين جميع إنزيمات تحلل PET ودرجات الحرارة المختبرة، حيث أطلقت 29.66 مللي مول من المنتجات (مجموع BHET وMHET وTPA) في 3 ساعات. نظراء مثل BhrPETase وLCC وLCC ICCG ، و PES-H1 التي تظهر أداءً عاليًا في التحلل عند درجات حرارة مرتفعة، جعلت النشاط المائي أقل بمقدار 1.8 و 4.7 و 2.1 و 2.0 و 19 مرة مقارنةً بـ TurboPETase، على التوالي. عند درجات الحرارة غير المثلى، TurboPETase

الشكل 1 | تمثيل تخطيطي لإعادة تصميم إنزيمات هيدروكسي PET باستخدام الطريقة الحاسوبية الهجينة. تم التنبؤ بالطفرات المحتملة المفيدة باستخدام نموذج المحول المدرب على مجموعتين من البيانات (اللوحة اليسرى). تم اختيار أفضل عشرة مواقع للأحماض الأمينية المتوقعة (دوائر حمراء). أدى إزالة المواقع المكررة إلى 18 موقعًا من البقايا، من بينها تم اقتراح 7 مواقع لتكون موجودة في موقع ارتباط PET (اللوحة اليمنى). تظهر ذرات هذه المواقع من الأحماض الأمينية ككرات زرقاء، بينما تظهر المواقع الـ 11 المتبقية ككرات مرجانية. يتم تمثيل PET والثلاثي الحفاز كتمثيلات كروية وعصوية. ب تمثيل تخطيطي لاستراتيجية GRAPE. تم استخدام أربعة خوارزميات للتنبؤ بالطفرات المثبتة (اللوحة اليسرى). بعد التصفية الهيكلية، تم التحقق من المرشحين المحتملين المثبتين تجريبيًا (اللوحة اليمنى). تظهر ذرات الطفرات ذات الاستقرار الحراري المحسن ككرات زرقاء، بينما تظهر الطفرات الأخرى التي تم التحقق منها تجريبياً ككرات مرجانية. ج تمثيل تخطيطي لخطوة التراكم. تم إضافة الطفرات في 7 مواقع من البقايا الموجودة في موقع ارتباط PET إلى النوع البري.
إنزيم (BhrPETase)، مما أدى إلى أفضل نتيجة BhrPETase (M2). إضافة الطفرات في المواقع الستة المتبقية إلى M2 أدت إلى متغيرات نشطة ذات استقرار منخفض بشكل ملحوظ، وبالتالي تم استخدام استراتيجية GRAPE. تم دمج الطفرات المثبتة في M2 وأسفرت عن المتغير المستقر حرارياً M6، الذي يمكنه تعويض الطفرات غير المستقرة في خطوات التراكم اللاحقة. تم تجميع الطفرات النشطة في مواقع W104 وF243 بشكل تركيبي على M6، مما أدى إلى الطفرة النهائية TurboPETase. د الاستقرار الحراري والنشاط النسبي لتفكيك PET لـ BhrPETase والمتغيرات. تم توحيد الأنشطة وفقًا لـ BhrPETase. البيانات من تجربة مستقلة واحدة. الطفرات التي تم التنبؤ بها بواسطة نموذج Transformer واستراتيجية GRAPE ملونة باللون الأزرق والأخضر، على التوالي. الطفرات المزدوجة في مواقع W104 وF243 على M6 موضحة باللون الأحمر. الأسهم تمثل مسار التراكم. المنطقة الصفراء تمثل نطاق درجة حرارة الانصهار المثالي لإنزيمات تحلل PET لتمكين التحلل الفعال. .
تجاوزت باستمرار إنزيمات الهيدراز الأخرى للبولي إيثيلين تيريفثاليت، على الرغم من انخفاض النشاط التحللي. عند درجة الحرارة المثلى لـ HotPETase و CaPETase من أنتج TurboPETase 11.73 مللي مول من المنتجات الأحادية في 3 ساعات، بينما أنتج HotPETase و CaPETase أنتجت 4.32 مللي مول و 0.60 مللي مول من المونومرات، والتي كانت أقل بمقدار 1.7 و 18 مرة مقارنة بـ TurboPETase. عند التعرض لـ سجل TurboPETase كفاءات تحليلية تفوق تلك الخاصة بـ FastPETase و DepoPETase بـ و ، على التوالي. في ضوء تركيزات الإنزيمات المنخفضة المستخدمة في بعض التقارير، قمنا بإعادة معايرة تفاعلاتنا لتعكس هذه الظروف لضمان مقارنة أكثر عدلاً (الشكل 2C-E). تحت ظروف التفاعل المبلغ عنها، كانت معدلات تفاعل LCC كانت قيم HotPETase و FastPETase أقل بمقدار 1.8 و 4.9 و 1.0 مرة، على التوالي، مقارنةً بـ TurboPETase. مؤخرًا، تم إجراء تجارب مماثلة لتقييم أداء التحلل لـ FastPETase و HotPETase و PES-H1. و LCC تحت الظروف الصناعية أظهرت نتائجهم أن HotPETase أظهر نشاطًا نوعيًا أعلى مقارنةً بـ PES-H1. عند تحميل منخفض للركيزة . ومع ذلك، كما أن تركيزات الركيزة
زيادة إلى و كان تحويل PET لـ HotPETase أقل بكثير من تلك الخاصة بـ PES-H1 . يُقترح أن تكون هذه الكفاءة المنخفضة عند تحميل الركيزة العالي ناتجة عن الاستقرار الحراري المحدود وخصائص التحفيز الأخرى لـ HotPETase، مثل تثبيط المنتج. على الرغم من الأداء الجيد لـ PES-H1 تحت ظروف ذات صلة صناعية، كانت عملية التحلل النهائي لا تزال أقل من تلك التي حققتها LCC. نظرًا للتحسينات المبلغ عنها في PES-H1 في محلول فوسفات البوتاسيوم 1 م، قمنا أيضًا بمقارنة TurboPETase مع PES-H1 تحت تركيز عازل مرتفع، مع استمرار TurboPETase في التفوق، مما ينتج ما يصل إلى 2.5 مرة من منتجات التحلل لـ PES-H1 / في ج (الشكل التوضيحي التكميلي 6). لتقييم استقرار TurboPETase على المدى الطويل، قمنا بتمديد وقت التفاعل. أظهرت النتائج أداءً مستمرًا للإنزيم TurboPETase عند درجات حرارة مرتفعة، حيث أنتج 130 مللي مول من المنتجات الأحادية القابلة للذوبان على مدار 12 ساعة عند بينما المنتجات المفرج عنها مع BhrPETase و LCC و LCC كانت أقل بكثير (الشكل التوضيحي 7). تسلط نتائج التحلل الضوء على التفوق الكبير في التحلل المائي

تفاعلات دورة TurboPETase و FastPETase تجاه أفلام Gf-PET عند تحت ظروف التفاعل المبلغ عنها ج تحميل الإنزيم تحميل المواد الصلبة، 100 مللي مول من محلول فوسفات البوتاسيوم، pH 8.0). يتم تقديم البيانات كمتوسط س.د. ( تجارب مستقلة بيولوجيًا). تفاعلات زمنية لـ TurboPETase و HotPETase تجاه أفلام Gf-PET عند تحت ظروف التفاعل المبلغ عنها تحميل الإنزيم تحميل المواد الصلبة، 50 مللي مول من محلول غليسين-NaOH، pH 9.2). يتم تقديم البيانات كمتوسط س.د. ( تجارب مستقلة بيولوجيًا). تفاعلات زمنية لإنزيم TurboPETase وLCC نحو أفلام Gf-PET في باستخدام تحميل الإنزيم المبلغ عنه في محلول فوسفات البوتاسيوم بتركيز 100 مللي مولار ). كانت نسبة المواد الصلبة تُعرض البيانات كمتوسط س.د. ( تجارب مستقلة بيولوجيًا). يتم توفير بيانات المصدر كملف بيانات مصدر.
أداء TurboPETase عبر درجات حرارة مختلفة وظروف تفاعل أخرى تم اختبارها.

لتفسير أداء التحلل المائي المحسن، تم تحليل الحركيات من خلال نموذج مايكلس-منتن التقليدي ونموذج مايكلس-منتن العكسي. كما هو موضح في الشكل 3A، أظهرت المنحنيات علاقات قريبة من الخطية لمعدل البداية وتحميل الركيزة تحت جميع الظروف لـ TurboPETase وBhrPETase وLCC. لم يتم ملاحظة سلوك التشبع التقليدي لأنه حتى أدنى تركيزات الإنزيم المستخدمة هنا ) كانت مرتفعة جدًا بحيث لا يكون النهج التقليدي صالحًا، مما يشير إلى معدلات التفكك السريعة جدًا للإنزيمات من سطح PET. بالإضافة إلى ذلك، أجرينا مقارنة حركية للركائز القابلة للذوبان (MHET و ) كما هو موضح في الشكل التوضيحي التكميلي 8 والجدول التكميلي 7. أظهر الكفاءة التحفيزية لـ TurboPETase تجاه MHET زيادة متواضعة فقط مقارنةً بـ PET (مع زيادة بنسبة 32%)، مما يشير إلى أنه قد تكون هناك عوامل أخرى، ربما زيادة الامتصاص على السطح، تساهم في زيادة كفاءة تحلل PET. وعلى العكس، فإن الانخفاض الطفيف في “TurboPETase لـ NPB
مصحوبًا بانخفاض في قوة الارتباط، مما يشير إلى تغييرات محتملة في مجال ارتباط الركيزة، مما يجعله أقل ملاءمة لتفاعلات الجزيئات الصغيرة الأخرى.

على الرغم من أن التحلل المائي للبولي إيثيلين تيريفثاليت لم يستطع تلبية المعايير للنهج التقليدي، إلا أن نموذج مايكلس-منتن العكسي كان أكثر ملاءمة. لقد تم استخدام معادلة مايكلس-منتن العكسية بنجاح لدراسة حركيات الإنزيمات غير المتجانسة مثل السليلوزات، والتي يمكن من خلالها تقدير الفعالية التحفيزية ضد مواقع الهجوم المتاحة على سطح البوليمر. كعملية تآكل سطحية نموذجية، فإن التحلل المائي الإنزيمي للبولي إيثيلين تيريفثاليت (PET) يكاد يكون غير قادر على اختراق النواة الداخلية للبوليmer، مما يؤدي إلى الوصول إلى عدد محدود من الروابط الاسترية السطحية (المعروفة أيضًا بمواقع الهجوم) حتى لو كانت الإنزيمات بكمية كبيرة. وبالتالي يحدث التشبع عندما تصبح جميع المواقع على السطح مشغولة، وتتكاثر جزيئات الإنزيم الزائدة في المذيب. يجب ملاحظة أن ليس جميع مواقع الامتزاز قادرة على التحويل الحفزي، كما أن الامتزاز غير المحدد يمثل أيضًا نسبة كبيرة. قمنا بقياس تركيزات الإنزيمات الحرة، وقام بتحويله إلى تغطية الركيزة، لحساب إجمالي امتصاص الإنزيمات على سطح PET (الشكل التكميلي 9 و

الشكل 3 | المعلمات الحركية والتحليل الهيكلي لـ TurboPETase.
مخططات مايكلس-منتن التقليدية والعكسية لـ TurboPETase و BhrPETase و في في محلول فوسفات البوتاسيوم 100 مللي مولار، pH 8.0. تُعرض البيانات كمتوسط س.د. ( تجارب مستقلة بيولوجيًا). يتم توفير بيانات المصدر كملف بيانات مصدر. قيم C RMSF (في ) للجميع ذرات BhrPETase و TurboPETase خلال محاكاة الديناميكا الجزيئية، مما يشير إلى تغييرات عالمية
في مرونة البروتين، خاصةً في تجويف ارتباط PET. تم تمثيل الطفرات H218S/F222I وW104L وF243T كذرات برتقالية، بينما تم تمثيل الثلاثي الحفاز كذرات وردية ساخنة. D مخطط تخطيطي لعمليات تحلل PET. مقارنةً بالإنزيم البري، قد يكون TurboPETase أكثر تنوعًا بسبب زيادة المرونة على طول تجويف ارتباط البروتين PET، مما يسمح له بالهجوم على هياكل سطحية مختلفة.

الجدول التكميلي 8). يمثل الإنزيمات المرتبطة المشبعة (الظاهرة)، بينما هو ثابت التفكك . عند تركيزات إنزيم منخفضة، أظهر TurboPETase امتصاصًا أعلى على سطح PET مقارنةً بنظرائه. ومع ذلك، عند الوصول إلى التشبع، كانت سعات الامتصاص القصوى متشابهة ( ) لوحظت، مما يبرز إمكانيات الربط العامة المتسقة عبر الإنزيمات. يمكن توسيع مقارنات هذه الإنزيمات من خلال النظر في التغيرات المحددة في معلمات مايكلس-منتن العكسية، والتي يمكن أن تعكس القدرة على الربط بمواقع الهجوم على سطح PET. كما هو موضح في الشكل 3B والجدول 1، أظهرت القيم اختلافات طفيفة بين TurboPETase وBhrPETase وLCC ، خاصة للقيم عند تحميل الركيزة، مما يشير إلى أن السعة الامتصاصية المحددة لـ TurboPETase عند مواقع الهجوم على
لم يتعرض سطح PET للتلف. من الجدير بالذكر أن TurboPETase أظهر زيادة بمقدار 2.1 مرة في مقارنةً بـ BhrPETase و LCC المعامل العكسي، أقصى سرعة تفاعل لكل موقع تفاعلي متاح )، يحدد المعدل عندما تكون جميع مواقع الهجوم مغطاة بالإنزيم . نظرًا لعدم وجود اختلافات جوهرية في و تمت ملاحظة قيم مرتفعة بين الإنزيمات، قد تشير القيم إلى استهداف موسع لـ TurboPETase نحو مواقع هجوم محددة عندما حافظت الإنزيمات على مستوى امتصاص عام مستقر. وبالتالي، افترضنا أن الأداء المحسن في التحلل البوليمري لـ TurboPETase قد يعتمد، على الأقل جزئيًا، على القدرة المعززة على مهاجمة طيف أوسع من مواقع الهجوم المحددة التي يمكن أن تتحلل لتشكيل مركب منتج.

تحليل هيكلي متعمق يساعدنا أيضًا على فهم الأسس الجزيئية لتحسينات الأداء. وفقًا لنموذج TurboPETase الذي توقعته AlphaFold2 وتمت محاكاة الديناميكا الجزيئية (MD) اللاحقة، قد يُعزى الأداء المحسن لـ TurboPETase إلى الجوانب الرئيسية التالية: تحسين مرونة شق ربط الركيزة (H218S/F222I، W104L وF243T)، تحسين التفاعلات الشحنية على سطح البروتين (A209R وD238K)، وإدخال رابطة ثنائية الكبريت (A251C-A281C). يُقترح أن تساهم A209R وD238K ورابطة الكبريت الثنائية A251C-A281C بشكل أساسي في تحسين الاستقرار الحراري مع الحفاظ على النشاط (الأشكال التكميلية 10 و11)، بينما قد يُعزى تحسين فعالية التحلل المائي إلى الاستبدالات القريبة من المواقع النشطة. يُقترح أن H218 تشكل تعبئة وثيقة مع W190 المحفوظة في الإنزيمات المماثلة. وجد تشين وآخرون أن النشاط التحللي لـ PET يمكن أن يستفيد من موقع نشط أكثر مرونة في الطفرة المزدوجة H214S/F218I (التي تتوافق مع H218S/F222I في BhrPETase). في الدراسة الحالية، كشفت محاكاة الديناميكا الجزيئية لشكل الأبو من TurboPETase عن حرية دوران موسعة لـ W190 التي منحها الطفرة H218S/F222I (الشكل التكميلي 12)، وهو ما يتماشى مع ملاحظة التشكيلات المتنوعة لـ W156 المقابل في IsPETase. عند الارتباط بـ PET، يتم تقليل اهتزاز W190 وتثبيته بواسطة التفاعلات مع ركيزة PET. تم تعزيز هذه المرونة في شق ارتباط PET بشكل أكبر من خلال التفاعلات التآزرية التي تم الحصول عليها من إضافة W104L و F243T، كما تم الكشف عنه بواسطة C نتائج تقلب الجذر التربيعي المتوسط (RMSF) (الشكل 3C). تم الإبلاغ سابقًا عن أن W104 يتجمع ضد P248 المجاورة لاستقرار P248. . في TurboPETase المعاد تصميمه، قد يؤدي التخلي عن هذا التفاعل من خلال استبدال الليوسين إلى زيادة المرونة الشكلية داخل منطقة الحلقة (N246-A250)، كما يتضح من الانخفاض الكبير في الارتباط المتبادل لهذه المناطق (الشكل التكميلي 13). بالنسبة لاستبدال آخر F243T في تجويف ارتباط PET، يبدو أن الملف الاستيراتيكي لـ F243 يحدد موقع ارتباط أكثر محيطية لـ PET. ومع ذلك، قد يؤدي تحوله إلى الثريونين، الذي يتمتع بميزة استيراتيكية أقل وضوحًا، إلى تحرير المساحة لارتباط PET بحالة أكثر مرونة. والأهم من ذلك، أنه بدون الملف الاستيراتيكي للحلقة العطرية، قد يجذب T243 PET أعمق في التجويف، مما يقرب الكربونيل القابل للتغيير من السيرين الحفاز، مع تقليص المسافات البينية من إلى (الشكل التوضيحي 14). في الوقت نفسه، قد تؤثر المرونة المعززة سلبًا على استقرار البروتين، وهو ما يتماشى مع الانخفاض الملحوظ في درجات حرارة الانصهار للطفرات النقطية الفردية. من خلال دمج تحليلنا الهيكلي مع البيانات الحركية، افترضنا أن المرونة المتزايدة بشكل كبير على طول تجويف ربط PET قد توفر مساحة أكبر لاستيعاب مجموعة متنوعة من أشكال الهجوم من خلال الربط الديناميكي، وهو ما قد يكون حاسمًا لتكوين مجمعات كاتاليتيكية قادرة على العمل على هياكل سطحية مختلفة (الشكل 3D). بناءً على النتائج المذكورة أعلاه، استنتجنا أن TurboPETase ربما يكون أكثر تنوعًا فيما يتعلق بتكوين خيط PET الذي يهاجمه. ومع ذلك، فإن التفاصيل
يتطلب تحليل الآلية مزيدًا من الجهود من خلال أبحاث أكثر عمقًا.

أظهرت الدراسات السابقة كفاءة محدودة في التحلل البيولوجي لإنزيم ISPETase ونسخه تجاه البوليستر شبه العطري الآخر، وبالتحديد PBT، عند . مقارنةً بـ PET، يتمتع PBT بدرجة حرارة انتقال زجاجي أقل ( )، الذي يتراوح بين 37 و . في هذه الدراسة، على الرغم من أن يتجاوز من PBT، مما يعزز بشكل كبير من حركة سلاسل بوليمر PBT، أظهرت جميع الإنزيمات التي تم فحصها كفاءة تدهور مخفضة بشكل ملحوظ تجاه أفلام PBT عند فيما يتعلق بتدهور PET (الشكل التكميلي 15). على وجه التحديد، أنتج TurboPETase كميات أكبر من المنتجات التحليلية ( ) من كل من BhrPETase و LCC تشير هذه النتائج إلى أن المواقع النشطة للإنزيمات الحالية التي تقوم بتفكيك PET كانت أقل كفاءة في الارتباط بالسلاسل الأليفاتية الممتدة في PBT مقارنةً بـ PET. وبالتالي، لا تزال هناك حاجة إلى جهود مخصصة في اكتشاف الإنزيمات أو الهندسة المخصصة لتحسين عملية التحلل البوليمري لفئات جديدة من البوليستر شبه العطرية.

تمت بذل جهود متنوعة لتطوير أنظمة إنزيمية مزدوجة لإزالة المنتجات الوسيطة BHET و MHET. ، والتي تُعرف بأنها مثبطات إنزيمات هيدراز PET. أفاد هاوغويتز وآخرون بنظام إنزيم مزدوج يجمع بين طفرات TfCa المهندسة وإنزيم PETase PM الذي حقق زيادة بمقدار 4 أضعاف في المنتجات الكلية تجاه أفلام GfPET مقارنةً بـ PETase PM بمفرده عند فوق قمنا بمزيد من استكشاف إمكانيات تطبيق TurboPETase من خلال ربطه بالإنزيم المقاوم للحرارة الذي تم الإبلاغ عنه مؤخرًا والذي يقوم بتحلل BHET، وهو BHETase. ، في نظام إنزيمي مزدوج. عند تحميل منخفض للركيزة ( )، نظام الإنزيم المزدوج زاد بشكل فعال من العائد الإجمالي للمنتجات، مقارنةً بالاستخدام الفردي لـ TurboPETase (الشكل التكميلي 16). ومع ذلك، ظهرت ملاحظة مثيرة عند تحميل PET بمستوى مرتفع من تجاوزت TurboPETase وحدها العوائد من معظم نسب الإنزيمات في نظام الإنزيم المزدوج عند الاستثناء الوحيد هو نسبة. ومع ذلك، في التحقيق الحالي، تم فقط تحليل تدهور المواد البولي إيثيلين تيريفثاليت غير المتبلور عند تم تقييمها. يمكن أن تتوسع الأبحاث المستقبلية لفحص فعالية نظام الإنزيم المزدوج على أنواع مختلفة من الهيدرازات MHET وركائز PET ذات الخصائص الفيزيائية المتنوعة تحت ظروف تفاعل مختلفة، بما في ذلك درجات حرارة متنوعة.

لتقييم أداء التحلل البوليمري لـ TurboPETase عند مستويات تحميل المواد الصلبة ذات الصلة بالصناعة بشكل أفضل، قمنا بمقارنة التحلل البوليمري لنفايات PET الملونة المعالجة مسبقًا (PcPET) باستخدام TurboPETase و LCC. عند تحميل الركيزة بـ حقق TurboPETase تحللًا شبه كامل للبوليمر. ، تم حسابها من بيانات HPLC) لنفايات PcPET في 8 ساعات (الشكل 4A)، مع معدل إنتاج أقصى قدره 61.3 جرام من PET المحلل (الشكل التكميلي 17 والجداول التكملية 9 و 10). لوحظ تغيير طفيف في بلورية PcPET (وصلت إلى بعد 8 ساعات)، مما يسمح بإعادة استخدام نفايات PcPET المتبقية على الفور لعملية التحلل البوليمري. على النقيض من ذلك، LCC مطلوب 16 ساعة للوصول تحلل البوليمر (محسوب من بيانات HPLC) عند ، وأظهر PcPET المتبقي بلورية مشابهة لـ ، مما يدل على أن عملية “الشيخوخة الفيزيائية” تم قمعها عند درجات حرارة أقل. عند درجة الحرارة المثلى للتفاعل التي تم الإبلاغ عنها سابقًا شركة ذات مسؤولية محدودة وصلت إلى أقصى تحويل لـ (محسوب من بيانات HPLC) على مدى 12 ساعة، ولم يتم الحصول على أي زيادة أخرى بعد فترة تفاعل مطولة بسبب قابلية تشوه سلاسل PET العالية. أظهر PcPET المتبقي مستوى عالٍ من

التحلل المائي الإنزيمي. تُعرض البيانات كمتوسط س.د. ( تجارب مستقلة بيولوجيًا). ج تقريبًا تدهور كامل لزجاجات PcPET المعالجة مسبقًا بواسطة TurboPETase عند مع تحميل الركيزة و تحميل الإنزيم في محلول مائي في مفاعل حيوي سعة 7.5 لتر. تم حساب نسب تحلل PET بناءً على استهلاك NaOH (تم تنظيم درجة حموضة خليط التفاعل عند 8.0). البيانات من تجربة مستقلة واحدة. تم توفير بيانات المصدر كملف بيانات مصدر.
البلورية، المقدرة بـ وهو يتماشى مع تقرير سابق .

يمكن أن تؤثر العديد من العوامل على الهجوم الإنزيمي ضد البلاستيك: مثل البلورية، حركة السلسلة، حجم الجزيء، الطبوغرافيا السطحية والخصائص الكارهة للماء. . من بين هذه، تم دراسة دور انخفاض البلورية في تحلل PET بشكل موسع. بلورية تتجاوز تم اقتراحه سابقًا بشكل كبير لعرقلة عملية التحلل الإنزيمي. في التحلل البوليمري لمساحيق PET غير المعالجة بالذوبان ( البلورية)، وجدنا انخفاضًا كبيرًا في أداء التحلل (الشكل التكميلي 18 والجدول التكميلي 11). ومع ذلك، خلال التحلل المائي لـ PcPET المعالج مسبقًا، حتى عندما وصلت البلورية إلى بعد 4 ساعات من التحلل بواسطة في لم نلاحظ تراجعًا سريعًا في معدل التدهور. أظهر بفاف وآخرون أن LCC أكثر كفاءة في تحليل البوليمرات الأقصر أظهرت الدراسات الحديثة أيضًا أن PET المعالج بشكل مكثف، مع درجة بوليمرية (DP) أقل من 20 وبلورية عالية، يمكن أن يظل قابلًا للتحلل بدرجة عالية. . هذه النتائج أكدت على أهمية عوامل أخرى غير البلورية في التحلل الإنزيمي، وشجعت على مزيد من التحقيق من خلال تحليل كروماتوغرافيا النفاذ الهلامي (GPC)، الذي كشف عن متوسط وزن منخفض بشكل ملحوظ ( ) ومتوسط العدد ( الكتل الجزيئية في مساحيق PcPET مقارنة بمساحيق PET غير المعالجة بالذوبان (الجدول التكميلي 12). من نتائج GPC، نفترض أن الوزن الجزيئي المنخفض لـ PcPET المعالج مسبقًا قد يساهم في الحفاظ على معدل التحلل بواسطة في خلال الساعات الأولى من التفاعل، ولكن زيادة إضافية في البلورية إلى أدى إلى تقليل كبير في غير المتبلور
المناطق، مما يعيق المزيد من التحفيز الإنزيمي. علاوة على ذلك، خلال عملية التحلل البوليمري، لاحظنا أيضًا انخفاضًا طفيفًا في وتغييرات معتدلة في على الرغم من تحقيق أكثر من تحلل البوليمر (الشكل 4B). هذا يتماشى مع الدراسات السابقة حول تحلل PET المائي بواسطة Cut190. لقد تم اقتراح أن التحلل المائي الإنزيمي للبولي إيثيلين تيريفثاليت (PET) يبدأ عادةً بقطع سلسلة من النوع الداخلي بعد ارتباط الإنزيم بسطح PET. يحدث مزيد من التحلل المائي للروابط الاستر المجاورة داخل المناطق غير المتبلورة من خلال قطع سلسلة من النوع الخارجي، مما يؤدي إلى إطلاق منتجات قابلة للذوبان. بالنسبة للبوليمرات التي تخضع للتقطيع العشوائي، فإن احتمال التقطيع الخارجي يرتبط عكسيًا بطول السلسلة. بالنسبة للبولي إيثيلين تيريفثاليت (PET) مع درجة بوليمرية (DP) حوالي 200، فإن احتمال الانقسام الخارجي أقل بكثير من الانقسام الداخلي. في هذه الدراسة، كانت درجة البوليمرية للبولي إيثيلين تيريفثاليت المعالج مسبقًا (PcPET)، والتي تبلغ حوالي 50، أقل بكثير من تلك الخاصة بمواد PET الخام النموذجية. وقد أدى ذلك إلى زيادة كبيرة في عدد نهايات السلاسل المتاحة للانقسامات الخارجية. وبالتالي، لم يعد الانقسام من النوع الداخلي، الذي كان سيقلل من درجة البوليمرية لـ PET، يحتل نسبة مهيمنة، مما قد يفسر التغيرات الطفيفة في الحجم الجزيئي التي لوحظت خلال عملية التحلل المائي لـ PET.

لاستكشاف الجدوى الصناعية، قمنا بتكبير التفاعل وأجريناه في مفاعل حيوي سعة 7.5 لتر مع تحميل PET من في محلول مائي عند درجة حموضة 8.0. يعتبر تحميل الإنزيم مصدر قلق خاص للصناعة حيث أن تكلفة الإنزيم من بين العوامل الأساسية في عملية تحلل الكتلة الحيوية. على عكس استخدام تركيزات عالية من الإنزيم تصل إلى في عملية تحويل الكتلة الحيوية تحميل الإنزيم مشبع في تحلل PET. استنادًا إلى نموذج TEA ، تغيير من
إلى مستويات تحميل الإنزيمات تؤدي فقط إلى زيادة في MSP (الولايات المتحدة) )، في حين أن تكاليف رأس المال والتشغيل ستزداد بمقدار لا يقل عن للحفاظ على مدة التفاعل المطولة عند استخدام مستويات تحميل إنزيم منخفضة. والأهم من ذلك، في التفاعلات على نطاق واسع مع عند تحميل الركيزة، كان الانخفاض في نشاط الإنزيم وكفاءة التحلل البوليمري أكثر وضوحًا عند مستويات تحميل إنزيم أقل. . في عملية تحلل PET التي أبلغ عنها تورنييه وآخرون، كانت نسبة التحويل النهائية تم تحقيقه بواسطة LCC يستخدم تحميل الإنزيم مقارنة بـ تحويل مع تحميل الإنزيم . ومن ثم، تم اختيار تحميل الإنزيم لتحقيق توازن بين الإنتاجية وتكلفة الإنزيم. كما هو موضح في الشكل 4C، فإن تقدم التفاعل المقاس تقريبًا خطي خلال الساعتين الأوليين مع تحقيق حوالي 57% من التحلل البوليمري، يليه مرحلة أبطأ من 2 إلى 8 ساعات. وفقًا للمعلمات الحركية المستخلصة من الشكل 3، اقترحنا أن معدل التفاعل المنخفض قد يُعزى إلى الانخفاض الكبير في تحميل PET عند مستويات التحويل العالية. على الرغم من انخفاض الكفاءة التحليلية، فإن حوالي تحلل البوليمر محسوب من بيانات HPLC، محسوب من NaOH المستهلكة و تم حسابه من فقدان الوزن، كما هو مدرج في الجدول التكميلي 10) الذي تحقق خلال 8 ساعات أثناء التفاعل الموسع يجعل الإنتاج على نطاق تجريبي ممكنًا. يمكن أن يؤدي المزيد من تحسين العملية إلى تحسين كفاءة التحلل البوليمري لتركيزات أقل من نفايات PET.

تقدم التحلل الحيوي للبولي إيثيلين تيريفثاليت (PET) نهجًا مستدامًا وفعالًا من حيث الطاقة لإعادة تدوير PET، مما يمثل بديلاً أكثر صداقة للبيئة لطرق التخلص الحالية مثل المدافن والحرق. على الرغم من تحقيق تقدم كبير في هذا الصدد، فإن الهدف النهائي هو تطوير إنزيمات وعمليات مناسبة للتطبيقات على نطاق صناعي. كل من محتوى المواد الصلبة العالي وتحويلها يفيدان اقتصاديات التحلل الحيوي لـ PET، حيث يقلل من النفقات الرأسمالية والتشغيلية. ومع ذلك، فإن معلق المادة يظهر لزوجة ظاهرة عالية بسبب تحميل المواد الصلبة العالي، مما يؤدي إلى محدودية نقل الكتلة والحرارة، مما يقلل من كفاءة الإنزيمات في المراحل المبكرة من التحلل المائي. والأهم من ذلك، أن زيادة تحميل المواد الصلبة إلى مستويات ذات صلة صناعية ستقلل من عائد التحلل بسبب التثبيط الناتج عن تركيزات المنتجات العالية. . وبالتالي، قد لا تكون الاستقرار الحراري للإنزيم كافية لتحلل PET في الصناعة. تتداخل عوامل متعددة، تؤثر على فعالية الإنزيم في السيناريوهات الواقعية. أحد الجوانب التي غالبًا ما يتم تجاهلها من قبل المجتمع العلمي هو التباين في التحلل المائي الإنزيمي غير المتجانس بين التجارب المخبرية والإنتاج الصناعي. على سبيل المثال، يمكن تعزيز نشاط التحلل للبولي إيثيلين تيريفثاليت (PET) في المختبر من خلال الدمج مع وحدات ربط غير تحفيزية لزيادة تركيز الإنزيم على سطح PET. ومع ذلك، فإن هذه الميزة تضيع تمامًا عند مستوى تحميل المواد الصلبة في الصناعة. على الرغم من التقدمات الأخيرة في هندسة إنزيمات الهيدراز PET لتحسين أدائها في تحلل PET، لا تزال الجهود مطلوبة في السعي نحو إنزيمات هيدراز PET جديدة لمعالجة فقدان التحويل تحت الظروف الصناعية ذات الصلة.

هنا، استخدمنا استراتيجية حسابية هجينة لإعادة تصميم إنزيم هيدراز PET الذي يتفوق بشكل كبير على إنزيمات هيدراز PET المعروفة الأخرى. تم تحقيق تدهور شبه كامل لزجاجات PET بعد الاستهلاك بمستوى تحميل صلب ذي صلة صناعيًا، مما يجعل هذا الإنزيم المحسن عالي الكفاءة مرشحًا جيدًا للتطبيقات المستقبلية في عمليات إعادة تدوير البلاستيك الصناعية. تم إثبات الآلية المسؤولة عن تعزيز أداء الإنزيم من خلال تحليلات حركية مستمدة من نظام تفاعل مائي عكسي من نوع مايكلس-منتن بالإضافة إلى التحليل الهيكلي، مما يبرز أهمية تحسين التفاعلات البوليمرية المحددة على مواقع الهجوم المحددة بدلاً من الامتصاص السطحي غير المحدد العام. قد تساعد النتائج في تعزيز المعرفة حول تحفيز التفاعلات غير المتجانسة وستكون مفيدة في تصميم عمليات تدهور البلاستيك القابلة للتطبيق صناعيًا.
الإنزيمات لمعالجة التحديات المرتبطة بالبلاستيكات الأخرى الأكثر وفرة، مثل البولي يوريثانات ذات الهياكل القابلة للتحلل المائي. بينما يدفع إمكان تصميم الإنزيمات المزيد من التطورات في تحسين أداء الإنزيمات، من الضروري تقييم كفاءتها في التحلل البوليمري تحت ظروف ذات صلة صناعية لإظهار الجدوى العملية.

مجموعة بيانات التدريب غير المراقب. تسلسلات متجانسة من BhrPETase و LCC تم البحث عنهم من Uniclust30 (الإصدار 2018_08) وقاعدة بيانات BFD باستخدام HHblits (تم تعيين عدد التكرارات إلى 4، وتم ترك المعلمات الأخرى كقيم افتراضية) باستخدام 15 تسلسلًا أساسيًا في عائلة Pfam PF01083 كاستعلامات. تم تجميع جميع التسلسلات التي تم البحث عنها في الهوية باستخدام CD-HIT للحصول على 10847 تسلسل. نظرًا لأن BFD و Uniclust30 تم تجميعهما عند تشابه منخفض جدًا، فقد يكونان قد تم أخذ عينات منهما بشكل غير كافٍ لنمذجة اللياقة في المناطق القريبة جدًا. العمل السابق الذي قام به فريزر وآخرون. تم أخذ عينة من MSA المبنية على بروتينات أكثر تشابهًا للتنبؤ بمتغيرات الأمراض. كما استرجعنا 15051 تسلسلًا ينتمي إلى PF01083 من قاعدة بيانات UniProt.

تفاصيل التدريب وتوقع المرشحين “الأقل ملاءمة”. لنمذجة مسافة الملاءمة للتسلسلات، قمنا بتدريب شبكة عصبية مع مشفر-فك مشفر من الصفر. استخدمنا مشفر Transformer لمعالجة تسلسلات الأحماض الأمينية المدخلة مع تضمين الموضع المطلق. على عكس النماذج الأخرى مثل الشبكات المتكررة والشبكات التلافيفية، لم يقم Transformer بفرض أي افتراضات حول ترتيب التسلسل وكان أكثر قوة في التقاط العلاقات بعيدة المدى في التسلسل بسبب آلية الانتباه (المعادلة 1):

قمنا بتطبيق الانتباه الذاتي متعدد الرؤوس كما هو موصوف في المرجع 60. يتكون المشفر من 3 طبقات من المحولات مع 8 رؤوس باستخدام حجم تضمين قدره 512. استنادًا إلى تضمينات المشفر، يقوم المفكك بتوليد احتمالات لكل رمز. تم تدريب النموذج بهدف نمذجة اللغة المقنعة للتنبؤ بالحمض الأميني الحقيقي في الموضع المقنع. في هذه الدراسة، تم استبدال عدد من الرموز برموز القناع أثناء التدريب. استخدمنا مُحسِّن آدم مع معدل تعلم محدد إلى تم تدريب النماذج لمدة 20 دورة باستخدام حجم دفعة قدره 32. تم تصفية المتبقيات عن طريق الفرز حسب القيم اللوجستية المعينة للأحماض الأمينية WT. تم اختيار أعلى عشرة مواقع متبقية ذات أعلى درجات متوسطة من توقع كل نموذج. تم حساب الدرجة المتوسطة باستخدام المعادلة التالية:

أين هو متوسط درجة موقع البقايا المتوقعة، و هي القيم المتوقعة للوجيتات للطفرات النقطية الفردية في موضع البقايا والأحماض الأمينية من النوع البري، على التوالي. باستثناء المواضع المكررة، تم توليد ما مجموعه 18 موضع بقايا، من بينها تم اقتراح أن تكون W104 وH164 وM166 وW190 وH191 وH218 وF/I243 تقع على الأخدود المرتبط بـ PET.

استراتيجية GRAPE المبلغ عنها في دراستنا السابقة تم استخدامه لتحسين استقرار البروتين. تسلسل BhrPETase تم تقديمه إلى خادم GRAPE-WEB عبر الإنترنت (https://nmdc.cn/grape-web/“). استنادًا إلى معلومات تسلسل BhrPETase ألفا فولد 2 تم استخدامه للتنبؤ بنموذج الهيكل. بعد ذلك، تم إجراء حسابات الطاقة باستخدام FoldX روزيتا_كارتيسيان_دي دي جي ، و ABACUS تم استخدامه للتنبؤ بالطفرات المستقرة. خوارزمية DDD تم استخدامه للتنبؤ بـ
روابط ثنائي الكبريتيد المناسبة. تم تعيين العتبات لـ ABACUS و FoldX و Rosetta إلى و -1.5 وحدة حرارية مكافئة، على التوالي.

تم نمذجة TurboPETase بواسطة AlphaFold2. ثم تم محاكاة البروتين لمدة 20 نانوثانية. تم استخدام الهيكل التمثيلي الذي تم الحصول عليه من محاكاة الديناميكا الجزيئية وهيكل بلورة BhrPETase (معرف PDB: 7EOA) لمزيد من التوصيل. تم إنشاء ركيزة نموذجية تتكون من ثلاث وحدات PET متتالية، تحاكي المجموعات الطرفية N وC لتغطية سلسلة البوليمر من كلا الطرفين. تم استخدام YASARA لإجراء توصيل جزيئي لـ PET إلى TurboPETase وBhrPETase. تم اختيار نموذج أعلى طاقة ربط. تم إخضاع النموذج المختار لتوصيل محلي لـ 999 جولة. تم محاكاة النموذج المحسن لمجمعات TurboPETase-PET وBhrPETase-PET في AMBER. باستخدام حقل القوة ff16SB. تم بروتنة بقايا His242 في حالة HID. تم إضافة الأيونات للحفاظ على حيادية النظام. ثم تم حل النظام في صندوق ثماني الأوجه مقطوع باستخدام نموذج الماء TIP3P مع المسافة حول المذاب. بعد عملية الذوبان، خضعت الأنظمة لتقليل من 12,000 خطوة وتم تسخينها تدريجياً من 0 كلفن إلى 338 كلفن بتردد تصادم بعد التوازن، تم إجراء محاكاة الديناميكا الجزيئية لمدة 100 نانوثانية لكل مركب، باستخدام خطوة زمنية قدرها 2 فيمتوثانية.

الجينات التي تشفر BhrPETase (رقم الوصول في GenBank: GBD22443)، LCC (رقم الوصول في GenBank: AEV21261)، LCC (LCC S283C/1127G)، ICCG (ICCG فاستبيتيز (ISPETase رقم الوصول إلى GenBank لـ ISPETase: BBYR01000074)، HotPETase (IsPETase S214Y/O119K/S213E/R90T/O182M/N212K/R224L/S58A/S61V/K95N/M154G/N241/K252M/T270Q)، DepoPET ase (ISPETase ), PES-H1 و CaPETase (CaPETase ، رقم الوصول إلى GenBank لـ PETase: SHM40309) تم تصنيعه وتحسينه للتعبير في الإشريكية القولونية (General Biosystems، آنهوي، الصين). ببتيد الإشارة لـ BhrPETase، LCC، LCC ICCG و بيتايز تمت إزالتها من الحمض النووي الاصطناعي. تم تصنيع الجينات لـ BhrPETase و LCC و LCC PES-H1 وتم استنساخ FastPETase في مواقع Nhel و Xhol من متجه pBAD (الذي يحتوي على علامة هيستيدين في الطرف N)، بينما تم استنساخ جين ICCG ديبوبيتيز، كابيتاز تم استنساخ HotPETase في مواقع Ndel و Xhol من متجه pET-21a(+) (الذي يحتوي على علامة هيستيدين في الطرف C). تم تقديم قائمة بتسلسلات النوكليوتيدات في الجدول التكميلي 13.

تم إنتاج طفرات BhrPETase باستخدام مجموعة التحوير الموجه QuickChange (Agilent Technologies، سانتا كلارا، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية). تم معالجة منتجات PCR بعد ذلك باستخدام DpnI (New England Biolabs، إبسويتش، ماساتشوستس، الولايات المتحدة الأمريكية) لهضم قالب الحمض النووي الأصلي، ثم تم إدخالها في خلايا E. coli TOP10. تم التحقق من الطفرات المدخلة من خلال تسلسل الحمض النووي (Tianyi Huiyuan، بكين، الصين).

البلازميدات التي تحتوي على جينات BhrPETase، تم تحويل FastPETase ونسخها إلى E. coli BW25113. بلازميدات ICCG ديبوبيتيز وكابيتيز تم تحويلها إلى E. coli C41(DE3)، بينما تم تحويل البلازميد الخاص بـ HotPETase إلى خلايا إيشيريشيا كولاي روزيتا غامي-ب (تم شراء خلايا التعبير القابلة للتنافس من زومان بيوتيك، بكين، الصين). تم زراعة الخلايا في وسيط في إلى من ثم تم تحفيز تعبير البروتين عن طريق إضافة L-أرابينوز (BhrPETase، LCC، LCC PES-H1 ، FastPETase ونسخها) أو 1 مللي مول من الإيزوبروبيل -D-thيوقالكوبيرانويد (ICCG ديبوبيتيز، كابيتاز و HotPETase). تم زراعة الخلايا لمدة 20 ساعة في تم حصاده بواسطة
الطرد المركزي ) ومعلقة في محلول التحلل ( و 20 مللي مول من الإيميدازول، pH 7.5 ). تم إجراء تكسير الخلايا من خلال الموجات فوق الصوتية على الثلج. تم الحصول على مستخلصات الخلايا الناتجة بعد الطرد المركزي عند لمدة 60 دقيقة عند ، تليها عملية الترشيح من خلال فلتر ميلكس لإزالة الرواسب. تم غسل البروتينات غير المرتبطة في عمود HisTrap HP سعة 5 مل باستخدام محلول الغسيل. ، و 60 مللي مول من الإيميدازول، pH 7.5)، تم استرجاع البروتين المستهدف باستخدام محلول الإخراج ( و 300 مليمول من الإيميدازول، pH 7.5 ). بعد ذلك، تم استبدال المحلول العازل بمحلول تخزين و 100 مليمول من NaCl، pH 7.5) باستخدام HiPrep عمود إزالة الملح. تم تخزين الإنزيم المنقى في تم تحديد تركيزات البروتين باستخدام طريقة BCA مع ألبومين مصل البقر كمرجع.

تقييم نشاط الطفرات خلال هندسة BhrPETase. فيلم Gf-PET غير المتبلور (Goodfellow، سمك، رقم المنتج ES301445، حوالي 15 ملغ) تم نقعها في من محلول 1 م من فوسفات البوتاسيوم تحميل المواد الصلبة) مع من الإنزيم المنقى ( “تحميل الإنزيمات” في لمدة 3 ساعات. في تحليل HPLC، كانت المرحلة المتنقلة تتكون من مخزن و مخزن (المخزن A: حمض الفورميك في الماء المقطر؛ العازل ب: أسيتونتريل). كانت سرعة التدفق وتم تنفيذ الفصل في مع إجراء الكشف عند 260 نانومتر.

مقارنة TurboPETase مع إنزيمات التحلل المائي الأخرى للبولي إيثيلين تيريفثاليت تحت ظروف تفاعل متطابقة. تم تقدير الأنشطة الأولية لإنزيمات التحلل المائي للبولي إيثيلين تيريفثاليت عند درجات حرارة مختلفة. فيلم Gf-PET ( حوالي 15 ملغ) تم نقعها في محلول عازل فوسفات البوتاسيوم بتركيز 100 مللي مولار ( تحميل المواد الصلبة) مع ( 0.3 تحميل الإنزيمات) ( تحميل الإنزيم) للإنزيم المنقى عند 50، 60 أو لمدة 3 ساعات، ثم تم تحليل السائل العلوي بواسطة HPLC لتحديد تركيز المونومرات المحررة من PET.

نظرًا للدرجة العالية من التحويل بعد التفاعلات المطولة، تم إجراء تحليل مسار الزمن في محلول فوسفات البوتاسيوم 1 م (pH 8.0) لتوفير سعة تخزين كافية. فيلم Gf-PET ( حوالي 15 ملغ) تم نقعها في من محلول 1 م من فوسفات البوتاسيوم تحميل المواد الصلبة) مع ( تحميل الإنزيم) للإنزيم المنقى عند 50، 60 أو لمدة 12 ساعة.

مقارنة TurboPETase مع إنزيمات التحلل الأخرى للبولي إيثيلين تيريفثاليت تحت ظروف التفاعل المبلغ عنها. فيلم Gf-PET ( حوالي 15 ملغ) تم نقعها في مخزن ( تحميل المواد الصلبة) لمدة 12 ساعة. للمقارنة مع FastPETase، تم نقع فيلم Gf-PET في محلول فوسفات البوتاسيوم 100 مللي مول (pH 8.0) في مع من الإنزيم المنقى ( ج تحميل الإنزيم). للمقارنة مع HotPETase، تم نقع فيلم Gf-PET في محلول 50 مللي مول من غليسين-NaOH (رقم الهيدروجيني 9.2) في مع من الإنزيم المنقى ( تحميل الإنزيم). للمقارنة مع LCC تم نقع فيلم Gf-PET في محلول فوسفات البوتاسيوم 100 مللي مولار (pH 8.0) في مع من الإنزيم المنقى ( تحميل الإنزيم) لمدة 3 ساعات.

معالجة مسبقة لزجاجات PET. تم جمع زجاجات PET المستعملة من محطة جمع القمامة في بكين، الصين. تم غسل الزجاجات بالماء المنزوع الأيونات وتجفيفها، ثم تم طحنها إلى رقائق صغيرة باستخدام كسارة JZ-T-005 (أدوات شيايان الدقيقة، دونغقوان، الصين). بعد ذلك، تم تحويل الرقائق إلى حالة غير متبلورة باستخدام جهاز بثق مزدوج اللولب SY-6219-20/32 (أدوات شيايان الدقيقة، دونغقوان، الصين). كانت درجات الحرارة المحددة هي في مناطق البثق،
في مضخة الانصهار، و في مناطق تغيير الشاشة. تم ميكرونيزه الألياف غير المتبلورة من PET بواسطة مطحنة DFY-1000D (دينغلي، ونتشو، الصين) في درجة حرارة الغرفة. بعد الغربلة، تم الحصول على مساحيق PET بحجم جزيئات أقل من تم الحصول عليها (11.1% بلورية في المتوسط).

مقارنة أداء التحلل البوليمري لـ TurboPETase و LCC تم خلط عشرين جرامًا من مسحوق PET المعالج مسبقًا و80 مل من محلول فوسفات البوتاسيوم 100 مليمول (pH 8.0) الذي يحتوي على 40 ملغ من الإنزيم المنقى في مفاعل حيوي سعة 200 مل (Kusnc، شنغهاي، الصين). تم استخدام خلاط مغناطيسي للحفاظ على التحريك المستمر بسرعة 300 دورة في الدقيقة. تم تنظيم درجة الحرارة عند (أو لـ ) عن طريق غمر الحمام المائي، وتم تنظيم الرقم الهيدروجيني عند 8.0 عن طريق إضافة محلول NaOH بتركيز 4 م. تم إجراء التجارب ثلاث مرات وتم تقييمها وفقًا لذلك.

خلال التفاعل، تم تقييم نسبة تحلل PET من خلال تحليل السائل العلوي باستخدام HPLC. تم التحقق من العائد النهائي للتحلل من خلال فحص وزن PET المتبقي. تم تصفية خليط التفاعل من خلال أوراق فلترة نوعية من Whatman الدرجة 1 (GE Healthcare، الولايات المتحدة الأمريكية). تم غسل الرواسب مرتين بالماء المنزوع الأيونات ثم تم تجفيفها عند بين عشية وضحاها. لتقييم نسبة PET في المتبقي، تم تحضين 200 ملغ من المتبقي المجفف في 20 مل من محلول NaOH بتركيز 4 م. لمدة 3 ساعات. بعد ذلك، تم قياس كمية TPA المحررة بواسطة تحليل HPLC. الوزن الإجمالي للمواد المتبقية ونسبة PET موضحة في الجدول التكميلي 9.

تقدير أداء التحلل البوليمري لـ TurboPETase على نطاق أوسع. تم دمج 0.5 كجم من مسحوق PET المعالج مسبقًا، و1.9 لتر من الماء المقطر و0.1 لتر من محلول TurboPETase (الذي يحتوي على 1 جرام من الإنزيم المنقى) في مفاعل حيوي سعة 7.5 لتر (New Brunswick Scientific، إديسون، نيو جيرسي، الولايات المتحدة الأمريكية). تم الحفاظ على معدل التحريك عند 300 دورة في الدقيقة، وتم تنظيم درجة الحرارة عند ، وتم تنظيم الرقم الهيدروجيني عند 8.0 عن طريق إضافة محلول NaOH بتركيز 4 م. تم تقييم نسبة تحلل PET خلال التفاعل وفقًا لاستهلاك القاعدة. بالإضافة إلى ذلك، تم التحقق من العائد النهائي للتحلل عن طريق تحليل المتبقي (كانت طرق التحلل القلوي وتحليل HPLC متطابقة مع البروتوكول أعلاه)، والذي تم جمعه عن طريق الطرد المركزي ( )، تم غسله مرتين بالماء منزوع الأيونات وتجفيفه في بين عشية وضحاها.

لتحديد درجات حرارة الانصهار الظاهرة، تم استخدام اختبار استقرار حراري قائم على الفلورية. تم إضافة صبغة SYPRO Orange المخففة بمقدار -fold (Molecular Probes، Life Technologies، الولايات المتحدة الأمريكية) في محلول البروتين. تم وضع الخليط في لوحة PCR ذات 96 بئر ذات جدران رقيقة، وتم إغلاقها بشريط لاصق بجودة بصرية. تم تسخين الخليط في نظام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) CFX 96 (BioRad، هيركوليس، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية) من 25 إلى بمعدل تسخين قدره تم تحليل بلورية PET و PBT بواسطة المسح الحراري التفاضلي (DSC). تم ضبط المعايير وفقًا لإجراء تم الإبلاغ عنه سابقًا. لتحليل الوزن الجزيئي للبولي إيثيلين تيرفثالات (PET)، تم تطبيق تحليل كروماتوغرافيا النفاذ الهلامي (GPC). تم إجراء قياسات GPC باستخدام نظام Agilent 1260 (Agilent 1260، شركة Agilent Technologies Inc.، الولايات المتحدة الأمريكية) مع كاشف مؤشر الانكسار (RI). كانت المرحلة المتنقلة تتكون من 1،1،1،3،3،3-هيكسافلورو-2-بروبانول (HFIP)، وتم إجراء التحليل عند بمعدل تدفق قدره .