© المؤلفون 2024

اكتشاف موت الخلايا (2024)10:40;https://doi.org/10.1038/s41420-024-01815-9

ما كان معروفًا سابقًا

نظرًا للاقتراح الأخير لعلاج CAR-NK، هناك حاليًا عدد قليل جدًا من تصاميم CAR المتاحة للرجوع إليها، خاصةً للأورام الصلبة. من غير الواضح ما إذا كان هناك تصميم عالمي فعال لجميع الأورام الصلبة أو ما إذا كان هناك تصميم حل مثالي محدد لكل ورم صلب. علاوة على ذلك، فإن حجم العينة التجريبية الحالي عمومًا صغير جدًا ويفتقر إلى التكامل. نحتاج إلى عدد كبير من التجارب الأساسية والسريرية للتحقق من مقارنة تأثيرات مختلف CARs. هناك حاجة إلى مزيد من التحقق
لتحديد ما إذا كان يمكن تطبيق CAR-NK على نطاق واسع في علاج الأورام الصلبة في الممارسة السريرية في المستقبل.

في الظروف العادية، يمكن للجهاز المناعي التعرف على خلايا الورم والقضاء عليها داخل بيئة الورم الدقيقة (TME). ومع ذلك، من أجل البقاء والنمو، تستخدم خلايا الورم استراتيجيات متنوعة لقمع الجهاز المناعي، مما يمكّنها من البقاء خلال مراحل مختلفة من الاستجابة المناعية المضادة للورم. تُعرف هذه الظاهرة، حيث تظهر خلايا الورم الخصائص الموصوفة، باسم ‘الهروب المناعي’ [1]. العلاج المناعي للورم هو طريقة علاجية للسيطرة على الأورام والقضاء عليها من خلال مكافحة الهروب المناعي واستعادة الاستجابة المناعية المضادة للورم الطبيعية للجسم. مستقبلات المستضدات الهجينة (CARs) هي بروتينات اندماج، وهيكل CAR لخلايا CAR-NK يتكون عادةً من ثلاثة مكونات: منطقة ربط المستضد خارج الخلية (عادةً scFv)، الفاصل، والنطاق العابر للغشاء، ومنطقة التنشيط داخل الخلية. خلايا القاتل الطبيعي (NK)، كخلايا مناعية فطرية فريدة، تظهر سمية خلوية سريعة وقوية لعلاج السرطان وإزالة مسببات الأمراض دون تحسس مسبق أو التعرف على المستضد [2]. تم تعديل خلايا CAR-NK وراثيًا للتعبير عن CAR من خلال التعديل الجيني، مما يربط الأجسام المضادة (أو المستقبلات) التي تتعرف على المستضدات السطحية للخلايا المستهدفة (مثل خلايا مصابة بالفيروس وخلايا سرطانية) مع جزيئات الإشارة المطلوبة لتنشيط خلايا المناعة. يمكن أن يتصدى هذا التعديل لمستقبلات مثبطة، مما يعزز تأثير القتل المحدد لخلايا NK على الخلايا المستهدفة [3].

بالنسبة للمرضى الذين يعانون من ورم صلب متقدم سريريًا أو انتشر بشكل واسع مع استجابة ضعيفة للعلاج الجراحي و

CDDpress
العلاجات التقليدية، تقدم خلايا CAR-NK بلا شك الأمل. إن تعظيم دور CAR-NK في الأورام الصلبة هو تحدٍ حالي في مجال الأورام. يتطلب نجاح علاج CAR-NK في الأورام الصلبة معالجة صعوبات متنوعة، بما في ذلك تصميم الهيكل الأمثل لـ CAR وتعديل المسارات المثبطة والمنشطة الداخلية لخلايا NK وراثيًا [4]. تشير الأبحاث الحالية إلى أن البيئة المثبطة TME (نقص التغذية والحالة المناعية المثبطة) تشكل عقبة كبيرة أمام التطبيق الفعال لـ CAR-NK في الأورام الصلبة. ومع ذلك، لا تزال الحالة الوظيفية وآلية الضرر لخلايا NK داخل TME غير معروفة [5]. يمكن أن تؤدي TME إلى خلل شديد في خلايا المناعة السامة، ودرجة ضعف السمية في خلايا NK داخل TME لمرضى السرطان مرتبطة ارتباطًا وثيقًا بتوقعات مختلف أنواع السرطان. على الرغم من ذلك، لا تزال الآليات الأساسية لخلل خلايا NK في TME غير مفهومة تمامًا. تتناول هذه المقالة التحديات التي تطرحها TME على تطبيق CAR-NK في الأورام الصلبة. تتعمق في عملية بناء CAR-NK، مستكشفة تأثيرات نقص الأكسجة، والعوامل الأيضية، ومستقبلات سطح خلايا NK، والسيتوكينات، والإكسوزومات على فعالية CAR-NK في الأورام الصلبة. يتم مراجعة الآليات التي تحكم عمل CAR-NK في مختلف الأورام الصلبة وحالة البحث الحالية حول الإمكانيات السريرية لـ CAR-NK لعلاج الأورام الصلبة بشكل شامل.

تشمل المناعة غير المحددة خلايا الظهارة المخاطية، البلعميات، وخلايا القاتل الطبيعي، وتظهر خصائص مثل نطاق واسع من العمل، استجابة سريعة، استقرار نسبي، وقابلية وراثية. تهدف استجابة المناعة الفعالة إلى القضاء على الخلايا الخبيثة أو تثبيط نموها. على الرغم من فعالية المناعة غير المحددة، يمكن لخلايا السرطان أن تتجنب المراقبة المناعية من خلال عرقلة تقديم المستضدات، واستخدام التنظيم السلبي، وتجنيد تجمعات الخلايا المثبطة للمناعة. يؤدي ذلك إلى إعاقة وظائف خلايا المناعة الفعالة وفشل الاستجابات المناعية المضادة للورم. استجابةً لهذا التحدي، ظهرت العلاجات المناعية، بمبدأ تعزيز أو تحسين قدرات الخلايا المناعية المضادة للسرطان لمنع هروب المناعة من خلايا السرطان. حاليًا، تنقسم العلاجات المناعية إلى خمس فئات: الأجسام المضادة المستهدفة، العلاج بالخلايا المتبناة، الفيروسات المحللة للأورام، لقاح السرطان، والعوامل المناعية. تقدم العلاجات المناعية مزايا لا يمكن تعويضها: أولاً، تنشط نظام المناعة في الجسم، مما يستعيد وظيفة المناعة ويقضي بشكل مستمر على خلايا الورم؛ ثانيًا، تعيد بناء وتعزيز وظيفة المناعة العامة، مما يمنع بشكل فعال تكرار الورم وانتشاره مع تأثيرات نظامية؛ ثالثًا، تحسن قدرة المناعة في الجسم، مما يقضي تمامًا على خلايا الورم المتبقية وآفات الميكرو-انتشار؛ رابعًا، تتمتع العلاجات المناعية بنطاق واسع من التطبيقات، مناسبة للأورام الخبيثة الصلبة، الأورام الدموية، وما إلى ذلك، وخاصة مفيدة للأورام التي تحتوي على آفات متعددة أو انتشار واسع. بالنسبة للمرضى الذين يعانون من سرطان متقدم فقدوا فرصة الجراحة، أو في حالة صحية سيئة، أو لا يمكنهم تحمل العلاج الإشعاعي أو الكيميائي بجرعات عالية أو غير حساسين ومقاومين للعلاج الكيميائي، تظهر العلاجات البيولوجية وحدها كخيار مهم. لا تحسن هذه الطريقة الأعراض بشكل كبير فحسب، بل تعزز أيضًا جودة الحياة وتطيل فترة البقاء؛ والأهم من ذلك، فإن الآثار الجانبية تكون نسبياً خفيفة، وذلك بفضل استخدام تقنية الاستهداف الجزيئي، التي تؤثر بشكل انتقائي على خلايا الورم دون التأثير على الخلايا الطبيعية وتضمن سلامة أعلى. من بين مختلف أساليب العلاج البيولوجي، حظي العلاج بالخلايا المتبناة باهتمام متزايد. يتضمن العلاج بالخلايا المتبناة جمع خلايا المناعة البشرية، التي تُزرع في المختبر لزيادة أعدادها أو تعزيز وظيفة القتل المستهدفة لديها. بعد ذلك، يتم ضخ هذه الخلايا المعدلة مرة أخرى في جسم المريض لمكافحة مسببات الأمراض، خلايا السرطان، أو الخلايا المتحورة.
الخلايا في الدم والأنسجة. تشمل ACT أساليب مختلفة، بما في ذلك علاج الخلايا اللمفاوية المتسللة إلى الورم (TIL)، وعلاج مستقبلات الخلايا التائية المهندسة (TCR)، وعلاج CAR-T، وعلاج CAR-NK.

أكثر التطبيقات الواعدة في علاج الأورام المناعي يكمن في خلايا المناعة المعززة بواسطة CAR ضمن العلاج بالخلايا المتبنية. CAR، وهو بروتين مدمج معدل بشكل صناعي، يمتلك مجال تعرف على المستضد خارج الخلية وعدة مجالات إشارة داخل الخلية معدلة وراثياً. كانت المحاولة الأولى لهذه التكنولوجيا، CARs من الجيل الأول، تتكون من هيكل أساسي يتضمن نوعاً مفرداً خارج الخلية (scFv) مسؤولاً عن التعرف على خلايا السرطان ومجال نقل الإشارة داخل الخلية (CD3). السلسلة) حاسمة لتنشيط الخلايا. تشمل المجالات داخل الخلايا في CARs من الجيل الثاني والثالث عادةً واحدًا أو اثنين من جزيئات الإشارة المساعدة، مثل 4-1BB (CD137)، CD28، CD27، OX40 (CD134)، عامل التحفيز المساعد للخلايا التائية القابلة للتحفيز (ICOS)، أو مثبط الوحدة التنظيمية I (RIAD). تعزز هذه الجزيئات تنشيط الخلايا، وتكاثرها، ومدة بقائها. CARs من الجيل الرابع، المعروفة أيضًا باسم CARs الدقيقة أو CARs المدرعة، تطلق معدلات المناعة عند الوصول إلى بيئة الورم الدقيقة. تستهدف هذه CARs بيئة الورم الدقيقة، وتطلق عوامل تنظيم المناعة، وتجذب/تنشط المزيد من خلايا المناعة لمهاجمة خلايا الورم. تحقق CAR-NK نقل الجينات من خلال طرق متنوعة، بما في ذلك الفيروسات الراجعة، الفيروسات القهقرية، التوصيل الكهربائي، الحويصلات الدهنية، والعناصر الجينية المتنقلة. يحتوي نقل الفيروسات الراجعة على عيبين: الأول هو أن الفيروس يمكن أن يُدرج في الجينوم، مما قد يؤدي إلى سرطان خلوي؛ والثاني هو أن النقل الفيروسي يمكن أن يثبط حيوية خلايا NK الأولية. الفيروس القهقري لديه سمية جينية منخفضة وتغيرات إدراجية. ومع ذلك، فإن كفاءة النقل للفيروس القهقري في خلايا NK الأولية منخفضة نسبيًا، وعادة ما تتطلب عدة جولات من النقل. يمكن أن يكون التوصيل الكهربائي وحقن الحويصلات الدهنية فعالين أيضًا في إدخال الجينات الخارجية إلى خلايا NK، حيث تعبر الجينات المنقولة بسرعة، وتكون مستويات الموت الخلوي منخفضة، وتكون الفروق بين الأفراد صغيرة. ومع ذلك، فإن الحمض النووي الخارجي الذي يتم نقله بواسطة التوصيل الكهربائي والحويصلات الدهنية لن يندمج في جينوم الخلايا المستهدفة، لذا فإن تعبير الجين المنقول يكون قصير الأمد نسبيًا. العناصر الجينية المتنقلة هي عناصر حمض نووي متنقلة يمكن أن تُنقل بكفاءة بين الناقلات والكروموسومات من خلال آلية “القص واللصق”، مما يؤدي إلى خلايا CAR-iPSC-NK التي تعبر عن جزيئات CAR بشكل مستقر. مقارنةً بالناقلات الفيروسية، فإن هذه الأنظمة المتنقلة لها عدة مزايا، مثل انخفاض المناعية، وارتفاع السلامة الحيوية، وانخفاض تكلفة الإنتاج، والقدرة على نقل قطع جينية كبيرة تزيد عن 100 كيلوبايت. ومع ذلك، لا يزال نظام العناصر الجينية المتنقلة بحاجة إلى التغلب على عيوب كفاءة النقل المنخفضة وموت خلايا NK الناتج عن التوصيل الكهربائي لحمض نووي بلازميدي. التأثير المثبط للمناعة للبيئة الدقيقة هو أكبر عقبة أمام تطبيق CAR-NK في الأورام الصلبة. في ضوء ذلك، يجب أن تختار تصميم CAR-NK لعلاج الأورام الصلبة خطة يمكن أن تتجاوز أو تحسن البيئة الدقيقة لتعظيم الفعالية.

بالمقارنة مع علاج CAR-T، يتمتع علاج CAR-NK بمزايا وخصائص فريدة بسبب استبدال خلايا الحامل من T إلى خلايا NK. تمتلك خلايا NK نشاطًا سميًا وتعمل بشكل مشابه جدًا لخلايا CD8 +T. إن انخفاض خطر رفض خلايا NK يسمح بتوليد خلايا NK في CAR-NK من مجموعة متنوعة من المصادر. تنشأ خلايا NK من الطحال، والكبد، والأعضاء اللمفاوية الثانوية، والغدة الصعترية، والأمعاء، واللوزتين، والرحم. على عكس خلايا B وخلايا T، تعتبر خلايا NK نوعًا من اللمفاويات التي يمكنها قتل خلايا الورم وخلايا الفيروسات المصابة بشكل غير محدد دون تحسس مسبق. تقتل خلايا NK بشكل رئيسي الخلايا المستهدفة من خلال ثلاثة آليات: أولاً، القتل المباشر للخلايا المستهدفة عن طريق الإفراج عن
حبيبات سيتوبلازمية تحتوي على البيرفورين والجرانزيمات. ثانياً، إطلاق السيتوكينات، مثل IFN- TNF- ، إلخ، يحفز موت الخلايا السرطانية من خلال التفاعل مع المستقبلات المقابلة على سطح خلايا الورم. ثالثًا، يرتبط مستقبل Fc CD16 بمنطقة Fc من الأجسام المضادة، مما يمكن أن يحفز السمية الخلوية المعتمدة على الأجسام المضادة (ADCC) لقتل الخلايا. هذه الآليات المتنوعة للقتل هي أساس النشاط المضاد للورم المزدوج لخلايا CAR-NK [21]. عند تصميم CARs لخلايا CARNK، يمكن النظر في الجوانب التالية: 1. يمكن أن تعزز السيتوكينات الذاتية مثل IL-2 وIL-15 سمية خلايا NK وتعزز تكاثرها [22]؛ 2. تغيير التركيب الأيضي للأورام أو تعديل برامج التعبير الجيني في الخلايا المناعية لحمايتها من غزو المستقلبات المثبطة في TME [23]؛ 3. يمكن أن تتجنب الأورام المراقبة المناعية وتحسن التكيف الأيضي والنشاط المضاد للورم عن طريق حجب بروتينات نقاط التفتيش المناعية المثبطة مثل PD-L1 وLAG-3 وTIGIT [24-26]؛ 4. تجهيز خلايا NK بمستقبلات كيموكين خارجية مستقرة لتعزيز قدرتها على الدخول واختراق الأورام [27]. تحظى علاج CAR-NK باهتمام متزايد بسبب سلامته وفعاليته.

تشير نقص الأكسجين إلى العملية المرضية التي تتضمن تغييرات غير طبيعية في الأيض، والوظيفة، والبنية الشكلية للأنسجة بسبب نقص إمدادات الأكسجين أو الاضطرابات في استخدام الأكسجين داخل الأنسجة. يمكن أن يؤدي بيئة الورم الناقص الأكسجين إلى تحفيز تكوين الأوعية الدموية الشاذ، وإعادة برمجة الأيض الطاقي، وتسهيل التهرب المناعي، وتنشيط الغزو والانتقال، وتحفيز الالتهاب المؤيد للورم، والحفاظ على إشارات التكاثر، والتسبب في عدم استقرار الجينوم. لذلك، يجب إعطاء اهتمام كافٍ لتأثير بيئة الورم الناقص الأكسجين على فعالية CAR-NK. توضح هذه الفقرة الآليات والاستراتيجيات المقابلة المتعلقة بتأثيرات نقص الأكسجين والعوامل الأيضية على فعالية CAR-NK. خلال تطوير الورم وتقدمه، غالبًا ما تواجه خلايا السرطان والخلايا الداعمة تحديات في الحصول على المغذيات والأكسجين بسبب الأوعية الدموية الورمية التي تتطور بشكل سيء، وتوزعها بشكل غير منظم، وسهولة تسربها. تظهر معظم الأورام الصلبة مناطق من نقص الأكسجين الدائم أو المؤقت. يؤدي نقص الأكسجين إلى زيادة التعبير عن الجينات المستجيبة لنقص الأكسجين.
عوامل نقص الأكسجين (HIFs) تتكون من وحدات ألفا الحساسة للأكسجين (HIF1a و HIF-2a و HIF-3a) ووحدات بيتا المعبر عنها بشكل دائم (HIF-1 تشير الدراسات إلى أن نقص الأكسجين يمكن أن يقلل من مستويات الفسفرة لـ ERK و STAT3 بطريقة تعتمد على الفوسفاتاز البروتيني التيروزيني 1 (SHP-1)، مما يعيق السمية الخلوية لخلايا NK. تركيز الأكسجين المنخفض يعيق التعبير ووظيفة المستقبلات المنشطة NKp44 و NKp46 و NKp30 و NKG2D في خلايا NK، بينما يقلل من MICA (سلسلة معقد التوافق النسيجي الرئيسي من الفئة A). علاوة على ذلك، يزيد نقص الأكسجين من مستوى الالتهام الذاتي لخلايا الورم، مما يؤدي إلى تعزيز تحلل الجرانيزيم B. على الرغم من تعزيز تحلل الجلوكوز في خلايا NK، إلا أن نقص الأكسجين يؤدي في النهاية إلى انخفاض سمية خلايا NK.

البيئة الدقيقة منخفضة الأكسجين لخلايا الورم تحد من مصادر الخلايا، مما يؤدي إلى تراكم كبير لأدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) خارج الخلايا. تعمل نوكليازات غشاء خلايا الورم CD39 وCD73 على ATP، محولة إياه إلى أدينوسين (ADO). بدوره، يمنع ADO نضوج خلايا NK من خلال A2AR، مما يضعف وظيفة المناعة المضادة للورم لخلايا NK. في الوقت نفسه، يؤثر ADO على خلايا البطانة الوعائية والخلايا الداعمة، مما يعزز تشكيل الأوعية الدموية الجديدة في البيئة الدقيقة للورم ويخلق ظروفًا ملائمة لانتشار الورم. أظهرت الدراسات أن تعبير CD73 يرتفع خلال نمو سرطان الثدي والساركوما. في ظروف نقص الأكسجين، تولد عملية التحلل السكري في البيئة الدقيقة للورم كميات كبيرة من حمض اللاكتيك. يمنع اللاكتات زيادة عامل النسخ NFAT، مما يقلل بدوره من IFN- لخلايا NK. الإنتاج. حمض اللبنيك (بيئة ذات pH منخفض) يزيد أيضًا من عدد خلايا المناعة المثبطة المشتقة من النخاع (MDSC) ويحفز موت الخلايا المبرمج [38، 39]. علاوة على ذلك، أظهر براند وآخرون [40] أيضًا أن امتصاص اللاكتات بواسطة خلايا NK الفأرية يؤدي إلى تَحمُّض داخلي وضعف في التمثيل الغذائي للطاقة، مما يعيق بشدة نشاطها المضاد للورم. يعتمد تمثيل خلايا NK بشكل كبير على مجمع الهدف الثديي من الراباميسين 1 (mTORC1) [41]، وهو مستشعر للمواد الغذائية/التمثيل الغذائي يتم تنشيطه بواسطة الأحماض الأمينية، وينسق تخليق البروتين. يؤدي تثبيط mTORC1 إلى انخفاض نشاط خلايا NK [42]. يرتبط فسفرة MTOR بنضوج خلايا NK في نخاع العظام والطحال [43]. الأحماض الأمينية، وخاصة الجلوتامين، تدخل الخلايا عبر الناقل SLC7A5/SLC3A2، والتنظيم المباشر لـ c-Myc، هي مسارات حاسمة في تمثيل خلايا NK [44]. يشارك c-Myc في تنظيم تعبير الناقلات الجلوكوزية وإنزيمات التحلل السكري. بالإضافة إلى ذلك، ينظم بروتين ربط عنصر تنظيم الستيرول (SREBP)، وهو عامل نسخي، التحلل السكري والأكسدة.

الفوسفوريلation في خلايا NK. خلايا الورم تحفز PPARa/ الإشارات من خلال زيادة استقلاب الدهون وتعريض الأحماض الدهنية تثبط SREBP، مما يقلل من إنتاج السيتوكينات ونشاط الخلايا القاتلة الطبيعية [45].

حالياً، يتضمن معالجة نقص الأكسجين التحكم في مستويات HIF. يمكن أن يثبط البورتيزوميب، وهو أول مثبط للبروتيازوم تم اكتشافه، النشاط النسخي لـ HIF-1. لقد أظهر مثبط إشارة المTOR، التيمسيروليموس، القدرة على حجب ترجمة HIF-1a. يمكن أن يؤدي تطبيع الأوعية الدموية للورم إلى تعزيز الاستجابة لنقص الأكسجين، حيث أن الأورام الناقصة للأكسجين تعبر بشكل مفرط عن بروتينات مؤيدة لتكوين الأوعية مثل VEGF، مما يؤدي إلى شبكات وعائية غير طبيعية تعزز الهروب المناعي وتقلل من فعالية العلاج المناعي. يمكن أن يؤدي إعطاء أدوية مضادة لتكوين الأوعية تستهدف VEGF أو مستقبلاته إلى تطبيع الأوعية الدموية. ومع ذلك، قد يؤدي العلاج الأحادي باستخدام الأدوية المضادة لتكوين الأوعية إلى تفاقم نقص الأكسجين في الورم، مما يؤدي إلى مقاومة العلاج وتدهور نتائج المرضى. يبدو أن الجمع بين العلاج المناعي وتطبيع الأوعية الدموية واعد لتحسين نتائج المرضى. تشير دراسات مجموعة ميشليه إلى أن استهداف علاج الورم باستخدام الراباميسين، الذي يثبط mTORC1 والجليكوليز، قد يحد بشكل فعال من نمو الورم عن طريق كبح الأيض الجليكولي لوربورغ في خلايا الورم.

NKG2D، المشفر بواسطة جين Klrk1، يعمل كمستقبل منشط على سطح خلايا NK. في البشر، يشكل NKG2D معقدًا مع بروتين التكيف DAP10، ناقلاً الإشارات إلى الأسفل من خلال الشحنة في مجاله الغشائي. DAP10، المعروف أيضًا باسم KAP10، هو بروتين تكيفي صغير عبر الغشاء مع تسلسل YINM في ذيله السيتوبلازمي. يرتبط بالوحدة الفرعية p85 من PI3K وGrb2، المرتبطة ارتباطًا وثيقًا بـ Vav1. ينشط NKG2D خلايا NK ويوفر إشارات مساعدة لخلايا CD8 + T. يسمح الهيكل الجزيئي لـ NKG2D بالارتباط بالعديد من الروابط MHC I-like المختلفة هيكليًا (NKG2DLs). يتم تنظيم تعبير NKG2DLs بشكل متزايد خلال التحول الخبيث، والإجهاد التأكسدي، والعدوى الفيروسية. يتم العثور على MICA/B، وخاصة MICA وMICB وULBP1-6 في البشر، في أورام الظهارة المعوية، بالإضافة إلى أورام الرئة والثدي والكلى والمبيض والبروستاتا. و المجالات، التي يتم ترميزها بواسطة الجينات في MHC حتى التجانس. يُوجد عادةً في أورام الظهارة المعوية [55]، ويمكن أن يُوجد أيضًا في أورام الرئة والثدي والكلى والمبيض والبروستاتا [56]. تحتوي ULBP1-6 على مجالات a1 و a2 ويمكن أن تكون مرتبطة عبر الغشاء (ULBP4 و 5)، أو مرتبطة بالدهون الفوسفاتيديلينوزيتول (GPI) (ULBP1-3، 6) أو كليهما (ULBP2 و 5) [51]. أظهرت الدراسات أن إشارة التنشيط التي تتوسطها ارتباط NKG2D بالليغاند يمكن أن تتجاوز الإشارة الناتجة عن مستقبلات المثبطة لتنشيط خلايا NK [57]. NKG2D هو مستقبل متعدد الوظائف يمكنه الارتباط مباشرة بمجموعة متنوعة من عائلات جزيئات الليغاند المعبر عنها على سطح الخلايا المستهدفة دون تقديم مستضد، مما ينشط أو يحفز الفاعلين المناعيين [58]. يتبع هذا التنشيط إطلاق بروتينات سيتوليتية مثل البيرفورين والجرانزيمات، التي تتوسط القتل في خلايا الورم. تلعب الاستجابة المناعية المتوسطة بواسطة NKG2D دورًا حاسمًا في مراقبة الورم، ويمكن لمسار NKG2D تنظيم بدء الورم وتقدمه، وهو أمر أساسي لضمان فعالية CAR-NK في الأورام الصلبة [53].

يمكن أن يتم تنظيم تعبير NKG2D في خلايا NK البشرية بواسطة IL-15 و IL-10 و IL-12 و TNF-a و IFN-a [59]. قد يكون انخفاض تنظيم NKG2D بسبب إنتاج NKG2DLs القابلة للذوبان بواسطة خلايا الورم. تشير العديد من النتائج إلى أن التركيزات العالية من NKG2DLs القابلة للذوبان قد تثبط مناعة الورم ونشاط خلايا NK من خلال انخفاض تنظيم تعبير NKG2D أو الانقضاض البروتيني لـ MICA/B. يرتبط تنظيم تعبير NKG2DLs القابلة للذوبان بانتشار سرطان الثدي في العقد اللمفاوية، والذي يرتبط بتشخيص سيء في الأورام الصلبة.
مثل الميلانوما، الورم العصبي الجنيني، سرطان البروستاتا، وسرطان الكلى [56، 60-63]. بالإضافة إلى NKG2DLs القابلة للذوبان، فإن السيتوكينات في بيئة الورم المجاورة (TME) تشارك أيضًا في آليات هروب الورم المعتمدة على NKG2D. السيتوكينات المؤيدة للالتهاب IFN- و TGF- تخفيض تعبير MICA وULBP ومنع تنشيط خلايا NK المعتمد على NKG2D [64-66].

يجب الإشارة إلى أن الدراسات الحديثة وجدت أن NKG2D يمكن أن يعزز من نشاط الخلايا القاتلة الطبيعية (NK) في الوساطة المناعية المعتمدة على الأجسام المضادة (ADCC) بطريقة تآزرية، مما يمكن أن يزيد من النشاط المضاد للورم لخلايا CAR-NK ويعمل كتكملة للطريقة التي تقتل بها CAR الأورام الصلبة. صمم غوان وآخرون مستقبلات هجينة PD1-NKG2D تحتوي على منطقة المفصل NKG2D ونطاق التحفيز المساعد 4-1BB، وأظهرت تعبيرًا سطحيًا مستقرًا، وساهمت في السمية الخلوية في المختبر لخلايا NK92 ضد خلايا ورمية متنوعة. قام البروفيسور شياو بإنشاء CAR-NK من خلال دمج النطاق الخارجي لمستقبل الخلايا القاتلة الطبيعية NKG2D مع DAP12، مما كان له تأثير كبير على الفئران المصابة بأورام صلبة. تم علاج ثلاثة مرضى مصابين بسرطان القولون النقيلي بعد ذلك بعمليات حقن محلية لخلايا CAR-NK. لوحظ انخفاض في إنتاج السائل البطني وانخفاض كبير في عدد خلايا الورم في عينات السائل البطني في أول مريضين تم علاجهما بحقن منخفضة الجرعة من خلايا CAR-NK داخل البطن. تم ملاحظة تراجع سريع في الورم في المنطقة الكبدية من خلال تصوير دوبلر بالموجات فوق الصوتية وتم تأكيد الاستجابة الأيضية الكاملة في الآفات الكبدية المعالجة بواسطة تصوير الانبعاث البوزيتروني (PET) مع التصوير المقطعي المحوسب (CT).

KIR هو جزيء مستقبل يشبه الأجسام المضادة يمكنه الارتباط ببعض جزيئات HLA-I من الفئة، ويعمل كمنظم رئيسي لوظيفة خلايا NK. يتم تصنيفه إلى KIR2D (ذو مجالين) وKIR3D (ثلاثة مجالات) بناءً على عدد المجالات الخارجية الشبيهة بالأجسام المضادة. في KIR2D/3D، يحتوي الجزء السيتوبلازمي الذي يحتوي على دافع ITIM على تسلسل أحماض أمينية أطول، يعرف باسم KLR2DL/3DL، ويعمل كمستقبل مثبط لخلايا NK. الجزء الآخر من المنطقة السيتوبلازمية الذي يحتوي على دافع ITAM له تسلسل أحماض أمينية أقصر، يعرف باسم KIR2DS/3DS. تحتوي المنطقة الغشائية على ليسين مشحون إيجابياً، مما يشكل مستقبل تنشيط قتل خلايا NK عند دمجه مع حمض الأسبارتيك المشحون سلبياً في المنطقة الغشائية وثنائي DAP-12 الذي يحتوي على ITAM في المنطقة السيتوبلازمية. تمر خلايا NK بعملية تُعرف بالتروغوسيتوز، وهي عملية بيولوجية تتضمن قضم جزء من غشاء الخلية وجزيئات سطحها من خلايا تقديم المستضدات من خلال المشبك المناعي. تتيح هذه العملية لخلايا NK نقل مواد سطح غشاء الخلية من الخلايا المستهدفة إلى الخلايا الفعالة. يسهل تنشيط CAR في خلايا NK نقل المستضدات المعروفة لـ CAR من الأورام إلى خلايا NK. ومع ذلك، يمكن أن يؤدي ذلك إلى انخفاض في كثافة مستضد الورم، مما يضعف ارتباط خلايا CAR-NK بالأهداف. بالإضافة إلى ذلك، قد يؤدي إلى التعرف الذاتي، والارتباط المستمر الذي يتوسطه CAR، والقتل الذاتي، وانخفاض الاستجابة في خلايا NK التي تعبر عن مستضدات الحبيبات (NKTROG+). يمكن مواجهة هذه الظاهرة من خلال نظام ثنائي CAR يجمع بين CAR تنشيطي موجه ضد مستضد ورمي معروف وCAR مثبط للتعرف الذاتي لخلايا NK الذي يرسل إشارة “لا تقتلني” إلى خلايا NK عند الاتصال بـ TROG+. يمنع هذا النظام أكل الحبيبات الناتج عن مستضدات الحبيبات مع الحفاظ على إشارات CAR التنشيطية ضد مستضدات الأورام، مما يؤدي إلى تعزيز نشاط خلايا CAR-NK. أفاد لي بأن exocytosis الذي يتوسطه CAR ساهم في تقليل كثافة مستضد الهدف، بالإضافة إلى أكل خلايا NK وانخفاض الاستجابة. استخدموا مستقبلًا مثبطًا يعتمد على KIR محدد للمستضد (iCAR) الذي نجح في تثبيط أكل خلايا NK الناتج عن مستضد TROG الذي يتوسطه CAR، مما يمنع خلايا NK المعتمدة على CAR من إنتاج عواقب مناعية ناتجة عن مستضد TROG مع الاحتفاظ بالقدرة على التعبير عن نفس المستضد والوظائف الفعالة الرئيسية لخلايا الورم. قد تجد هذه الإشارات الديناميكية المعدلة لـ AI-CAR تطبيقات مفيدة لتحسين الاستمرارية العلاجية والفعالية العلاجية لمجموعة من علاجات خلايا NK المتبناة.

DNAM-1 البشري (CD226) هو بروتين سكري عبر الغشاء من النوع الأول، بحجم يقارب 65 كيلو دالتون (kDa). يتكون من تسلسل رائد مكون من 18 حمض أميني (aa)، ويمتلك مجالًا خارجيًا مكونًا من 230 حمض أميني يحتوي على مجالين من نوع Ig-like C2، ومجال عبر الغشاء مكون من 28 حمض أميني، ومجال سيتوبلازمي مكون من 60 حمض أميني يحتوي على بقايا (Tyr322 وSer329) [74]. يعمل DNAM-1 كمستقبل منشط يحفز السمية الخلوية التي تتوسطها خلايا NK عند التفاعل مع الروابط CD155 وCD112 [75]. ومن الجدير بالذكر أن الروابط PVR/CD155 وNectin-2/CD112 لـ DNAM-1 تُعبر بشكل رئيسي على خلايا الأورام الصلبة، خاصة تلك ذات الأصل الظهاري والعصبي [76، 77]، وفي خلايا الأنسجة الطبيعية يكون التعبير قليلًا جدًا. وجد فريق فوكاتشتي [78] أن خلايا NK المهندسة FL-DNAM-1CD3z المدمجة مع أدوية مناعية مثل Nutlin3a يمكن أن تمثل نهجًا جديدًا للعلاج المناعي لعلاج الأورام العصبية غير الوظيفية p53. نظرًا لأن روابط DNAM-1 تُعبر في العديد من الأورام الصلبة [79]، فإن هذا النهج العلاجي يثبت فعاليته ليس فقط للأورام العصبية ولكن أيضًا لسرطان القولون والمستقيم، وسرطان الثدي، وسرطان المبيض، وسرطان الرئة، وسرطان البنكرياس، وأورام صلبة أخرى تظهر خللًا في p53 [80].

NCR هو مجموعة من المستقبلات المفعلة على سطح خلايا NK، بما في ذلك NKp46 (NCR1، CD335)، NKp44 (NCR2، CD336)، وNKp30 (NCR3، CD337). جميعها أعضاء في عائلة الأجسام المضادة الفائقة (IgSF)، ولكن ليس لديها تشابه مع بعضها البعض [81] وعادة ما تلعب دور القتل عندما تفقد KIRs قدرتها على التعرف على نفسها. يتم التعبير عن NKp46 وNKp30 على سطح جميع خلايا NK. يحتوي الجزء الخارجي من NKp46 على منطقتين شبيهة بالأجسام المضادة، بينما يحتوي الجزء الخارجي من NKp30 على منطقة واحدة فقط من النوع V. المناطق السيتوبلازمية لكل من NKp46 وNKp30 قصيرة نسبيًا، وتحتوي المناطق عبر الغشاء على أرجينين مشحون إيجابيًا. عندما تتفاعل مع المنطقة عبر الغشاء التي تحتوي على حمض الأسبارتيك المشحون سلبًا، تحتوي المنطقة السيتوبلازمية على

نمط ITAM CD3 عندما لا تكون الثنائيات المتجانسة مرتبطة تساهميًا، فإنها قادرة على نقل إشارات التنشيط. على النقيض من ذلك، يتم التعبير عن NKp44 بشكل حصري على سطح خلايا NK المنشطة، مما يجعله علامة محددة. تحتوي منطقته خارج الخلوية على مجال واحد من نوع V. على عكس NKp46 وNKp30، تفتقر المنطقة السيتوبلازمية لـ NKp44 إلى نمط ITAM. ومع ذلك، تحتوي منطقته عبر الغشاء على ليسين موجب الشحنة، مما يسمح بالارتباط غير التساهمي مع حمض الأسبارتيك سالب الشحنة في المنطقة عبر الغشاء وثنائي DAP12 المحتوي على نمط ITAM في المنطقة السيتوبلازمية، مما ينقل إشارات التنشيط. أظهرت الدراسات أن تقليل NKp30 مرتبط بانتشار الورم العصبي الدبقي ومقاومة العلاج الكيميائي. في الوقت الحالي، هناك نقص في البيانات حول تطبيق NCR في استهداف CAR-NK للأورام الصلبة، مما يتطلب مزيدًا من التحقق.

عامل نمو التحول- عامل النمو المحول- تي جي إف ) ينتمي إلى مجموعة من TGF- المكتشفة حديثًا عائلة سوبر تنظم نمو الخلايا وتمايزها. بالإضافة إلى TGF- تشمل هذه العائلة أيضًا الأكتيفينات، المثبطات، مواد مثبطات مولر (MIS) وبروتينات تشكيل العظام (BMPs) [83]. TGF- يتم إنتاجه بشكل رئيسي بواسطة خلايا الورم، وخلايا T التنظيمية (Tregs) وخلايا تثبيط النخاع العظمي (MDSCs) في بيئة الورم. وهو مرتبط ارتباطًا وثيقًا بسوء التنبؤ في سرطان الرئة، وسرطان البنكرياس، وسرطان المعدة، وسرطان القولون والمستقيم، وسرطان الثدي وسرطان الكبد، وتعبّر تقريبًا جميع خلايا الجهاز المناعي عن TGF- المستقبلات (TGF- R) [84-89]. TGF- يتم إفرازه كديمر غير نشط يتطلب معالجة بواسطة آلية مختلفة للتفعيل. TGF النشط- يرتبط بمستقبل رباعي يتكون من اثنين من TGF سلاسل RI واثنان من TGF- سلاسل RII. عند الارتباط بـ TGF- تقوم مستقبلات النوع الثاني بفوسفة مستقبلات النوع الأول، التي تنقل الإشارة بعد ذلك من خلال فوسفة عامل النسخ

سماد2/3 [90]. ثم ينتقل هذا المعقد إلى النواة، ويرتبط بسما4 وعوامل مساعدة أخرى، ويعمل على تقليل السمية الخلوية للخلايا القاتلة الطبيعية.

TGF- يعيق تنشيط الخلايا القاتلة الطبيعية ووظيفتها عن طريق تقليل تنظيم مستقبلات تنشيط الخلايا القاتلة الطبيعية مثل NKG2D وDNAM1 وNKp30، بالإضافة إلى المسارات الأيضية مثل mTOR/c-Myc. كما أنه يضعف وظيفة الخلايا القاتلة الطبيعية بشكل مباشر عن طريق تقليل تنظيم تنشيط مستقبلات الخلايا القاتلة الطبيعية، وخاصة NKG2D وNKp30، أو تثبيط مسار mTOR، مما يساعد على هروب خلايا الورم من المناعة [91]. TGF- تزداد الإنتاجية خلال نمو الورم والتقدم الخبيث، وتقوم بشكل انتقائي بقمع تعبير MICA وULBP2 وULBP4، بينما لا تتأثر MICB وULBP1 وULBP3 [65]. تتواجد بكثافة عالية في بيئة الورم الصلب، TGF- له تأثير مثبط للمناعة كبير. إنه يعزز تعبير CXCR3 و CXCR4 بينما يثبط تعبير CX3CR1 في خلايا NK البشرية، مما يعيق خروج خلايا NK من نخاع العظام ويثبط نضوج خلايا NK. تعبر الخلايا عن مجموعة متنوعة من البروتينات المضادة للأكسدة، مثل سوبر أكسيد ديسموتاز (SOD) وكاتالاز، التي يمكن أن تحول أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) إلى ماء وأكسجين. يمكن إنتاج ROS في ظل ظروف الحالة الثابتة وتشارك في عمليات بيولوجية متنوعة مثل مسارات الإشارة الحمراء والأبوبة. يمكن أن تتسبب ROS الزائدة في تلف مكونات خلوية مختلفة مثل الحمض النووي والبروتينات في خلايا NK. قد تؤدي ROS الزائدة أيضًا إلى إشارة غير طبيعية لخلايا NK من خلال التعديل الأكسيدي لبروتينات الإشارة الحساسة للأكسدة مثل MAPK و HIF أو NFkB. اكتشف مايكلودس وآخرون أن TGF- يمكن أن يثبط أيضًا نشاط خلايا NK عن طريق تحفيز إنتاج ROS. أظهرت الدراسة الحالية أن النقل المشترك لخلايا NK مع CAR B7H3 وعامل النمو المحول- المستقبل السالب المهيمن (DNR) حافظ على الوظيفة السيتوليتية في وجود عامل النمو المحول الخارجي- قد تكون استراتيجية التعبير المشترك لـ DNR و CAR في هذه الرواية نهجًا واعدًا لعلاج الأورام العصبية المركزية المقاومة مثل GBM [94].

تعتبر الإنترلوكينات وسطاء حيويين للالتهاب، حيث تتحكم في جوانب مختلفة من بيولوجيا خلايا NK. تعبر خلايا NK عن مستقبلات السيتوكين في وقت مبكر من تطورها [95] وتحتاج إلى الإشارات.
من خلال غاما مشترك سلسلة للتطوير، التوازن الداخلي والتفعيل. سلسلة، بروتين سكري عبر الغشاء من النوع 1 بوزن 40 كيلودالتون، هو الوحدة الإشارية للإنترلوكينات. يمكن لكل من IL-2 و IL-15 الإشارة من خلال مركب يتكون من و IL-2R السلاسل [96]، تنشط STAT1 وSTAT5 من خلال JAK-1 وJAK-3، على التوالي [97]. تعبر خلايا NK المنشطة عن IL-2Ra (CD25)، مما يعزز بشكل كبير منAffinityها لـ IL-2، مما يعزز تكاثر خلايا NK وإنتاج الجزيئات المميتة مثل البيرفورين والجرانزيم B [98]. النقل العرضي لـ IL-15 من IL-15Ra إلى IL-15R المجمعات على خلايا NK تبدأ تكاثر الخلايا وإعادة برمجة النسخ. تشمل عائلة السيتوكينات المتغايرة IL-12، IL-23، IL-27 وIL-35. يتكون IL-12 من p40 وp35 a و الوحدات الفرعية، ترتبط بمجمع مستقبل IL-12 (IL-12R) IL-12R IL-12R ، ويتم تنظيم إشارات IL-12R بواسطة كيناز التيروزين-2/JAK-2 الذي ينقل وينشط المنظم النسخي STAT4 [99]. أظهر لي [100] وسيلفستري [101] أن الجيل الرابع من CAR المستهدف لـ CD19 (CAR.19) الذي يعبر عن IL-15 أو IL-15/IL-15Ra بشكل مشترك قد عزز بشكل كبير تكاثر خلايا NK-92، وإفراز السيتوكينات المسببة للالتهابات، والنشاط السمي للخلايا ضد خطوط خلايا السرطان في المختبر وفي نموذج الفأر الزرعي.

تدعم البيانات الحالية الدور الإيجابي للإنترلوكينات في علاج خلايا CAR-NK للأورام الصلبة. وجد بيريز-مارتينيز [102] أن خلايا CAR-NK المحفزة بالإنترلوكين-15 المأخوذة من متبرعين قد تكون قابلة للتطبيق وآمنة لدى الأطفال الذين يعانون من أورام صلبة مقاومة للعلاج. أظهرت الدراسات أن مطابقة خلايا CAR-NK مع الكيموكينات التي تفرزها الأورام (مثل IL-8 ومستقبل CXCR1) تعزز من هجرة الأورام وغزوها [103]. يمكن أن تستفيد خلايا NK، التي تفتقر إلى البيروكسريدكسين-1 (PRDX1)، من IL15، الذي يزيد من تعبير PRDX1 ويحمي وظيفة خلايا NK. قام كلوبوتوفسكا وزملاؤها [104] بتعديل خلايا CAR NK التي تعبر عن PRDX1 بشكل مفرط، مما يظهر نشاطًا مضادًا للأورام قويًا ضد خلايا سرطان الثدي تحت الضغط التأكسدي (الشكل 3).

الإكسوزومات هي حويصلات (EVs) ( ) التي تحتوي على RNA وبروتينات معقدة. في عام 1987، اكتشف جونستون وآخرون [105]

الحويصلات التي تطلقها الخلايا الشبكية أثناء الزراعة في المختبر، مما أدى إلى صياغة مصطلح ‘الإكسوزومات’. يمكن لمجموعة متنوعة من الخلايا إفراز الإكسوزومات في ظل الظروف الطبيعية والمرضية، والتي تُشتق أساسًا من الأجسام متعددة الحويصلات التي تتشكل من انغماس الجسيمات الليزوزومية. يتم إطلاق هذه الحويصلات في المصفوفة خارج الخلوية بعد اندماج الغشاء الخارجي للحويصلات المتعددة مع غشاء الخلية. جميع أنواع الخلايا المزروعة تفرز الإكسوزومات، التي يمكن أن تدخل في النهاية إلى الدورة الدموية، ودخول الدم، واللعاب، والبول، والسائل الدماغي الشوكي، وحليب الثدي. تحمل الإكسوزومات بروتينات متنوعة، بما في ذلك بروتينات مرتبطة بنقل الغشاء (RAB GTPases، annexins، Flillins، ALIX، وTSG101)، ببتيدات رباعية (CD9، CD63، CD81، HSP60، وHSP90)، أحماض نووية (mRNA، miRNA، IncRNA، circRNA)، ودهون (sphingomyelin، phosphatidylserine، phosphatidylinositol، phosphatidic acid، ceramide، وcholesterol). إنها تسهم في التواصل بين الخلايا ونقل المعلومات الجينية، مما يلعب دورًا حاسمًا في تشخيص الأمراض وتوقعاتها.

تحتوي الإكسوزومات المستمدة من الأورام (TDEs) على مكونات جزيئية متنوعة، بما في ذلك الدهون، والبروتينات المرتبطة بالغشاء، والـ RNA غير المشفر الطويل (IncRNAs)، والـ miRNAs، والتي تشارك في عدة عمليات لتكوين الورم والغزو، بما في ذلك تكوين الأوعية الدموية، والتكاثر، والنمو، والانتشار، والهروب المناعي. تشير العديد من الدراسات إلى أن الإكسوزومات المستمدة من الأورام تعيق المناعة المضادة للأورام من خلال إضعاف وظيفة الخلايا الشجرية (DC) وخلايا NK وخلايا T. من بين هذه الخلايا، تعتبر خلايا NK خط الدفاع الأول ضد تحول الخلايا الخبيثة، ويمكن أن تتعرض وظيفتها للإعاقة بواسطة خلايا الورم من خلال آليات متنوعة، حيث تلعب الإكسوزومات الورمية دورًا رئيسيًا في خلل وظيفة خلايا NK. يمكن أن يتم امتصاص الإكسوزومات المستمدة من الأورام بواسطة خلايا NK من خلال آليات متنوعة، بما في ذلك اندماج الغشاء البلازمي، والابتلاع الخلوي، والبلعمة، والميكروبينوسيتوز، والداخلية المعتمدة على طوف الدهون. إنها تحفز الإشارات اللاحقة من خلال تفاعلات المستقبل-الليغاند، مما يؤدي إلى تقليل نشاط خلايا NK المضاد للأورام. كما تتداخل الإكسوزومات الورمية مع تجنيد خلايا NK، والهجرة، والتكاثر، والبقاء، والنشاط السيتوليتي، وإنتاج السيتوكينات، وتعبير المستقبلات. هناك أدلة على أن الإكسوزومات من سرطان الخلايا الكلوية الواضحة تتجنب المراقبة المناعية الفطرية من خلال تنشيط TGF- مسار SMAD، مما يثبط وظيفة خلايا القاتل الطبيعي [109]. أظهر زهاو [110] أن الإكسوزومات
يمكن أن يؤدي سرطان القناة البنكرياسية إلى تقليل تعبير مستقبلات تنشيط خلايا NK، مما يؤدي إلى خلل في خلايا NK. ومن المثير للاهتمام أن عدة دراسات [111، 112] أظهرت أن IL-15 يمكن أن يعكس تثبيط تعبير NKG2D بواسطة الإكسوزومات الورمية ويحمي خلايا NK من التأثير المثبط المرتبط بالإكسوزومات TGF- في الوقت الحالي، تم التأكيد على أن EVs CAR-T يمكن أن تحافظ على نشاط خلايا CAR-T، ولها تأثير إيجابي على الأورام الدموية والأورام الصلبة [113]. من المتوقع أن يكون لـ CAR-NK تأثير مشابه، في انتظار مزيد من الأبحاث.

يُعترف بأن استكشاف علاج CAR-NK في الأورام الصلبة لا يزال في مراحله المبكرة، مع زيادة عدد الدراسات السريرية التي تُجرى كل عام. على الرغم من أن خلايا CAR-NK تمتلك مزايا فريدة، إلا أنها ليست خالية من التحديات. تشمل العقبات مسائل تتعلق باستمرارية الخلايا، والتغلب على البيئة المناعية المثبطة، وتحسين كفاءة النقل، من بين أمور أخرى. هذه المعرفة تمهد الطريق للبحث والتطوير المستمرين لمعالجة هذه التحديات وتعزيز فعالية علاج CAR-NK في علاج الأورام الصلبة (الشكل 4).

مؤخراً، تم الحصول على نتائج مرضية تتعلق بتأثير CAR-NK المثبط على الورم الدبقي. تشير أبحاث وانغ وآخرون [114] إلى أن تطوير خلايا NK البشرية المهندسة وراثياً متعددة الوظائف (CD73. mCAR pNK) يمكن أن يولد نشاطاً فعالاً مضاداً للورم الدبقي بسبب تباين الورم وخصائصه المناعية المثبطة المتعددة في بيئة الورم الدبقي. يستهدف استهداف الالتهام الذاتي كمنظم مناعي تعزيز توجيه خلايا CAR-NK الفعالة إلى مواقع ورم الدبقي، بينما يعيد برمجة بيئة الورم الدبقي لتكون أكثر حساسية للاستهداف القائم على CAR. أظهر زانغ [115] أن مستقبلات عامل النمو التيروزين كيناز ErbB2 (HER-2) المحددة لـ NK-92/5.28.z (CAR من الجيل الثاني) تمتلك نشاطاً مضاداً للورم قوياً وانتقائياً ضد خلايا الورم الدبقي في المختبر ونماذج زراعة الورم الدبقي في الموقع، بالإضافة إلى الشفاء وتحفيز النشاط المضاد للورم الداخلي.

المناعة بعد علاج NK-92/5.28.z في الفئران المناعية. صمم موراكامي [116] خط خلايا CAR-NK جديد (CAR-KHYG-1، الجيل الثاني من CAR) خصيصًا للأورام التي تعبر عن متغير مستقبل عامل نمو البشرة الثالث (EGFRvIII). أظهرت النتائج أن EvCAR-KHYG-1 يثبط نمو خلايا GBM من خلال الاستماتة بطريقة محددة تعبر عن EGFRvIII. قام تشودري94 بنقل خلايا NK المشتقة من CB مع CAR B7-H3 وTGF- مستقبلات سلبية مهيمنة (DNR). أظهر هذا الجيل الثاني من CAR نشاطًا سيتوليتيك قويًا ضد خلايا GBM في المختبر. علاوة على ذلك، تم التعرف على مستضد الكريات البيضاء البشرية G (HLA-G) كبروتين نقطة تفتيش مناعية (ICP)، وهو معبر عنه حديثًا في الغالبية العظمى من خلايا الورم. وجدت JAN [117] أن خلايا NK المعدلة بواسطة CAR-HLA-G أظهرت تأثيرات سيتوليتيك قوية ضد خلايا سرطان الثدي والدماغ والبنكرياس والمبيض في المختبر. علاوة على ذلك، أظهرت هذه الخلايا انخفاضًا كبيرًا في نمو الورم الزرعي في نموذج الفأر الأورثوتوبي، مما أدى إلى زيادة في متوسط البقاء. يحمل هذا النهج وعدًا للتطبيقات المستقبلية في علاج CAR-NK لمجموعة من الأورام الصلبة.

طور لو [118] مستقبل انتقال تحفيزي هجين (CCCR) يتكون من نطاق PD1 الخارجي، ونطاق NKG2D عبر الغشاء والنطاق السيتوبلازمي، ونطاق NKG2D السيتوبلازمي. . هذا المستقبل لديه القدرة على تحويل إشارات PD1 السلبية إلى إشارات تنشيط، مما يعكس بشكل فعال التأثير المثبط للمناعة لـ PD1. في نموذج زراعة ورم سرطان الرئة، أظهرت خلايا CCCR-NK92 (الجيل الثالث من CAR) تثبيطًا كبيرًا لنمو الورم. ومن الجدير بالذكر أنه في التطبيق السريري، أفاد الدكتور زانغ وزملاؤه [119] أن هذا النظام قد يسبب حدوث متلازمة إطلاق السيتوكينات (CRS)، ويجب على الأطباء أن يكونوا يقظين بشأن هذا التأثير الجانبي أثناء علاج CAR-NK.

بالنسبة لسرطان الرئة غير صغير الخلايا، قام ليو [120] بتصميم خلايا NK-92 المحددة لـ DLL3 واستكشاف إمكانياتها في علاج سرطان الرئة صغير الخلايا. أظهر التعايش بين خط خلايا DLL3 SCLC وخلايا NK-92 CAR-DLL3 سمية خلوية وإنتاج السيتوكينات بشكل ملحوظ في المختبر. تحفز خلايا NK-92 CAR-DLL3 تراجع الورم في نموذج ورم رئوي نقيل مشتق من H446 عند عتبة أمان ملائمة. لوحظت نشاط مضاد للورم قوي لخلايا NK-92 CAR-DLL3 في نموذج ورم تحت الجلد لسرطان الرئة صغير الخلايا. علاوة على ذلك، تم الكشف عن خلايا NK-92 CAR-DLL3 المتسللة إلى الورم بشكل مميز في زراعة DLL3 SCLC. في دراسة أجراها يانغ [121]، كانت خلايا NK-92MI الحاملة لـ CAR مضاد B7-H3 (CAR من الجيل الثاني) فعالة في تقييد نمو سرطان الرئة غير صغير الخلايا المزروع في الفئران، مما أدى إلى إطالة مدة البقاء بشكل ملحوظ مقارنة بخلايا NK-92MI غير المعدلة. كانت إفرازات البيرفورين/جرانزيم B وتعبير CD107a مرتفعة بشكل ملحوظ في خلايا NK-92MI CAR مضاد B7-H3. صمم تشامبرز وآخرون [122] CAR-NK يستهدف محور الأدينوزين CD73 عن طريق حجب النشاط الإنزيمي لـ CD73. لا تؤدي هذه الطريقة فقط إلى إضعاف الأيض الأدينوزيني المدفوع بامتصاص ATP الناجم عن نقص الأكسجين بواسطة خلايا السرطان في نموذج NSCLC، بل تحفز أيضًا سكون الورم. كما تعزز تسلل خلايا NK إلى أورام CD73 وتعزز التنشيط داخل الورم.

جزيء التصاق الخلايا الظهارية (EpCAM)، وهو مستضد تمايز شامل للخلايا الظهارية، يتم التعبير عنه عبر أنواع مختلفة من السرطان ويملك إمكانيات ورمية داخلية. تظهر خلايا التأثير التي تعبر عن CAR وIL-15 (CAR من الجيل الرابع) فعالية دون الحاجة إلى السيتوكينات الخارجية، مما يمكّن من استمرار التكاثر في ظل ظروف EpCAM. تظهر هذه الخلايا نشاط قتل انتقائي عالي ضد خلايا سرطان الثدي التي تعبر عن EpCAM. تسهل هذه الاستراتيجية العزل السريع والتوسع المستمر لخلايا NK المنقولة، مما يعزز من إمكانياتها السريرية [123]. بالنسبة لسرطان الثدي HER-2+، أظهرت البيانات أن التعبير عن HER-2 CAR في خلايا NK من المتبرعين الأصحاء ومرضى سرطان الثدي يمكن أن يعزز بشكل فعال من وظيفتها المضادة للورم ضد خلايا السرطان التي تعبر عن HER-2، و
بالمقارنة مع التعبير عن MHC الفئة I، فإن ذلك غير ذي صلة. من المهم أن خلايا HER-2 CAR-NK تظهر سمية خلوية معززة تجاه أهداف الورم مقارنة بخلايا HER-2 CAR-T المتطابقة مع المتبرعين. ومن الجدير بالذكر أن خلايا HER-2 CAR-NK تحافظ على وظيفة سمية خلوية عالية في وجود عوامل مثبطة للمناعة المتواجدة بكثرة في الأورام الصلبة، مما يشير إلى كفاءتها وسلامتها للعلاج المناعي للأورام الصلبة [124-128].

في حالة سرطان الثدي الثلاثي السلبي (TNBC)، أظهر Liu وزملاؤه [129] أن علاج خلايا EGFR-CAR-NK (CAR من الجيل الثاني) قد يكون استراتيجية واعدة لمرضى TNBC. لا تكون العلاجات التقليدية للسرطان ولا العلاجات المناعية التقليدية فعالة لمرضى TNBC. تحفز خلايا EGFR-CAR-NK بشكل خاص تحلل خلايا TNBC في المختبر. أو يمكن استخدامها لعلاج مرضى TNBC الذين يظهرون تعبيرًا معززًا عن EGFR. كما أظهرت مجموعة Chen [130] أن خلايا EGFR-CAR NK-92 (CAR من الجيل الثاني) زادت من التحلل الخلوي وإنتاج IFN في خطوط خلايا سرطان الثدي MDA-MB-231 وMDA-MB-468 وMCF-7 (في المختبر)، وقللت من نمو الورم في الفئران الحاملة للورم (في الجسم الحي). استخدم Hu [131] نهج مستقبلات المستضدات الهجينة (CAR)، حيث طور واختبر خلايا TF-CAR-NK (CAR من الجيل الثاني)، التي تعبر عن CD16، مما يتيح السمية الخلوية المعتمدة على الأجسام المضادة (ADCC). يمكن لخلايا TF-CAR-NK قتل خلايا TNBC، ويمكن تعزيز فعاليتها مع L-ICON ADCC في المختبر. علاوة على ذلك، كانت خلايا TF-CAR-NK فعالة في العلاج في الجسم الحي لـ TNBC في كل من خطوط الخلايا ونماذج الفئران المستمدة من الأورام لدى المرضى. تؤسس هذه الدراسة دليلًا على مفهوم استهداف TF في العلاج المناعي CAR-NK كهدف جديد لعلاج فعال لـ TNBC.

قام Cao [132] بتصميم خلايا CAR NK-92 المستهدفة لـ MSLN وCD19 (خلايا CAR NK المستهدفة لـ MSLN وCD19). أظهرت النتائج أن خلايا MSLN-CAR NK يمكن أن تقتل بشكل خاص خلايا سرطان المعدة MSLN+ (N87 وMKN28 وAGS) في المختبر، ولكن لم يكن لها تأثير على خلايا MSLN- (Huh-7). كما لوحظ أن خلايا MSLN-CAR NK يمكن أن تقضي بشكل فعال على خلايا سرطان المعدة في نماذج الأورام تحت الجلد وفي تجويف البطن. كما أنها أطالت بشكل كبير من عمر الفئران الحاملة للأورام في تجويف البطن. والأهم من ذلك، لوحظ تأثير مضاد للورم قوي وتسلل كبير لخلايا NK في نماذج الأورام المستمدة من المرضى المعالجة بخلايا MSLN-CAR-NK، مما أظهر بشكل أكبر الفعالية العلاجية لعلاج خلايا MSLN-CAR-NK في سرطان المعدة.

قام Xiao وزملاؤه [69] بإنشاء CAR RNA NKG2D (CAR من الجيل الثاني) باستخدام طريقة التوصيل الكهربائي RNA التي توفر تعبيرًا مؤقتًا عن CAR، مما عزز بشكل كبير النشاط التحللي لخلايا NK ضد عدة خطوط خلايا أورام صلبة في المختبر. بعد ذلك، تم علاج ثلاثة مرضى بسرطان القولون النقيلي بالتسريب المحلي لخلايا NKG2D RNA-CAR NK. لوحظ تقليل إنتاج السائل البطني وانخفاض كبير في عدد خلايا الورم في عينات السائل البطني في أول مريضين تلقيا تسريبًا داخل البطن لجرعات منخفضة من خلايا CAR-NK. تلقى المريض الثالث الذي يعاني من نقائل ورم الكبد حقنًا عبر الجلد موجهة بالموجات فوق الصوتية تلاها تسريب داخل البطن لخلايا CAR-NK. لوحظ تراجع سريع للورم في منطقة الكبد من خلال تصوير الموجات فوق الصوتية دوبلر. قام Zhang وزملاؤه [133] بإنشاء CAR من الجيل الثاني المستهدف لـ EpCAM ونقلها إلى خلايا NK-92 باستخدام ناقلات فيروسية. كانت خلايا CAR-NK-92 الناتجة قادرة على التعرف بشكل خاص على خلايا سرطان القولون الإيجابية لـ EpCAM، وإطلاق السيتوكينات (بما في ذلك IFN- , البيرفورين، والجرانزيم B)، وإظهار سمية خلوية محددة في المختبر. كان لـ CEA-CAR NK-92MI الذي أنشأه Shiozawa وزملاؤه [134] سمية خلوية متزايدة بشكل كبير ضد خطوط خلايا سرطان القولون الإيجابية لـ CEA.

قام Liu [135] بإنشاء هيكل CAR يستهدف ويتعرف على مستضد c-MET باستخدام عدوى فيروسية وأظهر
خصوصية وفعالية العلاج المناعي لخلايا CAR-NK المستهدفة لـ c-MET في علاج سرطان الكبد البشري في المختبر. مؤخرًا، قام Chen130 بإنشاء خلايا GPC3-CAR-NK استنادًا إلى جسم مضاد معزز بال affinity يستهدف GPC3 لعلاج مرضى سرطان الكبد. تم استخدام L3C7c-Fc لعكس المستوى العالي من ligand 1 المبرمج القابل للذوبان (sPD-L1) في مرضى HCC، مما يعزز من تأثير هذه الخلايا CAR-NK ويوفر دليلًا تجريبيًا لتطوير استراتيجيات العلاج المناعي اللاحقة لسرطان الكبد.

بالنسبة لسرطان البنكرياس الغدي (PDAC)، وجد Lee وزملاؤه [136] أن مستقبل الفولات a (FRa) ومستقبل الموت 4 (DR4) كانا معبرين بشكل كبير في خلايا PDAC. يرتبط التعبير المشترك عن FRa وDR4/5 بنتائج سريرية أسوأ ويعتبر هدفًا محتملاً للعلاج الجزيئي. أعادوا برمجة خلايا FRa CAR-NK المتجانسة لحمل ligands تحفز الموت الخلوي وأعادوا توجيهها إلى FRa وبدؤوا الموت الخلوي الانتقائي للسرطان المعتمد على DR45 في الأورام الإيجابية لـ FRa وDR4/5. نتيجة لذلك، أدى تحميل خلايا NK بالligands السامة المعاد توجيهها إلى تعزيز كبير في الموت الخلوي الانتقائي للورم. قام فريق Da [137] بإنشاء خلايا CAR-NK-92 المستهدفة لمستضد الميسوتيلين (MSLN) (CAR من الجيل الثاني) من خلال نظام النقل، وأكدوا أنها أظهرت نشاط قتل أكثر فعالية ضد خلايا سرطان البنكرياس. تم تعزيز التأثير المضاد لسرطان البنكرياس بشكل أكبر بعد الزراعة المشتركة مع المحفز STING cGAMP. أظهرت خلايا PSCA-CAR_s15 NK التي تم تصميمها بواسطة Teng وزملاؤه [138] تثبيطًا كبيرًا للورم.

في الوقت الحالي، هناك دراسات محدودة حول تطبيق CAR-NK في الأورام البولية، ولا يزال هذا المجال غير مستكشف نسبيًا. يعتبر بروتين 8 الشبيه بعامل نخر الورم-أ (TIPE2)، الذي يرمز له TNFAIP8L2، منظمًا سلبيًا جديدًا للمناعة الفطرية والمكتسبة ويلعب دورًا رئيسيًا في الحفاظ على توازن المناعة. أظهرت الدراسات أن التعبير عن TNFAIP8L2 مرتبط بتوقعات سيئة لورم الدبقيات منخفض الدرجة في الدماغ (LGG) وسرطان الخلايا الكلوية الكروموفوب (سرطان الخلايا الكلوية الكروموفوب) وسرطان الخلايا الكلوية الشفاف (سرطان الخلايا الكلوية الشفاف)، وقد يصبح هدفًا لعلاج CAR-NK لسرطان الكلى [139]. قام Zhang [140] بإنشاء CAR محدد لمستقبل عامل النمو البشري (EGFR-) من خلال الفيروسات. تم تأكيد القدرة القاتلة المحددة لخلايا CAR-NK-92 المعدلة (CAR-NK-92) على خطوط خلايا سرطان الكلى (RCC) في المختبر. تم دراسة التأثير التآزري لـ cabozantinib وخلايا CAR-NK-92 المحددة لـ EGFR في المختبر وفي الجسم الحي، مما يمثل تقدمًا في علاج CAR-NK لسرطان الكلى.

تم التحقق من فعالية CAR-T في علاج الأورام الدموية، ولكن ستعاني خلايا CAR-T من فقدان المستضدات المستهدفة، وتنوع الأورام، والبيئة المناعية المثبطة. غير فعالة ضد الأورام الصلبة. تلعب خلايا NK أيضًا دورًا مهمًا في مجال مكافحة الأورام، لذا فإن CAR-NK الأكثر أمانًا وكفاءة قد جذبت تدريجيًا انتباه الجميع وسعيهم. يمكن أن تتعرف خلايا NK المعدلة بهيكل CAR أيضًا نظريًا على خلايا الورم بكفاءة وتقتل خلايا الورم من خلال إطلاق وسائط القتل وتحفيز موت الخلايا المستهدفة. بالمقارنة مع CAR-T في علاج الأورام الصلبة، أولاً وقبل كل شيء، فإن CAR-NK أكثر أمانًا. مؤخرًا، تم تأكيد العلاج المناعي CAR-NK في عدة سياقات سريرية. نظرًا لعمر خلايا CAR-NK المحدود في الدورة الدموية، فإن خطر الآثار الجانبية على الأنسجة الطبيعية ومرض الطعم ضد المضيف (GVHD) منخفض نسبيًا. ثانيًا، تتمتع خلايا CAR-NK بأنشطة مضادة للأورام مزدوجة. بالإضافة إلى قتل خلايا الورم المستهدفة في حالة مستقبلات المستضدات الهجينة، فإن خلايا CAR-NK نفسها لها تأثيرات مضادة للسرطان ويمكن تنشيطها بشكل مستقل. خلايا NK بدون هجين.
يمكن لمستقبلات المستضدات قتل خلايا السرطان مباشرة عن طريق إفراز Perforin-1 و Granzyme أو عن طريق مستقبلات الموت، أو عن طريق إفراز السيتوكينات والكيموكينات لتنشيط خلايا المناعة مثل الخلايا و الخلايا، ويمكنها أيضًا قتل خلايا السرطان من خلال السمية المعتمدة على الأجسام المضادة (ADCC)، مما يمكنها من محاربة تباين الأورام بشكل أفضل [143]. ثالثًا، إن انخفاض خطر رفض خلايا NK يسمح بتوليد خلايا CAR-NK من مجموعة متنوعة من المصادر، بما في ذلك خطوط خلايا NK92، وخلايا الدم المحيطية الوحيدة النواة (PBMCs)، والدم السري (UCB)، والخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs) [144]. باستخدام تقنيات الهندسة الوراثية المتقدمة، يمكن لخلايا NK أن تعبر عن جزيئات أخرى مع CARs، بما في ذلك السيتوكينات، والأجسام المضادة، والبروتيازات، وما إلى ذلك، مما يمكن أن يعزز تكاثر خلايا NK، ونقلها، واختراقها للأورام. رابعًا، يمكن تعديل مسارات الإشارة في خلايا NK (تنشيط NKG2D عبر DAP10 [145]، تقليل TIGIT لتقليل مستقبلات NKG2A المثبطة [26]) لتعزيز السمية الخلوية لخلايا NK. خامسًا، يمكن تعديلها ضد البيئة المجاورة المثبطة: خلايا NK التي تم نقلها باستخدام TGF- المستمد من الدم السري. يمكن لمستقبل II (DNRII) مقاومة التأثير المثبط لـ TGF- في البيئة المجهرية للورم، مع الاحتفاظ بقدرتها على القتل والإنترفيرون الإفراز [146]. بدلاً من ذلك، يتم تحويل الإشارات المثبطة لـ PD1 في البيئة المجهرية للورم إلى إشارات تنشيطية بواسطة مستقبلات التحفيز المساعدة المدمجة (CCCRs) التي تشمل المجال الخارجي لـ PD1، والمجالات الغشائية والسيتوبلازمية لـ NKG2D، والمجال السيتوبلازمي 4-1BB لإشارة NKG2D، مما يعكس التأثير المثبط للمناعة لـ PD1 [118]. قام Ng وآخرون [103] بتحسين استجابة خلايا CAR-NK للكيماويات المفرزة من الورم (مستقبل IL-8 CXCR1) من خلال مطابقة خلايا CAR-NK. تثبيط هجرة الورم وغزوه.

البيانات في الجدول 1 مأخوذة من سجل التجارب السريرية الأمريكيةClinicalTrials.gov“). في الوقت الحالي، هناك 25 تجربة سريرية لتطبيق CAR-NK على الأورام الصلبة، وقد نشرت واحدة منها النتائج: أكدت NCT03415100 التحلل القوي لخلايا سرطان القولون البشرية HCT116 الإيجابية لمستقبل NKG2D بواسطة خلايا CAR-NK. كانت حيوية الخلايا في المنتج النهائي قبل الحقن أكبر من . لا توجد تفاعلات سلبية خطيرة (الدرجة لم يتم العثور على أي أحداث سلبية (أحداث سلبية) في أي من المرضى الثلاثة. تم ملاحظة فقط متلازمة إطلاق السيتوكين من الدرجة 1، ولم يظهر أي مريض أعراض عصبية. كانت أكثر أحداث السلبية المرتبطة بالعلاج التي تم الإبلاغ عنها تشمل الحمى، والتعب، وفقدان الشهية. من أجل تطبيق علاج CAR-NK بشكل حقيقي في العلاج السريري في المستقبل، نحتاج إلى التحقق من النتائج التجريبية الأساسية لـ CAR-NK في أنواع مختلفة من الأورام الصلبة التي تم تقديمها أعلاه في التجارب السريرية، وتقديم توصيات محددة لمختلف بيئات الورم في الجسم البشري. تحسين محدد، مع جمع الآثار الجانبية التي تحدث أثناء العلاج. مع تقدم هذه التجارب السريرية، يُعتقد أن المزيد من البيانات ستثبت الإمكانات السريرية لتطبيق CAR-NK في الأورام الصلبة، وتوفر خيارات علاجية جديدة للأورام الصلبة المعقدة المتقدمة.

التطبيق السريري لخلايا CAR-NK ضد الأورام الصلبة يتأثر بشكل كبير بالبيئة المجهرية للورم. نقص الأكسجين، البيئة الحمضية، البيئة الغنية بالأدينوزين، مستقبلات سطح خلايا NK، TGF- IL، والإكسوزومات تؤثر جميعها على النشاط المضاد للورم لخلايا CAR-NK. يمكن أن تثبط هروب خلايا الورم من المناعة عن طريق تعديل المسار الداخلي، ومكافحة تباين الورم، ومناهضة البيئة المثبطة للورم، وتحسين قدرة خلايا CAR-NK على التسلل إلى نسيج الورم. على الرغم من التجارب السريرية الجارية، لا يزال هناك فهم محدود للآليات الكامنة وراء فعالية CAR-NK في الأورام الصلبة، وخاصة في سرطان الكبد، والسرطان الصفراوي، والأورام البولية. بينما توجد بعض التجارب قيد التنفيذ، فإن العديد منها في المرحلة الأولية مع أحجام عينات صغيرة، والقيود نسبياً كبيرة. يتطلب التطبيق السريري الحقيقي لعلاج CAR-NK بحثاً وتجارب معمقة.

في القرن الحادي والعشرين، كانت حالات الأورام في تزايد مستمر، ومع ذلك فإن فهمنا لها لا يزال محدودًا. العلاجات الفعالة للأورام الصلبة المتقدمة مفقودة.

مما يؤدي إلى انخفاض معدل البقاء على قيد الحياة للمرضى. تعتبر المناعية، وخاصة علاج CAR-NK، واعدة للمرضى الذين يعانون من أورام صلبة خبيثة متقدمة. هناك حاجة لمزيد من الاستكشاف لتعزيز فعالية علاج CAR-NK، مما يؤدي في النهاية إلى زيادة معدل البقاء على قيد الحياة وتحسين جودة الحياة لهؤلاء المرضى.

ساهم WW في المخطوطة والرسوم. قام YL و ZH بتعديل القواعد والشكل. ساهم ZS في الفكرة والتصميم. جمع SL و MJ و BZ و MD و WW و XM و LL المعلومات ذات الصلة. قرأ جميع المؤلفين ووافقوا على المخطوطة النهائية.

تم دعم هذا العمل ماليًا من قبل مشروع البناء المشترك لعام 2022 لخطة اختراق العلوم الطبية والتكنولوجيا في هنان (رقم المنحة: LHGJ20220313) وبرنامج رعاية العلماء الشباب المتميزين لعام 2023 من قبل جمعية هنان للعلوم والتكنولوجيا (رقم المنحة: 2023HYTP030).

يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح متنافسة.

يجب توجيه المراسلات والطلبات للحصول على المواد إلى وينكانغ وانغ، زينكيانغ سون أو شين جي.

معلومات إعادة الطباعة والإذن متاحة علىhttp://www.nature.com/إعادة طباعة

ملاحظة الناشر: تظل شركة سبرينجر ناتشر محايدة فيما يتعلق بالمطالبات القضائية في الخرائط المنشورة والانتماءات المؤسسية.

الوصول المفتوح هذه المقالة مرخصة بموجب رخصة المشاع الإبداعي النسب 4.0 الدولية، التي تسمح بالاستخدام والمشاركة والتكيف والتوزيع وإعادة الإنتاج بأي وسيلة أو صيغة، طالما أنك تعطي الائتمان المناسب للمؤلفين الأصليين والمصدر، وتوفر رابطًا لرخصة المشاع الإبداعي، وتوضح إذا ما تم إجراء تغييرات. الصور أو المواد الأخرى من طرف ثالث في هذه المقالة مشمولة في رخصة المشاع الإبداعي الخاصة بالمقالة، ما لم يُشار إلى خلاف ذلك في سطر الائتمان للمواد. إذا لم تكن المادة مشمولة في رخصة المشاع الإبداعي الخاصة بالمقالة وكان استخدامك المقصود غير مسموح به بموجب اللوائح القانونية أو يتجاوز الاستخدام المسموح به، فسيتعين عليك الحصول على إذن مباشرة من صاحب حقوق الطبع والنشر. لعرض نسخة من هذه الرخصة، قم بزيارة http:// creativecommons.org/licenses/by/4.0/.
© المؤلف(ون) 2024

© The Author(s) 2024

Cell Death Discovery (2024)10:40; https://doi.org/10.1038/s41420-024-01815-9

What was known before

Due to the recent proposal of CAR-NK therapy, there are currently very few CAR end designs available for reference, especially for solid tumors. It is unclear whether there is a universal design that is effective for all solid tumors or whether there is a specific optimal solution design for each solid tumor. Moreover, the current experimental sample size is generally too small and lacks integration. We need a large number of basic and clinical trials to verify and compare the effects of various CARs. Further validation
is needed to determine whether CAR-NK can be widely applied in the treatment of solid tumors in clinical practice in the future.

Under normal circumstances, the immune system can identify and eliminate tumor cells within the Tumor microenvironment (TME). However, to survive and grow, tumor cells employ diverse strategies to suppress the immune system, enabling their survival during different stages of the anti-tumor immune response. This phenomenon, where tumor cells exhibit the described characteristics, is termed ‘immune escape’ [1]. Tumor immunotherapy is a treatment method to control and eradicate tumors by combating immune escape and reinstating the body’s normal anti-tumor immune response. Chimeric antigen receptors (CARs) are fusion proteins, and the CAR structure of CAR-NK cells typically comprises three components: the extracellular antigen-binding region (usually scFv), the spacer and the transmembrane domain, and the intracellular activation domain. Natural Killer (NK) cells, as unique innate immune cells, display rapid and potent cytotoxicity for cancer immunotherapy and pathogen clearance without prior sensitization or antigen recognition [2]. CAR-NK cells are engineered to express CAR through genetic modification, connecting antibodies (or receptors) recognizing surface antigens of target cells (e.g. virus infected cells and cancer cells) with Signaling molecule required to activate immune cells. This modification can counteract inhibitory receptors, thereby enhancing NK cells’ specific killing effect on target cells [3].

For patients with solid tumor who are clinically advanced or extensively metastasized with poor responses to surgical and

CDDpress
conventional treatments, CAR-NK cells undoubtedly offer hope. Maximizing the role of CAR-NK in solid tumor is a current challenge in the field of oncology. Successful CAR-NK therapy in solid tumor requires to addressing various difficulties, including designing the optimal CAR structure and genetically modifying the intrinsic inhibitory and activating pathways of NK cells [4]. Current research indicates that the suppressive TME (nutritional deprivation and immunosuppressive state) poses a significant obstacle to the effective application of CAR-NK in solid tumors. However, the functional state and damage mechanism of NK cells within the TME remain unknown [5]. The TME can induce severe dysfunction in cytotoxic immune cells, and the extent of impaired cytotoxicity in NK cells within the TME of cancer patients is closely linked to the prognosis of various cancers. Despite this, the underlying mechanisms of NK cell dysfunction in the TME are not yet fully understood. This article addresses the challenges posed by the TME to the application of CAR-NK in solid tumors. It delves into the construction process of CAR-NK, exploring the impacts of hypoxia, metabolic factors, NK cell surface receptors, cytokines, and exosomes on the efficacy of CAR-NK in solid tumors. The mechanisms governing the functioning of CAR-NK in various solid tumors and the current research status of CAR-NK’s clinical potential for treating solid tumors are comprehensively reviewed.

Nonspecific immunity comprises mucosal epithelial cells, phagocytes, and natural killer cells, demonstrating characteristics such as a wide range of action, rapid response, relative stability, and heritability. An effective immune response aims to eliminate malignant cells or inhibit their growth [6]. Despite the innate effectiveness of nonspecific immunity, cancer cells can elude immune surveillance by impeding antigen presentation, employing negative regulation, and recruiting immunosuppressive cell populations [7, 8]. This leads to the impairment of immune cell effector functions and the failure of anti-tumor immune responses. In response to this challenge, immunotherapy emerged, with the principle of enhancing or improving the anti-cancer abilities of immune cells to prevent immune escape by cancer cells. Currently, immunotherapy falls into five categories: targeted antibody [9], adoptive cell therapy [10], oncolytic virus [11], cancer vaccine [12] and immunomodulator [13]. Tumor immunotherapy offers irreplaceable advantages: Firstly, it activates the body’s immune system, restoring immune function and persistently eliminating tumor cells; Secondly, it reconstructs and enhances overall immune function, effectively preventing tumor recurrence and metastasis with systemic effects.; Thirdly, it improves the body’s immune ability, thoroughly eliminating residual tumor cells and micro-metastasis lesions; Fourthly, Immunotherapy has a broad range of applications, suitable for solid malignant tumors, hematological malignancies, etc., especially beneficial for malignancies with multiple lesions or extensive metastasis. For patients with advanced cancer who have lost the opportunity for surgery, are in poor physical condition, or cannot tolerate high-dose radiotherapy or chemotherapy or are insensitive and resistant to chemotherapy, biological therapy alone emerges as a significant option. This approach not only significantly improves symptoms and enhances the quality of life but also prolongs survival time [14, 15]; Importantly, the side effects are relatively mild, attributed to the use of molecular targeting technology, which selectively impacts tumor cells without affecting normal cells and ensures higher safety [16, 17]. Among the various biological therapy modalities, adoptive Cell therapy (ACT) has garnered increasing attention. ACT involves the collection of human autoimmune cells, which are cultured in vitro to expand their numbers or enhance their targeted killing function. Subsequently, these modified cells are infused back into the patient’s body to combat pathogens, cancer cells, or mutated
cells in the blood and tissues. ACT encompasses various approaches, including Tumor Infiltrating Lymphocyte (TIL) therapy, Engineered T Cell Receptor (TCR) therapy, CAR-T therapy, and CAR-NK therapy.”

The most promising application in tumor immunotherapy lies in CAR-engineered immune cells within adoptive cell therapy. CAR, an artificially modified fusion protein, possesses an extracellular antigen recognition domain and several genetically modified intracellular signaling domains. The initial attempt at this technology, the first-generation CARs, had a basic structure comprising an extracellular single-stranded variant (scFv) responsible for identifying cancer cells and an intracellular signal transduction domain (CD3 Chain) crucial for cell activation.The intracellular domains of the second and third generation CARs typically include one or two co-stimulatory signaling molecules, such as 4-1BB (CD137), CD28, CD27, OX40 (CD134), inducible T cell co-stimulatory factor (ICOS), or regulatory subunit I anchoring disruptor (RIAD). These enhance cell activation, proliferation, and survival time. The fourth generation CARs, also known as precision CARs or armored CARs, release immune modulators upon reaching the tumor microenvironment. They target the tumor microenvironment, release immune regulatory factors, and attract/activate more immune cells to attack tumor cells [18]. CAR-NK achieves gene transduction through various methods, including retroviruses, lentiviruses, electroporation, liposomes, and DNA transposons [19]. Retroviral vector transduction has two disadvantages: one is that the virus can be inserted into the genome, which may lead to cellular cancer; the other is that retroviral transduction can inhibit the viability of primary NK cells. Lentivirus has low genotoxicity and insertional mutagenesis. Nonetheless, the transduction efficiency of lentivirus in primary NK cells is relatively low, and multiple rounds of transduction are usually required. Electroporation and liposome transfection can also effectively introduce exogenous genes into NK cells, and the transferred genes express quickly, the level of apoptosis is low, and the inter-individual variability is small. However, the exogenous DNA transduced by electroporation and liposomes will not integrate into the genome of the target cells, so the expression of the transgene is relatively short-lived. DNA transposons are mobile DNA elements that can be efficiently transposed between vectors and chromosomes through a “cut and paste” mechanism, resulting in CAR-iPSC-NK cells stably expressing CAR molecules. Compared with viral vectors, these transposon systems have several advantages, such as low immunogenicity, high biosafety, low production cost, and the ability to transduce large gene fragments longer than 100 kb . However, the transposon system still needs to overcome the disadvantages of low transduction efficiency and NK cell death caused by electroporation of plasmid DNA. The immunosuppressive effect of the microenvironment is the biggest obstacle to the application of CAR-NK in solid tumor. In view of this, the design of CAR-NK for the treatment of solid tumor should choose a scheme that can bypass or improve the TME to maximize the efficacy [20, 21].

Compared with CAR-T therapy, CAR-NK therapy has its unique advantages and characteristics due to the replacement of carrier cells from T to NK cells. NK cells have cytotoxic activity and function most similarly to CD8 +T cells. The low risk of rejection of NK cells allows NK cells in CAR-NK to be generated from a variety of sources. NK cells originate from the spleen, liver, secondary lymphoid organs, thymus, intestine, tonsil, and uterus. Unlike B cells and T cells, NK cells are a type of lymphocytes that can nonspecifically kill tumor cells and virus-infected cells without prior sensitization. NK cells mainly kill target cells through three mechanisms: Firstly, direct killing of target cells by releasing
cytoplasmic granules containing perforin and granzymes. Secondly, The release of cytokines, such as IFN- , TNF- , etc., induces tumor cell apoptosis through the interaction with the corresponding receptors on the surface of tumor cells. Thirdly, The Fc receptor CD16 binds to the Fc region of the antibody, which can trigger antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) to kill cells. These diverse killing mechanisms are the basis for the dual anti-tumor activity of CAR-NK cells [21]. When designing CARNK CARs, the following aspects can be considered: 1.Autocrine cytokines such as IL-2 and IL-15 can enhance NK cell toxicity and promote NK cell proliferation [22]; 2.Change the metabolic composition of tumors or modify gene expression programs in immune cells to protect them from the invasion of inhibitory metabolites in TME [23]; 3.Tumors can evade immune surveillance and improve metabolic adaptability and anti-tumor activity by blocking inhibitory immune checkpoint proteins such as PD-L1, LAG-3, and TIGIT [24-26]; 4.Equip NK cells with stable ectopic chemokine receptors to enhance their ability to enter and penetrate tumors [27]. CAR-NK therapy is receiving increasing attention due to its safety and efficacy.

Hypoxia refers to the pathological process involving abnormal changes in the metabolism, function and morphological structure of tissues due to insufficient oxygen supply or disorders in oxygen utilization within tissues. The hypoxic TME can induce aberrant angiogenesis, reprogram energy metabolism, facilitate immune evasion, activate invasion and metastasis, induce pro-tumor inflammation, maintain proliferative signals, and cause genomic instability [28]. Therefore, adequate attention should be given to the impact of the hypoxic TME on the efficacy of CAR-NK. This section elucidates the mechanisms and corresponding strategies regarding the effects of hypoxia and metabolic factors on the efficacy of CAR-NK (Fig. 1). Throughout tumor development and progression, cancer cells and stromal cells often face challenges in obtaining nutrients and oxygen due to poorly developed, disorderly distributed, and easily leaky tumor blood vessels. Most solid tumors exhibit areas of permanent or temporary hypoxia [29]. Hypoxia leads to the upregulation of hypoxia-inducible
factors (HIFs) composed of oxygen-sensitive alpha subunits (HIF1a, HIF-2a, and HIF-3a) and constitutively expressed beta subunits (HIF-1 ). Studies indicate that hypoxia can reduce the phosphorylation levels of ERK and STAT3 in a protein tyrosine phosphatase 1 (SHP-1)-dependent manner, impairing the cytotoxicity of NK cells [30]. Low O2 concentration hinder the expression and function of activated receptors NKp44, NKp46, NKp30, and NKG2D in NK cells [31], while reducing MICA (Major histocompatibility complex class Related chain A) [32]. Furthermore, hypoxia increases the autophagy level of tumor cells, leading to enhanced degradation of granzyme B [33]. Despite promoting NK cell glycolysis, hypoxia ultimately results in decreased NK cell toxicity.

The hypoxic microenvironment of tumor cells limits cellular sources, resulting in a substantial accumulation of extracellular adenosine triphosphate (ATP). Tumor cell membrane nucleases CD39 and CD73 act on ATP, converting it into adenosine (ADO). ADO, in turn, inhibits NK cell maturation through A2AR, compromising the anti-tumor immune function of NK cells [34, 35]. Simultaneously, ADO affects vascular endothelial cells and stromal cells, promoting the formation of TME neovascularization and creating favorable conditions for tumor metastasis [36]. Studies have shown that CD73 expression is upregulated during the growth of breast cancer and sarcoma [37]. In hypoxic conditions, glycolysis in the TME generates significant amounts of lactic acid. Lactate inhibits the upregulation of nuclear factor of activated T cells (NFAT), which in turn reduces NK cell IFN- production. Lactic acid (low pH environment) also increases the number of myeloid-derived suppressor cells (MDSC) and induces apoptosis [38, 39]. Furthermore, Brand et al. [40] also showed that lactate uptake by mouse NK cells leads to intracellular acidification and impaired energy metabolism, severely inhibiting their antitumor activity. NK cell metabolism heavily relies on the mammalian target of rapamycin complex 1 (mTORC1) [41], a nutrient/metabolic sensor activated by amino acids, coordinating protein synthesis. Inhibition of mTORC1 leads to decreased NK cell activity [42]. Phosphorylation of MTOR is associated with NK cell maturation in bone marrow and spleen [43]. Amino acids, especially glutamine, entering cells through transporter SLC7A5/SLC3A2, and direct regulation of c-Myc, are crucial pathways in NK cell metabolism [44]. c-Myc is involved in regulating the expression of glucose transporters and glycolytic enzymes. Additionally, sterol regulatory element-binding protein (SREBP), a transcription factor, regulates glycolysis and oxidative

phosphorylation in NK cells. Tumor cells triggering PPARa/ signaling by increasing lipid metabolism and fatty acid exposure inhibit SREBP, diminishing cytokine production and NK cell cytotoxic activity [45].

Currently, addressing hypoxia involves controlling HIF levels. Bortezomib, the first discovered proteasome inhibitor, can inhibit HIF-1 transcriptional activity [46]. The mTOR signaling inhibitor temsirolimus has demonstrated the ability to block HIF-1a translation [47]. Normalizing tumor vasculature can enhance the response to hypoxia, as hypoxic tumors overexpress proangiogenic proteins like VEGF, resulting in abnormal vascular networks that promote immune escape and reduce immunotherapy efficacy. Administering anti-angiogenic drugs targeting VEGF or its receptors can normalize blood vessels. However, monotherapy with anti-angiogenic drugs may exacerbate tumor hypoxia, leading to treatment resistance and worsened patient outcome [48]. Combining immunotherapy with vascular normalization appears promising for improving patient outcomes. Studies by Michelet’s group suggest that targeting tumor therapy with rapamycin, inhibiting mTORC1 and glycolysis, may effectively limit tumor growth by restraining Warburg’s glycolytic metabolism in tumor cells [49].

NKG2D, encoded by the Klrk1 gene, serves as an activating receptor on the surface of NK cells. In humans, NKG2D forms a complex with the adapter protein DAP10, transmitting downstream signals through the charge in its transmembrane domain. DAP10, also known as KAP10, is a small transmembrane adapter protein with a YINM sequence in its cytoplasmic tail [50]. It binds the p85 subunit of PI3K and Grb2, closely associated with Vav1. NKG2D activates NK cells and delivers co-stimulatory signals to CD8 + T cells [51]. The molecular structure of NKG2D allows it to bind many structurally distinct MHC I-like ligands (NKG2DLs) [52]. The expression of NKG2DLs is upregulated during malignant transformation, oxidative stress, and viral infection. MICA/B, mainly MICA, MICB, and ULBP1-6 in humans [53], is found in gastrointestinal epithelial tumors, as well as lung, breast, kidney, ovary, and prostate tumors [54]. MICA/B contains and domains, which are encoded by genes in MHC with up to homology. It is commonly found in gastrointestinal epithelial tumors [55], and can also be found in lung, breast, kidney, ovary, and prostate tumor [56]. ULBP1-6 contain a1 and a2 domains and can be transmembrane-linked (ULBP4 and 5), glycosylphosphatidylinositol (GPI)-linked (ULBP1-3, 6) or both (ULBP2 and 5) [51]. Studies have demonstrated that the activation signal mediated by NKG2D binding to ligand can bypass the inhibitory receptor-induced signal to activate NK cells [57]. NKG2D is a multifunctional receptor that can directly bind to a variety of ligand molecule families expressed on the surface of target cells without antigen presentation, thereby activating or co-stimulating immune effectors [58]. This activation is followed by the release of cytolytic proteins like perforin and granzymes, which mediate killing in tumor cells. The NKG2D-mediated immune response plays a crucial role in tumor surveillance, and the NKG2D pathway can regulate tumor initiation and progression, which is essential for ensuring the efficacy of CAR-NK in solid tumors [53].

The expression of NKG2D in human NK cells can be upregulated by IL-15, IL-10, IL-12, TNF-a and IFN-a [59]. The downregulation of NKG2D may be due to the production of soluble NKG2DLs by tumor cells. Many results suggest that high concentrations of soluble NKG2DLs may inhibit tumor immunity and NK cell activity through downregulation of NKG2D expression or proteolytic shedding of MICA/B. The upregulation of soluble NKG2DLs expression is associated with breast cancer Lymph node metastasis is associated with poor prognosis in solid tumors such
as melanoma, neuroblastoma, prostate cancer, and kidney cancer [56, 60-63]. In addition to soluble NKG2DLs, cytokines in the TME are also involved in NKG2D-mediated tumor escape mechanisms. The pro-inflammatory cytokines IFN- and TGF- downregulate the expression of MICA and ULBP and inhibit NKG2D-mediated NK cell activation [64-66].

It should be noted that recent studies have found that NKG2D can enhance NK cell-mediated ADCC in a synergistic manner, which can increase the anti-tumor activity of CAR-NK and serve as a complement to the way CAR kills solid tumor [67]. Guo et al. [68] designed chimeric PD1-NKG2D receptors containing the NKG2D hinge region and 4-1BB co-stimulatory domain, showed stable surface expression, and mediated the in vitro cytotoxicity of NK92 cells against various tumor cells. Professor Xiao [69] constructed CAR-NK by fusing the extracellular domain of NK cell receptor NKG2D with DAP12, having a significant effect on mice with solid tumor. Three patients with metastatic colorectal cancer were subsequently treated with local infusions of CAR-NK cells. Reduced ascitic fluid production and a significant reduction in the number of tumor cells in ascites samples were observed in the first two patients treated with low-dose CAR-NK cell intraperitoneal infusions. Rapid tumor regression in the hepatic region was observed by Doppler ultrasound imaging and complete metabolic response in the treated liver lesions was confirmed by positron emission tomography (PET)-computed tomography (CT) scans.

KIR is an Ig-like receptor molecule that can bind to certain HLA-I class molecules, serving as a key regulator of NK cell function. It is categorized into KIR2D (two domains) and KIR3D (three domains) based on the number of extracellular Ig-like domains. In KIR2D/3D, the cytoplasmic region containing the ITIM motif has a longer amino acid sequence, known as KLR2DL/3DL, acting as an NK cell inhibitory receptor. The other part of the cytoplasmic region containing the ITAM motif has a shorter amino acid sequence, known as KIR2DS/3DS. The transmembrane region contains a positively charged lysine, forming an NK cell killing activated receptor when combined with negatively charged aspartic acid in the transmembrane region and the DAP-12 homodimer containing ITAM in the cytoplasmic region [70]. NK cells undergo trogocytosis, a biological process involving the gnawing off of a part of the cell membrane and its surface molecules from antigenpresenting cells through the immune synapse. This process allows NK cells to transfer cell membrane surface substances from target cells to effector cells. CAR activation in NK cells facilitates the transfer of CAR cognate antigens from tumors to NK cells. However, this can lead to a decrease in tumor antigen density, weakening CAR-NK cell binding to targets. Additionally, it may induce self-recognition, sustained CAR-mediated binding, selfkilling, and low reactivity in NK cells expressing granulocyte antigens (NKTROG+) [71, 72]. This phenomenon can be counteracted by a dual-CAR system that combines an activating CAR directed against a cognate tumor antigen and an NK selfrecognition inhibitory CAR that delivers a “don’t kill me” signal to NK cells upon contact with TROG+. This system prevents granulocyte antigen-mediated cannibalism while preserving activating CAR signaling against tumor antigens and leads to enhanced CAR-NK cell activity. Li [73] reported aCAR-mediated exocytosis, which contributed to the reduction of target antigen density, as well as NK cell cannibalism and hyporesponsiveness. They used an antigen-specific inhibitory KIR-based receptor (iCAR) that successfully inhibited aCAR-mediated TROG antigen-induced NK cell cannibalism, preventing aCAR NK cells from producing TROG antigen-induced immunomodulatory consequences while retaining the ability to express the same antigen key effector functions of tumor cells. This dynamically modulated AI-CAR signaling may find useful applications to improve the in vivo persistence and therapeutic efficacy of a range of adoptive NK cell therapies.

Human DNAM-1 (CD226) is a type I transmembrane glycoprotein, approximately 65 kilodaltons (kDa) in size. It consists of an 18 amino acid (aa) leader sequence, a 230 amino acid extracellular domain with two Ig-like C2 group domains, a 28 amino acid transmembrane domain, and a 60 amino acid cytoplasmic domain containing two residues (Tyr322 and Ser329) [74]. DNAM-1 serves as an activating receptor that triggers NK cell-mediated cytotoxicity upon interaction with the ligands CD155 and CD112 [75]. Notably, the PVR/CD155 and Nectin-2/CD112 ligands of DNAM-1 are mainly expressed on solid tumor cells, especially those of epithelial and neuronal orig [76, 77], and in normal tissue cells very little expression. Focaccetti’s team [78] found that FL-DNAM-1CD3z engineered NK cells combined with immunomodulatory drugs such as Nutlin3a could represent a new immunotherapeutic approach for the treatment of p53 dysfunctional neuroblastoma. Given that DNAM-1 ligands are expressed in many solid tumor [79], this treatment approach proves effective not only for neuroblastoma but also for colorectal cancer, breast cancer, ovarian cancer, lung cancer, pancreatic cancer, and other solid tumors exhibiting p53 dysfunction [80].

NCR is a group of surface activated receptors on NK cells, including NKp46 (NCR1, CD335), NKp44 (NCR2, CD336), and NKp30 (NCR3, CD337). All three are members of the immunoglobulin superfamily (IgSF), but have no homology with each other [81] and typically play a killing role when KIRs lose their ability to recognize themselves. NKp46 and NKp30 are expressed on the surface of all NK cells. The extracellular region of NKp46 contains two Ig-like domains, and the extracellular region of NKp30 has only one V-type domain. The cytoplasmic regions of NKp46 and NKp30 are relatively short, and the transmembrane regions both contain positively charged arginine. When they interact with the transmembrane region containing negatively charged Aspartic acid, the cytoplasmic region containing

ITAM motif CD3 When homologous dimers are not covalently bound, they are able to transduce activation signals. In contrast, NKp44 is exclusively expressed on the surface of activated NK cells, serving as a specific marker. Its extracellular region features a single V-type domain. Unlike NKp46 and NKp30, the cytoplasmic region of NKp44 lacks the ITAM motif. However, its transmembrane region contains positively charged lysine, allowing non-covalent binding with negatively charged aspartic acid in the transmembrane region and the DAP12 homodimer containing the ITAM motif in the cytoplasmic region, thereby transmitting activation signals. Studies have shown that NKp30 downregulation is associated with neuroblastoma metastasis and chemotherapy resistance [82]. At present, there is a lack of data on the application of NCR in CAR-NK targeting solid tumor, which requires further verification (Fig. 2).

Transforming growth factor- (transforming growth factor- , TGF ) belongs to a group of newly discovered TGF- superfamily that regulates cell growth and differentiation. In addition to TGF- , this family also includes activins, inhibitors, Mullerian inhibitor substances (MIS) and bone morphogenetic proteins (BMPs) [83]. TGF- It is mainly produced by tumor cells, regulatory T cells (Tregs) and myelogenous Sexual inhibition cells (MDSCs) in TME. It is closely related to the poor prognosis of lung cancer, pancreatic cancer, gastric cancer, colorectal cancer, breast cancer and liver cancer, and almost all the immune system cells express TGF- Receptors (TGF- R) [84-89]. TGF- is secreted as an inactive dimer that requires processing by a different mechanism for activation. Active TGF- binds to a tetrameric receptor consisting of two TGF RI chains and two TGF- RII chains. Upon binding to TGF- , type II receptors phosphorylate type I receptors, which then propagate the signal through phosphorylation of the transcription factor

Smad2/3 [90]. This complex then moves to the nucleus, binds to Smad4 and other cofactors and mediates a decrease in NK cytotoxicity.

TGF- inhibits NK cell activation and function by downregulating NK cell-activating receptors like NKG2D, DNAM1, and NKp30, as well as metabolic pathways such as mTOR/c-Myc. It directly impairs NK cell function by downregulating the activation of NK receptors, particularly NKG2D and NKp30, or inhibiting the mTOR pathway, aiding tumor cell immune evasion [91]. TGF- production increases during tumor growth and malignant progression, and selectively suppresses the expression of MICA, ULBP2, and ULBP4, while MICB, ULBP1, and ULBP3 are unaffected [65]. Highly enriched in the solid tumor microenvironment, TGF- has a significant immunosuppressive effect. It enhances the expression of CXCR3 and CXCR4 while inhibiting the expression of CX3CR1 in human NK cells, hindering NK cell egress from the bone marrow and inhibiting NK cell maturation [92]. Cells express a variety of antioxidant proteins, such as superoxide dismutase (SOD) and catalase, which can convert reactive oxygen species (ROS) into water and oxygen. ROS can be produced under steady-state conditions and participate in various biological processes such as redox signaling pathways and apoptosis. Excessive ROS can damage various cellular components such as DNA and protein of NK cells. Excess ROS may also lead to abnormal NK cell signaling through oxidative modification of redox-sensitive signaling proteins such as MAPK, HIF, or NFkB. Michaeloudes et al. [93] discovered that TGF- can also inhibit NK cell activity by stimulating ROS generation. The present study showed that cotransduction of NK cells with B7H3 CAR and transforming growth factor- dominant negative receptor (DNR) preserved cytolytic function in the presence of exogenous transforming growth factor- . This novel DNR and CAR co-expression strategy may be a promising approach to treat refractory CNS tumors like GBM [94].

Interleukins are pivotal mediators of inflammation, governing various aspects of NK cell biology. NK cells express cytokine receptors early in their development [95] and require signaling
through a common gamma ( ) chain for development, homeostasis and functionalization. The chain, a 40 kDa type 1 transmembrane glycoprotein, is the signaling subunit of interleukins. Both IL-2 and IL-15 can signal through a complex consisting of and IL-2R chains [96], activating STAT1 and STAT5 through JAK-1 and JAK-3, respectively [97]. Activated NK cells express IL-2Ra (CD25), which significantly enhances their affinity to IL-2, promoting NK cell proliferation and the production of lytic molecules such as perforin and granzyme B [98]. Transpresentation of IL-15 from IL-15Ra to IL-15R complexes on NK cells initiates cell proliferation and transcriptional reprogramming. The IL-12 heterodimeric cytokine family includes IL-12, IL-23, IL-27 and IL-35. IL-12, composed of p40 and p35 a and subunits, binds to the IL-12 receptor (IL-12R) complex IL-12R IL-12R , and IL-12R signaling is regulated by tyrosine kinase-2/JAK- 2 transmits and activates the transcriptional regulator STAT4 [99]. Li [100] and Silvestre [101] demonstrated that the fourth- generation CD19-targeted CAR (CAR.19) co-expressing IL-15 or IL-15/IL-15Ra significantly enhanced NK-92 cell proliferation, proinflammatory cytokine secretion, and cytotoxic activity against cancer cell lines in vitro and in a xenograft mouse model.

Current data support the positive role of interleukins in CAR-NK cell therapy for solid tumors. Pérez-Martínez [102] found that allogeneic IL-15-stimulated CAR-NK cells may be feasible and safe in children with refractory solid tumors. Studies have demonstrated that matching CAR-NK cells with tumor-secreted chemokines (such as IL-8 and receptor CXCR1) enhances tumor migration and invasion [103]. NK cells, lacking peroxiredoxin-1 (PRDX1), can benefit from IL15, which upregulates PRDX1 expression and protects NK cell function. Klopotowska et al. [104] engineered PRDX1-overexpressing PD-L1-CAR NK cells, displaying potent antitumor activity against breast cancer cells under oxidative stress (Fig. 3).

Exosomes are vesicles (EVs) ( ) that contain complex RNA and proteins. In 1987, Johnstone et al. [105] discovered

vesicles released by reticulocytes during in vitro culturing, coining the term ‘exosomes’. A variety of cells can secrete exosomes under normal and pathological conditions, primarily derived from multivesicular bodies formed by lysosomal particle invagination. These vesicles are released into the extracellular matrix after the fusion of the multivesicle’s outer membrane with the cell membrane. All cultured cell types secrete exosomes, which can eventually enter the circulation, entering blood, saliva, urine, cerebrospinal fluid, and breast milk. Exosomes carry diverse proteins, including membrane transport-related proteins (RAB GTPases, annexins, Flillins, ALIX, and TSG101), tetrapeptides (CD9, CD63, CD81, HSP60, and HSP90), nucleic acids (mRNA, miRNA, IncRNA, circRNA), and lipids (sphingomyelin, phosphatidylserine, phosphatidylinositol, phosphatidic acid, ceramide, and cholesterol) [106]. They mediate cell communication and genetic information transmission, playing a crucial role in disease diagnosis and prognosis.

Tumor-derived exosomes (TDEs) contain diverse molecular components, including lipids, membrane-associated proteins, long non-coding RNAs (IncRNAs), and miRNAs, which are involved in several processes of tumor formation and invasion, including angiogenesis, proliferation, and Growth, metastasis and immune escape. Numerous studies indicate that TDEs hinder anti-tumor immunity by impairing the function of dendritic cells (DC), NK cells, and T cells. Among these, NK cells, considered the first line of defense against malignant cell transformation, can have their function inhibited by tumor cells through various mechanisms, with tumor exosomes playing a key role in NK cell dysfunction. TDEs can be taken up by NK cells through various mechanisms, including plasma membrane fusion, endocytosis, phagocytosis, micropinocytosis, and lipid raft-mediated internalization. They induce downstream signaling through receptor-ligand interactions, downregulating NK cell antitumor activity [107]. Tumor exosomes also interfere with NK cell recruitment, migration, proliferation, survival, cytolytic activity, cytokine production, and receptor expression [108]. There is evidence that exosomes from clear cell renal cell carcinoma evade innate immune surveillance by activating the TGF- SMAD pathway, thereby inhibiting natural killer cell function [109]. Zhao [110] demonstrated that exosomes
from pancreatic ductal carcinoma could downregulate the expression of NK cell activating receptors, leading to NK cell dysfunction. Interestingly, several studies [111, 112] demonstrated that IL-15 could reverse the suppression of NKG2D expression by tumor exosomes and protect NK cells from the inhibitory effect of exosome-associated TGF- . At present, it has been confirmed that CAR-T EVs can maintain the activity of CAR-T cells, and has a positive effect on hematological tumors and solid tumor [113]. CAR-NK is expected to have a similar effect, waiting for further research.

The exploration of CAR-NK therapy in solid tumors is acknowledged to be in its early stages, with an increasing number of clinical studies being conducted each year. While CAR-NK cells possess unique advantages, they are not without challenges. The hurdles include issues related to cell persistence, overcoming the immunosuppressive microenvironment, and optimizing transduction efficiency, among others. This recognition sets the stage for ongoing research and development to address these challenges and further enhance the effectiveness of CAR-NK therapy in the treatment of solid tumors (Fig. 4).

Recently, gratifying results have been obtained regarding the inhibitory effect of CAR-NK on glioblastoma. The research by Wang et al. [114] indicates that that the development of multifunctional genetically engineered human NK (CD73. mCAR pNK ) cells can generate effective anti GBM activity due to the tumor heterogeneity and multiple immunosuppressive characteristics of GBM TME. Targeting autophagy as an immunomodulator promotes the homing of effector CAR-NK cells to GBM tumor sites, while reprogramming the GBM TME to be more sensitive to CARbased targeting. Zhang [115] demonstrated that growth factor receptor tyrosine kinase ErbB2 (HER-2)-specific NK-92/5.28.z (second-generation CAR) Potent and selective antitumor activity against GBM cells in vitro and in orthotopic GBM xenograft models, as well as cure and induction of endogenous antitumor

immunity after NK-92/5.28.z treatment in immunocompetent mice. Murakami [116] designed a novel CAR-NK cell line (CAR-KHYG-1, second-generation CAR) specifically for tumors expressing epidermal growth factor receptor variant III (EGFRvIII). Results showed that EvCAR-KHYG-1 inhibits GBM cell growth through apoptosis in a specific manner expressing EGFRvIII. Chaudhry94 co-transduced CB-derived NK cells with B7-H3 CAR and TGF- dominant-negative receptor (DNR). This second-generation CAR showed potent cytolytic activity against GBM cells in vitro. Moreover, human leukocyte antigen G (HLA-G), identified as an immune checkpoint protein (ICP), is newly expressed in a majority of tumor cells. JAN [117] found that HLA-G CAR-transduced NK cells exhibited robust cytolytic effects against breast, brain, pancreatic, and ovarian cancer cells in vitro. Furthermore, these cells demonstrated a significant reduction in xenograft tumor growth in an orthotopic mouse model, leading to prolonged median survival. This approach holds promise for future applications in CAR-NK therapy for a range of solid tumors.

Lu [118] developed a chimeric co-stimulatory transition receptor (CCCR) consisting of PD1 extracellular domain, NKG2D transmembrane and cytoplasmic domain, and NKG2D cytoplasmic domain . This receptor has the capacity to convert negative PD1 signals into activation signals, effectively reversing the immunosuppressive effect of PD1. In a lung cancer xenograft model, CCCR-NK92 cells(third generation CAR) demonstrated significant inhibition of tumor growth. It’s noteworthy that in clinical application. Dr. Zhang et al. [119] reported that this regimen may cause the occurrence of cytokine release syndrome (CRS), and Clinicians should be vigilant regarding this side effect during CAR-NK treatment.

For non-small cell lung cancer, Liu [120] engineered DLL3specific NK-92 cells and explored their potential in treating SCLC. Co-culture of the DLL3 SCLC cell line with DLL3-CAR NK-92 cells exhibited significant in vitro cytotoxicity and cytokine production. DLL3-CAR NK-92 cells induce tumor regression in an H446-derived lung metastatic tumor model at a favorable safety threshold. Potent antitumor activity of DLL3-CAR NK-92 cells was observed in a subcutaneous tumor model of SCLC. Furthermore, distinct tumor-infiltrating DLL3-CAR NK-92 cells were detected in DLL3 SCLC xenografts. In a study by Yang [121], NK-92MI cells carrying an anti-B7-H3 CAR(second-generation CAR) effectively restricted the growth of transplanted non-small cell lung cancer in mice, significantly prolonging the survival time compared to unmodified NK-92MI cells. The secretion of perforin/granzyme B and the expression of CD107a were notably elevated in anti-B7-H3 CAR-NK-92MI cells. Chambers et al. [122] designed a CAR-NK targeting the CD73 adenosine axis by blocking CD73 enzymatic activity. This approach not only impairs adenosinergic metabolism driven by hypoxic ATP uptake by cancer cells in an NSCLC model but also induces tumor stasis. It promotes NK cell infiltration into CD73 tumors and enhances intratumoral activation.

Epithelial cell adhesion molecule (EpCAM), a pan-epithelial differentiation antigen, is expressed across various cancers and possesses endogenous oncogenic potential. Effector cells coexpressing CAR and IL-15(forth-generation CAR) exhibit effectiveness without exogenous cytokines, enabling continued proliferation under EpCAM conditions. These cells demonstrate highly selective killing activity against EpCAM-expressing breast cancer cells. This strategy facilitates rapid isolation and sustained expansion of relocated NK cells, enhancing their potential clinical utility [123]. For HER-2+ breast cancer, data have shown that the expression of HER-2 CAR in NK cells from healthy donors and breast cancer patients can effectively enhance its anti-tumor function against various HER-2-expressing cancer cells, and
compared with MHC class I expression is irrelevant. Importantly, HER-2 CAR-NK cells exhibit enhanced cytotoxicity to tumor targets compared to donor-matched HER-2 CAR-T cells. Notably, HER-2 CAR-NK cells maintain high cytotoxic function in the presence of immunosuppressive factors enriched in solid tumors, suggesting their efficiency and safety for solid tumor immunotherapy [124-128].

In the case of triple-negative breast (TNBC) cancer, Liu et al. [129] showed that EGFR-CAR-NK cell(second-generation CAR) therapy may be a promising strategy for TNBC patients. Neither traditional cancer therapy nor conventional immunotherapy is effective for TNBC patients. EGFR-specific CAR-NK cells specifically trigger the lysis of TNBC cells in vitro. Or it can be used to treat TNBC patients showing enhanced expression of EGFR. Chen’s group [130] also demonstrated that EGFR-CAR NK-92 cells(secondgeneration CAR) increased cytolysis and IFN production in breast cancer cell lines MDA-MB-231, MDA-MB-468, and MCF-7 (in vitro), and reduced tumor growth in tumor-bearing mice (in vivo). Hu [131] utilized a chimeric antigen receptor (CAR) approach, developed and tested tissue factor (TF)-CAR-NK(second-generation CAR), which co-expressed CD16, Fc receptor (FcyllI) mediated antibody-dependent cytotoxicity (ADCC). TF-CAR-NK cells can kill TNBC cells, and their efficacy can be enhanced with L-ICON ADCC in vitro. Furthermore, TF-CAR-NK cells were effective for the in vivo treatment of TNBC in both cell lines and patient tumor-derived xenograft mouse models. This study establishes evidence for the concept of targeting TF in CAR-NK immunotherapy as a novel target for effective treatment of TNBC.

Cao [132] engineered MSLN and CD19-targeted CAR NK-92 (MSLN and CD19-CAR NK) cells. The results showed that MSLN-CAR NK cells could specifically kill MSLN+ gastric cancer cells (N87, MKN28 and AGS) in vitro, but had no effect on MSLN- cells (Huh-7). It was also observed that MSLN-CAR NK cells could effectively eliminate gastric cancer cells in subcutaneous and intraperitoneal tumor models. They also significantly prolong the survival of intraperitoneal tumor-bearing mice. More importantly, a strong antitumor effect and considerable NK cell infiltration were observed in MSLN-CAR-NK cell-treated patient-derived xenografts, which further demonstrated the therapeutic efficacy of MSLN-CAR-NK cell therapy in gastric cancer.

Xiao et al. [69] constructed NKG2D RNA CAR(second-generation CAR) by using the RNA electroporation method that provides transient expression of CAR, which significantly enhanced the cytolytic activity of NK cells against several solid tumor cell lines in vitro. Subsequently, three patients with metastatic colorectal cancer were treated with local infusion of NKG2D RNA-CAR NK cells. Reduced ascitic fluid production and a significant reduction in the number of tumor cells in ascitic fluid samples were observed in the first two patients receiving intraperitoneal infusion of low doses of CAR-NK cells. The third patient with liver tumor metastases received ultrasound-guided percutaneous injection followed by intraperitoneal infusion of CAR-NK cells. Rapid tumor regression in the liver region was observed by Doppler ultrasound imaging. Zhang et al. [133] constructed EpCAM-specific second-generation CAR and transduced them into NK-92 cells using lentiviral vectors. The resulting CAR-NK-92 cells could specifically recognize EpCAM-positive colorectal cancer cells, release cytokines (including IFN- , perforin, and granzyme B), and exhibit specific cytotoxicity in vitro. The anticarcinoembryonic antigen (CEA)-CAR NK-92MI constructed by Shiozawa et al. [134] had significantly increased cytotoxicity against CEA-positive colon cancer cell lines.

Liu [135] constructed a CAR structure targeting and recognizing c-MET antigen using lentivirus infection and demonstrated the
specificity and effectiveness of c-MET targeting CAR-NK cell immunotherapy in the treatment of human liver cancer in vitro. Recently, Chen130 constructed GPC3-CAR-NK cells based on an affinity-enhanced antibody targeting GPC3 for the treatment of liver cancer patients. L3C7c-Fc was used to reverse the high level of soluble programmed death ligand 1 (sPD-L1) in HCC patients, enhancing the effect of this CAR-NK cell and providing experimental evidence for the development of subsequent liver cancer immunotherapy strategies.

For pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC), Lee et al. [136] found that folate receptor a (FRa) and death receptor 4 (DR4) were significantly overexpressed in PDAC cells. Co-expression of FRa and DR4/5 is associated with poorer clinical outcomes and is a potential target for biomolecular therapy. They reprogrammed allogeneic FRa CAR-NK cells to carry apoptosis-inducing ligands and redirected them to FRa and initiated DR45-mediated cancerselective cell death in FRa and DR4/5-positive tumors. As a result, loading NK cells with redirected cytotoxic ligands led to significantly enhanced tumor-selective apoptosis. Da’s team [137] constructed anti-mesothelin (MSLN) CAR-NK-92 cells(se-cond-generation CAR) through a transposon system, and verified that they showed more effective killing activity against pancreatic cancer cells. The anti-pancreatic cancer effect was further enhanced after co-culture with STING agonist cGAMP. Prostate stem cell antigen (PSCA)-CAR_s15 NK cells engineered by Teng et al. [138] exhibited significant tumor suppression.

At present, there are limited studies on the application of CAR-NK in urological tumors, and it remains a relatively underexplored field. Tumor necrosis factor-a-inducible protein 8 -like 2 (TIPE2), encoded by TNFAIP8L2, is a newly discovered negative regulator of innate and acquired immunity and plays a key role in maintaining immune homeostasis. Studies have shown that the expression of TNFAIP8L2 is related to the poor prognosis of brain low-grade glioma (LGG), renal chromophobe cell carcinoma (chromophobe renal cell carcinoma) and renal clear cell carcinoma (Kidney renal clear cell carcinoma), and may become a CAR-NK Targets for the treatment of renal cancer [139]. Zhang [140] constructed the epidermal growth factor (EGFR-)-specific thirdgeneration CAR through lentivirus. The specific killing ability of CAR-modified NK-92 cells (CAR-NK-92) on renal cell carcinoma (RCC) cell lines was confirmed in vitro. The synergistic effect of cabozantinib and EGFR-specific CAR-NK-92 cells was studied in vitro and in vivo, representing a breakthrough in CAR-NK therapy for kidney cancer.

The effectiveness of CAR-T in the treatment of hematological malignancies has been verified, but CAR-T cells will suffer from loss of target antigens, tumor heterogeneity, and immunosuppressive TME. Ineffective against solid tumors. NK cells also play an important role in the anti-tumor field, so the safer and more efficient CAR-NK have gradually attracted everyone’s attention and pursuit. NK cells modified by CAR structure can also theoretically efficiently recognize tumor cells and kill tumor cells by releasing killing mediators and inducing apoptosis of target cells. Compared with CAR-T in the treatment of solid tumors, first of all, CAR-NK is safer. Recently, CAR-NK immunotherapy has been confirmed in multiple clinical settings. Due to the limited lifetime of CAR-NK cells in circulation, the risk of side effects on normal tissues and graft-versus-host disease (GVHD) is relatively low [141]. Secondly, CAR-NK cells have dual anti-tumor activities. In addition to killing tumor target cells in the state of chimeric antigen receptors [142], CAR-NK cells themselves have anti-cancer effects and can be activated independently. NK cells without chimeric
antigen receptors can kill cancer cells directly by releasing Perforin-1 and Granzyme or by death receptors, or by secreting cytokines and chemokines to activate immune cells such as cells and cells, and can also kill cancer cells by antibody dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC), which can better fight against tumor heterogeneity [143]. Thirdly, the low risk of rejection of NK cells allows CAR-NK cells to be generated from a variety of sources, including NK92 cell lines, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), cord blood (UCB), and induced pluripotent stem cells (iPSCs) [144]. Using advanced genetic engineering technology, NK cells can co-express other molecules with CARs, including cytokines, antibodies, proteases, etc., which can promote NK cell proliferation, transport and penetration into tumors. Fourthly, modification of NK cell signaling pathways (activation of NKG2D via DAP10 [145], knockdown of TIGIT downregulation of inhibitory NKG2A receptors [26]) can enhance NK cell cytotoxicity. Fifth, it can be modified against the suppressive TME: NK cells transduced with cord blood-derived TGF- receptor II (DNRII) can resist the inhibitory effect of TGF- in the TME, retaining its killing ability and Interferon secretion [146]. Alternatively, the inhibitory PD1 signaling in the TME is converted to an activating one by chimeric co-stimulatory switching receptors (CCCRs) including the extracellular domain of PD1, the transmembrane and cytoplasmic domains of NKG2D, and the cytoplasmic domain 4-1BB of NKG2D signal, thereby reversing the immunosuppressive effect of PD1 [118]. Ng et al. [103]. enhanced the response of CAR-NK cells to tumor-secreted chemokines (IL-8 receptor CXCR1) by matching CAR-NK cells Inhibition of tumor migration and invasion.

The data in Table 1 is from the US Clinical Trials Registry (ClinicalTrials.gov). At present, there are 25 clinical trials of CAR-NK applied to solid tumors, one of which has published the results: NCT03415100 confirmed the strong lysis of NKG2D ligand-positive HCT116 human colorectal cancer cells by CAR-NK cells. Cell viability in the final product prior to infusion was greater than . No serious adverse reactions (grade adverse events) were found in any of the three patients. Only grade 1 cytokine release syndrome was observed, and no patient developed neurologic symptoms. The most common treatment-related adverse events reported included fever, fatigue, and anorexia. In order to truly apply CAR-NK therapy to clinical treatment in the future, we need to verify the basic experimental results of CAR-NK in different solid tumors introduced above in clinical trials, and make specific recommendations for different TME in the human body. Specific optimization, while also collecting side effects that occur during treatment. With the progress of these clinical trials, it is believed that more data will prove the clinical application potential of CARNK in solid tumors, and provide new treatment options for advanced complex solid tumors.

The clinical application of CAR-NK against solid tumors is largely influenced by TME. Hypoxia, acidic environment, high adenosine environment, NK cell surface receptors, TGF- , IL, and exosomes all affect the anti-tumor activity of CAR-NK. It can inhibit tumor cell immune escape by modifying the intrinsic pathway, combating tumor heterogeneity, antagonizing inhibitory TME, and improving the ability of CAR-NK cells to infiltrate tumor tissue. Despite ongoing clinical trials, there remains a limited understanding of the mechanisms underlying CAR-NK efficacy in solid tumors, particularly in liver cancer, cholangiocarcinoma, and urological tumors. While some trials are underway, many are in the preliminary stage with small sample sizes, and limitations are relatively large. The true clinical application of CAR-NK therapy requires in-depth research and experimentation.

In the 21st century, the incidence of tumors has been steadily increasing, yet our understanding of them remains limited. Effective treatments for advanced solid tumors are lacking,

leading to a low survival rate for patients. Immunotherapy, particularly CAR-NK therapy, holds promise for patients with advanced malignant solid tumors. Further exploration is needed to enhance the efficacy of CAR-NK therapy, ultimately maximizing the survival rate and improving the quality of life for these patients.

WW contributed to the manuscript and figures. YL and ZH modified the grammar and format. ZS contributed to conception and design. SL, MJ, BZ, MD, WW, XM and LL collected relevant information. All authors read and approved the final manuscript.

This work was financially supported by the 2022 joint construction project of Henan Medical Science and technology breakthrough plan (Grant No. LHGJ20220313) and 2023 Young Elite Scientists Sponsorship Program by Henan Association for Science and Technology (Grant No. 2023HYTP030).

The authors declare no competing interests.

Correspondence and requests for materials should be addressed to Wenkang Wang, Zhenqiang Sun or Xin Ge.

Reprints and permission information is available at http://www.nature.com/ reprints

Publisher’s note Springer Nature remains neutral with regard to jurisdictional claims in published maps and institutional affiliations.

Open Access This article is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License, which permits use, sharing, adaptation, distribution and reproduction in any medium or format, as long as you give appropriate credit to the original author(s) and the source, provide a link to the Creative Commons license, and indicate if changes were made. The images or other third party material in this article are included in the article’s Creative Commons license, unless indicated otherwise in a credit line to the material. If material is not included in the article’s Creative Commons license and your intended use is not permitted by statutory regulation or exceeds the permitted use, you will need to obtain permission directly from the copyright holder. To view a copy of this license, visit http:// creativecommons.org/licenses/by/4.0/.
© The Author(s) 2024