DOI: https://doi.org/10.1007/s00604-026-07866-2
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/41652079
تاريخ النشر: 2026-02-07
المؤلف: Canan Özyurt وآخرون
الموضوع الرئيسي: تقنيات الاستشعار الحيوي والتحليل الحيوي المتقدمة
نظرة عامة
تسلط الأبحاث الضوء على الأهمية الحرجة لبكتيريا Acinetobacter baumannii، وهي مسببة أمراض مقاومة متعددة للأدوية مصنفة كـ “مسبب أمراض ذو أولوية حرجة” من قبل منظمة الصحة العالمية. تنتشر عدوى A. baumannii على مستوى العالم، مما يؤدي إلى معدلات مرضية ووفاة كبيرة وأعباء على الرعاية الصحية بسبب فترات الإقامة الطويلة في المستشفى وأنظمة العلاج المعقدة. غالبًا ما تكون الطرق التقليدية للكشف عن A. baumannii، مثل الزراعة والاختبارات الكيميائية الحيوية، غير كافية بسبب طبيعتها المستغرقة للوقت وعدم قدرتها على تمييزها عن الأنواع ذات الصلة الوثيقة. بالمقابل، حسنت التقنيات الجزيئية، وخاصة الاختبارات المعتمدة على PCR والتضخيم المتساوي الحرارة، الحساسية والخصوصية في تحديد هذه البكتيريا.
تقدم الدراسة أول مجموعة من الأبتاميرات المستهدفة لبروتياز A. baumannii الإفرازي SPSFQ، والتي تم دمجها بنجاح في جهاز استشعار الطيف الكهربائي (EIS). أظهرت الأبتاميرات تقاربًا عاليًا لـ SPSFQ، مع ثوابت تفكك نانوية ($K_d$)، وعرض جهاز الاستشعار نطاقًا ديناميكيًا واسعًا (1.0-10,000 fg/mL) مع حدود كشف منخفضة (LOD = 5.44 fg/mL) وكمية (LOQ = 18.15 fg/mL). أشارت اختبارات الانتقائية إلى تفاعل عرضي ضئيل، مما يؤكد على ارتباط الأبتامير القوي بـ SPSFQ. يمثل هذا الجهاز أداة واعدة للكشف المبكر ومراقبة A. baumannii في البيئات السريرية، مع دراسات مستقبلية تهدف إلى إقامة علاقات كمية بين مستويات SPSFQ وعدد الخلايا البكتيرية لتعزيز فائدته التشخيصية.
مقدمة
تناقش مقدمة ورقة البحث أهمية *Acinetobacter baumannii* (A. baumannii) كمسبب رئيسي للأمراض في الرعاية الصحية، خاصة بسبب سلالاتها المقاومة متعددة الأدوية التي تعقد التشخيص والعلاج. تتطلب طرق الكشف الجزيئية التقليدية، على الرغم من فعاليتها، غالبًا معدات متخصصة، مما يحد من استخدامها في البيئات ذات الموارد المحدودة. تبرز الورقة إمكانيات أجهزة الاستشعار الحيوية، وخاصة الأنواع البصرية والكيميائية الكهربائية، للكشف الحساس والدقيق عن A. baumannii، مع التأكيد على الحاجة إلى أساليب مبتكرة لتحسين القدرات التشخيصية.
تركز الدراسة على الكشف عن SPSFQ، وهو بروتياز سيرين شبيه بالسوبتيليسين تم تحديده حديثًا من A. baumannii، والذي يعمل كعلامة حيوية محتملة للعدوى. يذكر المؤلفون تطوير أبتاميرات DNA أحادية السلسلة (ssDNA) محددة لـ SPSFQ باستخدام طريقة تطور الروابط بواسطة إثراء أسي (MB-SELEX) المعتمدة على الخرز المغناطيسي. تم تحديد تسلسلين من الأبتاميرات، Apt1 وApt2، مع ثوابت تفكك (Kd) تبلغ 42.10 ± 6.7 نانومتر و26.98 ± 1.35 نانومتر، على التوالي. ثم تم تصميم جهاز استشعار كهربائي يعتمد على الطيف الكهربائي (EIS) باستخدام تسلسل Apt2، محققًا حساسية عالية للكشف عن SPSFQ عند مستوى الفيمتوغرام لكل ملليلتر. تقدم الدراسة جهاز استشعار جديد يستخدم أبتاميرات موسومة بالثيول ويقيم أدائه للكشف عن SPSFQ في مصل الإنسان التجاري، مما يمثل تقدمًا كبيرًا في تكنولوجيا أجهزة الاستشعار الحيوية للكشف عن مسببات الأمراض.
طرق
يستعرض قسم “المواد والطرق” تصميم التجربة والإجراءات المستخدمة في الدراسة. يوضح المواد المحددة المستخدمة، بما في ذلك أي مواد كيميائية، معدات، وعينات بيولوجية، بالإضافة إلى مصادرها وطرق تحضيرها. كما يصف القسم المنهجيات المطبقة لجمع البيانات، بما في ذلك أي تحليلات إحصائية أو تقنيات حسابية مستخدمة لتفسير النتائج.
بالإضافة إلى ذلك، قد يبرز القسم أي ضوابط أو متغيرات تم اعتبارها أثناء التجارب لضمان صحة وموثوقية النتائج. بشكل عام، يوفر هذا الجزء من البحث نظرة شاملة على البروتوكولات المتبعة، مما يمكّن من إعادة الإنتاج والشفافية في العملية العلمية.
النتائج
تشير نتائج اختبار النشاط الكيراتينوليتي للبروتين المعاد التركيب SPSFQ إلى زيادة كبيرة في الامتصاص، تحديدًا زيادة قدرها 0.05 عند تركيز 1 ميكرومتر، كما تم قياسه باستخدام كيراتين أزور K 8500. تتوافق هذه التغيرات مع زيادة قدرها 5 وحدات في نشاط SPSFQ، حيث كانت البروتياز K وSPSFQ المعاد التركيب تعمل كضوابط، كما هو موضح في الشكل 2B. تعرف الدراسة وحدة واحدة من النشاط الكيراتينوليتي على أنها كمية الإنزيم اللازمة لرفع الامتصاص عند 595 نانومتر بمقدار 0.01 خلال ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية.
علاوة على ذلك، تم حساب قيم ΔRct لكل إلكترود تم إعداده باستخدام معادلة مخطط المعايرة، مما يسمح بتحديد قيم التركيز المقابلة. كما تم حساب معامل التباين (%CV) بناءً على البيانات المكتسبة، مما يوفر رؤى حول إمكانية إعادة إنتاج وموثوقية قياسات النشاط الكيراتينوليتي.
المناقشة
في دراسة SELEX، تم بناء مكتبة من DNA أحادي السلسلة (ssDNA) واستخدامها لاختيار الأبتاميرات المحددة لبروتين SPSFQ، الذي تم التعبير عنه بشكل غير متجانس في E. coli. استخدمت الدراسة مواد كيميائية وأجهزة متنوعة، بما في ذلك خرز النيكل-NTA المغناطيسي لتنقية البروتين ومجموعة من أنظمة PCR والرحلان الكهربائي للتحليل. تم التعبير عن بروتين SPSFQ وتنقيته بنجاح، مما أسفر عن حوالي 1 ملغ/مل من البروتين المعاد التركيب، تم تأكيده من خلال تحليل SDS-PAGE الذي يظهر شريطًا عند حوالي 38 كيلو دالتون. تم تقييم النشاط الكيراتينوليتي لـ SPSFQ المنقى باستخدام كيراتين أزور كركيزة، مما يظهر القدرة الوظيفية للإنزيم.
شمل عملية SELEX سبع جولات من الاختيار المعتمد على الخرز المغناطيسي، حيث تم إخضاع مكتبة ssDNA للاختيار السلبي لتعزيز الخصوصية. تم تحديد مرشحي الأبتاميرات، المعروفين باسم Apt1 وApt2، وتمت دراستها من حيث تقاربها لربط بروتين SPSFQ، مع تحديد قيم ثابت التفكك (Kd) من خلال قياسات الفلورية. تم تحسين أداء جهاز الاستشعار باستخدام الطيف الكهربائي (EIS)، مما كشف عن استجابة خطية لتركيزات SPSFQ تتراوح من 1.0 fg/mL إلى 10,000 fg/mL. أظهر جهاز الاستشعار موثوقية وانتقائية عالية، حيث نجح في الكشف عن SPSFQ في عينات مصل الإنسان المخففة، مما يشير إلى إمكانيته للتطبيقات العملية في الكشف الجزيئي.
DOI: https://doi.org/10.1007/s00604-026-07866-2
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/41652079
Publication Date: 2026-02-07
Author(s): Canan Özyurt et al.
Primary Topic: Advanced biosensing and bioanalysis techniques
Overview
The research highlights the critical importance of Acinetobacter baumannii, a multidrug-resistant pathogen classified as a “critical priority pathogen” by the World Health Organization. A. baumannii infections are prevalent globally, leading to significant morbidity, mortality, and healthcare burdens due to prolonged hospital stays and complicated treatment regimens. Traditional methods for detecting A. baumannii, such as culture and biochemical assays, are often inadequate due to their time-consuming nature and inability to distinguish it from closely related species. In contrast, molecular techniques, particularly PCR-based assays and isothermal amplification, have improved sensitivity and specificity in identifying this pathogen.
The study introduces the first selection of DNA aptamers targeting the A. baumannii secretory protease SPSFQ, successfully integrated into an electrochemical impedance spectroscopy (EIS) biosensor. The aptamers demonstrated high affinity for SPSFQ, with nanomolar dissociation constants ($K_d$), and the biosensor exhibited a wide dynamic range (1.0-10,000 fg/mL) with low limits of detection (LOD = 5.44 fg/mL) and quantification (LOQ = 18.15 fg/mL). Selectivity tests indicated minimal cross-reactivity, affirming the aptamer’s strong binding to SPSFQ. This biosensor represents a promising tool for early detection and monitoring of A. baumannii in clinical settings, with future studies aimed at establishing quantitative relationships between SPSFQ levels and bacterial cell counts to enhance its diagnostic utility.
Introduction
The introduction of the research paper discusses the significance of *Acinetobacter baumannii* (A. baumannii) as a major pathogen in healthcare, particularly due to its multidrug-resistant strains that complicate diagnosis and treatment. Traditional molecular detection methods, while effective, often require specialized equipment, which limits their use in resource-limited settings. The paper highlights the potential of biosensors, specifically optical and electrochemical types, for the sensitive and specific detection of A. baumannii, emphasizing the need for innovative approaches to improve diagnostic capabilities.
The study focuses on the detection of SPSFQ, a newly characterized extracellular subtilisin-like serine protease from A. baumannii, which serves as a potential biomarker for infection. The authors report the development of SPSFQ-specific single-stranded DNA (ssDNA) aptamers using the magnetic bead-based systematic evolution of ligands by exponential enrichment (MB-SELEX) method. Two aptamer sequences, Apt1 and Apt2, were identified with dissociation constants (Kd) of 42.10 ± 6.7 nM and 26.98 ± 1.35 nM, respectively. An electrochemical impedance spectroscopy (EIS)-based biosensor was then designed using the Apt2 sequence, achieving high sensitivity for SPSFQ detection at the femtogram per milliliter level. The study presents a novel impedimetric biosensor utilizing thiol-labeled aptamers and evaluates its performance for detecting SPSFQ in commercial human serum, marking a significant advancement in biosensor technology for pathogen detection.
Methods
The “Materials and Methods” section outlines the experimental design and procedures employed in the study. It details the specific materials used, including any reagents, equipment, and biological samples, as well as their sources and preparation methods. The section also describes the methodologies applied for data collection, including any statistical analyses or computational techniques utilized to interpret the results.
Additionally, the section may highlight any controls or variables considered during the experiments to ensure the validity and reliability of the findings. Overall, this part of the research provides a comprehensive overview of the protocols followed, enabling reproducibility and transparency in the scientific process.
Results
The results of the keratinolytic activity test for the recombinant SPSFQ protein indicate a significant increase in absorbance, specifically a 0.05 increase at 1 µM concentration, as measured using Keratin Azure K 8500. This change corresponds to a 5 unit increase in SPSFQ activity, with proteinase K and recombinant SPSFQ serving as controls, as illustrated in Figure 2B. The study defines one unit of keratinolytic activity as the enzyme amount necessary to elevate the absorbance at 595 nm by 0.01 within one hour at 37 °C.
Furthermore, the ΔRct values for each prepared electrode were computed using the calibration chart’s equation, allowing for the determination of corresponding concentration values. The coefficient of variation (%CV) was also calculated based on the acquired data, providing insights into the reproducibility and reliability of the keratinolytic activity measurements.
Discussion
In the SELEX study, a single-stranded DNA (ssDNA) library was constructed and utilized to select aptamers specific to the SPSFQ protein, which was heterologously expressed in E. coli. The study employed various chemicals and instrumentation, including Ni-NTA magnetic agarose beads for protein purification and a range of PCR and electrophoresis systems for analysis. The SPSFQ protein was successfully expressed and purified, yielding approximately 1 mg/mL of recombinant protein, confirmed by SDS-PAGE analysis showing a band at approximately 38 kDa. The keratinolytic activity of the purified SPSFQ was assessed using keratin azure as a substrate, demonstrating the enzyme’s functional capability.
The SELEX process involved seven rounds of magnetic bead-based selection, with the ssDNA library subjected to negative selection to enhance specificity. The aptamer candidates, identified as Apt1 and Apt2, were characterized for their binding affinity to the SPSFQ protein, with dissociation constant (Kd) values determined through fluorescence measurements. The biosensor’s performance was optimized using electrochemical impedance spectroscopy (EIS), revealing a linear response to SPSFQ concentrations ranging from 1.0 fg/mL to 10,000 fg/mL. The biosensor demonstrated high reproducibility and selectivity, successfully detecting SPSFQ in diluted human serum samples, thereby indicating its potential for practical applications in biomolecular detection.