الأدوار التفاضلية لخلايا T التنظيمية البشرية CD4+ و CD8+ في التحكم في الاستجابات المناعية الذاتية التفاعلية Differential roles of human CD4+ and CD8+ regulatory T cells in controlling self-reactive immune responses

المجلة: Nature Immunology، المجلد: 26، العدد: 2
DOI: https://doi.org/10.1038/s41590-024-02062-x
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39806065
تاريخ النشر: 2025-01-13

الأدوار التفاضلية لخلايا T التنظيمية البشرية CD4+ و CD8+ في التحكم في الاستجابات المناعية الذاتية التفاعلية

تاريخ الاستلام: 26 أبريل 2024
تم القبول: 10 ديسمبر 2024
نُشر على الإنترنت: 13 يناير 2025
تحقق من التحديثات

شين تشين مصطفى غانيزاده فامسي مالاجوسيولا إلسا سولا روبسون كاباسو كاران راج كاثوريا ومارك م. ديفيس

هنا قمنا بتحليل المساهمات النسبية لـ الخلايا التائية التنظيمية التي تعبر عن بروتين فوكهيد بوكس P3 (FOXP3) و CD8 الخلايا التائية التنظيمية التي تعبر عن مستقبلات الأجسام المضادة الشبيهة بالخلايا القاتلة للتحكم في الخلايا التائية والبائية الذاتية التفاعل في الأعضاء المناعية المستمدة من اللوزتين البشرية. FOXP3 و GZMB ترمزان على التوالي للبروتينات FOXP3 وجرانزيم B، والتي تعتبر حاسمة لوظائف التثبيط للخلايا CD4. و الخلايا التائية التنظيمية. باستخدام تقنية تحرير الجينات CRISPR-Cas9، تمكنا من تحقيق تقليل لـ في تعبير هذه الجينات. أدى حذف FOXP3 في خلايا T من اللوزتين إلى إنتاج أجسام مضادة ضد مجموعة متنوعة من الأوتوأنجينات وزيادة في تقارب الأجسام المضادة الخاصة بالإنفلونزا. بالمقابل، أدى حذف GZMB إلى زيادة في خلايا T المساعدة الجريبية، مما يتماشى مع إلغاء الخلايا التائية التنظيمية التي لوحظت في نماذج الفئران، وتوسع ملحوظ للخلايا الذاتية التفاعل و الخلايا. تسلط هذه النتائج الضوء على الأدوار المتميزة ولكن التكميلية لـ و الخلايا التائية التنظيمية في تنظيم الاستجابات الخلوية والمناعية السائلة لمنع المناعة الذاتية.
كيف يحافظ الجهاز المناعي على التسامح تجاه المستضدات الذاتية بينما لديه القدرة على إطلاق استجابات قوية تجاه المستضدات الأجنبية كان سؤالًا مركزيًا في علم المناعة منذ أن طرحه بول إهرليش لأول مرة في عام 1901 (مرجع 1). بعد بعض البدايات الخاطئة، ظهرت الحقبة الحديثة من التحقيقات في هذا السؤال مع تحليلات تسامح خلايا B بواسطة غودنو. واكتشاف، من قبل ساكاغوتشي وزملائه، لـ مجموعة فرعية من الخلايا تعبر عن عامل النسخ FOXP3 الذي ثبت أن له دورًا رئيسيًا في منع المناعة الذاتية . في الآونة الأخيرة، مجموعة صغيرة من تم العثور على خلايا T في الفئران من قبل كانتور وزملائه كفئة فرعية أخرى من خلايا T تشارك في التحكم في النشاط الذاتي. . عمل من قبل مجموعتنا لقد أظهرت أن هذه الخلايا التائية تلعب دورًا حاسمًا في منع المناعة الذاتية بعد العدوى ولديها مستويات مرتفعة في الأمراض المناعية الذاتية البشرية. هذه الخلايا CD8
تعبّر خلايا T عن جينات ترمز لأعضاء عائلة Ly49 في الفئران وم receptors مثل الأجسام المضادة القاتلة (KIRs) في البشر، وهي نشطة بشكل ملحوظ خلال الأمراض المعدية؛ تشير الأدلة إلى أنها مكلفة بشكل خاص بالتحكم في خلايا T ذاتية التفاعل التي تم تنشيطها بواسطة العدوى. . وبالتالي، هناك نوعان رئيسيان على الأقل من التنظيمي تحافظ الخلايا على التسامح، لكن لم يتم استكشاف أدوارها المحددة بشكل واسع.
للإجابة على هذا السؤال، استخدمنا نظام الأورغانويد الخاص باللوزتين البشرية الذي أنشأناه مؤخرًا استجابةً للتحفيز بواسطة فيروس الإنفلونزا ولقاحات أخرى، يعيد هذا النظام تجسيد عمليات التحوير الجسمي، نضوج الألفة ونضوج خلايا B وينتج أجسامًا مضادة محددة للمستضد. . هنا، قمنا بتعطيل كل من اللوزتين و الخلايا عن طريق الإزالة الجينات الرئيسية المتعلقة بـ
شكل. و أظهرت مجموعات الخلايا في اللوزتين البشرية اختلافات في النسبة والظواهر مقارنة بالدم المحيطي. أ-ج، نسب خلايا ( ) و CD25 خلايا ( ) ، جريبي خلايا ( ; ، و خلايا وغرنازيم الخلايا (ج) من عينات الدم واللوزتين من متبرعين متطابقين في العمر والجنس ( ).
مخططات FACS التمثيلية لتعبير FOXP3 في خلايا CD4+ T (د) وتعبير KIR وجرانزيم B في CD8 خلايا T (e) من ثقافات اللوزتين WT و KO بعد 5 أيام من التحفيز الكهربائي. PBMCs، خلايا الدم المحيطية الوحيدة النواة؛ SSC، تشتت الجانب. المتوسط ± الانحراف المعياري الموضح. تم حساب الأهمية في a-c باستخدام اختبار غير متزاوج ذو جانبين. -اختبار.
وظائفهم وقاموا بقياس تأثيراتهم على التفاعلات الذاتية و الخلايا. إبطال وظائف CD4+ أدى حذف جين FOXP3 في خلايا T اللوزية إلى إنتاج الأجسام المضادة الذاتية عند التحفيز بمجموعة من الأنتيجينات الذاتية الكلاسيكية. وكان هذا متوافقًا مع إنتاج الأجسام المضادة الذاتية التي تعد سمة مميزة لطفرات FOXP3 في كل من البشر والفئران. بالإضافة إلى الالتهاب الشديد من الجدير بالذكر أن معظم الأعضاء العضلية اللوزية أظهرت زيادات ملحوظة في تقارب الأجسام المضادة المحددة لمستضد، مما يشير إلى أن خلايا T التي تعبر عن FOXP3 تقوم أيضًا بقمع إنتاج الأجسام المضادة عالية التقارب. يمكن أن يفسر هذا سبب استقرار معظم تقارب الأجسام المضادة في نطاق حوالي نانومول واحد. ، ربما بسبب التفاعل المتبادل مع المستضدات الذاتية. لتخفيف وظيفة الخلايا، قمنا بإزالة الـ الجين الذي يشفر الجرانزيم ب، وهو جزيء فعال حاسم لهذه الخلايا . كان لهذا الاضطراب تأثير طفيف فقط على إنتاج الأجسام المضادة الذاتية ولكن تأثير أكثر وضوحًا على التفاعلات الذاتية و الخلايا. هذه النتيجة لـ كانت الخلايا مرتبطة بالزيادة الكبيرة في الخلايا المساعدة الجريبية الخلايا التي تُرى في الفئران الناقصة في خلايا ، وهو نمط ظاهري لاحظناه أيضًا في الأعضاء العضلية لللوزتين. تشير هذه النتائج إلى أن الزيادة في كانت الخلايا نتيجة لفرار المزيد من خلايا T ذات التفاعل الذاتي من نقطة تفتيش التسامح هذه. بشكل غير متوقع، وجدنا زيادة ملحوظة في البلازما بلاست. KO ، لكن هذا كان يعتمد على الخلايا وكان من المحتمل أن يكون تأثيرًا غير مباشر. أخيرًا، اكتشفنا انحيازًا جنسيًا كبيرًا في هذه إزالة الخلايا، حيث تعطي اللوزتان من النساء عادةً أقوى الاستجابات الذاتية التفاعلية. وقد لوحظت هذه التحيزات أيضًا في خلايا B اللوزية غير المعالجة. وكان هذا متسقًا مع التحيزات المعروفة المتعلقة بالجنس التي تُرى في العديد من الأمراض المناعية الذاتية. وقد تكون أداة تشخيصية مفيدة لتحديد النساء المعرضات للخطر.
نستنتج أن CD4 و CD8 تتمتع الخلايا بأدوار متداخلة ولكن متميزة في تنظيم الاستجابات الخلوية والمناعية ومنع المناعة الذاتية. هذه التعديلات الجينية على الأعضاء العضلية لللوزتين
كما تُظهر أيضًا أننا يمكننا نمذجة الميزات الرئيسية لكيفية التحكم في خلايا B و T الذاتية التفاعل، وبشكل أوسع، اختبار الفرضيات بسرعة وتحديد الآليات في نظام إنساني بحت.

النتائج

اللوزتين والدم تختلف الخلايا في التردد والنمط الظاهري و تمت دراسة الخلايا في الفئران ودم الإنسان لكن بشكل أقل في اللوزتين البشرية. لمعالجة هذه الفجوة، قمنا أولاً بالتحقيق ومقارنة النسب والأنماط الظاهرية لـ CD4 و مجموعات الخلايا في اللوزتين وخلايا الدم المحيطية المأخوذة من نفس الأفراد الذين يعانون من انقطاع النفس أثناء النوم، بمتوسط عمر يقارب 40 عامًا. تكرار كانت الخلايا أعلى بشكل ملحوظ في اللوزتين مقارنة بالدم (الشكل 1 أ والشكل التمديدي 1 أ). على الرغم من أن CD4 المتداولة تعبّر الخلايا عادةً عن مستويات عالية من CD25 على السطح (المرجع 18)، وجدنا أن ما يقرب من نصف اللوزتين أظهرت مجموعة الخلايا مستويات منخفضة من CD25 (المرجع 19) (الشكل 1أ). بالإضافة إلى ذلك، كان هناك نسبة أعلى من جُريبي الخلايا في اللوزتين مقارنة بالدم (الشكل 1ب والشكل البياني الممتد 1ب). ترددات كانت الخلايا التي تعبر عن KIR مشابهة في عينات اللوزتين والدم (الشكل 1c). ومع ذلك، أظهرت الخلايا من الدم مستويات أعلى بشكل ملحوظ من تعبير الجرنازيم B (الشكل 1c).

إزالة الجينات بكفاءة باستخدام Cas9-RNPs

بعد ذلك، هدفنا إلى استئصال الوظيفة مجموعات الخلايا لاختراق التسامح الذاتي في الأعضاء العضلية اللوزية البشرية . نظرًا لأن استنفاد الخلايا باستخدام علامة السطح CD25 يصبح غير فعال لأن أكثر من نصف خلايا CD4+ تعبّر مجموعة الخلايا عن مستويات منخفضة من CD25، قررنا تعطيل الوظيفة المثبطة للخلايا عن طريق حذف الجينات الرئيسية FOXP3 و GZMB باستخدام بروتين نوكلياز Cas9 (RNP). يشفر جين FOXP3 عامل نسخ مهم يثبت
الشكل 2 | أنماط خلايا T وB الالتهابية في عضيات اللوزتين KO FOXP3 وGZMB. أ، ب، التحليل الإحصائي لتغير الطي في تردد الخلايا المنشطة (CD27 CD4 و CD8 الخلايا و (CD38 ) خلايا (أ) وخلايا مركز الجراثيم B وخلايا البلازما (ب) في الأعضاء العضوية مع FOXP3 KO أو خلايا T KO مقارنةً مع WT المتبرعين). ج، د، التحليل الإحصائي لتغير الطي في تكرار الخلايا المنشطة ( ) و الخلايا و ( ) خلايا ( ) وخلايا B في المركز الجرثومي ( )
وخلايا البلازما (CD38 CD27 ) (د) في زراعة الأعضاء مع CD8 KO GZMB خلايا أو خلايا T مقارنة مع WT. هـ، التحليل الإحصائي لتغير النسبة المئوية لخلايا B في المركز الجرثومي والبلسمات في الأعضاء مع WT أو GZMB KO في CD8 خلايا T أو في أولئك الذين لديهم CXCR5 نقص تلاه KO لـ GZMB في الخلايا مقارنةً مع ضوابط WT المتبرعين). متوسط تم الإشارة إلى الانحراف المعياري. تم حساب الدلالة الإحصائية باستخدام تحليل التباين الأحادي (ANOVA) تلاه اختبار المقارنات المتعددة لتوكاي.
وظيفة كبح CD4 خلايا يشفّر GZMB الجرانزيم B، الذي يعد ضروريًا لوظيفة السمية الخلوية لـ CD8. خلايا وقد أظهر أن له مستويات عالية من التعبير عن النسخ والبروتين في الخلايا المنشطة خلايا قمنا بعزل خلايا T الكلية من اللوزتين البشرية وقمنا بإدخالها كهربائيًا باستخدام مجمعات RNP التي تتكون من بروتين Cas9، وRNA الموجه المستهدف لـ FOXP3 (gRNAs) أو gRNAs المستهدفة لـ GZMB (الشكل البياني الموسع 1c). تتكون gRNAs من تسلسلات مختلطة.
تم استخدامها كعنصر تحكم لتوليد خلايا T من النوع البري (WT). لتجنب احتمال تأثير الخرزات المرفقة على وظيفة خلايا تقديم المستضد (على سبيل المثال، خلايا B والخلايا النخاعية)، قمنا بتنقية الخلايا السلبية عن CD3 بشكل منفصل من قنينة جديدة من خلايا اللوزتين. تم عد الخلايا السلبية عن CD3 والخلايا الإيجابية عن CD3 التي تم إدخالها كهربائيًا، ودمجها وزرعها في الأطباق المتداخلة بكثافة الخلايا لكل عضوي كما في السابق بعد 5 أيام، قمنا بتقييم الـ
الشكل 3 | إنتاج الأجسام المضادة المحددة للذات المختلفة في الأعضاء العضلية لللوزتين من نوع FOXP3 KO و GZMB KO بعد التحفيز. تم الكشف عن الأجسام المضادة الذاتية المحددة لـ PR3 و dsDNA و snRNP و core histone في السائل فوق الطفيل لزراعة لمدة 10 أيام تحت الظروف المحددة. لـ FOXP3 KO؛ المتبرعين لـ

تم حساب التغير النسبي في قيم الكثافة الضوئية (OD) مقارنةً بـ PBS. يتم الإشارة إلى المتوسط ± الانحراف المعياري. تم حساب الأهمية الإحصائية بواسطة تحليل التباين الثنائي (ANOVA) تلاه اختبار المقارنات المتعددة لتوكاي.
القدرة على البقاء وكفاءة KO من خلال قياس مستويات البروتين داخل الخلايا عبر تحليل تدفق الخلايا. حافظت خلايا T من ثقافات WT و KO على قدرة جيدة على البقاء ( الخلايا الحية) (الشكل البياني الممتد 1d). في الأعضاء العضوية لللوزتين FOXP3KO، انخفض التعبير داخل الخلايا لـ FOXP3 بشكل ملحوظ من إلى (الشكل 1د). وبالمثل، في ثقافات GZMB KO، كانت التعبير داخل الخلايا عن الجرanzيم B في KIR تم تقليل خلايا T بشكل كبير، حيث تم تحقيق متوسط كفاءة KO بنسبة 95% (الشكل 1e). تظهر هذه النتائج أنه يمكن تحقيق KO جيني عالي الكفاءة باستخدام Cas9-RNPs في خلايا T اللوزية البشرية، مع الحفاظ على قابلية الخلايا للحياة.

أعضاء اللوزتين العضوية KO تظهر أنماط التهابية

للتحقيق في تأثير إزالة جينات FOXP3 و GZMB في خلايا T على النمط الظاهري العام للأورغانويدات اللوزية، قمنا بفحص نسب مجموعات خلايا B و T المختلفة باستخدام علامات سطحية مرتبطة بالتفعيل والتمايز. في غياب شبه كامل لجين FOXP3 أو GZMB في خلايا T الكلية، أظهرت الأورغانويدات اللوزية علامات التهاب، تتميز بزيادة نسب الخلايا التي تعبر عن علامة التفعيل CD38 وجزيء التكامل CD27 بين كلاهما. و تمت مقارنة خلايا T مع WT (الشكل 2أ والشكل البياني الممتد 2أ-د). بالإضافة إلى ذلك، كان هناك ارتفاع كبير في نسبة الخلايا المنشطة الخلايا من عضيات اللوزتين GZMBKO (الشكل 2أ والشكل البياني الممتد 2هـ). مع كلا الطريقتين، أظهرت عضيات اللوزتين زيادة في نسبة خلايا مركز الجراثيم B (CD38 ) و البلازما بلاست (CD38 ) (الشكل 2ب والشكل الإضافي 2ف) في معظم المتبرعين.
لمزيد من التحقيق في دور CD8 الخلايا في الأنماط الالتهابية الملحوظة في الأورغانويد مع خلايا T المفقودة GZMB – خاصة بالنظر إلى التقارير السابقة عن التأثيرات السامة للخلايا التي تتوسطها CD4 خلايا
عبر إنزيم غرانزيم ب على خلايا T الذاتية التفاعل -قمنا بتكرار التجارب عن طريق إلغاء في أي منهما أو الخلايا (الشكل البياني الموسع 3أ). كشفت نتائجنا عن توسع كبير في خلايا، خلايا، الخلايا والبلازما بلاست داخل الأعضاء العضلية اللوزية التي تحتوي على خلايا T (الشكل 2c، d والشكل البياني الموسع 3b، c). كانت هذه النتائج متوافقة مع الأنماط الظاهرية التي لوحظت لخلايا T الكلية. ومن الجدير بالذكر، في تأثرت خلايا T أيضًا بالالتهاب، حيث لاحظنا زيادة مماثلة في نسبة الـ السكان، خاصة في خلايا، الخلايا والبلازما بلاست (الشكل 2 ج، د والشكل الإضافي 3 ب، ج).
تلعب الخلايا أدوارًا أساسية في تشكيل المراكز الجرثومية وتوجيه تمايز خلايا B من خلال توفير إشارات تحفيزية مساعدة. للمزيد من التحقيق فيما إذا كان توسيع البلازما بلاست الذي لاحظناه في الأعضاء العضوية مع في كانت الخلايا نتيجة تفاعل مباشر بين خلايا T و B أو حدثت بشكل غير مباشر عبر الخلايا، قمنا بفحص تمايز خلايا B بعد إزالة فعالة لـ الخلايا تليها KO من في الخلايا (الشكل البياني الممتد 4أ، ب). عندما يكون CXCR5 تم استنفاد خلايا T، بينما كان عدد تم الحفاظ على الخلايا كما في النوع البري، وكان هناك انخفاض كبير في تكرار البلازما بلاست ومركز الجراثيم. الخلايا في عضيات اللوزتين المعطلة GZMB (الشكل 2e والشكل الإضافي 4c). تشير هذه النتيجة إلى أن زيادة مستويات البلازما تتطلب وجود الخلايا وبالتالي من المحتمل أن تمثل تأثيرًا غير مباشرًا.

إنتاج الأجسام المضادة الذاتية التفاضلية في عضيات اللوزتين KO

على الرغم من ملاحظة الأنماط الالتهابية في الخلايا داخل كل من عضيات اللوزتين KO، لم يكن هناك تغيير ملحوظ في الأجسام المضادة الذاتية
الشكل 4 | خلايا B ذاتية التفاعل التي تم توسيعها من عضيات اللوزتين KO FOXP3 بعد التحفيز بـ LAIV والمستضدات الذاتية. أ، رسم بياني تمثيلي لفحص تدفق الخلايا يظهر خلايا B إيجابية للسفيرومر محددة لـ PR3 وsnRNP-C وهيستون الأساسي (H3.1) بعد 7 أيام من الثقافة. ب، التغير النسبي في نسبة الخلايا المزدوجة التلوين. خلايا
بين ظروف التحفيز و PBS في اللوزتين مع خلايا T من النوع البري، FOXP3 KO و GZMB KO بعد 7 أيام من التحفيز المتبرعين). يتم الإشارة إلى المتوسط ± الانحراف المعياري. تم حساب الدلالة الإحصائية باستخدام تحليل التباين ثنائي الاتجاه متبوعًا باختبار المقارنات المتعددة لتوكاي.
إنتاج مقارنة مع الأعضاء العضلية اللوزية WT، حتى مع إضافة الأوتوأنجين إلى الثقافة (الشكل البياني الممتد 5). الدراسات السابقة اقترحت أن العدوى الفيروسية قد تكون عاملاً رئيسياً في بدء الأمراض المناعية الذاتية. وقد أظهرت نماذج الفئران تطور أنماط المناعة الذاتية بعد الإصابة الفيروسية . لذلك، قمنا بالتحقيق فيما إذا كان لقاح الإنفلونزا الحي المضعف (LAIV) يمكن أن يحفز استجابة مناعية ذاتية في المركز الجرثومي. تم تحفيز الأنسجة العضلية من اللوزتين WT و FOXP3 KO و GZMB KO بمحلول ملحي معزز بالفوسفات (PBS) أو LAIV بمفرده أو مزيج من LAIV وكوكتيل الأنتيجين الذاتي. احتوى كوكتيل الأنتيجين الذاتي على بروتيناز 3 (PR3) والهيستونات الأساسية وDNA مزدوج الشريطة (dsDNA) والريبونوكليوبروتينات النووية الصغيرة (snRNP)، والتي تعتبر أهدافًا شائعة نسبيًا للأجسام المضادة الذاتية في المرضى الذين يعانون من أمراض مناعية ذاتية. والعدوى الفيروسية في الأعضاء العضلية لللوزتين WT، أدى تحفيز LAIV إلى انخفاض نسبة CD4 الخلايا وزيادة في النسبة المئوية من الخلايا (الشكل البياني الممتد 6أ، ب)، كلاهما يتميز بزيادة تعبير CD38 (الشكل البياني الممتد 6ج، د). ومع ذلك، لم يُلاحظ أي زيادة ملحوظة في الأجسام المضادة الذاتية بعد تحفيز LAIV (الشكل 3). بالمقابل، أظهرت الأعضاء العضلية لللوزتين التي تفتقر إلى FOXP3 مستويات أعلى تصل إلى سبعة أضعاف من الأجسام المضادة الذاتية مقارنةً بالأنواع البرية بعد التحفيز بـ LAIV والمستضدات الذاتية (الشكل 3). كما لاحظنا أن معظم الأعضاء العضلية لللوزتين KO FOXP3 التي تنتج كميات كبيرة من الأجسام المضادة الذاتية كانت مستمدة من متبرعات إناث، في حين أن التحفيز أفرزت عضيات اللوزتين KO مستويات ضئيلة فقط من الأجسام المضادة الذاتية. تشير هذه النتائج إلى أن CD4 تتمتع الخلايا بدور أكثر بروزًا في التحكم في استجابات الأجسام المضادة الذاتية مقارنةً بـ الخلايا، بما يتماشى مع نقص FOXP3 الذي لوحظ في الفئران والبشر .

توسعت خلايا B الذاتية التفاعل في الأعضاء العضوية KO FOXP3 بعد التحفيز

أدت المستويات الأعلى من إنتاج الأجسام المضادة الذاتية في الأعضاء العضلية لللوزتين KO FOXP3 إلى افتراضنا أن تكرار خلايا B الذاتية التفاعل سيكون مرتفعًا أيضًا بعد التحفيز. لاختبار هذه الفرضية، قمنا بإنشاء مجموعة من ثلاثة ‘سفيرومرات’، وهي مواد متعددة الحساسيات تعتمد على الفيريتين المعدل. ، تحديداً
استهداف الأوتوأنجين PR3 و snRNP-C و core histone. في وجود LAIV، حفز كوكتيل الأوتوأنجين بشكل عميق توسيع خلايا B المحددة للأنتيجين الذاتي في عضيات اللوزتين FOXP3 KO (الشكل 4a، b)، بما يتماشى مع مستويات الأجسام المضادة الذاتية الملحوظة. ومن الجدير بالذكر أن أعلى اثنين من عضيات اللوزتين FOXP3KO التي أنتجت تكرارًا أعلى من خلايا B ذات النشاط الذاتي بعد تحفيز LAIV بالإضافة إلى الأوتوأنجين كانت أيضًا مستمدة من متبرعات إناث (الشكل 4b). بالمقابل، كان لإزالة GZMB في خلايا T اللوزية تأثير طفيف فقط على تكرارات خلايا B ذات النشاط الذاتي (الشكل 4a، b)، مما يؤكد أن CD4 تقوم الخلايا بتعديل إفراز الأجسام المضادة الذاتية من خلال تقييد تنشيط الأجسام المضادة الذاتية. الخلايا.

استجابة خلايا T التلقائية التفاضلية في الأعضاء العضوية KO

على الرغم من أنتجت الأعضاء العضوية لللوزتين KO استجابة خفيفة للأجسام المضادة الذاتية (الشكل 3)، وفي معظم المتبرعين لاحظنا زيادة في نسبة خلايا T المنشطة مقارنةً بأعضاء اللوزتين WT (الشكل 2a). وهذا يشير إلى أن قد تظهر الخلايا استجابة مثبطة أكثر قوة ضد استجابات الخلايا التائية الذاتية التفاعل. لاختبار هذه الفرضية، قمنا بتحليل تأثيرات الخلايا على الخلايا المحددة للببتيدات الذاتية المشتقة من الألدولاز الفركتوز ثنائي الفوسفات، الكيراتين، SMCY المشفر بواسطة الكروموسوم Y، البري برو إنسولين (PPI) وإنزيم حمض الغلوتاميك ديكاربوكسيلاز 65. لقد تم اكتشاف هذه الببتيدات الذاتية سابقًا في دم البشر الأصحاء، وSMCY المحددة الخلايا، على وجه الخصوص، تخضع لتنظيم صارم في الذكور لاكتشاف الخلايا المحددة لهذه الببتيدات الذاتية، قمنا بإنشاء تم استخدام السفيرومرات وأيضًا تم استخدام ببتيد من فيروس التهاب الكبد C كتحكم سلبي. قمنا بتحفيز الأعضاء العضلية لللوزتين بخلايا T من نوع WT و FOXP3 KO و GZMB KO المستمدة من متبرعين يحملون HLA-A*0201 باستخدام PBS و LAIV، أو LAIV المضاف إليه ببتيدات مستمدة من الأوتوأنجين. بعد 7 أيام من التحفيز، أظهرت اثنان من ثلاثة أعضاء لوزتين FOXP3 KO زيادة بمقدار الضعف في تكرار الاستجابة الذاتية. الخلايا. جميع الثلاثة أظهرت عضيات اللوزتين KO زيادة تقارب ثلاثة أضعاف مع دلالة إحصائية في CD8 المحدد بواسطة الببتيد الذاتي. خلايا T بعد التحفيز مع لقاح الأنفلونزا الحي المضعف ومجموعة ببتيدات الأوتوأنتيجين (الشكل 5أ).
الشكل 5 | الفرق و استجابات الخلايا للذات المستضدات في الأعضاء العضلية لللوزتين KO FOXP3 و KO GZMB بعد التحفيز بـ LAIV وتحفيز الذات المستضد. أ، HLA-Aتم زراعة الأعضاء العضلية اللوزية 0201 تحت الظروف المحددة WT أو KO لمدة 7 أيام ثم تم جمعها لتلوين السفيرومير. نسبة الأجسام الذاتية التفاعل تم تحديد الخلايا بعد التصفية الخلايا وخلايا T السلبية للفيروس الحليمي البشري. تم حساب التغير النسبي في نسبة خلايا T الذاتية التفاعل تحت ظروف التحفيز مقارنةً بمجموعة التحكم (المعالجة بـ PBS) ( المتبرعين). ب، HLA-DRB104:01 عضيات اللوزتين مع WT، FOXP3 KO أو GZMB KO إجمالي CD3 خلايا T تم زراعة المتبرعين لمدة 7 أيام، تلاها صبغ باستخدام كريات محددة للبيبتيد الذاتي أو كريات محددة لـ HA. تم قياس التغير النسبي في نسبة CD4 التفاعلية الذاتية. الخلايا مقارنة مع PBS
تم حساب الشرط. تم استنفاد خلايا T، تلاها نقص GZMB في الخلايا. بعد ذلك، أو تم إعادة إدخال الخلايا إلى الثقافة قبل التحفيز بـ LAIV والمستضدات الذاتية. تلقت الثقافات الضابطة (WT) تحفيز LAIV دون استنفاد أو كسر جيني. تظهر الرسوم البيانية التمثيلية لـ FACS النسب المئوية لخلايا CD4+ التائية الذاتية التفاعل الإيجابية للسفيرومير (اللوحة العلوية) أو CD4 الخاصة بـ HA. خلايا T (اللوحة السفلية) من عضيات اللوزتين تحت الظروف المحددة. د، التغير النسبي في تكرار خلايا CD4 الذاتية التفاعل والمحددة لـ HA خلايا T مقارنةً مع WT المتبرعين). يتم الإشارة إلى المتوسط ± الانحراف المعياري. الدلالة الإحصائية في و تم حسابها باستخدام تحليل التباين ثنائي الاتجاه متبوعًا باختبار المقارنات المتعددة لتوكاي. سيفر، سيفرومير؛ غير ذي دلالة.
بعد ذلك، بحثنا في تنظيم الأجسام الذاتية التفاعل خلايا بواسطة مجموعات الخلايا. اخترنا ببتيدات ذاتية من gp100 أو الفيبرينوجين أو PPI، حيث إن هذه ذات صلة بالاستجابات المضادة للأورام والمناعة الذاتية. . يمكن التعرف على هذه المستضدات بواسطة الخلايا في الأفراد الأصحاء التي تعبر عن HLA-DRB1*04:01 (المرجع 34). تم تضمين كواشف السفيرومر المحددة لهيماغلوتينين الإنفلونزا (HA) في لوحة التلوين لتقييم التثبيط بواسطة و خلايا T ذاتية التفاعل مقارنة بخلايا T المنشطة الأخرى. ومن الجدير بالذكر أننا
لوحظت زيادة ذات دلالة إحصائية في خلايا T المحددة لمستضدات الذات، لا سيما في الأعضاء العضلية اللوزية مع خلايا T المعطلة GZMB التي تم تحفيزها بواسطة LAIV والببتيدات الذاتية التفاعلية (الشكل 5ب). بينما خلايا CD4 التفاعلية مع HA توسعت خلايا T بعد تحفيز لقاح الأنفلونزا الحي المضعف، ولم يكن هناك فرق كبير في نسبة خلايا HA المحددة. خلايا T عبر ثقافات WT و FOXP3KO و GZMB KO (الشكل البياني الممتد 7). علاوة على ذلك، فإن الغالبية العظمى من CD4 الذاتية التفاعل الموسعة خلايا T في تم اشتقاق عضيات اللوزتين المنشطة بواسطة KO من متبرعات إناث
الشكل 6 | يعزز FOXP3 KO من affinity الأجسام المضادة، في حين أن GZMB KO يظهر تأثيرًا محدودًا فقط. تم جمع سوائل الخلايا من ثقافات اللوزتين WT وGZMB KO وFOXP3 KO المحفزة بـ LAIV بعد 10 أيام من الثقافة. تم إجراء اختبار تداخل البيولوجيا لقياس affinity الربط للأجسام المضادة مع هيماغلوتينين HA CA/09. يتم عرض تداخل آثار الربط تحت الحالة المحددة. تم حسابه من أسعار الصرف ) باستخدام معادلة حركية الترتيب الأول: تم تحديد الدلالة الإحصائية باستخدام تحليل التباين الأحادي (ANOVA) متبوعًا باختبار المقارنات المتعددة لتوكاي. NS، غير دال.
(الشكل 5ب). على النقيض من ذلك، لم يؤثر حذف FOXP3 على تكرار CD4 الخلايا المحددة لمستضدات الذات (الشكل 5ب).
لتأكيد المزيد من الزيادة في التفاعلات الذاتية خلايا من كان سبب العضيات KO بشكل خاص هو العجز الوظيفي لـ الخلايا، استنفدنا خلايا من اللوزتين مشتقة من DRB1*04:01 المتبرعين، تليها KO لـ GZMB في CD8 خلايا T. و ثم أعيدت الخلايا إلى الثقافة وتم تزويدها بببتيدات ذاتية مختارة من gp100 أو الفيبرينوجين أو خليط PPI و LAIV. في غياب الخلايا والجرانزيم B، حفزت الخلطة بشكل عميق توسيع CD4 المحدد بالذات للبيبتيدات. خلايا T. إعادة تقديم خلايا T من نفس المتبرع قللت بشكل كبير من نسبة خلايا T الذاتية التفاعل، بينما إدخال كمية متساوية من لم تؤثر خلايا T (الشكل 5c، d). بالمقابل، لم يكن هناك تأثير كبير على نسبة الخلايا تحت ظروف قابلة للمقارنة. تشير هذه النتائج إلى أن الخلايا هي مثبط قوي للذاتية التفاعلية الخلايا.
بشكل عام، تظهر نتائجنا أن و تمتلك الخلايا مجالات مسؤولية متميزة لقمع اللمفاويات ذات التفاعل الذاتي، على الرغم من وجود بعض التداخل.

إزالة FOXP3 تعزز من قوة ارتباط الأجسام المضادة

نظرًا لأن AsFOXP3 يلعب دورًا حاسمًا في تنظيم إنتاج الأجسام المضادة الذاتية، فقد بحثنا فيما إذا كان يمكن أن يؤثر أيضًا على استجابات الأجسام المضادة ضد المستضدات الأجنبية. واستفدنا من حقيقة أننا استخدمنا LAIV كعامل مساعد في هذه التجارب، قمنا بقياس نصف العمر الأجسام المضادة المستحثة ضد الهيماغلوتينين المعاد تركيبه (HA). تم تحفيز الأعضاء العضلية اللوزية مع خلايا T من النوع البري (WT) أو خلايا T المفقودة FOXP3 أو خلايا T المفقودة GZMB باستخدام PBS أو LAIV لمدة 10 أيام. تم جمع السائل الفائق من ثقافات الأعضاء العضلية لاختبارات التداخل الحيوي. أدى حذف FOXP3 في خلايا T اللوزية إلى زيادة في الأجسام المضادة، بحيث كانت أعلى بمقدار 18 مرة مقارنةً بالحالة المطابقة للمتبرع WT (الشكل 6)، مما يشير إلى أن خلايا T التي تعبر عن FOXP3 تمكّن إنتاج أجسام مضادة ذات تقارب أعلى بكثير في معظم المتبرعين من اللوزتين. تأثير كان KO أقل دراماتيكية، مع تحسن متوسط بمقدار الضعف في خمسة متبرعين. تشير هذه البيانات إلى أن CD4 الخلايا لا تنظم فقط خلايا B ذات النشاط الذاتي ولكن لها أيضًا تأثير على الخلايا بشكل عام، مما يحد بشكل فعال من تقاربها إلى النطاق النموذجي، عند أو بالقرب من 1 نانومتر.

زيادة النشاط الذاتي في الأعضاء العضوية من النساء مقارنة بالرجال

في السنوات الأخيرة، حظيت عوامل الخطر المرتبطة بالأمراض المناعية الذاتية، مثل الجنس والشيخوخة، باهتمام كبير. باستخدام نظام الأعضاء العضلية لللوزتين، استكشفنا بعض العوامل التي قد تكون مرتبطة بالأجسام المضادة ذات التفاعل الذاتي. أظهرت دراسة سابقة أن خلايا B غير الناضجة المبكرة في المتبرعين الأصحاء يمكن أن تنتج أجسامًا مضادة ذات تفاعل ذاتي. . وبالتالي، قمنا بالتحقيق فيما إذا كانت الأجسام المضادة الذاتية كانت الخلايا موجودة أيضًا في اللوزتين وما إذا كان هناك ارتباط مع الجنس. لهذا الغرض، استخدمنا كريات حيوية محددة لـ PR3 وsnRNP أو الهيستون الأساسي، مرتبطة بالستربتافيدين المكون من PE أو APC، وقمنا بتلوين عينات اللوزتين من متبرعين ذكور وإناث متطابقين في العمر. في معظم المتبرعين، نجحنا في الكشف عن الخلايا المحددة لهذه الأوتوأنتيجينات، والتي تشكل حوالي إلى خلايا B. ومن الجدير بالذكر أن هذه المستويات الأعلى وُجدت فقط في المتبرعات الإناث (الشكل 7أ، ب). بعد ذلك، بحثنا فيما إذا كانت الجنس والعمر الزمني يساهمان في إنتاج الأجسام المضادة الذاتية التي لاحظناها في الأعضاء العضلية اللوزية المحفزة مع خلايا T KO FOXP3. في الواقع، وجدنا ارتباطًا قويًا بين إنتاج الأجسام المضادة الذاتية والعمر، مع اكتشاف مستويات أعلى من الأجسام المضادة الذاتية في المتبرعين الذين تزيد أعمارهم عن 40 عامًا (الشكل 7ج). تسلط هذه النتائج الضوء على الطبيعة الفريدة والتمثيلية لخلايا اللوزتين والأعضاء العضلية كنظام قيم لاختبار الفرضيات والدراسات الميكانيكية المتعلقة بالأمراض المناعية الذاتية البشرية.

نقاش

على الرغم من أننا تعلمنا الكثير عن خصائص وأهمية خلايا CD4 التي تعبر عن FOXP3 الخلايا التائية في تعزيز التسامح الذاتي ، لقد ظهر مؤخرًا فقط أن مجموعة صغيرة من الخلايا، التي تتميز بتعبير Ly49 في الفئران وتعبير KIR في البشر، تلعب أيضًا دورًا مهمًا . هذه CD8 تكون الخلايا نشطة بشكل خاص في الأمعاء خلال مرض السيلياك الحاد وترتفع في المرضى الذين يعانون من أمراض مناعية ذاتية أخرى، بالإضافة إلى ذلك خلال العدوى في البشر والفئران. القطع الشرطي للنوع السائد الجين في الفئران يؤدي إلى عواقب مناعية ذاتية بعد الإصابة إما بفيروس الإنفلونزا أو فيروس التهاب السحايا اللمفاوي. أهمية كلاهما أنواع الخلايا في التحكم في التفاعل الذاتي تثير السؤال عن الأدوار المحددة التي قد تلعبها. للإجابة على هذا السؤال، استخدمنا عرضنا الأخير الذي أظهر أن نوعًا من الأورغانويد المصنوع من خلايا اللوزتين البشرية يمكن أن يعيد إنتاج العديد من السمات المميزة للاستجابة المناعية التكيفية في المختبر، خاصة عند تحفيزه بمختلف اللقاحات. تعتبر التعليقات الخلوية المفردة لخلايا اللوزتين كنقطة انطلاق لزراعة الأعضاء منصة مثالية لاستخدام تحرير الجينات CRISPR-Cas9 لتعطيل CD4. و الخلايا لتحليل أدوارها النسبية في التحكم في الاستجابة الذاتية و الخلايا.
إزالة FOXP3 أدت إلى توسع خلايا B الذاتية التفاعل وإنتاج الأجسام المضادة الذاتية. الأجسام المضادة الذاتية هي سمة من سمات تعطيل FOXP3 في البشر والفئران. ؛ وبالتالي، فإن هذا التأثير في الأعضاء العضلية اللوزية يعكس النتائج في الجسم الحي. ومع ذلك، كان من المدهش أنه على الرغم من أن كل من FOXP3 و GZMB KO يؤديان إلى مستويات مشابهة من الخلايا وخلايا البلازما، كانت الأخيرة لها تأثير ضئيل فقط على إنتاج الأجسام المضادة المحددة للذات. نظرًا لأن تُعرف الخلايا بأنها تستهدف الخلايا، كما لوحظ في دراستنا ودراسات أخرى لكنها لا تؤثر على إنتاج الأجسام المضادة، نفترض أن تأثيرات CD4+ تُمارَس الخلايا على إنتاج الأجسام المضادة الذاتية من خلال التفاعل المباشر مع خلايا B. يدعم ذلك العمل السابق الذي يُظهر أن CD4 توجد الخلايا في الجريبات وحدود T-B في اللوزتين البشرية ويمكنها قمع إعادة تركيب فئة خلايا B بشكل مباشر. بالإضافة إلى تثبيط خلايا B المنتجة للأجسام المضادة الذاتية في المختبر . على الرغم من إزالة FOXP3 في البشر الخلايا لا تؤثر على تعبير CD25 و CTLA-4 قد تكون هناك جزيئات إشارة أخرى متورطة، بالنظر إلى التأثير المحتمل لـ FOXP3 على وظائف بنية الجينوم وتنظيم النسخ. . نظرًا لتنوع FOXP3 تعداد الخلايا فهم أي المجموعات الفرعية تساهم في إنتاج الأجسام المضادة الذاتية و تنظيم الخلايا أمر حاسم.
الشكل 7| تظهر خلايا B اللوزية تكرارًا أعلى للتفاعل الذاتي لدى النساء مقارنة بالرجال، بغض النظر عن التخفيف الخلايا. أ، مخططات FACS تمثيلية تظهر خلايا B اللوزية الإيجابية لـ spheromer (PR3) من متبرعين ذكور وإناث متطابقين في العمر. ب، مخططات نقطية توضح النسبة المئوية لـ الخلايا المحددة لـ PR3، الهيستون و snRNP من متبرعين متطابقين في العمر تم الكشف عن الأجسام المضادة الذاتية المحددة لـ PR3 و dsDNA و snRNP و core histone بواسطة ELISA في السائل الفائق لزراعة لمدة 10 أيام من الأعضاء العضوية مع خلايا T من النوع البري و FOXP3 KO. تم تحفيزها باستخدام لقاح الأنفلونزا الحي الموهن (LAIV) ومجموعات الأنتيجينات الذاتية. تم تحليل التغير النسبي في الكثافة الضوئية مقارنةً بمحلول فوسفات البفر (PBS) باستخدام تحليل الانحدار الخطي.
نموذج للتنبؤ بالعلاقات بين مستويات الأجسام المضادة الذاتية، والعمر، والجنس. تمثل معاملات نموذج الانحدار (الميل) تأثير العمر على المتغير التابع لكل جنس، مع قيم تشير إلى الأهمية الإحصائية. إحصائيات النموذج ( -إحصائي، القيمة والتعديل ) يتم الإبلاغ عنها لكل جسم مضاد ذاتي: dsDNA: معدل ; PR3: معدل ; هيستون: ، معدل ; snRNP: معدل . في تم حساب الأهمية باستخدام اختبار مان ويتني أحادي الجانب؛ المتوسط ± الخطأ المعياري موضح.
لقد لاحظنا أيضًا زيادات كبيرة في الألفة المصلية العامة للأجسام المضادة المحددة للإنفلونزا في معظم الأعضاء العضوية التي تفتقر إلى FOXP3 وإلى حد أقل في الضربات القاضية؛ هذا يذكر بالزيادة في الألفة للأجسام المضادة الذاتية المحددة في الأفراد الذين يعانون من نقص AIRE ويشير إلى أن تعطيل تحمل خلايا T يسمح بظهور أجسام مضادة ذات affinity أعلى. من المحتمل أن يتعلق ذلك بالظاهرة التي تفيد بأنه كلما زادت affinity الجسم المضاد، زادت فرص التفاعل المتبادل المرضي مع واحد أو أكثر من المستضدات الذاتية. . تشير هذه النتيجة أيضًا إلى سبب أن معظم الأجسام المضادة وحيدة النسيلة عادة ما تقع ضمن نطاق النانومول المنخفض ونادرًا ما تكون أعلى من ذلك. .
تُبرز نتائجنا الأدوار المختلفة لـ و الخلايا في تنظيم المناعة الذاتية، ربما من خلال استهداف أنشطة خلوية مختلفة والمشاركة في مراحل مختلفة من تطور المناعة الذاتية. سمح GZMB KO لكل من CD4 التفاعلية الذاتية و CD8 تتكاثر خلايا T، مما يدل على أن الخلايا هي العامل الرئيسي الذي يتحكم في تحمل خلايا T، خاصة بالنسبة لخلايا CD4 الذاتية التفاعل. خلايا T. هذا CD4 تمت ملاحظة التأثير في وقت سابق من خلال الزيادة الملحوظة في الخلايا في الفئران الناقصة في خلايا ، مما يشير إلى أن المزيد من تم السماح للخلايا بالتوسع أكثر من المعتاد عندما كانت نشاطات الخلايا غائبة أو متقلبة. بالإضافة إلى ذلك، أظهرت الأعمال السابقة مع المرضى المصابين بفيروس SARS-CoV-2 أو الإنفلونزا زيادة في النسب المئوية لـ الخلايا خلال هذه العدوى ولكن لا تغيير في خلايا تعتبر العدوى محفزًا حاسمًا لانهيار التسامح، حيث أبلغ العديد من مرضى المناعة الذاتية عن حدوث عدوى قبل ظهور الأعراض السريرية مباشرة. . وبالتالي، فإن تعطيل CD8 يمكن أن يكون التحكم في الخلايا خطوة أولى رئيسية في تحفيز المناعة الذاتية السريرية. ومع ذلك، يمكن أن تسبق الأجسام المضادة الذاتية مرض المناعة الذاتية لسنوات. من المحتمل أن يكون هناك فقدان لـ CD4 تحكم الخلايا في وقت سابق.
باختصار، قمنا بتطوير نماذج عضوية من اللوزتين البشرية للذاتي المناعة باستخدام تقنيات تحرير الجينات CRISPR-Cas9. من خلال إجراء KO مستهدف، بحثنا في الأدوار المميزة لنوعين مختلفين من مجموعات الخلايا. تعطيل FOXP3 في CD4 الخلايا داخل الأعضاء اللوزية أدت إلى زيادة كبيرة في خلايا B الذاتية التفاعل، والأجسام المضادة الذاتية، والألفة النوعية للأجسام المضادة. من ناحية أخرى، أدى حذف GZMB في خلايا T إلى خلل في خلايا CD8. الخلايا، مما يعزز توسيع الخلايا والتفاعلية الذاتية و الخلايا، وتعزيز تمايز خلايا B. تتماشى هذه النتائج مع الملاحظات التي تم إجراؤها في نماذج الفئران والمرضى الذين يعانون من عيوب و الخلايا. إن الاستكشاف الإضافي لنموذج الأورغانويد اللوزي يحمل إمكانيات كبيرة لتحديد آليات جديدة وترجمتها إلى أساليب علاجية للأمراض المناعية الذاتية.

المحتوى عبر الإنترنت

أي طرق، مراجع إضافية، ملخصات تقارير Nature Portfolio، بيانات المصدر، بيانات موسعة، معلومات تكميلية، شكر وتقدير، معلومات مراجعة الأقران؛ تفاصيل مساهمات المؤلفين والمصالح المتنافسة؛ وبيانات توفر البيانات والرموز متاحة علىhttps://doi.org/10.1038/s41590-024-02062-x.

References

  1. Valent, P. et al. Paul Ehrlich (1854-1915) and his contributions to the foundation and birth of translational medicine. J. Innate Immun. 8, 111-120 (2016).
  2. Goodnow, C. C. et al. Altered immunoglobulin expression and functional silencing of self-reactive B lymphocytes in transgenic mice. Nature 334, 676-682 (1988).
  3. Asano, M., Toda, M., Sakaguchi, N. & Sakaguchi, S. Autoimmune disease as a consequence of developmental abnormality of a T cell subpopulation. J. Exp. Med. 184, 387-396 (1996).
  4. Baecher-Allan, C. & Hafler, D. A. Human regulatory T cells and their role in autoimmune disease. Immunol. Rev. 212, 203-216 (2006).
  5. Jiang, H., Zhang, S. I. & Pernis, B. Role of CD8+ T cells in murine experimental allergic encephalomyelitis. Science 256, 1213-1215 (1992).
  6. Kim, H. J. et al. Stable inhibitory activity of regulatory T cells requires the transcription factor Helios. Science 350, 334-339 (2015).
  7. Kim, H. J., Verbinnen, B., Tang, X., Lu, L. & Cantor, H. Inhibition of follicular T-helper cells by CD8 regulatory T cells is essential for self tolerance. Nature 467, 328-332 (2010).
  8. Li , J. et al. cells suppress pathogenic T cells and are active in autoimmune diseases and COVID-19. Science 376, eabi9591 (2022).
  9. Saligrama, N. et al. Opposing T cell responses in experimental autoimmune encephalomyelitis. Nature 572, 481-487 (2019).
  10. Wagar, L. E. et al. Modeling human adaptive immune responses with tonsil organoids. Nat. Med. 27, 125-135 (2021).
  11. Kastenschmidt, J. M. et al. Influenza vaccine format mediates distinct cellular and antibody responses in human immune organoids. Immunity 56, 1910-1926.e7 (2023).
  12. Hadaschik, E. N. et al. Regulatory T cell-deficient scurfy mice develop systemic autoimmune features resembling lupus-like disease. Arthritis Res. Ther. 17, 35 (2015).
  13. Tsuda, M. et al. The spectrum of autoantibodies in IPEX syndrome is broad and includes anti-mitochondrial autoantibodies. J. Autoimmun. 35, 265-268 (2010).
  14. Chang, S. E. et al. New-onset IgG autoantibodies in hospitalized patients with COVID-19. Nat. Commun. 12, 5417 (2021).
  15. Poulsen, T. R., Jensen, A., Haurum, J. S. & Andersen, P. S. Limits for antibody affinity maturation and repertoire diversification in hypervaccinated humans. J. Immunol. 187, 4229-4235 (2011).
  16. Choi, S. J. et al. and NKG2A cells are distinct innate-like populations in humans. Cell Rep. 42, 112236 (2023).
  17. Rubtsova, K., Marrack, P. & Rubtsov, A. V. Sexual dimorphism in autoimmunity. J. Clin. Invest. 125, 2187-2193 (2015).
  18. Dieckmann, D., Plottner, H., Berchtold, S., Berger, T. & Schuler, G. Ex vivo isolation and characterization of cells with regulatory properties from human blood. J. Exp. Med. 193, 1303-1310 (2001).
  19. Baecher-Allan, C. M. & Hafler, D. A. The purification and functional analysis of human CD4 regulatory T cells. Curr. Protoc. Immunol. 72, 7.4B.1-7.4B. 12 (2006).
  20. Hori, S., Nomura, T. & Sakaguchi, S. Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3. Science https://doi.org/10.1126/science. 1079490 (2003).
  21. Salti, S. M. et al. Granzyme B regulates antiviral CD8+ T cell responses. J. Immunol. 187, 6301-6309 (2011).
  22. Li , J. et al. cells suppress pathogenic T cells and are active in autoimmune diseases and COVID-19. Science https://doi. org/10.1126/science.abi9591 (2022).
  23. Loebbermann, J. et al. Regulatory T cells expressing granzyme B play a critical role in controlling lung inflammation during acute viral infection. Mucosal Immunol. 5, 161-172 (2012).
  24. Ise, W. et al. T follicular helper cell-germinal center B cell interaction strength regulates entry into plasma cell or recycling germinal center cell fate. Immunity 48, 702-715.e4 (2018).
  25. Mintz, M. A. & Cyster, J. G. T follicular helper cells in germinal center B cell selection and lymphomagenesis. Immunol. Rev. 296, 48-61(2020).
  26. Shulman, Z. et al. T follicular helper cell dynamics in germinal centers. Science 341, 673-677 (2013).
  27. Getts, D. R., Chastain, E. M., Terry, R. L. & Miller, S. D. Virus infection, antiviral immunity, and autoimmunity. Immunol. Rev. 255, 197-209 (2013).
  28. Dieker, J. et al. Autoantibodies against modified histone peptides in SLE patients are associated with disease activity and lupus nephritis. PLoS ONE 11, e0165373 (2016).
  29. Kattah, N. H., Kattah, M. G. & Utz, P. J. The U1-snRNP complex: structural properties relating to autoimmune pathogenesis in rheumatic diseases. Immunol. Rev. 233, 126-145 (2010).
  30. Primo, V. C. et al. Anti-PR3 immune responses induce segmental and necrotizing glomerulonephritis. Clin. Exp. Immunol. 159, 327-337 (2010).
  31. Mallajosyula, V. et al. CD8 T cells specific for conserved coronavirus epitopes correlate with milder disease in patients with COVID-19. Sci. Immunol. https://doi.org/10.1126/sciimmunol.abg5669 (2021).
  32. Yu, W. et al. Clonal deletion prunes but does not eliminate self-specific CD8 T lymphocytes. Immunity 42, 929-941 (2015).
  33. Nielen, M. M. et al. Antibodies to citrullinated human fibrinogen (ACF) have diagnostic and prognostic value in early arthritis. Ann. Rheum. Dis. 64, 1199-1204 (2005).
  34. Su, L. F., Kidd, B. A., Han, A., Kotzin, J. J. & Davis, M. M. Virus-specific CD4 memory-phenotype T cells are abundant in unexposed adults. Immunity 38, 373-383 (2013).
  35. Yuan, J. et al. Safety and immunogenicity of a human and mouse gp100 DNA vaccine in a phase I trial of patients with melanoma. Cancer Immun. 9, 5 (2009).
  36. Zhang, L., Nakayama, M. & Eisenbarth, G. S. Insulin as an autoantigen in NOD/human diabetes. Curr. Opin. Immunol. 20, 111-118 (2008).
  37. Goronzy, J. J. & Weyand, C. M. Immune aging and autoimmunity. Cell. Mol. Life Sci. 69, 1615-1623 (2012).
  38. Whitacre, C. C. Sex differences in autoimmune disease. Nat. Immunol. 2, 777-780 (2001).
  39. Wardemann, H. et al. Predominant autoantibody production by early human B cell precursors. Science https://doi.org/10.1126/ science. 1086907 (2003).
  40. Fontenot, J. D., Gavin, M. A. & Rudensky, A. Y. Foxp3 programs the development and function of CD4 CD25 regulatory T cells. Nat. Immunol. 4, 330-336 (2003).
  41. Kim, J. M. & Rudensky, A. The role of the transcription factor Foxp3 in the development of regulatory T cells. Immunol. Rev. 212, 86-98 (2006).
  42. Sakaguchi, S. Naturally arising Foxp3-expressing CD25 regulatory T cells in immunological tolerance to self and non-self. Nat. Immunol. 6, 345-352 (2005).
  43. Yang, S., Fujikado, N., Kolodin, D., Benoist, C. & Mathis, D. Immune tolerance. Regulatory T cells generated early in life play a distinct role in maintaining self-tolerance. Science 348, 589-594 (2015).
  44. Zheng, Y. & Rudensky, A. Y. Foxp3 in control of the regulatory T cell lineage. Nat. Immunol. 8, 457-462 (2007).
  45. Hoshino, A. et al. Identification of autoantibodies using human proteome microarrays in patients with IPEX syndrome. Clin. Immunol. 203, 9-13 (2019).
  46. Kinnunen, T. et al. Accumulation of peripheral autoreactive B cells in the absence of functional human regulatory T cells. Blood 121, 1595-1603 (2013).
  47. McCarron, M. J. & Marie, J. C. TGF-beta prevents T follicular helper cell accumulation and B cell autoreactivity. J. Clin. Invest. 124, 4375-4386 (2014).
  48. Lim, H. W., Hillsamer, P., Banham, A. H. & Kim, C. H. Cutting edge: direct suppression of B cells by regulatory T cells. J. Immunol. https://doi.org/10.4049/jimmunol.175.7.4180 (2005).
  49. likuni, N., Lourenço, E. V., Hahn, B. H. & La, C. Cutting edge: regulatory T cells directly suppress B cells in systemic lupus erythematosus. J. Immunol. https://doi.org/10.4049/ jimmunol. 0901163 (2009).
  50. Lam, A. J. et al. Optimized CRISPR-mediated gene knockin reveals FOXP3-independent maintenance of human Treg identity. Cell Rep. 36, 109494 (2021).
  51. Zhang, W. et al. FOXP3 recognizes microsatellites and bridges DNA through multimerization. Nature 624, 433-441 (2023).
  52. Le Coz, C. et al. Human T follicular helper clones seed the germinal center-resident regulatory pool. Sci. Immunol. 8, eade8162 (2023).
  53. Davis, M. M. In praise of descriptive science: a breath of fresh AIRE. Cell 166, 530-531 (2016).
  54. Meyer, S. et al. AIRE-deficient patients harbor unique high-affinity disease-ameliorating autoantibodies. Cell 166, 582-595 (2016).
  55. Rabia, L. A., Desai, A. A., Jhajj, H. S. & Tessier, P. M. Understanding and overcoming trade-offs between antibody affinity, specificity, stability and solubility. Biochem. Eng. J. 137, 365-374 (2018).
  56. Suurmond, J. & Diamond, B. Autoantibodies in systemic autoimmune diseases: specificity and pathogenicity. J. Clin. Invest. 125, 2194-2202 (2015).
  57. Sundaresan, B., Shirafkan, F., Ripperger, K. & Rattay, K. The role of viral infections in the onset of autoimmune diseases. Viruses https://doi.org/10.3390/v15030782 (2023).
  58. Arbuckle, M. R. et al. Development of anti-dsDNA autoantibodies prior to clinical diagnosis of systemic lupus erythematosus. Scand. J. Immunol. 54, 211-219 (2001).
  59. Arbuckle, M. R. et al. Development of autoantibodies before the clinical onset of systemic lupus erythematosus. N. Engl. J. Med. 349, 1526-1533 (2003).
  60. Leslie, D., Lipsky, P. & Notkins, A. L. Autoantibodies as predictors of disease. J. Clin. Invest. 108, 1417-1422 (2001).
  61. Olsen, N. J., Okuda, D. T., Holers, V. M. & Karp, D. R. Editorial: understanding the concept of pre-clinical autoimmunity. Front. Immunol. 13, 983310 (2022).
Publisher’s note Springer Nature remains neutral with regard to jurisdictional claims in published maps and institutional affiliations.
Open Access This article is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License, which permits use, sharing, adaptation, distribution and reproduction in any medium or format, as long as you give appropriate credit to the original author(s) and the source, provide a link to the Creative Commons licence, and indicate if changes were made. The images or other third party material in this article are included in the article’s Creative Commons licence, unless indicated otherwise in a credit line to the material. If material is not included in the article’s Creative Commons licence and your intended use is not permitted by statutory regulation or exceeds the permitted use, you will need to obtain permission directly from the copyright holder. To view a copy of this licence, visit http://creativecommons. org/licenses/by/4.0/.
(c) The Author(s) 2025

طرق

عينات بشرية ومعالجة اللوزتين

تمت تغطية جمع ومعالجة عينات اللوزتين من الأطفال والمتطوعين البالغين بواسطة بروتوكولات مجلس المراجعة المؤسسية (IRB) 30837 و60741، المعتمدة من قبل مجلس المراجعة المؤسسية بجامعة ستانفورد. تم طلب الدم من المتبرعين الأصحاء من مركز دم ستانفورد بموجب بروتوكول IRB 40146. تم الحصول على موافقة خطية مستنيرة من المشاركين البالغين ومن الأوصياء القانونيين للأطفال الذين تتراوح أعمارهم بين سنوات. لم يتم تقديم تعويضات للمشاركين. تم استبعاد أي أفراد كانوا يتناولون أدوية مناعية نظامية، أو لديهم تاريخ من الأمراض المناعية أو الذاتية، أو كانوا يعانون من عدوى نشطة خطيرة في وقت الإجراء.
اتبعت إجراءات أخذ عينات اللوزتين ما تم وصفه في دراسة سابقة. تم جمع عينات اللوزتين مباشرة بعد الجراحة وزرعها في وسط هام F-12 (جيبكو) يحتوي على نورموكين (إنفيوجن) والبنسلين والستربتوميسين لمدة لا تقل عن ساعة واحدة عند قبل المعالجة. بعد ذلك، تم تقطيع نسيج اللوزتين يدويًا إلى قطع صغيرة ( ) ومرت عبر تصفية باستخدام مكبس حقنة للحصول على تعليق خلوي. تم غسل الفلتر مرارًا وتكرارًا بوسيط كامل للمساعدة في تصفية الخلايا. كان الوسيط الكامل يتضمن RPMI مدعومًا بـ Glutamax (ثيرمو فيشر)، مصل الجنين البقري (FBS) البنسلين-ستربتوميسين نورموكين (إنفيفوجين) مكمل الأنسولين-ترانسفيرين-سيلينيوم (جيبكو) الأحماض الأمينية غير الأساسية و بيوروفات الصوديوم. تم تقليل الحطام بواسطة فصل كثافة فيكول. تم غسل الخلايا المجمعة بمحلول PBS، وتم عدها وتجميدها في قوارير تجميد في FBS + 10% ثنائي ميثيل سلفوكسيد. تم تخزين الكميات المجمدة في حتى الاستخدام.

معالجة الدم

تم تخفيف الدم بوسط زراعة الخلايا و FBS في نسبة الحجم. تم وضع هذا الدم المخفف بعناية فوق وسط تدرج الكثافة (Ficoll-Paque، GE Healthcare) وتم الطرد المركزي عند 800 جرام لمدة 20 دقيقة دون استخدام الفرامل. لجمع خلايا الدم المحيطية الوحيدة النواة، تم إدخال ماصة مباشرة من خلال طبقة البلازما العليا إلى الواجهة التي تحتوي على خلايا الوحيدة النواة. تم غسل الخلايا المجمعة مرتين بالوسط، وتجميدها في كميات باستخدام FBS مع ثنائي ميثيل سلفوكسيد ومخزن في حتى الحاجة.

تجميع كاس9-RNP والكهربة

تم تحضير Cas9-RNPs (تقنيات الحمض النووي المتكاملة) عن طريق الحضانة كاس9 مع gRNA (Synthego) بنسبة 1:1 في لمدة 15 دقيقة، مما يؤدي إلى تركيز نهائي قدره تم توفير تسلسلات الأوليغونوكليوتيدات في الجدول التكميلي 1. تم إجراء التحفيز الكهربائي باستخدام مواد من مجموعة P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit S (لونزا) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. تم تعليق خلايا T المستهدفة بلطف في محلول P3 المضاف إليه مادة المكمل 1 بكثافة مليون خلية لكل . تم خلط Cas9-RNPs وخلايا T برفق في محلول P3. ثم تم نقل هذا المزيج إلى قنينة 4D-Nucleofector من شركة Lonza Bioscience وخضع لعملية التحفيز الكهربائي باستخدام الرمز EH105. بعد التحفيز الكهربائي، تم وضع القنينة في حاضنة زراعة الأنسجة في لمدة 30 دقيقة للسماح للخلايا بالتعافي. بمجرد التعافي، كانت الخلايا جاهزة للزراعة في الأطباق المتداخلة.

فرز الخلايا وتجميع الأعضاء العضوية

للتجارب المتعلقة بـ KO التي تشمل خلايا T الكلية، تم عزل خلايا T من تعليقات الخلايا المفردة من اللوزتين باستخدام مجموعة عزل خلايا T البشرية الكاملة (Miltenyi Biotec) للتخثير الكهربائي. CD3 تم الحصول على الخلايا عن طريق استنفاد CD3 تم استخدام خلايا T مع كريات ميكرو CD3، بشرية (ميلتيني بيوتيك). تم إعادة تجميع الأعضاء العضوية عن طريق دمج خلايا مع الخلايا بنفس نسبة الخلايا المحددة للمتبرع وزرعت بكثافة الخلايا في لكل ترانسويل.
لـ تجارب KO في خلايا، غير ملامسة تم عزل خلايا T باستخدام CD8 مجموعة عزل خلايا T، بشرية (ميلتيني)
بيوتيك) للتخثير الكهربائي. CD8 تم جمع جزء الخلايا عن طريق صبغ تعليق الخلايا المفردة من اللوزتين بمضاد CD8-PE لمدة 30 دقيقة في ، تلاها استنفاد باستخدام كريات مضادة لـ PE (Miltenyi Biotec). تم إعادة تجميع الأورغانويدز المعطلة عن طريق دمج الخلايا التي تحتوي على CD8 الخلايا بنفس نسبة الخلايا المحددة للمتبرع والمزروعة في الأطباق المتداخلة.
لـ تجارب KO في خلايا، غير ملامسة تم عزل الخلايا أولاً باستخدام مجموعة عزل خلايا بان تي، بشرية (ميلتينيي بيوتيك)، تلتها CD8 استنفاد خلايا T باستخدام مجموعة REAlease CD8 MicroBead Kit، بشرية (Miltenyi Biotec). بعد التحفيز الكهربائي و الاسترداد، CD3 الخلايا، CD8 خلايا T (تمت إزالة الكريات وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة) و تم إعادة دمج الخلايا بنفس نسبة الخلايا المحددة للمتبرع وزراعتها في الخلايا في لكل ترانسويل.
لتقليل CXCR5 يليه في تم صبغ تعليقات الخلايا، تعليق الخلايا الأحادية من اللوزتين، باستخدام أجسام مضادة مضادة للبشر CD8-PE (BioLegend) و CXCR5-PE (BioLegend) في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 30 دقيقة. تم إزالة الخلايا الإيجابية لـ PE باستخدام كريات ميكرو مضادة لـ PE (Miltenyi Biotec) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. CD8 غير المتأثرة تم عزل خلايا T باستخدام CD8 مجموعة عزل خلايا T، بشرية (ميلتيني بيوتيك)، تليها التحفيز الكهربائي. أخيرًا، الـ تم دمج الخلايا مع عدد الخلايا عند نفس نسبة الخلايا المحددة للمتبرع.

زراعة الخلايا والتحفيز

لثقافة الخلايا المحفوظة بالتبريد، تم إذابة أجزاء منها في وسط كامل، وتم عدها وإعادة تعليقها إلى خلايا لكل مل للثقافات الأكبر أو خلايا لكل ملليلتر للثقافات الأصغر. ثم، الخلايا في تم وضعها في كل insert زراعة الخلايا، الذي كان لديه حجم المسام (Millipore Sigma). 1 مل من الوسط الكامل المدعوم بـ تم إضافته إلى الغرفة السفلى. (فلو مIST الرباعي الأنفي 2022-2023) تم إضافته لكل علبة، ما يعادل إلى وحدات التركيز الفلورية لكل سلالة. تم إضافة الأوتوأنتيجينات في بعض التجارب. يمكن إضافة عامل تنشيط خلايا B البشرية المؤتلفة (BioLegend) إلى الثقافة بعد 4 أيام. تم حضن ثقافات الخلايا في مع الرطوبة، وتمت إضافة وسط إضافي إلى الآبار السفلية حسب الحاجة.

اختبار وظيفي

تم تنقية الخلايا من خلايا اللوزتين باستخدام كريات ميكرو CD8 (Miltenyi Biotec) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة وتم صبغها بأجسام مضادة للتدفق، وحي. أو تم فرز الخلايا بواسطة قياس التدفق الخلوي (BD). تم فرز تمت إضافة الخلايا مرة أخرى إلى CD8 خلايا اللوزتين، مختلطة مع بروتين Cas9 و gRNA GZMB أو gRNA مختلط (كـ WT) لإجراء KO. بعد السماح لها بالراحة لمدة 30 دقيقة بعد التحفيز الكهربائي، تم استخدام أعداد متساوية من أو تم إضافة خلايا إلى الثقافة لـ خلايا اللوزتين بنسبة 1:50. إجمالي الخلايا لكل حالة في تم وضعها في كل insert زراعة الخلايا، الذي كان لديه حجم المسام (ميلليبور سيغما). ثم، 1 مل من الوسط الكامل المدعوم بـ لايف (لقاح الأنفلونزا الرباعي عن طريق الأنف 2022-2023، يعادل إلى وحدات التركيز الفلورية لكل سلالة) تم إضافة الببتيدات الذاتية إلى الغرفة السفلية. بعد يوم من IL-2 و تم إضافة عامل تنشيط خلايا B البشرية المؤتلفة (BioLegend) إلى الثقافة. تم حضن ثقافات الخلايا في مع الرطوبة، وتمت إضافة وسط إضافي إلى الآبار السفلية حسب الحاجة.

تدفق الخلايا

تم إعادة تعليق الأعضاء الثقافية عن طريق شطف الغشاء بالوسط وجمعها من الترانسويلز. تم غسل الخلايا بمحلول فرز الخلايا المعتمد على الفلورية (FACS) (PBS). ألبومين مصل البقر أزيد الصوديوم و2 مللي مول من EDTA) وتمت معالجته بحاجز مستقبلات Fc (BioLegend، ) في محلول FACS لمدة 10 دقائق ،
تبع ذلك صبغ باستخدام صبغة Aqua Zombie الحية/الميتة (ثيرمو فيشر) والأجسام المضادة ضد علامات السطح ( ). تشمل الأجسام المضادة ضد العلامات السطحية الأجسام المضادة البشرية CD3 (BUV805، Clone UCHT1، BD) و CD19 (BUV737، Clone HIB19، BD)، و CD4 (BV650، Clone OKT4، BioLegend)، و CD8 (BV421، Clone BPA-T8، BioLegend)، و CXCR5 (PE-Dazzle 594، Clone J252D4، BioLegend)، و PD1 (APC، Clone EH12.2H7، BioLegend)، و CD38 (Alexa Fluor 700، Clone HIT2، BioLegend)، و CD27 (Pecy7، Clone 0323، BioLegend)، و KIR3DL1 (PE، Clone DX9، BioLegend)، و KIR2DL2/L3/S2 (PE، Clone DX27، BioLegend)، و KIR2DL5 (PE، Clone UP-R1، BioLegend)، و CD25 (BV711، Clone M-A251، BioLegend) و KIR2DL2/L3 (PE، DX27، BioLegend). للتلوين داخل الخلايا، تم تثبيت الخلايا وتمريرها باستخدام مجموعة تثبيت وتمرير الخلايا الداخلية (eBioscience) تلاها تلوين مع FOXP3 (AF647 أو AF488، Clone 259D، BioLegend) أو جسم مضاد للجرانزيم B (FITC، Clone QA16A02، BioLegend) ( تم جمع جميع بيانات المحلل على أجهزة BD FACSymphony أو Agilent NovoCyte Penteon وتم تحليلها باستخدام برنامج FlowJo (TreeStar) وبرنامج BD FACSDiva.

كشف الأجسام المضادة بواسطة اختبار الامتزاز المناعي المرتبط بالإنزيم

للكشف عن الأجسام المضادة الخاصة بالإنفلونزا، تم طلاء ألواح الامتزاز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) (كوستار) بـ لكل بئر من لقاح الإنفلونزا المعطل الرباعي Fluzone لعام 2022-2023 (سانوفي). للكشف عن الأجسام المضادة المحددة للذات، تم طلاء ألواح ELISA (كوستار) بـ PR3، snRNP، الهيستونات الأساسية أو dsDNA لكل بئر كأنتيجين الالتقاط. تم طلاء الألواح بأنتيجين الالتقاط طوال الليل، تلاها مواد حجب لمدة ساعتين. ثم، تم إضافة سوائل الخلايا من ثقافة اللوزتين إلى الألواح المطلية والمحمية. بعد غسل الألواح بمحلول الغسيل، تم استخدام الأجسام المضادة الثانوية المرتبطة بالبيروكسيداز من الفجل الحار المضادة للبشر. تم إضافة (سيغما) إلى اللوحة لمدة ساعة واحدة، تلتها محلول ركيزة TMB (ثيرمو ساينتيفيك). تم إضافة حمض الكبريتيك لإيقاف التفاعل، وتم قراءة اللوحات عند 450 نانومتر.

تعبير البروتين، التنقية والبيوتينيل

قمنا بإنتاج البروتين وتنقيته لتوليد الكريات وفقًا لدراسة سابقة. باختصار، تم زراعة 20 مل من خلايا Expi293F بكثافة الخلايا القابلة للحياة لكل مل في وسط تعبير Expi293 (ثيرمو فيشر ساينتيفيك) وتم نقلها باستخدام بلازميدات التعبير باستخدام مادة نقل ExpiFectamine 293 وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. تم تزويد الخلايا بمعززات بعد 18 ساعة وتمت مواصلة الحضانة لمدة 4 أيام. تم جمع السائل العلوي عن طريق الطرد المركزي. ) وتم خلطه بلطف مع كرات حمض النيتريلوترياسيتيك النيكل المتوازنة مع العازل (Ni-NTA) (Qiagen) طوال الليل في ثم تم جمع كريات Ni-NTA وغسلها بمحلول ملحي مخفف بHEPES يحتوي على 20 مليمول من الإيميدازول (pH 7.2). تم استرجاع البروتين المرتبط باستخدام 200 مليمول من الإيميدازول في محلول ملحي مخفف بHEPES (pH 7.2). تم تنقية البروتينات بشكل إضافي باستخدام وحدات الطرد المركزي Amicon Ultra (Millipore Sigma) بناءً على حجمها الجزيئي. تم تحليل الفractions المسترجعة من حيث النقاء باستخدام تقنية الرحلان الكهربائي للهلام بولي أكريلاميد مع صوديوم دوديسيل سلفات. تم استبدال محلول البروتين لإزالة الإيميدازول وتم بيوتينيلته باستخدام مجموعة تفاعل بيوتين-بروتين ليغاز BirA (Avidity) وفقًا لتوصيات الشركة المصنعة. تم تنقية البروتينات البيوتينية بعد ذلك باستخدام وحدات الطرد المركزي Amicon Ultra (Millipore Sigma) بناءً على وزنها الجزيئي. تم تحليل الفractions المسترجعة من حيث النقاء والبيوتينيل باستخدام تقنية الرحلان الكهربائي للهلام بولي أكريلاميد مع صوديوم دوديسيل سلفات.

تجميع معقد الببتيد-MHC-سفيرومر ومعقد الأوتوانتيجين-سفيرومر

تم بدء التجميع عن طريق توليد ببتيد SAv شبه مشبع معقد. أولاً، -I مونومرات (تترا مير NIH
تمت مزج أحادية pMHC-I (من مرفق نسيج NIH) أو الأوتوأنتيجينات (التي تم إنتاجها داخليًا) مع ستربتافيدين-فلوروفور (BioLegend) بنسبة 1:0.45 في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة محميًا من الضوء. تم توفير تسلسلات المونومرات في الجدول التكميلي 2. ثم تم تحضين المزيج مع هيكل ماكسي-فيريتين المهندَس. عند درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة محمية من الضوء مع دوران لطيف. تم إضافة فائض مولاري من D-biotin لتشبع أي مواقع ربط البيوتين الحرة على الستربتافيدين. تم تخزين السفيرومر المجمع في للاستخدام لاحقًا.

قياس affinity الربط

الارتباط الجزيئي لبروتين الهيماغلوتينين الكامل الطول H1 كاليفورنيا/04/2009 للإنفلونزا ) تم قياس الأجسام المضادة المفرزة في وسط الثقافة للأورغانويد اللوزتين البشرية المشار إليها في اليوم العاشر بعد تحفيز LAIV باستخدام تقنية التداخل الحيوي بواسطة جهاز Octet QK (Pall ForteBio). تم قياس المستضد ( مخفف في PBST (PBS مع تم التقاط Tween 20، pH 7.4 باستخدام مستشعرات Ni-NTA الحيوية. تم غمر المستشعرات المرتبطة بالليغاند في سوائل الثقافة المخففة بالتسلسل. تم مراقبة الارتباط والانفصال لمدة ساعة واحدة. تم إجراء مرجعية مزدوجة باستخدام مستشعرات غير مرتبطة وليغاند غير ذي صلة وهو بروتين ربط المالتوز من الإشريكية القولونية. تم حسابه من معدل الخروج ( ) باستخدام معادلة حركية الترتيب الأول، تم إجراء كل تفاعل ربط في نسختين.

التحليل الإحصائي

تم إجراء معظم التحليلات الإحصائية باستثناء تلك الموضحة في الشكل 7 باستخدام برنامج GraphPad Prism (الإصدار 10). جميع النتائج مقدمة كمتوسط ± خطأ معياري. تم تحليل دلالة الفروق بين المجموعات كما هو موضح في أساطير الأشكال. لتقييم العلاقة بين مستويات الأجسام المضادة الذاتية وعمر المتبرع وجنسه، تم إجراء تحليل الانحدار الخطي لكل جسم مضاد ذاتي (dsDNA، PR3، الهيستون و snRNP). تم استخدام تغييرات الكثافة الضوئية من اختبارات ELISA كمتغير استجابة، مع تفاعلات العمر والجنس كمتنبئات. قام النموذج بتقدير المعاملات (المنحدرات) لتأثيرات العمر في الذكور والإناث بشكل منفصل. تم تقييم ملاءمة النموذج باستخدام -إحصائي، القيمة والتعديل القيمة. تم تحديد الدلالة الإحصائية لكل متنبئ، وتم تقييم المتبقيات لدقة النموذج. تم إجراء جميع التحليلات باستخدام R.

ملخص التقرير

معلومات إضافية حول تصميم البحث متاحة في ملخص تقارير مجموعة ناتشر المرتبط بهذه المقالة.

توفر البيانات

جميع البيانات متاحة في الأشكال 1-7، المعلومات التكميلية والأشكال الموسعة 1-7. تم توفير بيانات المصدر مع هذه الورقة.

توفر الشيفرة

رمز للتحليل الإحصائي باستخدام وقد تم وصف الحزم البرمجية الموجودة في قسم الطرق. لم يتم استخدام أي كود مخصص في هذه الدراسة.

شكر وتقدير

نشكر جميع المتطوعين والمرضى على مشاركتهم في هذه الدراسة. كما نشكر L. Chen و L. Kamalyan على معالجة اللوزتين، و J. Li على توفير الببتيدات الذاتية التفاعل، ومرفق FACS المشترك في ستانفورد على المساعدة في تحليل التدفق الخلوي، و D. Fernandez و O. N. Pattelli من مركز معرفة الهيكل الجزيئي في ستانفورد ChEM-H على توجيههم في إنتاج البروتين وتنقيته. أخيرًا، نشكر المشاركين على تبرعهم بأنسجتهم لدراسة الأعضاء العضوية اللوزية. تم إجراء تصنيف HLA في مرفق الجينوميات الوظيفية في ستانفورد. تم دعم هذا العمل من قبل مؤسسة Lundbeck لتبادل الأبحاث الدنماركية الأمريكية.
زمالة لم.ج. ومنح من معهد هوارد هيوز الطبي، والتمويل المفتوح، ومؤسسة بيل وميليندا غيتس، والمعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية (AIO57229) لم.م.د.

مساهمات المؤلفين

تمت conceptualization المشروع وتصميم الدراسة بواسطة X.C. و M.M.D. تم إجراء التجارب بواسطة X.C. و M.G. و K.R.K. تم إجراء تحليلات البيانات بواسطة X.C. و M.M.D. ساعد E.S. في قواعد بيانات عينات اللوزتين وخلايا الدم البيضاء المحيطية وجمع البيانات ومعالجتها وتخزينها. قام V.M. بإجراء تجارب وتحليل التداخل البيولوجي. قدم R.C. عينات اللوزتين. كتب X.C. و M.M.D. الورقة بمساهمة من جميع المؤلفين.

المصالح المتنافسة

م.م.د.، إكس.سي.، م.ج. و ف.م. هم مخترعون في طلب براءة اختراع (PCT/US2023/010431) حول الأنظمة والطرق التي تتضمن خلايا T المعدلة الموصوفة في هذا العمل. يعلن المؤلفون الآخرون عدم وجود مصالح متنافسة.

معلومات إضافية

البيانات الموسعة متاحة لهذا البحث فيhttps://doi.org/10.1038/s41590-024-02062-x.
معلومات إضافية النسخة الإلكترونية تحتوي على مواد إضافية متاحة فيhttps://doi.org/10.1038/s41590-024-02062-x.
يجب توجيه المراسلات والطلبات للحصول على المواد إلى مارك م. ديفيس.
معلومات مراجعة الأقران تشكر مجلة Nature Immunology بينغ سو والمراجعين الآخرين المجهولين على مساهمتهم في مراجعة هذا العمل. المحرر الرئيسي: س. هيوستن، بالتعاون مع فريق Nature Immunology.
معلومات إعادة الطباعة والتصاريح متاحة علىwww.nature.com/reprints.
الشكل البياني الممتد 1| نسبة مجموعة الخلايا والاختلافات الظاهرية في اللوزتين مقارنة بالدم المحيطي المتطابق مع المتبرع والقدرة على البقاء بعد الإزالة. أ، تم استخدام استراتيجية تدفق مفصلة للرسوم البيانية في الشكل 1أ-ج. ب، ملف تعريف FACS تمثيلي يظهر تعبير CD25 وCXCR5 وFOXP3.
في عينات PBMC واللوزتين. ج، سير عمل لإنشاء عضيات لوزية معدلة وراثيًا باستخدام Cas9-RNPs. د، ملف FACS تمثيلي يظهر صبغة Live/Dead لخلايا T من عضيات اللوزتين WT وFOXP3 KO وGZMB KO.




الشكل البياني الممتد 4 | مخططات تمثيلية توضح تمايز البلازما بلاست بعد نضوب خلايا الأعضاء العضلية لللوزتين. أ، تعبير غرانزيم ب في CD8 خلايا T تحت الظروف المشار إليها من عضيات اللوزتين. ب، تعبير CXCR5 في CD4 خلايا T تحت
الشروط المشار إليها من الأعضاء العضلية لللوزتين. ج، تعبير CD27 و CD38 في خلايا B من الأعضاء العضلية لللوزتين مع WT و GZMB KO و GZMB KO المستنفد من CXCR5 خلايا T.
الشكل البياني الموسع 5| إنتاج الأجسام المضادة الذاتية المحددة لـ PR3 في الأعضاء العضوية مع خلايا T من النوع البري أو خلايا T غير الموجودة فيها FOXP3. تم جمع سوائل الخلايا بعد عشرة أيام من الأعضاء العضوية مع خلايا T من النوع البري أو خلايا T غير الموجودة فيها FOXP3، وتم قياس الأجسام المضادة الذاتية المحددة لـ PR3.
بواسطة إليسا ( تم حساب التغير في الأجسام المضادة المحددة لـ PR3 (OD) بين ظروف PBS و PR3. تم تحديد الأهمية باستخدام تحليل التباين الأحادي (ANOVA) متبوعًا باختبار المقارنات المتعددة لتوكاي. ns، غير دال.
الشكل البياني الموسع و علامات وتظاهرات Tregs في الأعضاء العضوية WT المحفزة بـ LAIV أو LAIV بالإضافة إلى الأوتوأنتيجينات. أ، مخططات FACS تمثيلية تظهر CD4 تريغس (فوكس بي 3) في CD4 خلايا T) أو CD8 تريغس (KIR في الخلايا) في الأعضاء العضلية لللوزتين من النوع البري بعد 5 أيام من الثقافة. ب، التغير النسبي في نسبة الخلايا و الخلايا في عضيات اللوزتين من النوع البري المحفزة بـ LAIV أو LAIV بالإضافة إلى الأوتوأنتيجينات المتبرعين). ج، ممثل
رسوم FACS تظهر تعبير CD38 على CD4 تريغس (مُحددة مسبقًا على FOXP3 خلايا T تريغس (مُحددة مسبقًا على الخلايا) في الأعضاء العضلية لللوزتين من النوع البري بعد 5 أيام من الثقافة. د، التغير النسبي في نسبة الخلايا المنشطة فوكس بي 3 الخلايا و الخلايا في عضيات اللوزتين من النوع البري المحفزة بـ LAIV أو LAIV بالإضافة إلى الأوتوأنتيجينات تم حساب الأهمية في (ب) و (د) بواسطة تحليل التباين الأحادي (ANOVA) تلاه اختبار المقارنات المتعددة لتوكاي.

الملخص

الشكل البياني الموسع 7 | نسبة الأجسام المضادة المحددة لـ HA الخلايا في الأورغانويد مع خلايا T من النوع البري (WT) أو خلايا T غير الموجودة فيها FOXP3 (FOXP3 KO) أو خلايا T غير الموجودة فيها GZMB (GZMB KO). أورغانويد اللوزتين HLA-DRB1*04:01 مع خلايا T من النوع البري (WT) أو خلايا T غير الموجودة فيها FOXP3 أو خلايا T غير الموجودة فيها GZMB إجمالي CD3. خلايا ( تم زراعة المتبرعين لمدة 7 أيام، تلاها صبغ باستخدام السفيرومر المحدد لـ HA. التغير النسبي في نسبة HA المحدد تم حساب الخلايا بالنسبة لشرط PBS. يتم الإشارة إلى المتوسط ± الانحراف المعياري. تم حساب الدلالات الإحصائية باستخدام تحليل التباين الثنائي الاتجاه متبوعًا باختبار المقارنات المتعددة لتوكاي. جميع قيم p أكبر من 0.05.

محفظة الطبيعة

المؤلف(المؤلفون) المراسلون: مارك م. ديفيس
آخر تحديث بواسطة المؤلفين: 2024/12/05

ملخص التقرير

تتمنى Nature Portfolio تحسين قابلية إعادة إنتاج العمل الذي ننشره. يوفر هذا النموذج هيكلًا للاتساق والشفافية في التقرير. لمزيد من المعلومات حول سياسات Nature Portfolio، يرجى الاطلاع على سياسات التحرير وقائمة مراجعة سياسة التحرير.

الإحصائيات

لجميع التحليلات الإحصائية، تأكد من أن العناصر التالية موجودة في أسطورة الشكل، أسطورة الجدول، النص الرئيسي، أو قسم الطرق.
غير متوفر
تم التأكيد
□ X
حجم العينة بالضبط لكل مجموعة/شرط تجريبي، معطاة كرقم منفصل ووحدة قياس
□
□ بيان حول ما إذا كانت القياسات قد أُخذت من عينات متميزة أو ما إذا كانت نفس العينة قد تم قياسها عدة مرات
□ X
اختبار(ات) الإحصاء المستخدمة وما إذا كانت أحادية الجانب أو ثنائية الجانب
يجب أن تُوصف الاختبارات الشائعة فقط بالاسم؛ واصفًا التقنيات الأكثر تعقيدًا في قسم الطرق.

□ وصف لجميع المتغيرات المرافقة التي تم اختبارها
□ X
وصف لأي افتراضات أو تصحيحات، مثل اختبارات الطبيعية والتعديل للمقارنات المتعددة
□
وصف كامل للمعلمات الإحصائية بما في ذلك الاتجاه المركزي (مثل المتوسطات) أو تقديرات أساسية أخرى (مثل معامل الانحدار) وَالتباين (مثل الانحراف المعياري) أو تقديرات مرتبطة بعدم اليقين (مثل فترات الثقة)
□ X
لاختبار الفرضية الصفرية، إحصائية الاختبار (على سبيل المثال، ) مع فترات الثقة، أحجام التأثير، درجات الحرية و قيمة ملحوظة أعطِ القيم كقيم دقيقة كلما كان ذلك مناسبًا.
□ لتحليل بايزي، معلومات حول اختيار القيم الأولية وإعدادات سلسلة ماركوف مونت كارلو
□ لتصميمات هرمية ومعقدة، تحديد المستوى المناسب للاختبارات والتقارير الكاملة عن النتائج
□ تقديرات أحجام التأثير (مثل حجم تأثير كوهين) بيرسون )، مما يشير إلى كيفية حسابها
تحتوي مجموعتنا على الإنترنت حول الإحصائيات لعلماء الأحياء على مقالات تتناول العديد من النقاط المذكورة أعلاه.

البرمجيات والشيفرة

معلومات السياسة حول توفر كود الكمبيوتر
جمع البيانات
تم جمع بيانات تحليل تدفق الخلايا باستخدام برنامج BD FACSDiva (الإصدار 7). تم الحصول على بيانات FACS باستخدام أجهزة BD FACSymphony أو Agilent NovoVyte Penteon.
تحليل البيانات
تم استخدام FlowJo 10.7.0 لتحليل بيانات تدفق الخلايا. وتم استخدام GraphPad Prism 10.1 و R studio 4.0.3 للرسم والتحليل الإحصائي.
بالنسبة للمخطوطات التي تستخدم خوارزميات أو برامج مخصصة تكون مركزية في البحث ولكن لم يتم وصفها بعد في الأدبيات المنشورة، يجب أن تكون البرمجيات متاحة للمحررين والمراجعين. نحن نشجع بشدة على إيداع الشيفرة في مستودع مجتمعي (مثل GitHub). راجع إرشادات مجموعة Nature لتقديم الشيفرة والبرمجيات لمزيد من المعلومات.

بيانات

معلومات السياسة حول توفر البيانات
يجب أن تتضمن جميع المخطوطات بيانًا عن توفر البيانات. يجب أن يوفر هذا البيان المعلومات التالية، حيثما ينطبق:
  • رموز الانضمام، معرفات فريدة، أو روابط ويب لمجموعات البيانات المتاحة للجمهور
  • وصف لأي قيود على توفر البيانات
  • بالنسبة لمجموعات البيانات السريرية أو بيانات الطرف الثالث، يرجى التأكد من أن البيان يتماشى مع سياستنا
جميع البيانات متاحة في الأشكال والنصوص والأشكال التكميلية، مع بيانات المصدر.
محفظة الطبيعة | ملخص التقرير
أبريل 2023

البحث الذي يتضمن مشاركين بشريين، بياناتهم، أو مواد بيولوجية

معلومات السياسة حول الدراسات التي تشمل مشاركين بشريين أو بيانات بشرية. انظر أيضًا معلومات السياسة حول الجنس، الهوية/التقديم الجنسي، والتوجه الجنسي والعرق، والاثنية والعنصرية.
التقارير عن الجنس والنوع الاجتماعي تم الإبلاغ عن كل من المرضى الذكور والإناث. تم الحصول على معلومات الجنس من السجلات الإلكترونية للمرضى، مع جمع الموافقة المستنيرة من جميع المشاركين. تتراوح أعمار المرضى بين 4 و 66 عامًا، مع من المجموعة التي تكون ذكورًا و أنثى. تم توفير بيانات الجنس في بيانات المصدر
التقارير عن العرق أو الإثنية أو غيرها من التجمعات الاجتماعية ذات الصلة تُدرج بيانات العرق والإثنية في المعلومات التكميلية
خصائص السكان تم تجنيد المرضى الذين يخضعون لعملية استئصال اللوزتين بموافقة لجنة الأخلاقيات للمساهمة بأنسجة في هذه الدراسة. تم استبعاد المرضى الذين يعانون من عدوى خطيرة أو الذين يتناولون أدوية مناعية نظامية من الدراسة. تتراوح أعمار المرضى من 4 إلى 66 عامًا، مع من المجموعة التي تكون ذكورًا و أنثى.
التوظيف سيتم إحالة المرضى إلى الوحدات السريرية المناسبة لرعايتهم، مثل الإجراءات الجراحية. قبل إجراء عملية المريض، سيتواصل فريق البحث لدينا مع عائلة المريض الطفل أو البالغ للحصول على موافقة خطية مستنيرة. تم استبعاد المرضى الذين يعانون من عدوى خطيرة أو الذين كانوا يتناولون أدوية مناعية نظامية من الدراسة. الأفراد المسؤولون عن الحصول على موافقة المرضى وجمع الأنسجة لم يكونوا متورطين في الجوانب العلمية للدراسة. لا نتوقع أي انحياز منهجي في استراتيجيتنا لجمع البيانات.
رقابة الأخلاقيات تمت تغطية جمع وعمل عينات اللوزتين من الأطفال والمتطوعين البالغين بواسطة بروتوكولات IRB 30837 و60741، المعتمدة من قبل مجلس المراجعة المؤسسية بجامعة ستانفورد (IRB). تم الحصول على موافقات مستنيرة من المشاركين و/أو من الآباء/الأوصياء القانونيين. لم يتم تقديم تعويض للمشاركين. تم طلب دم من متبرعين أصحاء من مركز دم ستانفورد بموجب بروتوكول IRB 40146.
يرجى ملاحظة أنه يجب أيضًا تقديم معلومات كاملة حول الموافقة على بروتوكول الدراسة في المخطوطة.

التقارير المتخصصة في المجال

يرجى اختيار الخيار أدناه الذي يناسب بحثك بشكل أفضل. إذا لم تكن متأكدًا، اقرأ الأقسام المناسبة قبل اتخاذ قرارك.
علوم الحياة
العلوم السلوكية والاجتماعية
العلوم البيئية والتطورية والبيئية
لنسخة مرجعية من الوثيقة بجميع الأقسام، انظرnature.com/documents/nr-reporting-summary-flat.pdf

تصميم دراسة العلوم الحياتية

يجب على جميع الدراسات الإفصاح عن هذه النقاط حتى عندما يكون الإفصاح سلبياً.
حجم العينة تفاوتت أحجام العينات من إلى اعتمادًا على التجارب التي تم إجراؤها. تم تحديد حجم العينة بناءً على التجارب السابقة (PMID: 33432170) وتوافر العينات السريرية.
استثناءات البيانات لم يتم استبعاد أي بيانات
التكرار تم تقديم عدد المتبرعين الذين تم اختبارهم في أساطير الأشكال. توقعنا وجود تباين بين المتبرعين في الاستجابة للتحفيز والعلاج، وتم الإبلاغ عن الاستجابات للتحفيز في الأشكال أو في النص. تم استخدام متبرعين مختلفين لإظهار نطاق الاستجابات الممكنة.
العشوائية كانت المجموعات التجريبية مرتبطة بالتحفيز، والجنس، والعمر، وبالتالي فإن العشوائية ليست ذات صلة.
عمى التعمية غير ذات صلة بهذه الدراسة لأنها ليست تجربة سريرية. الهدف هو تقييم استجابات زراعة الخلايا لعلاجات مختلفة باستخدام اختبارات معتمدة.

التقارير عن مواد وأنظمة وطرق محددة

نحتاج إلى معلومات من المؤلفين حول بعض أنواع المواد والأنظمة التجريبية والأساليب المستخدمة في العديد من الدراسات. هنا، يرجى الإشارة إلى ما إذا كانت كل مادة أو نظام أو طريقة مدرجة ذات صلة بدراستك. إذا لم تكن متأكدًا مما إذا كان عنصر القائمة ينطبق على بحثك، يرجى قراءة القسم المناسب قبل اختيار رد.
المواد والأنظمة التجريبية
غير متوفر مشارك في الدراسة غير متوفر مشارك في الدراسة
□ – الأجسام المضادة إكس □
□ – خطوط خلايا حقيقية النواة □ – قياس التدفق الخلوي
– □ إكس □
– □
□
إكس □
“め” translates to “م” in Arabic. □

الأجسام المضادة

الأجسام المضادة المستخدمة
مضاد بشري CD3 (BUV805) 1/50 BD Biosciences رقم الكاتالوج# 612895؛ RRID:AB_2870183
مضاد بشري CD19 (BUV737) 1/50 BioLegend رقم الكاتالوج# 741829؛ RRID:AB_2871164
CD4 المضاد للبشر (BV650) 1/50 BioLegend رقم الكاتالوج# 317436؛ RRID:AB_2563050
CD8 المضاد للبشر (BV421) 1/50 BioLegend رقم الكاتالوج 301036؛ RRID:AB_10960142
CXCR5 المضاد للبشر (PE-Dazzle 594) 1/50 BioLegend رقم الكاتالوج 356928؛ RRID:AB_2563689
PD1 المضاد للبشر (APC) 1/20 BioLegend رقم الكاتالوج# 329908؛ RRID:AB_940475
CD38 المضاد للبشر (أليكس فلور 700) 1/100 بيو ليجند رقم الكاتالوج 303524؛ RRID:AB_2072781
CD27 المضاد للبشر (Pecy7) 1/100 BioLegend رقم الكاتالوج 302838؛ RRID:AB_2561919
مضاد بشري CD158e1 (KIR3DL1) (PE) 1/50 BioLegend رقم الكاتالوج 312708؛ RRID:AB_2249498
CD158b المضاد للبشر (KIR2DL2/L3، NKAT2) (PE) 1/100 BioLegend رقم الكاتالوج 312606؛ RRID:AB_2130554
أجسام مضادة مضادة للبشر CD158f (KIR2DL5) (PE) 1/100 BioLegend رقم الكاتالوج 341304؛ RRID:AB_2130701
مضاد-FOXP3 (أليكس فلور 488) 1/50 بايو ليجند رقم الكاتالوج # 320212؛ RRID:AB_430887
مضاد-FOXP3 (أليكس فلور 647) 1/50 بايو ليجند رقم الكاتالوج# 320214؛ RRID:AB_492984
مضاد جرانزيم B (FITC) 1/100 BioLegend رقم الكاتالوج# 372206؛ RRID:AB_2687030
مضاد بشري CD25 (BV711) 1/50 BioLegend رقم الكاتالوج# 356138؛ RRID:AB_2632781
CD8 المضاد للبشر (PE) 1/10 BioLegend رقم الكاتالوج؛ 344706؛ RRID:AB_1953244
CXCR5 المضاد للبشر (PE) 1/25 BioLegend رقم الكاتالوج# 356904؛ RRID:AB_2561813
التحقق
تم شراء جميع الأجسام المضادة من الموردين التجاريين (BD Biosciences، BioLegend، ThermoFisher). تم تأكيد بيان التحقق من موقع الشركات المصنعة لاستخدامها ذي الصلة في الدراسة:
CD3 المضاد البشري (BUV805) https://www.bdbiosciences.com/en-us/products/reagents/flow-cytometry-reagents/research-reagents/single-color-antibodies-ruo/buv805-mouse-anti-human-cd3.612895
مضاد CD19 البشري (BUV737) https://www.bdbiosciences.com/en-us/resources/scientific-resources?resourceType::all=all مضاد CD4 البشري (BV650) https://www.biolegend.com/en-ie/products/brilliant-violet-650-anti-human-cd4-antibody-7786؟
معرف المجموعة=BLG5901
مضاد CD8 البشري (BV421) https://www.biolegend.com/en-ie/products/brilliant-violet-421-anti-human-cd8a-antibody-7152 مضاد CXCR5 البشري (PE-Dazzle 594) https://www.biolegend.com/en-ie/products/pe-dazzle-594-anti-human-cd185-cxcr5-antibody-9860
PD1 المضاد البشري (APC) https://www.biolegend.com/en-ie/products/apc-anti-human-cd279-pd-1-antibody-4413
مضاد CD38 المضاد للبشر (أليكس فلور 700) https://www.biolegend.com/en-ie/products/alexa-fluor-700-anti-human-cd38-antibody-6050 مضاد CD27 المضاد للبشر (بيكسي7) https://www.biolegend.com/en-us/products/pe-cyanine7-anti-human-cd27-antibody-8434
مضاد CD158e1 (KIR3DL1) المضاد البشري (PE) https://www.biolegend.com/en-us/products/pe-anti-human-cd158e1-kir3dl1-nkb1-antibody-2286
مضاد CD158b (KIR2DL2/L3، NKAT2) (PE) https://www.biolegend.com/en-us/products/pe-anti-human-cd158b-j-kir2dI2-I3-s2-antibody-2281
أجسام مضادة مضادة للبشر CD158f (KIR2DL5) (PE) https://www.biolegend.com/en-us/products/pe-anti-human-cd158f-kir2dl5-antibody-5809
مضاد FOXP3 (أليكس فلور 488) https://www.biolegend.com/en-us/products/alexa-fluor-488-anti-human-foxp3-antibody-2908
مضاد FOXP3 (أليكس فلور 647) https://www.biolegend.com/en-us/products/alexa-fluor-647-anti-human-foxp3-antibody-2909 مضاد غرانزيم B (FITC) https://www.biolegend.com/en-us/products/fitc-anti-human-mouse-granzyme-b-recombinant-antibody-14430
CD25 المضاد البشري (BV711) https://www.biolegend.com/en-us/products/brilliant-violet-711-anti-human-cd25-antibody-13762 CD8 المضاد البشري (PE) https://www.biolegend.com/en-us/products/pe-anti-human-cd8-antibody-6247
مضاد CXCR5 (PE) المضاد البشري https://www.biolegend.com/en-us/products/pe-anti-human-cd185-cxcr5-antibody-8358

خطوط خلايا حقيقية النواة

معلومات السياسة حول خطوط الخلايا والجنس والنوع في البحث
مصدر(s) خط الخلايا
المصادقة
تلوث الميكوبلازما
خلايا Expi293F من ثيرمو فيشر (رقم الكات# A14527)
تم التحقق من هوية خطوط الخلايا بشكل متكرر من خلال ميزاتها الشكلية
تم اختبار تلوث الميكوبلازما سلبياً للميكوبلازما عبر qPCR الذي أجرته شركة ثيرمو فيشر.

النباتات

مخزونات البذور غير متوفر
أنماط جينية نباتية جديدة
□
غير متوفر
المصادقة غير متوفر

تدفق الخلايا

المؤامرات

أكد أن:
توضح تسميات المحاور العلامة والفلوركروم المستخدم (مثل CD4-FITC).
المقاييس على المحاور واضحة تمامًا. قم بتضمين الأرقام على المحاور فقط للرسم البياني في أسفل اليسار من المجموعة (المجموعة هي تحليل للعلامات المتطابقة).
جميع الرسوم البيانية هي رسوم بيانية متساوية الارتفاع مع نقاط شاذة أو رسوم بيانية بالألوان الزائفة.
تم توفير قيمة عددية لعدد الخلايا أو النسبة المئوية (مع الإحصائيات).
المنهجية
تحضير العينة تم إعادة تعليق الأعضاء الثقافية عن طريق شطف الغشاء بالوسط وجمعها من الترانسويلز. تم غسل الخلايا بمحلول FACS (PBS + 0.1% BSA، 0.05% نازيد الصوديوم و 2 مللي مول EDTA) ومعالجتها بحاجز مستقبلات Fc (Biolegend، ) في محلول FACS لمدة 10 دقائق تليها صبغة Aqua Zombie الحية/الميتة ( ) والأجسام المضادة ضد العلامات السطحية لتلوين داخل الخلايا، تم تثبيت الخلايا وتمريرها، تلا ذلك تلوين باستخدام الأجسام المضادة المضادة لـ FOXP3 أو المضادة للجرانزيم B. ).
آلة تم الحصول على بيانات FACS باستخدام أجهزة BD FACSymphony أو Agilent NovoVyte Penteon. تم استخدام BD FACSAria لفرز الخلايا.
برمجيات تم جمع بيانات تحليل تدفق الخلايا باستخدام برنامج BD FACSDiva (الإصدار 7).
وفرة تجمع الخلايا نقاء الخلايا المفروزة كان أكثر من
استراتيجية البوابة
لإنشاء الرسوم البيانية في الشكل 1، بدأنا باستبعاد الحطام من خلال تحديد البوابة على FSC-A مقابل SSC-A. بعد ذلك، قمنا بتحديد الخلايا المفردة باستخدام رسم بياني قطري لـ FSC-A مقابل FSC-H لإزالة الخلايا المزدوجة، تلا ذلك اختيار الخلايا الحية من خلال تحديد السكان السالب من صبغة Live/Dead. ثم قمنا بتحديد خلايا CD3+ T، مميزين إياها عن خلايا غير T من خلال استبعاد CD19. الخلايا. في هذه المرحلة، قمنا بفصل العنصرين الرئيسيين مجموعات الخلايا، و الخلايا، إلى مجموعات متميزة باستخدام مخطط CD4 مقابل CD8.
لتحديد نسبة خلايا CD4+ Tregs كما هو موضح في الشكل 1 (A، اللوحة اليسرى)، قمنا بتحديد خلايا FOXP3+ الكلية ضمن مجموعة CD4+. تم تحديد نسبة مجموعة CD25- في الشكل 1 (A، اللوحة اليمنى) من خلال تحديد مجموعة CD25 السلبية من خلايا FOXP3+CD4+T. لتحديد نسبة خلايا T Follicular Regulatory، قمنا بفحص نسبة الخلايا الموجبة لكل من CXCR5 و FOXP3 من خلايا CD4+T.
داخل مجموعة خلايا CD8+ T، حددنا خلايا CD8+ Tregs بناءً على تعبير KIR (مستقبلات الأجسام المضادة القاتلة الشبيهة بالأجسام المضادة)، والتي تحدد مجموعة تنظيمية داخل خلايا CD8+ T. أخيرًا، قمنا بتقييم تعبير Granzyme B في هذه الخلايا KIR + CD8+ Tregs.
قم بتحديد هذا المربع لتأكيد أنه تم تقديم رقم يوضح استراتيجية البوابة في المعلومات التكميلية.
  1. معهد المناعة وزرع الأعضاء والعدوى، جامعة ستانفورد، ستانفورد، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية. قسم المناعة والميكروبيولوجيا، جامعة كوبنهاغن، كوبنهاغن، الدنمارك. قسم جراحة النوم، قسم الأنف والأذن والحنجرة – جراحة الرأس والعنق، كلية الطب بجامعة ستانفورد، ستانفورد، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية. قسم علم الأحياء الدقيقة والمناعة، كلية الطب بجامعة ستانفورد، ستانفورد، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية. معهد هوارد هيوز الطبي، كلية الطب بجامعة ستانفورد، ستانفورد، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية. ساهم هؤلاء المؤلفون بالتساوي: شين تشين، مصطفى غانيزادا. -البريد الإلكتروني:mmdavis@stanford.edu

Journal: Nature Immunology, Volume: 26, Issue: 2
DOI: https://doi.org/10.1038/s41590-024-02062-x
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39806065
Publication Date: 2025-01-13

Differential roles of human and regulatory T cells in controlling self-reactive immune responses

Received: 26 April 2024
Accepted: 10 December 2024
Published online: 13 January 2025
Check for updates

Xin Chen , Mustafa Ghanizada , Vamsee Mallajosyula , Elsa Sola , Robson Capasso , Karan Raj Kathuria & Mark M. Davis

Here we analyzed the relative contributions of regulatory T cells expressing Forkhead box protein P3 (FOXP3) and CD8 regulatory T cells expressing killer cell immunoglobulin-like receptors to the control of autoreactive T and B lymphocytes in human tonsil-derived immune organoids. FOXP3 and GZMB respectively encode proteins FOXP3 and granzyme B, which are critical to the suppressive functions of CD4 and regulatory T cells. Using CRISPR-Cas9 gene editing, we were able to achieve a reduction of in the expression of these genes. FOXP3 knockout in tonsil T cells led to production of antibodies against a variety of autoantigens and increased the affinity of influenza-specific antibodies. By contrast, GZMB knockout resulted in an increase in follicular helper T cells, consistent with the ablation of regulatory T cells observed in mouse models, and a marked expansion of autoreactive and cells. These findings highlight the distinct yet complementary roles of and regulatory T cells in regulating cellular and humoral responses to prevent autoimmunity.
How the immune system maintains tolerance to self-antigens while having the ability to launch vigorous responses to foreign antigens has been a central question in immunology since Paul Ehrlich first raised it in 1901 (ref. 1). After some false starts, the modern era of investigations into this question emerged with analyses of B cell tolerance by Goodnow and the discovery, by Sakaguchi and colleagues, of a cell subset expressing the transcription factor FOXP3 that has been shown to have a major role in preventing autoimmunity . More recently, a small subset of T cells in mice was found by Cantor and colleagues to be another T cell subset involved in controlling autoreactivity . Work by our group has shown that these T cells have a critical role in preventing autoimmunity following infection and have elevated levels in human autoimmune diseases. These CD8
T cells express genes encoding members of the Ly49 family in mice and killer cell immunoglobulin-like receptors (KIRs) in humans and are notably active during infectious diseases; evidence suggests that they are specifically tasked with controlling self-reactive T cells that have been activated by infection . Thus, at least two major types of regulatory cell maintain tolerance, but their specific roles have not been explored extensively.
To address this question, we used our recently established human tonsil organoid system . In response to stimulation with influenza and other vaccines, this system recapitulates the processes of somatic hypermutation, affinity maturation and B cell maturation and produces antigen-specific antibodies . Here, we disabled each of the tonsillar and cells by knockout of key genes related to
Fig. and cell subsets in human tonsils showed percentage and phenotypic differences compared with peripheral blood. a-c, Percentages of cells ( ) and CD25 cells ( ), follicular cells ( ; , and cells and granzyme cells (c) from blood and tonsil samples from age- and gender-matched donors ( ).
d,e, Representative FACS plots of FOXP3 expression in CD4+ T cells (d) and KIR and granzyme B expression in CD8 T cells (e) from WT and KO tonsil cultures 5 days postelectroporation. PBMCs, peripheral blood mononuclear cells; SSC, side scatter. The mean ± s.e.m. is indicated. Significance in a-c was calculated using a two-sided unpaired -test.
their functions and gauged their effects on self-reactive and cells. Ablating the functions of CD4+ cells by knocking out the FOXP3 gene in tonsillar T cells resulted in production of autoantibodies upon stimulation with a panel of classical autoantigens. This was commensurate with the production of autoantibodies that is a hallmark of FOXP3 mutations in both humans and mice , as well as with severe inflammation . Notably, most tonsil organoids exhibited significant increases in the affinity of antigen-specific antibodies, indicating that FOXP3-expressing T cells also suppress generation of high-affinity antibodies. This could explain why most antibody affinities plateau in about the one-nanomolar range , perhaps owing to cross-reactivity to self-antigens. To attenuate the function of cells, we knocked out the gene, which encodes granzyme B, a critical effector molecule of these cells . This disruption had only a minor effect on autoantibody production but a much more pronounced effect on self-reactive and cells. This finding for cells was correlated with the large increase in follicular helper cells seen in mice deficient in cells , a phenotype we also observed in the tonsil organoids. These results suggest that the increase in cells was due to more self-reactive T cells escaping this tolerance checkpoint. Unexpectedly, we found a notable rise in plasmablasts with KO , but this was dependent on cells and was likely to have been an indirect effect. Last, we discovered a significant sex bias in these cell ablations, with tonsils from women typically giving the strongest autoreactive responses. This bias was also observed in unmanipulated tonsillar B cells. This was consistent with the well-known sex biases seen in many autoimmune diseases and could be a useful diagnostic to identify women at risk.
We conclude that CD4 and CD8 cells have overlapping yet distinct roles in regulating cellular and humoral responses and preventing autoimmunity. These genetic modifications of the tonsil organoids
also demonstrate that we can model key features of how autoreactive B and T cells are controlled and, more broadly, quickly test hypotheses and define mechanisms in a purely human system.

Results

Tonsillar and blood cells differ in frequency and phenotype and cells have been characterized in mice and human blood but less so in human tonsils. To address this gap, we first investigated and compared the percentages and phenotypes of CD4 and cell subsets in tonsils and peripheral blood cells derived from the same individuals with sleep apnea, with an average age of approximately 40 years. The frequency of cells was significantly higher in tonsils compared with blood (Fig. 1a and Extended Data Fig. 1a). Although circulating CD4 cells usually express high surface levels of CD25 (ref.18), we found that nearly half of the tonsillar cell population expressed low levels of CD25 (ref.19) (Fig.1a). In addition, there was a higher percentage of follicular cells in the tonsils compared with the blood (Fig. 1b and Extended Data Fig. 1b). The frequencies of cells expressing KIR were similar in tonsil and blood samples (Fig.1c). However, cells from the blood displayed significantly higher levels of granzyme B expression (Fig.1c).

Efficient gene KO using Cas9-RNPs

Next, we aimed to ablate the functional cell subsets to breach self-tolerance in human tonsil organoids . Given that cell depletion using the CD25 surface marker becomes inefficient because more than half of the CD4+ cell population expresses low levels of CD25, we decided to disrupt the suppressive function of the cells by knocking out key genes FOXP3 and GZMB using Cas9 nucleoprotein (RNP). The FOXP3 gene encodes an important transcription factor that stabilizes
Fig. 2 | Inflammatory T and B cell phenotypes in FOXP3 and GZMB KO tonsil organoids. a,b, Statistical analysis of fold change in frequency of activated (CD27 ) CD4 and CD8 cells and (CD38 ) cells (a) and germinal center B cells and plasmablasts (b) in organoids with FOXP3 KO or KO T cells compared with WT ( donors). c,d, Statistical analysis of fold change in frequency of activated ( ) and cells and ( ) cells ( ) and germinal center B cells ( )
and plasmablasts (CD38 CD27 ) (d) in organoid culture with GZMB KO CD8 cells or T cells compared with WT. e, Statistical analysis of fold change in percentage of germinal center B cells and plasmablasts in organoids with WT or GZMB KO in CD8 T cells or in those with CXCR5 depletion followed by GZMB KO in cells compared with WT controls ( donors). Mean s.e.m. is indicated. Statistical significance was calculated using one-way analysis of variance (ANOVA) followed by Tukey’s multiple comparisons test.
the suppressive function of CD4 cells . GZMB encodes granzyme B, which is essential for the cytotoxic function of CD8 cells and has been shown to have high transcript and protein expression levels in activated cells . We isolated total T cells from human tonsils and electroporated them with RNP complexes consisting of the Cas9 protein, FOXP3-targeting guide RNAs (gRNAs) or GZMB-targeting gRNAs (Extended Data Fig. 1c). gRNAs consisting of scrambled sequences
were used as a control to generate wild-type (WT) T cells. To avoid the possibility of the attached beads interfering with the function of antigen-presenting cells (for example, B cells and myeloid cells), we purified the unlabeled CD3-negative cells separately from a new vial of tonsil cells. The CD3-negative cells and electroporated CD3-positive cells were enumerated, combined and plated into transwells at a density of cells per organoid as before . After 5 days, we assessed the
Fig. 3 | Differential autoantigen-specific antibody production in FOXP3 KO and GZMB KO tonsil organoids after stimulation. Autoantibodies specific to PR3, dsDNA, snRNP and core histone were detected in the supernatant of 10-day cultures under the indicated conditions ( for FOXP3 KO; donors for

). The fold change in optical density (OD) values compared with PBS was calculated. The mean ± s.e.m. is indicated. Statistical significance was calculated by two-way ANOVA followed by Tukey’s multiple comparisons test.
viability and the KO efficiency by measuring intracellular protein levels via flow cytometry. T cells from WT and KO cultures maintained good viability ( live cells) (Extended Data Fig. 1d). In FOXP3KO tonsil organoids, the intracellular expression of FOXP3 markedly decreased from to (Fig. 1d). Similarly, in GZMB KO cultures, the intracellular expression of granzyme B in KIR T cells was significantly reduced, achieving an average KO efficiency of 95% (Fig. 1e). These results demonstrate that highly efficient gene KO can be achieved using Cas9-RNPs in human tonsillar T cells, while maintaining favorable cell viability.

KO tonsil organoids show inflammatory phenotypes

To investigate the impact of ablation of the FOXP3 and GZMB genes in T cells on the overall phenotype of tonsil organoids, we examined the percentages of different B and T cell subsets using surface markers associated with activation and differentiation. In the near absence of FOXP3 or GZMB gene in total T cells, tonsil organoids exhibited signs of inflammation, characterized by increases in percentages of cells expressing activation marker CD38 and costimulation molecule CD27 among both and T cells compared with WT (Fig. 2a and Extended Data Fig. 2a-d). In addition, there was a significant elevation in the percentage of activated cells from GZMBKO tonsil organoids (Fig. 2a and Extended Data Fig. 2e). With both KOs, tonsil organoids showed an increased percentage of germinal center B cells (CD38 ) and plasmablasts (CD38 ) (Fig. 2b and Extended Data Fig. 2f) in most donors.
To further investigate the role of CD8 cells in the inflammatory phenotypes observed in organoids with GZMB KO T cells-particularly given prior reports of cytotoxic effects mediated by CD4 cells
via granzyme B on autoreactive T cells -we replicated experiments by knocking out in either or cells (Extended Data Fig. 3a). Our findings revealed significant expansion of cells, cells, cells and plasmablasts within tonsil organoids containing T cells (Fig. 2c,d and Extended Data Fig. 3b,c). These results were consistent with the phenotypes seen for total T cells. Notably, in T cells also affected inflammation, as we observed a similar increase in the percentage of the population, especially in cells, cells and plasmablasts (Fig. 2c,d and Extended Data Fig. 3b,c).
cells play essential parts in the formation of germinal centers and direction of B cell differentiation by providing costimulatory signaling . To further investigate whether the expansion of plasmablasts we observed in organoids with in cells was due to direct interaction between T and B cells or occurred indirectly via cells, we examined B cell differentiation after efficient depletion of cells followed by KO of in cells (Extended Data Fig. 4a,b). When CXCR5 T cells were depleted, while the number of cells was kept the same as in the WT, there was a significant reduction in the frequency of plasmablasts and germinal center cells in GZMB KO tonsil organoids (Fig. 2e and Extended Data Fig. 4c). This finding suggests that the increased plasmablast levels require the presence of cells and thus are likely to represent an indirect effect.

Differential autoantibody production in KO tonsil organoids

Despite inflammatory phenotypes being observed in cells within both KO tonsil organoids, there was no significant change in autoantibody
Fig. 4 | Autoreactive B cells expanded from FOXP3 KO tonsil organoids after stimulation with LAIV and autoantigens. a, Representative FACS plot showing costained spheromer-positive B cells specific to PR3, snRNP-C and core histone (H3.1) after 7 days of culture. b, Fold change in the percentage of costained cells
between stimulation and PBS conditions in tonsils with WT, FOXP3 KO and GZMB KO T cells 7 days poststimulation ( donors). The mean ± s.e.m. is indicated. Statistical significance was calculated using two-way ANOVA followed by Tukey’s multiple comparisons test.
production compared with WT tonsil organoids, even with addition of the autoantigen to the culture (Extended Data Fig. 5). Previous studies have suggested that viral infection could be a primary factor in initiation of autoimmune diseases , and mouse models have shown the development of autoimmune phenotypes following viral infection . Thus, we investigated whether live attenuated influenza vaccine (LAIV) could induce an autoimmune response in the germinal center. The WT, FOXP3 KO and GZMB KO tonsil organoids were stimulated with phosphate-buffered saline (PBS), LAIV alone or a combination of LAIV and autoantigen cocktail. The autoantigen cocktail contained proteinase 3 (PR3), core histones, double-stranded DNA (dsDNA) and small nuclear ribonucleoproteins (snRNP), which are relatively common targets of autoantibodies in patients with autoimmune diseases and viral infections . In WT tonsil organoids, LAIV stimulation led to a decreased percentage of CD4 cells and an increased percentage of cells (Extended Data Fig. 6a,b), both characterized by elevated CD38 expression (Extended Data Fig. 6c,d). However, no significant increase in autoantibodies was observed following LAIV stimulation (Fig. 3). By contrast, the FOXP3-deficient tonsil organoids showed up to seven-fold higher levels of autoantibodies compared with WT after stimulation with LAIV and autoantigens (Fig. 3). We also observed that most FOXP3 KO tonsil organoids with high autoantibody production were derived from female donors, whereas stimulated KO tonsil organoids secreted only minimal levels of autoantibodies. These results suggest that CD4 cells have a more prominent role in control of autoantibody responses compared with cells, consistent with FOXP3 deficiencies observed in mice and humans .

Autoreactive B cells in FOXP3 KO organoids expanded after stimulation

The higher levels of autoantibody production in the FOXP3 KO tonsil organoids led us to hypothesize that the frequency of autoreactive B cells would also be elevated following stimulation. To test this hypothesis, we generated a pool of three ‘spheromers’, which are highly sensitive multimer reagents based on modified maxi-ferritin , specifically
targeting the autoantigens PR3, snRNP-C and core histone. In the presence of LAIV, the autoantigen cocktail profoundly stimulated the expansion of self-antigen-specific B cells in FOXP3 KO tonsil organoids (Fig. 4a,b), consistent with the observed autoantibody levels. Notably, the top two FOXP3KO tonsil organoids that produced the higher frequency of autoreactive B cells after LAIV plus autoantigen stimulation were also derived from female donors (Fig. 4b). By contrast, knocking out GZMB in tonsillar T cells had only a minor impact on the frequencies of autoreactive B cells (Fig. 4a,b), confirming that CD4 cells modulate autoantibody secretion by constraining the activation of autoreactive cells.

Differential autoreactive T cell response in KO organoids

Although KO tonsil organoids generated a mild autoantibody response (Fig. 3), in most donors we observed an increased percentage of activated T cells compared with WT tonsil organoids (Fig. 2a). This suggests that cells may exhibit a more robust suppressive response against autoreactive T cell responses. To test this hypothesis, we analyzed the effects of cells on cells specific to self-peptides derived from fructose bisphosphate aldolase, keratin, Y-chromosome-encoded SMCY, preproinsulin (PPI) and glutamic acid decarboxylase 65. These self-peptides have previously been detected in the blood of healthy humans, and SMCY-specific cells, in particular, are strictly regulated in males . To detect cells specific to these self-peptides, we generated spheromers and also used a peptide from the hepatitis C virus as a negative control. We stimulated the tonsil organoids with WT, FOXP3 KO and GZMB KO T cells derived from HLA-A*0201 donors with PBS, LAIV, or LAIV supplemented with the autoantigen-derived peptides. After 7 days poststimulation, two of three FOXP3 KO tonsil organoids showed a two-fold increase in the frequency of self-specific cells. All three KO tonsil organoids showed an almost-three-fold increase with statistical significance in self-peptide-specific CD8 T cells after stimulation with LAIV and the autoantigen peptide pool (Fig. 5a).
Fig. 5 | Differential and cell responses to autoantigens in FOXP3 KO and GZMB KO tonsil organoids after stimulation with LAIV and autoantigen stimulation. a, HLA-A0201 tonsil organoids under the indicated WT or KO conditions were cultured for 7 days and then collected for spheromer staining. The percentage of autoreactive cells was determined after gating cells and human papillomavirus spheromer-negative T cells. The fold change in the percentage of autoreactive T cells under stimulated conditions compared with the control group (treated with PBS) was calculated ( donors). b, HLA-DRB104:01 tonsil organoids with WT, FOXP3 KO or GZMB KO total CD3 T cells ( donors) were cultured for 7 days, followed by staining with self-peptide-specific or HA-specific spheromers. The fold change in the percentage of autoreactive-specific CD4 cells compared with the PBS
condition was calculated. T cells were depleted, followed by GZMB KO in cells. Subsequently, or cells were reintroduced into the culture before stimulation with LAIV and autoantigens. Control cultures (WT) received LAIV stimulation without depletion or gene KO. Representative FACS plots show the percentages of spheromer-positive autoreactive CD4+ T cells (upper panel) or HA-specific CD4 T cells (lower panel) from tonsil organoids under the indicated conditions. d, Fold change in the frequency of autoreactive and HA-specific CD4 T cells compared with WT ( donors). Mean ± s.e.m. is indicated. Statistical significance in and was calculated using two-way ANOVA followed by Tukey’s multiple comparisons test. Spher, spheromer; NS, not significant.
We next investigated the regulation of autoreactive cells by cell subsets. We selected self-peptides from gp100, fibrinogen or PPI, as these are relevant in antitumor responses and autoimmunity . These antigens can be recognized by cells in healthy individuals expressing HLA-DRB1*04:01 (ref. 34). Influenza hemagglutinin (HA)-specific spheromer reagents were included in the staining panel to assess the suppression by and cells of autoreactive T cells compared with other activated T cells. Notably, we
observed a statistically significant expansion of T cells specific to self-antigens, particularly in tonsil organoids with GZMB KO T cells stimulated by LAIV and autoreactive peptides (Fig. 5b). Whereas HA-reactive CD4 T cells expanded after LAIV stimulation, there was no significant difference in the percentage of HA -specific T cells across the WT, FOXP3KO and GZMB KO cultures (Extended Data Fig. 7). Furthermore, the majority of expanded autoreactive CD4 T cells in the KO stimulated tonsil organoids were derived from female donors
Fig. 6 | FOXP3 KO enhances antibody affinity, whereas GZMB KO shows only a limited effect. Cell supernatants from LAIV-stimulated WT, GZMB KO and FOXP3 KO tonsil cultures were collected after 10 days of culture. Biolayer interferometry assay was performed to measure the binding affinity of antibodies to HA CA/09 hemagglutinin. An overlay of binding traces under the indicated condition is shown. The was calculated from the off-rates ( ) using the equation for first-order rate kinetics: . Statistical significance was determined using one-way ANOVA followed by Tukey’s multiple comparisons test. NS, not significant.
(Fig. 5b). By contrast, knocking out FOXP3 did not affect the frequency of CD4 cells specific to self-antigens (Fig. 5b).
To further confirm that the increase in autoreactive cells from KO organoids was specifically due to functional impairment of cells, we depleted cells from tonsils derived from DRB1*04:01 donors, followed by KO of GZMB in CD8 T cells. and cells were then reintroduced into the culture and supplemented with selected self-peptides from gp100, fibrinogen, or PPI and LAIV cocktail. In the absence of cells and granzyme B, the cocktail profoundly stimulated the expansion of autopeptide-specific CD4 T cells. Reintroducing T cells from the same donor significantly reduced the percentage of autoreactive T cells, whereas introducing an equal amount of T cells did not (Fig. 5c,d). By contrast, there was no significant effect on the percentage of cells under comparable conditions. These results suggest that cells are a potent suppressor of autoreactive cells.
Overall, our results demonstrate that and cells have distinct areas of responsibility for suppression of self-reactive lymphocytes, albeit with some overlap.

FOXP3 KO enhances higher antibody affinity

AsFOXP3 is critical in regulation of autoantibody production, we investigated whether it could also affect antibody responses against foreign antigens. Taking advantage of the fact that we had used LAIV as an adjuvant in these experiments, we measured the half-life of the elicited antibodies against recombinant influenza hemagglutinin (HA). The tonsil organoids with WT, FOXP3 KO or GZMB KO T cells were stimulated with PBS or LAIV for 10 days. Supernatants from the organoid cultures were collected for the biolayer interferometry assays. Knocking out FOXP3 in tonsillar T cells led to an increase in the of the antibodies, such that it was up to 18 -fold higher than that in the donor-matched WT condition (Fig. 6), indicating that FOXP3-expressing T cells enable production of antibodies with much higher binding affinities in most tonsil donors. The effect of KO was less dramatic, with an average two-fold improvement in five donors. These data indicate that CD4 cells not only regulate autoreactive B cells but also have an impact on cells in general, effectively limiting their affinity to the typical range, at or near 1 nM .

Higher autoreactivity in organoids from women compared with men

In recent years, risk factors associated with autoimmune diseases, such as sex and aging, have garnered significant attention . Using our tonsil organoid system, we explored some factors that might be associated with self-reactive antibodies. A previous study showed that early immature B cells in healthy donors could produce self-reactive antibodies . Thus, we investigated whether autoreactive cells were also present in tonsils and whether there was a correlation with sex. For this purpose, we used biotinylated spheromers specific to PR3, snRNP or core histone, coupled with PE- or APC-conjugated streptavidin, and costained tonsil samples from age-matched male and female donors. In most donors, we successfully detected cells specific to these autoantigens, constituting approximately to of B cells. Notably, these higher levels were found only in the female donors (Fig. 7a,b). Next, we investigated whether sex and chronological age contributed to the autoantibody production we observed in stimulated tonsil organoids with FOXP3 KO T cells. Indeed, we found a strong correlation between autoantibody production and age, with higher levels of autoantibodies detected in donors above 40 years of age (Fig. 7c). These results highlight the unique and representative nature of tonsil cells and organoids as a valuable system for hypothesis testing and mechanistic studies related to human autoimmune diseases.

Discussion

Although we have learned a great deal about the characteristics and importance of FOXP3-expressing CD4 T cells in enforcing self-tolerance , it has only recently emerged that a small subset of cells, characterized by Ly49 expression in mice and KIR expression in humans, also plays an important part . These CD8 cells are particularly active in the intestines during acute celiac disease and are elevated in patients with other autoimmune diseases, as well as during infections in humans and mice . Conditional KO of the predominant gene in mice leads to autoimmune sequelae following either influenza or lymphocytic choriomeningitis virus infection . The importance of both cell types in controlling self-reactivity raises the question of what their specific roles might be. To address this question, we made use of our recent demonstration that a type of organoid made from human tonsil cells could reproduce many of the hallmarks of an adaptive immune response in vitro, especially when stimulated with various vaccines . The single-cell suspensions of tonsil cells as a starting point for organoid culture provide an ideal platform for using CRISPR-Cas9 gene editing to disable CD4 and cells to analyze their relative roles in controlling autoreactive and cells.
Knocking out FOXP3 resulted in expansion of self-reactive B cells and production of autoantibodies. Autoantibodies are a characteristic of FOXP3 disruption in humans and mice ; thus, this effect in the tonsil organoids phenocopies the in vivo results. However, it was surprising that despite both FOXP3 and GZMB KO resulting in similar levels of cells and plasma cells, the latter had only a minimal impact on autoantigen-specific antibody production. Given that cells are known to target cells, as observed in our study and others , but do not affect antibody production, we speculate that the effects of CD4+ cells on autoantibody production are exerted through direct interaction with B cells. This is supported by previous work showing that CD4 cells are present in follicles and T-B borders in human tonsils and can directly suppress B cell class switch recombination , as well as inhibiting autoantibody-producing B cells in vitro . Although FOXP3 ablation in human cells does not affect CD25 and CTLA-4 expression , other signaling molecules may be involved, considering the potential impact of FOXP3 on genome architectural functions and transcriptional regulation . Given the diverse FOXP3 cell population , understanding which subsets contribute to autoantibody production and cell regulation is crucial.
Fig. 7| Tonsillar B cells show a higher frequency of autoreactivity in women versus men, regardless of attenuating cells. a, Representative FACS plots showing spheromer (PR3)-positive tonsillar B cells from age-matched male and female donors. b, Dot plots illustrating the percentage of cells specific to PR3, histone and snRNP from age-matched donors ( ). c, Autoantibodies specific to PR3, dsDNA, snRNP and core histone were detected by ELISA in the supernatant of 10 -day cultures from organoids with WT and FOXP3 KO T cells stimulated with LAIV and autoantigen pools. The fold change in optical density compared with PBS was analyzed using a linear regression
model to predict the correlations between autoantibody levels, age and sex. The regression model coefficients (slopes) represent the effect of age on the response variable for each sex, with values indicating statistical significance. Model statistics ( -statistic, value and adjusted ) are reported for each autoantibody: dsDNA: , adjusted ; PR3: , adjusted ; histone: , , adjusted ; snRNP: , adjusted . In , significance was calculated using one-sided MannWhitney test; mean ± s.e.m. is indicated.
We also observed substantial increases in the bulk serological affinity of influenza-specific antibodies in most of the FOXP3-deficient organoids and to a lesser extent in KOs; this is reminiscent of the increased affinity for self-specific antibodies in AIRE-deficient individuals and indicates that disrupting T cell tolerance allows the emergence of higher-affinity antibodies. This is likely to relate to the phenomenon by which the higher the affinity of an antibody, the greater the chances of pathological cross-reactivity to one or more self-antigens . This result also suggests a reason that most monoclonal antibodies typically fall within the low nanomolar range and rarely higher .
Our results highlight the differential roles of and cells in regulating autoimmunity, potentially by targeting different cellular activities and involvement in different stages of autoimmune development. GZMB KO allowed both autoreactive CD4 and CD8 T cells to proliferate, demonstrating that cells are the major factor controlling T cell tolerance, especially for autoreactive CD4 T cells. This CD4 effect was earlier observed by the marked increase in cells in mice deficient in cells , suggesting that more cells were allowed to expand than normal when cell activity was absent or attenuated. In addition, previous work with patients infected with SARS-CoV-2 or influenza has demonstrated increased proportions of cells during these infections but no change in cells . Infection is a crucial trigger for the breakdown of tolerance, with many autoimmunity patients reporting an infection just before the onset of clinical symptoms . Thus, the disruption of CD8 cell control could be a key first step in triggering clinical autoimmunity. However, as autoantibodies can precede autoimmune disease by years , there is likely to be a loss of CD4 cell control earlier.
In summary, we have developed human tonsil organoid models of autoimmunity using CRISPR-Cas9 gene editing techniques. By performing targeted KO, we investigated the distinct roles of two different cell subsets. Knocking out FOXP3 in the CD4 cell within the tonsil organoids resulted in a drastic increase in autoreactive B cells, autoantibodies and antigen-specific antibody affinity. On the other hand, knocking out GZMB in T cells led to dysfunction of CD8 cells, promoting the expansion of cells and autoreactive and cells, and enhancing B cell differentiation. These findings align with observations made in mouse models and patients with defective and cells. Further exploration of the tonsil organoid model holds significant potential for identifying new mechanisms and translating them into therapeutic approaches for autoimmune diseases.

Online content

Any methods, additional references, Nature Portfolio reporting summaries, source data, extended data, supplementary information, acknowledgements, peer review information; details of author contributions and competing interests; and statements of data and code availability are available at https://doi.org/10.1038/s41590-024-02062-x.

References

  1. Valent, P. et al. Paul Ehrlich (1854-1915) and his contributions to the foundation and birth of translational medicine. J. Innate Immun. 8, 111-120 (2016).
  2. Goodnow, C. C. et al. Altered immunoglobulin expression and functional silencing of self-reactive B lymphocytes in transgenic mice. Nature 334, 676-682 (1988).
  3. Asano, M., Toda, M., Sakaguchi, N. & Sakaguchi, S. Autoimmune disease as a consequence of developmental abnormality of a T cell subpopulation. J. Exp. Med. 184, 387-396 (1996).
  4. Baecher-Allan, C. & Hafler, D. A. Human regulatory T cells and their role in autoimmune disease. Immunol. Rev. 212, 203-216 (2006).
  5. Jiang, H., Zhang, S. I. & Pernis, B. Role of CD8+ T cells in murine experimental allergic encephalomyelitis. Science 256, 1213-1215 (1992).
  6. Kim, H. J. et al. Stable inhibitory activity of regulatory T cells requires the transcription factor Helios. Science 350, 334-339 (2015).
  7. Kim, H. J., Verbinnen, B., Tang, X., Lu, L. & Cantor, H. Inhibition of follicular T-helper cells by CD8 regulatory T cells is essential for self tolerance. Nature 467, 328-332 (2010).
  8. Li , J. et al. cells suppress pathogenic T cells and are active in autoimmune diseases and COVID-19. Science 376, eabi9591 (2022).
  9. Saligrama, N. et al. Opposing T cell responses in experimental autoimmune encephalomyelitis. Nature 572, 481-487 (2019).
  10. Wagar, L. E. et al. Modeling human adaptive immune responses with tonsil organoids. Nat. Med. 27, 125-135 (2021).
  11. Kastenschmidt, J. M. et al. Influenza vaccine format mediates distinct cellular and antibody responses in human immune organoids. Immunity 56, 1910-1926.e7 (2023).
  12. Hadaschik, E. N. et al. Regulatory T cell-deficient scurfy mice develop systemic autoimmune features resembling lupus-like disease. Arthritis Res. Ther. 17, 35 (2015).
  13. Tsuda, M. et al. The spectrum of autoantibodies in IPEX syndrome is broad and includes anti-mitochondrial autoantibodies. J. Autoimmun. 35, 265-268 (2010).
  14. Chang, S. E. et al. New-onset IgG autoantibodies in hospitalized patients with COVID-19. Nat. Commun. 12, 5417 (2021).
  15. Poulsen, T. R., Jensen, A., Haurum, J. S. & Andersen, P. S. Limits for antibody affinity maturation and repertoire diversification in hypervaccinated humans. J. Immunol. 187, 4229-4235 (2011).
  16. Choi, S. J. et al. and NKG2A cells are distinct innate-like populations in humans. Cell Rep. 42, 112236 (2023).
  17. Rubtsova, K., Marrack, P. & Rubtsov, A. V. Sexual dimorphism in autoimmunity. J. Clin. Invest. 125, 2187-2193 (2015).
  18. Dieckmann, D., Plottner, H., Berchtold, S., Berger, T. & Schuler, G. Ex vivo isolation and characterization of cells with regulatory properties from human blood. J. Exp. Med. 193, 1303-1310 (2001).
  19. Baecher-Allan, C. M. & Hafler, D. A. The purification and functional analysis of human CD4 regulatory T cells. Curr. Protoc. Immunol. 72, 7.4B.1-7.4B. 12 (2006).
  20. Hori, S., Nomura, T. & Sakaguchi, S. Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3. Science https://doi.org/10.1126/science. 1079490 (2003).
  21. Salti, S. M. et al. Granzyme B regulates antiviral CD8+ T cell responses. J. Immunol. 187, 6301-6309 (2011).
  22. Li , J. et al. cells suppress pathogenic T cells and are active in autoimmune diseases and COVID-19. Science https://doi. org/10.1126/science.abi9591 (2022).
  23. Loebbermann, J. et al. Regulatory T cells expressing granzyme B play a critical role in controlling lung inflammation during acute viral infection. Mucosal Immunol. 5, 161-172 (2012).
  24. Ise, W. et al. T follicular helper cell-germinal center B cell interaction strength regulates entry into plasma cell or recycling germinal center cell fate. Immunity 48, 702-715.e4 (2018).
  25. Mintz, M. A. & Cyster, J. G. T follicular helper cells in germinal center B cell selection and lymphomagenesis. Immunol. Rev. 296, 48-61(2020).
  26. Shulman, Z. et al. T follicular helper cell dynamics in germinal centers. Science 341, 673-677 (2013).
  27. Getts, D. R., Chastain, E. M., Terry, R. L. & Miller, S. D. Virus infection, antiviral immunity, and autoimmunity. Immunol. Rev. 255, 197-209 (2013).
  28. Dieker, J. et al. Autoantibodies against modified histone peptides in SLE patients are associated with disease activity and lupus nephritis. PLoS ONE 11, e0165373 (2016).
  29. Kattah, N. H., Kattah, M. G. & Utz, P. J. The U1-snRNP complex: structural properties relating to autoimmune pathogenesis in rheumatic diseases. Immunol. Rev. 233, 126-145 (2010).
  30. Primo, V. C. et al. Anti-PR3 immune responses induce segmental and necrotizing glomerulonephritis. Clin. Exp. Immunol. 159, 327-337 (2010).
  31. Mallajosyula, V. et al. CD8 T cells specific for conserved coronavirus epitopes correlate with milder disease in patients with COVID-19. Sci. Immunol. https://doi.org/10.1126/sciimmunol.abg5669 (2021).
  32. Yu, W. et al. Clonal deletion prunes but does not eliminate self-specific CD8 T lymphocytes. Immunity 42, 929-941 (2015).
  33. Nielen, M. M. et al. Antibodies to citrullinated human fibrinogen (ACF) have diagnostic and prognostic value in early arthritis. Ann. Rheum. Dis. 64, 1199-1204 (2005).
  34. Su, L. F., Kidd, B. A., Han, A., Kotzin, J. J. & Davis, M. M. Virus-specific CD4 memory-phenotype T cells are abundant in unexposed adults. Immunity 38, 373-383 (2013).
  35. Yuan, J. et al. Safety and immunogenicity of a human and mouse gp100 DNA vaccine in a phase I trial of patients with melanoma. Cancer Immun. 9, 5 (2009).
  36. Zhang, L., Nakayama, M. & Eisenbarth, G. S. Insulin as an autoantigen in NOD/human diabetes. Curr. Opin. Immunol. 20, 111-118 (2008).
  37. Goronzy, J. J. & Weyand, C. M. Immune aging and autoimmunity. Cell. Mol. Life Sci. 69, 1615-1623 (2012).
  38. Whitacre, C. C. Sex differences in autoimmune disease. Nat. Immunol. 2, 777-780 (2001).
  39. Wardemann, H. et al. Predominant autoantibody production by early human B cell precursors. Science https://doi.org/10.1126/ science. 1086907 (2003).
  40. Fontenot, J. D., Gavin, M. A. & Rudensky, A. Y. Foxp3 programs the development and function of CD4 CD25 regulatory T cells. Nat. Immunol. 4, 330-336 (2003).
  41. Kim, J. M. & Rudensky, A. The role of the transcription factor Foxp3 in the development of regulatory T cells. Immunol. Rev. 212, 86-98 (2006).
  42. Sakaguchi, S. Naturally arising Foxp3-expressing CD25 regulatory T cells in immunological tolerance to self and non-self. Nat. Immunol. 6, 345-352 (2005).
  43. Yang, S., Fujikado, N., Kolodin, D., Benoist, C. & Mathis, D. Immune tolerance. Regulatory T cells generated early in life play a distinct role in maintaining self-tolerance. Science 348, 589-594 (2015).
  44. Zheng, Y. & Rudensky, A. Y. Foxp3 in control of the regulatory T cell lineage. Nat. Immunol. 8, 457-462 (2007).
  45. Hoshino, A. et al. Identification of autoantibodies using human proteome microarrays in patients with IPEX syndrome. Clin. Immunol. 203, 9-13 (2019).
  46. Kinnunen, T. et al. Accumulation of peripheral autoreactive B cells in the absence of functional human regulatory T cells. Blood 121, 1595-1603 (2013).
  47. McCarron, M. J. & Marie, J. C. TGF-beta prevents T follicular helper cell accumulation and B cell autoreactivity. J. Clin. Invest. 124, 4375-4386 (2014).
  48. Lim, H. W., Hillsamer, P., Banham, A. H. & Kim, C. H. Cutting edge: direct suppression of B cells by regulatory T cells. J. Immunol. https://doi.org/10.4049/jimmunol.175.7.4180 (2005).
  49. likuni, N., Lourenço, E. V., Hahn, B. H. & La, C. Cutting edge: regulatory T cells directly suppress B cells in systemic lupus erythematosus. J. Immunol. https://doi.org/10.4049/ jimmunol. 0901163 (2009).
  50. Lam, A. J. et al. Optimized CRISPR-mediated gene knockin reveals FOXP3-independent maintenance of human Treg identity. Cell Rep. 36, 109494 (2021).
  51. Zhang, W. et al. FOXP3 recognizes microsatellites and bridges DNA through multimerization. Nature 624, 433-441 (2023).
  52. Le Coz, C. et al. Human T follicular helper clones seed the germinal center-resident regulatory pool. Sci. Immunol. 8, eade8162 (2023).
  53. Davis, M. M. In praise of descriptive science: a breath of fresh AIRE. Cell 166, 530-531 (2016).
  54. Meyer, S. et al. AIRE-deficient patients harbor unique high-affinity disease-ameliorating autoantibodies. Cell 166, 582-595 (2016).
  55. Rabia, L. A., Desai, A. A., Jhajj, H. S. & Tessier, P. M. Understanding and overcoming trade-offs between antibody affinity, specificity, stability and solubility. Biochem. Eng. J. 137, 365-374 (2018).
  56. Suurmond, J. & Diamond, B. Autoantibodies in systemic autoimmune diseases: specificity and pathogenicity. J. Clin. Invest. 125, 2194-2202 (2015).
  57. Sundaresan, B., Shirafkan, F., Ripperger, K. & Rattay, K. The role of viral infections in the onset of autoimmune diseases. Viruses https://doi.org/10.3390/v15030782 (2023).
  58. Arbuckle, M. R. et al. Development of anti-dsDNA autoantibodies prior to clinical diagnosis of systemic lupus erythematosus. Scand. J. Immunol. 54, 211-219 (2001).
  59. Arbuckle, M. R. et al. Development of autoantibodies before the clinical onset of systemic lupus erythematosus. N. Engl. J. Med. 349, 1526-1533 (2003).
  60. Leslie, D., Lipsky, P. & Notkins, A. L. Autoantibodies as predictors of disease. J. Clin. Invest. 108, 1417-1422 (2001).
  61. Olsen, N. J., Okuda, D. T., Holers, V. M. & Karp, D. R. Editorial: understanding the concept of pre-clinical autoimmunity. Front. Immunol. 13, 983310 (2022).
Publisher’s note Springer Nature remains neutral with regard to jurisdictional claims in published maps and institutional affiliations.
Open Access This article is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License, which permits use, sharing, adaptation, distribution and reproduction in any medium or format, as long as you give appropriate credit to the original author(s) and the source, provide a link to the Creative Commons licence, and indicate if changes were made. The images or other third party material in this article are included in the article’s Creative Commons licence, unless indicated otherwise in a credit line to the material. If material is not included in the article’s Creative Commons licence and your intended use is not permitted by statutory regulation or exceeds the permitted use, you will need to obtain permission directly from the copyright holder. To view a copy of this licence, visit http://creativecommons. org/licenses/by/4.0/.
(c) The Author(s) 2025

Methods

Human samples and tonsil processing

The collection and processing of tonsil samples from children and adult volunteers were covered by institutional review board (IRB) protocols 30837 and 60741, approved by the Stanford University IRB. Blood from healthy donors was requested from the Stanford Blood Center under IRB protocol 40146. Written informed consent was obtained from adult participants and from the legal guardians of children aged years. No participant compensation was provided for the participants. Any individuals who were taking systemic immunomodulatory drugs, had a history of immunosuppressive or autoimmune diseases, or had a serious active infection at the time of the procedure were excluded.
The procedures for tonsil samples followed those described in a previous study . Tonsil samples were collected immediately after surgery and incubated in Ham’s F-12 medium (Gibco) containing Normocin (InvivoGen), penicillin and streptomycin for at least 1 h at before processing. Afterward, tonsil tissue was manually sectioned into small pieces ( ) and passed through a filter using a syringe plunger to obtain a cell suspension. The filter was repeatedly washed with complete medium to help filter the cells. Complete medium included RPMI supplemented with Glutamax (Thermo Fisher), fetal bovine serum (FBS), penicillin-streptomycin, Normocin (InvivoGen), insulin-transferrin-selenium supplement (Gibco), nonessential amino acids and sodium pyruvate. Debris was reduced by Ficoll density gradient separation. Collected cells were washed with PBS, enumerated and frozen into cryovials in FBS + 10% dimethyl sulfoxide. Frozen aliquots were stored at until use.

Blood processing

Blood was diluted with cell culture medium and FBS in a volume ratio. This diluted blood was then carefully placed on top of a density gradient medium (Ficoll-Paque, GE Healthcare) and centrifuged at 800 g for 20 min without the brake. For collection of peripheral blood mononuclear cells, a pipette was inserted directly through the upper plasma layer into the interface containing the mononuclear cells. The collected cells were washed twice with medium, frozen in aliquots using FBS with dimethyl sulfoxide and stored at until needed.

Cas9-RNP assembly and electroporation

Cas9-RNPs (Integrated DNA Technologies) were prepared by incubating Cas9 with gRNA (Synthego) at a 1:1 ratio at for 15 min , resulting in a final concentration of . The sequences of oligonucleotides are provided in Supplementary Table 1. Electroporation was performed using reagents from a P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit S (Lonza) according to the manufacturer’s instructions. Target T cells were gently suspended in P3 buffer supplemented with supplement 1 reagent at a density of million cells per . The Cas9-RNPs and T cells were mixed gently in the P3 buffer. This mixture was then transferred to a 4D-Nucleofector cuvette from Lonza Bioscience and subjected to electroporation using code EH105. Following electroporation, the cuvette was placed in the tissue culture incubator at for 30 min to allow the cells to recover. Once recovered, the cells were ready to be cultured in transwells.

Cell sorting and organoid assembly

For KO experiments involving total T cells, T cells were isolated from tonsil single-cell suspensions using a Human Pan T Cell Isolation Kit (Miltenyi Biotec) for electroporation. CD3 cells were obtained by depleting CD3 T cells using CD3 MicroBeads, human (Miltenyi Biotec). Organoids were reassembled by combining cells with cells at the same donor-specific cell ratio and cultured at a density of cells in per transwell.
For KO experiments in cells, untouched T cells were isolated using a CD8 T Cell Isolation Kit, human (Miltenyi
Biotec) for electroporation. The CD8 cell fraction was collected by staining the tonsil single-cell suspension with CD8-PE antibody for 30 min at , followed by depletion with anti-PE MicroBeads (Miltenyi Biotec). KO organoids were reassembled by combining cells with CD8 cells at the same donor-specific cell ratio and cultured in transwells.
For KO experiments in cells, untouched cells were first isolated using a Pan T Cell Isolation Kit, human (Miltenyi Biotec), followed by CD8 T cell depletion using a REAlease CD8 MicroBead Kit, human (Miltenyi Biotec). After electroporation and a recovery, the CD3 cells, CD8 T cells (beads removed according to the manufacturer’s instructions) and cells were recombined at the same donor-specific cell ratio and cultured at cells in per transwell.
For CXCR5 depletion followed by in cells, tonsil single-cell suspensions were stained with anti-human CD8-PE (BioLegend) and CXCR5-PE (BioLegend) antibodies at room temperature in the dark for 30 min . PE-positive cells were depleted using anti-PE MicroBeads (Miltenyi Biotec) according to the manufacturer’s instructions. Untouched CD8 T cells were isolated using a CD8 TCell Isolation Kit, human (Miltenyi Biotec), followed by electroporation. Finally, the cells were combined with the cell population at the same donor-specific cell ratio.

Cell culture and stimulation

For culture of cryopreserved cells, aliquots were thawed into complete medium, enumerated and resuspended to cells per ml for larger cultures or cells per ml for smaller cultures. Then, cells in were plated into each cell culture insert, which had a pore size (Millipore Sigma). 1 ml complete medium supplemented with was added to the lower chamber. (Intranasal FluMist Quadrivalent 2022-2023) was added per well, equivalent to to fluorescent focus units per strain. autoantigens were added in some experiments. of recombinant human B cell-activating factor (BioLegend) may be added to the culture after 4 days. Cell cultures were incubated at with humidity, and supplemented with additional medium to the lower wells as necessary.

functional assay

cells were purified from tonsil cells using CD8 microbeads (Miltenyi Biotec) per the manufacturer’s instructions and stained with flow antibodies, and live or cells were sorted out by flow cytometry (BD). Sorted cells were added back to CD8 tonsil cells, mixed with Cas9 protein and GZMB gRNA or scrambled gRNA (as WT) to perform KO. After being allowed to rest for 30 min postelectroporation, equal numbers of or cells were added to the culture of tonsil cells at a 1:50 ratio. A total of cells per condition in were plated into each cell culture insert, which had a pore size (Millipore Sigma). Then, 1 ml complete medium supplemented with LAIV (Intranasal FluMist Quadrivalent 2022-2023, equivalent to to fluorescent focus units per strain) and autopeptides was added to the lower chamber. After day of IL-2 and of recombinant human B cell-activating factor (BioLegend) were added to the culture. Cell cultures were incubated at with humidity, and supplemented with additional medium to the lower wells as necessary.

Flow cytometry

Culture organoids were resuspended by rinsing the membrane with medium and collected from the transwells. Cells were washed with fluorescence-activated cell sorting (FACS) buffer (PBS bovine serum albumin, sodium azide and 2 mM EDTA) and treated with Fc receptor block (BioLegend, ) in FACS buffer for 10 min ,
followed by staining with live/dead Aqua Zombie stain (Thermo Fisher) and antibodies against surface markers ( ). Antibodies against surface markers include anti-human CD3 (BUV805, Clone UCHT1, BD) and anti-human CD19 (BUV737, Clone HIB19, BD), anti-human CD4 (BV650, Clone OKT4, BioLegend), anti-human CD8 (BV421, Clone BPA-T8, BioLegend), anti-human CXCR5 (PE-Dazzle 594, Clone J252D4, BioLegend), anti-human PD1 (APC, Clone EH12.2H7, BioLegend), anti-human CD38 (Alexa Fluor 700, Clone HIT2, BioLegend), anti-human CD27 (Pecy7, Clone 0323, BioLegend), anti-human KIR3DL1 (PE, Clone DX9, BioLegend), anti-human KIR2DL2/L3/S2 (PE, Clone DX27, BioLegend), anti-human KIR2DL5 (PE, Clone UP-R1, BioLegend), anti-human CD25 (BV711, Clone M-A251, BioLegend) and anti-human KIR2DL2/L3 (PE, DX27, BioLegend). For intracellular staining, the cells were fixed and permeabilized with the Intracellular Fixation & Permeabilization Buffer Set (eBioscience) followed by staining with anti-human FOXP3 (AF647 or AF488, Clone 259D, BioLegend) or anti-granzyme B antibody (FITC, Clone QA16A02, BioLegend) ( ). All analyzer data were collected on BD FACSymphony or Agilent NovoCyte Penteon instruments and analyzed using FlowJo (TreeStar) and BD FACSDiva software.

Antibody detection by enzyme-linked immunosorbent assay

For detection of influenza-specific antibodies, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) plates (Costar) were coated with per well of 2022-2023 Fluzone Quadrivalent inactivated influenza vaccine (Sanofi). For detection of autoantigen-specific antibodies, ELISA plates (Costar) were coated with PR3, snRNP, core histone or dsDNA per well as the capture antigen. Plates were coated with capture antigen overnight, followed by blocking reagents for 2 h . Then, cell supernatants from tonsil culture were added to the coated, blocked plates. After the plates had been washed with washing buffer, horseradish peroxidase-conjugated anti-human secondary antibodies to (Sigma) were added to the plate for 1 h , followed by TMB substrate solution (Thermo Scientific). Sulfuric acid was added to stop the reaction, and the plates were read at 450 nm .

Protein expression, purification and biotinylation

We performed protein production and purification for generating spheromers following a previous study . Briefly, 20 ml of Expi293F cells were subcultured at a density of viable cells per ml in Expi293 expression medium (Thermo Fisher Scientific) and transfected with expression plasmids using ExpiFectamine 293 transfection reagent according to the manufacturer’s instructions. The cells were supplemented with enhancers after 18 h and further incubated for 4 days. The supernatant was collected by centrifugation ( ) and gently mixed with buffer-equilibrated nickel-nitrilotriacetic acid (Ni-NTA) beads (Qiagen) overnight at . Then, the Ni-NTA beads were collected and washed with 20 mM imidazole in HEPES-buffered saline (pH 7.2). The bound protein was eluted using 200 mM imidazole in HEPES-buffered saline (pH 7.2). The proteins were further purified using Amicon Ultra centrifugal units (Millipore Sigma) based on their molecular size. The eluted fractions were analyzed for purity using sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis. The protein was buffer-exchanged to remove the imidazole and biotinylated using a BirA biotin-protein ligase reaction kit (Avidity) according to the manufacturer’s recommendations. The biotinylated proteins were subsequently purified using Amicon Ultra centrifugal units (Millipore Sigma) based on their molecular weight. The eluted fractions were analyzed for purity and biotinylation using sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis.

Assembly of the peptide-MHC-spheromer complex and autoantigen-spheromer complex

The assembly was started by generating a semisaturated SAv-peptide complex. First, -I monomers (NIH tetramer
core facility), pMHC-I monomers (NIH tetramer core facility) or autoantigens (generated in-house) were incubated with streptavi-din-fluorophore (BioLegend) at a 1:0.45 ratio at room temperature for 30 min protected from light. The sequences of monomers are provided in Supplementary Table 2. Then, the mixture was incubated with an engineered maxi-ferritin scaffold at room temperature for 1 h protected from light with gentle rotation. Molar excess of D-biotin was added to saturate any free biotin-binding sites on streptavidin of . The assembled spheromer was stored at for later use.

Binding affinity measurement

The binding affinity of full-length H1 California/04/2009 influenza hemagglutinin ( ) to the antibodies secreted into the culture media of the indicated human tonsil organoids on day 10 after LAIV stimulation was measured by biolayer interferometry using an Octet QK instrument (Pall ForteBio). The antigen ( ) diluted in PBST (PBS with Tween 20, pH 7.4 ) was captured using Ni-NTA biosensors. The ligand-bound biosensors were dipped into a serially diluted culture supernatant. The association and dissociation were both monitored for 1 h . Double referencing was performed using unliganded biosensors and an irrelevant Escherichia coli maltose-binding protein. The was calculated from the off-rate ( ) using the equation for first-order rate kinetics, . Each binding interaction was performed in duplicate.

Statistical analysis

Most statistical analyses except for those shown in Fig. 7 were performed using GraphPad Prism (v.10). All results are presented as mean ± s.e.m. The significance of the differences between groups were analyzed as described in the figure legends. To assess the relationship between autoantibody levels and donor age and sex, a linear regression analysis was conducted for each autoantibody (dsDNA, PR3, histone and snRNP). Optical density fold changes from ELISA assays were used as the response variable, with age and sex interaction terms as predictors. The model estimated the coefficients (slopes) for age effects in males and females separately. Model fit was evaluated using the -statistic, value and adjusted value. Statistical significance was determined for each predictor, and residuals were assessed for model accuracy. All analyses were performed using R.

Reporting summary

Further information on research design is available in the Nature Portfolio Reporting Summary linked to this article.

Data availability

All data are available in Figs. 1-7, Supplementary Information and Extended Data Figs. 1-7. Source data are provided with this paper.

Code availability

Code for statistical analysis using and existing software packages has been described in the Methods section. No custom code was used in this study.

Acknowledgements

We thank all the volunteers and patients for their participation in this study. We also thank L. Chen and L. Kamalyan for tonsil processing, J. Li for providing the autoreactive peptides, the Stanford Shared FACS Facility for assistance in flow cytometric analysis, and D. Fernandez and O. N. Pattelli from Stanford ChEM-H Macromolecular Structure Knowledge Center for their guidance in protein production and purification. Finally, we thank the participants for donating their tissues for the tonsil organoids study. HLA typing was performed at the Stanford Functional Genomics Facility. This work was supported by the Lundbeck Foundation’s Danish American Research Exchange
Fellowship to M.G. and grants from the Howard Hughes Medical Institute, Open Philanthropy, The Bill and Melinda Gates Foundation, and NIAID (AIO57229) to M.M.D.

Author contributions

Project conceptualization and study design were performed by X.C. and M.M.D. Experiments were performed by X.C., M.G. and K.R.K. Data analyses were performed by X.C. and M.M.D. E.S. assisted with tonsil and peripheral blood mononuclear cell sample databases and data collection, processing and banking. V.M. performed the biolayer interferometry experiments and analysis. R.C. provided tonsil samples. X.C. and M.M.D. wrote the paper with input from all authors.

Competing interests

M.M.D., X.C., M.G. and V.M. are inventors on a patent application (PCT/US2023/010431) on the systems and methods incorporating modified T cells described in this work. The other authors declare no competing interests.

Additional information

Extended data is available for this paper at https://doi.org/10.1038/s41590-024-02062-x.
Supplementary information The online version contains supplementary material available at https://doi.org/10.1038/s41590-024-02062-x.
Correspondence and requests for materials should be addressed to Mark M. Davis.
Peer review information Nature Immunology thanks Bing Su and the other, anonymous, reviewer(s) for their contribution to the peer review of this work. Primary Handling Editor: S. Houston, in collaboration with the Nature Immunology team.
Reprints and permissions information is available at www.nature.com/reprints.
Extended Data Fig. 1| The cell subset percentage and phenotypic differences in tonsils compared to donor-matched peripheral blood and viability after knockouts. a, A detailed flow gating strategy is used for the plots in Fig. 1a-c. b, A representative FACS profile showing CD25, CXCR5, and FOXP3 expression
in PBMC and tonsil samples. c, A workflow of generating genetically modified tonsil organoids using Cas9-RNPs. d, A representative FACS profile showing Live/Dead staining of T cells from the WT, FOXP3 KO, and GZMB KO tonsil organoids.




Extended Data Fig. 4 | Representative plots showing plasmablast differentiation after depletion and cells of tonsil organoids. a, Granzyme B expression in CD8 T cells under the indicated conditions from tonsil organoids. b, CXCR5 expression in CD4 T cells under
indicated conditions from tonsil organoids. c, Expression of CD27 and CD38 in B cells from tonsil organoids with WT, GZMB KO, and CXCR5-depleted GZMB KO T cells.
Extended Data Fig. 5| PR3-Specific Autoantibody Production in Organoids with WT or FOXP3 KO T Cells. Ten-day cell supernatant from organoids with WT or FOXP3 KO T cells w as collected, and PR3-specific autoantibody was measured
by ELISA ( ). The fold change in PR3-specific antibody (OD) between PBS and PR3 conditions was calculated. Significance was determined using one-way ANOVA followed by Tukey’s multiple comparisons test. ns, not significant.
Extended Data Fig. and Tregs markers and phenotypes in WT organoids stimulated with LAIV or LAIV plus autoantigens. a, Representative FACS plots showing CD4 Tregs (FOXP3 in CD4 T cells) or CD8 Tregs (KIR in cells) in WT tonsil organoids after 5 days of culture. b, Fold change in the percentage of cells and cells in WT tonsil organoids stimulated with LAIV or LAIV plus autoantigens ( donors). c , Representative
FACS plots showing CD38 expression on CD4 Tregs (pre-gated on FOXP3 T cells) or Tregs (pre-gated on cells) in WT tonsil organoids after 5 days of culture. d, Fold change in the percentage of activated FOXP3 cells and cells in WT tonsil organoids stimulated with LAIV or LAIV plus autoantigens ( donors). Significance in (b) and (d) was calculated by one-way ANOVA followed by Tukey’s multiple comparisons test.

Abstract

Extended Data Fig. 7 | The percentage of HA -specific cells in organoids with WT, FOXP3 KO, or GZMB KO T cells. HLA-DRB1*04:01 tonsil organoids with WT, FOXP3 KO or GZMB KO total CD3 cells ( donors) were cultured for 7 days, followed by staining with HA-specific spheromer. The fold change in the percentage of HA -specific cells relative to the PBS condition was calculated. Mean ± s.e.m is indicated. Significances were calculated by two-way ANOVA followed by Tukey’s multiple comparisons test. All p-values are greater than 0.05.

natureportfolio

Corresponding author(s): Mark M Davis
Last updated by author(s): 2024/12/05

Reporting Summary

Nature Portfolio wishes to improve the reproducibility of the work that we publish. This form provides structure for consistency and transparency in reporting. For further information on Nature Portfolio policies, see our Editorial Policies and the Editorial Policy Checklist.

Statistics

For all statistical analyses, confirm that the following items are present in the figure legend, table legend, main text, or Methods section.
n/a
Confirmed
□ X
The exact sample size for each experimental group/condition, given as a discrete number and unit of measurement
□
□ A statement on whether measurements were taken from distinct samples or whether the same sample was measured repeatedly
□ X
The statistical test(s) used AND whether they are one- or two-sided
Only common tests should be described solely by name; describe more complex techniques in the Methods section.

□ A description of all covariates tested
□ X
A description of any assumptions or corrections, such as tests of normality and adjustment for multiple comparisons
□
A full description of the statistical parameters including central tendency (e.g. means) or other basic estimates (e.g. regression coefficient) AND variation (e.g. standard deviation) or associated estimates of uncertainty (e.g. confidence intervals)
□ X
For null hypothesis testing, the test statistic (e.g. ) with confidence intervals, effect sizes, degrees of freedom and value noted Give values as exact values whenever suitable.
□ For Bayesian analysis, information on the choice of priors and Markov chain Monte Carlo settings
□ For hierarchical and complex designs, identification of the appropriate level for tests and full reporting of outcomes
□ Estimates of effect sizes (e.g. Cohen’s , Pearson’s ), indicating how they were calculated
Our web collection on statistics for biologists contains articles on many of the points above.

Software and code

Policy information about availability of computer code
Data collection
Flow cytometry date were collected using BD FACSDiva software (v7). FACS data were obtained using BD FACSymphony or Agilent NovoVyte Penteon instruments.
Data analysis
FlowJo 10.7.0 was used for the analysis of flow cytometry data. GraphPad Prism 10.1 and R studio 4.0.3 were used for plotting and statistical analysis.
For manuscripts utilizing custom algorithms or software that are central to the research but not yet described in published literature, software must be made available to editors and reviewers. We strongly encourage code deposition in a community repository (e.g. GitHub). See the Nature Portfolio guidelines for submitting code & software for further information.

Data

Policy information about availability of data
All manuscripts must include a data availability statement. This statement should provide the following information, where applicable:
  • Accession codes, unique identifiers, or web links for publicly available datasets
  • A description of any restrictions on data availability
  • For clinical datasets or third party data, please ensure that the statement adheres to our policy
All data are available in the figures, text, and supplementary figures, with source data.
nature portfolio | reporting summary
April 2023

Research involving human participants, their data, or biological material

Policy information about studies with human participants or human data. See also policy information about sex, gender (identity/presentation), and sexual orientation and race, ethnicity and racism.
Reporting on sex and gender Both male and female patients are reported. Sex information was obtained from electronic patient records, with informed consent collected from all participants. The patients’ ages range from 4 to 66 years, with of the cohort being male and female. Sex data was provided in the source data
Reporting on race, ethnicity, or other socially relevant groupings Race and ethnicity data are listed in the supplementary information
Population characteristics Patients undergoing tonsillectomy were recruited with IRB approval for donating tissues to this study. Patients with serious infections or who were taking systemic immunomodulatory drugs were excluded from the study. The patients’ ages range from 4 to 66 years, with of the cohort being male and female.
Recruitment Patients will be referred to the appropriate clinical units for their respective care, such as surgical procedures. Prior to the patient’s surgery, our research team will contact the family of the child or adult patient to obtain written informed consent. Patients with serious infections or who were taking systemic immunomodulatory drugs were excluded from the study. Individiuals responsible for consenting patients and collecting tissues were not involved in the scientific aspects of the study. We do not expect any systematic bias in our collection strategy.
Ethics oversight The collection and process of tonsil samples from children and adult volunteers were covered by IRB protocols 30837 and 60741, approved by the Stanford University Institutional Review Board (IRB). Informed consents were obtained from the participants and/or from parents/legal guardians. No participant compensation was provided for the participants. Blood from healthy donors was requested from the Stanford Blood Center under IRB protocol 40146.
Note that full information on the approval of the study protocol must also be provided in the manuscript.

Field-specific reporting

Please select the one below that is the best fit for your research. If you are not sure, read the appropriate sections before making your selection.
Life sciences
Behavioural & social sciences
Ecological, evolutionary & environmental sciences
For a reference copy of the document with all sections, see nature.com/documents/nr-reporting-summary-flat.pdf

Life sciences study design

All studies must disclose on these points even when the disclosure is negative.
Sample size Sample sizes varied from to depending on the experiments performed. Sample size was based on previous expeiments (PMID: 33432170 ) and clinical samples availability.
Data exclusions No data were excluded
Replication The number of donors tested is provided in the figure legends. We anticipated inter-donor variation in response to the stimulation and treatment and responses to stimulation were reported in figures or in text. Different donors were used to demonstrate the range of possible responses.
Randomization Experimental groups were stimulation-related, sex and age-related, thus randomization is not relevant.
Blinding Blinding is irrelevant for this study as it is not a clinical trial. The objective is to assess cell culture responses to various treatments using established assays.

Reporting for specific materials, systems and methods

We require information from authors about some types of materials, experimental systems and methods used in many studies. Here, indicate whether each material, system or method listed is relevant to your study. If you are not sure if a list item applies to your research, read the appropriate section before selecting a response.
Materials & experimental systems
n/a Involved in the study n/a Involved in the study
□ – Antibodies X □
□ – Eukaryotic cell lines □ – Flow cytometry
– □ X □
– □
□
X □
め □

Antibodies

Antibodies used
anti-human CD3 (BUV805) 1/50 BD Biosciences Cat# 612895; RRID:AB_2870183
anti-human CD19 (BUV737) 1/50 BioLegend Cat# 741829; RRID:AB_2871164
anti-human CD4 (BV650) 1/50 BioLegend Cat# 317436; RRID:AB_2563050
anti-human CD8 (BV421) 1/50 BioLegend Cat# 301036; RRID:AB_10960142
anti-human CXCR5 (PE-Dazzle 594) 1/50 BioLegend Cat# 356928; RRID:AB_2563689
anti-human PD1 (APC) 1/20 BioLegend Cat# 329908; RRID:AB_940475
anti-human CD38 (Alexa Fluor 700) 1/100 BioLegend Cat# 303524; RRID:AB_2072781
anti-human CD27 (Pecy7) 1/100 BioLegend Cat# 302838; RRID:AB_2561919
anti-human CD158e1 (KIR3DL1) (PE) 1/50 BioLegend Cat# 312708; RRID:AB_2249498
anti-human CD158b (KIR2DL2/L3, NKAT2) (PE) 1/100 BioLegend Cat# 312606; RRID:AB_2130554
anti-human CD158f (KIR2DL5) Antibody (PE) 1/100 BioLegend Cat# 341304; RRID:AB_2130701
anti-FOXP3 (Alexa Fluor 488) 1/50 BioLegend Cat# 320212; RRID:AB_430887
anti-FOXP3 (Alexa Fluor 647) 1/50 BioLegend Cat# 320214; RRID:AB_492984
anti-granzyme B (FITC) 1/100 BioLegend Cat# 372206; RRID:AB_2687030
anti-human CD25 (BV711) 1/50 BioLegend Cat# 356138; RRID:AB_2632781
anti-human CD8 (PE) 1/10 BioLegend Cat#; 344706; RRID:AB_1953244
anti-human CXCR5 (PE) 1/25 BioLegend Cat# 356904; RRID:AB_2561813
Validation
All antibodies were purchased from commercial suppliers (BD Biosciences, BioLegend, ThermoFisher). Validation statement were confirmed from the manufacturers’ website for their relevant used in the study:
anti-human CD3 (BUV805) https://www.bdbiosciences.com/en-us/products/reagents/flow-cytometry-reagents/research-reagents/ single-color-antibodies-ruo/buv805-mouse-anti-human-cd3.612895
anti-human CD19 (BUV737) https://www.bdbiosciences.com/en-us/resources/scientific-resources?resourceType::all=all anti-human CD4 (BV650) https://www.biolegend.com/en-ie/products/brilliant-violet-650-anti-human-cd4-antibody-7786?
GroupID=BLG5901
anti-human CD8 (BV421) https://www.biolegend.com/en-ie/products/brilliant-violet-421-anti-human-cd8a-antibody-7152 anti-human CXCR5 (PE-Dazzle 594) https://www.biolegend.com/en-ie/products/pe-dazzle-594-anti-human-cd185-cxcr5-antibody-9860
anti-human PD1 (APC) https://www.biolegend.com/en-ie/products/apc-anti-human-cd279-pd-1-antibody-4413
anti-human CD38 (Alexa Fluor 700) https://www.biolegend.com/en-ie/products/alexa-fluor-700-anti-human-cd38-antibody-6050 anti-human CD27 (Pecy7) https://www.biolegend.com/en-us/products/pe-cyanine7-anti-human-cd27-antibody-8434
anti-human CD158e1 (KIR3DL1) (PE) https://www.biolegend.com/en-us/products/pe-anti-human-cd158e1-kir3dl1-nkb1-antibody-2286
anti-human CD158b (KIR2DL2/L3, NKAT2) (PE) https://www.biolegend.com/en-us/products/pe-anti-human-cd158b-j-kir2dI2-I3-s2-antibody-2281
anti-human CD158f (KIR2DL5) Antibody (PE) https://www.biolegend.com/en-us/products/pe-anti-human-cd158f-kir2dl5-antibody-5809
anti-FOXP3 (Alexa Fluor 488) https://www.biolegend.com/en-us/products/alexa-fluor-488-anti-human-foxp3-antibody-2908
anti-FOXP3 (Alexa Fluor 647) https://www.biolegend.com/en-us/products/alexa-fluor-647-anti-human-foxp3-antibody-2909 anti-granzyme B (FITC) https://www.biolegend.com/en-us/products/fitc-anti-human-mouse-granzyme-b-recombinant-antibody-14430
anti-human CD25 (BV711) https://www.biolegend.com/en-us/products/brilliant-violet-711-anti-human-cd25-antibody-13762 anti-human CD8 (PE) https://www.biolegend.com/en-us/products/pe-anti-human-cd8-antibody-6247
anti-human CXCR5 (PE) https://www.biolegend.com/en-us/products/pe-anti-human-cd185-cxcr5-antibody-8358

Eukaryotic cell lines

Policy information about cell lines and Sex and Gender in Research
Cell line source(s)
Authentication
Mycoplasma contamination
Expi293F Cells from thermofisher (cat# A14527)
Identity of the cell lines were frequently checked by their morphological features
Mycoplasma contamination was tested negative for mycoplasma via qPCR performed by ThermoFisher

Plants

Seed stocks N/A
Novel plant genotypes
□
N/A
Authentication N/A

Flow Cytometry

Plots

Confirm that:
The axis labels state the marker and fluorochrome used (e.g. CD4-FITC).
The axis scales are clearly visible. Include numbers along axes only for bottom left plot of group (a ‘group’ is an analysis of identical markers).
All plots are contour plots with outliers or pseudocolor plots.
A numerical value for number of cells or percentage (with statistics) is provided.
Methodology
Sample preparation Culture organoids were resuspended by rinsing the membrane with media and collected from the transwells. Cells were washed with FACS buffer (PBS+0.1% BSA, 0.05% sodium azide and 2 mM EDTA) and treated with Fc receptor block (Biolegend, ) in FACS buffer for 10 mins followed by staining with live/dead Aqua Zombie stain ( ), and antibodies against surface markers . For intracellular staining, the cells were fixed and permeabilized followed by staining with anti-FOXP3 or anti-granzyme B antibody ( ).
Instrument FACS data were obtained using BD FACSymphony or Agilent NovoVyte Penteon instruments. BD FACSAria was used for Cell sorting
Software Flow cytometry date were collected using BD FACSDiva software (v7).
Cell population abundance The purify of the sorted cells was more than
Gating strategy
For generating the plots in Fig. 1, we began by excluding debris through gating on FSC-A vs. SSC-A. Next, we gated for single cells using a diagonal plot of FSC-A versus FSC-H to remove doublets, followed by selecting live cells by gating the negative population from the Live/Dead stain. We then identified CD3+ T cells, distinguishing them from non-T cells by excluding CD19 cells. At this stage, we separated the two main cell subsets, and cells, into distinct populations using a CD4 vs. CD8 plot.
To identify the percentage of CD4+ Tregs as shown in Fig 1(A, left panel), we gated on total FOXP3+ cells within the CD4+ population. The percentage of the CD25- population in Fig 1(A, right panel) was further determined by gating on the CD25 negative population from FOXP3+CD4+T cells. To determine the percentage of T Follicular Regulatory cells, we examined the percentage of CXCR5 and FOXP3 double-positive cells from CD4+T cells.
Within the CD8+ T cell population, we identified CD8+ Tregs based on the expression of KIR (Killer Immunoglobulin-like Receptor), which defines a regulatory subset within CD8+T cells. Finally, we assessed the Granzyme B expression in these KIR + CD8+ Tregs.
Tick this box to confirm that a figure exemplifying the gating strategy is provided in the Supplementary Information.
  1. Institute for Immunity, Transplantation, and Infection, Stanford University, Stanford, CA, USA. Department of Immunology and Microbiology, University of Copenhagen, Copenhagen, Denmark. Division of Sleep Surgery, Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, Stanford University School of Medicine, Stanford, CA, USA. Department of Microbiology and Immunology, Stanford University School of Medicine, Stanford, CA, USA. The Howard Hughes Medical Institute, Stanford University School of Medicine, Stanford, CA, USA. These authors contributed equally: Xin Chen, Mustafa Ghanizada. -e-mail: mmdavis@stanford.edu