https://doi.org/10.1038/s41586-025-09263-w
تم الاستلام: 1 يونيو 2023
تم القبول: 9 يونيو 2025
تم النشر على الإنترنت: 16 يوليو 2025
الوصول المفتوح

Annalaura Mastrangelo ${ }^{mathbf{1 , 3 0}}$, Iñaki Robles-Vera ${ }^{mathbf{1 , 3 0}}$, Diego Mañanes ${ }^{mathbf{1 , 2}}$, Miguel Galán ${ }^{mathbf{1 , 2}}$, Marcos Femenía-Muiña ${ }^{1,3}$, Ana Redondo-Urzainqui ${ }^{1,2}$, Rafael Barrero-Rodríguez ${ }^{1,2}$, Eleftheria Papaioannou ${ }^{4,5,6}$, Joaquín Amores-Iniesta ${ }^{1}$, Ana Devesa ${ }^{1,7,8}$, Manuel Lobo-González ${ }^{1}$, Alba Carreras ${ }^{9}$, Katharina R. Beck ${ }^{9}$, Sophie Ivarsson ${ }^{9}$, Anders Gummesson ${ }^{9,10}$, Georgios Georgiopoulos ${ }^{11,12,13}$, Manuel Rodrigo-Tapias ${ }^{1,14}$, Sarai Martínez-Cano ${ }^{mathbf{1 , 1 4}}$, Ivan Fernández-López ${ }^{mathbf{1}}$, Vanessa Nuñez ${ }^{mathbf{1}}$, Alessia Ferrarini ${ }^{mathbf{1}}$, Naohiro Inohara ${ }^{15}$, Kimon Stamatelopoulos ${ }^{11}$, Alberto Benguría ${ }^{1}$, Danay Cibrian ${ }^{1,8,16}$, Francisco Sánchez-Madrid ${ }^{1,8,16,17}$, Vanesa Alonso-Herranz ${ }^{18}$, Ana Dopazo ${ }^{1,8}$, Coral Barbas ${ }^{19}$, Jesús Vázquez ${ }^{1,8}$, Juan Antonio López ${ }^{1,8}$, Alicia González-Martín ${ }^{4,5,6}$, Gabriel Nuñez ${ }^{15,19,20}$, Konstantinos Stellos ${ }^{21,22,23,24}$, Göran Bergström ${ }^{9,25}$, Fredrik Bäckhed ${ }^{9,25,26,27}$, Valentín Fuster ${ }^{1,28}$, Borja Ibañez ${ }^{1,8,29}$ & David Sancho ${ }^{1 boxtimes text { ® }}$

تعتبر الأمراض القلبية الوعائية (CVD) من الأسباب الرئيسية للوفاة في جميع أنحاء العالم، حيث يعد تصلب الشرايين المحدد الرئيسي لها. على الرغم من التقدم في الوقاية والعلاج، فإن الزيادة في المراضة والوفيات المرتبطة بـ CVD تبرز الحاجة إلى تدخلات مبكرة في السكان الذين يبدو أنهم أصحاء. تصلب الشرايين هو مرض معقد متعدد العوامل تعتمد وقايته على درجات تعتمد على عوامل الخطر القلبية الوعائية التقليدية التي لا تحدد الأفراد المعرضين لخطر الإصابة بأمراض الأوعية الدموية التصلبية في المراحل المبكرة . علاوة على ذلك، فإن التدخلات الدوائية الرئيسية مرتبطة بعوامل الخطر المعروفة (أيض الدهون ومؤخراً الالتهاب ). وهذا يبرز الحاجة إلى استكشاف العلاجات التي تستهدف عوامل أخرى في الفيزيولوجيا المرضية لتصلب الشرايين ، وخاصة للمرضى الذين، على الرغم من العلاج الأمثل، لا يزال لديهم خطر قلبي وعائي متبقي كبير .

التواصل بين أيض الميكروبيوتا والمضيف يساهم في CVD . ومع ذلك، تم وصف عدد قليل فقط من المستقلبات المعتمدة على الميكروبيوتا التي تتوافق مع المراحل المتأخرة من المرض . سعينا لتحديد المستقلبات الميكروبية المرتبطة
بالمراحل المبكرة من مرض الأوعية الدموية التصلبية التي يمكن أن تساهم في تقدم تصلب الشرايين.

للكشف عن المستقلبات الميكروبية التي يمكن أن تؤثر على تقدم تصلب الشرايين، قمنا بإطعام الفئران المعرضة لتصلب الشرايين Apoe أنظمة غذائية مختلفة مع أو بدون علاج بالمضادات الحيوية لتقليل الميكروبيوتا (الشكل التمديدي 1a). أدت الأنظمة الغذائية عالية الكوليسترول (HC) إلى تصلب الشرايين، والذي تم منعه جزئيًا عند العلاج بالمضادات الحيوية مع نظام غذائي HC مدعوم بالكولين (HC/HC) (الشكل 1a). أظهر التحليل الأيضي غير المستهدف إعادة تشكيل كبيرة لمتغيرات البلازما (الشكل 1b,c) المرتبطة بتغير تكوين الميكروبيوتا المعوية (الشكل 1d,e والشكل التمديدي 1b) عند إدارة النظام الغذائي والمضادات الحيوية. أولاً، قمنا بالتحقق من صحة التحليل الأيضي من خلال إثبات أن المستقلب المشترك بين المضيف والميكروبات، ثلاثي ميثيل الأمين -أكسيد (TMAO) تم تحفيزه من خلال إضافة الكولين الغذائي ومرتبط

الشكل 1| يكشف التحليل الأيضي غير المستهدف عن ImP كمستقلب معتمد على الميكروبيوتا مرتبط بتصلب الشرايين. تم إطعام الفئران Apoe نظام غذائي عادي، نظام غذائي HC أو نظام غذائي HC/HC مع أو بدون مضادات حيوية (abx) في مياه الشرب. أ، قياس حجم آفة اللويحات التصلبية في قوس الشريان الأورطي بواسطة صبغة زيت أحمر O. تمثل كل نقطة فأرًا فرديًا ( لكل مجموعة لجميع الظروف، باستثناء الفئران التي تتغذى على نظام غذائي عادي وتم إعطاؤها مضادات حيوية والفئران التي تتغذى على HC/HC، ). ، مخططات الدرجات لتحليل التمييز الجزئي (PLS-DA) الذي تم إجراؤه على بيانات الكروماتوغرافيا السائلة-مطياف الكتلة (LC-MS) لعينات البلازما المجمعة عند نقطة النهاية (القتل الرحيم) ( لكل مجموعة) للأنظمة الغذائية الثلاثة (ب) والأنظمة الغذائية الثلاثة مع المضادات الحيوية (ج) وتحليل تسلسل 16S rDNA لعينات الساكنة المجمعة عند نقطة النهاية (عادي، HC، ;

HC/HC، ) (د). هـ، تحليل غنى Chao1 لتنوع الميكروبيوتا. و، ز، وفرة ImP النسبية في البلازما من الفئران الذكور عند نقطة النهاية تم قياسها بواسطة LC-MS غير المستهدف (ف) والارتباط مع آفة قوس الشريان الأورطي (ز). ح، مصفوفة الارتباط تظهر الارتباط بين ImP وأجناس الميكروبيوتا المعوية (>0.1% من الوفرة الكلية) في عينات الساكنة من الفئران Apoe التي تتغذى على أنظمة غذائية عادية، HC أو HC/HC لمدة 8 أسابيع. تم تجميع البيانات من تجربتين مستقلتين (عادي، HC، ; HC/HC، ). ز، ح، معامل الارتباط ( ) و القيم تم حسابها بواسطة اختبار ارتباط ترتيب سبيرمان. أ، هـ، ف، البيانات الفردية والمتوسط الحسابي ± s.e.m. لكل مجموعة موضحة. ANOVA أحادي الجانب ذو جانبين مع تصحيح توكي. .
مع تصلب الشرايين بطريقة تعتمد على الميكروبيوتا (الشكل التمديدي 1c,d). من الجدير بالذكر أننا حددنا ImP، وهو مستقلب معتمد على الميكروبيوتا ، ليكون مرتبطًا بشدة بتصلب الشرايين عند التغذية بـ HC (الشكل 1f,g والشكل التمديدي 1e). كانت تركيزات ImP في البلازما مرتبطة أيضًا بتغيرات في بيئة الميكروبات المعوية عند التدخل الغذائي، وخاصة مع زيادة نسبية في الإشريكية القولونية وشيغيلة، أو الإيوباكتيريوم (الشكل 1h). ومع ذلك، يتطلب تحديد سلالات معينة لديها القدرة على إنتاج ImP مزيدًا من التحقيق.

بعد ذلك، هدفنا إلى التحقيق فيما إذا كانت زيادة تركيز ImP في البلازما مرتبطة أيضًا بتصلب الشرايين في البشر. قمنا بتجنيد 400 متطوع غير مصابين من دراسة تقدم تصلب الشرايين تحت السريري المبكر (PESA)-المركز الوطني للبحوث القلبية الوعائية (CNIC)-سانتاندر (المشار إليها لاحقًا بدراسة PESA) (الجدول التمديدي 1a,b). بناءً على التصوير متعدد المناطق ومتعدد الأنماط (الموجات فوق الصوتية الوعائية ثنائية الأبعاد أو ثلاثية الأبعاد والتصوير المقطعي المحوسب غير المتباين)، قمنا بتصنيف 295 مشاركًا يعانون من تصلب الشرايين تحت السريري و105 ضوابط بدون تصلب الشرايين. تم تعريف مدى تصلب الشرايين وفقًا لعدد المواقع الوعائية المتأثرة ودرجة الكالسيوم في الشريان التاجي (CAC). تم استخدام التحليل الأيضي المستهدف لقياس ImP ومستقلباته ذات الصلة (الهستيدين وحمض يوروكان) في عينات البلازما. كانت تركيزات ImP في البلازما، ولكن ليس الهستيدين أو حمض يوروكان، مرتفعة بشكل انتقائي في الأفراد الذين يعانون من تصلب الشرايين تحت السريري مقارنة بالضوابط (الشكل 2a والشكل التمديدي 2a). لوحظت ارتباطات خطية وغير خطية بين تركيزات ImP وتصلب الشرايين ومدى تصلب الشرايين، على التوالي
(الشكل 2b). تم قياس ImP بعد ذلك في مجموعة مستقلة، مجموعة تحمل تحمل الجلوكوز (IGT) (الجدول التمديدي 2a,b)، والتي تضم متطوعين غير مصابين، بما في ذلك 529 ضابطًا و1,315 فردًا يعانون من تصلب الشرايين تحت السريري . من الجدير بالذكر أن الارتباط بين ImP وتصلب الشرايين المبكر تم تأكيده (الشكل 2c,d والشكل التمديدي 2a).

استكشفنا أيضًا الارتباط بين ImP، أنماط النظام الغذائي وتكوين الميكروبيوتا. من بين خمسة أنماط غذائية رئيسية مشتقة من تحليل المكونات الرئيسية (PCA) في مجموعة PESA (الشكل التمديدي 2b)، كان ImP مرتبطًا عكسيًا بنمط غذائي إفطار1 ونمط غذائي متوسطي (الشكل 2e)، بما يتماشى مع النتائج السابقة تم الكشف عن تسلسل الحمض النووي الريبوسومي (rDNA) لعينات البراز عن وجود ارتباط مباشر بين ImP والوفرة النسبية لـ Veillonella و Acidaminococcus، وارتباط عكسي مع عائلتي Erysipelotrichaceae و Coriobacteriaceae (الشكل 2e)، والتي تتغير في الأفراد الذين يعانون من أمراض القلب والأوعية الدموية. .

بعد ذلك، قمنا بالتحقيق في العلاقة بين مستوى ImP في البلازما وعوامل الخطر القلبية الوعائية المعروفة. في كلا المجموعتين، كان هناك ارتباط مباشر بين ImP ومستوى الجلوكوز الصائم وملف القلب الأيضي السلبي، بما في ذلك زيادة بروتين سي التفاعلي عالي الحساسية (hs-CRP)، ومؤشر كتلة الجسم (BMI)، والدهون الحشوية، والخلل الدهني وارتفاع ضغط الدم، وانخفاض مستوى كوليسترول البروتين الدهني عالي الكثافة (HDL) (الشكل 2e، f والجداول التكميلية 1b و2b). كما زادت نسبة نقاط تصلب الشرايين ودرجة CAC عبر تيرتيلات ImP المتزايدة (الجداول التكميلية 1b و2b). بعد تعديل العوامل التقليدية في كلا المجموعتين، كانت مستويات ImP الأعلى مرتبطة بشكل مستقل بالنتائج الرئيسية لتصلب الشرايين (الشكل 2g والجدول التكميلية 3)، مما يشير إلى أن مستويات ImP العالية تعتبر مؤشراً على زيادة خطر تصلب الشرايين. ومن الجدير بالذكر أن ImP أظهر أيضاً قيمة إضافية عند إضافته إلى مؤشرات تصلب الشرايين المعتمدة على الدم مثل

أ ، ج ، بلازما ImP في الأفراد الأصحاء (Ctrl) والأفراد الذين يعانون من تصلب الشرايين تحت السريري (AT) من PESA (أ ؛ Ctrl، و IGT(c; Ctrl، ; AT، ) المجموعات. ب، د، منحنيات الاستجابة للجرعة لتركيز ImP في البلازما والنقاط النهائية في مجموعات PESA (ب) و IGT (د). هـ، و، مصفوفات ارتباط سبيرمان بين ImP وخصائص تصلب الشرايين، النظام الغذائي والميكروبيوم في مجموعات PESA (هـ) و IGT (و). تم تعديل بنجاميني-هوشبرغ القيم. ALT، ألانين أمينوترانسفيراز؛ AST، أسبارتات أمينوترانسفيراز؛ BM، نخاع العظم؛ ECO2D، الموجات فوق الصوتية الوعائية ثنائية الأبعاد؛ ECO3D، الموجات فوق الصوتية الوعائية ثلاثية الأبعاد؛ F، عائلي؛ GFR، معدل تصفية الكلى؛ GGT، غاما-جلوتاميل ترانسفيراز؛ HTN، ارتفاع ضغط الدم. ج، نماذج الانحدار المعدلة لارتباط ImP بتصلب الشرايين (يسار) ومدى تصلب الشرايين (يمين) في PESA (أعلى، ) و IGT (أسفل، تم التحكم في تقديرات التأثير لعوامل مثل العمر، الجنس، التدخين، الكرياتينين، التاريخ العائلي لأمراض القلب والأوعية الدموية، الهيموجلوبين، ارتفاع ضغط الدم و LDL-C (مجموعة PESA) والعمر، التدخين، التاريخ العائلي لأمراض القلب والأوعية الدموية، ارتفاع ضغط الدم، LDL-C، Hb1Ac، hs-CRP و ALT (مجموعة IGT). أشرطة الخطأ
عرض فترات الثقة 95%. أو، نسبة الأرجحية. ج، مستوى ImP في البلازما لدى الأفراد الذين يعانون من تصلب الشرايين غير النشط (FDG ) وتصلب الشرايين النشط (FDG ، تم تصنيف الأفراد بشكل إضافي وفقًا للالتهاب الوعائي (الشرياني امتصاص F-FDG أ، تفعيل نخاع العظام امتصاص F-FDG في نخاع العظم، بي إم، ) والالتهاب الجهازي (التهاب الشرايين ونخاع العظام المتزامن امتصاص F-FDG، FDG نظام، ) (ج). FDG تشير إلى مجموعة من تصلب الشرايين غير النشط. أ، ج، ح، ج، الخط الأفقي يمثل الوسيط وأشرطة الخطأ تظهر النطاق الربعي (الجداول التكميلية 1أ، 2أ و4). اختبار مان-ويتني ذو الطرفين -اختبار. منحنى الاستجابة للجرعة لتأثير ImP في البلازما على تصلب الشرايين النشط لمجموعة PESA. ب، د، ي، تمثل الخطوط المتقطعة فترة الثقة؛ الخطوط الرأسية تحدد الثلثيات. ك، الانحدار اللوجستي المتعدد للصلابة تحت السريرية في مجموعات تصلب الشرايين ( _ _ أ و ) مقابل الضوابط وفقًا لمستوى ImP في البلازما. تم تعديل نسبة الأرجحية حسب العمر والجنس والتدخين والجلوكوز وhs-CRP وتركيز الهيموجلوبين. g، k، تشير الخطوط إلى فترات الثقة 95% (القيم في الجداول التكميلية 3 و 5). .
الكوليسترول منخفض الكثافة (LDL) و hs-CRP في تمييز انتشار تصلب الشرايين في كلا المجموعتين (الشكل البياني الموسع 2c، d).

في مجموعة PESA، تم تصنيف الأفراد الذين يعانون من تصلب الشرايين تحت السريري بشكل إضافي بواسطة -فلوروديوكسي جلوكوز ( امتصاص -FDG) في الشرايين و/أو تنشيط نخاع العظام في أولئك الذين لديهم عمليات أيضية
تصلب الشرايين النشط ( ) أو لا ( تمت ملاحظة زيادة في تركيز ImP في البلازما في مجموعة، تتبع ارتباطًا غير خطي مع النتيجة (الشكل 2h، i). مزيد من التصنيف حسب أظهر امتصاص F-FDG (الشكل البياني الموسع 2e والجدول التكميلي 4) تركيزًا أعلى من ImP في البلازما في المجموعات الفرعية للعظام

الشكل 3 | زيادة مستوى ImP المتداول تحفز تصلب الشرايين والالتهاب الجهازي في الفئران المعرضة لتصلب الشرايين التي تتغذى على الطعام العادي. أ، تم إعطاء ImP (lmP) أو عدم إعطائه (Ctrl) للفئران التي تتغذى على الطعام العادي. فئران. صبغة الزيت الأحمر O لقوس الشريان الأورطي (يسار، ) وصور تمثيلية للأبهر (يمين). ب-هـ، تم إعطاء ImP (lmP) أو عدم إعطائه (Ctrl) لـ Apoe الفئران. ب، الكمية (يسار) وصور تمثيلية (يمين) لصبغة زيت أحمر O لآفات جذر الشريان الأورطي. تشير رؤوس الأسهم إلى المناطق التي تحتوي على صبغة زيت أحمر O إيجابية. قضبان القياس، تحليل تدفق الخلايا لـ Ly6C وحيدات النواة و T-bet في CD4 خلايا T في الدم عند نقطة النهاية. صحيح، مخططات الكثافة التمثيلية لـ Ctrl و ImP. e، تقريب وتوقع متعدد الأبعاد (UMAP) (يسار) ونسب الخلايا (يمين) معلمة بنوع الخلايا المشتقة من الشريان الأورطي بالكامل، بناءً على الملفات التعبيرية. DCs، خلايا دندريتية؛ ECs، خلايا بطانية؛ FBs، ألياف؛ MFs، بلاعم؛ VSMCs، خلايا العضلات الملساء الوعائية. f، فئران تم تطعيمها بنخاع العظام من النوع البري (WT) (Ctrl، ) أو تصلب الشرايين بواسطة صبغة الزيت الأحمر O لفرع الشريان الأورطي (يسار) وممثل
صور الشريان الأورطي (يمين). ج، خريطة حرارية لتحليل المسار الجيني المقارن بين ImP والمجموعة الضابطة لخلايا البطانية، الألياف، والبلعميات من بيانات تسلسل RNA أحادي الخلية لـ Apoe فئران تم تغذيتها بنظام غذائي لمدة 4 أسابيع. EMT، الانتقال الظهاري-الم mesenchymal؛ NES، درجة الثراء المنظم. h، الوفرة العالمية للببتيدات (mTOR) والببتيدات الفوسفورية (p-mTOR) في BMDMs (يسار) أو MEFs (يمين) المعالجة بـ ImP لمدة 3 ساعات مع أو بدون AGN192403 (AGN). النسبة تتعلق بالظروف غير المحفزة. أنا، فئران تم تطعيمها بنخاع العظام من رابتور التحكم أو أبتور تحديد الكمية (يسار) وصور تمثيلية (i) لصبغة زيت الأحمر O للشريان الأورطي، تظهر تصلب الشرايين في قوس الشريان الأورطي. a-d,f,i، نقاط بيانات فردية ومتوسط ± انحراف معياري للخطأ على الأقل من تجربتين مستقلتين مجمعتين. a-d، اختبار t لعينات غير مرتبطة ذو طرفين. -اختبار. f,i، تحليل التباين الأحادي مع تصحيح توكي بعد الاختبار. g، اختبار كولموغوروف-سميرنوف ثنائي الاتجاه يقارن ImP مقابل غير المحفز. h، اختبار ويلكوكسون ذو الرتبة الموقعة ثنائي الاتجاه يقارن وفرة الببتيد والفوسفوببتيد في ImP مقابل ImP بالإضافة إلى علاجات AGN.
تنشيط النخاع _BM) والالتهاب الجهازي ( _SYS; الشكل 2j). من الجدير بالذكر أنه بعد التعديل لعوامل الخطر التقليدية، ظلت العلاقة بين ImP وزيادة المخاطر ذات دلالة إحصائية عبر جميع الفئات الفرعية من النشاط الأيضي. تصلب الشرايين (الشكل 2k والجدول التكميلي 5). بالإضافة إلى ذلك، أظهر ImP قدرة تمييز إضافية لتصلب الشرايين النشط مقارنةً بالكوليسترول LDL و hs-CRP بمفردهما (الشكل البياني الموسع 2c، d). تكشف هذه النتائج عن ارتباط قوي بين ImP وتصلب الشرايين، وخاصةً تصلب الشرايين النشط، مما يشير إلى إمكانية استخدامه كمؤشر على تصلب الشرايين النشط المبكر قبل أن تصبح الأمراض المصاحبة عوامل مشوشة.

لاستكشاف تأثير ImP على تصلب الشرايين بشكل أعمق وتحديد ما إذا كان له دور سببي في تطوير المراحل المبكرة من المرض، قمنا بإعطاء ImP في مياه الشرب لفئران معرضة لتصلب الشرايين، بما في ذلك تلك التي تتغذى على العلف. الفئران، التي عالجناها بـ ImP لمدة 12 أسبوعًا (الشكل 3 أ والشكل البياني الممتد 3 أ، ب) وتغذت على طعام عادي الفئران، التي عالجناها بـ ImP لمدة 8 أسابيع (الشكل 3ب)
و الشكل الإضافي للبيانات 3c-e). في كلا النموذجين، زادت مكملات ImP من تطور تصلب الشرايين في الشريان الأورطي وجذر الشريان الأورطي دون التأثير على تركيز الكوليسترول أو الجلوكوز في الدم (الشكل 3a,b والشكل الإضافي للبيانات 3a-e). أدى التغذية بنظام HC الغذائي وحده إلى إنتاج ImP (الشكل 1f). لم تؤدِ مكملات ImP الإضافية إلى تفاقم تصلب الشرايين بشكل كبير في المجموعة التي تغذت على HC. الفئران، على الرغم من أنها زادت من آفات تصلب الشرايين في الفئران (الشكل 3f، g من البيانات الموسعة). وبالتالي، لإقامة نموذج مباشر يعتمد على ImP لتصلب الشرايين من أجل التحقيقات اللاحقة، قمنا بإعطاء ImP حصريًا للفئران التي تتغذى على طعام عادي. ومن الجدير بالذكر، الفئران المعالجة بـ ImP لمدة ثمانية أسابيع أظهرت توسعًا في الخلايا الالتهابية البروتينية Ly6C الخلايا الوحيدة، وخلايا T المساعدة و خلايا T المساعدة الخلايا (الشكل 3ج، د والشكل التوضيحي الممتد 4أ) في الدم، المرتبطة ببيئة مؤيدة لتصلب الشرايين .

لفهم التغيرات المحددة التي يسببها ImP في الشريان الأورطي، قمنا بإجراء تحليل تسلسل RNA على مستوى الخلية الواحدة (scRNA-seq) للشريان الأورطي بالكامل من الفئران التي تتغذى على نظام غذائي عادي. الفئران التي تم إعطاؤها ImP لمدة أربعة أو ثمانية أسابيع (الشكل 4b-e من البيانات الموسعة). أظهرت الفئران المعالجة بـ ImP لمدة أربعة أسابيع زيادة طفيفة في تصلب الشرايين في قوس الأبهر (الشكل 4f من البيانات الموسعة)، وبعض التغيرات المحلية في
تكرار تجمع الخلايا في الشريان الأورطي (الشكل التوضيحي 4e)، دون تغييرات في الخلايا المناعية الدائرة (الشكل التوضيحي 4g، h). بالمقابل، أظهر تسلسل RNA أحادي الخلية للشرايين الأورطية من الفئران المعالجة بـ ImP لمدة ثمانية أسابيع زيادة في العدد النسبي للأرومات الليفية، والخلايا البطانية، والخلايا المناعية (الشكل 3e). تم تأكيد العدد المتزايد من الخلايا المناعية في الشريان الأورطي من خلال تحليل تدفق الخلايا (الشكل التوضيحي 4i) والتحليل النسيجي لجذر الشريان الأورطي، الذي أظهر زيادة في تسلل خلايا T في طبقة الإنتيما-ميديا وزيادة في صبغة MAC2 للماكروفاجات الالتهابية في لويحة التصلب العصيدي للفئران المعالجة بـ ImP مقارنة بالمجموعة الضابطة (الشكل التوضيحي 4j، k). من المRemarkably، كانت قدرة ImP على تحفيز تصلب الشرايين منخفضة بشكل ملحوظ في فئران مزروعة بـ نخاع العظام، الذي يفتقر إلى خلايا T و B (الشكل 3f والشكل 41 من البيانات الموسعة). تحدد هذه البيانات ImP كمساهم جديد في مسببات تصلب الشرايين في الفئران المعرضة لتصلب الشرايين، والذي يرتبط بتنشيط الاستجابة المناعية دون التأثير على تركيز الكوليسترول في مجرى الدم.

لتحليل الأهداف الخلوية لمركب ImP في الشريان الأورطي، قمنا بدراسة التغيرات النسخية باستخدام تحليل scRNA-seq بعد أربعة أسابيع من العلاج. أظهر تحليل إثراء مجموعة الجينات (GSEA) لكل نوع خلية زيادة في المسارات النسخية المرتبطة بالالتهابات في البلعميات، والألياف، والخلايا البطانية بعد علاج ImP (الشكل 3g). أظهر إعادة تجميع كل نوع خلية في تحليلات مستقلة تحديد أربعة مجموعات فرعية من البلعميات، وخمس مجموعات فرعية من الألياف، وثلاث مجموعات فرعية من الخلايا البطانية (الشكل التمديدي 5a-c). أظهر تحليل تأثير ImP في هذه المجموعات الفرعية (بما في ذلك بيانات الأربعة والثمانية أسابيع) انخفاضًا في مجموعة MF1 المرتبطة بالجينات المنزلية. وزيادة في مجموعة MF3 التي تعبر عن الجينات المرتبطة بتمثيل الدهون، والالتهاب، وتنشيط البلعميات (الشكل البياني الممتد 5d، g). أدى زيادة ImP في الدورة الدموية إلى توسيع مجموعات FB2 وFB3 وFB4 في الشريان الأورطي، والتي تم تمييزها بتعبير الجينات المرتبطة باستجابة الأستيل كولين، والاستجابة المناعية، والالتهاب، وتنظيم المصفوفة خارج الخلوية، على التوالي (الشكل البياني الممتد 5e، g). أخيرًا، مجموعة EC1، التي أعربت عن جينات تنظم وظيفة الخلايا البطانية. علامات الميزانشيم وجينات تعزيز تكوين الأوعية الدموية تم إثراءه في الشريان الأورطي بعد علاج ImP (الشكل 5f، g من البيانات الموسعة).

متسقًا مع هذه النتائج، كان بإمكان ImP تنشيط الخلايا الليفية الجنينية الفأرية (MEFs) في المختبر من خلال تحفيز إنتاج بروتين كيميائي جاذب للوحيدات النواة النشط-1، الذي يزيد من تجنيد الوحيدات النواة (الشكل البياني الممتد 5h,i) المرتبط بتكوين تصلب الشرايين. علاوة على ذلك، أظهرت تحليل تسلسل RNA (RNA-seq) تحفيزًا سريعًا للعديد من المسارات الالتهابية ومسارات التنشيط بعد إعطاء ImP، لا سيما في البلعميات المشتقة من نخاع العظم (BMDMs) وفي خلايا الفيبروبلاست (MEFs)، ولكن ليس في خلايا بطانة الشريان الأورطي للفئران (MAECs) (الشكل التمديدي 5j)، مما يشير إلى أن البلعميات والفيبروبلاست قد يكونان الأهداف الرئيسية لـ ImP. ومن الجدير بالذكر أن تحليل الفوسفوبروتينات أظهر زيادة في الوفرة العالمية للفوسفوببتيدات التابعة لمسار mTOR في BMDMs وMEFs بعد علاج ImP (الشكل 3h والشكل التمديدي 5k). كانت هذه النتائج متوافقة مع النتائج السابقة في الخلايا الكبدية الأولية. وزيادة إشارة S6 الفسفورية (p-S6) (التي تشير إلى تنشيط mTOR) التي وجدناها في BMDMs و MEFs بعد علاج ImP (الشكل التوضيحي الممتد 51). علاوة على ذلك، فإن التحضين المسبق مع مثبط mTOR، الراباميسين، منع تحفيز إنتاج TNF بواسطة ImP في BMDMs و MEFs (الشكل التوضيحي الممتد 5m). Apoe الفئران التي تم تغذيتها بنظام غذائي من الشوفان وتم إعطاؤها ImP لمدة 8 أسابيع أظهرت أيضًا زيادة في p-S6 في البلعميات البريتونية (الشكل البياني الممتد 5n). ومن الجدير بالذكر أن الحذف الانتقائي لـ Raptor (المعروف أيضًا باسم Rptor؛ المرتبط بتنظيم mTOR) في الخلايا النخاعية لـ فئران تم تطعيمها بنخاع العظم من راaptor مقابل رابتور التحكم أخوة الأشقاء منعوا تحفيز تصلب الشرايين بواسطة ImP (الشكل 3i والشكل الإضافي 50). هذه البيانات تظهر أن ImP مباشرة
يُفعّل استجابة التهابية تعتمد على mTOR في الخلايا النخاعية، مما يساهم في تكوين اللويحات.

نظرًا لأن ImP يحتوي على حلقة إيميدازول، افترضنا أنه يمكن أن يتم استشعاره بواسطة مستقبلات الإيميدازولين المعبر عنها بشكل شائع IIR و لذا قمنا بمعالجة BMDMs و MEFs بـ ImP في وجود AGN192403 (مضاد I1R) أو إيدازوكسين (مضاد لمستقبلات الإيميدازولين) . نظرًا لأن العديد من ligands مستقبلات الإيميدازولين قد ترتبط أيضًا -مستقبلات الأدرينالين (على سبيل المثال، إيدازوكسين)، قمنا بتضمين يوهيمبين (وهو مضاد لمستقبلات الأدرينالين مع تقارب منخفض لمستقبلات الإيميدازولين زيادة p-S6 وتحفيز TNF في BMDMs وMEFs، وكان هذا التأثير محجوزًا بشكل انتقائي بواسطة AGN192403 (الشكل التمديدي 6a، b). أكدت التحليلات الفوسفوبروتينية أن AGN192403 قام بتثبيط تنشيط مسار mTOR الناتج عن ImP (الشكل 3h). أدى إسكات IIR بواسطة RNAs مثبطة صغيرة (siRNAs) تستهدف Nisch في MEFs إلى حجب إنتاج p-S6 وTNF الناتج عن ImP، مما يكشف أن ImP يشير بشكل انتقائي من خلال I1R لهذه الوظائف الالتهابية. من الجدير بالذكر أن AGN192403 منع p-S6 أو TNF الناتج عن ImP في خلايا تم علاجها بـ siRNA التحكم، لكنه لم يكن له تأثير في الخلايا التي تم إسكات IIR فيها، مما يتماشى مع التأثير الانتقائي لهذا المثبط على محور ImP-I1R (الشكل التمديدي 6c، d).

لتحليل وظيفة ImP في خلايا النخاع الشوكي بشكل أعمق، قمنا بتزاوج فئران Lyz2-cre مع Nisch. فئران لتوليد فئران Lyz24Nisch. أظهر تحليل تعبير Nisch حذفًا انتقائيًا في خلايا النخاع العظمي الطحالية، على عكس الحفاظ على التعبير في خلايا فأر إيش مقارنة مع التحكم نيش الفئران (الشكل 6e من البيانات الموسعة). من الجدير بالذكر أن تحفيز p-S6 وإنتاج TNF بواسطة BMDMs المدفوع بـ ImP كان معتمدًا بالكامل على Nisch (الشكل 6f,g من البيانات الموسعة)، مما يؤكد IIR كالعائل. مستقبل. لتحديد ما إذا كان حجب محور ImP-IIR في الخلايا النخاعية سيمنع التأثيرات الأثيروجينية لـ ImP، قمنا بإعطاء ImP لـ Ldlr فئران CD45.1 المزروعة بنخاع العظم من أو غياب IIR في الخلايا النخاعية منع تصلب الشرايين الناتج عن ImP (الشكل 4 أ والشكل التمديدي 6 ح).
لتحليل الاستخدام المحتمل لـ AGN192403 لمنع تصلب الشرايين الناتج عن ImP، قمنا بإعطاء ImP و AGN192403 معًا في مياه الشرب لجرذان Apoe التي تتغذى على العلف. الفئران لمدة ثمانية أسابيع. لاحظنا أن العلاج بـ AGN192403 منع تكوين لويحات تصلب الشرايين الناتجة عن ImP في كل من الفئران الذكور والإناث (الشكل 4ب والشكل الإضافي 7أ، ب)، دون التأثير على إجمالي الكوليسترول أو تركيز ImP في البلازما (الشكل الإضافي 7ج، د). منع علاج AGN192403 التوسع الناتج عن ImP في Ly6C وحيدات النواة و الخلايا، إنتاج السيتوكينات المؤيدة للالتهابات، زيادة في الخلايا B و T الدائرة و p-S6 المعتمد على ImP في البلعميات البريتونية (الشكل 4c-e والشكل الإضافي 7f). علاوة على ذلك، أثر علاج AGN192403 على تسلل الخلايا المناعية في الشريان الأورطي، من خلال حجب القدرة المحلية لـ ImP على زيادة تنظيمي نسبة الخلايا (الشكل 4f والشكل الإضافي 7g، h) ومنع تسلل البلعميات المؤيدة للالتهاب والخلايا B الناتج عن ImP (الشكل 4g والشكل الإضافي 7i، j). تظهر هذه النتائج أن الحذف المحدد لـ IIR في الخلايا النخاعية وAGN192403 يمنع تصلب الشرايين الناتج عن ImP في الفئران المعرضة لتصلب الشرايين التي تتغذى على الطعام العادي.

لتقييم قدرة تثبيط محور ImP-IIR على علاج تصلب الشرايين، قمنا بتغذية تم تغذية الفئران على نظام غذائي عالي الدهون أو نظام غذائي HC لمدة ثمانية أسابيع وتم علاجها أو عدم علاجها بـ AGN192403 في الأسابيع الأربعة الأخيرة من نظام HC الغذائي. أدى نظام HC الغذائي إلى تحفيز تصلب الشرايين وإنتاج ImP، وكان العلاج بـ AGN192403 مثبطًا لتقدم تصلب الشرايين في الفئران الذكور والإناث، دون التأثير على تركيز ImP (الشكل 4 والبيانات الموسعة الشكل 8a-c). ومن الجدير بالذكر أن هذا العلاج قلل أيضًا من حجم اللويحات، وتمدد النواة النخرية وصبغة الكاسبيز-3 (الشكل 4i والبيانات الموسعة الشكل 8d)، مما يدل على تقليل تعقيد اللويحات في الفئران. . ومع ذلك، لم يؤثر هذا التأثير الوقائي على زيادة تركيز الكوليسترول

الشكل 4 | حجب IIR يمنع تحفيز تصلب الشرايين بواسطة ImP أو نظام غذائي عالي الكوليسترول. أ، فئران تم زراعتها بنخاع العظام من مجموعة التحكم نيش (Ctrl، ) أو Lyz2 نيش (Ctrl، ) وتم تغذيته بنظام غذائي من الشوفان لمدة 12 أسبوعًا. صبغة الزيت الأحمر O لقوس الأبهر (يسار) وصور تمثيلية للأبهر (يمين). ب-ج، تغذية بالشوفان تمت معالجة الفئران كما هو موضح. ب، صبغة الزيت الأحمر O لقوس الشريان الأورطي (يسار) وصور تمثيلية للشريان الأورطي (يمين). Ctrl، AGN، . ج، يسار، Ly6C وحيدات النوى في الدم عند نقطة النهاية ). صحيح، مخططات كثافة التمثيل. د، IFN و TNF في البلازما. . e، اليسار، صبغة p-S6 في البلعميات البريتونية. Ctrl، ; AGN . صحيح، الرسوم البيانية التمثيلية. ف، نسبة إلى خلايا مت infiltrated في الشريان الأورطي. خلايا مت infiltrated في الشريان الأورطي. يسار، بيانات فردية. يمين، مخططات كثافة تمثيلية. ح-م، أبوي تم إطعام الفئران نظام غذائي عادي أو نظام غذائي عالي الكربوهيدرات لمدة 8 أسابيع؛ تم إضافة AGN192403 إلى مجموعة النظام الغذائي العالي الكربوهيدرات (HC + AGN) في الأسابيع الأربعة الأخيرة.

صبغة قوس الأبهر (يسار) وصور تمثيلية للأبهر (يمين). تشاو، صبغة ماسون ثلاثية الألوان لجذور الشريان الأورطي. قياس الآفات في جذور الشريان الأورطي (يسار)، منطقة النواة النخرية (وسط) وصور تمثيلية (يمين). تشير الأسهم إلى المناطق النخرية. تشاو، شريط المقياس، البيانات الفردية (يسار) ومخططات الكثافة التمثيلية (يمين) لتحديد كمية Ly6C في الدم باستخدام تحليل تدفق الخلايا وحيدات النواة ; تشاو، ; HC، ; HC + AGN، ) و T-bet خلايا ( ; تشاو، ; HC، ; HC ). أنا، بلازما IFN و TNF. تشاو، ; HC، ; HC + AGN، . م، بيانات فردية (يسار؛ تشاو، ومخططات تمثيلية (يمين) لتلوين p-S6 في البلعميات البريتونية. أ-م، نقاط بيانات فردية ومتوسط ± خطأ معياري من على الأقل تجربتين مستقلتين مجمعتين. تحليل التباين أحادي الاتجاه مع تصحيح توكي بعد الاختبار.
في الفئران التي تم تغذيتها بنظام HC الغذائي (الشكل التوضيحي الممتد 8e). علاوة على ذلك، فإن علاج AGN192403 منع التحفيز المعتمد على نظام HC الغذائي لمستويات Ly6C في الدم. وحيدات النواة، المناعة والسيتوكينات المؤيدة للالتهابات (الشكل 4j-1). كما أن العلاج أثر سلبًا على تحفيز p-S6 الناتج عن النظام الغذائي عالي الدهون في البلعميات البريتونية (الشكل 4m). تظهر هذه النتائج أن إعطاء AGN192403، الذي يثبط محور ImP-I1R، يمنع تصلب الشرايين المرتبط بتنشيط خلايا المناعة دون التأثير على
تركيز الكوليسترول في البلازما، مما يشير إلى نهج جديد لعلاج تصلب الشرايين.

تسبب العوامل المعقدة لأمراض القلب والأوعية الدموية والطبيعة الصامتة لتصلب الشرايين تحديات في اكتشاف المراحل المبكرة من المرض.

ركزت الدراسات السابقة على ارتباطات ImP وغيرها من المستقلبات المعتمدة على الميكروبات بمراحل متقدمة من أمراض القلب والأوعية الدموية أو الوفيات. على وجه التحديد، تم ربط ImP بمرض السكري من النوع 2، والأمراض القلبية الأيضية لدى الأشخاص المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية، ومرض الشريان التاجي، وفشل القلب. . هنا، نوضح أن ImP مرتبط بتقدم تصلب الشرايين في الفئران ومع تصلب الشرايين النشط تحت السريري في مجموعة صحية بخلاف ذلك، حيث يتم اكتشاف تصلب الشرايين فقط من خلال دراسات التصوير المتقدمة التي لا تتوفر في الممارسة السريرية لفحوصات السكان الكبيرة. . تم التحقق من هذه النتائج بشكل مستقل في مجموعة إضافية من مرضى تحمل الجلوكوز المختل، على الرغم من الاختلافات في تركيز ImP الوسيط في مجموعة PESA، مما يدعم العلاقة بين ImP وتصلب الشرايين المبكر ويقترح استخدامه كتشخيص مرافق وهدف علاجي للطب الشخصي. علاوة على ذلك، نوضح أن ImP يحفز تصلب الشرايين دون التأثير على تركيز الكوليسترول في الدم. يمكن أن تكون التأثيرات المؤيدة لتصلب الشرايين لـ ImP متعددة الأوجه وتؤثر على أنواع خلايا متعددة. لقد لاحظنا أن إدارة ImP أدت إلى زيادة محلية في النشاط النسخي في البلعميات، والألياف، وإلى حد أقل، الخلايا البطانية. كانت هذه التغيرات النسخية تتميز بزيادة تجنيد خلايا المناعة والالتهاب، مما قد يكون وراء تأثير ImP المسبب لتصلب الشرايين. بالإضافة إلى ذلك، قام ImP بتنشيط استجابات مناعية فطرية ومكتسبة مؤيدة لتصلب الشرايين، مما أدى إلى زيادة تسلل خلايا المناعة إلى جذور الشريان الأورطي، مما ساهم في تقدم تصلب الشرايين. ، مما يرتبط بشكل أكبر بالمضاعفات السريرية واللويحات غير المستقرة أو القابلة للكسر على الرغم من أن إدارة ImP لا تؤثر على تركيز الجلوكوز، وضغط الدم وبعض معايير وظائف الكلى والكبد، لا يمكننا استبعاد أن التأثيرات النظامية الأخرى قد تساهم في المرض، والتي سيتعين تناولها في الدراسات المستقبلية.

نحدد IIR كمستقبل لـ ImP الذي يحفز إنتاج p-S6 والسيتوكينات المؤيدة للالتهابات، بما يتماشى مع تنشيط mTOR في البلعميات الذي يساهم في تصلب الشرايين. نجد أن تصلب الشرايين الناتج عن ImP يعتمد بالكامل على تعبير IIR في الخلايا النخاعية. ومع ذلك، نظرًا لتعبير وتأثيرات النسخ لـ ImP في أنواع الخلايا الأخرى التي تساهم في تصلب الشرايين (الخلايا الليفية والخلايا البطانية)، قد يؤثر ImP أيضًا على هذه الخلايا من خلال تعزيز تصلب الشرايين. يمنع الحصار الدوائي لـ IIR تقدم تصلب الشرايين والاستجابة الالتهابية الناتجة عن نظام غذائي ImP أو HC، بغض النظر عن التغيرات في تركيز الكوليسترول ولكن يعتمد على حجب mTOR في البلعميات. ومن الجدير بالذكر أن حجب I1R قلل أيضًا من صبغة الكاسبيز-3 والنواة النخرية في اللويحة كقراءات لتعقيد اللويحة المرتبط باللويحات النشطة وغير المستقرة. الذي قد يكون أساسًا لارتباطه بفشل القلب تُستخدم العلاجات المخفضة للدهون حاليًا لمنع تقدم تصلب الشرايين. ومع ذلك، لا يزال معدل الأحداث القلبية الوعائية مرتفعًا حتى لدى المرضى الذين يتلقون علاجات مخفضة للدهون مناسبة. على الرغم من توفر علاجات أخرى، إلا أنها لم تُثبت بعد لعلاج تصلب الشرايين وعادة ما تكون مرتبطة بعوامل الخطر المعروفة. لذا، نقترح محور ImP-I1R في الخلايا النخاعية كهدف مستقل لعلاج تصلب الشرايين الذي قد يتعاون بشكل محتمل مع العلاجات الحالية.

أي طرق، مراجع إضافية، ملخصات تقارير Nature Portfolio، بيانات المصدر، بيانات موسعة، معلومات تكميلية، شكر وتقدير، معلومات مراجعة الأقران؛ تفاصيل مساهمات المؤلفين والمصالح المتنافسة؛ وبيانات توفر البيانات والرموز متاحة علىhttps://doi.org/10.1038/s41586-025-09263-w.

4. براندتس، ج. وراي، ك. ك. علاجات جديدة ومستقبلية لتعديل الدهون للوقاية من أمراض القلب والأوعية الدموية. نات. ريف. كارديو. 20، 600-616 (2023).
5. ريدكر، ب. م. وآخرون. العلاج المضاد للالتهابات باستخدام كاناكنوماب لمرض تصلب الشرايين. نيو إنجلاند جورنال أوف ميديسين 377، 1119-1131 (2017).
6. نيلسون، ك.، فوستر، ف. & ريدكر، ب. م. الكولشيسين بجرعة منخفضة للوقاية الثانوية من مرض الشريان التاجي. مجلة الكلية الأمريكية لأمراض القلب 82، 648-660 (2023).
7. ساباتين، م. س. وآخرون. إيفولوكوماب والنتائج السريرية لدى المرضى الذين يعانون من أمراض القلب والأوعية الدموية. نيو إنجلند جورنال أوف ميديسين 376، 1713-1722 (2017).
8. كاسينبروود، ل. وآخرون. توزيع تقدير خطر الأحداث الوعائية المتكررة على مدى 10 سنوات والخطر المتبقي في مجموعة الوقاية الثانوية. الدورة الدموية 134، 1419-1429 (2016).
9. تشاكرون، ر. م.، أولسون، ل. م. وباكهيد، ف. إمكانيات تخصيص الميكروبيوم المعوي للوقاية من الأمراض القلبية الأيضية وعلاجها. نات. ريف. كارديو. 20، 217-235 (2023).
10. نيمت، إ. وآخرون. أطلس لمنتجات الميكروبات المعوية المستمدة من الأحماض الأمينية العطرية ومخاطر الأمراض القلبية الوعائية والوفيات. مجلة القلب الأوروبية 44، 3085-3096 (2023).
11. ويتكوفسكي، م.، ويكس، ت. ل. & هازن، س. ل. ميكروبيوتا الأمعاء وأمراض القلب والأوعية الدموية. دائرة. بحث. 127، 553-570 (2020).
12. نيمت، إ. وآخرون. مستقلب ميكروبي معوي مرتبط بأمراض القلب والأوعية الدموية يعمل عبر مستقبلات الأدرينالين. خلية 180، 862-877.e22 (2020).
13. مارتينيز-لوبيز، م. وآخرون. استشعار الميكروبيوتا بواسطة محور مينكل-سايك في الخلايا الشجرية ينظم إنتاج الإنترلوكين-17 و-22 ويعزز سلامة الحاجز المعوي. المناعة 50، 446-461.e9 (2019).
14. وانغ، ز. وآخرون. استقلاب فلورا الأمعاء للفوسفاتيديل كولين يعزز أمراض القلب والأوعية الدموية. نيتشر 472، 57-63 (2011).
15. كو، أ. وآخرون. الإيميدازول بروبيونات المنتج ميكروبيًا يعيق إشارات الأنسولين من خلال mTORC1. خلية 175، 947-961.e17 (2018).
16. رويير، ب. وآخرون. بروتيوميات البلازما لتوقع التكلسات الشريانية التاجية تحت السريرية في الوقاية الأولية. مجلة القلب الأمريكية 271، 55-67 (2024).
17. مولينارو، أ. وآخرون. تم زيادة بروبيونات الإيميدازول في مرض السكري وهو مرتبط بأنماط النظام الغذائي وبيئة الميكروبات المتغيرة. نات. كوميونيك. 11، 5881 (2020).
18. كوري، أ. وآخرون. الميكروبات الفموية والمعوية واللويحات في المرضى الذين يعانون من تصلب الشرايين. وقائع الأكاديمية الوطنية للعلوم 108، 4592-4598 (2011).
19. ترسيد، م.، أندرسن، ج. Ø.، بروخ، ك. & هوف، ج. ر. الميكروبيوم المعوي في مرض الشريان التاجي وفشل القلب: المعرفة الحالية والاتجاهات المستقبلية. إي بايو ميديسين 52، 102649 (2020).
20. فرنانديز-فرييرا، ل. وآخرون. الالتهاب الوعائي في تصلب الشرايين تحت السريري المكتشف بواسطة PET/MRI الهجين. مجلة الكلية الأمريكية لأمراض القلب 73، 1371-1382 (2019).
21. ديفيسا، أ. وآخرون. تنشيط نخاع العظام استجابةً لمتلازمة الأيض وتصلب الشرايين المبكر. مجلة القلب الأوروبية 43، 1809-1828 (2022).
22. ما، ج.، ليو، ج.، صن، ي. وزهاو، ز. السيتوكينات المرتبطة بالاستجابة المناعية في تصلب الشرايين. المجلة الأمريكية للبحوث الانتقالية 14، 6424-6444 (2022).
23. غولد، إي. إس. وآخرون. ATF3 يحمي من تصلب الشرايين عن طريق قمع تكوين أجسام الدهون المستحث بواسطة 25-هيدروكسي كوليسترول. ج. إكسب. ميد. 209، 807-817 (2012).
24. وكيليك، س. ك.، دنفي، ج.، هيراس-مورييلو، إ.، ماسترنغو، أ. وسانشو، د. استقلاب البلعميات النسيجية في التوازن والمرض. الخلية. المناعة الجزيئية. 19، 384-408 (2022).
25. تشين، ج. ي.، كورتيز، س. و فيريرا، ف. ب. بروبردين: جزيء متعدد الأوجه مرتبط بالالتهابات والأمراض. مناعة جزيئية 102، 58-72 (2018).
26. كيس، م. ج. وبايندر، س. ج. التأثير المتعدد الأوجه للمكمل على تصلب الشرايين. تصلب الشرايين 351، 29-40 (2022).
27. كان، هـ. وآخرون. تحليل النسخ الجيني على مستوى الخلية الواحدة يكشف عن تباين خلوي في الشرايين الأورطية الصاعدة للفئران العادية والفئران التي تتبع نظام غذائي عالي الدهون. التجارب. مول. ميد. 53، 1379-1389 (2021).
28. زهاو، ج. وآخرون. تقنيات النسخ الجيني على مستوى الخلية الواحدة تكشف عن مرونة البطانة خلال تكوين تصلب الشرايين السكري. Front. Cell Dev. Biol. 9، 689469 (2021).
29. غوتشيفا، ف.، تشين، إكس.، بيترز، سي.، رينهكل، تي. وجويس، ج. أ. حذف الكاتيبسين H يعيق التحول الوعائي، التوعية ونمو الأورام في نموذج فأر لسرطان خلايا جزر البنكرياس. الكيمياء الحيوية 391، 937-945 (2010).
30. شيه، س.-سي. وآخرون. بروتين L6 TM4SF1 حاسم لوظيفة الخلايا البطانية وتكوين الأوعية الدموية في الأورام. أبحاث السرطان 69، 3272-3277 (2009).
31. شنييلر، د. وآخرون. السيتوكين الشبيه 1 هو عامل جديد محفز لتكوين الأوعية يتم إفرازه بواسطة خلايا السلف البطانية ويقوم بوساطة وظائفها. دائرة. بحث. 124، 243-255 (2019).
32. داير، ل. أ.، بي، إكس. و باترسون، س. دور BMPs في وظيفة الخلايا البطانية وعدم وظيفتها. اتجاهات الغدد الصماء والتمثيل الغذائي 25، 472-480 (2014).
33. آييلو، ر. ج. وآخرون. بروتين كيميائي جذب وحيدات النوى-1 يسرع تصلب الشرايين في الفئران التي تفتقر إلى بروتين الأبوليبوبروتين E. علم الأوعية الدموية. 19، 1518-1525 (1999).
34. وانغ، ل.، لورانس، ج. س.، ستورغيل، ت. و. & هاريس، ت. إ. نشاط مركب الهدف الثديي من الراباميسين 1 (mTORC1) مرتبط بفوسفاتة الرابتور بواسطة mTOR. ج. كيمياء حيوية. 284، 14693-14697 (2009).
35. بوسكيه، ب.، هودسون، أ.، غارسيا-سيفيلا، ج. أ. ولي، ج.-إكس. نظام مستقبلات الإيميدازولين: الماضي، الحاضر، والمستقبل. مراجعة علم الأدوية 72، 50-79 (2020).
36. هيد، ج. أ. ومايوروف، د. ن. مستقبلات الإيميدازولين، عوامل جديدة والإمكانات العلاجية. عوامل الأدوية القلبية الوعائية والدموية. 4، 17-32 (2006).
37. زانغ، إكس. وآخرون. الأنظمة الغذائية الغنية بالبروتين تزيد من خطر الإصابة بأمراض القلب والأوعية الدموية من خلال تنشيط الماكرومير mTOR لقمع الميتوفاجي. نات. ميتاب. 2، 110-125 (2020).
38. مولينارو، أ. وآخرون. الإيميدازول بروبيونات المنتج ميكروبيًا مرتبط بفشل القلب والوفيات. مجلة جACC لفشل القلب. 11، 810-821 (2023).
39. زو، و. وآخرون. المستقلبات الميكروبية المعوية TMAO تعزز فرط تفاعل الصفائح الدموية وزيادة خطر thrombosis. خلية 165، 111-124 (2016).
40. وانغ، ز. وآخرون. ميكروبيوتا الأمعاء، وعوامل الالتهاب الدائرة، والمواد الأيضية، وتصلب الشرايين السباتية في عدوى فيروس نقص المناعة البشرية. ميكروبيوم 11، 119 (2023).
41. فان سون، ج. وآخرون. بروبيونات الإيميدازول في البلازما مرتبط إيجابيًا بضغط الدم لدى البشر الذين يعانون من زيادة الوزن والسمنة. المغذيات 13، 2706 (2021).
42. ترواسيد، م. وآخرون. التغيرات في ميكروبيوم الأمعاء ومستويات الإيميدازول بروبيونات المتداولة مرتبطة بمرض الشريان التاجي الانسدادي لدى الأشخاص المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية. مجلة الأمراض المعدية 229، 898-907 (2024).
43. ناجيسواران، ف. وآخرون. المستقلبات الميكروبية المعوية إيميدازول بروبيونات تؤثر سلبًا على وظيفة الخلايا البطانية وتعزز تطور تصلب الشرايين. علم الأوعية الدموية. 45، 823-839 (2025).
44. ويست، ر. س. أ. وآخرون. تقنيات التصوير بالرنين المغناطيسي الناشئة لتصوير تصلب الشرايين. علم الأوعية الدموية. 39، 841-849 (2019).
45. جيمبرون، م. أ. وغارسيا-كاردينا، ج. خلل وظيفة الخلايا البطانية وعلم الأمراض المرتبط بتصلب الشرايين. دائرة. بحث. 118، 620-636 (2016).
46. روي، ب.، أوريكشوني، م. ولي، ك. كيف يشكل الجهاز المناعي تصلب الشرايين: أدوار المناعة الفطرية والتكيفية. نات. ريف. إيمونول. 22، 251-265 (2022).
47. فين، أ. ف.، ناكانو، م.، نارولا، ج.، كولودجي، ف. د. وفيرماني، ر. مفهوم اللويحة القابلة للخطر/ غير المستقرة. علم الأوعية الدموية والتخثر. 30، 1282-1292 (2010).
48. وولف، د. ولي، ك. المناعة والالتهاب في تصلب الشرايين. دائرة. بحث. 124، 315-327 (2019).
49. زانغ، إكس. وآخرون. تحديد تأثير العتبة الذي يتوسطه الليوسين والذي يحكم إشارة الماكرومول الماكرومول والمخاطر القلبية الوعائية. نات. ميتاب. 6، 359-377 (2024).
50. لويد-جونز، د. م. وآخرون. 2017 تحديث مركّز لمسار قرار الإجماع من خبراء ACC لعام 2016 حول دور العلاجات غير الستاتينية في خفض كوليسترول LDL في إدارة مخاطر مرض القلب والأوعية الدموية التصلبي: تقرير من مجموعة العمل التابعة للكلية الأمريكية لأمراض القلب حول مسارات قرار الإجماع من الخبراء. ج. أم. كول. كارد. 70، 1785-1822 (2017).
51. غوبتا، أ. وآخرون. الأحداث السلبية المرتبطة بالعلاج بالستاتين غير المموه، ولكن ليس مع العلاج المموه، في تجربة النتائج القلبية الأنجلو-سكندنافية – ذراع خفض الدهون (ASCOT-LLA): تجربة عشوائية مزدوجة التعمية خاضعة للرقابة الوهمية ومرحلتها غير العشوائية وغير المموهة. لانسيت 389، 2473-2481 (2017).

ملاحظة الناشر: تظل شركة سبرينغر ناتشر محايدة فيما يتعلق بالمطالبات القضائية في الخرائط المنشورة والانتماءات المؤسسية.

الوصول المفتوح هذه المقالة مرخصة بموجب رخصة المشاع الإبداعي النسبية-غير التجارية-بدون اشتقاقات 4.0 الدولية، التي تسمح بأي استخدام غير تجاري، ومشاركة، وتوزيع، وإعادة إنتاج في أي وسيلة أو صيغة، طالما أنك تعطي الائتمان المناسب للمؤلفين الأصليين والمصدر، وتوفر رابطًا لرخصة المشاع الإبداعي، وتوضح إذا قمت بتعديل المادة المرخصة. ليس لديك إذن بموجب هذه الرخصة لمشاركة المواد المعدلة المشتقة من هذه المقالة أو أجزاء منها. الصور أو المواد الأخرى من طرف ثالث في هذه المقالة مشمولة في رخصة المشاع الإبداعي الخاصة بالمقالة، ما لم يُشار إلى خلاف ذلك في سطر الائتمان للمادة. إذا لم تكن المادة مشمولة في رخصة المشاع الإبداعي الخاصة بالمقالة وكان استخدامك المقصود غير مسموح به بموجب اللوائح القانونية أو يتجاوز الاستخدام المسموح به، فستحتاج إلى الحصول على إذن مباشرة من صاحب حقوق الطبع والنشر. لعرض نسخة من هذه الرخصة، قم بزيارة http:// creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/.
© المؤلفون 2025، نشر معدل 2025

¹المركز الوطني لأبحاث القلب والأوعية الدموية كارلوس الثالث (CNIC)، مدريد، إسبانيا. مدرسة الدكتوراه، الجامعة المستقلة في مدريد، مدريد، إسبانيا. مدرسة الدكتوراه، جامعة كومبلوتنسي بمدريد، مدريد، إسبانيا. معهد الأبحاث الحيوية سولس-موريال (IIBM)، المجلس الوطني الإسباني للبحث – جامعة مدريد المستقلة، مدريد، إسبانيا. قسم الكيمياء الحيوية، كلية الطب، جامعة مدريد المستقلة، مدريد، إسبانيا. مستشفى لا باز معهد أبحاث الصحة – إيديبا، مدريد، إسبانيا. مستشفى فاستر للقلب في جبل سيناء، كلية الطب في جبل سيناء، نيويورك، نيويورك، الولايات المتحدة الأمريكية. سيبر للأمراض القلبية الوعائية (CIBER-CV)، مدريد، إسبانيا. مختبر والينبرغ، قسم الطب الجزيئي والسريري، جامعة غوتنبرغ، غوتنبرغ، السويد. قسم الوراثة السريرية والجينوميات، مستشفى ساهلجرينسكا الجامعي، غوتنبرغ، السويد. قسم العلاجات السريرية، جامعة أثينا الوطنية وكابوديستريان، كلية الطب، أثينا، اليونان. مدرسة الهندسة الطبية الحيوية وعلوم التصوير، كلية كينغز لندن، لندن، المملكة المتحدة. قسم الفسيولوجيا، كلية الطب، جامعة باتراس، باتراس، اليونان. إنمونوتيك إس إل، ألكالا دي هيناريس، إسبانيا. قسم علم الأمراض، كلية الطب بجامعة ميتشيغان، آن آربر، ميشيغان، الولايات المتحدة الأمريكية. قسم المناعة، معهد الأبحاث الصحية بمستشفى الأميرات، مدريد، إسبانيا. قسم الطب، جامعة مدريد المستقلة (UAM)، مدريد، إسبانيا. مركز الميتابولوميات والتحليل الحيوي (CEMBIO)، كلية الصيدلة، جامعة سان بابلو-CEU، بوديلا ديل مونتي، إسبانيا. مركز روجيل للسرطان، كلية الطب بجامعة ميتشيغان، آن آربر، ميشيغان، الولايات المتحدة الأمريكية. مركز تعليم وبحوث الأمراض المعدية (CIDER)، جامعة أوساكا، أوساكا، اليابان. قسم أبحاث القلب والأوعية الدموية، المركز الأوروبي لعلوم الأوعية (ECAS)، كلية الطب مانهايم، جامعة هايدلبرغ، مانهايم، ألمانيا. المركز الألماني لأبحاث القلب والأوعية الدموية (DZHK)، موقع الشريك هايدلبرغ/مانهايم، مانهايم، ألمانيا. قسم الطب السادس، مركز جامعة مانهايم الطبي، جامعة هايدلبرغ، مانهايم، ألمانيا. معهد هلمهولتز للعلوم القلبية الوعائية الانتقالية (HI-TAC) في مركز ماكس ديلبروك للطب الجزيئي في جمعية هلمهولتز (MDC)، جامعة هايدلبرغ، مانهايم، ألمانيا. قسم الفيزيولوجيا السريرية، مستشفى ساهلجرينسكا الجامعي، غوتنبرغ، السويد. مبادرة صحة الميكروبيوم من مؤسسة نوفو نورديسك، الجامعة التقنية في الدنمارك، كونغنس لينغبي، الدنمارك. المعهد الوطني للغذاء، الجامعة التقنية في الدنمارك، كونغنس لينغبي، الدنمارك. معهد زينا ومايكل أ. وينر لأمراض القلب، كلية أيخان للطب في جبل سيناء، نيويورك، الولايات المتحدة الأمريكية. معهد أبحاث الصحة، مؤسسة خيمينيز دياث، الجامعة المستقلة في مدريد (IIS FJD-UAM)، مدريد، إسبانيا. ساهم هؤلاء المؤلفون بالتساوي: أنالورا ماسترنجيلو، إينياكي روبلز-فيرا. البريد الإلكتروني: dsancho@cnic.es

تم تربية الفئران والحفاظ عليها في مجموعات من خمسة حيوانات لكل قفص في CNIC تحت ظروف خالية من مسببات الأمراض المحددة. استخدمنا خلفية بروأثيروجينية B6.129P2-Apoe. فئران (مختبر جاكسون، السلالة 002052، Apoe ); B6.129S7-Ldlr فئران /J (مختبر جاكسون، السلالة 002207، Ldlr ) تم التهجين مع B6.SJL-Ptprc بيبك فئران /BoyJ التي تعبر عن علامة CD45.1 المتجانسة (مختبر جاكسون، السلالة 002014، B6 CD45.1)؛ B6.129S7-Rag1 فئران (مختبر جاكسون، السلالة 002216، Rag1 ); B6.Cg-Rptor فئران (مختبر جاكسون، السلالة 013188، راب ) تم تزاوجها مع B6.129P2-Lyz2 فئران (cre)Ifo/J (مختبر جاكسون، السلالة 004781، Lyz2-cre) لإنتاج Lyz2 رافتور (كري ) والتحكم في رابتور (كري الأشقاء من نفس الولادة استخدموا كضوابط. الحيوانات المنوية من B6.Nisch تم استخدام فئران /H (مركز ماري ليون في MRC هارويل، المملكة المتحدة؛ EM:08808) للتخصيب في المختبر لفئران ROSA-Flpe (Gt(ROSA)26Sor لإنشاء نيش فئران (tm1c). نيش تم تزاوج الفئران مع Lyz2-cre (B6.129P2-Lyz2 (cre)Ifo/J) فئران لتوليد Lyz20Nisch ( ) والتحكم في نيش تم استخدام أشقاء (Cre-) كضوابط. كانت الفئران تتراوح أعمارها بين 7 إلى 12 أسبوعًا عند بدء التجارب. تم تخصيص أشقاء من نفس الجنس عشوائيًا لمجموعات التجربة. كان الباحثون غير مدركين لتخصيص المجموعات أثناء جمع البيانات وتحليلها لتقليل التحيز. تمت الموافقة على الدراسات الحيوانية من قبل لجنة الأخلاقيات المحلية في CNIC وUAM ومجتمع مدريد، PROEX 300.4/21 وPROEX 119.6/22. كانت جميع إجراءات الحيوانات متوافقة مع توجيه الاتحاد الأوروبي 2010/63/EU وتوصية 2007/526/EC بشأن حماية الحيوانات المستخدمة لأغراض تجريبية وعلمية أخرى، والتي يتم تنفيذها بموجب القانون الإسباني بموجب المرسوم الملكي 53/2013. تم تغذية الفئران بأنظمة غذائية مختلفة، بما في ذلك العلف، HC (10% دهون، 0.75% كوليسترول، SSNIFF S9167-E011) وHC/HC (HC + 1% كولين، SSNIFF S9167-E016)، كما هو موضح في كل تجربة. لكل فأر في اليوم، تم إعطاء Biogen Cientifica BA-F-3185.0001 في مياه الشرب. AGN192403 ( تم إعطاء g لكل فأر في اليوم، Labclinics B6583-10) في مياه الشرب.

لإزالة البكتيريا المعوية، مزيج من المضادات الحيوية من كل من الأمبيسيلين (نورمون)، النيومايسين سلفات (سيغما ألدريتش) والميترونيدازول (سانوفي)، فانكومايسين (نورمون) و تم استخدام السوكراوز (سيغما ألدريتش) المذاب في الماء وتم تجديده كل ثلاثة أيام كما هو موضح .

لقياس آفات تصلب الشرايين، أو تم إطعام ذكور أو إناث الفئران نظام غذائي عادي أو نظام غذائي عالي الكوليسترول لمدة 4 أو 8 أو 12 أسبوعًا، كما هو موضح في كل تجربة. تم جمع الدم من الفئران التي تم ثقبها تحت الفك. بعد ذلك، تم ضخ الفئران بـ 10 مل من محلول ملحي فوسفات (PBS) عبر ثقب قلبي لإزالة تلوث الدم من الأنسجة الوعائية. تم تشريح الشرايين الأورطية وتثبيتها في الفورمالدهيد. (PanReac، AppliChem) في درجة حرارة الغرفة طوال الليل. ثم، تم صبغ الشرايين الأورطية المعرضة لترسبات الدهون باستخدام زيت أحمر O (سيغما ألدريش) قبل تقييم الاختبار السطحي. باختصار، بعد التثبيت، تم غسل الشرايين الأورطية بـ إيزوبروبانول وتم صبغه لمدة ساعة مع من زيت أحمر O. بعد خطوتي غسيل لمدة 5 دقائق مع الإيزوبروبانول تم تخزين الشرايين الأورطية في PBS-أزيد 0.05%. تم التقاط الصور باستخدام كاميرا لايكا نيكون مع مكبر، وتم حساب آفات تصلب الشرايين في الأورطة من خلال حساب نسبة مساحة الآفة إلى المساحة السطحية الكلية. تم إجراء هذا القياس باستخدام طريقة آلية تقوم بت quantifying تراكم الدهون في الآفات من خلال تطبيق عتبة اللون على المناطق الإيجابية لصبغة الزيت الأحمر O. تم تحديد العتبة من قبل الباحث وظلت ثابتة ضمن نفس دفعة الصبغ، كما هو موضح. تم إجراء تحليل الصور باستخدام برنامج ImageJ.

تم تثبيت القلوب المروية بـ الفورمالديهايد لمدة 48 ساعة في درجة حرارة الغرفة. بالنسبة لتقطيع البارافين، تم حجز القلوب المثبتة في الإيثانول 70% طوال الليل وتم تضمينها في كتل البارافين. تم قطع مقاطع بسمك أربعة ميكرومترات من جذور الشريان الأورطي وتجفيفها طوال الليل في تم استخدام بروتوكول التريكروم القياسي لبروتوكول ماسون باستخدام هيماتوكسيليين ويغرت للنوى والأخضر الفاتح كصبغة للكولاجين. تم استخدام صبغة التريكروم لتحليل اللويحات والنواة النخرية (المحددة كمناطق غير مصبوغة داخل اللويحة). تم إجراء صبغ خلايا T في جذور الشريان الأورطي للقلب بواسطة الكيمياء المناعية باستخدام جسم مضاد CD3 (Invitrogen، MA1-90582). تم إجراء صبغ البلعميات في لويحة التصلب العصيدي بواسطة الكيمياء المناعية باستخدام جسم مضاد MAC2 (Invitrogen، 14-5302-85). تم إجراء صبغ كاسبيز-3 في جذور الشريان الأورطي للقلب باستخدام جسم مضاد مضاد كاسبيز-3 (Cell Signaling Technology، 9661). تم إجراء الصبغ في جهاز صبغ تلقائي (Autostainer Plus، Dako). كأجسام مضادة ثانوية، استخدمنا مضاد ضد الأرانب (Dako Envision K4003) لصبغ CD3 وكاسبيز-3 ومضاد ضد الأرانب ضد الجرذان (Abcam Ab6734) لصبغ MAC2. تم الحصول على الصور الرقمية باستخدام ماسح Carl Zeiss Axio Scan Z1. تم إجراء تحليل الصور باستخدام برنامج NDPview 2 وImageJ.

خلال عملية الانتقاء، تم استئصال الأعور وغسله بمحلول PBS لجمع محتوياته، التي تم تخزينها في حتى معالجة العينة.

تم الحصول على عينات الدم عن طريق ثقب القلب. تم جمع المصل بعد الطرد المركزي للدم عند لمدة 10 دقائق ومجمد عند تم تحليل معايير السيروم البيوكيميائية باستخدام جهاز التحليل الآلي Dimension RxL Max في اليوم التالي للاستخراج. تم قياس محتوى الجلوكوز والبروتين باستخدام جهاز التحليل الآلي Dimension RxL Max.

المواد. كان الأسيتونيتريل من درجة LC-MS من فلوكا التحليلية؛ الميثانول والماء من فيشر العلمية؛ الإيثانول من ميرك وحمض الفورميك من هوني ويل فلوكا.

تحضير العينة. عينات البلازما تم إعدادها كما هو موصوف باختصار، تم إزالة البروتينات عن طريق إضافة مادة باردة خليط من الميثانول: الإيثانول (1:1، حجماً) بنسبة (المذيب: العينة) ومن خلال تخزين العينات على الثلج لمدة 20 دقيقة. تم إعداد عينة فارغة باتباع نفس إجراء الاستخراج، مع إضافة المذيبات فقط إلى أنبوب إيبندورف سعة 1.5 مل. تم إعداد عينات مراقبة الجودة (QCs) عن طريق تجميع عينات البلازما من مستقلين الفئران واتباع نفس إجراءات الاستخراج. تم طرد العينات، ومعايير الجودة، والعينات الفارغة، في جهاز الطرد المركزي عند لـ وتم نقل السائل العلوي إلى أنبوب إيبندورف سعة 1.5 مل. تم تجفيف السوائل العلوية بعد ذلك في جهاز السرعة (مركز Savant SPD131DDA، فخ البخار المبرد Savant RVT5105 ومضخة التفريغ OFP400، Thermo Fisher Scientific) لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة. قبل تحليل LC-MS، تم إعادة تعليق العينات المجففة وعينات الجودة في و من خليط مكون من الأسيتونيتريل: عن طريق الاهتزاز المستمر في لمدة 10 دقائق عند ثم تم الطرد المركزي عند لمدة 5 دقائق لإزالة المواد غير القابلة للذوبان. تم وضع الجزء القابل للذوبان في حاوية عينة جهاز LC-MS.

تحليل LC-MS. تم إجراء تحليل الميتابولوميات غير المستهدف باستخدام نظام HPLC Ultimate 3000 الذي يتكون من جهاز إزالة الغازات، ومضختين ثنائيتين، وجهاز أخذ عينات تلقائي مع منظم حرارة، تم الحفاظ عليه عند (ثيرمو فيشر ساينتيفيك) متصلة بجهاز مطياف الكتلة الهجين LTQ Orbitrap XL (ثيرمو فيشر ساينتيفيك). العينات تم حقنها على عمود Merck SeQuant ZIC-HILIC الذي تم الحفاظ عليه حرارياً عند ،
وتم فصل المستقلبات عند مع المذيب A المكون من الماء مع حمض الفورميك، والمذيب ب المكون من الأسيتونيتريل مع حمض الفورميك. بدأ التدرج من إلى من B في 15 دقيقة، مع الحفاظ على الثبات لمدة 3 دقائق والعودة إلى الظروف الابتدائية في 0.1 دقيقة، وأخيرًا مع الحفاظ على إعادة التوازن عند من B لمدة 11.9 دقيقة. تم جمع البيانات في وضع الأيونات الإيجابية ESI. عمل مطياف الكتلة في وضع المسح الكامل من 70 إلى بدقة 60,000. تم جمع طيف MS/MS في وضع يعتمد على البيانات عبر التفكك الناتج عن الاصطدام (CID) في فخ الأيونات. تم تحليل العينات بترتيب عشوائي. تم تحليل العينات المرجعية في البداية، وفي النهاية، وكل ست عينات.

معالجة البيانات. تم محاذاة البيانات المولدة أولاً باستخدام Compound Discoverer (Thermo Fisher Scientific)؛ تم استخراج الإشارات وتجميعها في ميزات (آثار نظيرية من محلل واحد في حالة شحن معينة) باستخدام عقدة Metaboprofiler في Compound Discoverer (إضافة مفتوحة المصدر متاحة مجانًا من OpenMS؛https://openms.de/كما هو موصوف . تم تصفية الميزات بعد ذلك حسب الوجود مع الاحتفاظ بالكيانات التي كانت موجودة في الأقل من العينات من نفس المجموعة. تم تعويض القيم المفقودة باستخدام -طريقة الجيران الأقرب أو عن طريق حد الكشف (LoD) (1/5 من الحد الأدنى للقيمة الإيجابية لكل متغير) وفقًا لنسبة القيم المفقودة للميزة داخل المجموعة في MetaboAnalyst الإصدار 5 (https://www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/home.xhtml) تمت معالجة البيانات بشكل تلقائي وتحويلها إلى لوغاريتمية. تم توضيح المستقلبات من خلال البحث عن كتلتها التجريبية الدقيقة مقابل وسيط الكتلة Ceu.http://ceumass.eps.uspceu.es/) ومصفوفة البيانات الناتجة التي تتعامل معها Turboputativehttps://proteomics.cnic.es/تيربو بيوتيتيف/ تم تأكيد تحديد ImP بعد ذلك باستخدام المعيار المرجعي (Sigma Aldrich 77951) في تحليل LC-MS/MS لاحقًا بعد التفكك الناتج عن الاصطدام عالي الطاقة باستخدام 50 eV كطاقة اصطدام.

بالنسبة لعينات الدم، تم صبغ التعليقات الخلوية المفردة لمدة 30 دقيقة عند مع مجموعة صبغة خلايا ميتة/حية القابلة للإصلاح Aqua (Life Technologies). بعد الغسل بمحلول PBS، تم صبغ الخلايا في محلول FACS يحتوي على مضاد CD16/32 (BioXcell)، 3% FBS و0.05% EDTA مع كوكتيل الأجسام المضادة المناسب لمدة 30 دقيقة على الثلج. تم صبغ الخلايا بكوكتيل من الأجسام المضادة ضد CD45-APCCy7 (Biolegend)، CD11b-BV605 (Biolegend)، CD11c-BV650 (Biolegend)، Ly6C-BV711 (Biolegend)، LY6G-APC (BD Biosciences)، CD8-PE (eBioscience)، CD90-BV785 (BD Biosciences)، MHCII-AF700 (Biolegend)، B220-PerCP5.5 (Biolegend)، SiglecH-FITC (eBioscience)، CD4-PeCy7 (Biolegend). في مجموعة أخرى من التجارب، تم صبغ الخلايا بـ CD45-APCCy7 (Biolegend)، LY6G-V450 (BD Biosciences)، CD11b-ef660 (eBioscience)، CD11c-PE (Biolegend)، B220-PerCP (Biolegend)، CD90-UV805 (Fisher scientific)، XCR1-BV785 (Biolegend)، CD206-eF450 (Biolegend)، MHCII-UV737 (BD Biosciences)، F4/80-PerCp5.5 (Biolegend)، Roryt-APC (Biolegend)، T-bet-PECF594 (BD Biosciences)، Ly6C-BV711 (Biolegend)، CD86-PECy7 (Biolegend)، FOXP3-FITC (Biolegend)، CD4-BV570 (Biolegend). تم غسل الخلايا مرة أخرى وإعادة تعليقها في محلول FACS لجمع البيانات باستخدام جهاز تحليل تدفق LSRFortessa SORP (Becton Dickinson) أو FACSymphony (Becton Dickinson) وتم تحليلها باستخدام برنامج FlowJo الإصدار 10 (TreeStar). استراتيجيات التصفية المستخدمة في هذه التحليلات مفصلة في الشكل التكميلية 1.

لإجراء تحليل تدفق الخلايا المصفاة للخلايا المتسللة إلى الشريان الأورطي، تم ضخ 10 مل من محلول فوسفات البفر (PBS) عبر ثقب قلبي لإزالة تلوث الدم من الأنسجة الوعائية. تم الاحتفاظ بالشرايين الأورطية في وسط دوبلكو المعدل (DMEM) البارد ليتم هضمها. تمت إزالة الدهون المحيطة بالأوعية وتم فتح الشريان الأورطي الصدري مع القوس طوليًا وقطعه إلى قطع أصغر تم حضنها لمدة 30 دقيقة في في حمام مائي في محلول هضم (كولاجيناز A) )، (روش/سيغما 10103586001)، ديسبايز II ( ), (روش/سيغما 04942078001)، DNase I (روش/سيغما 10104159001)
إيلاستاز ) و Libersase TL ( 0.2 وحدة وونش لكل مل , 5401119001)). بعد فترة الحضانة، تم خلط الأنسجة المهضومة عن طريق السحب، وتم تصفيتها من خلال منخل ودوران عند 400 جرام لمدة 5 دقائق تم صبغ الخلايا الفردية بمزيج من الأجسام المضادة ضد CD45-APCCy7 (Biolegend)، CD11b-BV605 (Biolegend)، CD11c-BV650 (Biolegend)، Ly6C-BV711 (Biolegend)، LY6G-APC (BD Biosciences)، CD8-PE (eBioscience)، CD90-BV785 (BD Biosciences)، MHCII-AF700 (Biolegend)، B220-PerCP5.5 (Biolegend)، SiglecH-FITC (eBioscience)، CD4-PeCy7 (Biolegend). اعتمادًا على الإعداد التجريبي، تم صبغ الخلايا بـ CD45-APCCy7 (Biolegend)، LY6G-V450 (BD Biosciences)، CD11b-ef660 (eBioscience)، CD45-APCCy7 (Biolegend)، LY6G-V450 (BD Biosciences)، CD11b-ef660 (eBioscience)، CD11c-PE (Biolegend)، B220-PerCP (Biolegend)، CD90-UV805 (Fisher scientific)، XCR1-BV785 (Biolegend)، CD206-eF450 (Biolegend)، MHCII-UV737 (BD Biosciences)، F4/80-PerCp5.5 (Biolegend)، Roryt-APC (Biolegend)، T-bet-PECF594 (BD Biosciences)، Ly6C-BV711 (Biolegend)، CD86-PECy7 (Biolegend)، FOXP3-FITC (Biolegend)، CD4-BV570 (Biolegend)، CD31-PE (Biolegend) و VCAM-AF594 (Biotechne). تم غسل الخلايا وإعادة تعليقها في محلول FACS لجمع البيانات باستخدام جهاز تحليل تدفق LSRFortessa SORP (Becton Dickinson) أو FACSymphony (Becton Dickinson) وتم تحليلها باستخدام برنامج FlowJo الإصدار 10 (TreeStar). استراتيجيات التصفية لـ خلايا، خلايا، و تظهر الخلايا في الشكل التوضيحي 2، وتظهر تلك الخاصة بمجموعة الماكروفاج في الشكل التوضيحي 3.

مجموعة PESA. تم إجراء هذه الدراسة على مجموعة فرعية من المشاركين من دراسة PESA دراسة PESA-CNIC-Santander (NCT01410318) هي دراسة مستمرة للمراقبة من نوع المجموعة المستقبلية تشمل 4,184 موظفًا غير مصاب بأعراض من بنك سانتاندير في مدريد (تتراوح أعمارهم بين 40 و54 عامًا وخالٍ من أمراض القلب والأوعية الدموية المعروفة في البداية في عام 2009). بالإضافة إلى معايير الاستبعاد المتبعة في الدراسة الرئيسية. تم استبعاد المشاركين الذين تناولوا المضادات الحيوية في الأشهر الثلاثة التي سبقت جمع العينة، والذين لديهم داء السكري من النوع 2 المعروف أو الذين تم علاجهم من داء السكري و/أو الاضطرابات المعوية. وقد مكننا ذلك من إزالة التأثيرات المربكة المحتملة بسبب دور ImP في داء السكري ومقاومة الأنسولين. وتعديل ميكروبيوتا الأمعاء قد يؤثر على إنتاج ImP. تم تقييم تصلب الشرايين تحت السريري من خلال دراسات التصوير بما في ذلك الموجات فوق الصوتية الوعائية ثنائية وثلاثية الأبعاد للشرايين السباتية والوريد الفخذي، ووجود الكالسيوم في الشرايين التاجية الذي تم تقييمه بواسطة الأشعة المقطعية، كما تم وصفه سابقًا. خضع المشاركون الذين يعانون من تصلب الشرايين تحت السريرية لفحص كامل للجسم دراسة F-FDG PET/MRI لتوصيف الشرايين امتصاص F-FDG ونشاط الأيض في نخاع العظم، كما هو موصوف تضمن مقياس خطر القلب والأوعية الدموية المستخدم مقياس SCORE (تقييم المخاطر التاجية المنهجي) التابع للجمعية الأوروبية لأمراض القلب، والذي يحسب خطر الوفاة بسبب أمراض القلب والأوعية الدموية على مدى 10 سنوات. شملت اختبار الدم الصائم الكيمياء الحيوية وتحديد hs-CRP. في هذه الدراسة، تم تعريف ارتفاع ضغط الدم على أنه الانقباضي و/أو الانبساطي و/أو الأفراد الذين يتناولون أدوية خافضة لضغط الدم. تم تعريف اضطراب الدهون في الدم على أنه الكوليسترول الكلي الكوليسترول LDL -كوليسترول أو استخدام أدوية خافضة للدهون. تم إجراء تقييمات القياسات الجسمية وتحليل مقاومة الجسم الكهربائية خلال نفس الموعد لكل مشارك. تم قياس الطول والوزن باستخدام معدات معايرة (Tanita BC-545N) مع ارتداء المشاركين الملابس الداخلية وبدون أحذية. تم حساب مؤشر كتلة الجسم كوزن (بالكيلوجرام) مقسومًا على الطول (بالمتر) تربيعًا. تم تعريف مدى تصلب الشرايين بواسطة متغير ترتيبي مجموع يتم حسابه من عدد المواقع الوعائية المتأثرة إلى مجموع النقاط الكلي كما يلي: (1) تصلب الشرايين السباتية (نقاط: 0، لا توجد لويحات؛ 1، لويحة واحدة؛ 2، لويحتان؛ 3، 3 لويحات أو أكثر) كما تم تقديره بواسطة الموجات فوق الصوتية الوعائية ثلاثية الأبعاد ومجموعها لكل من الشريان السباتي الأيسر والأيمن؛ (2) تصلب الشرايين الفخذية (نقاط: 0، لا توجد لويحات؛ 1، لويحة واحدة؛ 2، لويحتان؛ 3، 3 لويحات أو أكثر) كما تم تقديره بواسطة الموجات فوق الصوتية الوعائية ثلاثية الأبعاد ومجموعها لكل من الشريان الفخذي الأيسر والأيمن؛ (3) وجود تكلس في الشريان الصاعد أو النازل.
الشريان الأورطي (نقاط: 0، لا؛ 1، نعم)؛ (4) درجة CAC (نقاط: 0، 0؛ 1، 0.1-99؛ 2، 100-399؛ 3، 400-الحد الأقصى). بالنسبة للتحليل الأيضي، تم جمع عينات الدم الطرفية بعد صيام ليلة كاملة وتمت عملية الطرد المركزي في في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق للحصول على البلازما التي تم تقسيمها وتخزينها في لتحليل تسلسل جين الأمبليكون 16S rDNA، تم جمع البراز في أكواب جمع وتم تجميده على الفور في حتى يتم إجراء مزيد من التحليل. وافق لجنة الأخلاقيات المؤسسية على بروتوكول الدراسة، وتم تزويد جميع المشاركين بموافقة مستنيرة مكتوبة. تم إدراج خصائص المشاركين في الجداول التكميلية 1a و 1b و 3.

مجموعة IGT. للتحقق من النتائج المستخلصة من دراسة PESA، تم استخدام مجموعة فرعية من مجموعة IGT (الأخلاقيات 560-13). تم وصف تصميم الموضوع والطريقة من مجموعة التحقق في مكان آخر. باختصار، تتكون عينة الدراسة من رجال ونساء تتراوح أعمارهم بين سنوات من منطقة غوتنبرغ (السويد)، تم تجنيدهم على أساس عشوائي من سجل السكان السويدي وشملوا بناءً على حالة الجلوكوز لديهم. تضمنت معايير الاستبعاد المطبقة: السكري المعروف، الأمراض الالتهابية (مثل مرض كرون، التهاب القولون التقرحي أو الأمراض الروماتيزمية)، العلاج بالستيرويدات أو الأدوية المناعية، السرطان (ما لم يكن خالياً من الانتكاسات خلال السنوات الخمس السابقة)، ضعف الإدراك، العلاج من الأمراض المعدية واستخدام المضادات الحيوية في الأشهر الثلاثة الماضية، عدم القدرة على فهم اللغة السويدية المكتوبة والم spoken، بالإضافة إلى الأفراد المولودين خارج السويد. تم دعوة المشاركين عن طريق رسالة وقدموا جميع الموافقات المستنيرة. تم تقييم تصلب الشرايين بواسطة تصوير بالموجات فوق الصوتية لشرايين السبات، باستخدام بروتوكول موحد يتضمن جهاز الموجات فوق الصوتية Siemens Acuson S2000، ومن خلال وجود كلس الشرايين التاجية الذي تم تقييمه بواسطة الأشعة المقطعية، كما تم وصفه سابقاً. تم قياس ضغط الدم الانقباضي مرتين باستخدام جهاز تلقائي (Omron M10-IT، شركة أومرون للرعاية الصحية) وتم استخدام متوسط القياسات. تم استخدام استبيان لجمع معلومات مفصلة عن الأدوية والتاريخ العائلي. عينة دم وريدية تم جمعه من المشاركين بعد صيام ليلة كاملة واستخدم للتحليل البيوكيميائي الفوري للجلوكوز، والهيموجلوبين الجليكوزي، والكوليسترول الكلي. تم حساب SCORE2 (تقييم المخاطر التاجية المنهجي) كما هو موصوف. تم قياس وزن الجسم والطول ومحيط الخصر والورك باستخدام معدات معايرة مع المشاركين مرتدين ملابس خفيفة بدون أحذية ووفقًا لتوصيات منظمة الصحة العالمية الحالية. تم تعريف مدى تصلب الشرايين بواسطة متغير ترتيبي مجموع يتم حسابه من عدد المواقع الوعائية المتأثرة إلى مجموع النقاط الكلي كما يلي: (1) تصلب الشرايين السباتية (نقاط: 0، لا توجد لويحات؛ 1، على الأقل لويحة واحدة في أي من الشريان السباتي الأيسر أو الأيمن؛ 2، لويحات في كلا الوعائين)؛ (2) درجة CAC (نقاط: 0، 0؛ 1، 0.1-99؛ 2، 100-399؛ 3، 400-الحد الأقصى). يتم سرد خصائص المشاركين في الجدول التكميلي 2a، b.

تم قياس مستويات البلازما من ImP وحمض يوروكانك والهستيدين باستخدام الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء للغاية (UHPLC) المرتبطة بمطيافية الكتلة بالت tandem (LC-MS/MS). تم إجراء التحليلات في مختبرين مختلفين في إسبانيا (مجموعة PESA) وفي السويد (مجموعة IGT). استخدم كلا المختبرين طرق LC-MS/MS موثوقة بالكامل.

تحديد ImP في عينات البلازما من الفئران التي تم إطعامها نظام غذائي يحتوي على علف أو نظام غذائي عالي الكوليسترول مع وبدون جر ماوس في اليوم) و/أو AGN192403 ( تم إجراء (لكل فأر في اليوم) في مياه الشرب من خلال اتباع الطريقة الموضحة أدناه للدراسة البشرية، تحديدًا لفئة PESA.

حلول ومعايير عملية. بالنسبة لمجموعة PESA، تم إعداد حلول مخزنة فردية بتركيز 1000 جزء في المليون من ImP (سيغما ألدريتش 77951) وحمض يوروكان. (حمض يوروكان-1،2،3- ، سيغما ألدريتش، 709638) والهيستيدين (L-هيستيدين- كلوريد الهيدروجين أحادي الهيدرات، سيغما ألدريتش، 791318) تم تحضيره في ماء نقي للغاية وتم تخزينه في ثم تم تحضير تخفيفاتهم في الميثانول:الإيثانول (1:1، حجماً/حجماً) وتخزينها في
. بالنسبة لمجموعة IGT، الهيستيدين (الهيستيدين- مختبر نظائر كامبريدج)، ImP وحمض يوروكانك (ImP- و اليوروكانات- تم تحضيرها في الأسيتونيتريل.

تحديد كمية المستقلبات. بالنسبة لمجموعة PESA، من الميثانول: الإيثانول ( ) أضيفت إلى من عينة البلازما و من المعايير الداخلية الموسومة نظريًا في الميثانول: الإيثانول (حمض اليوروكان والهيستيدين). تم خلط العينات في جهاز الخلط لمدة 10 ثوانٍ ثم تم الطرد المركزي عند لمدة 20 دقيقة عند . تم أخذ مئة ميكرولتر من السائل الطافي ونقلها إلى قوارير كروماتوغرافيا سائلة للتحليل. تم تحديد كمية المستقلبات باستخدام نظام UHPLC من سلسلة 1290 Infinity المتصل بجهاز قياس الكتلة الثلاثي الرباعي (QqQ) 6460 من Agilent Technologies. باختصار، من العينة تم حقنها في عمود InfinityLab Poroshell 120 HILIC-Z ( ، Agilent Technologies) بمعدل تدفق قدره . احتوى الطور المتحرك A على 20 مليمول من أمونيوم الفورمات في الماء النقي عند pH 3، بينما احتوى الطور المتحرك B على 20 مليمول من أمونيوم الفورمات المائي عند pH 3 في الأسيتونيتريل: . كانت الشروط الأولية عند الزمن 0 هي ، تتناقص إلى عند 11.5 دقيقة. ثم تم زيادة التدرج إلى عند الزمن 12.0 دقيقة واستمر حتى الوقت الإجمالي للتشغيل 15 دقيقة. تم الحصول على بيانات قياس الكتلة في وضع التأين الإيجابي. تم التحقق من الإشارات الخام لانتقالات المراقبة التفاعلية المتعددة وتم دمج القمم التي تتوافق مع جميع المركبات المستهدفة بواسطة MassHunter Quantitative B.10.00 (Agilent Technologies). كانت انتقالات المراقبة التفاعلية المتعددة (طاقة الاصطدام، eV) كما يلي: و لـ ImP;139 >121(10) و 139>93 (26) لحمض اليوروكان؛ 142>124 (10) و (26) لحمض اليوروكان الموسوم؛ و ، للهيستيدين؛ و و للهيستيدين الموسوم. تم تحديد تركيز ImP من خلال إنشاء منحنى قياسي مع تركيزات معروفة من هذا المستقلب. تم تحديد كمية الهيستيدين وحمض اليوروكان بدلاً من ذلك باستخدام المعايير الداخلية المضافة إلى عينات البلازما كما هو مذكور أعلاه. تم تحليل معايير المستقلبات جنبًا إلى جنب مع عينات البلازما باستخدام طريقة LC-MS/MS. تم أخذ تخفيف البلازما أثناء إعداد العينة في الاعتبار أيضًا للتحديد الكمي.

بالنسبة لمجموعة IGT، تم تحديد مستويات ImP، اليوروكان والهيستيدين في البلازما كما هو موصوف سابقًا مع تعديلات طفيفة . باختصار، من عينات البلازما تم استخراجها باستخدام 6 أحجام من الأسيتونيتريل المحتوي على 100 نانومتر من المعايير الداخلية قبل تجفيف العينات تحت تدفق النيتروجين. ثم، تم إعادة تكوين العينات باستخدام في 1-بيوتانول، خضعت لـ -تحويل استر البوتيل وأخيرًا أعيد تكوينها في الماء: الأسيتونيتريل ، تم تحديد مستويات اليوروكان والهيستيدين بواسطة تحليل UHPLCMS/MS باستخدام مراقبة التفاعلات المتعددة للانتقالات و ، على التوالي. بالنسبة للمعايير الداخلية، تم استخدام الانتقالات و . كان النظام التحليلي يتكون من نظام Acquity UPLC I-class المتصل بجهاز قياس الكتلة الثلاثي الرباعي Xevo TQ-XS (Waters). تم حقن حجم العينة في عمود C18 BEH مع جزيئات، Waters) وتم فصلها باستخدام تدرج يتكون من الماء مع 0.1% حمض الفورميك (الطور A) والأسيتونيتريل مع 0.1% حمض الفورميك (الطور B). تم إجراء التحديدات باستخدام منحنى قياسي مع تركيزات معروفة من ImP، اليوروكان والهيستيدين.

بالنسبة لعينات أمعاء الفئران، تم استخراج الحمض النووي الكلي باستخدام مجموعة MasterPure Complete DNA & RNA Purification Kit (Epicentre) مع بعض التعديلات، كما هو موصوف سابقًا . تم تطبيع تركيزات الحمض النووي باستخدام مقياس الفلورية Qubit 2.0 (Life Technology) وتم إنتاج أمبليكون محدد لجين 16S rDNA (منطقة V3-V4) وفقًا لبروتوكول إعداد مكتبة تسلسل الميتاجينوم 16S من Illumina. تم إجراء خطوة التعدد باستخدام مجموعة Nextera XT Index Kit (Illumina) وتم التحقق من منتج الأمبليكون PCR على
شريحة bioanalyzer DNA1000 (Agilent Technologies). تم تجميع العينات بكميات متساوية وتم تسلسلها باستخدام مجموعة MiSeq Reagent v.3، على منصة MiSeq Illumina (خدمة تسلسل FISABIO).

بالنسبة للعينات البشرية، تم استخراج الحمض النووي البرازي باستخدام مجموعة متاحة تجاريًا (E.Z.N.A stool DNA kit، Omega Biotek) . بعد ذلك، تم إنتاج مكتبة الأمبليكون لمنطقة V4 داخل جين 16S rDNA وتم تسلسل كلا طرفي الشظايا باستخدام MiSeq Illumina بواسطة مركز الميكروبيوم في جامعة ميتشيغان .

في كلا الدراستين، لاستبعاد والتحكم في تلوث الكواشف المحتمل، تم أيضًا تسلسل الكواشف لاستخراج الحمض النووي وتكبير PCR كضوابط. لتحليل بيانات الميكروبيوتا من الفئران والبشر، تم تنسيق التسلسلات ذات الطرفين، وتجميعها في وحدات تصنيف تشغيلية عند مستوى الهوية، وتم التعليق عليها باستخدام إصدار SILVA باستخدام DADA2 لبيانات الفئران و وقواعد بيانات RDP الإصدار 18 باستخدام Mothur (v.1.40.5) كما هو موصوف سابقًا لبيانات البشر. تم تحديد معاملات ارتباط رتبة سبيرمان بين مستوى ImP ووفرة البكتيريا باستخدام وظيفة otu.association من Mothur .

تم جمع بيانات تناول الطعام عبر استبيان تكرار الطعام شبه الكمي المكون من 136 عنصرًا والذي تم التحقق منه للسكان الإسبان . تم تصنيف الأطعمة المبلغ عنها خلال تقييم النظام الغذائي إلى 44 مجموعة غذائية بناءً على تشابه ملف المغذيات، وتم حسابها على مدار الأيام لاشتقاق تناول عادات وتم تطبيعها حسب مؤشر كتلة الجسم لكل مشارك. بعد ذلك، تم إجراء تحليل PCA في SPSS V.23.0 (SPSS) لتحديد الأبعاد الأساسية المشتركة (العوامل أو الأنماط) لاستهلاك الطعام من خلال اشتقاق تحميلات العوامل لكل مجموعة غذائية محددة مسبقًا. تم تدوير العوامل بعد ذلك باستخدام إجراء Varimax للحفاظ على العوامل غير المرتبطة. تم استخدام تحليل القيم الذاتية، ورسم بياني للانحدار، وقابلية تفسير حل العامل لدعم القرار النهائي بشأن الاحتفاظ بحل مكون من 5 عوامل، حيث كان لكل عامل قيمة ذاتية . وفقًا لتحميلات العوامل الملاحظة لمجموعات الطعام، أطلقنا على العامل الأول نمط النظام الغذائي المتوسطي (المغذي بالخضروات والحبوب الكاملة والأسماك)، والعاملين الثاني والثالث كأنماط النظام الغذائي للإفطار (الإفطار1: المغذي بالحبوب، الشاي، الألبان قليلة الدسم، والإفطار2: يتكون أساسًا من الخبز، البيض والقهوة)، والعامل الرابع نمط النظام الغذائي الغربي (المغذي باللحوم الحمراء، السكر، الوجبات الخفيفة والحبوب المكررة) والعامل الخامس نمط النظام الغذائي الاجتماعي (المغذي بالمشروبات الغازية والمشروبات الروحية).

تم علاج الفئران الذكور البالغة من العمر – أسبوع في مياه الشرب مع لكل فأر في اليوم) لمدة 4 أو 8 أسابيع. تم جمع الشرايين الأورطية وهضمها كما هو موصوف أعلاه. للحصول على عدد كافٍ من الخلايا، تم تجميع ثلاث شرايين لكل حالة. تم وضع علامة على كل عينة باستخدام أوليغو تعدد الخلايا (CMO) باستخدام بروتوكول وضع العلامات CMO لتسلسل scRNA-seq من 10X Genomics. تم غسل الخلايا المعلّمة بـ CMOs، ووضع علامة عليها بـ SytoxGreen وHoechst لضمان حيوية الخلايا، وتم فرز الخلايا الحية باستخدام جهاز فرز الخلايا FACs Aria. تم تجميع العينات وتم إجراء تسلسل scRNA-seq وفقًا لبروتوكول Chromium Next GEM Single Cell3’v.3.1 مع تقنية باركود الميزة لتعدد الخلايا (10x Genomics). باختصار، تم أولاً عد الخلايا والتحقق من حيويتها باستخدام عداد الخلايا Countess 3 (Thermofisher). بعد ذلك، تم تحميل الخلايا على شريحة 10X Genomics من جهاز Chromium Controller (10X Genomics). بعد تضخيم cDNA، تم إنتاج مكتبات التعبير الجيني وCMO وتم تسلسلها باستخدام جهاز تسلسل Illumina NextSeq 2000.

تم إجراء معالجة بيانات التسلسل الخام من ملف FASTQ من كل منفذ باستخدام Cell Ranger (v.6.1.2) مع المعلمات الافتراضية ومرجع جينوم الفأر mm10 (GRCm38.p6) المقدم من 10 X Genomics. تم تحميل مصفوفات العد الفريدة للمؤشرات الجزيئية (UMI) الصالحة للخلايا المرمزة لكل منفذ إلى R (v.4.1.2) لمزيد من التحليلات باستخدام حزم Bioconductor و Seurat (v.4.0.6) . أولاً، تم تصفية الخلايا وفقًا لعدد
إجمالي عد UMI ( و )، العدد الإجمالي للجينات المكتشفة ( و )، ونسبة عد UMI الميتوكوندريا ( ). ثم، تم فصل الخلايا الناتجة باستخدام حزمة R cellhash (v.1.0.2) باستخدام طرق htodemux و bff_cluster و gmm_demux و multiseq و dropletutils. تم استخدام تصنيف الإجماع لمزيد من التحليلات. بمجرد الحصول على المجموعة النهائية من الخلايا، تم تطبيع قيم التعبير النسخي إلى إجمالي عدد UMI لكل خلية مضروبًا في عامل مقياس قدره 10,000 وتم تحويله إلى لوغاريتم طبيعي (وظيفة NormalizeData). تم تعريف الجينات ذات التباين العالي باستخدام طريقة VST كما هو مطبق في إعداد Seurat. تم استخدام 2,000 جين ذو تباين عالي ونموذج PCA لتقليل هذه المساحة البُعدية بعد تطبيع قيم التعبير المحولة إلى لوغاريتم. في هذه الخطوة، تم التخلص من التباين المرتبط بإجمالي عدد العدادات باستخدام وظيفة ScaleData مع نماذج خطية. تم استخدام طريقة مخطط الكوع لتحديد عدد المكونات الرئيسية للتحليلات اللاحقة (25 مكونًا رئيسيًا). ثم، تم تجميع الخلايا باستخدام خوارزمية لوفيان وتم تصورها باستخدام خوارزمية تقريب الفضاء المتجانس والإسقاط لتقليل الأبعاد (UMAP) مع أول 25 مكونًا رئيسيًا كمدخلات. تم تحديد المجموعات الرئيسية باستخدام علامات معروفة وحساب الجينات المعبر عنها بشكل مختلف باستخدام اختبار مجموع الرتب ويلكوكسون باستخدام حزمة R presto (الإصدار 1.0.0) (الشكل الممتد 4). تم حساب نسب الخلايا لكل حالة في كل مجموعة خلوية، وتم استخدام اختبار Z لنسبتين باستخدام وظيفة prop.test في R لتحديد الدلالة.

تم إجراء تحليلات التعبير التفاضلي بين الظروف بشكل مستقل على كل مجموعة خلوية مقارنة بين ImP مقابل التحكم لكل نقطة زمنية (4 أو 8 أسابيع) باستخدام حزمة MAST R (الإصدار 1.20.0). تم تصنيف الجينات وفقًا لتغيرات اللوغاريتم المضاعف، وتم استخدام التصنيفات الناتجة كمدخلات لحزمة fgsea R جنبًا إلى جنب مع مجموعات الجينات الرئيسية من قاعدة بيانات التوقيع الجزيئي (MSigDB؛ https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb). من أجل تحديد مجموعات فرعية محددة من الخلايا داخل كل نوع عام من الخلايا، تم فصل كل مجموعة وتحليلها بشكل مستقل باستخدام نفس سير العمل الموضح أعلاه. تم تحديد المجموعات الفرعية باستخدام علامات معروفة وحساب الجينات المعبر عنها بشكل مختلف باستخدام حزمة R المعروفة باسم presto. أخيرًا، تم إجراء تحليل تمثيل زائد يأخذ في الاعتبار علامات الجينات لكل مجموعة فرعية محددة مع قاعدة بيانات GO (https://www.geneontology.org/) من أجل تفسير الحالة النسخية لكل مجموعة فرعية.

تم عزل MAECs من الشرايين الأورطية الصدرية للفئران كما هو موصوف تم زراعة الخلايا في الوسط 199 (جيبكو، تكنولوجيا الحياة إنفيتروجن) مصل جنين العجل + بنسلين/ستربتوميسين جلوتامين هيبز مكمل نمو الخلايا البطانية هيبارين ، جميعها من سيغما ألدريتش، تحت في تم عزل خطوط خلايا MEF من 13.5 يومًا بعد الإخصاب من الأجنة باستخدام بروتوكول قياسي. تم تشريح كل جنين في 10 مل من PBS معقم، مع إزالة أعضائه الداخلية ورأسه وساقيه. بعد 30 دقيقة من الحضانة مع هز خفيف في مع تريبسين، تم زراعة الخلايا في طبقين بحجم 100 مم وتم حضنها لمدة لتأسيس خطوط MEF المخلدة، تم زرع MEFs في مراحل مبكرة في أطباق 60 مم وتم إصابتها بـ فيروس Retrovirus معبأ يحمل جينات فيروس الورم الحليمي البشري (HPV) 16 E6/E7. تم إجراء الاختيار باستخدام من G418 لمدة 10 أيام.

تم زراعة خط خلايا L929 (ATCC CCL-1TM) المستخدم لإنتاج السائل الفائق M-CSF على قوارير زراعة الخلايا (ستيمسيل) معاد تعليقها في RPMI 1640 (سيغما) المدعمة بـ مصل جنين العجل المعطل حرارياً (FCS، سيغما)، 1 مللي مول من البيروفات (لونزا)، أحماض أمينية غير أساسية (ثيرمو فيشر ساينتيفيك)، 2 مللي مول من L-جلوتامين، البنسلين و ستربتوميسين (الثلاثة من لونزا)، هنا يسمى R10. تم الحصول على السوبرناتانت عن طريق ترشيح الثقافات التي استمرت 15 يومًا من خلال وحدات فلتر ستيريكوب (ميرك ميليبور) وتم استخدامها لاحقًا لتكملة الوسط من أجل توليد خلايا بون مارك ديريفيد ماكروفاج.

تم إنتاج بكتيريا ماوس BMDMs كما هو موضح مع بعض التعديلات. تم زراعة خلايا نخاع العظام من فئران WT C57BL/6J في وسط RPMI1640 مضاف إليه 30% M-CSF المستخلص من خط خلايا L929 و10% FBS، البنسلين ستربتوميسين، 10 مللي مولار هيبيس، 1 نانومولار صوديوم بايروفات (جميعها من جيبكو) لمدة 5 أيام في بيئة معقمة، ولكن ليست معالجة لزراعة الأنسجة، أطباق بتري.

تم زرع خلايا BMDMs و MEFs و MAECs المستنبتة بعدد متساوٍ وتركها للراحة طوال الليل. بشكل خاص، بالنسبة لخلايا BMDMs و MEFs، تم زراعة خلايا لكل بئر في أطباق 6 آبار الحجم النهائي، كورنينغ)، ولـ MAECs تم زراعة خلايا لكل بئر في p24 الحجم النهائي، كورنينغ). تم معالجة الخلايا في المختبر مع أو بدون ImP تم عزل RNA الكلي من BMDMs و MEFs (مجموعة أدوات QIAamp DNA Mini) و MAECs (مجموعة أدوات miRNeasy Micro). تم إجراء تجارب RNA-seq الجماعية في وحدة الجينوميات في CNIC. بالنسبة لعينات BMDM و MEF، تم إعداد مكتبات RNA-seq باستخدام مجموعة أدوات NEBNext Ultra II Directional RNA Library preparation (New England Biolabs) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. بالنسبة لعينات MAECs، تم إعداد المكتبات باستخدام مجموعة أدوات NEBNext Single Cell/Low Input RNA Library Prep Kit for Illumina (New England Biolabs) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. تم تسلسل جميع المكتبات في جهاز Nextseq 2000 (Illumina). تم الحصول على ملفات FastQ لكل عينة باستخدام برنامج bcl2fastq v. 22.20 (Illumina). كان عدد القراءات لكل عينة يتراوح بين 11 و 21 مليون. تم معالجة القراءات مسبقًا وفقًا لنوع إعداد المكتبة باستخدام cutadapt لقص المحولات و FastQC لتقييم جودة القراءة. في حالة قراءات RNA-seq الاتجاهية (BMDMs و MEFs)، تمت إزالة تسلسلات محولات Illumina، وتم الاحتفاظ فقط بالقراءات التي تزيد عن 30 نقطة أساسية كصالحة. بالنسبة لـ MAECs، بالإضافة إلى تسلسلات محولات Illumina، تم اكتشاف وإزالة المحولات من بروتوكول NEBNext منخفض الإدخال، وتم الاحتفاظ فقط بالقراءات التي تزيد عن 30 نقطة أساسية كصالحة. تم تعيين القراءات الناتجة إلى النسخة المرجعية من الجينوم GRCm38.102 باستخدام STAR. وتم تقدير مستويات التعبير الجيني باستخدام RSEM تم إجراء تحليلات إضافية باستخدام R (الإصدار 4.3.2). باختصار، تم حساب العد لكل مليون، وتم تحديد عوامل الحجم للتطبيع بين العينات باستخدام طريقة المتوسط المقصوص لقيم M. ثم، تم استخدام بيانات موحدة لوغاريتمياً مع الأخذ في الاعتبار فقط الجينات التي تحتوي على تم استخدام العد في 3 عينات لتحليل التعبير التفاضلي، مما سمح بإجراء جميع المقارنات الممكنة ضمن نفس نوع الخلايا باستخدام حزمة DESeq2 في R. تم إجراء تحليل إثراء مجموعة الجينات باستخدام حزمة R fgsea، مقارنةً بين 1 ساعة و 2 ساعة بعد تحفيز ImP مع 0 ساعة (غير المحفز) داخل كل نوع من الخلايا. تم ترتيب الجينات في كل مقارنة وفقًا لـ “، وتم استخدام fgsea جنبًا إلى جنب مع مجموعات الجينات Hallmark من قاعدة بيانات التوقيع الجزيئي (MSigDB؛https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb“). أخيرًا، تم تمثيل درجات الإثراء المنضبطة للمسارات المختارة المهمة كخريطة حرارية باستخدام حزمة R ComplexHeatmap. .

تم زراعة BMDMs و MEFs في خلايا لكل بئر في أطباق 6 آبار (كورنينغ)، حجم نهائي 2 مل، وتمت الراحة طوال الليل في وسط RPMI 1%. تم معالجة الخلايا في المختبر مع أو بدون وتم حضنه مع AGN192403 أو لا المضاد) لمدة 180 دقيقة. تم غسل طبقات زراعة الخلايا بمحلول PBS، وتم الحصول على مستخلصات البروتين باستخدام محلول التحلل (50 مليمول/لتر تريس-هيدروكلوريد pH ثلاثي-(2-كربوكسي إيثيل) الفوسفين (TCEP) يحتوي على كوكتيلات مثبطات البروتياز والفوسفاتاز (Complete Mini خالية من EDTA وphosSTOP، روش). تم غلي العينات لمدة 5 دقائق وتم الاحتفاظ بها لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لتذويب وتقليل البروتينات، وبعد ذلك تم الطرد المركزي عند لمدة 15 دقيقة، تم استرداد السائل العلوي، وتم تحديد تركيز البروتين باستخدام مجموعة اختبار بروتين RC DC (مختبرات بيو راد).

تم إجراء تحليلات البروتيوم والفوسفوبروتيوم باستخدام وسم TMT المتساوي الكثافة 18-بلكس كما هو موصوف التحليل الإحصائي لـ
تم إجراء البيانات الكمية باستخدام ، وتم إجراء التحليل المقارن بين الظروف باستخدام القيم المعيارية و ، والتي تمثل اللوغاريتم الثنائي للنسبة بين الوفرة في العينة و التحكم فيه للببتيد وبروتين ، على التوالي. GSEA يستخدم تم استخدام قيم الببتيدات لتقييم مستويات الفسفرة في بروتينات مسار إشارة mTOR بين الظروف (أي، الخلايا المحفزة بـ ImP مقابل غير المحفزة). بالإضافة إلى ذلك، تم إجراء اختبار ويلكوكسون للرتب الموقعة باستخدام وفرة الببتيدات الفسفورية المقترنة. قيم لتحديد تأثيرات AGN192403 في مستويات الفسفرة لمسار المTOR بين الخلايا المعالجة بـ ImP والمزودة أو غير المزودة بـ AGN192403.

تم زراعة خلايا MEFs و BMDMs المستنبتة بأعداد متساوية خلايا لكل بئر) في أطباق 6 آبار ( الحجم النهائي، كورنينغ) وترك ليلاً. تم معالجة الخلايا في المختبر مع أو بدون تم حضنه مع الراباميسين (10 نانومتر)، AGN192403 ( مضاد)، إيدازوكسان (0.29 نانومول، مستقبل إيميدازولين و مضاد مستقبلات الأدرينالين) أو يوهيمبين ( المضاد). بعد 24 ساعة، تم جمع الخلايا ووضع علامة عليها باستخدام جسم مضاد p-S6-PE (Cell Signalling 5316) وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة وتم قياس التنشيط بواسطة تحليل تدفق الخلايا.

تم عزل خلايا البريتوان عن طريق الغسل باستخدام 5 مل من PBS البارد. تم زرع الخلايا وتم غسل الخلايا غير الملتصقة بـ PBS بعد ساعة. تم تعريف الخلايا الملتصقة على أنها ماكروفاجات بريتوانية، والتي تم التحكم فيها بشكل روتيني بواسطة قياس التدفق الخلوي. تم تقييم صبغة p-S6 بواسطة قياس التدفق الخلوي كما هو موضح أعلاه.

تم زراعة خلايا MEFs و BMDMs المستنبتة بأعداد متساوية خلايا لكل بئر) في أطباق 96 بئر ( الحجم النهائي، كورنينغ) وترك ليلاً. تم معالجة الخلايا في المختبر مع وبدون ImP ( ) وتم حضنه مع الراباميسين ( 10 نانومول )، AGN192403 ( مضاد)، إيدازوكسان (0.29 نانومتر، مستقبل إيميدازولين و مضاد) أو يوهيمبين ( المضاد). بعد 24 ساعة، تم جمع السائل الفائق، وتم قياس تركيز TNF باستخدام مجموعة ELISA TNF الفأري DuoSet (DY410) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة.

تم زرع خلايا MEFs المستنبتة ( خلايا لكل بئر) في أطباق 96 بئر ( الحجم النهائي، كورنينغ) وترك لمدة ليلة. تم معالجة الخلايا في المختبر مع وبدون بعد 24 ساعة، تم جمع السائل الفائق، وتم قياس تركيز MCP1 باستخدام مجموعة ELISA الخاصة بالفأر CCL2/JE/MCP1 DuoSet (DY479) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة.

تم تقييم هجرة المونوسيتات الدائرة التي تحفزها خلايا الفيبروبلاست المولدة من الأنسجة (MEFs) في اختبار هجرة الترانسويل. تم الحصول على المونوسيتات الدائرة من فئران Apoe البالغة من العمر 8 أسابيع. تم فرز الفئران الذكور (CD3 سي دي 49 سيجل “). في البداية، تم وضع خلايا الفيبروبلاست الجنينية (MEFs) في الحجرة السفلية من الترانسويل مع DMEM 1% FBS. وتم وضع المونوسيتات المفروزة في الحجرة العلوية من الترانسويل مع RPMI 1% FBS. تم تحفيز خلايا الفيبروبلاست الجنينية (MEFs) بـ بعد 24 ساعة، تم جمع الوسط تحت الترانسويل وتم قياس عدد الخلايا في السائل الطافح باستخدام LSRFortessa SORP (بيكتون ديكنسون).

تم جمع الدم كما هو موضح أعلاه. كمية TNF و IFN تم قياس مستوى السيروم وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة باستخدام مجموعة ELISA ثنائية TNF للفئران (DY410) و IFN للفئران دوست ELISA (DY485)، على التوالي.

تم تعريض فئران CD45.1 للإشعاع القاتل بجرعتين من 550 راد (5.5 غيغا)، تفصل بينهما مدة لا تقل عن 3 ساعات، ليكون إجمالي جرعة الإشعاع 1,100 راد، تلاها حقن وريدي بـ خلايا نخاع العظم من CD45.2+ راaptor أو التحكم في الراaptor أشقاء من نفس القمامة. في تجارب موازية، -خلايا مستقبلات الأدرينالين من أو تم نقل فئران C57BL/6J من النوع البري. في مجموعة أخرى من التجارب، تم تعريض فئران CD45.1 للإشعاع القاتل كما هو موضح أعلاه، تلا ذلك حقن وريدي لـ خلايا نخاع العظم من CD45.2 ليز2 نيش أو تحكم نيش أشقاء من نفس القمامة. تم حقن الفئران المزروعة بـ من سيفوفيتين تحت الجلد لمنع العدوى عند زراعة نخاع العظم. عند إعادة تكوين نخاع العظم بعد أيام، تم معالجة الفئران أو لم يتم معالجتها بـ لكل فأر في اليوم، بيجين ساينتيفيكا BA-F-3185.0001) لمدة 12 أسبوعًا في مياه الشرب.

تم إجراء كتم تعبير I1R في المختبر باستخدام siRNA Nisch (Santa Cruz sc-61202)، وهو مجموعة من 3 siRNAs محددة الهدف بطول 19-25 نيوكليوتيد مصممة لتقليل تعبير جين Nisch أو siRNA التحكم (Santa Cruz sc-36869) الذي يتكون من تسلسل مختلط مرتبط بـ 10-20 فلوريسئين والذي لا يؤدي إلى التحلل المحدد لأي mRNA خلوي. تم زراعة MEFs في طبق. خلايا لكل بئر) في لوحة زراعة الأنسجة ذات 6 آبار في 2 مل من وسط النمو العادي الخالي من المضادات الحيوية والمكمل بـ FBS. بعد 24 ساعة، تم غسل الخلايا بوسط نقل siRNA (سانتا كروز sc-3686860) وتم إضافة محلول ثنائي الشريطة siRNA (A + B) بعد الخلط بواسطة الماصة واحتضان المحلول المخلوط لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (A: 60 بيكومول siRNA في وسط نقل siRNA; ب: مادة نقل siRNA (سانتا كروز sc-29528) إلى وسط نقل siRNA). تم حضانة خلايا MEFs مع المحلول المختلط. بعد 5 ساعات من النقل، تمت إزالة الوسط وأضيف 2 مل من RMPI 10% FBS مع المضادات الحيوية. بعد 24 ساعة، تم معالجة الخلايا في المختبر مع وبدون وتم حضانته مع AGN192403 أو بدونها الخصم).