الاستخدام الانتقائي للبوليسكاريدات الطبية بواسطة أنواع بكتيرويدس وبارابكتيرويدس في أمعاء الإنسان

النتائج

رسم خريطة استخدام البولي سكريات الطبية بواسطة أنواع بكتيرويدس وبارابكتيرويدس في أمعاء الإنسان

قد تكون اختلافات ملفات نمو البوليسكاريدات الطبية ناتجة عن الاختلافات في الخصائص الفيزيائية والكيميائية للبوليسكاريدات، مثل تركيب السكريات الأحادية وبنية البوليسكاريدات. لتحديد ما إذا كانت بنية البوليسكاريد أو تركيب السكريات الأحادية تسبب اختلافات في ملفات النمو، اخترنا ثمانية بوليسكاريدات طبية تظهر ملفات نمو مختلفة. أولاً، قمنا بتوصيف الخصائص الفيزيائية والكيميائية لهذه البوليسكاريدات (الشكل التوضيحي التكميلي 4A-B، الشكل التوضيحي التكميلي 5A-D، والجداول التكميلية 5-7). أظهر تحليل تركيب السكريات الأحادية أن APs و GPs و GLPs_1 و GLPs_2 تتكون بشكل رئيسي من الجلوكوز (Glc) (92.8%، ، و ، على التوالي). كانت DPs_1 و DPs_2 تتكون بشكل رئيسي من المانوز (Man) ( و78.7%، على التوالي). كانت LBPs_1 تتكون بشكل رئيسي من أرابينوز (Ara) جالاكتوز، و حمض الجالاكتورونيك (GalA)، بينما كانت LBPs_2 تتكون بشكل رئيسي من ، و أظهرت السكريات المتعددة الطبية المختارة اختلافات في محتوى السكر الكلي، والوزن الجزيئي والتوزيع، وتركيب السكريات الأحادية، مما يدل على أن السكريات المتعددة الطبية كانت متنوعة في الخصائص الفيزيائية والكيميائية. ومن الجدير بالذكر أننا لم نجد تقريبًا أي ارتباط بين مسافة تركيب السكريات الأحادية وملف النمو، مما يشير إلى أن السكريات المتعددة ذات التركيب المشابه للسكريات الأحادية لم تظهر ملفات نمو مشابهة (الشكل التكميلي 4C). على سبيل المثال، سكر متعدد الفصوص (APs) و GPs،

يرتبط ملف استخدام البوليسكاريدات الطبية بالتنوع الجيني في الإنزيمات النشطة على الكربوهيدرات

تحليل النسخ الجيني يكشف أن بعض وحدات الجينات المحددة مرتفعة بشكل كبير بواسطة البوليسكاريدات الطبية

قمنا أيضًا بتحليل بيانات التعبير الجيني لبكتيرويدس باستخدام DPs_2، التي تعزز بشكل انتقائي نمو B. uniformis. مع التركيز على B. uniformis DA183، قمنا بمقارنة بيانات النسخ الجيني عند زراعتها باستخدام DPs والجلوكوز كمصدرين للكربون. كانت أعلى 10 جينات في عملية التمثيل الغذائي للكربوهيدرات التي تم تنظيمها بشكل إيجابي تقع في PUL34 من B. uniformis DA183 (PUL34_Bu) (الشكل 3G-I، الشكل التوضيحي 6E-F، الجدول التوضيحي 11). DPs هي أوليغوسكاريد مانوز يتكون هيكله العظمي من -D-جلك -دي مان

مجموعة جينات PUL34_Bu في B. uniformis مطلوبة لاستغلال بوليسكاريدات دندروبيوم

لاستكشاف الأساس الجيني الذي يكمن وراء الاستخدام المحدد للغاية لسكريات دندروبيوم (DPs) بواسطة بكتيريا ب. يونيكوميس، استخدمنا أداة تحرير جينوم بكتيرويديس المعتمدة على تقنية كريسبر/كاس. لبناء طفرات حذف PUL34 (الطرق). لضمان نجاح الجين

الضربة القاضية، استهدفنا منطقتين في مجموعة الجينات لإجراء ضربة قاضية منفصلة (الشكل 4A). كانت المنطقة الأولى (PUL34M_Bu) مقطعًا متوسط الحجم مع زيادة ملحوظة في مستوى النسخ وجينات يتم نسخها في نفس الاتجاه. احتوت المنطقة الثانية (PUL34S_Bu) على ثلاثة إنزيمات رئيسية كانت نظائر إنزيمات رئيسية ثلاثة متورطة في استخدام الإينولين. بما في ذلك بروتين مشابه لبروتين SusD لارتباط البوليسكاريد
في الغشاء الخارجي، يوجد بروتين شبيه بـ SusC لنقل البوليمرات السكرية، و GH26 لتحلل الروابط الجليكوسيدية. أكدت تقنية الرحلان الكهربائي للهلام وتسلسل الحمض النووي نجاح إلغاء المنطقتين (الشكل 4B، الشكل التوضيحي 9A-D). عند زراعتها في وسط mBMM مع DPs كمصدر الكربون الوحيد، نمت السلالة البرية، بينما لم تنمو السلالة الطافرة (الشكل 4C وD).

الشكل 3 | زيادة تنظيم جينات مواقع استخدام البوليسكاريد المحددة بواسطة البوليسكاريدات الطبية. رسم بياني بركاني لـ تعبير جين DA57 في الفولغاتوس مقارنةً بالوسط الأدنى المدعوم بالـ GPs مع الجلوكوز، موضحًا نسبة التغير ( -المحور) مقابل الدلالة التفاضلية (-لوغاريتم 10 المعدل -قيمة، المحور). تم تمييز أعلى 10 جينات مرتفعة التعبير باللون الأخضر. تم إجراء تحليل التعبير التفاضلي باستخدام DESeq2، مع استخدام اختبار والد ذو الجانبين. تم تعديل تم الحصول على القيم بعد تصحيحها لاختبار الفرضيات المتعددة باستخدام طريقة بنجاميني وهوشبرغ للتحكم في معدل الاكتشاف الخاطئ (FDR). الجينات التي تم تعديلها -قيمة تعتبر ذات دلالة إحصائية. -المحور يمثل تغير الطي في تعبير الجين، بينما -المحور يظهر الـ- المعدل -القيمة. تم إجراء كل تجربة ثلاث مرات لضمان الموثوقية. ب يوضح المخطط أن PUL19 من P. vulgatus DA57 (PUL19_Pv) يحتوي على 8 جينات، بحجم مجموعة يبلغ 14,518 قاعدة. susC: ناقل معتمد على TonB يشبه susC؛ susD: سكر سطحي يشبه susD-
بروتين الربط؛ GH: هيدروكسي الجليكوسيد؛ Unk: وظائف غير معروفة. C مخططات البركان للتعبير الجيني لـ P. distasonis DA104 مقارنةً بالوسائط الدنيا المدعمة بـ GPs والجلوكوز. التحليل الإحصائي هو نفسه كما في (A). D يوضح المخطط التخطيطي أن PUL29 من P. distasonis DA104 (PUL29 Pd) يحتوي على 8 جينات، بحجم مجموعة يبلغ 13,063 قاعدة. E-F يعرض مخطط الفقاعات التعبير التفاضلي لـ E) جينات PUL19 Pv ، و F) جينات PUL29 Pd وجيناته الثلاثة المجاورة، باستخدام GPs والجلوكوز. G مخططات البركان للتعبير الجيني لـ B. uniformis DA183 مقارنةً بالوسائط الدنيا المدعمة بـ DPs والجلوكوز. التحليل الإحصائي هو نفسه كما في (A). H يوضح المخطط التخطيطي أن PUL34_Bu يحتوي على 22 جينًا، بحجم مجموعة يبلغ 39,709 قاعدة. CE: استراز الكربوهيدرات. I يعرض مخطط الفقاعات التعبير التفاضلي لجين PUL34_Bu وجيناته الثلاثة المجاورة، باستخدام DPs والجلوكوز. المنطقة بين خطين عموديين متقطعين باللون السماوي تشير إلى الجينات التي تم تنظيمها بشكل كبير مع اتجاه نسخ متسق.

إن إنزيمات GH26 ضرورية لاستخدام المانان المستخرج من النباتات في B. uniformis

النشاط الإنزيمي والخصوصية لإنزيم Bacteroides GH26

لتقييم دور مجال CBM في GH26 BuDA183، قمنا أولاً بمقارنة النشاط الإنزيمي لنوع البرية الكامل و GH26 المقطوع من CBM. ومن المثير للاهتمام أنه لم يتم ملاحظة أي فرق كبير في نشاط الإنزيم بين GH26 نوع البرية (Km=3.75 ± 1.44 ملغ/مل، Kcat وتم تقصير CBM GH26 ككات ) (الشكل التكميلي 13A-B، الشكل التكميلي 16A-B، والجدول التكميلي 18). من الجدير بالذكر أن بعض الدراسات أظهرت أن مجال CBM يوفر حماية حرارية لبعض الإنزيمات المحللة للكربوهيدرات. من خلال مقارنة أنشطة الإنزيمات لنوع GH26 البري و GH26 المقطوع من CBM عند درجات حرارة مختلفة، وجدنا أن GH26 المقطوع من CBM أصبح أقل استقرارًا حراريًا. على وجه التحديد، كانت قيم Tm هي لنوع البرية GH26 و للنمط المختصر من CBM (الشكل التكميلي 16C، والجدول التكميلي 19). وهذا يشير إلى أن الوظيفة المحتملة لمجال CBM من GH26 مرتبطة بالاستقرار الحراري.

الشكل 5 | استخدام المانان المستمد من النباتات بواسطة إنزيمات Bacteroides GH26. شجرة تطورية لتسلسلات بروتين GH26، بما في ذلك 89 GH26 موصوفة. . ب. يونيورميس GH26 في هذه الدراسة. أسماء الكائنات تشير إلى مستوى الأنواع، بجانب رقم الوصول إلى GenBank لبروتين GH33 الذي تم تحليله. تم إنشاء الشجرة باستخدام طريقة الاحتمال الأقصى. تم تلوين علامة الشجرة حسب تصنيف EC. تم تمييز ب. يونيورميس GH26 في هذه الدراسة بنجمة حمراء ذات خمس نقاط. تم تمييز GH26 المتبلور من ب. أوفاتوس بنجمة رمادية ذات خمس نقاط. ب. تُظهر النقطة المخطط كثافة نمو ب. أوفاتوس ATCC8483 (باللون الأزرق)، ب. يونيورميس DA183 (باللون الرمادي)، ب. يونيورميس ATCC8492 (باللون الأحمر)، سلالة الطفرة من ب. يونيورميس ATCC8492 المحذوف منها PUL34S (باللون الأخضر) وسلالة الطفرة الأخرى من ب. يونيورميس ATCC8492 المحذوف منها PUL34S (باللون البرتقالي) التي تستخدم 6 مصادر كربون، مثل الجلوكوز، بوليسكاريد دندروبيوم أوفيكينايل (DPs)، غلوكومانان كونجاك، صمغ الغوار.
الجالاكتومانان، جالاكتومانان الخروب، ومانان جوز العاج. تُعرض البيانات كقيم متوسطة تم إجراء التحاليل في ثلاث نسخ فنية ).
هيكل مجال C لبكتيريا ب. يونيكوميس GH26. D تم التنبؤ بالهيكل العام لبكتيريا ب. يونيكوميس GH26 بواسطة AlphaFold2 استنادًا إلى تسلسل البروتين. تم تلوين المجال الشبيه بـ Ig باللون الأخضر، ومجال GH26 باللون الأحمر، والليكتين المرتبط بالغالاكتوز باللون الأرجواني، على التوالي. E تم تراكب هيكل مجال ب. يونيكوميس GH26 (الأحمر) على هيكل ب. أوفاتوس GH26 (الرمادي) (رمز PDB 6HF4) (درجة TM RMSD المواقع النشطة (E415 و E504)، مواقع ربط الكالسيوم (L198 و S201)، ومواقع ربط الركيزة (V170 و A200 و W207 و Y342 و W527 و Y528) من B. uniformis GH26 (نماذج عصا حمراء)، والمواقع النشطة (E201 و E291)، مواقع ربط الكالسيوم (L105 و S108)، ومواقع ربط الركيزة (V77 و A107 و W112 و Y148 و W314 و Y315) من B. ovatus GH26 (نماذج عصا رمادية) محفوظة.

نقاش

طرق

جمع وحفظ عينات البراز البشري

عزل وزراعة بكتيريا بكتيرويدس وبارابكتيرويدس من الأمعاء

.

، تم توزيع الوسط الأساسي المعدل في طبق 96 بئر. تم غسل الثقافات البكتيرية مرتين بمحلول PBS لا هوائي، وتم ضبط الكثافة الضوئية عند 600 نانومتر (OD600) لمحلول البكتيريا إلى 0.1. أشارت منحنيات النمو إلى أن كل من mBMM وmYCFA دعمت عمومًا نمو أنواع البكتيرويد (الشكل التكميلي 1). مقارنةً بـ mYCFA، قدم mBMM، كونه وسطًا صناعيًا بتركيب واضح، قياسات أكثر استقرارًا لاستخدام البوليسكاريد.

كأنواع أساسية.

. تم قياس OD النمو وتسجيله كل 12 ساعة باستخدام قارئ الميكرو بلايت.

للحصول على المنتج النهائي. بالنسبة للبوليسكاريدات الطبية_2 (مثل، DPs_2)، كانت عملية الاستخراج مشابهة لتلك الخاصة بالبوليسكاريدات الطبية_1 (مثل، DPs_1)، مع الخطوة الإضافية للغسيل لإزالة الجزيئات الأصغر من 3.5 كيلو دالتون.

تحديد الوزن الجزيئي والتوزيع

تحديد تركيب السكريات الأحادية

تسلسل وتحليل النسخ الجيني

التعليق الجينومي لموقع استخدام البوليسكاريد (PUL)

بناء طفرات knockout لبكتيريا B. uniformis

محاذاة التسلسل والبنية

تعبير وتنقية إنزيم باكتيرويدس GH26

اختبار نشاط إنزيم باكتيرويدس GH26

حركية الإنزيمات

الربط الجزيئي والتصورات

الإحصائيات وإمكانية التكرار

ملخص التقرير

توفر البيانات

References

1. Garrett, W. S. The gut microbiota and colon cancer. Science 364, 1133-1135 (2019).
2. Sun, L. et al. Bile salt hydrolase in non-enterotoxigenic Bacteroides potentiates colorectal cancer. Nat. Commun. 14, 755 (2023).
3. Huang, J. et al. Ginseng polysaccharides alter the gut microbiota and kynurenine/tryptophan ratio, potentiating the antitumour effect of antiprogrammed cell death 1/programmed cell death ligand 1 (anti-PD-1/PD-L1) immunotherapy. Gut 71, 734-745 (2022).
4. Tanoue, T. et al. A defined commensal consortium elicits CD8 T cells and anti-cancer immunity. Nature 565, 600-605 (2019).
5. Zafar, H. & Saier, M. H. Jr Gut Bacteroides species in health and disease. Gut Microbes 13, 1848158 (2021).
6. Beller, Z. W. et al. Inducible CRISPR-targeted “knockdown” of human gut Bacteroides in gnotobiotic mice discloses glycan utilization strategies. Proc. Natl Acad. Sci. 120, e2311422120 (2023).
7. Hehemann, J.-H. et al. Transfer of carbohydrate-active enzymes from marine bacteria to Japanese gut microbiota. Nature 464, 908-912 (2010).
8. Kijner, S., Ennis, D., Shmorak, S., Florentin, A. & Yassour, M. CRISPR-Cas-based identification of a sialylated human milk oligosaccharides utilization cluster in the infant gut commensal Bacteroides dorei. Nat. Commun. 15, 105 (2024).
9. Panwar, D., Shubhashini, A. & Kapoor, M. Complex alpha and beta mannan foraging by the human gut bacteria. Biotechnology Advances, 108166 (2023).
10. Buzun, E. et al. A bacterial sialidase mediates early-life colonization by a pioneering gut commensal. Cell Host Microbe 32, 181-190. e189 (2024).
11. Kou, F. et al. A review of Ganoderma lucidum polysaccharides: Health benefit, structure-activity relationship, modification, and nanoparticle encapsulation. International journal of biological macromolecules, 125199 (2023).
12. Lin, T.-L. et al. Role of gut microbiota in identification of novel TCMderived active metabolites. Protein Cell 12, 394-410 (2021).
13. Yu, Y., Shen, M., Song, Q. & Xie, J. Biological activities and pharmaceutical applications of polysaccharide from natural resources: A review. Carbohydr. Polym. 183, 91-101 (2018).
14. Shan-Shan, S., Kai, W., Ke, M., Li, B. & Hong-Wei, L. An insoluble polysaccharide from the sclerotium of Poria cocos improves hyperglycemia, hyperlipidemia and hepatic steatosis in ob/ob mice via modulation of gut microbiota. Chin. J. Nat. Med. 17, 3-14 (2019).
15. Shi, L. Bioactivities, isolation and purification methods of polysaccharides from natural products: A review. Int. J. Biol. Macromolecules 92, 37-48 (2016).
16. Wu, T.-R. et al. Gut commensal Parabacteroides goldsteinii plays a predominant role in the anti-obesity effects of polysaccharides isolated from Hirsutella sinensis. Gut 68, 248-262 (2019).
17. Zhang, Y. et al. Identification of the core active structure of a Dendrobium officinale polysaccharide and its protective effect against dextran sulfate sodium-induced colitis via alleviating gut microbiota dysbiosis. Food Res. Int. 137, 109641 (2020).
18. Martens, E. C., Chiang, H. C. & Gordon, J. I. Mucosal glycan foraging enhances fitness and transmission of a saccharolytic human gut bacterial symbiont. Cell host microbe 4, 447-457 (2008).
19. Lapébie, P., Lombard, V., Drula, E., Terrapon, N. & Henrissat, B. Bacteroidetes use thousands of enzyme combinations to break down glycans. Nat. Commun. 10, 2043 (2019).
20. Martens, E. C. et al. Recognition and degradation of plant cell wall polysaccharides by two human gut symbionts. PLOS Biol. 9, e1001221 (2011).
21. Foley, M. H., Cockburn, D. W. & Koropatkin, N. M. The Sus operon: a model system for starch uptake by the human gut Bacteroidetes. Cell. Mol. Life Sci. 73, 2603-2617 (2016).
22. Luis, A. S. et al. A single sulfatase is required to access colonic mucin by a gut bacterium. Nature 598, 332-337 (2021).
23. Wu, S. et al. GMrepo: a database of curated and consistently annotated human gut metagenomes. Nucleic acids Res. 48, D545-D553 (2020).
24. Liu, C. et al. Enlightening the taxonomy darkness of human gut microbiomes with a cultured biobank. Microbiome 9, 119 (2021).
25. Drula, E. et al. The carbohydrate-active enzyme database: functions and literature. Nucleic acids Res. 50, D571-D577 (2022).
26. Qi, H. et al. Comparisons of isolation methods, structural features, and bioactivities of the polysaccharides from three common Panax species: A review of recent progress. Molecules 26, 4997 (2021).
27. Kuang, M.-T. et al. Structural characterization and hypoglycemic effect via stimulating glucagon-like peptide-1 secretion of two polysaccharides from Dendrobium officinale. Carbohydr. Polym.
    241, 116326 (2020).
28. Yin, J.-Y. et al. Separation, structure characterization, conformation and immunomodulating effect of a hyperbranched heteroglycan from Radix Astragali. Carbohydr. Polym. 87, 667-675 (2012).
29. Wardman, J. F., Bains, R. K., Rahfeld, P. & Withers, S. G. Carbohydrate-active enzymes (CAZymes) in the gut microbiome. Nat. Rev. Microbiol. 20, 542-556 (2022).
30. Yin, Y. et al. dbCAN: a web resource for automated carbohydrateactive enzyme annotation. Nucleic acids Res. 40, W445-W451 (2012).
31. Stewart, R. D., Auffret, M. D., Roehe, R. & Watson, M. Open prediction of polysaccharide utilisation loci (PUL) in 5414 public Bacteroidetes genomes using PULpy. bioRxiv, 421024, https://doi.org/ 10.1101/421024 (2018).
32. Guo, M., Shao, S., Wang, D., Zhao, D. & Wang, M. Recent progress in polysaccharides from Panax ginseng CA Meyer. Food Funct. 12, 494-518 (2021).
33. Li, J. et al. Purification, structural characterization, and immunomodulatory activity of the polysaccharides from Ganoderma lucidum. Int. J. Biol. macromolecules 143, 806-813 (2020).
34. Zheng, L. et al. CRISPR/Cas-based genome editing for human gut commensal bacteroides species. ACS Synth. Biol. 11, 464-472 (2022).
35. García-Bayona, L. & Comstock, L. E. Streamlined genetic manipulation of diverse bacteroides and parabacteroides isolates from the human gut microbiota. MBio 10, 01762-01719 (2019).
36. Almeida, A. et al. A unified catalog of 204,938 reference genomes from the human gut microbiome. Nat. Biotechnol. 39, 105-114 (2021).
37. Buchfink, B., Reuter, K. & Drost, H.-G. Sensitive protein alignments at tree-of-life scale using DIAMOND. Nat. methods 18, 366-368 (2021).
38. Zhou, N. et al. Konjac glucomannan: a review of structure, physicochemical properties, and wound dressing applications. J. Appl. Polym. Sci. 139, 51780 (2022).
39. Mudgil, D., Barak, S. & Khatkar, B. S. Guar gum: processing, properties and food applications-a review. J. food Sci. Technol. 51, 409-418 (2014).
40. Lazaridou, A., Biliaderis, C. G. & Izydorczyk, M. S. Structural characteristics and rheological properties of locust bean galactomannans: a comparison of samples from different carob tree populations. J. Sci. Food Agriculture 81, 68-75 (2001).
41. Ghysels, S. et al. Fast pyrolysis of mannan-rich ivory nut (Phytelephas aequatorialis) to valuable biorefinery products. Chem. Eng. J. 373, 446-457 (2019).
42. Jumper, J. et al. Highly accurate protein structure prediction with AlphaFold. Nature 596, 583-589 (2021).
43. Bågenholm, V. et al. A surface-exposed GH26 -mannanase from Bacteroides ovatus: Structure, role, and phylogenetic analysis of BoMan26B. J. Biol. Chem. 294, 9100-9117 (2019).
44. Okano, H., Kanaya, E., Ozaki, M., Angkawidjaja, C. & Kanaya, S. Structure, activity, and stability of metagenome-derived glycoside hydrolase family 9 endoglucanase with an N-terminal Ig-like domain. Protein Sci. 24, 408-419 (2015).
45. Liberato, M. V. et al. Molecular characterization of a family 5 glycoside hydrolase suggests an induced-fit enzymatic mechanism. Sci. Rep. 6, 23473 (2016).
46. Murray, P. A., Kern, D. G. & Winkler, J. R. Identification of a galactosebinding lectin on Fusobacterium nucleatum FN-2. Infect. Immun. 56, 1314-1319 (1988).
47. Kuhaudomlarp, S., Gillon, E., Varrot, A. & Imberty, A. LecA (PA-IL): A galactose-binding lectin from Pseudomonas aeruginosa. Lectin Purification and Analysis: Methods and Protocols, 257-266 (2020).
48. Bolam, D. N. et al. Mannanase A from Pseudomonas fluorescens ssp. cellulosa is a retaining glycosyl hydrolase in which E212 and E320 are the putative catalytic residues. Biochemistry 35, 16195-16204 (1996).
49. Eberhardt, J., Santos-Martins, D., Tillack, A. F. & Forli, S. AutoDock Vina 1.2. O: New docking methods, expanded force field, and python bindings. J. Chem. Inf. modeling 61, 3891-3898 (2021).
50. Nguyen, T. B., Pires, D. E. & Ascher, D. B. CSM-carbohydrate: protein-carbohydrate binding affinity prediction and docking scoring function. Brief. Bioinforma. 23, bbab512 (2022).
51. dos Santos, C. R. et al. Molecular insights into substrate specificity and thermal stability of a bacterial GH5-CBM27 endo-1, 4- -Dmannanase. J. Struct. Biol. 177, 469-476 (2012).
52. Roske, Y., Sunna, A., Pfeil, W. & Heinemann, U. High-resolution crystal structures of Caldicellulosiruptor strain Rt8B. 4 carbohydrate-binding module CBM27-1 and its complex with mannohexaose. J. Mol. Biol. 340, 543-554 (2004).
53. Zhao, L. et al. Gut bacteria selectively promoted by dietary fibers alleviate type 2 diabetes. Science 359, 1151-1156 (2018).
54. O’Keefe, S. J. et al. Fat, fibre and cancer risk in African Americans and rural Africans. Nat. Commun. 6, 1-14 (2015).
55. Sorbara, M. T. & Pamer, E. G. Microbiome-based therapeutics. Nat. Rev. Microbiol. 20, 365-380 (2022).
56. Gauffin Cano, P., Santacruz, A., Moya, Á. & Sanz, Y. Bacteroides uniformis CECT 7771 ameliorates metabolic and immunological dysfunction in mice with high-fat-diet induced obesity. (2012).
57. López-Almela, I. et al. Bacteroides uniformis combined with fiber amplifies metabolic and immune benefits in obese mice. Gut Microbes 13, 1-20 (2021).
58. Morita, H. et al. Bacteroides uniformis and its preferred substrate, cyclodextrin, enhance endurance exercise performance in mice and human males. Sci. Adv. 9, eadd2120 (2023).
59. Yan, Y. et al. Bacteroides uniformis-induced perturbations in colonic microbiota and bile acid levels inhibit TH17 differentiation and ameliorate colitis developments. npj Biofilms Microbiomes 9, 56 (2023).
60. Dai, W. et al. Discovery of Bacteroides uniformis F18-22 as a Safe and Novel Probiotic Bacterium for the Treatment of Ulcerative Colitis from the Healthy Human Colon. Int. J. Mol. Sci. 24, 14669 (2023).
61. Nie, Q. et al. Gut symbionts alleviate MASH through a secondary bile acid biosynthetic pathway. Cell 187, 2717-2734. e2733 (2024).
62. Zeng, P., Li, J., Chen, Y. & Zhang, L. The structures and biological functions of polysaccharides from traditional Chinese herbs. Prog. Mol. Biol. Transl. Sci. 163, 423-444 (2019).
63. Cuskin, F. et al. Human gut Bacteroidetes can utilize yeast mannan through a selfish mechanism. Nature 517, 165-169 (2015).
64. Sastre, D. E. et al. Human gut microbes express functionally distinct endoglycosidases to metabolize the same N-glycan substrate. Nat. Commun. 15, 5123 (2024).
65. Martens, E. C., Roth, R., Heuser, J. E. & Gordon, J. I. Coordinate regulation of glycan degradation and polysaccharide capsule biosynthesis by a prominent human gut symbiont. J. Biol. Chem. 284, 18445-18457 (2009).
66. Bågenholm, V. et al. Galactomannan catabolism conferred by a polysaccharide utilization locus of Bacteroides ovatus: enzyme synergy and crystal structure of a -mannanase. J. Biol. Chem. 292, 229-243 (2017).
67. Patnode, M. L. et al. Strain-level functional variation in the human gut microbiota based on bacterial binding to artificial food particles. Cell host microbe 29, 664-673. e665 (2021).
68. Odamaki, T. et al. Comparative genomics revealed genetic diversity and species/strain-level differences in carbohydrate metabolism of three probiotic bifidobacterial species. Int. J. Genomics 2015, 567809 (2015).
69. van Leeuwen, P. T., Brul, S., Zhang, J. & Wortel, M. T. Synthetic microbial communities (SynComs) of the human gut: design, assembly, and applications. FEMS Microbiol Rev 47, https://doi. org/10.1093/femsre/fuad012 (2023).
70. Cheng, A. G. et al. Design, construction, and in vivo augmentation of a complex gut microbiome. Cell 185, 3617-3636.e3619 (2022).
71. Parks, D. H. et al. GTDB: an ongoing census of bacterial and archaeal diversity through a phylogenetically consistent, rank normalized and complete genome-based taxonomy. Nucleic acids Res. 50, D785-D794 (2022).
72. Bacic, M. K. & Smith, C. J. Laboratory maintenance and cultivation of bacteroides species. Curr. Protoc. Microbiol. https://doi.org/10. 1002/9780471729259.mc13c01s9 (2008).
73. Liu, W., Zhu, W. Y., Yao, W. & Mao, S. Y. Isolation and identification of a lactate-utilizing, butyrate-producing bacterium and its primary metabolic characteristics. Wei Sheng Wu Xue Bao 47, 435-440 (2007).
74. Fischer, E. & Sauer, U. Metabolic flux profiling of Escherichia coli mutants in central carbon metabolism using GC-MS. Eur. J. Biochem 270, 880-891 (2003).
75. Portnoy, V. A., Herrgård, M. J. & Palsson, B. Aerobic fermentation of D-glucose by an evolved cytochrome oxidase-deficient Escherichia coli strain. Appl Environ. Microbiol 74, 7561-7569 (2008).
76. DuBois, M., Gilles, K. A., Hamilton, J. K. & Rebers, P. t. & Smith, F. Colorimetric method for determination of sugars and related substances. Anal. Chem. 28, 350-356 (1956).
77. Dubois, M., Gilles, K., Hamilton, J., Rebers, P. & Smith, F. A colorimetric method for the determination of sugars. Nature 168, 167-167 (1951).
78. Sun, L. et al. Structural characterization of rhamnogalacturonan domains from Panax ginseng CA Meyer. Carbohydr. Polym. 203, 119-127 (2019).
79. Vidal, S., Williams, P., O’neill, M. & Pellerin, P. Polysaccharides from grape berry cell walls. Part I: tissue distribution and structural characterization of the pectic polysaccharides. Carbohydr. Polym. 45, 315-323 (2001).
80. Zhang, X. et al. Total fractionation and characterization of the watersoluble polysaccharides isolated from Panax ginseng CA Meyer. Carbohydr. Polym. 77, 544-552 (2009).
81. Kazemi, M., Khodaiyan, F., Labbafi, M., Hosseini, S. S. & Hojjati, M. Pistachio green hull pectin: Optimization of microwave-assisted extraction and evaluation of its physicochemical, structural and functional properties. Food Chem. 271, 663-672 (2019).
82. Feng, Z. et al. The model polysaccharide potato galactan is actually a mixture of different polysaccharides. Carbohydr. Polym. 313, 120889 (2023).
83. Yang, X., Zhao, Y., Wang, Q., Wang, H. & Mei, Q. Analysis of the monosaccharide components in Angelica polysaccharides by high performance liquid chromatography. Anal. Sci. 21, 1177-1180 (2005).
84. Liu, J. et al. Multi-level fingerprinting and cardiomyocyte protection evaluation for comparing polysaccharides from six Panax herbal medicines. Carbohydr. Polym. 277, 118867 (2022).
85. Chen, S., Zhou, Y., Chen, Y. & Gu, J. fastp: an ultra-fast all-in-one FASTQ preprocessor. Bioinformatics 34, i884-i890 (2018).
86. Langmead, B. & Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat. methods 9, 357-359 (2012).
87. Li, B. & Dewey, C. N. RSEM: accurate transcript quantification from RNA-Seq data with or without a reference genome. BMC Bioinforma. 12, 1-16 (2011).
88. Dillies, M.-A. et al. A comprehensive evaluation of normalization methods for Illumina high-throughput RNA sequencing data analysis. Brief. Bioinforma. 14, 671-683 (2013).
89. Terrapon, N., Lombard, V., Gilbert, H. J. & Henrissat, B. Automatic prediction of polysaccharide utilization loci in Bacteroidetes species. Bioinformatics 31, 647-655 (2015).
90. Edgar, R. C. MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput. Nucleic acids Res. 32, 1792-1797 (2004).
91. Yang, Z. PAML 4: phylogenetic analysis by maximum likelihood. Mol. Biol. Evolution 24, 1586-1591 (2007).
92. Zhang, C., Shine, M., Pyle, A. M. & Zhang, Y. US-align: universal structure alignments of proteins, nucleic acids, and macromolecular complexes. Nat. methods 19, 1109-1115 (2022).
93. Teufel, F. et al. SignalP 6.0 predicts all five types of signal peptides using protein language models. Nat. Biotechnol. 40, 1023-1025 (2022).
94. Wells, J. et al. Chainsaw: protein domain segmentation with fully convolutional neural networks. Bioinformatics 40, btae296 (2024).
95. Miller, G. L. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Anal. Chem. 31, 426-428 (1959).
96. R Core Team. R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing (Vienna, Austria, 2018). https://www.R-project.org/.
97. Visualizer, D. Discovery studio visualizer. 2. Accelrys Software Inc. (2005).
98. Camacho, C. et al. BLAST+: architecture and applications. BMC Bioinforma. 10, 1-9 (2009).

شكر وتقدير

مساهمات المؤلفين

المصالح المتنافسة

معلومات إضافية

Selective utilization of medicinal polysaccharides by human gut Bacteroides and Parabacteroides species

Results

Mapping the utilization profile of medicinal polysaccharides by human gut Bacteroides and Parabacteroides species

Growth profiles variation among medicinal polysaccharides may be due to the differences in physicochemical properties of polysaccharides, such as monosaccharide composition, and polysaccharide structure. To determine whether polysaccharide structure or monosaccharides composition causes variations in growth profiles, we selected eight medicinal polysaccharides exhibiting different growth profile. First, we characterized the physical and chemical properties of these polysaccharides (Supplementary Fig. 4A-B, Supplementary Fig. 5A-D, and Supplementary Tables 5-7). The monosaccharide composition analysis revealed that APs, GPs, GLPs_1, and GLPs_2 were mainly composed of glucose (Glc) (92.8%, , and , respectively). DPs_1 and DPs_2 were mainly composed of mannose (Man) ( and 78.7%, respectively). LBPs_1 were mainly composed of arabinose (Ara), galactose, and galacturonic acid (GalA), while LBPs_2 were mainly composed of , and . The selected medicinal polysaccharides showed differences in total sugar content, molecular weight and distribution, and monosaccharide composition, which indicated that the medicinal polysaccharides were diverse in physicochemical properties. Notably, we found almost no correlation between distance of monosaccharide composition and growth profile, indicating that polysaccharides with similar monosaccharide composition did not exhibit similar growth profiles (Supplementary Fig. 4C). For instance, Astragalus polysaccharide (APs) and GPs,

The utilization profile of medicinal polysaccharides is associated with genomic variation in carbohydrate-active enzymes

Transcriptomics analysis reveals that specific PULs are highly up-regulated by medicinal polysaccharides

We also analyzed gene expression data for Bacteroides utilizing DPs_2, which selectively promoted the growth of B. uniformis. Focusing on B. uniformis DA183, we compared transcriptome data when cultivated with DPs and glucose as the sole carbon sources. The top 10 upregulated carbohydrate metabolism genes were located in PUL34 of B. uniformis DA183 (PUL34_Bu) (Fig. 3G-I, Supplementary Fig. 6E-F, Supplementary Table 11). DPs are mannose oligosaccharide with a backbone consisted of -D-GIc -D-Man

PUL34_Bu gene cluster in B. uniformis is required for Dendrobium polysaccharides utilization

To explore the genetic basis underlying the highly specific utilization of Dendrobium polysaccharides (DPs) by B. uniformis, we utilized CRISPR/Cas-based Bacteroides genome editing tool to construct PUL34 knock-out mutants (Methods). To ensure successful gene

knockout, we targeted two regions in the gene cluster for separate knockout (Fig. 4A). The first region (PUL34M_Bu) was a moderately sized segment with significant upregulation at the transcriptional level and genes transcribed in the same direction. The second region (PUL34S_Bu) contained three key enzymes which were isozymes of three key enzymes involved in inulin utilization , including a SusD-like protein for polysaccharide binding
in the outer membrane, a SusC-like protein for polysaccharide transport, and GH26 for glycosidic bond hydrolysis. Gel electrophoresis and DNA sequencing confirmed the successful knockout of the two regions (Fig. 4B, Supplementary Fig. 9A-D). When grown in mBMM medium with DPs as the sole carbon source, the wild-type strain grew, whereas the mutant strain did not (Fig. 4C, and D).

Fig. 3 | Up-regulation of specific polysaccharide utilization locus genes by medicinal polysaccharides. A Volcano plot of . vulgatus DA57 gene expression comparing minimal media supplemented with GPs to glucose, showing the foldchange ( -axis) versus the differential significance (-log10 adjusted -value, axis). The top 10 up-regulated genes are highlighted in green. Differential expression analysis was performed using DESeq2, employing a two-sided Wald test. Adjusted -values were obtained after correcting for multiple hypothesis testing using the Benjamini and Hochberg method to control the false discovery rate (FDR). Genes with an adjusted -value are considered statistically significant. The -axis represents the fold change in gene expression, while the -axis shows the – of the adjusted -value. Each experiment was conducted in triplicate to ensure reliability. B The schematic diagram shows that PUL19 of P. vulgatus DA57 (PUL19_Pv) contains 8 genes, with a cluster size of 14,518 base pairs. susC: susC-like TonB-dependent transporter; susD: susD-like cell-surface glycan-
binding protein; GH:glycoside hydrolyze; Unk: unknown functions. C Volcano plots of P. distasonis DA104 gene expression comparing minimal media supplemented with GPs to glucose. The statistical analysis is the same as in (A). D The schematic diagram shows that PUL29 of P. distasonis DA104 (PUL29 Pd) contains 8 genes, with a cluster size of 13,063 base pairs. E-F Bubble plot displays the differential expression of the E) PUL19 Pv , and F) PUL29 Pd genes and its neighboring 3 genes, utilizing GPs and glucose. G Volcano plots of B. uniformis DA183 gene expression comparing minimal media supplemented with DPs to glucose. The statistical analysis is the same as in (A). H The schematic diagram shows that PUL34_Bu contains 22 genes, with a cluster size of 39,709 base pairs. CE: carbohydrate esterase. I Bubble plot displays the differential expression of the PUL34_Bu gene and its neighboring 3 genes, utilizing DPs and glucose. The region between two vertical cyan dotted lines indicates significantly upregulated genes with consistent transcription direction.

GH26 enzymes is necessary for plant-derived mannan utilization in B. uniformis