فيولاين سانت أندريهبرونو شاربآن بيتونفينسنت روييسيلين بوسيمأنتوني بيرتراندماكسيم روتيفاليعقوب بيرغستيدتإتيان باتينماثيو ل. ألبرتلويس كوينتانا-مورسيداراغ دافي & اتحاد البيئة الداخلية*
الملخص
يختلف الأفراد بشكل كبير في استجاباتهم المناعية، حيث تلعب العوامل العمرية والجنسية والوراثية أدوارًا رئيسية في هذه التباينات الفطرية.. ومع ذلك، تظل المتغيرات التي تؤدي إلى مثل هذه الاختلافات في إفراز السيتوكينات – وهو عنصر حاسم في استجابة المضيف للتحديات المناعية – غير محددة بشكل جيد. هنا، قمنا بالتحقيق في 136 متغيرًا وحددنا التدخين، والعدوى الكامنة بفيروس السيتوميجالو، ومؤشر كتلة الجسم كعوامل رئيسية تساهم في تباين استجابة السيتوكينات، مع تأثيرات بمقادير مماثلة للعمر، والجنس، والوراثة. نجد أن التدخين يؤثر على كل من الاستجابات المناعية الفطرية والتكيفية. ومن الجدير بالذكر أن تأثيره على الاستجابات الفطرية يفقد بسرعة بعد الإقلاع عن التدخين ويرتبط بشكل خاص بمستويات البلازما من CEACAM6، في حين أن تأثيره على الاستجابات التكيفية يستمر لفترة طويلة بعد أن يتوقف الأفراد عن التدخين ويرتبط بالذاكرة الوراثية. يدعم ذلك ارتباط تأثير التدخين السابق على استجابات السيتوكينات مع الميثيلين الحمضي النووي في محولات الإشارة المحددة ومنظمات الأيض. تحدد نتائجنا ثلاثة متغيرات جديدة مرتبطة بتباين إفراز السيتوكينات وتكشف عن أدوار للتدخين في تنظيم الاستجابات المناعية على المدى القصير والطويل. هذه النتائج لها آثار سريرية محتملة على خطر تطوير العدوى، والسرطانات، أو الأمراض المناعية الذاتية.
توجد مستويات عالية من التباين بين الأفراد والسكان فيما يتعلق بالاستجابات للتحديات المناعية.. وقد تم تسليط الضوء على ذلك من خلال جائحة COVID-19 من خلال النتائج السريرية المتنوعة التي لوحظت بعد الإصابة بفيروس SARS-CoV-تؤثر متغيرات مثل العمر والجنس والوراثة بشكل كبير على طريقة استجابة الأفراد للعدوى.. ومع ذلك، فإن مثل هذه التباين المناعي لا يؤخذ عادة في الاعتبار عند تصميم العلاجات أو اللقاحات، وهناك حاجة لتحديد المتغيرات المرتبطة بتباين الاستجابة المناعية بشكل أفضل.
تم تطوير مشروع Milieu Intérieur لتقييم العوامل التي تسهم في استجابات المناعة ‘الصحية’ المتغيرة.تمت موازنة المجموعة من حيث العمر والجنس وتضم أفرادًا من خلفية جينية متجانسة، لتسهيل تحديد محددات المناعة الجديدة، بالإضافة إلى العمر والجنس والأنماط الجينية. لقد تقدم مشروع Milieu Intérieur بالفعل في فهم المتغيرات التي تنظم توازن المناعة. على وجه الخصوص، من خلال قياس تأثيرات العمر والجنس والوراثة وتركيب الخلايا على مستويات النسخ للجينات المرتبطة بالمناعة. وتأثيرات العمر والجنس والعدوى الكامنة بفيروس السيتوميجالو (CMV) والتدخين على تركيبة كريات الدم البيضاء .
لتحديد عوامل بيئية جديدة مرتبطة بتباين الاستجابة للتحفيز المناعي، ركزنا على إفراز بروتين السيتوكين كظاهرة استجابة مناعية. تم قياس تركيزات 13 سيتوكين مرتبط بالأمراض والطب (CXCL5، CSF2، IFNIL-1،
تم قياس TNF و IL-2 و IL-6 و IL-8 و IL-10 و IL-12p70 و IL-13 و IL-17 و IL-23 باستخدام تقنية Luminex، بعد 22 ساعة من تحفيز الدم الكامل القياسي مع 11 من المحفزات المناعية لـ 1,000 متبرع من Milieu Intérieur (الجدول التكميلي 1)، بالإضافة إلى مجموعة تحكم غير محفزة (حالة صفرية). يتم تصنيف التحفيزات إلى 4 فئات: ميكروبية (باسيلاس كالميت-غيران (BCG) وإشريكية قولونية (E. coli) والليبوبوليسكاريد (LPS) وكنيديا البيض (C.albicans)) وعوامل فيروسية (الإنفلونزا وحمض البوليمر الإينوزيني-البولي سيتيك (poly I:C))، والتي يتم التعرف عليها بشكل أساسي بواسطة مستقبلات على خلايا المناعة الفطرية؛ منشطات خلايا T (سموم ستافيلوكوكوس أوريوس B (SEB) والأجسام المضادة المضادة لـ CD3 و CD28 (anti-CD3 + CD28))، التي تحفز الاستجابات المناعية التكيفية؛ والسيتوكينات (TNF، IL- و IFN ).
علاقات التدخين، فيروس CMV ومؤشر كتلة الجسم
تحليل المكونات الرئيسية (PCA) (الشكل البياني الموسع 1) وخرائط الحرارة (الشكل البياني الموسع 2) لـ 13 سيتوكين في 12 تحفيز مناعي تبرز السيتوكينات المحددة التي تم تحفيزها في كل حالة مستقلة. التجميع الهرمي للاختلافات المتوسطة المعيارية المسجلة لمستويات السيتوكين (الشكل 1a) يميز بوضوح المجموعات التي تتوافق بشكل عام مع نوع التحفيز. تستقر الاستجابات المناعية التي تحفزها التحفيزات الفطرية (E. coli وLPS) والتحفيزات التكيفية (SEB وanti-CD3 + CD28) بشكل منفصل، وتظهر زيادة أكبر.
الشكل 1| المتغيرات المرتبطة بمستويات السيتوكينات في تحفيزات المناعة المتنوعة. أ، الفروق المتوسطة المعيارية للوغاريتم لـ 13 سيتوكين في 12 تحفيز مناعي. ب، الارتباطات المهمة (معدلة بواسطة بنجاميني-يكوتيليقيمة اختبار نسبة الاحتمالية (LRT) < 0.01) للمتغيرات التي تحتوي على سيتوكين واحد على الأقل مستحث لكل تحفيز مناعي ملونة باللون الأسود. ج، خرائط حرارية تظهر -log10 (تم تعديل بنجاميني-يكوتيليقيمة LRT) لمتغيرات eCRF المرتبطة على الأقل بسيتوكين واحد في كل تحفيز (تم تعديلها بواسطة بنجاميني-يكوتيليقيمة LRT ). ، ، .
التباين بين الأفراد في السيتوكينات المقاسة مقارنة بأنواع التحفيز الأخرى.
من نموذج التقرير الإلكتروني للحالة (eCRF)، قمنا بتجميع 136 متغيرًا اجتماعيًا ديموغرافيًا وبيئيًا وسريريًا وتغذويًا (الجدول التكميلي 2) واختبرنا علاقتها بالسيتوكينات المستحثة في كل تحفيز من خلال اختبارات نسبة الاحتمالات (LRTs)، باستخدام العمر والجنس والدفعة التجريبية كمتغيرات مصاحبة. يرتبط أحد عشر متغيرًا على الأقل بسيتوكين واحد في على الأقل تحفيز واحد (تم تعديل بنجاميني-يكوتيلي)قيمة ) (الشكل 1ب). هذه مرتبطة في الغالب بمؤشر كتلة الجسم (BMI) في تحفيزات SEB و BCG، والعدوى الكامنة بفيروس CMV في تحفيزات المناعة التكيفية والتدخين، الذي يظهر أكبر عدد من الارتباطات عبر التحفيزات. ترتبط المتغيرات المتعلقة بالتدخين بـ IL-2 و IL-13 في تحفيز SEB و anti-CD3 + CD28، وترتبط بـ CXCL5 في تحفيز المناعة الفطرية (الشكل 1c). تدعم هذه الملاحظات النتائج السابقة التي تظهر أن التدخين يعزز الالتهاب ويضعف المناعة ضد العدوى البكتيرية.وأن IL-2 و IL-13 متورطان في تعديل تأثيرات التعرض للتبغ. سي إم في العدوى الكامنة مرتبطة بـ CSF2 و IFNوTNF عند تحفيز المناعة التكيفية، بما يتماشى مع عملنا السابق الذي يظهر ارتباطات قوية بين إيجابية الأجسام المضادة لفيروس CMV وزيادة أعداد مجموعات الذاكرة الفعالة لخلايا T.لقد لاحظنا أيضًا أن المتغيرات المتعلقة بمؤشر كتلة الجسم مرتبطة بـ CXCL5 بعد تحفيز BCG، و بـ IL-2 بعد تحفيز SEB، وهو ما يتماشى مع عدم تنظيم CXCL5 و IL-2 في السمنة.. نظرًا لأن التفاعلات المحتملة قد توجد بين المتغيرات التي تم اختبارها والعمر، قمنا بإجراء نفس التحليل مع الأخذ في الاعتبار تفاعلات العمر والتدخين في النماذج. النتائج مشابهة جدًا لتلك التي تم الحصول عليها دون النظر في التفاعلات، وبعض المتغيرات المتعلقة بالتدخين مرتبطة بأهمية أعلى في ظروف تحفيز SEB وanti-CD3 + CD28 وE. coli وLPS (الشكل 3 من البيانات الموسعة). من الجدير بالذكر أنه من خلال تضمين هذه التفاعلات، فإن المتغيرات المتعلقة بالتدخين مرتبطة بشكل كبير باستجابات IL-2 بعد تحفيز BCG. قد تعكس استجابة IL-2 هذه “مستضدًا محددًا طويل الأمد.استجابة الخلية إلىالتطعيم، الذي تلقاه جميع أفراد المجموعة عند الولادة بسبب التطعيم الإجباري بلقاح BCG في فرنسا قبل عام 2007، مما يعزز الروابط بين التدخين ومناعة خلايا T. تم أيضًا اختبار التأثيرات الفردية للعمر والجنس، وتظهر نتائج LRT المقابلة وأحجام التأثير في الأشكال التكميلية 4 و5. بالإضافة إلى ذلك، نظرًا لأن مستضد الكريات البيضاء البشرية (HLA) هو محدد معروف لتنوع استجابة المناعة، والذي يكون ذا صلة في الغالب للاستجابات المحددة للمستضد، قمنا باختبار الروابط بين أنواع HLA التي تم تحديدها سابقًا.وتم تحفيز استجابات السيتوكين بعد نفس الإجراء الذي استخدمناه لمتغيرات المتبرعين الأخرى. لقد اكتشفنا ارتباطًا واحدًا فقط ذا دلالة، بين معقد التوافق النسيجي الرئيسي من الفئة الثانية، DQ بيتا 1 HLA.DBQ1.1P و IL-6 في حالة التحكم غير المحفزة. ومع ذلك، لم تُلاحظ أي ارتباطات مع استجابات السيتوكين المحفزة بعد التحفيز.
تأثير التدخين مستمر
لتقييم التأثير البيولوجي للتدخين على إفراز السيتوكينات، قمنا برسم أحجام التأثير لمتغيرات التدخين من النماذج الخطية. لاحظنا أن التدخين الحالي يؤثر على كل من الاستجابات المناعية الفطرية والتكيفية (الشكل 2أ والشكل الإضافي 6). يرتبط التدخين بزيادة أقوى في تحفيز CXCL5 بعد تحفيز E. coli، وزيادة أقوى في تحفيز IL-2 وIL-13 بعد تحفيز SEB (تم تعديل بنجاميني-يكوتيلي)قيمة LRT < 0.001). المتغيرات المتعلقة بالتدخين مثل عدد سنوات التدخين، عدد السنوات منذ آخر تدخين، وإجمالي عدد السجائر تظهر ارتباطات متسقة (الشكل 2ب، ج).
من الجدير بالذكر، على عكس المدخنين الحاليين (الشكل 2أ)، لا يظهر المدخنون السابقون زيادة ملحوظة في إفراز CXCL5 بعد تحفيز المناعة الفطرية، بينما يظهرون زيادة في إفراز IL-2 وIL-13 بعد تحفيز المناعة التكيفية، مقارنة بغير المدخنين (الشكل 2د). تُظهر الرسوم البيانية لصناديق تركيز السيتوكينات أن مستويات CXCL5 في المدخنين السابقين وغير المدخنين ليست مختلفة بشكل ملحوظ، لكنها تختلف عن تلك الموجودة في المدخنين الحاليين بعد تحفيزات المناعة الفطرية (الشكل 2هـ والشكل الإضافي 6أ، د). على العكس، فإن مستويات IL-2 في المدخنين الحاليين والمدخنين السابقين ليست مختلفة بشكل ملحوظ لكنها تختلف عن تلك الموجودة في غير المدخنين في تحفيزات المناعة التكيفية (الشكل 2و والشكل الإضافي 6ب، هـ). يرتبط إنتاج السيتوكينات لكل من المدخنين الحاليين والمدخنين السابقين بعدد سنوات التدخين في تحفيزات المناعة التكيفية، لكن هذا ليس هو الحال بالنسبة للمدخنين السابقين في تحفيزات المناعة الفطرية (الشكل 2ز والشكل الإضافي 6ج، ف). تُظهر هذه النتائج مجتمعة تأثيرًا قصير الأمد للتدخين على استجابات المناعة الفطرية، وتأثيرًا طويل الأمد للتدخين على استجابات المناعة التكيفية.
خلايا المناعة وبروتينات البلازما
نظرًا لأن مستويات السيتوكينات المستحثة مرتبطة بأعداد مجموعات فرعية محددة من خلايا المناعة الدائرة، اختبرنا ما إذا كانت ارتباطات السيتوكينات بالتدخين تبقى قائمة عند أخذ هذه المجموعات الخلوية في نماذجنا بعين الاعتبار (الشكل 3 والشكل التمديدي 7a). ارتباطات CMV
الشكل 2 | تأثيرات التدخين على الاستجابات المناعية الفطرية والتكيفية، ممثلة بـ. كولاي وتحفيز SEB، على التوالي. أ-د، مخططات حجم التأثير ثنائية الجانب تمثل التأثير على كل سيتوكين مستحث باستخدامأفراد مستقلون مع فترة ثقة 0.95 للتدخين الحالي مقارنة بعدم التدخين (أ)، لعدد سنوات التدخين (ب)، لسنوات منذ آخر تدخين (ج)، وللتدخين السابق (د) في تحفيز E. coli أو SEB. أحجام تأثير ذات دلالة ) باللون الأسود، بينما الأخرى باللون الرمادي. تلك التي تحتوي أيضًا على تعديل بنجاميني-يكوتيليقيمة LRTموسومة بنجمة حمراء. بالضبطالقيم المقدمة في تركيز CXCL5 بعد تحفيز E. coli (e) وتركيز IL-2 بعد تحفيز SEB (f) لـ
أبداً، المدخنون السابقون والحاليون. تمثل الرسوم البيانية الصندوقيةأفراد مستقلون. الخط المركزي يُظهر الوسيط، وتمثل المفاصل النسب المئوية 25 و75، وتمتد الشعيرات من المفصل إلى أكبر أو أصغر القيم، ولا تتجاوز 1.5 نطاق ربعي. تُظهر اختبارات ويلكوكسون ذات الجانبين المعدلة لمقارنات متعددة.القيم (من اليسار إلى اليمين): و و تركيز CXCL5 بعد تحفيز E. coli وتركيز IL-2 وIL-13 بعد تحفيز SEB مقابل عدد سنوات التدخين للمدخنين الحاليين أو السابقين. المناطق الرمادية تمثل فترات الثقة 0.95 لخطوط الانحدار الخطي. حالة السيروم مع مستويات CSF2 و IFNوتم فقدان TNF في تحفيز SEB عندما يتم استخدام أعداد خلايا الذاكرة T المحددة كمتغيرات مشتركة (الشكل 7a من البيانات الموسعة)، وهو ما يتماشى مع الارتباط المبلغ عنه لهذه الخلايا مع العدوى الكامنة لفيروس CMV.، ويقترح أن تأثيرات عدوى CMV الكامنة على السيتوكينات تتوسطها تغييرات في تركيبة خلايا الدم. التحليل نفسه الذي تم إجراؤه على متغير التدخين لتحفيزات المناعة الفطرية لا يظهر أي مجموعات خلوية واضحة تؤثر على ارتباط التدخين بمستويات CXCL5 (الشكل 3أ). على العكس من ذلك، عند تحفيزات المناعة التكيفية، فإن أعداد متعددة من خلية وتنظيميتزيل مجموعات الخلايا الفرعية ارتباط التدخين بمستويات البروتين (الشكل 3أ)، مما يشير إلى أن هذه المجموعات تتوسط تأثير التدخين في الاستجابات المناعية التكيفية. كما قمنا بتقييم دور 326 بروتينًا ذائبًا في الدم تم قياسه في بلازما مجموعة من 400 متبرع.لقد حددنا أن مستويات المستضد السرطاني الجنيني عند تضمين جزيء التصاق الخلايا المرتبط بمستضد 6 (CEACAM6) في النماذج، يتم القضاء على العلاقة بين التدخين وCXCL5 بعد التحفيزات المناعية الفطرية، مما يشير إلى أن CEACAM6 متورط في تنظيم CXCL5 لدى المدخنين (الشكل 3ب). نحن نفسر هذا التأثير على أنه تفاعل بيولوجي بدلاً من تحول في تجمعات خلايا المناعة، وذلك بسبب فترة التحفيز القصيرة التي تبلغ 22 ساعة، ولأن تحليل الانحدار الذي يتضمن أعداد الخلايا كمتغيرات مصاحبة (الشكل 3أ) لم يحدد أي ارتباطات خلوية مع العلاقة بين التدخين وCXCL5 الناتجة عن البكتيريا.
تغيرات ميثلة الحمض النووي
لاختبار الفرضية التي تفيد بأن آلية وراثية خارجية تتوسط التأثير المستمر للتدخين على الاستجابات المناعية التكيفية،
الشكل 3 | تأثيرات التدخين على السيتوكينات المستحثة تتأثر بمجموعات خلايا الدم وبروتينات البلازما. أ، خرائط حرارية تظهر الارتباطات (- (تعديل بنجاميني-يكوتيليقيمة LRT (صفة))) حالة التدخين مع السيتوكينات المستحثة في. كولاي وتحفيز SEB مع عدم وجود متغير عدد مجموعة الخلايا (السطر العلوي) أو كل من 76 عدد مجموعة الخلايا الممررة كمتغيرات في النماذج. ب، مخططات حجم التأثير ثنائية الجانب تمثل
أفراد مستقلون مع فترة ثقة 0.95 للمدخنين الحاليين مقارنة بغير المدخنين في تحفيز E.coli عندما لا يتم تمرير بروتين البلازما (الأعلى) أو CEACAM6 (الأسفل) كمتغير مصاحب في النماذج. دلالة ( أحجام التأثير باللون الأسود والأخرى باللون الرمادي. النجم الأحمر يشير إلى تعديل بنجاميني-يكوتيليقيمة LRT. حددنا ما إذا كان التدخين يؤثر على مستويات السيتوكينات من خلال تغييرات في ميثلة الحمض النووي. قمنا بقياس ميثلة الحمض النووي الأساسية في أكثر منالمواقع التي تستخدم مصفوفة MethylationEPIC وحددتالمواقع المرتبطة مباشرة بالتدخين – أي، غير الوسيطة بتكوين خلايا الدم – في مجموعة ميليو إنتيريور. من بين هذه المواقع، يرتبط 129 بشكل كبير بـ IL-2 في تحفيز SEB (تم تعديل بنجاميني-يكوتيليقيمة LRT < 0.001). اختبرنا ما إذا كانت مستويات الميثيلين في الحمض النووي لهذه المواقع CpG يمكن أن ترتبط بارتباط التدخين بمستويات السيتوكينات بعد تحفيز SEB. لاحظنا أن 11 CpG، عند اعتبارها كمتغيرات مشتركة في النماذج، تلغي ارتباط التدخين بـ IL-2 و IL-13 (تم تعديل بنجاميني-يكوتيلي) قيمة LRT < 0.001) (الشكل البياني الممتد 7b). من بين هذه، 3 تتعلق بمثبط مستقبلات الهيدروكربونات العطرية (الجين. المواقع الأخرى لمواقع CpG تت correspond إلى جينات F2RL3 ومستقبلات البروتين G (GPR15) ومستقبلات حمض الريتينويك (RARA) وإنزيم البروتين سيرين (PRSS23). في جميع هذه المواقع، نلاحظ انخفاضًا قويًا في الميثيل الحمضي في المدخنين الحاليين مقارنة بغير المدخنين، بينما يظهر المدخنون السابقون حالة متوسطة من الميثيل الحمضي (الشكل 4a). وبشكل متسق، في المدخنين السابقين، يرتبط عدد السنوات التي دخن فيها الأفراد (الشكل 4b) وإجمالي عدد السجائر التي دخنها (الشكل 4c) ومستويات IL-2 في تحفيز SEB (الشكل 4e) سلبًا بمستوى ميثيل الحمض لهذه الجينات، بينما يرتبط عدد السنوات منذ أن توقف المدخنون عن التدخين يرتبط بشكل إيجابي عام بمستوى ميثيل الحمض النووي لديهم (الشكل 4d). توفر هذه النتائج دليلاً على أن التأثير المستمر للتدخين على الاستجابات المناعية التكيفية مرتبط بميثيل الحمض النووي عند المحفزات التفاعلية وعوامل تنظيم الأيض.
الارتباطات الجينومية
نظرًا لأن بعض المتغيرات الجينية تظهر أدوارها التنظيمية عند التحفيز فقط، فإن دراستنا مناسبة بشكل خاص لتحديد مواقع الصفات الكمية للبروتينات المستجيبة (pQTLs). قمنا باختبار إجمالي 5,699,237 من تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة (SNPs) عالية الجودة المرتبطة بالاستجابات السيتوكينية الناتجة عن كل تحفيز، مع ضبط العمر والجنس والمتغيرات التقنية وعدد الخلايا المناعية الرئيسية (الجدول التكميلي 3) ونبلغ عن 44 pQTLs استجابة (الجدول 1). تعتبر قواعد بيانات Somalogic وOlink هي الموارد الرئيسية لـ pQTLs البلازمية، التي حددت pQTLs لبعض السيتوكينات التي اختبرناها في حالة الاستقرار.. ومع ذلك، حسب علمنا، فإن دراسة واحدة فقط – دراسة 500FG – اختبرت استجابة pQTLs لبعض السيتوكينات التي تم اختبارها في الدم الكاملمن بين الأزواج الشائعة المختبرة لتحفيز السيتوكينات، تحدد كلا الدراستين pQTLs لـ IL-6 و IL-1.في بولي I:C، TNF في C. albicans و IL-1في LPS. من الجدير بالذكر أن pQTL (rs3775291) الذي نحدده لـ IL-1 و IL-6 في بولي I: يقع في
الشكل 4 | التأثير المستمر للتدخين على الاستجابات المناعية التكيفية يرتبط بميثيل الحمض النووي عند المحفزات الإشارية ومنظمي الأيض. أ، مستويات ميثيل الحمض النووي لأفضل بروب التي تزيل ارتباط حالة التدخين مع IL-2 في تحفيز SEB، عندما تم تمريرها كمتغير مشترك في النماذج، للجينات المحددة وللمدخنين السابقين والحاليين. الخط المركزي يظهر الوسيط، وتمثل الأجزاء 25 و75 بالمئة، وتمتد الشعيرات من الجزء إلى أكبر أو أصغر القيم دون تجاوز 1.5 نطاق ربعي.اختبارات مجموع الرتب ويلكوكسون ذات الجانبين مع تعديل لمقارنات متعددة. من اليسار إلى اليمين:، ، (cg03636183); 7.9 (cg19859270); ، 0.31 (cg14391737).ب-هـ، الميثلة (مستوى 5 ميثيل سيتوزين) لكل بروب اعتمادًا على عدد السنوات التي دخن فيها الأفراد (للمدخنين الحاليين) (ب)، العدد الإجمالي لعدد السجائر المدخنة مدى الحياة (للمدخنين الحاليين) (ج)، عدد السنوات منذ آخر تدخين (للمدخنين السابقين) (د) وتركيز IL-2 بعد تحفيز SEB (هـ) للجينات المحددة.تظهر قيم الارتباط بيرسون ثنائي الاتجاه. موقع إكسون TLR3، في حين أن pQTLs التي أبلغت عنها دراسة 500FG لهذه السيتوكينات (rs28393318 لـ IL-1 و rs6831581 لجين IL-6) تقع في موقع TLR1-TLR6-TLR10 (TLR1/6/10). قمنا بإجراء تحليل شرطي بين الموقعين من خلال تمرير rs28393318 كمتغير مصاحب في تحديد pQTL لدينا، ونظهر أن الارتباط الذي نبلغ عنه بين IL-وتم الحفاظ على rs3775291، مما يشير إلى أنه مستقل عن الذي تم الإبلاغ عنه في دراسة 500FG (الجدول التكميلي 4). من بين الـ pQTLs الجديدة المحتملة التي حددناها، هناك 3 لـ CXCL5. تم تحديد واحدة عند تحفيز BCG وتقع في موقع TLR1/6/10. وتم تحديد أخرى في C. albicans. التحفيز ويقع في موقع CR1. تم ملاحظة الثالث في بولي I:C، IL-1 و IFN التحفيزات، ويقع في إنترون JMJD1C، الذي يشفر مرشح ديميثيلاز الهيستون H 3 K 27 me 3. كما حددنا pQTL عابر لـ IL-2 في التحفيز بواسطة anti-CD3 + CD28، والذي يقع بالقرب من جين مستقبل المناعة Ig Fc IIa (FCGR2A) – الذي تم تحديده كـ eQTL بواسطة اتحاد GTEx.-الذي تم ربطه بالعديد من الأمراض المناعية الذاتيةوشروط الاستجابة لتحفيز CD3 + CD28. أحد المتغيرات الجينية المرتبطة بالتحويل التي تهمنا هو IL-1IL-12، TNF، IL-6 و IFNفي بولي I:التحفيز، الذي يقع فيإكسون ومرتبط بالضمور البقعي المرتبط بالعمر
مقالة
الجدول 1 | cis-pQTLs و trans-pQTLs للسيتوكينات المستحثة في كل تحفيز
محفز
السيتوكين
معرف rs
معدلقيمة
سيس أو ترانس
موضع
E. كولاي
إنفاي
rs4833095
ترانز
موضع TLR1/6/10
IL-2
rs9306967
ترانز
موضع TLR1/6/10
IL-6
rs5743614
ترانس
موضع TLR1/6/10
IL-8
rs4833095
ترانس
موضع TLR1/6/10
IL-17a
rs9306967
ترانس
موضع TLR1/6/10
IL-23a
rs6815814
ترانس
موضع TLR1/6/10
LPS
CXCL5
rs352045
سيس
محفز CXCL5
IL-1
rs3764613
ترانس
معزز PPP5C
IL-6
rs62449491
سيس
معزز IL6
IL-10
rs1518110
سيس
معزز داخل الجين IL10
IL-12a/b
rs143060887
سيز/ترانس
المناطق التنظيمية المحتملة لجين IL12A
SEB
IL-6
rs11936050
ترانس
موضع TLR1/6/10
مضاد CD3+CD28 (المستجيبين)
CXCL5
rs352045
سيس
محفز CXCL5
IL-2
rs1801274
ترانس
قريب من FCGR2A
بي سي جي
CXCL5
rs10013453
ترانس
موضع TLR1/6/10
IL-2
rs4833095
ترانس
موضع TLR1/6/10
IL-6
rs72636686
ترانس
إنترون كازن
IL-8
rs4833095
ترانس
موضع TLR1/6/10
المبيضات البيض
CXCL5
rs10779330
ترانس
موضع CR1
IL-1
rs10863358
ترانس
موضع CR1
IL-23a
rs10779330
ترانس
موضع CR1
TNF
rs11117956
ترانز
موضع CR1
إنفلونزا
CXCL5
rs352045
سيس
محفز CXCL5
CXCL5
rs10822168
ترانس
إنترون JMJD1C
IL-6
rs35345753
سيس
معزز IL6
بولي I:C
CXCL5
rs352045
سيس
محفز CXCL5
CXCL5
rs10822168
ترانس
إنترون JMJD1C
IFNy
rs3775291
ترانس
إكسون TLR3
IL-1
rs3775291
ترانس
إكسون TLR3
IL-6
rs62449491
سيس
معزز IL6
IL-6
rs3775291
ترانز
إكسون TLR3
IL-12a/b
rs3775291
ترانس
إكسون TLR3
TNF
rs113845942
سيس
منطقة بين الجينات HLA-DRB
TNF
rs3775291
ترانس
إكسون TLR3
TNF
CSF2
rs112997843
ترانس
المنطقة بين الجينات
CXCL5
rs352045
سيس
محفز CXCL5
إنفاي
rs352045
ترانس
محفز CXCL5
IL-10
rs6689179
سيس
معزز IL10
IL-1
CXCL5
rs352045
سيس
محفز CXCL5
CXCL5
rs2393969
ترانس
إنترون JMJD1C
IFNy
rs2564594
ترانس
محفز CXCL5
IFNy
CXCL5
rs352045
سيس
محفز CXCL5
CXCL5
rs10822168
ترانس
إنترون JMJD1C
ومقاومة العدوى الفيروسيةمتسقة مع تحفيز البوليمر I:C الذي يعمل من خلال TLR3. تم تحديد ارتباطات انتقالية أخرى لـ IL-1في تحفيز LPS، مع المتغير المقابل rs3764613، الموجود في معزز PPP5C، ولـ IL-6 في تحفيز BCG، حيث المتغير المقابل rs72636686 موجود في إنترون منجين، الذي يشفر بروتين التصاق الخلايا. كما قمنا بتقييم التفاعلات المحتملة بين SNPs المحددة وحالة التدخين. لم تُلاحظ أي ارتباطات ذات دلالة إحصائية بالنسبة لـ E. coli وLPS وSEB وanti-CD3 + CD28. التحفيزات، لكن تحفيز BCG أظهر تفاعلًا جينيًا مع التدخين بشكل ملحوظ (حجم التأثير [1.42-1.75]، تم تعديلها بواسطة بنجاميني-يكوتيلي قيمة ) (الشكل البياني الموسع 8a,b) بين rs72636686 وحالة التدخين لمستويات IL-8. تُظهر هذه التفاعلات أن حالة التدخين يمكن أن تزيل الفروق في الاستجابة لبعض التحفيز المناعي بين الأفراد من أنماط وراثية مختلفة (الشكل البياني الموسع 8c)، مما يدعم تعديل تأثيرات النمط الوراثي بواسطة حالة التدخين.
الشكل 5| التباين الناتج عن السيتوكينات المفسرة. أ-ح، النسب المئوية للتباين المفسر بواسطة كل متغير مرتبط على الأقل بسيتوكين واحد ناتج في E.coli (أ)، LPS (ب)، SEB (ج)، anti-CD3 + CD28 (د)، BCG (هـ)، C. albicans (و)، poly I:C
(ز) وتحفيزات الإنفلونزا (ح).تُظهر كل رسم بياني المساهمات المتوسطة عبر الترتيبات بين المتغيرات المستقلة.
تفسير تباين السيتوكينات
لتقييم التأثير النسبي لجمعيات التدخين المحددة، قمنا بتحديد كيفية تفسير التباين بين الأفراد في كل سيتوكين مستحث بواسطة كل متغير مرتبط. تم دمج المواقع الجينية والوراثية، والمجموعات الرئيسية من خلايا المناعة، والعمر، والجنس، ومؤشر كتلة الجسم، والعدوى الكامنة بفيروس CMV، وحالة التدخين في نفس النموذج وتم حساب تأثيراتها على مستويات السيتوكينات المستحثة (الشكل 5a-h). لاحظنا أن التدخين يفسر ما بين 4 و 9% من التباين بين الأفراد للسيتوكينات المرتبطة، وهو مستوى يعادل تأثيرات العمر أو الجنس أو الجينات عند وجودها.
نقاش
هنا نوضح أن حالة التدخين، العدوى الكامنة بفيروس CMV ومؤشر كتلة الجسم، بالإضافة إلى العمر، الجنس، التباين الجيني، مستويات الميثيل دنا ومجموعات خلايا المناعة، هي المتغيرات الأكثر ارتباطًا بالتغير في إفراز السيتوكينات عند التحدي المناعي. تم التحقق من نهجنا لدراسة الاستجابات المناعية المستحثة تجاه المحفزات المتنوعة من خلال تحديد محددات بيئية وجينية جديدة لـ 11 من أصل 13 سيتوكين تم دراستها، وهي ارتباطات تم اكتشافها عبر ظروف التحفيز المختلفة. آثار التدخين تثير اهتمامًا خاصًا، حيث أن لها تأثيرات على كل من الاستجابات المناعية الفطرية والتكيفية (الشكل 10c من البيانات الموسعة). تصل التباينات التي يفسرها حالة التدخين لبعض السيتوكينات عند التحفيز إلى مستوى يعادل تلك الخاصة بالعمر والجنس والمتغيرات الجينية، والتي من المعروف أن لها آثارًا على مخاطر الأمراض. أظهر المدخنون الحاليون استجابة التهابية متزايدة بعد التحفيز البكتيري، والتي تفقد بسرعة عند التوقف عن التدخين. على العكس، تستمر آثار التدخين على استجابات الخلايا لسنوات بعد أن يتوقف الأفراد عن التدخين.
يرتبط تأثير التدخين بمجموعات خلايا و وميثيل دنا عند المحفزات النشطة وعوامل تنظيم الأيض، مما يبرز آلية للتأثيرات المستمرة في الاستجابة التكيفية. تم تحديد مواقع CpG AHRR وF2RL3 وGP15 وPRSS23 وRARA سابقًا كمواقع مرتبطة بالتدخين في الدم الكامل . من الجدير بالذكر أن موقع CpG الأكثر ارتباطًا بالتدخين داخل جين هو علامة حيوية كمية للتوقف عن التدخين و يرتبط بزيادة خطر الإصابة بمرض الانسداد الرئوي المزمن وسرطان الرئة . على الرغم من أن التفاعل بين AHRR في مسار AHR معقد ويعتمد على التوازن المحدد لنوع الخلية بين AHR وAHRR، فإن النشاط القمعي لـ AHRR ناتج عن إزاحة أو تثبيط ارتباط AHR بعناصر الاستجابة للمواد الغريبة في المحفز لأهدافه . قد يؤدي انخفاض التعبير عن جينات استقلاب المواد الغريبة، بدوره، إلى تقويض قدرة الجسم على استقلاب العوامل الضارة، مما قد يؤدي إلى ضعف وظيفة الرئة. وبالتالي، تشير أعمالنا إلى أن التدخين يمكن أن يحفز تعديلات جينية محددة قد تؤدي لاحقًا إلى استجابات مناعية متغيرة.
على العكس، لم نحدد وسطاء خلويين محتملين للاستجابة الالتهابية المتزايدة للتحفيز الفطري لدى المدخنين. وجدنا ارتباطًا قويًا بين مستويات CXCL5 المستحثة ومستويات CEACAM6 الدائرية، وهو بروتين سطحي خلوي ينتمي إلى عائلة الأجسام المضادة CEACAM. ينظم CXCL5 حركة العدلات إلى الرئة عبر CXCR2 وقد تم الإشارة إليه في الربو والعديد من السرطانات . يتم التعبير عن CEACAM6 على سطح العدلات والبلعميات وخلايا الظهارة الرئوية والمعوية، وتزداد مستوياته في العديد من السرطانات، مثل سرطان الثدي وسرطان المعدة حيث تم اقتراحه كعلامة حيوية سريرية . على الرغم من أن الدراسات السابقة اقترحت أن مستويات CXCL5 وCEACAM6 قد تزداد لدى المدخنين، إلا أن معظم الدراسات ركزت على المواقع الرئوية وفي المرضى الذين يعانون من أمراض تنفسية (مثل السرطان ومرض الانسداد الرئوي المزمن والربو)، مما قد يربك النتائج. تحدد دراستنا ارتباطًا قويًا بين هذه العلامات الحيوية المقترحة سابقًا للأمراض والاستجابة للتحديات المناعية لدى المدخنين مقابل غير المدخنين. علاوة على ذلك، تفتح نتائجنا في المتبرعين الأصحاء آفاقًا لمزيد من الاستكشاف لفهم كيف يعمل التدخين كعامل خطر للسرطانات خارج الرئتين.
على الرغم من أن دراستنا كشفت عن آثار جديدة للمتغيرات البيئية على الاستجابات المناعية، إلا أنها تقدم بعض القيود. أحدها هو غياب مجموعة تكرارية للتحقق من هذه النتائج. علاوة على ذلك، تم إجراء تحليلاتنا على مجموعة سكانية ذات خلفية جينية مماثلة، ولكن الجهود مستمرة لتضمين مجموعات سكانية أخرى من أصول متنوعة. ستسعى الدراسات المستقبلية أيضًا إلى
تحديد الشبكات التنظيمية النسخية التي تكمن وراء التأثير المستمر للتدخين على الاستجابات المناعية التكيفية. توفر هذه النتائج فهمًا جديدًا لتأثيرات التدخين على صحة الإنسان، ودور التأثيرات البيئية القابلة للتعديل على تباين الاستجابة المناعية.
المحتوى عبر الإنترنت
أي طرق، مراجع إضافية، ملخصات تقارير Nature Portfolio، بيانات المصدر، بيانات موسعة، معلومات تكميلية، شكر وتقدير، معلومات مراجعة الأقران؛ تفاصيل مساهمات المؤلفين والمصالح المتنافسة؛ وبيانات توفر البيانات والرموز متاحة على https://doi.org/10.1038/s41586-023-06968-8.
بروتين، ب. وآخرون. التباين في نظام المناعة البشري مدفوع إلى حد كبير بتأثيرات غير وراثية. خلية 160، 37-47 (2015).
كواش، هـ. وآخرون. التكيف الجيني والاختلاط بالنيندرتال شكل نظام المناعة في السكان البشريين. خلية 167، 643-656.e17 (2016).
باتين، إ. وآخرون. التباين الطبيعي في معلمات خلايا المناعة الفطرية مدفوع بشكل تفضيلي بالعوامل الجينية. نات. إيمونول. 19، 302-314 (2018).
بياسيكا، ب. وآخرون. الأدوار المميزة للعمر والجنس والوراثة في تشكيل التباين النسخي للاستجابات المناعية البشرية للتحديات الميكروبية. بروك. ناتل أكاد. ساي. الولايات المتحدة الأمريكية 115، E488-E497 (2018).
باكر، أ. ب. وآخرون. دمج بيانات متعددة الأوميات والتوصيف العميق يمكّن من التنبؤ باستجابات السيتوكين. نات. إيمونول. 19، 776-786 (2018).
سالجي، هـ. وآخرون. تقدير عبء SARS-CoV-2 في فرنسا. العلوم 369، 208-211 (2020).
نيدليك، ي. وآخرون. السلالة الجينية والانتقاء الطبيعي يدفعان الفروق السكانية في الاستجابات المناعية للعوامل الممرضة. خلية 167، 657-669.e21 (2016).
هادجادج، ج. وآخرون. ضعف نشاط الإنترفيرون من النوع الأول والاستجابات الالتهابية في مرضى COVID-19 الشديد. العلوم 369، 718-724 (2020).
لي، ي. وآخرون. التباين بين الأفراد والتأثيرات الجينية على استجابات السيتوكين للبكتيريا والفطريات. نات. ميد. 22، 952-960 (2016).
ليستون، أ.، كار، إ. ج. ولينترمان، م. أ. تشكيل التباين في نظام المناعة البشري. اتجاهات إيمونول. 37، 637-646 (2016).
توماس، س. وآخرون. دراسة Milieu Intérieur – نهج تكاملي لدراسة التباين المناعي البشري. كلين. إيمونول. 157، 277-293 (2015).
لوغادي، أ. أ. وآخرون. تعرض دخان السجائر يزيد من التهاب الرئة ويقوض المناعة ضد العدوى البكتيرية. ج. إيمونول. 192، 5226-5235 (2014).
ميرتينز، ت. ج. وآخرون. يؤثر دخان السجائر بشكل مختلف على التعبير الجيني المستحث بواسطة IL-13 في خلايا الظهارة الهوائية البشرية. فيزيول. ريب. 5، e13347 (2017).
شافي، س. وآخرون. CXC ligand 5 هو عامل مشتق من الأنسجة الدهنية يربط السمنة بمقاومة الأنسولين. خلية ميتاب. 9، 339-349 (2009).
فارغاس، ر. وآخرون. زيادة بروتين C-reactive وانخفاض محتوى إنترلوكين-2 في مصل الأفراد البدينين مع أو بدون مقاومة الأنسولين: ارتباطات مع عدد الكريات البيضاء ومحتوى الأنسولين والأديبونيكتين. داء السكري ميتاب. سندر. كلينيك. ريس. ريف. 10، S34-S41 (2016).
كارون، ب. وآخرون. تحليل جيني وتكاملي لخلايا المناعة لبروتينات البلازما في المتبرعين الأصحاء يحدد ارتباطات جديدة تتضمن جينات نقص المناعة الأولية. جينوم ميد. 14، 28 (2022).
بيرغستيدت، ج. وآخرون. العوامل المناعية التي تدفع تباين ميثيل دنا في الدم البشري. نات. كوم. 13، 5895 (2022).
سوكلسكي، ل. أ. وآخرون. دور حاسم لمحور الكيمياء الجذعية CXCL3/CXCL5/CXCR2 في تنظيم الاستجابات من النوع 2 في نموذج تفاقم الربو الناتج عن الفيروسات الأنفية. مجلة المناعة 205، 2468-2478 (2020).
رو، ج. ك. وآخرون. CEACAM6 هو علامة تنبؤية وعلاجية محتملة لسرطان المعدة. أونكوتارجت 8، 83673-83683 (2017).
تشن، ج. وآخرون. المستويات المرتفعة من CXCL5 في الدورة الدموية مرتبطة بتدهور وظيفة الرئة لدى مرضى COPD ونموذج الفأر المستحث بالتدخين لمرض COPD. آن. ميد. 51، 314-329 (2019).
وو، سي.-واي. وآخرون. CEACAM6 كهدف علاجي جديد لتعزيز الدفاع المضاد للأكسدة المعتمد على HO-1 في مرض الانسداد الرئوي المزمن. المجلة الأمريكية للطب التنفسي والعناية الحرجة 207، 1576-1590 (2023).
ملاحظة الناشر: تظل شركة سبرينغر ناتشر محايدة فيما يتعلق بالمطالبات القضائية في الخرائط المنشورة والانتماءات المؤسسية.
الوصول المفتوح هذه المقالة مرخصة بموجب رخصة المشاع الإبداعي النسب 4.0 الدولية، التي تسمح بالاستخدام والمشاركة والتكيف والتوزيع وإعادة الإنتاج بأي وسيلة أو صيغة، طالما أنك تعطي الائتمان المناسب للمؤلفين الأصليين والمصدر، وتوفر رابطًا لرخصة المشاع الإبداعي، وتوضح ما إذا كانت هناك تغييرات قد أُجريت. الصور أو المواد الأخرى من طرف ثالث في هذه المقالة مشمولة في رخصة المشاع الإبداعي الخاصة بالمقالة، ما لم يُشار إلى خلاف ذلك في سطر الائتمان للمواد. إذا لم تكن المادة مشمولة في رخصة المشاع الإبداعي الخاصة بالمقالة وكان استخدامك المقصود غير مسموح به بموجب اللوائح القانونية أو يتجاوز الاستخدام المسموح به، فسيتعين عليك الحصول على إذن مباشرة من صاحب حقوق الطبع والنشر. لعرض نسخة من هذه الرخصة، قم بزيارةhttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/. (ج) المؤلفون 2024
اتحاد البيئة الداخلية
لوران أبيلأندريس ألكوفرهوغ أشارفيليب بوسونولايج بوركبيتر برودينبيير بروهنسنادين سيرف-بنسوسانأنا كومانكريستوف د’إنفرتكارولين ديمانجللودوفيك ديريانماري-أجنيس ديليجيمس دي سانتوجيرار إبيرلجست إينينغاجاك فيلايإيفو غومبيرتس-بونيكاميلينا حسنغونيلا كارلسون هيدستامسيرج هيركبيرغمولي أ. إنجرسولأوليفييه لانتزروز آن كينيميكائيل مينيجرفريديريك ميشيلهوغو موكيهكلونا أوفارليإتيان باتينأنتونيو راوسيلفريديريك ريو-لوكاتلارس روجماغنوس فونتسأنفاج ساكونتابهايأوليفييه شوارزبينو شفيكوسكيسبنسر شورتفريديريك تانجيأنطوان توبرماثيلد توفييهماري-نويل أونغيهوركريستوف زيمرماثيو ل. ألبرتداراغ دافيولويز كوينتانا-مورسي مختبر الوراثة البشرية للأمراض المعدية، فرع نكر، INSERM UMR1163، باريس، فرنسا.مستشفى نكر للأطفال المرضى، باريس، فرنسا.معهد باستور، جامعة باريس سيتé، INSERM-U1224، وحدة البيولوجيا الخلوية للخلايا اللمفاوية، الرابطة الوطنية لمكافحة السرطان – فريق معتمد من الرابطة 2018، باريس، فرنسا.معهد باستور، جامعة باريس سيتي، قسم البيولوجيا الحاسوبية، باريس، فرنسا.وحدة ديناميات الاستجابات المناعية، معهد باستور، INSERM U1223، جامعة باريس سيتé، باريس، فرنسا.قسم الشيخوخة الطبية، كلية الطب، معهد ترينيتي للطب الانتقالي، كلية ترينيتي دبلن، جامعة دبلن، دبلن، أيرلندا.قسم صحة المرأة والطفل، معهد كارولينسكا، سولنا، السويد.وحدة الأجسام المضادة في العلاج وعلم الأمراض، INSERM UMR1222، معهد باستور، جامعة باريس سيت، باريس، فرنسا.جامعة باريس-سيتé، معهد إيميجين، مختبر المناعة المعوية، إنسرم U1163، باريس، فرنسا.وحدة اللمفاويات والمناعة، قسم المناعة، معهد باستور، INSERM U1223، جامعة باريس سيتé، باريس، فرنسا.معهد باستور، جامعة باريس سيتي، INRAE USC2019، وحدة البيولوجيا والمرضية الفطرية، باريس، فرنسا.معهد باستور، جامعة باريس سيتي، إنسرم U1224، وحدة المناعة والعلاج، باريس، فرنسا.معهد باستور، جامعة باريس سيتي، INSERM U1223، فريق معتمد من رابطة مكافحة السرطان، وحدة سلامة الجينوم، المناعة والسرطان، باريس، فرنسا.معهد باستور، وحدة المناعة الفطرية، جامعة باريس سيتé، إنسرم U1223، باريس، فرنسا.معهد باستور جامعة باريس سيتé، إنسرم U1224، وحدة البيئة الدقيقة والمناعة، باريس، فرنسا.ديناميات تفاعلات العائل والميكروب، معهد باستور، جامعة باريس سيتé، CNRS UMR3691، باريس، فرنسا.مدرسة علوم الحياة، المدرسة الفيدرالية Polytechnic في لوزان، لوزان، سويسرا.معهد باستور، جامعة باريس سيتي، CNRS وحدة البحث المختلطة 6047، INSERM U1306، وحدة البيولوجيا وعلم الوراثة لجدار البكتيريا، باريس، فرنسا.قسم الميكروبيولوجيا، علم الأورام وعلم الخلايا، معهد كارولينسكا، ستوكهولم، السويد.جامعة سوربون باريس نور وجامعة باريس سيت، إنسرم، إنراي، CNAM، مركز البحث في علم الأوبئة والإحصائيات (CRESS)، فريق البحث في علم الأوبئة الغذائية (EREN)، بوبيني، فرنسا.التهاب الغشاء المخاطي والمناعة، قسم المناعة، معهد باستور، باريس، فرنسا.جامعة باريس سيتي، معهد كوشين، إنسرم U1016، CNRS UMR 8104، باريس، فرنسا.مركز علاج السرطان المناعي، INSERM U932
جامعة PSL للبحوث، معهد كوري، باريس، فرنسا.الدراسة الطولية الأيرلندية حول الشيخوخة، كلية الطب، جامعة ترينيتي، دبلن، أيرلندا.جامعة باريس سيتي، معهد إيميجين، مختبر الاستجابات الالتهابية والشبكات النسخية في الأمراض، فريق أتيب-أفينير، INSERM UMR1163، باريس، فرنسا.وحدة إشارات السيتوكينات، INSERM U1224، معهد باستور، باريس، فرنسا.معهد باستور، جامعة باريس سيتي، INSERM U1222، وحدة المناعة الخلطية، باريس، فرنسا.مدرسة الكيمياء الحيوية والمناعة، معهد العلوم الطبية الحيوية في ترينيتي، كلية ترينيتي دبلن، دبلن، أيرلندا.كلية الطب، كلية ترينيتي دبلن، دبلن، أيرلندا.جامعة باريس سيتي، معهد إيماجين، إنسرم U1163، باريس، فرنسا.جامعة باريس سيتé، باريس، فرنسا.مختبر المناعة الوراثية للأمراض المناعية الذاتية لدى الأطفال، معهد إيميجين، INSERM UMR 1163، باريس، فرنسا. وحدة تنظيم المناعة، معهد باستور، جامعة باريس سيت، باريس، فرنسا.معهد روش، باريس، فرنسا.معهد باستور، جامعة باريس، وحدة الوراثة الوظيفية للأمراض المعدية، قسم الصحة العالمية، باريس، فرنسا.وحدة الفيروسات والمناعة، معهد باستور، جامعة باريس سيت، باريس، فرنسا.مختبر البيوميديسين الحاسوبي، معهد باستور، جامعة باريس سيت، باريس، فرنسا.UTechS التصوير الضوئي البيولوجي/C2RT، معهد باستور، جامعة باريس سيت، باريس، فرنسا.مختبر ابتكار اللقاحات، معهد باستور، جامعة باريس سيت، باريس، فرنسا.جامعة باريس سيت، معهد أبحاث سانت لويس، EMiLy، INSERM UMR S1160، باريس، فرنسا.خدمة سريرية تجريبية والوصول إلى موارد البحث البيولوجية (ICAReB)، معهد باستور، باريس، فرنسا.معهد باستور، جامعة باريس سيت، CNRS UMR 3691، وحدة التصوير والنمذجة، باريس، فرنسا.
طرق
عينات بشرية
جاءت العينات البشرية من مجموعة ميليو إنتير، التي تمت الموافقة عليها من قبل لجنة حماية الأشخاص – غرب 6 في 13 يونيو 2012، ومن قبل الوكالة الفرنسية الوطنية لأمان الدواء (ANSM) في 22 يونيو 2012. الدراسة برعاية معهد باستور (رقم ID-RCB باستور: 2012-A00238-35) وتمت كدراسة تدخلية في مركز واحد دون منتج تجريبي. تم تسجيل البروتوكول الأصلي تحت Clinical Trials.gov (رقم الدراسة NCT01699893). تم تأسيس العينات والبيانات المستخدمة في هذه الدراسة رسميًا كمجموعة بيولوجية ميليو إنتير (NCT03905993)، مع موافقات من لجنة حماية الأشخاص – جنوب البحر الأبيض المتوسط واللجنة الوطنية للمعلومات والحريات (CNIL) في 11 أبريل 2018. قدم المتبرعون موافقة خطية مستنيرة. تم تجنيد 1000 متبرع من مجموعة ميليو إنتير بواسطة BioTrial لتكون مكونة من أفراد أصحاء من نفس الخلفية الجينية (الغرب الأوروبي) ولتكون 100 امرأة و100 رجل من كل عقد من الحياة بين 20 و69 عامًا. تم اختيار المتبرعين بناءً على معايير إدراج واستبعاد مختلفة تم وصفها سابقًا . باختصار، كان مطلوبًا من المتبرعين عدم وجود تاريخ أو دليل على حالات مرضية شديدة أو مزمنة أو متكررة، أو اضطرابات عصبية أو نفسية، أو إساءة استخدام الكحول، أو استخدام حديث للأدوية، أو إعطاء لقاحات حديثة، أو استخدام حديث لوكلاء تعديل المناعة. لتجنب تأثير التقلبات الهرمونية في النساء، لم يتم تضمين النساء الحوامل والنساء في فترة ما قبل انقطاع الطمث. لتجنب التباين الجيني في مجموعة الدراسة، تم تقييد تجنيد المتبرعين للأفراد الذين وُلد والديهم وأجدادهم في فرنسا الحضرية. بالإضافة إلى ذلك، تحققنا رسميًا من كيفية تأثير الخلفية الجينية للمتبرعين على مستويات السيتوكينات من خلال إجراء اختبارات ارتباط بين أول 20 مكونًا رئيسيًا جينيًا من PCA على الأنماط الجينية الفردية وكل من السيتوكينات المستحثة في كل تحفيز. على الرغم من أن PC1 كان له ارتباط كبير مع IL-10 (تم تعديل بنجاميني-يكوتيلي القيمة ), وجدنا أن أول 20 مكونًا رئيسيًا لم تظهر أي ارتباطات كبيرة مع استجابات السيتوكينات عند عتبة القيمة (تم تعديل بنجاميني-يكوتيلي القيمة ) التي نستخدمها طوال هذه الدراسة. لتوضيح تجانس الهيكل الجيني لـ 1000 فرد من مجموعة ميليو إنتير، تم إجراء PCA باستخدام EIGENSTRAT على 261,827 SNPs مستقلة و1,723 فردًا، والتي تشمل 1000 متبرع من ميليو إنتير مع 723 فردًا من اختيار 36 مجموعة سكانية من شمال إفريقيا، والشرق الأدنى، وكذلك أوروبا الغربية والشمالية كما هو موضح، مشابه لما تم تنفيذه سابقًا . تم عرض PC1 مقابل PC2، PC1 مقابل PC3 وPC2 مقابل PC3 بالإضافة إلى رسم بياني لبار يوضح التباين الذي تفسره أول 20 مكونًا من PCA (الشكل 9b من البيانات الموسعة). ما لم يُذكر خلاف ذلك، تم إجراء جميع النتائج المعروضة على 955 فردًا من المجموعة الذين أعطوا موافقة لمشاركة بياناتهم علنًا، لضمان سهولة إعادة إنتاج النتائج.
تحفيز الدم الكامل باستخدام TruCulture
تم إجراء تحفيز الدم الكامل باستخدام TruCulture بطريقة موحدة كما تم وصفه سابقًا . باختصار، تم إعداد الأنابيب في دفعة مع المحفز المحدد، وإعادة تعليقها في حجم 2 مل من وسط مخفف، وتم الحفاظ عليها عند حتى وقت الاستخدام. كانت المحفزات المستخدمة في هذه الدراسة هي LPS المشتق من E. coli O111:B4 (Invivogen)، E. coli O111:B4 (Invivogen)، C. albicans (Invivogen)، بولي I:C من الدرجة اللقاحية (Invivogen)، Bacillus Calmette-Guerin الحي (Immucyst، Sanofi Pasteur)، H1N1 الحي المعطل للإنفلونزا A/PR8 (IAV) (Charles River)، SEB (معهد برنهارد نوخت)، CD3 + CD28 (R&D Systems وBeckman Coulter)، والسيتوكينات TNF (Miltenyi Biotech)، IL-1 (Peprotech) وIFN (Boehringer Ingelheim). تم توزيع ملليلتر واحد من الدم الكامل في كل من أنابيب TruCulture المسخنة مسبقًا، وتم إدخالها في حاضنة كتلة جافة، وتم الحفاظ عليها عند هواء الغرفة لمدة 22 ساعة. في نهاية فترة الحضانة، تم فتح الأنابيب، وتم إدخال صمام لفصل الخلايا المترسبة عن السائل الفائق ولإيقاف تفاعل التحفيز. تم تقسيم السائل الفائق إلى أجزاء وتم تجميده على الفور عند حتى وقت الاستخدام.
تحليل متعدد التحليلات باستخدام Luminex
تم تحليل السوائل الفائضة من أنابيب TruCulture بواسطة Rules Based Medicine باستخدام تقنية Luminex xMAP. تم تحليل العينات وفقًا لإرشادات تحسين مختبرات السريرية (CLIA). تم تحديد الحد الأدنى من الكمية القابلة للتحديد (LLOQ) كما تم وصفه سابقًا ، وهو أقل تركيز لمحلل في عينة يمكن اكتشافه بشكل موثوق وعندها يلبي الخطأ الكلي متطلبات CLIA لدقة المختبر. تم اختيار 13 سيتوكين (CXCL5، CSF2، IFN ، IL-1 ، TNF، IL-2، IL-6، IL-8، IL-10، IL-12p70، IL-13، IL-17 وIL-23)، التي تم قياسها في هذه الدراسة، لالتقاط أفضل تنوع استجابة المناعة. من بين 109 محللات تم اختبارها في البداية، هذه هي التي التقطت الحد الأقصى من التباين بعد التحفيز مع 4 محفزات (LPS، BCG، بولي I:C وSEB) التي أظهرت أكثر استجابات المناعة تميزًا بين 27 محفزًا تم اختبارها على مجموعة فرعية من 25 فردًا من مجموعة ميليو إنتير.
تحليل المكونات الرئيسية
تم إنشاء PCA في الشكل 1 من البيانات الموسعة في R 4.2.1 باستخدام حزمة FactoMineR 2.8. تم تحويل البيانات إلى لوغاريتم وتم قياسها بشكل افتراضي إلى وحدة وتم تعويض القيم المفقودة بمتوسط المتغير.
تصوير تحفيز السيتوكين
تم اعتبار السيتوكينات محرضة إذا كانت القيمة المطلقة لتركيزها الوسيط في الحالة المحفزة كانت -ضعف تركيزها في الحالة العدمية. تم حساب الفروق المعيارية اللوغاريتمية كما يلي (متوسط (تركيز السيتوكين في الحالة المحفزة) – متوسط (تركيز السيتوكين في الحالة العدمية)) / s.d.((تركيز السيتوكين في الحالة المحفزة) – (تركيز السيتوكين في الحالة العدمية)) وتم إنشاء خريطة الحرارة المقابلة باستخدام heatmaply 1.0.0 وdendextend 1.13.12 مع طريقة التجميع ‘الكاملة’ والمسافة ‘الإقليدية’ في إصدار R 4.2.1.
تحديد غير المستجيبين لـ CD3 + CD28
مستويات السيتوكينات التي ركزنا عليها منخفضة أو غير قابلة للاكتشاف في الحالة غير المحفزة، وتحفيز السيتوكين عمومًا متجانس ضمن هذه المجموعة الصحية من الأفراد، دون وجود مجموعات واضحة متميزة من المستجيبين وغير المستجيبين، باستثناء تحفيز anti-CD3 + CD28 (الشكل 2 من البيانات الموسعة). بالنسبة لتحفيز anti-CD3 + CD28، حددنا من خلال -تجميع الوسائل مجموعة من 705 أفراد استجابوا للتحفيز ومجموعة من 295 فردًا لم يستجيبوا. يتم تفسير عدم استجابة 295 فردًا من خلال تعدد أشكال Fc RIIA (rs1801274) الذي تم وصفه سابقًا بأنه يمنع الاستجابة لهذا التحفيز anti-CD3 + CD28 (الشكل 9 من البيانات الموسعة). وبالتالي، تم إجراء جميع التحليلات الإحصائية على تحفيزات anti-CD3 + CD28 في هذه الدراسة على المستجيبين فقط.
اختبارات ارتباط معايير eCRF مع السيتوكينات المحفزة
تم استخراج المتغيرات من النموذج الإلكتروني المعبأ من قبل المتبرعين بمساعدة طبيب. للحد من التحيزات في الارتباطات، كان يجب أن تحتوي المتغيرات الفئوية على ما لا يقل عن 5% من الأفراد في نصف مستويات الفئات على الأقل ليتم اعتبارها لاختبارات الارتباط. تم اختبار هذه المتغيرات الفئوية أو العددية للارتباطات مع مستويات السيتوكين المستحثة المحولة لوغاريتميًا في كل تحفيز من خلال اختبارات LRT، باستخدام العمر والجنس والمتغير الفني batchID (الذي يتوافق مع دفعتين من أنابيب TruCulture المنتجة في فترات زمنية مختلفة) كمتغيرات مصاحبة: قارن اختبار LRT النماذج lm(cytokine ~ variable + age + sex + batchID) مع Im(cytokine ~ age + sex + batchID)، تلاها تصحيح اختبار متعدد باستخدام طريقة بنجاميني-يكوتيلي. إلى خرائط الحرارة الكاملة، مع الأخذ في الاعتبار الاختبارات التي أجريت على 136 متغيرًا من CRF مع جميع السيتوكينات المستحثة في تحفيز محدد. بالنسبة للبيانات الموسعة الأشكال 4 و 5، كانت النماذج المقارنة هي Im(sitokine ~ العمر + الجنس + batchID) مع Im(sitokine ~ الجنس + batchID) للعمر والسيتوكين الجنس + رقم الدفعة) مع السيتوكينالعمر + رقم الدفعة) للجنس.تم تمثيل قيم اختبارات الارتباط باستخدام ggplot2 3.2.1 في R 3.6.0. تم التعديلتم حساب القيم على مخططات الصندوق باستخدام دالة wilcox.test، مع تصحيح للاختبارات المتعددة. يتم عرض نسخ من مخططات الصندوق ومخططات التشتت التي تم إنشاؤها على المتبقيات بعد الانحدار على العمر والجنس و batchID في الشكل الإضافي 6d-f.
رسوم بيانية لحجم التأثير
تم تقدير نماذج الانحدار الخطي في كل تحفيز باستخدام مستويات السيتوكين المستحثة المحولة لوغاريتميًا كنتيجة، والعمر، والجنس، ورقم الدفعة، والمتغيرات المشتركة ذات الاهتمام (مثل حالة التدخين) كمتغيرات متنبئة. تم أخذ التفاعلات مع المتغيرات المشتركة ذات الاهتمام في الاعتبار عند الإشارة. الأس exponential لتقديرات معاملات الانحدار، وتم رسم فترات الثقة. عندما تكون المتغيرات ذات الاهتمام من الطبيعة الفئوية، يتم عرض كل مستوى من المتغير بشكل مستقل، مع الأخذ في الاعتبار المستوى المحدد كمرجع. عندما يكون قيمة الـ-اختبار اختبار ما إذا كانت تقديرات المعامل مختلفة عن الصفر هو <0.01، يتم رسمها باللون الأسود، وإلا يتم رسمها باللون الرمادي. إذا كان اختبار LRT الذي يقارن الانحدار مع وبدون المتغير المعني في النموذج مع اختبار كاي-تربيع ذو دلالة إحصائية مع تعديل بنجاميني-يكوتيليقيمةيتم إضافة نجمة حمراء فوق قيمة حجم التأثير والفترة.
اختبارات ارتباط مجموعة الخلايا
تم تفصيل الحصول على بيانات تحليل تدفق الخلايا سابقًاتم إجراء اختبارات الارتباط باستخدام القيم المحولة لوغاريتمياً للسيتوكينات المستحثة في كل تحفيز كما هو الحال في اختبارات الارتباط لمعايير eCRF باستخدام العد الخام المحول لوغاريتمياً لمجموعات الخلايا لكل متبرع.تُشير القيم ذات الدلالة إلى النجوم كما يلي:; **ص < 0.01; *** .
اختبارات ارتباط ميثلة الحمض النووي
تم إنشاء ملفات تعريف ميثيلation CpG باستخدام شريحة Infinium MethylationEPIC BeadChip (Illumina) على الحمض النووي الجيني المعالج بصوديوم بيسلفيت (Zymo Research) لـ 958 فردًا من مجموعة Milieu Intérieur كما هو موصوف.. تم اختبار الارتباطات بين مستويات ميثلة الحمض النووي لمواقع CpG الموجودة ضمن 1 ميغابايت من موقع بدء النسخ لكل جين سيتوكين ومستويات السيتوكينات المستحثة المحولة لوغاريتميًا في كل تحفيز، مع ضبط العمر والجنس ومتغيرات التقنية (batchID) وعدد الخلايا المناعية الرئيسية لكل تحفيز، من خلال اختبار LRT وتم تحديد مواقع CpG المرتبطة بشكل ضعيف مع IL-17 في LPS (cg09582880) وIL-2 في C. albicans (cg17850932 و cg25065535) وIL-8 في تحفيز الإنفلونزا (cg16468729) (تم تعديل FDRقيمة LRT < 0.05) (الشكل البياني الممتد 10). كانت هذه التأثيرات خفيفة مقارنة بالمتغيرات الجينية المرتبطة المحددة والمتغيرات الأخرى المرتبطة التي تم تحديدها في هذه الدراسة، ولكنها تعتبر في النماذج العالمية النهائية (الشكل 5). تم اختيار مواقع CpG التي تتأثر مستويات الميثيل في الحمض النووي بها بشكل مباشر بالتدخين كما هو موصوف..
خرائط الحرارة توضح تأثيرات المتغيرات المشتركة
لاختبار ما إذا كانت مستويات بعض المتغيرات المشتركة، مثل مجموعات الخلايا، بروتينات البلازما أو مجسات ميثيل الحمض النووي، يمكن أن تعدل الارتباط الملحوظ لمتغير، مثل حالة التدخين، مع مستويات السيتوكينات المحفزة التي تم تحويلها لوغاريتمياً في كل تحفيز، قمنا بالمقارنة باستخدام اختبار النماذج المتعددة (LRT) لكل سيتوكين في كل تحفيز، مع نموذج يأخذ في الاعتبار كل من المتغير المعني والمتغير المشترك المعني (مع التفاعلات) بالإضافة إلى المتغيرات المعتادة مثل العمر، الجنس والمتغير الفني batchID، مع نموذج يحتوي على جميع المتغيرات ولكن ليس المتغير المعني، تلاه تعديل اختبار متعدد باستخدام طريقة بنجاميني-يكوتيلي على جميع خرائط الحرارة. على سبيل المثال، بالنسبة للشكل 3a، كان المتغير المعني هو حالة التدخين والمتغير المشترك المعني. كانت كل مجموعة خلوية فرعية، لذا قمنا بمقارنةالسيتوكينحالة التدخينمجموعة الخلايا الفرعية + العمر + الجنس + معرف الدفعة) مع lm(السيتوكينمجموعة الخلايا + العمر + الجنس + معرف الدفعة). عندما يكون اختبار النماذج اللوجستية (LRT) ذا دلالة إحصائية، فهذا يعني أن إضافة المتغير المعني إلى النموذج يحسن التوافق مع مستويات السيتوكين. بالنسبة للمتغيرات المتعلقة بمؤشر كتلة الجسم، فإنها لا تحسن التوافق مع كل من IL-2 و CXCL5 عندما يتم تمرير مجموعات خلايا T كمتغيرات مصاحبة، مما يظهر أن نهجنا قادر على تحديد الارتباطات الخلوية مع التأثيرات على مستويات CXCL5 عندما تكون موجودة.
تحليلات pQTL
تم تفصيل البروتوكولات ومرشحات مراقبة الجودة لتحديد الأنماط الجينية على مستوى الجينوم في المرجع 3. باختصار، تم تحديد الأنماط الجينية لـ 1,000 متبرع من Milieu Interieur على كل من شرائح HumanOmniExpress-24 وHumanExome-12 (Illumina)، والتي تشمل 719,665 SNP و245,766 SNP إكسونية، على التوالي. كانت نسبة التوافق المتوسطة بين مجموعتي تحديد الأنماط الجينية هي. تتضمن مجموعة البيانات النهائية 732,341 SNPs متعددة الأشكال عالية الجودة. بعد تقدير النمط الجيني ومرشحات مراقبة الجودة، تم تصفية 11,395,554 SNPs أخرى لترددات الأليل الصغير > 5%، مما أسفر عن مجموعة بيانات تتكون من 1,000 متبرع و5,699,237 SNPs لرسم خرائط pQTL. تم إجراء تحليلات pQTL باستخدام MatrixEQTL.2.2 حزمة R. تم اعتبار SNPs كـ pQTLs تعمل على مستوى cis إذا كانت تقع ضمن 1 ميغابايت من TSS للجين، وإلا تم اعتبارها كـ pQTLs تعمل على مستوى trans. تم تحويل بيانات تعبير البروتين لـ 1000 فرد إلى اللوغاريتم قبل تحليل pQTL. تم تطبيق تصحيح بونفيروني للاختبار المتعدد (المعدلقيمة ) تم تطبيقه على النتائج. استخدمنا عتبات الكشف لـ لـ cis-pQTLs ولـ trans-pQTLs والعمر والجنس والمتغير الفني batchID، بالإضافة إلى مجموعة الخلايا المرتبطة الرئيسية (وحيدات النوى لـ LPS، E. coli و C. albicans، CD4pos لـ SEB، CD8posEMRA لـ anti-CD3 + CD28، CD45pos لـ BCG، cDC3 لـ poly I:C، CD3pos للإنفلونزا، CD45pos لـ TNF، لا شيء لـ null، IL-1 و IFN ) كمتغيرات مصاحبة. SNPs المرتبطة بـ IFN في IFNتحفيز، مع IL-1في IL-1تم تجاهل التحفيز مع TNF في تحفيز TNF لأن كل من هذه السيتوكينات تمت إضافتها على التوالي إلى أنابيب TruCulture وبالتالي لا تعكس الإفراز الداخلي. لاختبار جدّة نتائج pQTL الخاصة بنا، درسنا قاعدة بيانات pQTL لبروتينات البلازما من SomaLogic.، لكل من pQTLs cis و trans المدرجة في الجدول 1. سمحت هذه المجموعة من البيانات باختبار الارتباطات لـ CXCL5 و IFNIL-1، IL-2 و IL-6 و IL-10 و IL-12a. تم تحديد ارتباطات هامة بين المتغيرات rs352045 (سيز)، rs2393969 (ترانس)، rs10822168 (ترانس) والبروتين CXCL5 (تم تعديل FDR المناسب، و بين rs35345753 (سيز)، rs62449491 (سيز) و IL-6 (تم تعديل FDR الخاص بها) و ) وبين rs3775291(trans) و IL-12A (تم تعديل FDR ). لاختبار الارتباطات للـ SNPs في حالة عدم التوازن الارتباطي مع الـ SNPs المشار إليها في الجدول 1، استخدمنا مجموعة بيانات من عدم التوازن الارتباطي من قاعدة بيانات الإنسيبل مع أسلاف مشابهة لمجموعة ميليو إنتير (1000GENOMES:phase_3:CEU: سكان يوتا من أصول شمالية وغربية أوروبية). لتكون شاملة، تم تضمين SNPs التي تحتوي على تم اختيارها كأليلات مرتبطة وخضعت لنفس التحليل الذي تم إجراؤه مع SNPs المرجعية. SNPs التي ظهرت كأهمية هي تلك التي في عدم توازن الارتباط مع SNP المشار إليه في الجدول 1 والذي يرتبط بشكل كبير مع البروتين المقابل. بالإضافة إلى ذلك، قمنا أيضًا بفحص نتائج eQTL. قارنّا نتائج pQTL الخاصة بنا مع eQTLs المبلغ عنها في عملنا السابق استنادًا إلى بيانات النسخ الجينية من نوع نانوستينج للسيتوكينات الشائعة (CSF2، IFNIL-1TNF، IL-2، IL-6، IL-8، IL-10، IL-12p70، IL-13، IL-17 و IL-23) ومحفزات (E. coli، C. albicans، الإنفلونزا، BCG، و SEB)“، الذي حدد موقعين رئيسيين: موقع TLR1/6/10 وموقع CR1. تم العثور على ارتباط المتغيرات المشار إليها في الجدول 1 في قاعدة بيانات اتحاد GTEx لـ rs1518110 و IL-10 (تم تعديل FDR )، لـ rs352045 (سيز) و CXCL5 (تم تعديل FDR ) في الدم الكامل و rs143060887 (سيز) و IL-12A (تم تعديل FDRتم العثور أيضًا على ارتباطات هامة بين rs352045 و CXCL5 وبين rs1518110 و IL-10 في كتالوج eQTLgen.
حساب التباين المفسر
بالنسبة لكل تحفيز، تم اعتبار جميع المتغيرات المرتبطة على الأقل بسيتوكين واحد مستحث لحساب النسبة المئوية لتباين كل سيتوكين مستحث الذي يفسره كل متغير مرتبط.قيمة ) مع حزمة R relaimpo 2.2.3 ورسمت باستخدام حزمة R ggplot2 3.2.1. الـتم حساب المساهمة المتوسطة عبر الترتيبات بين المتغيرات المستقلة باستخدام نوع Img في دالة calc.relimp من relaimpoتم استخدام بيانات السيتوكينات المحفزة المحولة لوغاريتميًا وعدد الخلايا الفرعية الخام المحولة لوغاريتميًا، بالإضافة إلى بيانات SNPs المرتبطة بالسيز والترانس وبروبي الميثيل. لكل تحفيز، تم اعتبار جميع pQTLs المرتبطة بالسيز (rs352045، rs143060887، rs62449491 وrs1518110 لـ LPS؛ rs352045 لـ anti-CD3 + CD28، rs352045، rs62449491 وrs113845942 لـ poly I:C؛ rs352045 وrs35345753 للإنفلونزا)، وpQTLs المرتبطة بالترانس (rs3764613 لـ LPS؛ rs4833095 لـ E. coli؛ rs11936050 لـ SEB؛ rs1801274 لـ anti-CD3 + CD28؛ rs4833095، rs72636686 وrs10013453 لـ BCG؛ rs10779330 وrs11117956 لـ C. albicans؛ rs3775291 وrs10822168 لـ poly I:C)، بالإضافة إلى بروبي الميثيل (cg09582880 لـ LPS؛ cg25065535 لـ C. albicans، cg17850932 لـ poly I:C وcg16468729 للإنفلونزا) ومجموعة الخلايا الرئيسية المرتبطة (المونوسيتات لـ LPS وE. coli وC. albicans، CD4pos لـ SEB، CD8posEMRA لـ anti-CD3 + CD28، CD45pos لـ BCG، cDC3 لـ poly I:C، CD3pos للإنفلونزا) في النماذج.
ملخص التقرير
معلومات إضافية حول تصميم البحث متاحة في ملخص تقارير مجموعة نيتشر المرتبط بهذه المقالة.
توفر البيانات
يمكن الوصول إلى بيانات مصفوفة SNP من أرشيف الجينوم والظواهر الأوروبي EGA تحت رقم الوصول EGAS00001002460، ويمكن الوصول إلى بيانات شدة الميثيلين الخام Infinium MethylationEPIC عبرhttps://dataset. owey.io/doi/10.48802/owey.f83a-1042تم توفير بيانات السيتوكينات تُقدم البيانات التكميلية 1 وبيانات eCRF في البيانات التكميلية 2. تُقدم البيانات المصدرية مع هذه الورقة.
توفر الشيفرة
جميع السكريبتات المتعلقة بهذه الدراسة متاحة على جيت هاب https:// github.com/ViolaineSaint-Andre/ولديك نسخة موسومة على زينودو:https://doi.org/10.5281/zenodo.10198929. 41. باترسون، ن.، برايس، أ. ل. ورايش، د. هيكل السكان والتحليل الذاتي. PLoS Genet. 2، e190 (2006). 42. بهار، د. م. وآخرون. الهيكل الجينومي للشعب اليهودي. نيتشر 466، 238-242 (2010). 43. دافي، د. وآخرون. التحليل الوظيفي من خلال أنظمة تحفيز الدم الكاملة القياسية يحدد حدود الاستجابة المناعية الصحية للمؤثرات المعقدة. المناعة 40، 436-450 (2014). 44. شابالين، أ. أ. مصفوفة eQTL: تحليل eQTL فائق السرعة عبر عمليات المصفوفات الكبيرة. المعلوماتية الحيوية 28، 1353-1358 (2012).
الشكر والتقدير يتم إدارة هذا البرنامج من قبل الوكالة الوطنية للبحث. لقد استفاد هذا العمل من دعم برنامج استثمر في المستقبل التابع للحكومة الفرنسية؛ المرجع ANR-10-LABX-69-01. أ. برتراند هو طالب من برنامج الدكتوراه FIRE الممول من مؤسسة بيتيكور شيلر وبرنامج EURIP للدراسات العليا (ANR-17-EURE-0012).
مساهمات المؤلفين: التصور: م.ل.أ، ل.ك.-م، د.د، ف.س.-أ و إ.ب. المنهجية: ف.س.-أ، أ. بيتون و د.د. البرمجيات: ف.س.-أ و أ. بيتون. التحقق: ف.س.-أ، أ. بيتون و د.د. التحليل الرسمي: ف.س.-أ و أ. بيتون. التحقيق: ف.س.-أ، ب.س، ج.ب، أ. بيرتراند و د.د. الموارد: م.ر، ج.ب، إ.ب، ل.ك.-م و د.د. تنظيم البيانات: ف.س.-أ، ف.ر، ب.س، إ.ب و د.د. الكتابة، المسودة الأصلية: ف.س.-أ و د.د. الكتابة، المراجعة والتحرير: ف.س.-أ، د.د، أ. بيتون، م.ر، ج.ب، إ.ب و ل.ك.-م. التصور: ف.س.-أ و د.د. الإشراف: د.د، ل.ك.-م، ف.س.-أ و إ.ب. إدارة المشروع: د.د. الحصول على التمويل: م.ل.أ، ل.ك.-م، د.د و اتحاد ميلو إنترير.
المصالح المتنافسة: م.ل.أ. هو موظف في شركة أوكتانت بيوساينسز، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية. د.د. حصل سابقًا على دعم منحة من شركة رولز بيسد ميديسن. يعلن المؤلفون الآخرون عدم وجود مصالح متنافسة.
معلومات إضافية
معلومات إضافية النسخة الإلكترونية تحتوي على مواد إضافية متاحة علىhttps://doi.org/10.1038/s41586-023-06968-8. يجب توجيه المراسلات والطلبات للحصول على المواد إلى فيولاين سانت أندري أو داراغ دافي. معلومات مراجعة الأقران تشكر Nature سام جانس والمراجعين الآخرين المجهولين على مساهمتهم في مراجعة هذا العمل. تقارير مراجعة الأقران متاحة. معلومات إعادة الطبع والتصاريح متاحة علىhttp://www.nature.com/reprints.
الشكل البياني الممتد 1 | تحليل المكونات الرئيسية (PCA) للأفراد بالنسبة لـ 13 سيتوكين في 12 حالة تحفيز. كل نقطة تمثل فردًا واحدًا في حالة تحفيز محددة. تُظهر الأسهم مساهمات السيتوكينات في البعدين الأولين.
مقالة
الشكل البياني الموسع 2 | خرائط حرارية تظهر مستويات تركيز السيتوكينات في كل حالة تحفيز لـ 1,000 فرد من مجموعة Milieu Intérieur. يتم إجراء التجميع الهرمي باستخدام طريقة وورد والمسافة الإقليدية على كل من الصفوف والأعمدة.
الشكل البياني الممتد 3 | خرائط حرارية تظهر -log10 (BY adj. pval لاختبار نسبة الاحتمالات) للارتباط مع متغيرات eCRF المرتبطة على الأقل بسيتوكين واحد في كل تحفيز مع الأخذ في الاعتبار حالة التدخين والعمر
التفاعلات في النماذج المقارنة. يتم تلوينها وفقًا لمفتاح الألوان على جانب كل خريطة حرارية وتظهر النجوم اعتمادًا على قوة الارتباط ( ).
مقالة
الشكل البياني الممتد 4 | خرائط حرارية تظهر ارتباطات متغيرات العمر والجنس مصححة للجنس أو العمر على التوالي ولـ batchId، على السيتوكينات المستحثة في كل حالة تحفيز. يتم تمييز دلالة اختبار نسبة الاحتمالات المعدلة BY بالنجوم (*P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001).
الشكل 5 من البيانات الموسعة | تأثير الجنس والعمر على السيتوكينات المستحثة. رسوم بيانية لحجم التأثير ذو الجانبين مصنوعة منأفراد مستقلون مع فترة ثقة 0.95 للجنس (أ) والعمر (ب) مصححة للعمر أو الجنس على التوالي و batchId، بشأن السيتوكينات المستحثة في كل حالة تحفيز لـ 1,000 فرد من مجموعة Milieu Interieur. أحجام التأثير الكبيرة باللون الأسود، والأخرى باللون الرمادي. دلالة اختبار نسبة الاحتمالات المعدلة BY موضحة بالنجوم (*P<0.05؛ **P<0.01؛ ***P<0.001).
الشكل 6 من البيانات الموسعة | تأثير التدخين على الاستجابات المناعية الفطرية والتكيفية، الممثلة بواسطة LPS و CDالتحفيزات على التوالي ونفس الرسوم البيانية على المتبقيات، بعد الانحدار على العمر والجنس ورقم الدفعة.
بعد تحفيز E. coli و LPS (د) أو IL-2 و IL-13 بعد تحفيز SEB و anti-CD3 + CD28 (هـ) بعد الانحدار على متغيرات العمر والجنس و batchId. تمثل مخططات الصندوقأفراد مستقلون. الخط المركزي يظهر الوسيط، والأجزاء تمثل النسب المئوية 25 و75، والشعيرات تمتد من الجزء إلى أكبر أو أصغر قيمة لا تتجاوز 1.5 نطاق ربعي. دلالة اختبارات مجموع الرتب ويلكوكسون ذات الجانبين مع تعديل المقارنات المتعددة موضحة بالنجوم فوق الصناديق على اليسار (بين المدخنين السابقين والمدخنين غير المدخنين)، في المنتصف (بين المدخنين غير المدخنين والمدخنين الحاليين) وعلى اليمين (بين المدخنين السابقين والمدخنين الحاليين) (N.S، غير دال؛ . -القيم من اليسار إلى اليمين، لـ CXCL5 في E.coli: 0.38، 7.1e-10 و9.9e-07؛ لـ CXCL5 في LPS: 0.34، 7.5e-12 و5.6e-08؛ لـ IL-2 في SEB: 1.4e-03، 1.2e-07 و4.2e-02 و لـ IL-2 في anti-CD3 + CD28: و ، بقايا CXCL5 بعد تحفيز E.coli أو LPS أو تركيزات IL-2 وIL-13 بعد تحفيز SEB أو anti-CD3 + CD28 مقابل عدد سنوات التدخين للمدخنين الحاليين (بالأحمر) أو المدخنين السابقين (بالأزرق). المناطق الرمادية توضح فترات الثقة 0.95 لخطوط الانحدار الخطي.
أ
الشكل الممتد 7| تأثير حالة CMV على السيتوكينات المستحثة يتعدل بواسطة مجموعات خلايا الدم وتأثير التدخين على السيتوكينات المستحثة يتعدل بواسطة CpGs محددة مرتبطة بمستويات IL2 المستحثة بعد
تحفيز SEB. أ، خريطة حرارية تظهر ارتباطات حالة فيروس السيتوميجالي (CMV) مع كل سيتوكين مستحث بعد تحفيز SEB، مع عدم وجود متغير خلوى (الخط العلوي) أو كل من 76 مجموعة خلوية تم تمريرها كمتغيرات في النماذج. دلالة اختبار نسبة الاحتمالات BY adj-pval
ب
موضحة بالنجوم ( ).ب، خريطة حرارية تظهر ارتباطات حالة التدخين مع كل سيتوكين مستحث بعد تحفيز SEB عندما لا يتم تمرير أي مسبار ميثيل (الخط العلوي) أو كل مسبار ميثيل فردي مرتبط بمستويات تركيز IL-2 في تحفيز SEB كمتغير في النماذج. دلالة اختبار نسبة الاحتمالات BY adj-pval موضحة بالنجوم ( ).
الشكل الممتد 8| تفاعلات حالة التدخين و SNPs. أ، خرائط حرارية تظهر -log10(BY adj.pval لاختبار نسبة الاحتمالات) للتفاعلات بين المتغيرات الجينية المدرجة في الجدول 1 وحالة التدخين لكل سيتوكين مستحث بعد تحفيز BCG مع اعتبار العمر والجنس و batchId كمتغيرات. هذه ملونة وفقًا لمفتاح الألوان على جانب الخريطة الحرارية والنجوم موضحة حسب قوة الارتباط., .ب، رسم بياني لحجم التأثير ذو الجانبين يمثل أفراد مستقلون مع فترة ثقة 0.95 لتفاعل SNP rs72636686 مع حالة التدخين، مصححًا للعمر والجنس و batchId،
على السيتوكينات المستحثة بعد تحفيز BCG. أحجام التأثير الدالة ( ) باللون الأسود، والأخرى باللون الرمادي. تلك التي لديها أيضًا BY adj.pval لاختبار نسبة الاحتمالات موسومة بنجمة حمراء. ج، رسم بياني يمثل أفراد مستقلون لمستويات IL8 اعتمادًا على النمط الجيني لـ rs72636686 وحالة التدخين. الخط المركزي يظهر الوسيط، والأجزاء تمثل النسب المئوية 25 و75، والشعيرات تمتد من الجزء إلى أكبر أو أصغر قيمة لا تتجاوز 1.5 نطاق ربعي. دلالة اختبارات مجموع الرتب ويلكوكسون ذات الجانبين مع تعديل المقارنات المتعددة موضحة فوق البيانات المقارنة.
الشكل الممتد 9 | مستويات بروتين IL-2 اعتمادًا على Fc RIIA تعدد الأشكال rs1801274 وتحليل PCA الجيني يظهر تجانس الخلفية الجينية لأفراد Milieu Intérieur. أ، رسوم بيانية تمثل أفراد مستقلون لمستويات تركيز IL-2 اعتمادًا على النمط الجيني للمتبرعين لمتغير rs1801274 الجيني قبل وبعد اختيار المستجيبين باستخدام K-means clustering (مجموعتين). الخط المركزي يظهر الوسيط، والأجزاء تمثل النسب المئوية 25 و75، والشعيرات تمتد من الجزء إلى أكبر أو أصغر قيمة لا تتجاوز 1.5 نطاق ربعي. دلالة اختبارات مجموع الرتب ويلكوكسون ذات الجانبين مع تعديل المقارنات المتعددة موضحة فوق الصناديق
(N.S، غير دال؛ ). -القيم من اليسار إلى اليمين على الرسم البياني العلوي: و وعلى الرسم البياني السفلي: <2.22e-16، 0.35 و0.15.ب، تم إجراء PCA على 261,827 SNPs مستقل و1,723 فرد، والتي تشمل 1,000 متبرع MI مع 723 فرد من اختيار 36 مجموعة سكانية من شمال إفريقيا، والشرق الأدنى، وكذلك أوروبا الغربية والشمالية. PC1 مقابل PC2 (الزاوية العليا اليسرى)، PC1 مقابل PC3 (الزاوية السفلى اليسرى) وPC2 مقابل PC3 (الزاوية العليا اليمنى) معروضة بالإضافة إلى رسم بياني (الزاوية السفلى اليمنى) للتباين المفسر بواسطة أول 20 مكون من PCA.
المقال
أ
التحفيز
mepQTL
LPS
IL17(cg09582880*)
C.albicans
IL2(cg17850932*, cg25065535*)
إنفلونزا
IL8(cg16468729*)
الشكل الممتد | ارتباط مسبارات ميثيل الحمض النووي مع سيتوكيناتها المعنية. أ، مسبارات ميثيل الحمض النووي الموجودة ضمن 1 ميغابايت من TSS لكل سيتوكين تظهر ارتباطات (معدل الاكتشاف الخاطئ بنجاميني-هوشبرغ adj-pval لاختبار نسبة الاحتمالات <0.05) مع مستويات التركيز لهذه
السيتوكينات في حالة التحفيز المحددة ( ). ب، رسوم بيانية تظهر مستويات التركيز المقابلة اعتمادًا على مستويات الميثيل لمسبارات. قيم Adj- من الانحدارات الخطية و-إحصائيات الارتباطات بيرسون ذات الجانبين موضحة على كل رسم.
natureportfolio
المؤلف(المؤلفون) المعنيون: فيولاين سانت-أندري & داراغ دافي
آخر تحديث من قبل المؤلف(المؤلفين): 19 أكتوبر 2023
ملخص التقرير
تسعى Nature Portfolio لتحسين قابلية إعادة إنتاج العمل الذي ننشره. يوفر هذا النموذج هيكلًا للاتساق والشفافية في التقرير. لمزيد من المعلومات حول سياسات Nature Portfolio، انظر سياسات التحرير وقائمة مراجعة سياسة التحرير.
الإحصائيات
لجميع التحليلات الإحصائية، تأكد من أن العناصر التالية موجودة في أسطورة الشكل، أسطورة الجدول، النص الرئيسي، أو قسم الطرق.
تم التأكيد
X حجم العينة الدقيق ( ) لكل مجموعة/شرط تجريبي، معطى كعدد منفصل ووحدة قياس
بيان حول ما إذا كانت القياسات قد أُخذت من عينات متميزة أو ما إذا كانت نفس العينة قد تم قياسها عدة مرات
X
اختبار(اختبارات) الإحصائية المستخدمة وما إذا كانت ذات جانب واحد أو جانبين
يجب وصف الاختبارات الشائعة فقط بالاسم؛ وصف تقنيات أكثر تعقيدًا في قسم الطرق.
X وصف لجميع المتغيرات التي تم اختبارها
وصف لأي افتراضات أو تصحيحات، مثل اختبارات الطبيعية والتعديل للمقارنات المتعددة
X
وصف كامل للمعلمات الإحصائية بما في ذلك الاتجاه المركزي (مثل المتوسطات) أو تقديرات أساسية أخرى (مثل معامل الانحدار) وAND التباين (مثل الانحراف المعياري) أو تقديرات عدم اليقين المرتبطة (مثل فترات الثقة)
X
لاختبار فرضية العدم، إحصائية الاختبار (مثل ) مع فترات الثقة، أحجام التأثير، درجات الحرية و القيمة المذكورة أعطِ القيم كقيم دقيقة كلما كان ذلك مناسبًا.
لتحليل بايزي، معلومات حول اختيار الأولويات وإعدادات سلسلة ماركوف مونت كارلو
للتصاميم الهرمية والمعقدة، تحديد المستوى المناسب للاختبارات والتقارير الكاملة للنتائج
X تقديرات أحجام التأثير (مثل حجم كوهين، ، بيرسون، )، موضحًا كيف تم حسابها
تحتوي مجموعتنا على الإنترنت حول الإحصائيات لعلماء الأحياء على مقالات حول العديد من النقاط أعلاه.
البرمجيات والرمز
معلومات السياسة حول توفر كود الكمبيوتر
جمع البيانات
برنامج تكنولوجيا Luminex xMAP
FlowJo (Treestar)
Illumina Infinium MethylationEPIC BeadChip
Illumina HumanOmniExpress-24 و HumanExome-12 BeadChips
تحليل البيانات
حزمة relaimpo 2.2.3
حزمة R ggplot2 3.2.1 (R 3.6.0)
حزمة MatrixEQTL 2.2 R
heatmaply 1.0.0 و dendextend 1.13.12 مع طريقة التجميع “الكاملة” و”المسافة الإقليدية” في (R 3.6.0)
R 4.2.1 باستخدام FactoMineR 2.8
البيانات
معلومات السياسة حول توفر البيانات
يجب أن تتضمن جميع المخطوطات بيانًا حول توفر البيانات. يجب أن يوفر هذا البيان المعلومات التالية، حيثما ينطبق:
رموز الوصول، معرفات فريدة، أو روابط ويب لمجموعات البيانات المتاحة للجمهور
وصف لأي قيود على توفر البيانات
بالنسبة لمجموعات البيانات السريرية أو بيانات الطرف الثالث، يرجى التأكد من أن البيان يتماشى مع سياستنا
يمكن الوصول إلى بيانات مصفوفة SNP من أرشيف الجينوم والظواهر الأوروبي EGA تحت رقم الوصول EGAS00001002460، ويمكن الوصول إلى بيانات شدة الميثيل Infinium MethylationEPIC الخام عبر الرابط التالي: https://dataset.owey.io/doi/10.48802/owey.f83a-1042، بيانات السيتوكين موجودة في البيانات التكميلية 1 وبيانات eCRF موجودة في البيانات التكميلية 2.
المشاركون في الأبحاث البشرية
معلومات السياسة حول الدراسات التي تشمل المشاركين في الأبحاث البشرية والجنس والنوع في البحث.
التقارير عن الجنس والنوع
تم تصميم المجموعة بشكل خاص لتكون متوازنة بالتساوي من حيث الجنس، 500 رجل و500 امرأة تم تصنيفهم أيضًا حسب العمر (20-69 عامًا). تم تأكيد الجنس (على عكس النوع) من خلال تحليل الكروموسومات الجينية. لتحديد تأثيرات البيئة على استجابات السيتوكين، قمنا بتصحيح كل من العمر والجنس. كما نبلغ عن تأثيرات الجنس المحددة على استجابات السيتوكين.
خصائص السكان
تم تجنيد 1000 متبرع من مجموعة Milieu Interieur بواسطة BioTrial (رين، فرنسا) لتكون مكونة من “أفراد أصحاء” من نفس الخلفية الجينية (الغرب الأوروبي) ولتكون هناك 100 امرأة و100 رجل من كل عقد من الحياة، بين 20 و69 عامًا. تم اختيار المتبرعين بناءً على معايير شمول واستبعاد مختلفة تم وصفها سابقًا (توماس وآخرون، 2015). باختصار، كان مطلوبًا من المتبرعين ألا يكون لديهم تاريخ أو دليل على حالات مرضية شديدة/مزمنة/متكررة، أو اضطرابات عصبية أو نفسية، أو إساءة استخدام الكحول، أو استخدام حديث للمخدرات، أو إعطاء لقاح حديث، أو استخدام حديث لوكلاء تعديل المناعة. لتجنب تأثير تقلبات الهرمونات في النساء، لم يتم تضمين النساء الحوامل والنساء في فترة ما قبل انقطاع الطمث. لتجنب التصنيف الجيني في مجموعة الدراسة، تم تقييد تجنيد المتبرعين للأفراد الذين وُلِدَ آباؤهم وأجدادهم في فرنسا الحضرية.
التجنيد
جاءت العينات البشرية من مجموعة Milieur Intérieur، وتم تجنيدها بواسطة BioTrial (رين، فرنسا) خلال سبتمبر 2011 – يوليو 2012. الدراسة برعاية معهد باستور (رقم ID-RCB: 2012-A00238-35) وتمت كدراسة تدخلية في مركز واحد دون منتج تجريبي. تم تسجيل البروتوكول الأصلي تحت ClinicalTrials.gov (رقم الدراسة NCT01699893). تم تأسيس العينات والبيانات المستخدمة في هذه الدراسة رسميًا كمجموعة بيانات Milieu Intérieur (NCT03905993)، مع موافقات من لجنة حماية الأشخاص – جنوب البحر الأبيض المتوسط ولجنة المعلومات الوطنية والحريات (CNIL) في 11 أبريل 2018. تم تعريف المتبرعين على أنهم أصحاء بناءً على معايير الشمول/الاستبعاد التي تم وصفها سابقًا في توماس وآخرون، علم المناعة السريرية 2015.
الإشراف الأخلاقي
تمت الموافقة على الدراسة من قبل لجنة حماية الأشخاص – غرب 6 في 13 يونيو 2012، ومن قبل الوكالة الفرنسية للأدوية (ANSM) في 22 يونيو 2012.
يرجى ملاحظة أنه يجب أيضًا تقديم معلومات كاملة حول الموافقة على بروتوكول الدراسة في المخطوطة.
التقارير الخاصة بالمجالات
يرجى اختيار الخيار أدناه الذي يناسب بحثك بشكل أفضل. إذا لم تكن متأكدًا، اقرأ الأقسام المناسبة قبل اتخاذ قرارك.
علوم الحياة العلوم السلوكية والاجتماعية العلوم البيئية والتطورية والبيئية
لنسخة مرجعية من الوثيقة مع جميع الأقسام، انظر nature.com/documents/nr-reporting-summary-flat.pdf
تصميم دراسة علوم الحياة
يجب على جميع الدراسات الإفصاح عن هذه النقاط حتى عندما يكون الإفصاح سلبيًا.
حجم العينة
تم حساب حجم العينة الأصلي لمجموعة Milieu Interieur ليكون لديه قوة كافية للتأثيرات الجينية القوية إلى المتوسطة. بالنسبة لهذه الدراسة المحددة، لم يتم حساب حجم عينة محدد وتم تضمين جميع المتبرعين المتاحين في كل خطوة تحليل. ما لم يُذكر خلاف ذلك، فإن جميع النتائج المعروضة قد تم تنفيذها على 956 فردًا من المجموعة الذين أعطوا موافقتهم لمشاركة بياناتهم علنًا لضمان سهولة إعادة إنتاج النتائج
استبعاد البيانات
بالنسبة لتحفيز CD3+CD28، حددنا من خلال التجميع باستخدام k -means مجموعة من 705 أفراد استجابوا للتحفيز ومجموعة من 295 فردًا لم يستجيبوا. يتم تفسير عدم استجابة 295 فردًا من خلال تعدد أشكال FcγRIIA (rs1801274) الذي تم وصفه سابقًا بأنه يمنع الاستجابة لهذا التحفيز CD3+CD28 (شتاين وآخرون، الجينات والمناعة، 2018) (الشكل التمديدي 9). وبالتالي، تم إجراء جميع التحليلات الإحصائية على تحفيزات CD3+CD28 في هذه الدراسة على 705 مستجيبين فقط.
التكرار
نظرًا للطبيعة المحددة للمجموعة ومجموعات البيانات المرتبطة، لم يتم إجراء التكرار.
التقارير عن المواد والأنظمة والأساليب المحددة
نحتاج إلى معلومات من المؤلفين حول بعض أنواع المواد والأنظمة التجريبية والأساليب المستخدمة في العديد من الدراسات. هنا، حدد ما إذا كانت كل مادة أو نظام أو طريقة مدرجة ذات صلة بدراستك. إذا لم تكن متأكدًا مما إذا كان عنصر القائمة ينطبق على بحثك، اقرأ القسم المناسب قبل اختيار رد.
المواد والأنظمة التجريبية
الطرق
غير متاح
مشارك في الدراسة
غير متاح
مشارك في الدراسة
X الأجسام المضادة
X
خطوط الخلايا حقيقية النواة
علم الحفريات وعلم الآثار
التصوير العصبي القائم على الرنين المغناطيسي
الأجسام المضادة
الأجسام المضادة المستخدمة
التحقق
تم تحليل السوبرناتانت من أنابيب TruCulture بواسطة Rules Based Medicine (أوستن، تكساس، الولايات المتحدة) باستخدام تقنية Luminex xMAP. تم تحليل العينات وفقًا لإرشادات تحسين مختبرات السريرية (CLIA). تم تحديد الحد الأدنى من كمية القياس (LLOQ) كما تم وصفه سابقًا (دافي وآخرون، المناعة 2014)، وهو أقل تركيز لمحلل في عينة يمكن اكتشافه بشكل موثوق وعندها يلبي الخطأ الكلي متطلبات CLIA لدقة المختبر. معلومات حول سلالات الأجسام المضادة المستخدمة في الاختبار هي ملكية Rules Based Medicine.
تم إجراء التحقق من كل زوج من الأجسام المضادة المستخدمة في اختبار Luminex بواسطة Rules Based Medicine وفقًا لإرشادات CLIA واختبار الخصوصية والحساسية والتفاعل المتبادل.
البيانات السريرية
معلومات السياسة حول الدراسات السريرية
يجب أن تمتثل جميع المخطوطات لإرشادات ICMJE لنشر الأبحاث السريرية ويجب تضمين قائمة مراجعة CONSORT المكتملة مع جميع التقديمات.
تسجيل التجارب السريرية
NCT01699893، NCT03905993
بروتوكول الدراسة
Clinical trials.gov : NCT01699893، NCT03905993
جمع البيانات
تم تجنيد المتبرعين بواسطة BioTrial (رين، فرنسا) خلال سبتمبر 2011 – يوليو 2012. تم توليد البيانات من هذه العينات منذ عام 2012.
النتائج
وحدة المناعة الانتقالية، قسم المناعة، معهد باستور، جامعة باريس سيت، باريس، فرنسا.معهد باستور، جامعة باريس سيت، مركز المعلوماتية الحيوية والإحصاء الحيوي، باريس، فرنسا.تقنيات القياس الخلوي والبيوماركر، مركز الأبحاث الانتقالية، معهد باستور، جامعة باريس سيت، باريس، فرنسا.DATACTIX، باريس، فرنسا.آفاق الابتكار في فرنسا.معهد الطب البيئي، معهد كارولينسكا، ستوكهولم، السويد.قسم الوبائيات الطبية والإحصاء الحيوي، معهد كارولينسكا، ستوكهولم، السويد.Octant Biosciences، سان فرانسيسكو، كاليفورنيا، الولايات المتحدة.كرسي الجينوم البشري والتطور، كلية فرنسا، باريس، فرنسا. *تظهر قائمة المؤلفين وانتماءاتهم في نهاية الورقة.البريد الإلكتروني: violaine.saint-andre@pasteur.fr; darragh.duffy@pasteur.fr
Violaine Saint-André , Bruno Charbit , Anne Biton , Vincent Rouilly , Céline Possémé , Anthony Bertrand , Maxime Rotival , Jacob Bergstedt , Etienne Patin , Matthew L. Albert , Lluis Quintana-Murci , Darragh Duffy & The Milieu Intérieur Consortium*
Abstract
Individuals differ widely in their immune responses, with age, sex and genetic factors having major roles in this inherent variability . However, the variables that drive such differences in cytokine secretion-a crucial component of the host response to immune challenges-remain poorly defined. Here we investigated 136 variables and identified smoking, cytomegalovirus latent infection and body mass index as major contributors to variability in cytokine response, with effects of comparable magnitudes with age, sex and genetics. We find that smoking influences both innate and adaptive immune responses. Notably, its effect on innate responses is quickly lost after smoking cessation and is specifically associated with plasma levels of CEACAM6, whereas its effect on adaptive responses persists long after individuals quit smoking and is associated with epigenetic memory. This is supported by the association of the past smoking effect on cytokine responses with DNA methylation at specific signal transactivators and regulators of metabolism. Our findings identify three novel variables associated with cytokine secretion variability and reveal roles for smoking in the shortand long-term regulation of immune responses. These results have potential clinical implications for the risk of developing infections, cancers or autoimmune diseases.
High levels of variability exist among individuals and populations in relation to responses to immune challenges . This has been highlighted by the COVID-19 pandemic through the diverse clinical outcomes observed after infection with SARS-CoV- . Variables such as age, sex and genetics have a major effect on the way individuals respond to infection . However, such immune variability is generally not considered in the design of treatments or vaccines, and there is a need to better identify the variables associated with immune response variation .
The Milieu Intérieur project was developed to assess the factors that contribute to variable ‘healthy’ immune responses . The cohort is equilibrated in terms of age and sex and comprises individuals of a homogenous genetic background, to facilitate identification of novel immune determinants, in addition to age, sex and genetic variants. The Milieu Intérieur project has already advanced our understanding of the variables that regulate immune homeostasis. In particular, by quantifying the effects of age, sex, genetics and cellular composition on the transcript levels of immune-related genes , and the effects of age, sex, cytomegalovirus (CMV) latent infection and smoking on blood leukocyte composition .
To identify new environmental factors associated with variability in response to immune stimulation, we focused on cytokine protein secretion as an immune response phenotype. The concentrations of 13 disease- and medically-relevant cytokines (CXCL5, CSF2, IFN , IL-1 ,
TNF, IL-2, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12p70, IL-13, IL-17 and IL-23) were measured with Luminex technology, after 22 h of standardized whole-blood stimulation with 11 immune agonists for the 1,000 Milieu Intérieur donors (Supplementary Table 1), as well as in a non-stimulated control (null condition). The stimulations are classified into 4 categories: microbial (Bacillus Calmette-Guérin (BCG), Escherichia coli (E. coli), lipopolysaccharide (LPS) and Candida albicans (C.albicans)) and viral (influenza and polyinosinic-polycytidylic acid (poly I:C)) agents, which are predominantly recognized by receptors on innate immune cells; T cell activators (Staphylococcus aureus enterotoxin B superantigen (SEB) and anti-CD3 and anti-CD28 antibodies (anti-CD3 + CD28)), which induce adaptive immune responses; and cytokines (TNF, IL- and IFN ).
Smoking, CMV and BMI associations
Principal component analysis (PCA) (Extended Data Fig. 1) and heat maps (Extended Data Fig. 2) of the 13 cytokines in the 12 immune stimulations highlight the specific cytokines that were induced in each independent condition. Hierarchical clustering of the standardized log mean differences of the cytokine levels (Fig. 1a) clearly distinguishes groups that broadly correspond to stimulation type. Immune responses induced by innate (E. coli and LPS) and adaptive (SEB and anti-CD3 + CD28) stimulations cluster separately, and show greater
Fig. 1| Variables associated with cytokine levels in diverse immune stimulations. a, Standardized log mean differences of 13 cytokines in 12 immune stimulations. b, Significant associations (Benjamini-Yekutieli adjusted value of likelihood ratio test (LRT) < 0.01) of variables with at least one induced cytokine for each immune stimulation are coloured in black.c, Heat maps showing-log10(Benjamini-Yekutieli adjusted value of LRT) for the eCRF variables associated with at least one cytokine in each stimulation (BenjaminiYekutieli adjusted value of LRT ). , , .
inter-individual variability in the measured cytokines compared with the other stimulation types.
From the electronic case report form (eCRF), we compiled 136 socio-demographic, environmental, clinical and nutritional variables (Supplementary Table 2) and tested their association with the induced cytokines in each stimulation through likelihood ratio tests (LRTs), using age, sex and experimental batch as covariates. Eleven variables are associated with at least one cytokine in at least one stimulation (Benjamini-Yekutieli adjusted value ) (Fig. 1b). These are related mostly to body mass index (BMI) in SEB and BCG stimulations, CMV latent infection in adaptive immune stimulations and smoking, which shows the most associations across stimulations.
Smoking-related variables are associated with IL-2 and IL-13 in SEB and anti-CD3 + CD28 stimulations, and they are associated with CXCL5 in innate immune stimulations (Fig.1c). These observations are supported by previous findings showing that smoking favours inflammation and compromises immunity to bacterial infection , and that IL-2 and IL-13 are involved in modulating effects of exposure to tobacco . CMV
latent infection is associated with CSF2, IFN and TNF upon adaptive immune stimulations, in line with our previous work showing strong associations between CMV seropositivity and increased numbers of T cell effector memory subsets . We also observed that BMI-related variables are associated with CXCL5 after BCG stimulation, and with IL-2 after SEB stimulation, which is consistent with the dysregulation of CXCL5 and IL-2 in obesity . As potential interactions may exist between our tested variables and age, we performed the same analysis considering age and smoking interactions in the models. The results are very similar to the ones obtained without considering interactions, and some smoking-related variables are associated with even higher significance in SEB, anti-CD3 + CD28, E. coli and LPS stimulation conditions (Extended Data Fig. 3). Notably, by including these interactions, smoking-related variables are significantly associated with IL-2 responses after BCG stimulation. This IL-2 response may reflect a long-lived antigen-specific cell response to vaccination, which all of the cohort received at birth owing to mandatory BCG vaccination in France prior to 2007, further strengthening the associations of smoking with T cell immunity. Individual effects of age and sex have also been tested, and corresponding LRT results and effects sizes are shown on Extended Data Figs. 4 and 5. In addition, as human leukocyte antigen (HLA) is a well-known determinant of immune response variability, which is mostly relevant for antigen-specific responses, we tested associations between previously identified HLA types and induced cytokine responses following the same procedure that we used for the other donor variables. We detected only one significant association, between the major histocompatibility complex class II, DQ beta 1 HLA.DBQ1.1P and IL-6 in the non-stimulated control condition. However no associations were observed with induced cytokine responses after stimulation.
The smoking effect is persistent
To assess the biological effect of smoking on cytokine secretion, we plotted the effect sizes for the smoking variables from the linear models. We observed that current smoking affects both innate and adaptive immune responses (Fig. 2a and Extended Data Fig. 6). Smoking is associated with stronger induction of CXCL5 after E. coli stimulation, and stronger induction of IL-2 and IL-13 after SEB stimulation (Benjamini-Yekutieli adjusted value of LRT < 0.001). The smoking-related variablesnumber of years smoking, number of years since last smoked, and total number of cigarettes-show consistent associations (Fig. 2b,c).
Of note, in contrast to current smokers (Fig. 2a), past smokers show no significant increase in CXCL5 secretion after innate immune stimulation, whereas they show an increase in IL-2 and IL-13 secretion after adaptive immune stimulation, compared with non-smokers (Fig. 2d). Box plots of cytokine concentrations show that the levels of CXCL5 in past smokers and non-smokers are not significantly different, but differ from those in current smokers after innate immune stimulations (Fig. 2e and Extended Data Fig. 6a,d). Conversely, the levels of IL-2 in current smokers and past smokers are not significantly different but differ from those in non-smokers in adaptive immune stimulations (Fig. 2f and Extended Data Fig. 6b,e). Cytokine production for both current and past smokers correlates with the number of years smoking in adaptive immune stimulations, but this is not the case for past smokers in innate immune stimulations (Fig. 2g and Extended Data Fig. 6c,f). These results collectively show a short-term effect of smoking on innate immune responses, and a long-term effect of smoking on adaptive immune responses.
Immune cells and plasma proteins
As induced cytokine levels are associated with numbers of specific subsets of circulating immune cells, we tested whether the smokingcytokine associations remain when considering these cell subsets in our models (Fig. 3 and Extended Data Fig. 7a). The associations of CMV
Fig. 2 | Smoking effects on innate and adaptive immune responses, represented by . coliand SEB stimulations, respectively. a-d, Two-sided effect size plots representing effect on each induced cytokine using independent individuals with 0.95 confidence interval for current smoking compared with non-smoking (a), for number of years smoking (b), for years since last smoke (c), and for past smoking (d) in E. coli or SEB stimulation. Significant effect sizes ( ) are in black, others are in grey. Those that also have Benjamini-Yekutieli adjusted value of LRT are labelled with a red star. Exact values are provided in the .e,f, CXCL5 concentration following E. coli stimulation (e) and IL-2 concentration following SEB stimulation (f) for
never, past and current smokers. Box plots represent independent individuals. The centre line shows the median, hinges represent the 25th and 75th percentiles and whiskers extend from the hinge to the largest or smallest values no further than 1.5 interquartile range. Two-sided Wilcoxon rank sum tests adjusting for multiple comparisons are shown. values (left to right): and and , CXCL5 concentration following E. coli stimulation and IL-2 and IL-13 concentration following SEB stimulation versus numbers of years smoking for current or past smokers. Grey areas depict the 0.95 confidence intervals of the linear regression lines.
serostatus with the levels of CSF2, IFN and TNF in SEB stimulation are lost when specific memory T cell numbers are used as covariates (Extended Data Fig. 7a), which is consistent with the reported association of these cells with CMV latent infection , and suggests that the effects of CMV latent infection on cytokines are mediated by changes in blood cell composition. The same analysis performed on the smoking variable for the innate immune stimulations show no clear cell subsets affecting the association of smoking with CXCL5 levels (Fig. 3a). Conversely, upon adaptive immune stimulations, the numbers of multiple cell and regulatory cell subsets eliminate the association of smoking with protein levels (Fig. 3a), suggesting that these subsets mediate the smoking effect in adaptive immune responses. We also assessed a role for 326 soluble blood proteins measured in the plasma of a subset of 400 donors . We identified that the levels of carcinoembryonic
antigen-related cell adhesion molecule 6 (CEACAM6), when included in the models, eliminates the association of smoking with CXCL5 after innate immune stimulations, suggesting that CEACAM6 is involved in CXCL5 regulation in smokers (Fig. 3b). We interpret this effect as a biological interaction rather than a shift in immune cell populations, owing to the short stimulation period of 22 h and because the regression analysis including cell numbers as covariates (Fig. 3a) did not identify any cellular associations with the bacteria-induced CXCL5-smoking association.
DNA methylation changes
To test the hypothesis that an epigenetic mechanism mediates the persistent effect of smoking on adaptive immune responses,
Fig. 3 | Effects of smoking on induced cytokines is modified by blood cell subsets and plasma proteins. a, Heat maps showing associations (- (Benjamini-Yekutieli adjusted value of LRT (adj. ))) of the smoking status with induced cytokines in . coli and SEB stimulations with either no cell subset count covariate (top line) or each of 76 cell subset counts passed as covariates in the models.b, Two-sided effect size plots representing
independent individuals with 0.95 confidence interval for current smokers compared with non-smokers in E.coli stimulation when no plasma protein (top) or CEACAM6 (bottom) is passed as a covariate in the models. Significant ( ) effect sizes are in black and others are in grey. The red star indicates a Benjamini-Yekutieli adjusted value of LRT .
we determined whether smoking affected cytokine levels through DNA methylation changes. We measured baseline DNA methylation at more than sites using the MethylationEPIC array and identified sites that are directly associated with smoking-that is, not mediated by blood cell composition-in the Milieu Intérieur cohort . Among those sites, 129 are significantly associated with IL-2 in SEB stimulation (Benjamini-Yekutieli adjusted value of the LRT < 0.001). We tested whether the DNA methylation levels of these CpG sites could be related to the association of smoking with cytokine levels after SEB stimulation. We observed that 11 CpGs , when passed as covariates in the models, eliminate the association of smoking with IL-2 and IL-13 (Benjamini-Yekutieli adjusted value of LRT < 0.001) (Extended Data Fig. 7b). Among these, 3 relate to the aryl hydrocarbon receptor repressor ( ) gene. The other CpG sites correspond to F2RL3 and G-protein-coupled receptor (GPR15), retinoic acid receptor (RARA) and serine protease (PRSS23) genes. At all of these loci, we observe a strong DNA hypomethylation in current smokers compared with non-smokers, with past smokers showing an intermediate state of methylation (Fig. 4a). Consistently, in past smokers, the number of years individuals smoked (Fig. 4b), the total number of cigarettes they smoked (Fig. 4c) and IL-2 levels in SEB stimulation (Fig. 4e) negatively correlate with the level of DNA methylation of these genes, whereas the number of years since they
stopped smoking generally positively correlate with their level of DNA methylation (Fig. 4d). These results provide evidence that a persistent effect of smoking on adaptive immune responses is associated with DNA methylation at signal trans-activators and metabolism regulators.
Genomic associations
As some genetic variants manifest their regulatory roles upon stimulation only, our study is particularly well suited to identify response protein quantitative trait loci (pQTLs). We tested a total of 5,699,237 high-quality imputed single nucleotide polymorphisms (SNPs) for associations with the cytokines induced in each stimulation, adjusting for age, sex, technical variables and major immune cell population counts (Supplementary Table 3) and report 44 reponse pQTLs (Table 1). The Somalogic and Olink databases are the main resources of plasma pQTLs, which have identified pQTLs for some of our tested cytokines at steady state . However, to our knowledge, only one study-the 500FG study-tested for response pQTLs for some of our tested cytokines in whole blood . Among the common tested cytokine-stimulation couples, both studies identify pQTLs for IL-6 and IL-1 in poly I:C, TNF in C. albicans and IL-1 in LPS. Of note, the pQTL (rs3775291) we identify for IL-1 and IL-6 in poly I: is located in
Fig. 4 | Persistent effect of smoking on adaptive immune responses correlates with DNA methylation at signal trans-activators and metabolism regulators. a, DNA methylation levels for the top probe that removes association of smoking status with IL-2 in SEB stimulation, when passed as a covariate in the models, for the indicated genes and for never, past and current smokers. The centre line shows the median, hinges represent the 25th and 75th percentiles and whiskers extend from the hinge to the largest or smallest values no further than 1.5 interquartile range and . Two-sided Wilcoxon rank sum tests adjusting for multiple comparisons. Left to right: , , (cg03636183); 7.9 (cg19859270); , 0.31 (cg14391737).b-e, Methylation ( 5 mC level) for each probe depending on the number of years individuals smoked (for current smokers) (b), the total lifetime number of cigarettes smoked (for current smokers) (c), the number of years since last smoke (for past smokers) (d) and IL-2 concentration following SEB stimulation (e) for the indicated genes. values and two-sided Pearson correlations are shown.
the TLR3 exon locus, whereas the pQTLs reported by the 500FG study for these cytokines (rs28393318 for IL-1 and rs6831581 for IL-6) are located in the TLR1-TLR6-TLR10 (TLR1/6/10) locus. We performed conditional analysis between the two loci by passing rs28393318 as a covariate in our pQTL identification, and show that the association we report between IL- and rs3775291 is maintained, indicating that it is independent of the one reported in the 500FG study (Supplementary Table 4). Among the potential new trans-pQTLs we identified, 3 are for CXCL5. One was identified upon BCG stimulation and is located in the TLR1/6/10 locus. Another one was identified in C. albicans
stimulation and is located in the CR1 locus. The third was observed in poly I:C, IL-1 and IFN stimulations, and is in an intron of JMJD1C, which encodes a candidate histone H 3 K 27 me 3 demethylase. We also identified a trans-pQTL for IL-2 in anti-CD3 + CD28 stimulation, which is close to the immunoglobulin Fc receptor IIa (FCGR2A) gene-identified as an eQTL by the GTEx consortium -that has been associated with multiple autoimmune diseases and conditions the response to anti-CD3 + CD28 stimulation . Another trans-pQTL of interest is for IL-1 , IL-12, TNF, IL-6 and IFN in poly I: stimulation, which is located in a exon and associated with age-related macular degeneration
Article
Table 1 | cis-pQTLs and trans-pQTLs for induced cytokines in each stimulation
Stimulus
Cytokine
rsID
Adjusted value
cis or trans
Locus
E. coli
IFNy
rs4833095
trans
TLR1/6/10 locus
IL-2
rs9306967
trans
TLR1/6/10 locus
IL-6
rs5743614
trans
TLR1/6/10 locus
IL-8
rs4833095
trans
TLR1/6/10 locus
IL-17a
rs9306967
trans
TLR1/6/10 locus
IL-23a
rs6815814
trans
TLR1/6/10 locus
LPS
CXCL5
rs352045
cis
CXCL5 promoter
IL-1
rs3764613
trans
PPP5C enhancer
IL-6
rs62449491
cis
IL6 enhancer
IL-10
rs1518110
cis
IL10 intronic enhancer
IL-12a/b
rs143060887
cis/trans
IL12A putative regulatory regions
SEB
IL-6
rs11936050
trans
TLR1/6/10 locus
Anti-CD3+CD28 (responders)
CXCL5
rs352045
cis
CXCL5 promoter
IL-2
rs1801274
trans
Close to FCGR2A
BCG
CXCL5
rs10013453
trans
TLR1/6/10 locus
IL-2
rs4833095
trans
TLR1/6/10 locus
IL-6
rs72636686
trans
KAZN intron
IL-8
rs4833095
trans
TLR1/6/10 locus
C. albicans
CXCL5
rs10779330
trans
CR1 locus
IL-1
rs10863358
trans
CR1 locus
IL-23a
rs10779330
trans
CR1 locus
TNF
rs11117956
trans
CR1 locus
Influenza
CXCL5
rs352045
cis
CXCL5 promoter
CXCL5
rs10822168
trans
JMJD1C intron
IL-6
rs35345753
cis
IL6 enhancer
Poly I:C
CXCL5
rs352045
cis
CXCL5 promoter
CXCL5
rs10822168
trans
JMJD1C intron
IFNy
rs3775291
trans
TLR3 exon
IL-1
rs3775291
trans
TLR3 exon
IL-6
rs62449491
cis
IL6 enhancer
IL-6
rs3775291
trans
TLR3 exon
IL-12a/b
rs3775291
trans
TLR3 exon
TNF
rs113845942
cis
HLA-DRB intergenic region
TNF
rs3775291
trans
TLR3 exon
TNF
CSF2
rs112997843
trans
Intergenic region
CXCL5
rs352045
cis
CXCL5 promoter
IFNy
rs352045
trans
CXCL5 promoter
IL-10
rs6689179
cis
IL10 enhancer
IL-1
CXCL5
rs352045
cis
CXCL5 promoter
CXCL5
rs2393969
trans
JMJD1C intron
IFNy
rs2564594
trans
CXCL5 promoter
IFNy
CXCL5
rs352045
cis
CXCL5 promoter
CXCL5
rs10822168
trans
JMJD1C intron
and resistance to viral infections , consistent with poly I:C stimulation acting through TLR3. Other trans associations were identified for IL-1 in LPS stimulation, with the corresponding variant rs3764613, located in a PPP5C enhancer, and for IL-6 in BCG stimulation, for which the corresponding variant-rs72636686-is in an intron of the gene, which encodes a cell adhesion protein. We also assessed potential interactions between the identified SNPs and smoking status. No significant associations were observed for E. coli, LPS, SEB and anti-CD3 + CD28
stimulations, but BCG stimulation showed significant genetic-smoking interaction (effect size [1.42-1.75], Benjamini-Yekutieli adjusted value ) (Extended Data Fig. 8a,b) between rs72636686 and smoking status for IL-8 levels. This interaction shows that smoking status can remove differences in response to some immune stimulation between individuals of different genotypes (Extended Data Fig. 8c), supporting modulation of genotype effects by the smoking status.
Fig. 5|Induced cytokine variance explained. a-h, Percentages of variance explained by each variable associated with at least one induced cytokine in E.coli (a), LPS (b), SEB (c), anti-CD3 + CD28 (d), BCG (e), C. albicans (f), poly I:C
(g) and influenza (h) stimulations. contributions averaged over orderings among regressors are represented on each plot.
Cytokine variance explained
To assess the relative effect of the smoking associations identified, we quantified how inter-individual variance in each induced cytokine may be explained by each associated variable. The genetic and epigenetic loci, major immune cell subsets, age, sex, BMI, CMV latent infection and smoking status were combined in the same model and their respective effects on induced cytokine levels were computed (Fig. 5a-h). We observed that smoking explained between 4 and 9% of the inter-individual variance of the associated cytokines, a level equivalent to age, sex or genetic effects when present.
Discussion
Here we show that smoking status, CMV latent infection and BMI, in addition to age, sex, genetic variation, DNA methylation levels and immune cell subsets, are the variables most associated with variation in cytokine secretion upon immune challenge. Our approach to study induced immune responses to diverse stimuli was validated by the identification of new environmental and genetic determinants for 11 of the 13 cytokines studied, associations that were detected across the different stimulation conditions. The effects of smoking are of particular interest, as they have effects on both innate and adaptive immune responses (Extended Data Fig. 10c). The variance explained by the smoking status for some cytokines upon stimulation reaches a level equivalent to those of age, sex and genetic variants, all of which are known to have implications for disease risk. Current smokers showed an increased inflammatory response following bacterial stimulation, which is quickly lost upon smoking cessation. Conversely, the smoking effects on cell responses persist years after individuals quit smoking.
The association of the smoking effect with long-lived and cell subsets and DNA methylation at signal trans-activators and metabolism regulators highlights a mechanism for the persistent effects in the adaptive response. AHRR, F2RL3, GP15, PRSS23 and RARA CpG sites were previously identified as candidate smoking-related loci in whole blood . Of note, the CpG site most associated with smoking-within the gene-is a quantitative biomarker of smoking cessation and
is associated with increased risk for chronic obstructive pulmonary disease and lung cancer . Although the interplay of AHRR in the AHR pathway is complex and depends on the cell-type specific balancing of AHR and AHRR, the repressive activity of AHRR is due to displacement or inhibition of AHR binding to xenobiotic response elements in the promoter of its targets . Decreased expression of xenobiotic metabolizing genes may, in turn, compromise the ability of the body to metabolize harmful agents, potentially leading to impaired lung function. Our work thus suggests that smoking can induce specific epigenetic modifications that could subsequently lead to altered immune responses.
By contrast, we did not identify putative cellular mediators for the increased inflammatory response to innate stimulation in smokers. We found a strong association between induced levels of CXCL5 with circulating levels of CEACAM6, a glycosylphosphatidylinositol cell surface protein that belongs to the CEACAM immunoglobulin supergene family. CXCL5 regulates neutrophil trafficking to the lung via CXCR2 and has been implicated in asthma and multiple cancers . CEACAM6 is expressed on the surface of neutrophils, macrophages and lung and intestinal epithelial cells and its levels are increased in multiple cancers, such as breast and gastric cancer where it has been proposed as a clinical biomarker . Although previous studies have suggested that levels of CXCL5 and CEACAM6 may be increased in smokers, most studies have focused on pulmonary sites and in patients with respiratory disease (such as cancer, chronic obstructive pulmonary disease and asthma), which can confound the results. Our study identifies a strong link between these previously proposed disease biomarkers and response to immune challenges in smokers versus non-smokers. Furthermore, our findings in healthy donors open avenues for further exploration into understanding how smoking acts as a risk factor for cancers beyond the lungs.
Although our study has revealed novel effects of environmental variables on immune responses, it does present some limitations. One is the absence of a replication cohort to validate these findings. Furthermore, our analyses were conducted on a population of similar genetic background, but ongoing efforts are underway to include other populations from diverse ancestries. Future studies will also aim to
identify the transcriptional regulatory networks that underly the persistent effect of smoking on adaptive immune responses. These findings provide new understanding on the effects of smoking on human health, and the role of modifiable environmental effects on immune response variability.
Online content
Any methods, additional references, Nature Portfolio reporting summaries, source data, extended data, supplementary information, acknowledgements, peer review information; details of author contributions and competing interests; and statements of data and code availability are available at https://doi.org/10.1038/s41586-023-06968-8.
Brodin, P. et al. Variation in the human immune system is largely driven by non-heritable influences. Cell 160, 37-47 (2015).
Quach, H. et al. Genetic adaptation and neandertal admixture shaped the immune system of human populations. Cell 167, 643-656.e17 (2016).
Patin, E. et al. Natural variation in the parameters of innate immune cells is preferentially driven by genetic factors. Nat. Immunol. 19, 302-314 (2018).
Piasecka, B. et al. Distinctive roles of age, sex, and genetics in shaping transcriptional variation of human immune responses to microbial challenges. Proc. Natl Acad. Sci. USA 115, E488-E497 (2018).
Bakker, O. B. et al. Integration of multi-omics data and deep phenotyping enables prediction of cytokine responses. Nat. Immunol. 19, 776-786 (2018).
Salje, H. et al. Estimating the burden of SARS-CoV-2 in France. Science 369, 208-211 (2020).
Nédélec, Y. et al. Genetic ancestry and natural selection drive population differences in immune responses to pathogens. Cell 167, 657-669.e21 (2016).
Hadjadj, J. et al. Impaired type I interferon activity and inflammatory responses in severe COVID-19 patients. Science 369, 718-724 (2020).
Brodin, P. Immune determinants of COVID-19 disease presentation and severity. Nat. Med. 27, 28-33 (2021).
Li, Y. et al. Inter-individual variability and genetic influences on cytokine responses to bacteria and fungi. Nat. Med. 22, 952-960 (2016).
Liston, A., Carr, E. J. & Linterman, M. A. Shaping variation in the human immune system. Trends Immunol. 37, 637-646 (2016).
Thomas, S. et al. The Milieu Intérieur study-an integrative approach for study of human immunological variance. Clin. Immunol. 157, 277-293 (2015).
Lugade, A. A. et al. Cigarette smoke exposure exacerbates lung inflammation and compromises immunity to bacterial infection. J. Immunol. 192, 5226-5235 (2014).
Mertens, T. C. J. et al. Cigarette smoke differentially affects IL-13-induced gene expression in human airway epithelial cells. Physiol. Rep. 5, e13347 (2017).
Butov, D., Kuzhko, M., Makeeva, N. & Butova, T. Smoking as a risk factor which activates IL-2 gene polymorphism in patients with MDR-TB. Eur. Respir. J. 46, PA4535 (2015).
Chavey, C. et al. CXC ligand 5 is an adipose-tissue derived factor that links obesity to insulin resistance. Cell Metab. 9, 339-349 (2009).
Vargas, R. et al. Increased C-reactive protein and decreased Interleukin-2 content in serum from obese individuals with or without insulin resistance: associations with leukocyte count and insulin and adiponectin content. Diabetes Metab. Syndr. Clin. Res. Rev. 10, S34-S41 (2016).
Caron, B. et al. Integrative genetic and immune cell analysis of plasma proteins in healthy donors identifies novel associations involving primary immune deficiency genes. Genome Med. 14, 28 (2022).
Bergstedt, J. et al. The immune factors driving DNA methylation variation in human blood. Nat. Commun. 13, 5895 (2022).
Sun, B. B. et al. Genomic atlas of the human plasma proteome. Nature 558, 73-79 (2018).
Ferkingstad, E. et al. Large-scale integration of the plasma proteome with genetics and disease. Nat. Genet. 53, 1712-1721 (2021).
Pietzner, M. et al. Mapping the proteo-genomic convergence of human diseases. Science 374, eabj1541 (2021).
Gudjonsson, A. et al. A genome-wide association study of serum proteins reveals shared loci with common diseases. Nat. Commun. 13, 480 (2022).
Koprulu, M. et al. Proteogenomic links to human metabolic diseases. Nat. Metab. 5, 516-528 (2023).
Li, Y. et al. A functional genomics approach to understand variation in cytokine production in humans. Cell 167, 1099-1110.e14 (2016).
Ardlie, K. G. et al. Human genomics. The genotype-tissue expression (GTEx) pilot analysis: multitissue gene regulation in humans. Science 348, 648-660 (2015).
Zhang, C., Wang, W., Zhang, H., Wei, L. & Guo, S. Association of FCGR2A rs1801274 polymorphism with susceptibility to autoimmune diseases: a meta-analysis. Oncotarget 7, 39436-39443 (2016).
Stein, M. M., Hrusch, C. L., Sperling, A. I. & Ober, C. Effects of an FcyRIIA polymorphism on leukocyte gene expression and cytokine responses to anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. Genes Immun. 20, 462-472 (2019).
Ma, L. et al. Association of toll-like receptor 3 polymorphism rs3775291 with agerelated macular degeneration: a systematic review and meta-analysis. Sci. Rep. 6, 19718 (2016).
Sironi, M. et al. A common polymorphism in TLR3 confers natural resistance to HIV-1 infection. J. Immunol. 188, 818-823 (2012).
Su, D. et al. Distinct epigenetic effects of tobacco smoking in whole blood and among leukocyte subtypes. PLoS ONE 11, e0166486 (2016).
Christiansen, C. et al. Novel DNA methylation signatures of tobacco smoking with trans-ethnic effects. Clin. Epigenetics 13, 36 (2021).
Philibert, R. et al. Reversion of AHRR demethylation is a quantitative biomarker of smoking cessation. Front. Psychiatry https://doi.org/10.3389/fpsyt.2016.00055 (2016).
Bojesen, S. E., Timpson, N., Relton, C., Davey Smith, G. & Nordestgaard, B. G. AHRR (cg05575921) hypomethylation marks smoking behaviour, morbidity and mortality. Thorax 72, 646-653 (2017).
Haarmann-Stemmann, T. & Abel, J. The arylhydrocarbon receptor repressor (AhRR): structure, expression, and function. Biol. Chem. 387, 1195-1199 (2006).
Sokulsky, L. A. et al. A critical role for the CXCL3/CXCL5/CXCR2 neutrophilic chemotactic axis in the regulation of type 2 responses in a model of rhinoviral-induced asthma exacerbation. J. Immunol. 205, 2468-2478 (2020).
Ru, G. Q. et al. CEACAM6 is a prognostic biomarker and potential therapeutic target for gastric carcinoma. Oncotarget 8, 83673-83683 (2017).
Chen, J. et al. The elevated CXCL5 levels in circulation are associated with lung function decline in COPD patients and cigarette smoking-induced mouse model of COPD. Ann. Med. 51, 314-329 (2019).
Wu, C.-Y. et al. CEACAM6 as a novel therapeutic target to boost HO-1-mediated antioxidant defense in COPD. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 207, 1576-1590 (2023).
Saint-André, V. Computational biology approaches for mapping transcriptional regulatory networks. Comput. Struct. Biotechnol. J. 19, 4884-4895 (2021).
Publisher’s note Springer Nature remains neutral with regard to jurisdictional claims in published maps and institutional affiliations.
Open Access This article is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License, which permits use, sharing, adaptation, distribution and reproduction in any medium or format, as long as you give appropriate credit to the original author(s) and the source, provide a link to the Creative Commons licence, and indicate if changes were made. The images or other third party material in this article are included in the article’s Creative Commons licence, unless indicated otherwise in a credit line to the material. If material is not included in the article’s Creative Commons licence and your intended use is not permitted by statutory regulation or exceeds the permitted use, you will need to obtain permission directly from the copyright holder. To view a copy of this licence, visit http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.
(c) The Author(s) 2024
The Milieu Intérieur Consortium
Laurent Abel , Andres Alcover , Hugues Aschard , Philippe Bousso , Nollaig Bourke , Petter Brodin , Pierre Bruhns , Nadine Cerf-Bensussan , Ana Cumano , Christophe D’Enfert , Caroline Demangel , Ludovic Deriano , Marie-Agnès Dillies , James Di Santo , Gérard Eberl , Jost Enninga , Jacques Fellay , Ivo Gomperts-Boneca , Milena Hasan , Gunilla Karlsson Hedestam , Serge Hercberg , Molly A. Ingersoll , Olivier Lantz , Rose Anne Kenny , Mickaël Ménager , Frédérique Michel , Hugo Mouquet , Cliona O’Farrelly , Etienne Patin , Antonio Rausell , Frédéric Rieux-Laucat , Lars Rogge , Magnus Fontes , Anavaj Sakuntabhai , Olivier Schwartz , Benno Schwikowski , Spencer Shorte , Frédéric Tangy , Antoine Toubert , Mathilde Touvier , Marie-Noëlle Ungeheuer , Christophe Zimmer , Matthew L. Albert , Darragh Duffy & Lluis Quintana-Murci Laboratory of Human Genetics of Infectious Diseases, Necker Branch, INSERM UMR1163, Paris, France. Necker Hospital for Sick Children, Paris, France. Institut Pasteur, Université Paris Cité, INSERM-U1224, Unité Biologie Cellulaire des Lymphocytes, Ligue Nationale Contre le Cancer-Équipe Labellisée Ligue 2018, Paris, France. Institut Pasteur, Université Paris Cité, Department of Computational Biology, Paris, France. Dynamics of Immune Responses Unit, Institut Pasteur, INSERM U1223, Université de Paris Cité, Paris, France. Department of Medical Gerontology, School of Medicine, Trinity Translational Medicine Institute, Trinity College Dublin, The University of Dublin, Dublin, Ireland. Department of Women’s and Children’s Health, Karolinska Institutet, Solna, Sweden. Unit of Antibodies in Therapy and Pathology, INSERM UMR1222, Institut Pasteur, Université de Paris Cité, Paris, France. Université Paris-Cité, Institut Imagine, Laboratory of Intestinal Immunity, INSERM U1163, Paris, France. Unit of Lymphocytes and Immunity, Immunology Department, Institut Pasteur, INSERM U1223, Université de Paris Cité, Paris, France. Institut Pasteur, Université Paris Cité, INRAE USC2019, Unité Biologie et Pathogénicité Fongiques, Paris, France. Institut Pasteur, Université Paris Cité, Inserm U1224, Immunobiology and Therapy Unit, Paris, France. Institut Pasteur, Université Paris Cité, INSERM U1223, Équipe Labellisée Ligue Contre Le Cancer, Genome Integrity, Immunity and Cancer Unit, Paris, France. Institut Pasteur, Innate Immunity Unit, Université Paris Cité, Inserm U1223, Paris, France. Institut Pasteur Université de Paris Cité, Inserm U1224, Microenvironment and Immunity Unit, Paris, France. Dynamics of Host-Pathogen Interactions, Institut Pasteur, Université de Paris Cité, CNRS UMR3691, Paris, France. School of Life Sciences, École Polytechnique Fédérale de Lausanne, Lausanne, Switzerland. Institut Pasteur, Université Paris Cité, CNRS Unité Mixe de Recherche 6047, INSERM U1306, Unité de Biologie et génétique de la paroi bactérienne, Paris, France. Department of Microbiology, Tumor and Cell Biology, Karolinska Institutet, Stockholm, Sweden. Université Sorbonne Paris Nord and Université Paris Cité, Inserm, INRAE, CNAM, Centre of Research in Epidemiology and StatisticS (CRESS), Nutritional Epidemiology Research Team (EREN), Bobigny, France. Mucosal Inflammation and Immunity, Department of Immunology, Institut Pasteur, Paris, France. Université Paris Cité, Institut Cochin, INSERM U1016, CNRS UMR 8104, Paris, France. Center for Cancer Immunotherapy, INSERM U932,
PSL Research University, Institut Curie, Paris, France. The Irish Longitudinal Study on Ageing, School of Medicine, Trinity College Dublin, Dublin, Ireland. Université Paris Cité, Imagine Institute, Laboratory of Inflammatory Responses and Transcriptomic Networks in Diseases, Atip-Avenir Team, INSERM UMR1163, Paris, France. Cytokine Signaling Unit, INSERM U1224, Institut Pasteur, Paris, France. Institut Pasteur, Université Paris Cité, INSERM U1222, Humoral Immunology Unit, Paris, France. School of Biochemistry and Immunology, Trinity Biomedical Sciences Institute, Trinity College Dublin, Dublin, Ireland. School of Medicine, Trinity College Dublin, Dublin, Ireland. Université Paris Cité, Institut Imagine, Inserm U1163, Paris, France. University of Paris Cité, Paris, France. Laboratory of Immunogenetics of Pediatric Autoimmune Diseases, Imagine Institute, INSERM UMR 1163, Paris, France. Immunoregulation Unit, Institut Pasteur, Université Paris Cité, Paris, France. Institut Roche, Paris, France. Institut Pasteur, Université de Paris, Functional Genetics of Infectious Diseases Unit, Department of Global Health, Paris, France. Virus and Immunity Unit, Institut Pasteur, Université de Paris Cité, Paris, France. Computational Systems Biomedicine Lab, Institut Pasteur, Université Paris Cité, Paris, France. UTechS Photonic Biolmaging/C2RT, Institut Pasteur, Université Paris Cité, Paris, France. Vaccines Innovation Laboratory, Institut Pasteur, Université de Paris Cité, Paris, France. Université Paris Cité, Institut de Recherche Saint Louis, EMiLy, INSERM UMR S1160, Paris, France. Investigational Clinical Service and Access to Research Bio-Resources (ICAReB), Institut Pasteur, Paris, France. Institut Pasteur, Université Paris Cité, CNRS UMR 3691, Imaging and Modeling Unit, Paris, France.
Methods
Human samples
Human samples came from the Milieu Intérieur cohort, which was approved by the Comité de Protection des Personnes-Ouest 6 on 13 June 2012, and by the French Agence Nationale de Sécurité du Médicament (ANSM) on 22 June 2012. The study is sponsored by Institut Pasteur (Pasteur ID-RCB Number: 2012-A00238-35) and was conducted as a single-centre interventional study without an investigational product. The original protocol was registered under Clinical Trials.gov (study no. NCT01699893). The samples and data used in this study were formally established as the Milieu Intérieur biocollection (NCT03905993), with approvals by the Comité de Protection des Personnes-Sud Méditerranée and the Commission Nationale de l’Informatique et des Libertés (CNIL) on 11 April 2018. Donors gave written informed consent. The 1,000 donors of the Milieu Interieur cohort were recruited by BioTrial to be composed of healthy individuals of the same genetic background (Western European) and to have 100 women and 100 men from each decade of life between 20 and 69 years of age. Donors were selected based on various inclusion and exclusion criteria that were previously described . In brief, donors were required to have no history or evidence of severe, chronic or recurrent pathological conditions, neurological or psychiatric disorders, alcohol abuse, recent use of drugs, recent vaccine administration and recent use of immune modulatory agents. To avoid the influence of hormonal fluctuations in women, pregnant and peri-menopausal women were not included. To avoid genetic stratification in the study population, the recruitment of donors was restricted to individuals whose parents and grandparents were born in Metropolitan France. Additionally, we formally checked how the genetic background of the donors could affect cytokine levels by performing association tests between the first 20 genetic principal components out of the PCA on the individual genotypes and each of the induced cytokines in each stimulation. Although PC1 had significant association with IL-10 (Benjamini-Yekutieli adjusted value ), we found that the first 20 principal components showed no significant associations with cytokine responses at the value threshold (Benjamini-Yekutieli adjusted value ) we use throughout this study. To illustrate the homogeneity of the genetic structure of the 1,000 individuals of the Milieu Intérieur cohort, a PCA was performed with EIGENSTRAT on 261,827 independent SNPs and 1,723 individuals, which include the 1,000 Milieu Intérieur donors together with 723 individuals from a selection of 36 populations originating from North Africa, the Near East, as well as western and northern Europe is shown, similarly to what was previously performed . PC1 versus PC2, PC1 versus PC3 and PC2 versus PC3 are displayed as well as a bar plot of the variance explained by the first 20 components of the PCA (Extended Data Fig. 9b). Unless otherwise stated, all displayed results have been performed on the 955 individuals of the cohort who gave consent to share their data publicly, in order to ensure easy reproducibility of the results.
TruCulture whole-blood stimulations
TruCulture whole-blood stimulations were performed in a standardized way as previously described . Briefly, tubes were prepared in batch with the indicated stimulus, resuspended in a volume of 2 ml buffered medium, and maintained at until time of use. Stimuli used in this study were LPS derived from E. coli O111:B4 (Invivogen), E. coli O111:B4 (Invivogen), C. albicans (Invivogen), vaccine-grade poly I:C (Invivogen), live Bacillus Calmette-Guerin (Immucyst, Sanofi Pasteur), live H1N1 attenuated influenza A/PR8 (IAV) (Charles River), SEB (Bernhard Nocht Institute), CD3 + CD28 (R&D Systems and Beckman Coulter), and cytokines TNF (Miltenyi Biotech), IL-1 (Peprotech) and IFN (Boehringer Ingelheim). One millilitre of whole blood was distributed into each of the prewarmed TruCulture tubes, inserted into a dry block incubator, and maintained at room air for 22 h . At the end of the incubation period, tubes were opened, and a valve was inserted
in order to separate the sedimented cells from the supernatant and to stop the stimulation reaction. Liquid supernatants were aliquoted and immediately frozen at until the time of use.
Luminex multi-analyte profiling
Supernatants from TruCulture tubes were analysed by Rules Based Medicine using the Luminex xMAP technology. Samples were analysed according to the Clinical Laboratory Improvement Amendments (CLIA) guidelines. The lower limit of quantification (LLOQ) was determined as previously described , and is the lowest concentration of an analyte in a sample that can be reliably detected and at which the total error meets CLIA requirements for laboratory accuracy. The 13 cytokines (CXCL5, CSF2, IFN , IL-1 , TNF, IL-2, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12p70, IL-13, IL-17 and IL-23), which were measured in this study, were selected to best capture broad immune response variability. Among 109 analytes initially tested, these are the ones that captured the maximum variance following stimulation with the 4 stimuli (LPS, BCG, poly I:C and SEB) that showed the most distinct immune responses among 27 stimuli tested on a subset of 25 individuals of the Milieu Interieur cohort.
Principal components analysis
The PCA in Extended Data Fig. 1 was created in R 4.2.1 using the FactoMineR 2.8 package. The data were log-transformed and by default scaled to unit and missing values were imputed by the mean of the variable.
Cytokine induction visualization
Cytokines were considered induced if the absolute value of their median concentration in the stimulated condition was -fold of their concentration in the null condition. Standardized log mean differences were computed as follows (mean(concentration of the cytokine in the stimulated condition) – mean(concentration of the cytokine in the null condition))/s.d.((concentration of the cytokine in the stimulated condition) – (concentration of the cytokine in the null condition)) and the corresponding heat map was generated with heatmaply 1.0.0 and dendextend 1.13.12 with ‘complete’ clustering method and ‘euclidean’ distance in R version 4.2.1.
Identification of CD3 + CD28 non-responders
Levels of cytokines that we focused on are low to undetectable in the non-stimulated condition, and cytokine induction is generally homogenous within this healthy population of individuals, with no clear distinguishable groups of responders and non-responders, except for anti-CD3 + CD28 stimulation (Extended Data Fig. 2). For the anti-CD3 + CD28 stimulation, we identified through -means clustering a group of 705 individuals that responded to the stimulation and a group of 295 individual did not. This lack of response of 295 individuals is explained by a Fc RIIA polymorphism (rs1801274) that was previously described as preventing response to this anti-CD3 + CD28 stimulation (Extended Data Fig. 9). All statistical analyses on anti-CD3 + CD28 stimulations in this study were thus performed on the responders only.
eCRF criteria association tests with induced cytokines
Variables were extracted from the eCRF filled by the donors with the help of a physician. To limit biases in associations, categorical variables had to have at least 5% of individuals in at least half of the categorical levels to be considered for association tests. Such categoricalvariables or numerical ones were tested for associations with the log-transformed induced cytokine levels in each stimulation through LRTs, using age, sex and the technical variable batchID (corresponding to two batches of TruCulture tubes produced at different periods of time) as covariates: the LRT compared the models lm(cytokine ~ variable + age + sex + batchID) with Im(cytokine ~ age + sex + batchID), followed by Benjamini-Yekutieli multiple testing correction applied
to the whole heat maps, so taking into account the tests made for the 136 CRF variables with all the induced cytokines in a specific stimulation. For Extended Data Figs. 4 and 5, the models compared were Im(cytokine ~ age + sex + batchID) with Im(cytokine ~ sex + batchID) for age and (cytokine sex + batchID) with (cytokine age + batchID) for sex. values of association tests were represented using ggplot2 3.2.1 in R 3.6.0. Adjusted values on the box plots were computed with the wilcox.test function, correcting for multiple testing. Versions of the box plots and scatter plots made on the residuals after regression on age, sex and batchID are displayed on Extended Data Fig. 6d-f.
Effect size plots
Linear regression models were estimated in each stimulation using the log-transformed induced cytokine levels as outcome and age, sex, batchID, and the covariates of interest (for example, smoking status) as predictor variables. Interactions with the covariates of interest were considered when indicated. Exponential of the regression coefficient estimates, and their confidence interval were plotted. When the covariate of interest is of categorical nature, each level of the variable is shown independently, considering the one specified as the reference. When the value of the -test testing if the coefficient estimate is different from zero is <0.01, it is plotted in black, otherwise it is plotted in grey. If the LRT comparing the regression with and without the variable of interest in the model with a Chi-square test is significant with a Benjamini-Yekutieli adjusted value , a red star is added above the effect size value and interval.
Cell subset association tests
Acquisition of flow cytometry data was detailed previously . Association tests with log-transformed values of induced cytokines in each stimulation were performed as for the eCRF criteria association tests using log-transformed raw counts of cell subsets for each donor. values of significance are indicated with asterisks as follows: ; **P < 0.01; *** .
DNA methylation association tests
CpG methylation profiles were generated using the Infinium MethylationEPIC BeadChip (Illumina) on genomic DNA treated with sodium bisulfite (Zymo Research) for 958 individuals of the Milieu Intérieur cohort as described . Associations between the DNA methylation levels for the CpG sites located within 1 Mb of each cytokine gene transcription start site (TSS) and the levels of log-transformed induced cytokines in each stimulation, adjusting for age, sex, technical variable batchID and major immune cell population counts for each stimulation, were tested through LRT and identified CpG sites weakly associated with IL-17 in LPS (cg09582880), IL-2 in C. albicans (cg17850932 and cg25065535) and IL-8 in influenza (cg16468729) stimulations (FDR adjusted value of LRT < 0.05) (Extended Data Fig. 10). These effects were mild compared with the identified associated genetic variants and the other associated variables identified in this study but are considered in the final global models (Fig. 5). CpG sites with DNA methylation levels that are directly affected by smoking have been selected as described .
Heat maps showing effects of covariates
To test if the levels of some covariates, such as cell subsets, plasma proteins or DNA methylation probes, could modify the observed association of a variable, such as smoking status, with the log-transformed induced levels of cytokines in each stimulation, we compared with a LRT for each cytokine in each stimulation the model considering both the variable of interest and the covariate of interest (with interactions) plus the usual covariates age, sex and the technical covariate batchID, with a model containing all the covariates but not the variable of interest, followed by a Benjamini-Yekutieli multiple testing adjustment on the whole heat maps. For example, for Fig. 3a, the variable of interest was smoking status and the covariate of interest
was each cell subset, so we compared (cytokine smoking status cell subset + age + sex + batchID) with lm(cytokine cell subset + age + sex + batchID). When the LRT is significant, it means adding the variable of interest to the model improves the fit to the cytokine levels. For BMI-related variables, these do not improve the fit to both IL-2 and CXCL5 when T cell subsets are passed as covariates, showing that our approach is powered to identify cellular associations with effects on CXCL5 levels when present.
pQTL analyses
Protocols and quality-control filters for genome-wide SNP genotyping are detailed in ref. 3 . In brief, the 1,000 Milieu Interieur donors were genotyped on both the HumanOmniExpress-24 and the HumanExome-12 BeadChips (Illumina), which include 719,665 SNPs and 245,766 exonic SNPs, respectively. Average concordance rate between the two genotyping arrays was . The final dataset included 732,341 high-quality polymorphic SNPs. After genotype imputation and quality-control filters, 11,395,554 SNPs were further filtered for minor allele frequencies > 5%, yielding a dataset composed of 1,000 donors and 5,699,237 SNPs for pQTL mapping. pQTL analyses were performed using the MatrixEQTL 2.2 R package. SNPs were considered as cis-acting pQTLs if they were located within 1 Mb of the TSS of the gene, otherwise they were considered as trans-pQTLs. Protein expression data of the 1,000 individuals were log-transformed prior to pQTL analysis. Bonferonni correction for multiple testing (adjusted value ) was applied to the results. We used detection thresholds of for cis-pQTLs and for trans-pQTLs and age, sex and the technical covariate batchID, as well as a main associated cell subset (monocytes for LPS, E. coli and C. albicans stimulations, CD4pos for SEB, CD8posEMRA for anti-CD3 + CD28, CD45pos for BCG, cDC3 for poly I:C, CD3pos for influenza, CD45pos for TNF, none for null, IL-1 and IFN ) as covariates. SNPs associated with IFN in IFN stimulation, with IL-1 in IL-1 stimulation and with TNF in TNF stimulation were disregarded because each of these cytokines were respectively added to the TruCulture tubes and thus do not reflect endogenous secretion. To test the novelty of our pQTL results, we studied the SomaLogic plasma protein pQTL database , for both cis- and trans-pQTLs listed in Table 1. This dataset allowed testing associations for CXCL5, IFN , IL-1 , IL-2, IL-6, IL-10 and IL-12a. Significant associations were identified between the variants rs352045 (cis), rs2393969 (trans), rs10822168 (trans) and the protein CXCL5 (respective FDR adjusted , and ), between rs35345753 (cis), rs62449491 (cis) and IL-6 (respective FDR adjusted and ) and between rs3775291(trans) and IL-12A (FDR adjusted ). To test associations for SNPs in linkage disequilibrium with the SNPs originally referenced in Table 1, we used a dataset of linkage disequilibrium from the ensemble database with similar ancestries as the Milieu Intérieur cohort (1000GENOMES:phase_3:CEU: Utah residents with Northern and Western European ancestry). To be inclusive, SNPs with a were selected as associated alleles and underwent the same analysis as the one performed with the SNPs of reference. SNPs that came out as significant are those in linkage disequilibrium with the SNP referenced in Table 1 that is significantly associated with the corresponding protein. In addition, we also screened eQTL results. We compared our pQTL results with the eQTLs reported in our previous work based on nanostring transcriptomic data for common cytokines (CSF2, IFN , IL-1 , TNF, IL-2, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12p70, IL-13, IL-17 and IL-23) and stimulations (E.coli, C. albicans, influenza, BCG, and SEB) , which identified 2 main loci: the TLR1/6/10 locus and the CR1 locus. Association of variants referenced in Table 1 were found in the GTEx consortium database for rs1518110 and IL-10 (FDR adjusted ), for rs352045 (cis) and CXCL5 (FDR adjusted ) in whole blood and for rs143060887 (cis) and IL-12A (FDR adjusted ). Significant associations between rs352045 and CXCL5 and between rs1518110 and IL-10 were also found in the eQTLgen catalogue.
Computation of variance explained
For each stimulation, all the variables associated with at least one induced cytokine were considered to compute the percentage of each induced cytokine variance explained by each associated variable ( value ) with the R package relaimpo 2.2.3 and plotted with the R package ggplot2 3.2.1. The contribution averaged over orderings among regressors was computed using the Img type in the calc.relimp function of the relaimpo package. For this analysis log-transformed induced cytokine data and log-transformed raw counts of cell subsets were used, as well as data for cis- and trans-associated SNPs and methylation probes. For each stimulation, all associated cis-pQTLs (rs352045, rs143060887, rs62449491 and rs1518110 for LPS; rs352045 for anti-CD3 + CD28, rs352045, rs62449491 and rs113845942 for poly I:C; rs352045 and rs35345753 for influenza), and trans-pQTLs (rs3764613 for LPS; rs4833095 for E. coli; rs11936050 for SEB; rs1801274 for anti-CD3 + CD28; rs4833095, rs72636686 and rs10013453 for BCG; rs10779330 and rs11117956 for C. albicans; rs3775291 and rs10822168 for poly I:C), as well as methylation probes (cg09582880 for LPS; cg25065535 for C. albicans, cg17850932 for poly I:C and cg16468729 for influenza) and a main associated cell subset (monocytes for LPS, E. coli and C. albicans stimulations, CD4pos for SEB, CD8posEMRA for anti-CD3 + CD28, CD45pos for BCG, cDC3 for poly I:C, CD3pos for influenza) were considered in the models.
Reporting summary
Further information on research design is available in the Nature Portfolio Reporting Summary linked to this article.
Data availability
SNP array data can be accessed from the European Genome-Phenome Archive EGA under accession EGAS00001002460, the Infinium MethylationEPIC raw intensity data can be accessed via https://dataset. owey.io/doi/10.48802/owey.f83a-1042. Cytokine data are provided
in Supplementary Data 1 and eCRF data are provided in Supplementary Data 2. Source data are provided with this paper.
Code availability
All the scripts related to this study are available on Github https:// github.com/ViolaineSaint-Andre/ and have a tagged copy on Zenodo: https://doi.org/10.5281/zenodo.10198929.
41. Patterson, N., Price, A. L. & Reich, D. Population structure and eigenanalysis. PLoS Genet. 2, e190 (2006).
42. Behar, D. M. et al. The genome-wide structure of the Jewish people. Nature 466, 238-242 (2010).
43. Duffy, D. et al. Functional analysis via standardized whole-blood stimulation systems defines the boundaries of a healthy immune response to complex stimuli. Immunity 40, 436-450 (2014).
44. Shabalin, A. A. Matrix eQTL: ultra fast eQTL analysis via large matrix operations. Bioinformatics 28, 1353-1358 (2012).
Acknowledgements This programme is managed by the Agence Nationale de la Recherche. This work benefited from support of the French government’s Invest in the Future programme; reference ANR-10-LABX-69-01. A. Bertrand is a student from the FIRE PhD programme funded by the Bettencourt Schueller Foundation and the EURIP Graduate Program (ANR-17-EURE-0012).
Author contributions Conceptualization: M.L.A., L.Q.-M, D.D., V.S.-A. and E.P. Methodology: V.S.-A., A. Biton and D.D. Software: V.S.-A. and A. Biton Validation: V.S.-A., A. Biton and D.D. Formal analysis: V.S.-A. and A. Biton. Investigation: V.S.-A., B.C., C.P., A. Bertrand and D.D. Resources: M.R., J.B., E.P., L.Q.-M. and D.D. Data curation: V.S.-A.,V.R., B.C., E.P. and D.D. Writing, original Draft: V.S.-A. and D.D. Writing, review and editing: V.S.-A, D.D., A. Biton, M.R., J.B., E.P. and L.Q.-M. Visualization: V.S.-A. and D.D. Supervision: D.D., L.Q.-M., V.S.-A. and E.P. Project administration: D.D. Funding acquisition: M.L.A., L.Q.-M., D.D. and the Milieu Interieur Consortium.
Competing interests M.L.A. is an employee of Octant Biosciences, CA, USA. D.D. previously received grant support from Rules Based Medicine. The other authors declare no competing interests.
Additional information
Supplementary information The online version contains supplementary material available at https://doi.org/10.1038/s41586-023-06968-8.
Correspondence and requests for materials should be addressed to Violaine Saint-André or Darragh Duffy.
Peer review information Nature thanks Sam Janes and the other, anonymous, reviewer(s) for their contribution to the peer review of this work. Peer review reports are available. Reprints and permissions information is available at http://www.nature.com/reprints.
Extended Data Fig. 1 | Principal component analysis (PCA) of individuals for the 13 cytokines in the 12 stimulation conditions. Each dot represents one individual in a specified stimulation condition. Contributions of the cytokines to the first two dimensions are represented with arrows.
Article
Extended Data Fig. 2 | Heatmaps showing cytokine concentration levels in each stimulation condition for the 1,000 individuals of the Milieu Intérieur cohort. Hierarchical clustering is performed with Ward method and euclidean distance on both lines and columns.
Extended Data Fig. 3 | Heatmaps showing-log10(BY adj. pval of likelihood ratio test) of association for the eCRF variables associated with at least one cytokine in each stimulation considering smoking status and age
interactions in the compared models. These are coloured according to the colour key on the side of each heatmap and stars are shown depending on the strength of association ( ).
Article
Extended Data Fig. 4 | Heatmaps showing associations of age and sex variables corrected for sex or age respectively and for batchId, on induced cytokines in each stimulation condition. Significance of the BY adj-pval likelihood ratio test is marked with stars (*P<0.05;**P<0.01; ***P<0.001).
Extended Data Fig. 5| Effect of sex and age on on induced cytokines.
Two-sided effect size plots made from independent individuals with 0.95 confidence interval for sex (a) and age (b) corrected for age or sex respectively and batchId, on induced cytokines in each stimulation condition
for the 1,000 individuals of the Milieu Interieur cohort. Significant effect sizes are in black, others are in grey. Significance of the BY adj-pval likelihood ratio test is marked with stars (*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001).
Extended Data Fig. 6 | Smoking effect on innate and adaptive immune responses, represented by LPS and CD stimulations respectively and same plots on residuals, after regression on age, sex and batchid.
following E. coli and LPS stimulations (d) or of IL-2 and IL-13 following SEB and anti-CD3 + CD28 stimulations (e) after regression on age, sex and batchId variables. Boxplots represent independent individuals. The centre line shows the median, hinges represent the 25th and 75th percentiles, and whiskers extend from the hinge to the largest or smallest value no further than the 1.5 interquartile range.Significance of two-sided Wilcoxon Rank Sum tests adjusting for multiple comparisons is indicated with stars above the boxes on the left (between never and past smokers), in the middle (between never and current smokers) and on the right (between past and current smokers) (N.S, not significant; . -values are from left to right, for CXCL5 in E.coli: 0.38, 7.1e-10 and 9.9e-07; for CXCL5 in LPS: 0.34, 7.5e-12 and 5.6e-08; for IL-2 in SEB:1.4e-03,1.2e-07 and 4.2e-02 and for IL-2 in anti-CD3 + CD28: and , CXCL5 residuals following E.coli or LPS stimulation or IL-2 and IL-13 concentrations following SEB or anti-CD3 + CD28 stimulation versus the numbers of years smoking for current smokers (red) or past smokers (blue). Grey areas depict the 0.95 confidence intervals of the linear regression lines.
a
Extended Data Fig. 7| Effect of CMV status on induced cytokines is modified by blood cell subsets and effect of smoking on induced cytokines is modified by specific CpGs associated with induced levels of IL2 following
SEB stimulation. a, Heatmap showing associations of the cytomegalovirus (CMV) serostatus with each induced cytokine following SEB stimulation, with either no cellular covariate (top line) or each of 76 cell subsets passed as covariates in the models. Significance of the BY adj-pval likelihood ratio test
b
is marked with stars ( ).b, Heatmap showing associations of the smoking status with each induced cytokine following SEB stimulation when either no methylation probe (top line) or each individual methylation probe associated with IL-2 concentration levels in SEB stimulation is passed as a covariate in the models. Significance of the BY adj-pval likelihood ratio test is marked with stars ( ).
Extended Data Fig. 8|Smoking status and SNPs interactions. a, Heatmaps showing -log10(BY adj.pval of likelihood ratio test) of interactions between genetic variants listed in Table 1 and smoking status for each induced cytokine following BCG stimulation considering age, sex and batchId as covariates. These are colored according to the color key on the side of the heatmap and stars are shown depending on the strength of association. , .b, Two-sided effect size plot made representing independent individuals with 0.95 confidence interval for the interaction of the SNP rs72636686 with the smoking status, corrected for age, sex and batchId,
on induced cytokines following BCG stimulation. Significant effect sizes ( ) are in black, others are in grey. Those that also have BY adj.pval of the likelihood ratio test are labelled with a red star. c, Boxplot representing independent individuals for IL8 levels depending on the genotype for rs72636686 and the smoking status. The centre line shows the median, hinges represent the 25th and 75th percentiles, and whiskers extend from the hinge to the largest or smallest value no further than the 1.5 interquartile range. Significance of two-sided Wilcoxon rank sum tests adjusting for multiple comparisons are indicated above the compared data.
Extended Data Fig. 9 | IL- 2 protein levels depending on Fc RIIA polymorphism rs1801274 and genetic PCA showing homogeneity of the genetic background of Milieu Intérieur individuals. a, Boxplots representing independent individuals for IL- 2 concentration levels depending on the genotype of the donors for the rs1801274 genetic variant before and after K-means clustering (2 groups) selection of responders. The centre line shows the median, hinges represent the 25th and 75th percentiles, and whiskers extend from the hinge to the largest or smallest value no further than the 1.5 interquartile range. Significance of two-sided Wilcoxon rank sum tests adjusting for multiple comparisons is indicated above the boxes
(N.S, not significant; ). -values are from left to right on the top boxplot: and and on the bottom boxplot: <2.22e-16, 0.35 and 0.15.b, PCA performed on 261,827 independent SNPs and 1,723 individuals, which include the 1,000 MI donnors together with 723 individuals from a selection of 36 populations from North Africa, the Near East, as well as western and northern Europe. PC1 versus PC2 (top left), PC1 versus PC3 (bottom left) and PC2 versus PC3 (top right) are displayed as well as a barplot (bottom right) of the variance explained by the first 20 components of the PCA.
Article
a
Stimulus
mepQTL
LPS
IL17(cg09582880*)
C.albicans
IL2(cg17850932*, cg25065535*)
Influenza
IL8(cg16468729*)
Extended Data Fig. | Association of DNA methylation probes with their cognate cytokines. a, DNA methylation probes located within 1 Mb of the TSS of each cytokine that show associations (Benjamini-Hochberg false discovery rate adj-pval of likelihood ratio test <0.05) with the concentration levels of these
cytokines in the specified stimulation condition ( ). b, Plots showing the corresponding concentration levels depending on the methylation levels of the probes. Adj- values of the linear regressions and -statistics of two-sided Pearson correlations are reported on each graph.
natureportfolio
Corresponding author(s): Violaine Saint-Andre & Darragh Duffy
Last updated by author(s): Oct 19, 2023
Reporting Summary
Nature Portfolio wishes to improve the reproducibility of the work that we publish. This form provides structure for consistency and transparency in reporting. For further information on Nature Portfolio policies, see our Editorial Policies and the Editorial Policy Checklist.
Statistics
For all statistical analyses, confirm that the following items are present in the figure legend, table legend, main text, or Methods section.
Confirmed
X The exact sample size ( ) for each experimental group/condition, given as a discrete number and unit of measurement
A statement on whether measurements were taken from distinct samples or whether the same sample was measured repeatedly
X
The statistical test(s) used AND whether they are one- or two-sided
Only common tests should be described solely by name; describe more complex techniques in the Methods section.
X A description of all covariates tested
A description of any assumptions or corrections, such as tests of normality and adjustment for multiple comparisons
X
A full description of the statistical parameters including central tendency (e.g. means) or other basic estimates (e.g. regression coefficient) AND variation (e.g. standard deviation) or associated estimates of uncertainty (e.g. confidence intervals)
X
For null hypothesis testing, the test statistic (e.g. ) with confidence intervals, effect sizes, degrees of freedom and value noted Give values as exact values whenever suitable.
For Bayesian analysis, information on the choice of priors and Markov chain Monte Carlo settings
For hierarchical and complex designs, identification of the appropriate level for tests and full reporting of outcomes
X Estimates of effect sizes (e.g. Cohen’s , Pearson’s ), indicating how they were calculated
Our web collection on statistics for biologists contains articles on many of the points above.
Software and code
Policy information about availability of computer code
Data collection
Luminex xMAP technology software
FlowJo (Treestar)
Illumina Infinium MethylationEPIC BeadChip
Illumina HumanOmniExpress-24 and the HumanExome-12 BeadChips
Data analysis
package relaimpo 2.2.3
R package ggplot2 3.2.1 (R 3.6.0)
MatrixEQTL 2.2 R package
heatmaply 1.0.0 and dendextend 1.13.12 with “complete” clustering method and “euclidien” distance in (R 3.6.0)
R 4.2.1 using FactoMineR 2.8
Data
Policy information about availability of data
All manuscripts must include a data availability statement. This statement should provide the following information, where applicable:
Accession codes, unique identifiers, or web links for publicly available datasets
A description of any restrictions on data availability
For clinical datasets or third party data, please ensure that the statement adheres to our policy
SNP array data can be accessed from the European Genome-Phenome Archive EGA under accession EGAS00001002460, the Infinium MethylationEPIC raw intensity data can be accessed via the following link: https://dataset.owey.io/doi/10.48802/owey.f83a-1042, cytokine data is in Supplementary Data 1 and eCRF data is in Supplementary Data 2.
Human research participants
Policy information about studies involving human research participants and Sex and Gender in Research.
Reporting on sex and gender
The cohort was specifically designed to be equally balanced in terms of sex, 500 men and 500 women who were also stratified by age (20-69 years old). Sex (as opposed to gender) was confirmed by genetic chromosome analysis. For identification of environmental effects on cytokine responses we corrected for both age and sex. We also report specific sex effects on cytokine responses.
Population characteristics
The 1,000 donors of the Milieu Interieur cohort were recruited by BioTrial (Rennes, France) to be composed of “healthy” individuals of the same genetic background (Western European) and to have 100 women and 100 men from each decade of life, between 20 and 69 years of age. Donors were selected based on various inclusion and exclusion criteria that were previously described (Thomas et al., 2015). Briefly, donors were required to have no history or evidence of severe/chronic/ recurrent pathological conditions, neurological or psychiatric disorders, alcohol abuse, recent use of drugs, recent vaccine administration, and recent use of immune modulatory agents. To avoid the influence of hormonal fluctuations in women, pregnant and peri-menopausal women were not included. To avoid genetic stratification in the study population, the recruitment of donors was restricted to individuals whose parents and grandparents were born in Metropolitan France.
Recruitment
Human samples came from the Milieur Intérieur cohort, and were recruited by BioTrial (Rennes, France) during September 2011-July 2012. The study is sponsored by Institut Pasteur (Pasteur ID-RCB Number: 2012-A00238-35) and was conducted as a single center interventional study without an investigational product. The original protocol was registered under ClinicalTrials.gov (study# NCT01699893). The samples and data used in this study were formally established as the Milieu Intérieur biocollection (NCT03905993), with approvals by the Comité de Protection des Personnes – Sud Méditerranée and the Commission Nationale de I’Informatique et des Libertés (CNIL) on April 11, 2018. Donors were defined as healthy based on inclusion/exlcusion criteria previously described in Thomas et al, Clinical Immunology 2015.
Ethics oversight
The study was approved by Comité de Protection des Personnes – Ouest 6 on June 13th, 2012, and by the French Agence Nationale de Sécurité du Médicament (ANSM) on June 22nd, 2012.
Note that full information on the approval of the study protocol must also be provided in the manuscript.
Field-specific reporting
Please select the one below that is the best fit for your research. If you are not sure, read the appropriate sections before making your selection.
Life sciences Behavioural & social sciences Ecological, evolutionary & environmental sciences
For a reference copy of the document with all sections, see nature.com/documents/nr-reporting-summary-flat.pdf
Life sciences study design
All studies must disclose on these points even when the disclosure is negative.
Sample size
The original sample size of the Milieu Interieur cohort was calculated to have sufficient power for strong to intermediate genetic effects. For this particular study no specific sample size was calculated and all available donors were included in each analysis step. Unless otherwise stated, all displayed results have been performed on the 956 individuals of the cohort who gave consent to share their data publicly in order to ensure easy reproducibility of the results
Data exclusions
For the CD3+CD28 stimulation, we identified through k -means clustering a group of 705 individuals that responded to the stimulation and a group of 295 individual did not. This lack of response of 295 individuals is explained by a FcүRIIA polymorphism (rs1801274) that was previously described as preventing response to this CD3+CD28 stimulation (Stein et al., Genes and Immunity, 2018) (Extended Data Fig. 9). All statistical analyses on CD3+CD28 stimulations in this study were thus performed on the 705 responders only.
Replication
Due to the specific nature of the cohort and associated data sets replication has not been performed.
Reporting for specific materials, systems and methods
We require information from authors about some types of materials, experimental systems and methods used in many studies. Here, indicate whether each material, system or method listed is relevant to your study. If you are not sure if a list item applies to your research, read the appropriate section before selecting a response.
Materials & experimental systems
Methods
n/a
Involved in the study
n/a
Involved in the study
X Antibodies
X
Eukaryotic cell lines
Palaeontology and archaeology
MRI-based neuroimaging
Antibodies
Antibodies used
Validation
Supernatants from TruCulture tubes were analyzed by Rules Based Medicine (Austin, Texas, US) using the Luminex xMAP technology. Samples were analyzed according to the Clinical Laboratory Improvement Amendments (CLIA) guidelines. The lower limit of quantification (LLOQ) was determined as previously described (Duffy et al., Immunity 2014), and is the lowest concentration of an analyte in a sample that can be reliably detected and at which the total error meets CLIA requirements for laboratory accuracy. Information on the antibody clones used in the assay is the propriety of Rules Based Medicine.
Validation of each antibody pair used in the Luminex assay has been performed by Rules Based Medicine in respect of CLIA guidlines and testing for specificity, sensitivity and cross-reactivity.
Clinical data
Policy information about clinical studies
All manuscripts should comply with the ICMJE guidelines for publication of clinical research and a completed CONSORT checklist must be included with all submissions.
Clinical trial registration
NCT01699893, NCT03905993
Study protocol
Clinical trials.gov : NCT01699893, NCT03905993
Data collection
Donors were recruited by BioTrial (Rennes, France) during September 2011-July 2012. Data has been generated from these samples since 2012.
Outcomes
Translational Immunology Unit, Department of Immunology, Institut Pasteur, Université Paris Cité, Paris, France. Institut Pasteur, Université Paris Cité, Bioinformatics and Biostatistics Hub, Paris, France. Cytometry and Biomarkers UTechS, Center for Translational Research, Institut Pasteur, Université Paris Cité, Paris, France. DATACTIX, Paris, France. Frontiers of Innovation in France. Institute of Environmental Medicine, Karolinska Institutet, Stockholm, Sweden. Department of Medical Epidemiology and Biostatistics, Karolinska Institutet, Stockholm, Sweden. Octant Biosciences, San Francisco, CA, USA. Chair Human Genomics and Evolution, Collège de France, Paris, France. *A list of authors and their affiliations appears at the end of the paper. e-mail: violaine.saint-andre@pasteur.fr; darragh.duffy@pasteur.fr
فرنسا.