التدهور الوظيفي السريع لخلايا القاتل الطبيعي بعد دخول الورم يحد من المناعة المضادة للورم

النتائج

تظهر خلايا NK تغييرات في الترانسكريبتوم بسرعة بعد دخول الورم

ثم حددنا نسبة و الخلايا داخل كل مجموعة لتوفير سياق للوقت الذي قضاه داخل بيئة الورم الدقيقة لكل مجموعة فرعية (الشكل 1C-E). كشفت هذه البيانات عن تدرج في نسبة الخلايا KR+ عبر مجموعات NK، حيث تتكون مجموعة NK_1 تقريبًا بالكامل من خلايا KG+ ومجموعة NK_5 في الطرف الآخر، التي تتكون من حوالي الخلايا. أظهر التحليل الإضافي لمجموعة NK_cycling أن الخلايا الدورية يمكن العثور عليها في جميع مجموعات خلايا NK/ILC/NKT، مما يشير إلى أن هذه لا تشكل نمطًا متميزًا (الشكل التوضيحي التكميلي 1K). ومع ذلك، من الجدير بالذكر أن NK_5 كانت غنية بشكل خاص بين خلايا NK الدورية، مما يشير إلى أن بعض خلايا NK المحتفظ بها في الورم قد تتوسع في الموقع (الشكل التوضيحي التكميلي 1L). لترتيب التغيرات النسخية التي تحدث داخل خلايا NK بعد دخولها الورم، قمنا بإجراء تحليل مسار زمني زائف، مستندًا إلى NK_1 حيث كانت تحتوي على أعلى نسبة من خلايا NK التي دخلت الورم مؤخرًا. أبرزت هذه التحليلات مجموعة NK_5 كحالة نهائية للمسار (الشكل 1F، G). وبالمثل، أشار تجريد الرسم القائم على التقسيم (PAGA) لرسم اتصال المجموعات (الشكل 1H) إلى أن المسار الرئيسي لمصير خلايا NK الورمية يتقدم من NK_1 إلى NK_2 ثم إلى توقيع NK_5 النسخي.

التعبير التفاضلي عن CD11b و CD49a يلتقط التغيرات الزمنية في نمط خلايا NK

تفقد خلايا NK بسرعة الوظائف الأساسية الفعالة بعد دخولها الورم

بعد أن حددنا كيفية التعرف على التغيرات الزمنية في حالة خلايا NK من خلال مزيج من الوسم الضوئي وتحليل تعبير الإنتجرين، سعينا لفهم كيف تأثرت وظيفة خلايا NK بالوقت الذي قضته في بيئة الورم الدقيقة. للنظر في التفاعلات الخلوية المحتملة لحالات خلايا NK المختلفة التي تم تحديدها بطريقة غير متحيزة، استخدمنا CellChat. وركزت بشكل خاص على الخلايا النخاعية داخل البيئة المجهرية للورم نظرًا للأدلة على تأثير هذا المحور الخلوي على المناعة المضادة للورم (الشكل التوضيحي 7). حددت هذه التحليل عددًا من الروابط المحتملة التي اختلفت اعتمادًا على حالة خلايا NK، بما في ذلك عدد من التفاعلات المناعية المحفزة (Ifng، Ccl5، Il18) التي تشمل خلايا NK التي تم تجنيدها حديثًا، ولكن ليس تلك التي تم الاحتفاظ بها داخل الورم لعدة أيام. ومن الروابط الأخرى الملحوظة كانت الاستجابة المحتملة لحالة NK_5 لإشارات Il15 بالإضافة إلى ظهور تفاعلات مستقبلات مثبطة (مثل Cd244a:Cd48). بشكل جماعي، أبرز هذا التحليل غير المتحيز في السليكون الإمكانية لوجود اتصالات خلوية مختلفة تمامًا بين خلايا NK التي تم تجنيدها حديثًا وتلك المحتفظ بها في الورم.

تدفع آليات متعددة في TME تحويل خلايا cNK إلى حجرة خلايا NK CD49a + المحتفظ بها في الورم

الشكل 3 | تغير خلايا NK بسرعة إنتاج الكيموكينات والسيتوكينات والغرانزيم خلال 24 ساعة من دخول TME. تم استخدام تدفق الخلايا لتأكيد التغيرات في وظيفة خلايا NK المعزولة من أورام MC38 بعد 24 ساعة من تحويل الضوء. A نسبة خلايا NK التي تنتج CCL5 بعد إعادة التحفيز خارج الجسم، مع هيستوجرامات تمثيلية جنبًا إلى جنب مع التعداد ( ). B نسبة خلايا NK التي تنتج IFN بعد التحفيز خارج الجسم، مع هيستوجرامات تمثيلية جنبًا إلى جنب مع العد ). تقرير C عن mKate 2 في الاستخدام فنيكر تم تقييم الفئران المراسلين، مع خلايا T مقابل خلايا NK المعزولة من أورام MC38. تم عرض الرسوم البيانية التمثيلية ونسبة الخلايا الموجبة لـ mKate2. تم عرض الرسوم البيانية التمثيلية التي تظهر نسبة خلايا NK المنتجة (D) جرزيم A، (E) جرزيم C، (F) جرزيم B، (G) CD107a، (H) بيرفورين في أورام MC38 التي تم تحويلها ضوئيًا وتم تحليلها بعد 24 ساعة. تم تجميع البيانات من تجربتين مستقلتين. ) للجميع

التحليلات باستثناء تعبير CD107a حيث من تجربة مستقلة واحدة. رسم كاريكاتوري يوضح إعداد التجربة حيث تم عزل خلايا NK الموجبة لـ CD11b و CD49a من أورام MC38 باستخدام تقنية فرز الخلايا (FACS) وتم زراعتها مع خلايا الميلانوما B16-F10 التي تم معالجتها مسبقًا بصبغة الخلايا البنفسجية والتي تم صبغها بعد ذلك لقياس حيوية الخلايا. ج مقارنة قتل الخلايا المستهدفة بواسطة خلايا NK من حيث السمية الخلوية بين خلايا NK الموجبة لـ CD11b و CD49a التي تم فرزها باستخدام FACS. تم تحديد الأهمية بواسطة تحليل التباين ثنائي الاتجاه مع اختبار المقارنة المتعددة لشيداك (A و B و D-H) مقارنةً بالمتوسطات لخلايا Kaede Green+ CD11b+، أو بين المجموعات (J)، واختبار كروسكال-واليس مع اختبار المقارنة المتعددة لدن (C). تُعرض البيانات مع جميع نقاط البيانات الفردية بالإضافة إلى القيمة المتوسطة. SD. في جميع التجارب ‘ يحدد ورمًا واحدًا على فأر فردي، أي، تشير إلى 3 فئران كل منها يحتوي على ورم واحد.

الشكل 4 | آليات متعددة في البيئة المجهرية للورم تدفع تحويل خلايا cNK إلى حالة محتفظة بالورم CD49a+. دور TGF و HIF-1 تم التحقيق فيها في المختبر وفي الجسم الحي كآليات تعزز تمايز خلايا NK إلى الحالة المحتفظ بها في الورم والتي تتميز بتعبير CD49a ووظائف أساسية معطلة. رسم بياني عمودي يوضح نسبة خلايا NK الموجبة لـ CD11b و CD49a بعد 48 ساعة من الزراعة في RPMI مع IL-2/IL-15 مع إضافة TGF-. و/أو DiPGE رسم كاريكاتيري يلخص تصميم التجربة لعرقلة إنتاج الورم تم تطعيم فئران كايدي إما بـ MC38 ( ) أو MC38 (MC38 ) خلايا، تم تحويلها ضوئيًا في D12 وتم تحليلها بعد 48 ساعة. C وزن الورم. D تعداد خلايا NK لكل ملغ من الورم. E مخططات تحليل التدفق تظهر تعبير Kaede Green مقابل Kaede Red بواسطة خلايا NK. F نسبة خلايا NK التي تعبر عن علامة Kaede Red بعد 48 ساعة من التحويل الضوئي. G نسبة خلايا NK في مجموعات CD11b+CD49a-، CD11b- CD49a- و CD11b- CD49a+. H نسبة خلايا NK
الخلايا التي تنتج CCL5، IFN جرانزيم A، جرانزيم C بعد إعادة التحفيز خارج الجسم. رسم كاريكاتيري يلخص التصميم التجريبي لاستهداف Hifla داخل خلايا NK، باستخدام Ncr1. x Hif1 فأر كايدي (NK-HIF1 ضربة قاضية ) مقابل رفقاء القمامة السلبيين لـ cre (NK-HIF1 WT ) مزروعة بأورام MC38، تم تحويلها ضوئيًا في اليوم 12 وتم تحليلها بعد 48 ساعة. ج وزن الورم. ك تعداد خلايا NK لكل ملغ من الورم. ل مخططات تحليل التدفق تظهر تعبير Kaede الأخضر مقابل Kaede الأحمر بواسطة خلايا NK. م نسبة خلايا NK التي تعبر عن علامة Kaede الحمراء بعد 48 ساعة من التحويل الضوئي. ن نسبة خلايا NK في الفئات CD11b+ CD49a-، CD11b- CD49a- و CD11b CD49a+. O نسبة خلايا NK التي تنتج CCL5، IFN ، غرانزيم A، غرانزيم C بعد إعادة التحفيز خارج الجسم. تم تحديد الأهمية الإحصائية بواسطة غير المقترن اختبارات ( ) أو تحليل التباين ثنائي الاتجاه مع اختبار المقارنة المتعددة لشيداك لمقارنة متوسطات المجموعات ( ). يتم عرض البيانات مع جميع نقاط البيانات الفردية بالإضافة إلى القيمة المتوسطة +/- الانحراف المعياري.

بينما كان هناك زيادة متواضعة في عدد خلايا NK في الورم (الشكل 4 ك)، لم تكن هناك اختلافات في نسبة خلايا NK الإيجابية لـ KR، أو نسبة مجموعات خلايا NK، أو إنتاج CCL5، أو IFN. تم الكشف عن الجرانزيم A أو الجرانزيم C (الشكل 4L-O).

تظهر خلايا NK في سرطان القولون والمستقيم البشري فقدان الوظائف الفعالة

تعزيز إشارات IL-15 يدفع تشكيل مجموعة متميزة من خلايا NK السامة داخل الورم

أخيرًا، بحثنا عن طرق يمكن أن تمنع أو تعكس فقدان وظيفة خلايا NK التي تم imprintها بسبب الإقامة في البيئة المجهرية للورم، وبالتالي تدعم استجابات مضادة للأورام محسّنة. IL-15 يحفز تمايز وتنشيط كل من خلايا T وNK. تشير البيانات الأولية للمرضى إلى أن الاستجابة لمحفزات IL-15R مرتبطة بتوسع خلايا NK وخلايا T CD8+ وزيادة في IFN. الإنتاج. ومع ذلك، فإنه غير واضح كيف يعزز تحفيز IL-15R استجابات خلايا NK المضادة للورم أو إمكانية تجنيد خلايا NK إلى الأورام الصلبة. لتحديد ما إذا كان تعزيز إشارات IL-15 أدى إلى الحفاظ على وظائف خلايا NK التي تتعطل عادة بسبب التكيف مع البيئة المجهرية للورم (TME)، تم علاج الفئران الحاملة للأورام بمركبات IL-15:IL-15Ra، حيث أن هذه المركبات لها نشاط معزز بشكل كبير مقارنة بـ IL-15 المؤتلف وحده. قمنا باختبار هذه المركبات، التي تم إعطاؤها في اليوم السابع واليوم الثاني عشر من نمو الورم، سواء قبل أو بالتزامن مع التحويل الضوئي، في نماذج ورمية متعددة (الشكل 6A). أظهرت فئران BALB/c Kaede الحاملة لأورام CT26 تحكمًا كبيرًا في الورم مع العلاج (الشكل 6B). كشفت تحليل حجرة خلايا NK داخل الورم عن اختلافات ملحوظة في تعبير الإنتجرين بعد إعطاء مركبات IL-15:IL15Ra (الشكل 6C). بشكل مفاجئ، أدى العلاج إلى تعبير غالبية خلايا NK عن CD49a، ومع ذلك، لاحظنا أيضًا ظهور مجموعة CD49a+CD11b+ التي كانت بالكاد قابلة للاكتشاف في ضوابط PBS (الشكل 6D). لنسأل عما إذا كانت مركبات IL-15:IL-15Ra قد تسببت في ظهور خلايا CD49a+ CD11b+ بعد دخولها إلى الورم، أو إذا كانت هذه الخلايا قد تشكلت في المحيط ثم انتقلت إلى الورم، قمنا بتحويل الأورام ضوئيًا وقارنّا نسبة تعبير KR داخل مجموعات خلايا NK داخل الورم المختلفة. لم يتسبب العلاج في فرق كبير في النسبة الإجمالية لـ الخلايا في الورم (الشكل 6E). تحليل مجموعات خلايا NK المحددة بواسطة

نقاش

طرق

تصميم الدراسة

فئران

توليد Ifng فئران المراسلين

نماذج أورام الفئران

نقص الخلايا

إدارة IL-15:IL-15R المجمعات

نقل خلايا NK الطحالية

تسمية الصور لمكونات الورم

تفكيك الأنسجة

اختبارات في المختبر

تدفق الخلايا

عزل FACS

بناء مكتبة الخلايا المفردة وتسلسلها

معالجة تسلسل RNA أحادي الخلية

تحليل تسلسل RNA أحادي الخلية من نماذج أورام الفئران

تحليل تسلسل RNA من الأورام البشرية

التحليل الإحصائي

ملخص التقرير

توفر البيانات

References

1. Galon, J. et al. Type, density, and location of immune cells within human colorectal tumors predict clinical outcome. Science 313, 1960-1964 (2006).
2. Naito, Y. et al. CD8+ T cells infiltrated within cancer cell nests as a prognostic factor in human colorectal cancer. Cancer Res. 58, 3491-3494 (1998).
3. Azimi, F. et al. Tumor-infiltrating lymphocyte grade is an independent predictor of sentinel lymph node status and survival in patients with cutaneous melanoma. J. Clin. Oncol. 30, 2678-2683 (2012).
4. Herbst, R. S. et al. Predictive correlates of response to the anti-PD-L1 antibody MPDL3280A in cancer patients. Nature 515, 563-567 (2014).
5. Im, S. J. et al. Defining CD8+ T cells that provide the proliferative burst after PD-1 therapy. Nature 537, 417-421 (2016).
6. Utzschneider, D. T. et al. T cell Factor 1-Expressing Memory-like CD8(+) T Cells sustain the immune response to chronic viral infections. Immunity 45, 415-427 (2016).
7. Siddiqui, I. et al. Intratumoral Tcf1(+)PD-1(+)CD8(+) T cells with stemlike properties promote tumor control in response to vaccination and checkpoint blockade immunotherapy. Immunity 50, 195-211.e110 (2019).
8. Sade-Feldman, M. et al. Defining T cell states associated with response to checkpoint immunotherapy in melanoma. Cell 175, 998-1013.e1020 (2018).
9. Trinchieri, G. Biology of natural killer cells. Adv. Immunol. 47, 187-376 (1989).
10. Smyth, M. J. et al. Differential tumor surveillance by natural killer (NK) and NKT cells. J. Exp. Med. 191, 661-668 (2000).
11. Vivier, E., Tomasello, E., Baratin, M., Walzer, T. & Ugolini, S. Functions of natural killer cells. Nat. Immunol. 9, 503-510 (2008).
12. Kim, S., lizuka, K., Aguila, H. L., Weissman, I. L. & Yokoyama, W. M. In vivo natural killer cell activities revealed by natural killer celldeficient mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97, 2731-2736 (2000).
13. Bottcher, J. P. et al. NK cells stimulate recruitment of cDC1 into the tumor microenvironment promoting cancer immune control. Cell 172, 1022-1037.e1014 (2018).
14. Barry, K. C. et al. A natural killer-dendritic cell axis defines checkpoint therapy-responsive tumor microenvironments. Nat. Med. 24, 1178-1191 (2018).
15. Roberts, E. W. et al. Critical role for CD103(+)/CD141(+) dendritic cells bearing CCR7 for tumor antigen trafficking and priming of T cell immunity in melanoma. Cancer Cell 30, 324-336 (2016).
16. Salmon, H. et al. Expansion and activation of CD103(+) dendritic cell progenitors at the tumor site enhances tumor responses to therapeutic PD-L1 and BRAF inhibition. Immunity 44, 924-938 (2016).
17. Broz, M. L. et al. Dissecting the tumor myeloid compartment reveals rare activating antigen-presenting cells critical for T cell immunity. Cancer Cell 26, 638-652 (2014).
18. Spranger, S., Dai, D., Horton, B. & Gajewski, T. F. Tumor-residing Batf3 dendritic cells are required for effector cell trafficking and adoptive T cell therapy. Cancer Cell 31, 711-723.e714 (2017).
19. Gao, Y. et al. Tumor immunoevasion by the conversion of effector NK cells into type 1 innate lymphoid cells. Nat. Immunol. 18, 1004-1015 (2017).
20. Cortez, V. S. et al. SMAD4 impedes the conversion of NK cells into ILC1-like cells by curtailing non-canonical TGF-beta signaling. Nat. Immunol. 18, 995-1003 (2017).
21. McFarland, A. P. et al. Multi-tissue single-cell analysis deconstructs the complex programs of mouse natural killer and type 1 innate lymphoid cells in tissues and circulation. Immunity 54, 1320-1337.e1324 (2021).
22. Cortez, V. S. et al. Transforming growth factor-beta signaling guides the differentiation of innate lymphoid cells in salivary glands. Immunity 44, 1127-1139 (2016).
23. Lopes, N. et al. Tissue-specific transcriptional profiles and heterogeneity of natural killer cells and group 1 innate lymphoid cells. Cell Rep. Med. 3, 100812 (2022).
24. Friedrich, C. et al. Effector differentiation downstream of lineage commitment in ILC1s is driven by Hobit across tissues. Nat. Immunol. 22, 1256-1267 (2021).
25. Vivier, E. et al. Innate lymphoid cells: 10 years on. Cell 174, 1054-1066 (2018).
26. Spits, H. et al. Innate lymphoid cells-a proposal for uniform nomenclature. Nat. Rev. Immunol. 13, 145-149 (2013).
27. Walker, J. A., Barlow, J. L. & McKenzie, A. N. Innate lymphoid cellshow did we miss them? Nat. Rev. Immunol. 13, 75-87 (2013).
28. Gasteiger, G., Fan, X., Dikiy, S., Lee, S. Y. & Rudensky, A. Y. Tissue residency of innate lymphoid cells in lymphoid and nonlymphoid organs. Science 350, 981-985 (2015).
29. Dutton, E. E. et al. Peripheral lymph nodes contain migratory and resident innate lymphoid cell populations. Sci. Immunol. 4, eaau8082 (2019).
30. Zhang, J. et al. T-bet and Eomes govern differentiation and function of mouse and human NK cells and ILC1. Eur. J. Immunol. 48, 738-750 (2018).
31. Klose, C. S. et al. Differentiation of type 1 ILCs from a common progenitor to all helper-like innate lymphoid cell lineages. Cell 157, 340-356 (2014).
32. Di Censo, C. et al. Granzyme A and CD160 expression delineates ILC1 with graded functions in the mouse liver. Eur. J. Immunol. 51, 2568-2575 (2021).
33. Nixon, B. G. et al. Cytotoxic granzyme C-expressing ILC1s contribute to antitumor immunity and neonatal autoimmunity. Sci. Immunol. 7, eabi8642 (2022).
34. Li, Z. et al. In vivo labeling reveals continuous trafficking of TCF-1+ T cells between tumor and lymphoid tissue. J. Exp. Med. 219, e20210749 (2022).
35. Tomura, M. et al. Monitoring cellular movement in vivo with photoconvertible fluorescence protein “Kaede” transgenic mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 10871-10876 (2008).
36. Walker, J. A. et al. Polychromic reporter mice reveal unappreciated innate lymphoid cell progenitor heterogeneity and elusive ILC3 progenitors in bone marrow. Immunity 51, 104-118.e107 (2019).
37. Robinette, M. L. et al. Transcriptional programs define molecular characteristics of innate lymphoid cell classes and subsets. Nat. Immunol. 16, 306-317 (2015).
38. Chiossone, L. et al. Maturation of mouse NK cells is a 4-stage developmental program. Blood 113, 5488-5496 (2009).
39. Van den Berge, K. et al. Trajectory-based differential expression analysis for single-cell sequencing data. Nat. Commun. 11, 1201 (2020).
40. Aibar, S. et al. SCENIC: single-cell regulatory network inference and clustering. Nat. Methods 14, 1083-1086 (2017).
41. Bernard, K. et al. Engagement of natural cytotoxicity programs regulates AP-1 expression in the NKL human NK cell line. J. Immunol. 162, 4062-4068 (1999).
42. Adams, N. M. et al. Transcription factor IRF8 orchestrates the adaptive natural killer cell response. Immunity 48, 1172-1182.e1176 (2018).
43. Rabacal, W. et al. Transcription factor KLF2 regulates homeostatic NK cell proliferation and survival. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 113, 5370-5375 (2016).
44. Khameneh, H. J. et al. Myc controls NK cell development, IL-15driven expansion, and translational machinery. Life Sci. Alliance 6 (2023).
45. Jin, S. et al. Inference and analysis of cell-cell communication using CellChat. Nat. Commun. 12, 1088 (2021).
46. Adam, C. et al. DC-NK cell cross talk as a novel CD4+ T-cellindependent pathway for antitumor CTL induction. Blood 106, 338-344 (2005).
47. Laine, A. et al. Regulatory T cells promote cancer immune-escape through integrin alphavbeta8-mediated TGF-beta activation. Nat. Commun. 12, 6228 (2021).
48. Stojanovic, A., Fiegler, N., Brunner-Weinzierl, M. & Cerwenka, A. CTLA-4 is expressed by activated mouse NK cells and inhibits NK Cell IFN-gamma production in response to mature dendritic cells. J. Immunol. 192, 4184-4191 (2014).
49. Lee, S. H., Fragoso, M. F. & Biron, C. A. Cutting edge: a novel mechanism bridging innate and adaptive immunity: IL-12 induction of CD25 to form high-affinity IL-2 receptors on NK cells. J. Immunol. 189, 2712-2716 (2012).
50. Ni, J. et al. Single-cell RNA sequencing of tumor-infiltrating NK cells reveals that inhibition of transcription factor HIF-1alpha Unleashes NK cell activity. Immunity 52, 1075-1087.e1078 (2020).
51. Krzywinska, E. et al. Loss of HIF-1alpha in natural killer cells inhibits tumour growth by stimulating non-productive angiogenesis. Nat. Commun. 8, 1597 (2017).
52. Cancer Genome Atlas Research, N. et al. The cancer Genome Atlas Pan-Cancer analysis project. Nat. Genet. 45, 1113-1120 (2013).
53. Pelka, K. et al. Spatially organized multicellular immune hubs in human colorectal cancer. Cell 184, 4734-4752.e4720 (2021).
54. Crinier, A. et al. High-dimensional single-cell analysis identifies organ-specific signatures and conserved NK Cell subsets in humans and mice. Immunity 49, 971-986.e975 (2018).
55. Tang, F. et al. A pan-cancer single-cell panorama of human natural killer cells. Cell 186, 4235-4251.e4220 (2023).
56. Lo, H. C. et al. Resistance to natural killer cell immunosurveillance confers a selective advantage to polyclonal metastasis. Nat Cancer 1, 709-722 (2020).
57. Kennedy, M. K. et al. Reversible defects in natural killer and memory CD8 T cell lineages in interleukin 15-deficient mice. J. Exp. Med. 191, 771-780 (2000).
58. Sun, H. et al. Accumulation of tumor-infiltrating CD49a(+) NK cells correlates with poor prognosis for human hepatocellular carcinoma. Cancer Immunol. Res. 7, 1535-1546 (2019).
59. Moreno-Nieves, U. Y. et al. Landscape of innate lymphoid cells in human head and neck cancer reveals divergent NK cell states in the tumor microenvironment. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 118, e2101169118 (2021).
60. Mackay, L. K. et al. The developmental pathway for CD103(+)CD8+ tissue-resident memory T cells of skin. Nat. Immunol. 14, 1294-1301 (2013).
61. Sheridan, B. S. et al. Oral infection drives a distinct population of intestinal resident memory CD8(+) T cells with enhanced protective function. Immunity 40, 747-757 (2014).
62. Zhang, N. & Bevan, M. J. Transforming growth factor-beta signaling controls the formation and maintenance of gut-resident memory T cells by regulating migration and retention. Immunity 39, 687-696 (2013).
63. Marquardt, N. et al. Unique transcriptional and protein-expression signature in human lung tissue-resident NK cells. Nat. Commun. 10, 3841 (2019).
64. Sojka, D. K. et al. Cutting edge: local proliferation of uterine tissueresident NK cells during decidualization in mice. J. Immunol. 201, 2551-2556 (2018).
65. Peng, H. et al. Liver-resident NK cells confer adaptive immunity in skin-contact inflammation. J. Clin. Investig. 123, 1444-1456 (2013).
66. Lin, E. Y. et al. Progression to malignancy in the polyoma middle T oncoprotein mouse breast cancer model provides a reliable model for human diseases. Am. J. Pathol. 163, 2113-2126 (2003).
67. Wrangle, J. M. et al. ALT-803, an IL-15 superagonist, in combination with nivolumab in patients with metastatic non-small cell lung cancer: a non-randomised, open-label, phase 1b trial. Lancet Oncol. 19, 694-704 (2018).
68. Grabstein, K. H. et al. Cloning of a T cell growth factor that interacts with the beta chain of the interleukin-2 receptor. Science 264, 965-968 (1994).
69. Burton, J. D. et al. A lymphokine, provisionally designated interleukin T and produced by a human adult T -cell leukemia line, stimulates T-cell proliferation and the induction of lymphokineactivated killer cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91, 4935-4939 (1994).
70. Ma, S., Caligiuri, M. A. & Yu, J. Harnessing IL-15 signaling to potentiate NK cell-mediated cancer immunotherapy. Trends Immunol. 43, 833-847 (2022).
71. Di Pilato, M. et al. CXCR6 positions cytotoxic T cells to receive critical survival signals in the tumor microenvironment. Cell 184, 4512-4530.e4522 (2021).
72. Lee, C. et al. Tumour-retained activated CCR7+ dendritic cells are heterogeneous and regulate local anti-tumour cytolytic activity. Nat. Commun https://doi.org/10.1038/s41467-024-44787-1 (2024).
73. Stoklasek, T. A., Schluns, K. S. & Lefrancois, L. Combined IL-15/IL15Ralpha immunotherapy maximizes IL-15 activity in vivo. J. Immunol. 177, 6072-6080 (2006).
74. Dubois, S., Patel, H. J., Zhang, M., Waldmann, T. A. & Muller, J. R. Preassociation of IL-15 with IL-15R alpha-IgG1-Fc enhances its activity on proliferation of NK and CD8+/CD44high T cells and its antitumor action. J. Immunol. 180, 2099-2106 (2008).
75. Hawke, L. G., Mitchell, B. Z. & Ormiston, M. L. TGF-beta and IL-15 synergize through MAPK pathways to drive the conversion of human NK cells to an innate Lymphoid Cell 1-like phenotype. J. Immunol. 204, 3171-3181 (2020).
76. Shimshek, D. R. et al. Codon-improved Cre recombinase (iCre) expression in the mouse. Genesis 32, 19-26 (2002).
77. Shcherbo, D. et al. Far-red fluorescent tags for protein imaging in living tissues. Biochem. J. 418, 567-574 (2009).
78. Fiancette, R. et al. Reciprocal transcription factor networks govern tissue-resident ILC3 subset function and identity. Nat. Immunol. 22, 1245-1255 (2021).
79. Wong, P., Wagner, J. A., Berrien-Elliott, M. M., Schappe, T. & Fehniger, T. A. Flow cytometry-based ex vivo murine NK cell cytotoxicity assay. STAR Protoc. 2, 100262 (2021).
80. Wolf, F. A., Angerer, P. & Theis, F. J. SCANPY: large-scale single-cell gene expression data analysis. Genome Biol. 19, 15 (2018).
81. Wolock, S. L., Lopez, R. & Klein, A. M. Scrublet: computational identification of cell doublets in single-cell transcriptomic data. Cell Syst. 8, 281-291.e289 (2019).
82. Wolf, F. A. et al. PAGA: graph abstraction reconciles clustering with trajectory inference through a topology preserving map of single cells. Genome Biol. 20, 59 (2019).
83. Haghverdi, L., Buttner, M., Wolf, F. A., Buettner, F. & Theis, F. J. Diffusion pseudotime robustly reconstructs lineage branching. Nat. Methods 13, 845-848 (2016).
84. Newman, A. M. et al. Determining cell type abundance and expression from bulk tissues with digital cytometry. Nat. Biotechnol. 37, 773-782 (2019).

شكر وتقدير

مساهمات المؤلفين

المصالح المتنافسة

معلومات إضافية

Rapid functional impairment of natural killer cells following tumor entry limits anti-tumor immunity

Results

NK cells rapidly exhibit transcriptome alterations after tumor entry

We then determined the proportion of and cells within each cluster to contextualize the time spent within the tumor microenvironment of each sub-cluster (Fig. 1C-E). These data revealed a gradation in the proportion of KR+ cells across the NK clusters, with the NK_1 cluster comprised almost entirely of KG+ cells and the NK_5 cluster at the other extreme, consisting of approximately cells. Further analysis of the NK_cycling cluster revealed that cycling cells could be found in all NK/ILC/NKT cell clusters, suggesting that these do not constitute a distinct phenotype (Supplementary Fig. 1K). However, of note, NK_5 was particularly enriched among the cycling NK cells, suggesting that some tumor-retained NK cells may expand in situ (Supplementary Fig. 1L). To temporally order the transcriptomic changes that occur within NK cells after entering the tumor we performed a pseudotime trajectory analysis, rooted in NK_1 since this contained the highest proportion of NK cells that had recently entered the tumor. These analyses highlighted the NK_5 cluster as the end state of the trajectory (Fig. 1F, G). Similarly, partition-based graph abstraction (PAGA) to map cluster connectivity (Fig. 1H), indicated that the major cell fate trajectory for tumor NK cells progresses from the NK_1 through to NK_2 and then onto the NK_5 transcriptional signature.

Differential expression of CD11b and CD49a expression capture temporal changes in NK cell phenotype

NK cells rapidly lose core effector functions after tumor entry

Having established how to identify the temporal changes in NK cell state through a combination of photo-labeling and analysis of integrin expression, we sought to understand how NK cell function was impacted by time spent in the tumor microenvironment. To consider the potential cellular interactions of the different NK cell states identified in an unbiased manner, we used CellChat and specifically focused on myeloid cells within the TME given evidence of this cellular axis impacting anti-tumor immunity (Supplementary Fig. 7). This analysis identified a number of potential associations that differed depending on the NK state, including a number of immunostimulatory interactions (Ifng, Ccl5, Il18) involving newly recruited NK cells, but not those that had been retained within the tumor for several days. Other associations of note included the potential responsiveness of the NK_5 state to Il15 signaling as well as the emergence of inhibitory receptor interactions (e.g., Cd244a:Cd48). Collectively, this unbiased in silico analysis highlighted the potential for quite different cellular communications between recently recruited and tumor-retained NK cells.

Multiple mechanisms in the TME drive the conversion of cNK cells to a tumor – retained CD49a + NK cell compartment

Fig. 3 | NK cells rapidly change chemokine, cytokine and granzyme production within 24 h of entering the TME. Flow cytometry was used to validate changes to the function of NK cells isolated from MC38 tumors at 24 h post photoconversion. A Proportion of NK cells producing CCL5 after ex vivo stimulation, with representative histograms alongside enumeration ( ). B Proportion of NK cells producing IFN after ex vivo stimulation, with representative histograms alongside enumeration ( ). C Reporting of mKate 2 in using fnycre reporter mice, with T cells versus NK cells isolated from MC38 tumors assessed. Representative histograms and the proportion of mKate2+ cells shown. Representative histograms showing proportion of NK cells producing (D) granzyme A, (E) granzyme C, (F) granzyme B, (G) CD107a, (H) Perforin in MC38 tumors that were photoconverted and analyzed 24 h later. Data pooled from 2 independent experiments ( ) for all

analyses except CD107a expression where from 1 independent experiment. I Cartoon showing experimental setup whereby CD11b + and CD49a + NK cells from MC38 tumors were FACS-isolated and co-cultured with B16-F10 melanoma cells pre-treated with cell trace violet that were then stained for cell viability. J NKmediated target cell killing comparing cytotoxicity between FACS sorted CD11b+ and CD49a+ NK cells ( ). Significance was determined by two-way ANOVA with Šidák’s multiple comparison test (A, B, and D-H) comparing means to Kaede Green+ CD11b+ cells, or between groups (J), and a Kruskal-Wallis test with Dunn’s multiple comparison test (C). Data are presented showing all individual data points as well as the mean value SD. In all experiments ‘ ‘ defines a single tumor on an individual mouse, i.e., refers to 3 mice each with a single tumor.

Fig. 4 | Multiple mechanisms in the TME drive the conversion of cNK cells to a tumor-retained CD49a+ state. The role of TGF and HIF-1 were investigated in vitro and in vivo as mechanisms promoting NK cell differentiation to the tumor retained state characterized by CD49a expression and disrupted core functions. A Bar chart showing proportion of CD11b + and CD49a + NK cells after 48 h in culture in RPMI with IL-2/IL-15 further supplemented with TGF- and/or DiPGE . B Cartoon summarizing experimental design for impeding tumor produced . Kaede mice were grafted with either MC38 ( ) or MC38 (MC38 ) cells, photoconverted on D12 and analyzed 48 h later. C Tumor weight. D Enumeration of NK cells per mg tumor. E Flow cytometry plots showing Kaede Green versus Kaede Red expression by NK cells. F Proportion of NK cells expressing Kaede Red label 48 h post photoconversion. G Proportion of NK cells in CD11b+CD49a-, CD11b- CD49a- and CD11b- CD49a+ subsets. H Proportion of NK
cells producing CCL5, IFN , granzyme A, granzyme C after ex vivo restimulation. I Cartoon summarizing experimental design for targeting Hifla within NK cells, using Ncr1 x Hif1 x Kaede mice (NK-HIF1 KO ) versus cre-negative littermates (NK-HIF1 WT ) grafted with MC38 tumors, photoconverted on D12 and analyzed 48 h later. J Tumor weight. K Enumeration of NK cells per mg tumor. L Flow cytometry plots showing Kaede Green versus Kaede Red expression by NK cells. M Proportion of NK cells expressing Kaede Red label 48 h post photoconversion. N Proportion of NK cells in CD11b+ CD49a-, CD11b- CD49a- and CD11bCD49a+ subsets. O Proportion of NK cells producing CCL5, IFN , granzyme A, granzyme C after ex vivo restimulation. Statistical significance was determined by unpaired tests ( ) or two-way ANOVA with Šidák’s multiple comparison test comparing group means ( ). Data are presented showing all individual data points as well as the mean value +/- SD.

while there was a modest increase in the number of NK cells in the tumor (Fig. 4 K ), no differences in the % of KR+ NK cells, the proportion of NK cell subsets, nor production of CCL5, IFN , granzyme A or granzyme C was detected (Fig. 4L-O).

NK cells in human colorectal cancer show loss of effector functions

Enhanced IL-15 signaling drives formation of a distinct cytotoxic intratumoral NK cell population

Finally, we sought approaches that could block or reverse the loss of NK cell function imprinted by residence in the TME and thus support enhanced anti-tumor responses. IL-15 drives the differentiation and activation of both T and NK cells . Initial patient data suggest that the response to IL-15R agonizts is associated with NK cell and CD8+ T cell expansion and increased IFN production. However, it is unclear how IL-15R agonism enhances NK cell anti-tumor responses or the potential recruitment of NK cells into solid tumors. To determine whether enhanced IL-15 signaling resulted in the maintenance of NK functions normally disrupted by adaptation to the TME, tumor bearing mice were treated with complexes of IL-15:IL-15Ra, since these complexes have a significantly enhanced activity versus recombinant IL-15 alone. We tested these complexes, administered at D7 and D12 of tumor growth, both prior to and concurrent with photoconversion, in multiple tumor models (Fig. 6A). BALB/c Kaede mice bearing CT26 tumors showed significantly enhanced tumor control with treatment (Fig.6B). Analysis of the intratumoral NK cell compartment revealed striking differences in integrin expression following administration of IL-15:IL15Ra complexes (Fig. 6C). Surprisingly, treatment resulted in the majority of the NK cells expressing CD49a, however we also observed the emergence of a CD49a+CD11b+ population barely detectable in the PBS controls (Fig. 6D). To ask whether IL-15:IL-15Ra complexes caused the emergence of CD49a+ CD11b+ cells after entry into the tumor, or if these cells were formed in the periphery and trafficked into the tumor, we photoconverted tumors and compared the % KR expression within different intratumoral NK cell subsets. Treatment did not cause a significant difference in the total proportion of cells in the tumor (Fig. 6E). Analysis of the NK cell subsets defined by

Discussion

Methods

Study design

Mice

Generation of Ifng reporter mice

Mouse tumor models