https://doi.org/10.1038/s41586-024-07548-0
تاريخ الاستلام: 10 نوفمبر 2023
تم القبول: 9 مايو 2024
نُشر على الإنترنت: 19 يونيو 2024
الوصول المفتوح

توزع على نطاق واسع عبر المجالات الثلاثة لأشكال الحياة الخلوية، تلعب الكربوهيدرات أدوارًا محورية في العديد من العمليات البيولوجية. غالبًا ما توفر الطبيعة وظيفة متغيرة بشكل كبير ببساطة من خلال ارتباط مجموعة جليكوسيل. نظرًا لأهميتها، تم تكريس جهود كبيرة للوصول إلى هذه السكريات ومشتقاتها لفهم خصائصها ووظائفها والأدوار المحتملة المتعلقة بالأمراض، ولتمكين اكتشاف العلاجات المعتمدة على السكر. لقد أدت صعوبة استخراج كميات ملحوظة من العينات النقية من الطبيعة إلى دفع الكيميائيين إلى تأمين معظم السكريات بوسائل اصطناعية. ولهذا الغرض، يتم استخدام الجليكوزيلation الكيميائية غير الإنزيمية. يمثل حجر الزاوية في كيمياء الكربوهيدرات من خلال تقديم طريق موثوق لتجميع مجموعة واسعة من الكيانات الجليكوسيدية الطبيعية وغير الطبيعية. ومع ذلك، على عكس الآلات الإنزيمية التي يمكن أن تتوسط في عملية الجليكوزيل باستخدام مانحين جليكوسيديين متعددين الهيدروكسيل غير المحميين مع تحكم ممتاز في الموقع. تعتبر منهجيات الجليكوزيل الكيميائية المعتمدة أقل دقة وعادة ما تتطلب استراتيجيات معقدة لحماية المجموعات. لتجاوز مشكلة انتقائية الموقع. يتم تسليط الضوء على هذه التعقيدات في المسارات الاصطناعية الحالية إلى مركبات -غليكوزيل فئة الكربوهيدرات الموازية التي هي نادرة في الطبيعة ولكنها اكتسبت أهمية متزايدة كبدائل قوية وغالبًا ما تكون أكثر فعالية بيولوجيًا لـ -الجليكوزيدات في تطوير الأدوية لعلاج السرطان والسكري وأمراض أخرى .
على النقيض من الطبيعة الانتقائية العالية للموقع للإنزيمات -الجليكوزيل (الشكل 1أ)، التقدم الرائد في الكيمياء غير الإنزيمية غالبًا ما تتطلب عملية الجليكوزيلation تسلسلات تفاعل متعددة الخطوات (حماية مجموعة الهيدروكسيل، التفعيل وإزالة الحماية) تتضمن تحكمًا دقيقًا و/أو ظروف تفاعل قاسية للتحويل الكامل.
السكريات الأصلية غير المحمية (أكثر الأشكال وفرة في الطبيعة) إلى سلفيات جليكوسيل مصممة تحتوي على مجموعات مغادرة أنوميرية مثل الهاليدات استرات سلفوكسيدات أو السلفونات ، مما يمهد الطريق للتفاعل الناتج عن تكوين روابط الكربون-كربون لتقديم المنتج غير المحمي المطلوب – مركب جليكوزيل فقط بعد إزالة الحماية في النهاية (الشكل 1ب). القيود العملية وعدم الكفاءة في هذه الأساليب تحد من استخدامها في الكيمياء الجليكوزية الاصطناعية وتمنع المزيد من التطبيقات في ظل ظروف بيولوجية معقدة. وبالتالي، فإن تنفيذ نظام يسمح بالربط المباشر للسكريات الأصلية من أجل جليكوزيل واسع النطاق للوصول إلى نظائر ستيريو متطابقة نقية مركبات -غليكوزيل وغيرها من المتغيرات المستقرة هيدروكيميائيًا والمهمة طبيًا (مثل – و -غليكوزيدات) بالإضافة إلى إن البروتينات السكرية المرتبطة بـ – هي هدف طويل الأمد في أبحاث علم السكريات. ومع ذلك، لا يزال هذا غير معروف بسبب التحديات العديدة المرتبطة بالكفاءة والانتقائية والتوافق الحيوي.

مستوحى من تقارير عن البيولوجيا “-جليكوزيل” حيث -جليكوزيل ترانسفيراز تسهل تشكيل مستقر -روابط غليكوسيدية باستخدام سكريات نوكليوتيد غير محمية تم توليدها من متغيراتها الأصلية عن طريق الفسفرة الأنوميرية الانتقائية. ، استنتجنا أنه يمكن اعتماد نهج محاكاة الطبيعة لتفعيل واستبدال مجموعة الهيدروكسيل الأنوميري (الهيمياستال) في سكر أصلي في شكله الحلقي (التغطية). سيوفر هذا وسيط ثيوغليكوزيد يمكنه، تحت ظروف مناسبة، أن يخضع لتقاطع إزالة الكبريت الموجه. مع كاشف مناسب في عملية واحدة (غليكوزيل). تمامًا كما في الطبيعة، يبقى مانح الغليكوزيل المنشط الذي تم توليده مؤقتًا بلا أثر. ومع ذلك، يجب معالجة العديد من التحديات.

الشكل 1| تصميم مخطط خالٍ من مجموعات الحماية ‘تغطية وغليكوزيل’ للتعديل المباشر للسكريات الأصلية إلى غليكوزيدات قوية. أ، التخليق الإنزيمي لـ -مركبات الجليكوزيل. ب، التحديات في التخليق الكيميائي غير الإنزيمي للمواد غير المحمية -مركبات الجليكوزيل. ج، نهجنا البيوميميتيك
لتحقيق تفاعل أنوميري انتقائي من حيث الموقع والاستيريو. R، مجموعة وظيفية؛ LG، مجموعة مغادرة؛ B، قاعدة؛ NTP، ثلاثي فوسفات النوكليوزيد؛ NDP، ثنائي فوسفات النوكليوزيد؛ Dha، ديهيدرو ألانين؛ 2,3,5,6-تترافلورو بيريدين-4-ثيول؛ و -تترافلورو-4-بيريديل.
لنجاح هذه الاستراتيجية ‘التغطية والجليكوزيل’، يجب أولاً تمييز مجموعات الهيدروكسيل المتعددة لضمان التغطية الانتقائية للهيمياستال لتشكيل مانح ثيوغليكوزيل مؤقت. ثانياً، يجب أن يكون المانح تفاعلياً بما فيه الكفاية للمشاركة في الربط المتقاطع دون تدخل تنافسي أو تفاعل مع مواقع الهيدروكسيل الأخرى، مما قد يؤدي إلى تفاعلات غير مرغوب فيها ومخاليط يصعب التعامل معها. بالإضافة إلى ذلك، هناك تحدي التحكم في النتيجة الاستيريوكيميائية لوظيفة الأنومير في سياق بقايا كربوهيدراتية معقدة ومتعددة الهيدروكسيل.

هنا نبلغ عن مخطط خالٍ من المعادن ومجموعات الحماية يمكّن من التعديل الأنميري المباشر للسكريات الأحادية والسكريات الثنائية غير المحمية في أشكالها الأصلية من خلال الاقتران المتقاطع القائم على الجذور مع مختلف الكواشف الكهربائية تحت ظروف الإشعاع الضوئي اللطيف (الشكل 1c). هذه الطريقة ‘تغطية وغليكوزيل’ تلغي الحاجة إلى التثبيت المسبق وإزالة مجموعات الحماية، مما يحل مشكلة مستمرة في هذا المجال ويوفر منصة عامة لـ
تسريع إعداد مركبات الكربو-، الثيو- والسيلينوغليكوزيل القوية بالإضافة إلى “-غليكوزيدات بانتقائية عالية في الموقع والبنية. كما نوضح أن البروتوكول قابل للتطبيق على التخليق الكيميائي المباشر لـ “غير المحمية. -جليكوزيل بروتينات بطريقة ما بعد الترجمة التي تكمل النظير البيولوجي – و -عمليات الجليكوزيل.

بالنظر إلى قابلية بعض المعادن الانتقالية للتثبيط بواسطة مجموعات الهيدروكسيل القطبية سعينا إلى تصميم بروتوكول خالٍ من المعادن يستفيد من تفاعل الكبريتات الألكيلية الفقيرة بالإلكترونات لإجراء تحولات إزالة الكبريت عند تنشيطها بالضوء. قمنا أولاً بتقييم معايير التفاعل التي تعزز الاستبدال النوكليوفيلي الانتقائي (التغطية) باستخدام د-جلوكوز. كنموذج ركيزة (الجدول التكميلي 3). الاستفادة من الحموضة الأكبر لمجموعة الهيدروكسيل الأنوميري مقارنةً بوحدات الهيدروكسيل الأخرى تم فحص مجموعة متنوعة من العوامل المنشطة (R-LG) لتحويل 1 إلى مشتق 2،3،5،6-تترافلورو بيريدين-4-ثيولغليكوزيد المستقر على الطاولة 2 تحت ظروف ضعيفة

الشكل 2 | تطوير التفاعل. أ، اختيار منشط مناسب لاستبدال نوكليوفيلي محدد الموقع. ب، تحديد أفضل مانح ثيوغليكوزيل للتقاطع المحفز بالضوء. تم تحديد العوائد بواسطة تحليل H NMR لمزيج التفاعل الخام؛ العوائد بين قوسين تشير إلى العوائد المعزولة. تم تحديد النسب الأنوميرية بواسطة الرنين المغناطيسي النووي والسائل
تحليل الكروماتوغرافيا-مطيافية الكتلة (LC-MS). DMC، كلوريد 2-كلورو-1،3-ثنائي ميثيل إيميدازوليوم؛ CDMT، 2-كلورو-4،6-ثنائي ميثوكسي-1،3،5-تريازين؛ NMM، -ميثيل مرفولين؛ HE، إستر هانتزخ (دي إيثيل 1،4-ديهيدرو-2،6-دايميثيل-3،5-بيريدينديكربوكسيليت)؛ LED، صمام ثنائي باعث للضوء؛ RT، درجة حرارة الغرفة؛ وC -تترافلوروفينيل.
الشروط الأساسية (الشكل 2أ). في وجود 2-كلورو-1،3-ثنائي ميثيل إيميدازوليوم كلوريد (DMC) المتاح تجارياً كمحفز وثلاثي إيثيل أمين كقاعدة، تم الحصول على 2 في عائد ( عائد معزول) وأكثر من نسبة عند في غضون ساعتين. في أيدينا، يمكن تخزين 2 (الصلب الأبيض) في الهواء على الطاولة لعدة أشهر دون تحلل ملحوظ. من الجدير بالذكر أن التركيب الفراغي C1 لهذا -مُتبرع الجليكوزيل غير ذي أهمية حيث سيتم تحويله إلى نوع جذر الجليكوزيل خلال المسار تكوين الروابط في الخطوة التالية (الشكل 3أ). أدت نظائر أخرى من DMC (3 و 4) إلى انخفاض ملحوظ في العوائد، في حين أن المواد الكيميائية الأخرى المستخدمة بشكل شائع مثل ملح الكلوروفوسفونيوم 5 ومزيج من 2-كلورو-4،6-ثنائي الميثوكسي-1،3،5-تريازين (CDMT) و -ميثيل مرفين (NMM) فشل في تعزيز التفاعل.
مع تحديد DMC كأكثر المحفزات فعالية، استخدمنا ظروف الاستبدال النووي لتخليق ليس فقط 2 ولكن أيضًا مجموعة من الثيوغلوكوزيدات (الهيدرو) أريل غير المحمية (6-9) للمقارنة. لدفع عملية الجليكوزيل، خضعنا الثيوغلوكوزيدات لتفاعل مع الأكريلات. تحت إضاءة الضوء المرئي . بعد مسح شامل للظروف (الجدول التكميلي 4)، اكتشفنا أن 2 خضع لعملية اقتران كربوني-كربوني إزالة الكبريت لتقديم غير محمي -الكيل جلوكوزيد 11 في عائد ( عائد معزول) وأكثر من الانتقائية باستخدام مزيج من إستر هانتز كعامل مختزل، و1,4-ديازابيسكلو[2.2.2]أوكتان (DABCO) وثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) كمذيب تحت إشعاع LED الأزرق في درجة حرارة الغرفة (الشكل 2ب). حسب علمنا، تمثل هذه التفاعل الاستخدام الناجح الأول لـ 2,3,5,6-تترافلورو بيريدين-4-ثيولغليكوسيد كفئة جديدة من مانحي الغليكوزيل في الغليكوزيل الكيميائي.
على النقيض، لوحظ تحويل ضعيف مع المواد الأقل نشاطًا في الأكسدة والاختزال -غلوكوزيدات مشتقة من ثيولات (هترو) أريلية أقل سحبًا للإلكترونات (6-9)، مما يبرز أهمية الجزء الهتروأروماتيكي المفلور للتقاطع المعزز بالضوء. . وقد تم دعم ذلك من خلال دراسات الفولتمترية الدورية التي تظهر أن لديه أقل سلبية
إمكانات الاختزال (الأشكال التكميلية 2-6)، والتي تقارن بتلك الخاصة بسلفون جليكوزيل هيتروأريل النشط في التفاعل الأكسدة-اختزال . بالمقابل، كان استبعاد مصدر الضوء، إستر هانتزتش أو DABCO ضارًا للتفاعل، وأدى تغيير القاعدة أو المذيب إلى انخفاض العوائد. لإظهار قوة نهج ‘التغطية والجليكوزيل’ من خلال التنشيط غير المرئي، أظهرنا أن يمكن أن يتم توليده من 1 في تسلسل واحد دون الحاجة إلى عزل -المتوسط الجليكوزي 2. الكفاءة العامة للخطوة والعائد (عائد 64% وعائد معزول 52%) تقدم مزايا ملحوظة مقارنة بالطرق الكيميائية السابقة طرق الجليكوزيل التي تتطلب خطوات متعددة (الشكل 1ب).

تم إجراء تجارب للحصول على فهم للعمليات الفردية لتنشيط السكر الأصلي والتقاطع المتقاطع. كما هو موضح في الشكل 2a، فإن الاستبدال النوكليوفيلي للد-glucose أعطى 2،3،5،6-تترافلورو بيريدين-4-ثيوغليكوسيد 2 بعائد 85% (عائد معزول 72%) وأكثر من نسبة. على العكس، وجدنا أن الثيوغليكوزيد المقابل 13 تم تأمينه في عائد ( عائد معزول) وأكثر من نسبة من د-مالتوز 12 تحت نفس الظروف المحددة (الشكل 3أ). في المحلول، و أنومرات السكريات الأصلية يمكن أن تتحول وتتواجد في حالة توازن؛ كل أنومر يتفاعل بشكل فردي مع DMC قبل أن يخضع لاستبدال نووي مقلوب. بواسطة الثيول (الشكل التوضيحي الإضافي 7). بدلاً من ذلك، فإن مجموعة 2-OH من DMC المنشط قد يشارك الوسيط الأنوميري في تفاعل المجموعة المجاورة من خلال هجوم نووي جزيئي داخلي لتوليد نوع 1,2-أنهدريد. ، والذي يكون عرضة لقطع الحلقة الانتقائي للموقع بواسطة النوكليوفيل الثيول. من المحتمل أن تكون هذه المسار غير مهمة في التفاعل الذي يؤدي إلى 13، نظرًا لأن تم الكشف عن -13 بكميات صغيرة. بالنسبة للسكريات الأخرى (الشكل 4)، قد تكون المسارات المختلفة للاستبدال النووي مفضلة بدرجات متفاوتة في نظام التفاعل. تم تأكيد بنية 2،3،5،6-تترافلورو بيريدين-4-ثيوغليكوسيد المشتق من D-مانوز من خلال تحليل البلورات بالأشعة السينية (قسم المعلومات التكميلية 7).

الشكل 3 | دراسات ميكانيكية. أ، تتقارب الأنومرات المختلفة من وسيط الثيوغليكوسيد في النهاية إلى نظير ضوئي نقي. -منتج جليكوزيل. ب، تجربة فخ الجذور تدعم وجود نوع جذري جليكوزيل. ج، طيف الامتصاص للأشعة فوق البنفسجية والمرئية لمكونات التفاعل في DMSO. د، آليات محتملة لتنشيط السكر الأصلي والتفاعل المتقاطع المحفز بالضوء-
الترابط. تم تحديد العوائد بواسطة تحليل NMR لمزيج التفاعل الخام؛ العوائد بين قوسين تشير إلى العوائد المعزولة. : تم تحديد النسب الأنوميرية بواسطة تحليل NMR و LC-MS. ESI، التأين بالرش الكهربائي؛ E، الكهرمغناطيسي.

تعريض 2 و 13 بشكل منفصل لظروف الربط المتقاطع القياسية مع أكريلات أدى إلى الحصول على 11 و 15، على التوالي، وكلاهما يمتلك نفس اتجاه الانتقائية الأنوميرية (الشكل 3أ). وهذا يدل بشكل ملحوظ على أنه، على عكس الجليكوزيلات غير المتجانسة، فإن التركيب الفراغي لـ C1 من الـ مانح الجليكوزيل غير ذي أهمية، مما يبرز
الميزة المميزة للاستراتيجية الحالية في تحويل خلطات من متساويات السكر الأصلية غير المحمية، من خلال مشتقاتها من الثيوغليكوزيد، إلى جليكوزيدات نقية من حيث التماثل بطريقة سلسة. في دراسة منفصلة، تم إضافة مواد خارجية ( -تترا ميثيل بيبيريدين-1-يل) أوكسيل (TEMPO) أوقف التأثير الضوئي

الشكل 4 | نطاق التفاعل مع السكريات الأصلية المختلفة. الربط المتقاطع للسكريات الأحادية والسكريات القليلة من خلال مانحي الجليكوزيل غير المحمي للحصول مباشرة على غير المحمي مركبات الجليكوزيل الألكيل. تم تحديد العوائد بواسطة
تحليل NMR لمزيج التفاعل الخام؛ العوائد بين قوسين تشير إلى العوائد المعزولة. تم تحديد النسب الأنوميرية بواسطة تحليل NMR و LC-MS. Bn، بنزيل.
تحويل 2 إلى 11 (الشكل 3ب). أظهر تحليل مطيافية الكتلة عالية الدقة (HRMS) تكوين مركب يمكن أن يُنسب إلى إضافة جليكوسيد TEMPO 16، مما يوفر دليلاً على أن نوع الجذري الجليكوزي (الأنوميري) الذي يعيش لفترة كافية يتم توليده خلال العملية. هذه العمليات تتناقض مع الجليكوزيلات الهتروتوليدية التي تفتقر أساسًا إلى تكوين نوع وسيط واضح (على سبيل المثال، كاتيون الجليكوزيل).

قمنا بمزيد من الاستكشاف لطبيعة التفاعل المحفز بالضوء (باستخدام كركيزة نموذجية) من خلال مطيافية الامتصاص فوق البنفسجي-visible (UVvis) (الشكل 3c). كشفت طيف الامتصاص المستقل لـ 2 و DABCO عن نطاقات موجودة بشكل كبير في منطقة الأشعة فوق البنفسجية، وأدى خلط هذين العنصرين فقط إلى انزياح أحمر صغير يمتد إلى المنطقة المرئية ( بالمقابل، أظهر محلول DMSO من إستر هانتزتش امتصاصًا قويًا في المنطقة المرئية، ولكن لم تُلاحظ أي تغييرات ملحوظة مع خليط من إستر هانتزتش وDABCO. أظهر خليط من 2 وإستر هانتزتش انزياحًا طفيفًا نحو الأحمر، والذي تم تضخيمه عندما تم دمج 2 وإستر هانتزتش وDABCO معًا في المحلول. تشير هذه النتائج إلى توليد معقد ثلاثي محتمل. بين 2، إستر هانتزتش و DABCO، الذي يُقترح أن يمتص الضوء المرئي وي undergo fragmentation إلى الجذري الجليكوزي.

الدراسات المقدمة هنا تدعم آلية كما هو موضح في الشكل 3d. التغطية الانتقائية للموقع لمجموعة الهيدروكسيل الأنوميري الأكثر حموضة بواسطة DMC تشكل مجموعة مغادرة مفعلة تخضع لهجوم نووي سهل بواسطة 2,3,5,6-tetrafluoropyridine-4-thiol تحت ظروف قاعدية، مدفوعة بالتوليد المتزامن لـ 1,3-dimethylimidazolidin-2-one (DMI) كمنتج ثانوي. يمكن أن يتشكل نوع 1،2-أنهدرو قبل الاستبدال النوكليوفيلي أيضًا
لا تحدث ولا يمكن استبعادها تمامًا (الشكل التوضيحي 7). يُفترض أن الوسيط الثيوغليكوزيدي الناتج يرتبط بإستر هانتزتش وDABCO في المحلول، مما يوفر معقد ثلاثي يمكنه امتصاص الضوء المرئي لتحفيز نقل الإلكترون المعتمد على الضوء (PET). متسق مع ردود الفعل الموثقة سابقًا تجعل الطبيعة عالية الاستقطاب لمجموعة الهتروأريل المفلورة الثيوغليكوسيد نشطًا كافيًا من حيث الأكسدة والاختزال لتفاعل PET. وهذا يؤدي إلى تكوين الجذري ثنائي الهيدروبيريدين 17 وأنيون جذري 18، الذي يميل إلى الانقسام بفقدان الكبريت لإنتاج نوع جذري جليكوزي و2،3،5،6-تترافلورو بيريدين-4-ثيولات (تم الكشف عن الحمض المترافق في خليط التفاعل). يتفاعل الجذري الجليكوزي لاحقًا مع شريك تفاعل تقاطع استقطابي، يسهل بواسطة 17، بطريقة انتقائية تحت السيطرة الحركية. لإعطاء الجليكوزيد غير المحمي المطلوب.

تم تسليط الضوء على عمومية بروتوكولنا الخالي من مجموعات الحماية من خلال الطيف الواسع من السكريات الأحادية والسكريات القليلة الأصلية التي يمكن تحويلها بشكل موثوق إلى شكل غير محمي بالكامل. – مركبات الجليكوسيل الألكيل (الشكل 4) من خلال سلفيد الجليكوسيد 2،3،5،6-تترافلورو بيريدين-4، والتي تم عزلها أو توليدها في الموقع واستخدامها (دون تنقية) للتقاطع. تشمل الأمثلة التمثيلية منتجات البيرانويد المكونة من السكريات الأحادية المستمدة من الكتلة الحيوية (19-21،24)، السكريات النادرة. والجلوكوز L غير الطبيعي (25). كما كانت الجليكوزيدات الأكثر تعقيدًا من المصادر الطبيعية بمثابة ركائز فعالة لتوصيل الجزيئات المقابلة مركبات الجليكوزيل الألكيل بكفاءة جيدة. تم ملاحظة تحكم استيريو جيد إلى ممتاز بشكل عام.

بجانب تمت دراسة المركبات الكربونية غير المشبعة، وتم التحقيق في الألكينات الأخرى كشركاء في التفاعل المتقاطع (الشكل 5أ). بكثافة

عائدات معزولة. نسب الأنومير، نسب الدياستيرومير (dr) و تم تحديد النسب بواسطة تحليل NMR و LC-MS. يشير النجمة إلى القيمة التي تم الحصول عليها كمزيج 77:23 E:Z. يشير السهم إلى أن D-galactose تم استخدامه. Ar، أريل؛ X، هاليد؛ Ac، أسيتيل؛ Boc، تيرت-بيوتيل أوكسي كربونيل.
الأكريلات والأكرلاميدات المفعلة المرتبطة بالمركبات النشطة بيولوجيًا (30، 31)، والأمينوساليسيلات (32)، والسكر الأميني (33) والبيبتيدات الصغيرة (34-36) كانت ركائز متوافقة، مما يوفر الوصول إلى مواد قطبية عالية. -مركبات جليكوزيلية تحمل مواقع حمضية وقاعدية متعددة. وهذا يوفر طريقة بسيطة لجليكوزيل الجزيئات المعقدة باستخدام السكريات الأصلية لمختلف التطبيقات، بما في ذلك تصميم ببتيدوميمتيك قائم على السكر. . تم قبول مستقبلات المايكل الأخرى مثل الفينيل سلفون (37) والفينيل فوسفونات (38) والفينيل بورونات (40) بالإضافة إلى الفينيل سيليكون (39) والأسيتات الأليلية (41) أيضًا في تفاعل فعال لتوفير المطلوب -مشتقات الجليكوزيل الألكيل التي تحمل مجموعات وظيفية يمكن أن تكون بمثابة مقابض تركيبية مفيدة لمزيد من التعديلات. ومن الجدير بالذكر بشكل خاص أن التفاعل المتقاطع وجد أنه يستمر حتى في
وجود ألكين مستبدل بألكيل أقل تنشيطًا (42). أوليغوسكاريد زائف مستقر من الناحية الأيضية كتل البناء مثل يمكن تجميع ثنائي السكاريد -غليكوسيدي 43 الذي يتميز بمركزين استيريو جديدين بسرعة مع تحكم كامل في الاستيريو من خلال التفاعل مع غلوكال إكسو كمتقبل للجذور.

لإظهار تعددية نهج ‘التغطية والجليكوزيل’ في تأمين فئات أخرى من السكريات غير المحمية، استبدلنا شريك الاقتران الألكيني مع مواد كيميائية إلكترونية أخرى يمكن أن تشارك كمتقبلات جذرية. باستخدام مادة كيميائية هالوألكينية (الشكل 5ب)، تم تأمين مركب الجليكوزيل الألكينيل (44) بنجاح مع اختيار أنوميري عالي؛ يُفترض أن هذه العملية تتم من خلال إضافة-اختزال الجليكوزيل الراديكالي. مسار إزالة الهاليد . يمكن أيضًا تحقيق جليكوزيل الهتروأريل من خلال الاقتران المباشر

الشكل 6 | التطبيق على الجليكوزيلation الكيميائي المباشر للبروتينات بعد الترجمة. جليكوزيلation البروتينات من خلال الربط المتقاطع للسكريات الأصلية التمثيلية (من خلال التغطية كمانحين ثيوغليكوزيل) للحصول على غير محمي -بروتينات جليكوسيل الألكيل. تم تحديد العوائد من خلال تحليل LC-MS بناءً على التحويل
لركيزة البروتين؛ تشير العوائد بين قوسين إلى التفاعلات مع مانحي الثيوغليكوزيل الناتجين في الموقع وغير المنقين. تريس، 2-أمينو-2-(هيدروكسي ميثيل)-بروبان-1،3-ديول؛ ثنائي البورون (bis(catecholato)diboron)؛ مان، D-مانوزيل؛ جال، D-جالاكتوزيل؛ غلكنا، N-acetيل-D-غلوكوزامينيل.
مع الهتروأرينات تحت ظروف خالية من الحمض، مما يؤدي إلى الحصول على 45-47 غير محمية بشكل انتقائي في أكثر المواقع نقصًا في الإلكترونات، وهو ما يتوافق مع تقرير سابق يتضمن جذور جليكوزيل محمية بالكامل. نهجنا في التفاعل الهتروأريلي هو تكميلي لاستراتيجية سابقة تم الإبلاغ عنها تعتمد على الميتالافوتوريدوكس والتي تتيح إزالة الأكسجين (غير متوافقة مع السكريات الأصلية) والتي تضمنت تنشيطًا مسبقًا لمجموعة الهيدروكسيل الأنوميري المكشوفة تلاها اقتران عابر مع هاليد هتروأريلي. .

ما وراء -الجليكوزيل، قمنا بتوسيع نطاق التفاعل الخالي من مجموعات الحماية لتحضير جليكوميمتيك أخرى مثل السيلينوجليكوزيدات (الشكل 5ج) والثيوجليكوزيدات (الشكل 5د). جنبًا إلى جنب مع مركبات C-جليكوزيل، وجدت هذه الكيانات العديد من التطبيقات كبدائل قوية للمواد الطبيعية الموجودة. -سكريات، وبالتالي فإن الطرق الفعالة لتخليقها بصفاء ستيريوكيميائي عالٍ مرغوبة بشدة. كل من سكر الجليكوزيد غير المحمي و -غليكوزيدات (50-54) كانت متاحة من خلال التفاعل مع مواد ثنائي السيلينيد أو ثنائي الكبريتيد ، على التوالي، مما يقارن بشكل إيجابي مع البروتوكولات السابقة التي اعتمدت على التحضير الشاق للسوابق الجليكوزيلية. ومن الجدير بالذكر أن 50-54 تم عزلها بشكل حصري كـ أنومرات (مقارنة بـ الأنومرات الناتجة عن الاستبدال النووي في الشكل 2). مشابه لـ -حالات الجليكوسيل في الأشكال 2 و 4، يمكن تفسير النتيجة الاستيريوكيميائية الملحوظة لـ 48-54 من خلال التفاعل المدعوم المداري بين زوج الإلكترون غير المرتبط من أكسجين الحلقة و للرابطة الناشئة عند الكربون الأنوميري في حالة الانتقال، حيث يتفاعل الجذري الجليكوزي مع النيوكليوفيل (الشكل 3د). -جليكوزيل يمكن أيضًا تحقيق ذلك مع الفينولات من خلال ضبط ظروف الربط المتقاطع المحفز بالضوء باستخدام اليوديد كعامل مختزل (الشكل البياني الموسع 1).

مدفوعين بنجاح جهودنا في تخليق المركبات الجليكوسيلية ذات الجزيئات الصغيرة، حاولنا اختبار بروتوكولنا ‘التغطية والجليكوسيلة’ في تخليق الجليكوبروتينات، المعروفة بدورها في الوساطة للعديد من العمليات البيولوجية الأساسية. في الطبيعة، تتشكل الجليكوبروتينات عادةً عن طريق ربط وحدات السكر بـ – أو -سلاسل جانبية تحتوي على بقايا الأحماض الأمينية السيرين أو الثريونين أو الأسباراجين باستخدام الجليكوزيل ترانسفيراز، مثل ارتباط -مرتبط- -د- -أسيتيلغلوكوزامين ( -GlcNAc) إلى بقايا السيرين أو الثريونين بواسطة -نقل غلوكوزامين. ومع ذلك، يمكن عكس هذا الجليكوزيل عن طريق الجليكوزيداز داخل الخلايا، وتُعد هذه العملية الديناميكية للكتابة والمسح تحديًا لاستكشاف الوظائف البيولوجية للبروتينات السكرية. في هذا السياق، تُعتبر الأساليب الكيميائية لتوليد بروتينات سكرية غير قابلة للكسر (مثل -الجليكوزيل بروتينات) تقدم استراتيجيات بديلة واعدة للتحقيق بشكل منهجي في وظائف الجليكوبروتينات. ومع ذلك، فإن التعديل الكيميائي بعد الترجمة للجليكوزيل للبروتينات، وخاصة ارتباط وحدات السكر بالبروتينات من خلال التفعيل الأنميري المباشر، لا يزال غير مستكشف إلى حد كبير في كيمياء الكربوهيدرات والبروتينات الاصطناعية. يمكن أن يُعزى ذلك إلى نقص السلفيات الجليكوزيلية غير المحمية المناسبة التي تكون مستقرة ولكنها تفاعلية بما فيه الكفاية، بالإضافة إلى المتطلبات الصارمة للظروف المتوافقة حيوياً، بما في ذلك التوافق مع الماء (الذي يطفئ مانحي الجليكوز الكيميائيين غير المتجانسين)، والقدرة على البقاء غير مدمرة للركائز البيولوجية، وانخفاض التفاعل تجاه المجموعات الوظيفية البيوجينية الموجودة في معظم البيئات البيولوجية. نظرًا لعدم قابلية استحلاب إستر هانتز في الوسط المائي الضروري، كانت ظروف الربط المتقاطع المستحث بالضوء تعتمد بدلاً من ذلك على تكوين معقدات نقل الشحنة بين 2،3،5،6-تترافلورو بيريدين-4-ثيولغليكوسيد و
ثنائي البورون (بيس كاتيكولات) ) كعامل مختزل (الجداول التكميلية 6-8).
بعد تحديد الظروف المثلى (500 مكافئ من ، في محلول تريس) كما هو موضح في الشكل 6، ثلاثة سكريات جليكوبروتين ثديية (D-mannose، D-galactose و تم اختيار -أسيتيلغلوكوزامين للتفاعل مع البروتينات المعلّمة بـ ديهيدروألانين (Dha) مع هياكل ووظائف متنوعة، بما في ذلك الهيستون H 3 (وهو صغير -بروتين نووي حلزوني)، بانC (إنزيم بانثوثينات سينثيتاز من المتفطرة السلية) بروتين نقل الفوسفات البكتيري PstS و Ss ج (أحد إنزيم برميل تريوز فوسفات إيزوميراز (TIM) . في الحدث، وُجد أن جميع البروتينات التي تم فحصها كانت قادرة على قبول الجذور السكرية تحت الظروف المحددة، مع النتيجة المرغوبة -بروتينات الجليكوزيل الألكيل تم تأمينها بعوائد جيدة إلى ممتازة عبر جميع الأنواع بغض النظر عن حجمها وطياتها. الكيمياء الفراغية للتركيبات الجديدة التي تم تشكيلها رابطة عند الكربون الأنوميري يُفترض أن الانتقائية) متطابقة مع تلك الخاصة بالتحلية الجزيئية الصغيرة (الشكل 4). ومن الجدير بالذكر أن الهيستون H3-GlcNAc-Ala10 يُنتج نموذجًا غير قابل للكسر للعلامة الإبيجينية المبلغ عنها GlcNAc-Ser10 (المرجع 61)؛ قد يوفر الوصول إلى هذا المركب الجليكوبروتيني ضوءًا على الدور البيولوجي غير المفهوم جيدًا لهذه العملية من التعديل بعد الترجمة. كما لوحظت كفاءات مماثلة في تفاعلات مانحي الثيوغليكوزيل المختلفة مع كل بروتين معين (حوالي 85% تحويل لـ eH3-Dha9، حوالي 80% تحويل لـ H3-Dha10، حوالي 55% تحويل لـ TEV H3-Dha2، حوالي التحويل لـ PanC-Dha44 وحول تم الكشف عن حوالي 5% من منتج ثانوي يتميز بإضافة وحدتين من GlcNAc لـ PstS-GlcNAc-Ala57، والذي نُعزيه إلى الجليكوزيل غير المحدد لبقايا الليسين. (الجدول التكميلي 9 والشكل التكميلي 15). مشابهة للأمثلة في الأشكال 2ب، 4 و5، تفعيل بدون أثر من خلال التكوين في الموقع لـ يمكن تنفيذ الوسائط الجليكوزيلية دون المساس بكفاءة جليكوزيل البروتين، مما يبرز قوة نهجنا الخالي من مجموعات الحماية ‘التغطية والجليكوزيل’ الذي يسمح باستخدام السكريات الأصلية مباشرة لجليكوزيل البروتينات بعد الترجمة.

أي طرق، مراجع إضافية، ملخصات تقارير Nature Portfolio، بيانات المصدر، بيانات موسعة، معلومات إضافية، شكر وتقدير، معلومات مراجعة الأقران؛ تفاصيل مساهمات المؤلفين والمصالح المتنافسة؛ وبيانات توفر البيانات والرموز متاحة فيhttps://doi.org/10.1038/s41586-024-07548-0.

ملاحظة الناشر: تظل شركة سبرينجر ناتشر محايدة فيما يتعلق بالمطالبات القضائية في الخرائط المنشورة والانتماءات المؤسسية.

الوصول المفتوح هذه المقالة مرخصة بموجب رخصة المشاع الإبداعي النسب 4.0 الدولية، التي تسمح بالاستخدام والمشاركة والتكيف والتوزيع وإعادة الإنتاج بأي وسيلة أو صيغة، طالما أنك تعطي الائتمان المناسب للمؤلفين الأصليين والمصدر، وتوفر رابطًا لرخصة المشاع الإبداعي، وتوضح إذا ما تم إجراء تغييرات. الصور أو المواد الأخرى من طرف ثالث في هذه المقالة مشمولة في رخصة المشاع الإبداعي الخاصة بالمقالة، ما لم يُشار إلى خلاف ذلك في سطر الائتمان للمواد. إذا لم تكن المادة مشمولة في رخصة المشاع الإبداعي الخاصة بالمقالة وكان استخدامك المقصود غير مسموح به بموجب اللوائح القانونية أو يتجاوز الاستخدام المسموح به، فستحتاج إلى الحصول على إذن مباشرة من صاحب حقوق الطبع والنشر. لعرض نسخة من هذه الرخصة، قم بزيارةhttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.
(ج) المؤلف(ون) 2024

البيانات البلورية متاحة مجانًا من مركز بيانات البلورات في كامبريدج تحت رقم المرجع CCDC-2263895 (S2). تم تحميل ملفات البيانات الخام MS/MS إلى مستودع PRIDE تحت رقم المرجع PXD046389. جميع البيانات الأخرى متاحة في النص الرئيسي أو المعلومات التكميلية.

الشكر والتقدير تم دعم هذا البحث من قبل وزارة التعليم في سنغافورة من خلال صندوق البحث الأكاديمي المستوى 2: A-8000941-00-00 (M.J.K.) ومجلس أبحاث الهندسة والعلوم الفيزيائية: V011359/1 (P) (B.G.D.). يتم تمويل معهد روزاليند فرانكلين من قبل أبحاث المملكة المتحدة والابتكار من خلال مجلس أبحاث الهندسة والعلوم الفيزيائية. ساعدت J. Wu في تحليل LC-MS وتنقية HPLC التحضيرية لجزيئات السكر الصغيرة. ساعد D. Jiang في تجارب الطيف الامتصاصي UV-vis. ساعد K. P. Loh في قياسات الفولتمترية الدورية. ساعد G. K. Tan في قياسات البلورات بالأشعة السينية. تم إنشاء الرسم في الشكل 1a باستخدامبايو ريندر.كوم.

مساهمات المؤلفين: M.J.K. و B.G.D. و Y.J. تصوروا العمل. Y.J. و Y.W. و Q.-Y.Z. و G.-Q.S. و Y.Z. و W.-Q.L. و N.S. أجروا دراسات تحسين نطاق التفاعل. Y.J. و X.-P.F. أجروا دراسات جليكوزيل البروتين. N.L. و S.M. نفذوا تجارب LC-MS/MS. M.J.K. و B.G.D. أداروا البحث. M.J.K. و B.G.D. و Y.J. كتبوا الورقة بمشاركة جميع المؤلفين.

المصالح المتنافسة تم تقديم براءات اختراع قد تمنح المؤلفين حقوق ملكية إذا تم ترخيصها.

معلومات إضافية النسخة الإلكترونية تحتوي على مواد إضافية متاحة علىhttps://doi.org/10.1038/s41586-024-07548-0.
يجب توجيه المراسلات والطلبات للحصول على المواد إلى بنيامين جي. ديفيس أو مينغ جو كو.
تُعرب Nature عن شكرها للمراجعين المجهولين على مساهمتهم في مراجعة هذا العمل.
معلومات إعادة الطباعة والتصاريح متاحة على http://www.nature.com/reprints.

https://doi.org/10.1038/s41586-024-07548-0
Received: 10 November 2023
Accepted: 9 May 2024
Published online: 19 June 2024
Open access

Widely distributed across the three domains of cellular life forms, carbohydrates play pivotal parts in many biological processes . Nature often provides greatly altered function simply through the attachment of a glycosyl moiety. Because of their importance, substantial efforts have been devoted to accessing these saccharides and their conjugates to better understand their properties, functions and potential disease-related roles and to enable the discovery of sugar-based therapeutics . The difficulty of extracting notable quantities of pure samples from nature has prompted chemists to secure most saccharides by synthetic means. To this end, non-enzymatic chemical glycosylation represents the cornerstone of carbohydrate chemistry by offering a reliable avenue to assemble a vast array of natural and non-natural glycoside entities. However, unlike enzymatic machineries that can mediate glycosylation by using unprotected polyhydroxylated glycosyl donors with excellent regiocontrol , established chemical glycosylation methodologies are less precise and typically require cumbersome protecting-group strategies to overcome the problem of site selectivity. These complications are highlighted in the existing synthetic routes to -glycosyl compounds , a parallel carbohydrate class that is rarer in nature but has gained increasing prominence as robust and often more biologically potent surrogates of -glycosides in developing medications to treat cancer, diabetes and other illnesses .
In contrast to the highly site-selective nature of enzymatic -glycosylation (Fig. 1a), the state-of-the-art advances in non-enzymatic chemical -glycosylation often require multi-step reaction sequences (hydroxylgroup protection, functionalization and deprotection) involving delicate control and/or harsh reaction conditions to transform fully
unprotected native sugars (the most abundant form in nature) into tailored glycosyl precursors containing anomeric leaving groups such as halides , esters , sulfoxides or sulfones , setting the stage for the ensuing carbon-carbon bond-forming reaction to deliver the desired unprotected -glycosyl compound only after eventual deprotection (Fig. 1b). The practical drawbacks and inefficiencies of these approaches consequently limit their use in synthetic glycochemistry and prevent further applications under intricate biological conditions. Thus, enacting a regime that allows direct coupling of native sugars for broad-scope glycosylation to access stereoisomerically pure -glycosyl compounds and other hydrolytically stable and medicinally important variants (such as – and -glycosides) as well as -linked glycoproteins is a longstanding goal in glycoscience research. However, this has remained unknown owing to numerous challenges associated with efficiency, selectivity and biocompatibility.

Inspired by reports of biological -glycosylation in which -glycosyltranferases mediate the formation of stable -glycosidic linkages using unprotected nucleotide sugars generated from their native variants by regioselective anomeric phosphorylation , we reasoned that a biomimetic approach could be adopted to preferentially activate and substitute the anomeric hydroxyl group (hemiacetal) in a native sugar in its cyclic form (capping). This would afford a thioglycoside intermediate that, under suitable conditions, could undergo stereocontrolled desulfurative cross-coupling with an appropriate reagent in a single operation (glycosylation). Just as in nature, the activated glycosyl donor that was temporarily generated remains traceless. However, several challenges have to be addressed

Fig. 1| Design of a protecting-group-free ‘cap and glycosylate’ blueprint for direct functionalization of native sugars to robust glycosides. a, Enzymatic synthesis of -glycosyl compounds.b, Challenges in the non-enzymatic chemical synthesis of unprotected -glycosyl compounds. c, Our biomimetic approach
to achieve site- and stereoselective anomeric functionalization of native sugars. R, functional group; LG, leaving group; B, base; NTP, nucleoside triphosphate; NDP, nucleoside diphosphate; Dha, dehydroalanine; , 2,3,5,6-tetrafluoropyridine-4-thiol; and -tetrafluoro-4-pyridyl.
for the success of this ‘cap and glycosylate’ strategy. First, the multiple hydroxyl groups must be distinguished to ensure selective masking of the hemiacetal to form a transient thioglycosyl donor. Second, the donor must be sufficiently reactive to participate in cross-coupling without competitive interference or reaction on other hydroxyl sites, which would otherwise result in undesired reactions and intractable mixtures. Added to these is the challenge of controlling the stereochemical outcome of anomeric functionalization in the context of a complex, polyhydroxylated carbohydrate residue.

Here we report a metal- and protecting-group-free blueprint that enables the direct anomeric functionalization of unprotected monosaccharides and oligosaccharides in their native forms by radical-based cross-coupling with various electrophiles under mild photoirradiation conditions (Fig.1c). This ‘cap and glycosylate’ approach eliminates the need for pre-installation and removal of protecting groups, solving an enduring problem in the field and providing a general platform to
accelerate the preparation of robust carbo-, thio- and selenoglycosyl compounds as well as -glycosides in high regio- and stereoselectivity. We also show that the protocol is amenable to the direct chemical synthesis of unprotected -glycosylproteins in a post-translational manner that is complementary to the analogous biological – and -glycosylation processes.

Considering the susceptibility of certain transition metals to inhibition by polar hydroxyl groups , we sought to engineer a metal-free protocol that harnesses the reactivity of electron-deficient alkyl sulfides to undergo desulfurative transformations on photoactivation . We first evaluated reaction parameters that promote regioselective nucleophilic substitution (capping) using d-glucose as the model substrate (Supplementary Table 3). Taking advantage of the greater acidity of the anomeric OH with respect to other hydroxyl units , various activating agents (R-LG) were examined to convert 1 to its bench-stable 2,3,5,6-tetrafluoropyridine-4-thioglycoside derivative 2 under weakly

Fig. 2 | Reaction development. a, Selection of an appropriate activator for site-selective nucleophilic substitution. b, Identification of the most effective thioglycosyl donor for photoinduced cross-coupling. Yields were determined by H NMR analysis of the crude reaction mixture; yields in parentheses denote isolated yields. Anomeric ratios were determined by NMR and liquid
chromatography-mass spectrometry (LC-MS) analysis. DMC, 2-chloro-1,3-dimethylimidazolinium chloride; CDMT, 2-chloro-4,6-dimethoxy-1,3,5-triazine; NMM, -methylmorpholine; HE, Hantzsch ester (diethyl 1,4-dihydro-2,6-dimethyl-3,5-pyridinedicarboxylate); LED, light-emitting diode; RT, room temperature; and C -tetrafluorophenyl.
basic conditions (Fig. 2a). In the presence of commercially available 2-chloro-1,3-dimethylimidazolinium chloride (DMC) as activator and triethylamine as base, 2 was obtained in yield ( isolated yield) and more than ratio at within 2 h . In our hands, 2 (white solid) could be stored in air on the bench over months without noticeable decomposition. It is worth noting that the C1 stereochemistry of this -glycosyl donor is inconsequential as it will be transformed into a glycosyl radical species during the course of bond formation in the subsequent step (Fig. 3a). Other analogues of DMC (3 and 4) led to markedly diminished yields, whereas other commonly used reagents such as chlorophosphonium salt 5 and a combination of 2-chloro-4,6-dimethoxy-1,3,5-triazine (CDMT) and -methylmorpholine (NMM) failed to promote the reaction.
With DMC identified as the most effective activator, we used the nucleophilic substitution conditions to synthesize not only 2 but also a range of unprotected (hetero)aryl thioglucosides (6-9) for comparison. To drive glycosylation, we subjected the thioglucosides to a reaction with acrylate under visible light illumination . After an extensive survey of conditions (Supplementary Table 4), we discovered that 2 underwent desulfurative C -C coupling to deliver unprotected -alkyl glucoside 11 in yield ( isolated yield) and more than selectivity using a combination of Hantzsch ester as reductant, 1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane (DABCO) and dimethyl sulfoxide (DMSO) as solvent under blue LED irradiation at ambient temperature (Fig. 2b). To our knowledge, this reaction represents the first successful use of 2,3,5,6-tetrafluoropyridine-4-thioglycoside as a new class of glycosyl donor in chemical glycosylation.
By contrast, poor conversion was observed with the less redox-active -glucosides derived from other less electron-withdrawing (hetero)aryl thiols (6-9), highlighting the importance of the fluorinated heteroaromatic moiety for photoinduced cross-coupling . This was supported by cyclic voltammetry studies showing that has the least negative
reduction potential (Supplementary Figs. 2-6), which is comparable to that of a redox-active heteroaryl glycosyl sulfone . By contrast, excluding the light source, Hantzsch ester or DABCO was detrimental to the reaction, and changing the base or solvent led to lower yields. To demonstrate the power of the ‘cap and glycosylate’ approach by traceless activation, we showed that could be generated from 1 in a single sequence without the need for isolating the -glycosyl intermediate 2. The overall step efficiency and yield (64% yield and 52% isolated yield) offer marked advantages over previous chemical -glycosylation approaches that require multiple steps (Fig. 1b).

Experiments were conducted to gain insight into the individual processes for native sugar activation and cross-coupling. As shown in Fig. 2a, nucleophilic substitution of d-glucose afforded 2,3,5,6-tetrafluoropyridine-4-thioglycoside 2 in 85% yield (72% isolated yield) and more than ratio. On the contrary, we found that the corresponding thioglycoside 13 was secured in yield ( isolated yield) and more than ratio from d-maltose 12 under the same established conditions (Fig. 3a). In solution, the and anomers of native sugars can interconvert and exist in equilibrium; each anomer individually reacts with DMC before undergoing stereoinvertive nucleophilic displacement by the thiol (Supplementary Fig. 7).Alternatively, the 2-OH group of the DMC-activated anomeric intermediate may engage in neighbouring group participation by an intramolecular nucleophilic attack to generate a 1,2-anhydro species , which is susceptible to site-selective ring cleavage by the thiol nucleophile. This pathway is probably insignificant in the reaction leading to 13, given that -13 was detected in minor amounts. For other saccharides (Fig. 4), the various pathways for nucleophilic substitution may be favoured to different extents in the reaction system . The structure of the 2,3,5,6-tetrafluoropyridine-4-thioglycoside derived from D-mannose was confirmed by X-ray crystallographic analysis (Supplementary Information section 7).

Fig. 3 | Mechanistic studies. a, Different anomers of the thioglycoside intermediate eventually converge to a stereoisomerically pure -glycosyl product.b, Radical trap experiment supports the intermediacy of a glycosyl radical species.c, UV-vis absorption spectra of reaction components in DMSO. d, Plausible mechanisms for native sugar activation and photoinduced cross-
coupling. Yields were determined by NMR analysis of the crude reaction mixture; yields in parentheses denote isolated yields. : Anomeric ratios were determined by NMR and LC-MS analysis. ESI, electrospray ionization; E, electrophile.

Subjecting 2 and 13 separately to standard cross-coupling conditions with an acrylate gave 11 and 15, respectively, both of which possess the same sense of anomeric selectivity (Fig. 3a). This notably implies that, unlike heterolytic glycosylations, the C1 stereochemistry of the -glycosyl donor is inconsequential, highlighting the
distinct advantage of the present strategy in transforming mixtures of unprotected native sugar isomers, through their thioglycoside derivatives, into stereoisomerically pure glycosides in a streamlined fashion. In a separate study, the addition of exogenous ( -tetramethylpiperidin-1-yl)oxyl(TEMPO) inhibited the photoinduced

Fig. 4 | Scope of the reaction with various native sugars. Cross-coupling of mono- and oligosaccharides through unprotected glycosyl donors to directly afford unprotected -alkyl glycosyl compounds. Yields were determined by
NMR analysis of the crude reaction mixture; yields in parentheses denote isolated yields. Anomeric ratios were determined by NMR and LC-MS analysis. Bn, benzyl.
transformation of 2 to 11 (Fig. 3b). High-resolution mass spectrometry (HRMS) analysis revealed the formation of a complex that can be ascribed to a TEMPO-glycoside adduct 16, providing evidence that a sufficiently long-lived glycosyl (anomeric) radical species is generated during the process. These processes are in contrast to heterolytic glycosylations that essentially lack the formation of a clear intermediate species (for example, glycosyl cation).

We further explored the nature of the photoinduced reaction (using as the model substrate) through ultraviolet-visible absorption (UVvis) spectroscopy (Fig. 3c). Independent absorption spectra of 2 and DABCO revealed bands largely in the UV region, and a mixture of these two components led only to a small redshift that extends into the visible region ( ). By contrast, a DMSO solution of Hantzsch ester exhibited strong absorption in the visible region, but no noticeable changes were observed with a mixture of Hantzsch ester and DABCO. A mixture of 2 and Hantzsch ester showed a slight bathochromic shift, which was amplified when 2 , Hantzsch ester and DABCO were combined together in solution. These results indicate the generation of a putative ternary complex between 2, Hantzsch ester and DABCO, which is proposed to absorb visible light and undergo fragmentation to the glycosyl radical.

The studies presented here support a mechanism as shown in Fig. 3d. Site-selective capping of the more acidic anomeric hydroxyl motif by DMC forms an activated leaving group that undergoes facile nucleophilic attack by 2,3,5,6-tetrafluoropyridine-4-thiol under basic conditions, driven by concomitant generation of 1,3-dimethylimidazolidin-2-one (DMI) as a by-product . Formation of a 1,2-anhydro species before nucleophilic substitution could also
occur and cannot be completely ruled out (Supplementary Fig. 7). The resulting thioglycoside intermediate is postulated to associate with Hantzsch ester and DABCO in solution, affording a ternary complex that can absorb visible light to trigger photoinduced electron transfer (PET) . Consistent with previously documented reactions , the highly electrophilic nature of the fluorinated heteroaryl motif renders the thioglycoside sufficiently redox-active for PET. This delivers dihydropyridine radical 17 and a radical anion 18 , which is prone to desulfurative fragmentation to give a glycosyl radical species and 2,3,5,6-tetrafluoropyridine-4-thiolate (the conjugate acid was detected in the reaction mixture). Subsequent reaction of the glycosyl radical with an electrophilic cross-coupling partner, facilitated by 17, proceeds in a stereoselective manner under kinetic control to give the desired unprotected glycoside.

The generality of our protecting-group-free protocol was highlighted by the wide spectrum of native mono- and oligosaccharides that could be reliably transformed into fully unprotected -alky glycosyl compounds (Fig. 4) through their 2,3,5,6-tetrafluoropyridine-4thioglycoside precursors, which were either isolated or generated in situ and used (without purification) for cross-coupling. Representative examples include pyranoside products constructed from biomass-derived monosaccharides (19-21,24), rare sugars and non-natural L-glucose (25). More complex glycans from natural sources also served as effective substrates to deliver the corresponding -alkyl glycosyl compounds in good efficiency. Across the board, good to excellent stereocontrol was observed.

Besides -unsaturated carbonyl compounds, other alkenes were investigated as cross-coupling partners (Fig. 5a). Densely

isolated yields. Anomeric ratios, diastereomeric ratios (dr) and ratios were determined by NMR and LC-MS analysis. The asterisk indicates the value obtained as a 77:23 E:Z mixture. The dagger indicates D-galactose was used. Ar, aryl; X, halide; Ac, acetyl; Boc, tert-butyloxycarbonyl.
functionalized acrylates and acrylamides conjugated to biologically active compounds (30, 31), an aminosalicylate (32), an amino sugar (33) and oligopeptides (34-36) were compatible substrates, providing access to highly polar -glycosylated conjugates bearing multiple acidic and basic sites. This offers a straightforward way to glycosylate complex molecules with native sugars for various applications, including the design of sugar-based peptidomimetics . Other Michael acceptors such as vinyl sulfone (37), vinylphosphonate (38) and vinylboronate (40) as well as less electrophilic vinyl silane (39) and allyl acetate (41) also underwent efficient reaction to furnish the desired -alkyl glycosyl adducts bearing functional groups that could serve as useful synthetic handles for further manipulations. Of particular note, cross-coupling was found to proceed even in the
presence of a less-activated alkyl-substituted alkene (42). Metabolically stable pseudo-oligosaccharide building blocks such as -glycosidic disaccharide 43 featuring two newly formed stereocentres could be expeditiously assembled with complete stereocontrol through reaction with an exo-glucal as radical acceptor.

To showcase the versatility of the ‘cap and glycosylate’ approach in securing other categories of unprotected saccharides, we replaced the alkene coupling partner with other electrophilic reagents that could participate as radical acceptors. Using a haloalkene reagent (Fig. 5b), a -alkenyl glycosyl compound (44) was successfully secured in high anomeric selectivity; this process is postulated to proceed through a glycosyl radical addition-reduction- halide elimination pathway . -Heteroaryl glycosylation could also be realized by direct coupling

Fig. 6 | Application to direct post-translational chemical glycosylation of proteins. Glycosylation of proteins by cross-coupling of representative native sugars (through capping as thioglycosyl donors) to afford unprotected -alkyl glycosylproteins. Yields were determined by LC-MS analysis based on conversion
of the protein substrate; yields in parentheses denote reactions with in situgenerated and unpurified thioglycosyl donors. Tris, 2-amino-2-(hydroxylmethyl)-propane-1,3-diol; , bis(catecholato)diboron; Man, D-mannosyl; Gal, D-galactosyl; GlcNAc, N-acetyl-d-glucosaminyl.
with heteroarenes under acid-free conditions, delivering unprotected 45-47 selectively at the most electron-deficient sites, which is congruent with a previous report involving fully protected glycosyl radicals . Our heteroarylation approach is complementary to a previously reported metallaphotoredox-enabled deoxygenative strategy (incompatible with native sugars) that involved pre-activation of an exposed anomeric hydroxyl followed by cross-coupling with a heteroaryl halide .

Beyond -glycosylation, we extended the protecting-group-free reaction manifold to the preparation of other glycomimetics such as selenoglycosides (Fig. 5c) and thioglycosides (Fig. 5d). Along with C-glycosyl compounds, these entities have found many applications as robust substitutes of the naturally occurring -saccharides, thus efficient ways to synthesize them in high stereochemical purity are highly desirable. Both unprotected Se-glycosides and -glycosides (50-54) were accessible through reaction with diselenide or disulfide reagents , respectively, comparing favourably with previous protocols that relied on laborious preparation of glycosyl precursors. It is to be noted that 50-54 were exclusively isolated as anomers (compared with anomers from nucleophilic substitution in Fig. 2). Similar to the -glycosyl cases in Figs. 2 and 4, the observed stereochemical outcome for 48-54 could be rationalized by the stabilizing orbital interaction between the nonbonding electron pair of the ring oxygen and the of the incipient bond at the anomeric carbon in the transition state, as the glycosyl radical reacts with the electrophile (Fig. 3d). -glycosylation with phenols could also be achieved by tuning the photoinduced cross-coupling conditions using iodide as reductant (Extended Data Fig. 1).

Encouraged by our successful efforts in small-molecule glycosyl compound synthesis, we attempted to test our ‘cap and glycosylate’ protocol in the synthesis of glycoproteins, which are known to mediate numerous essential biological processes. In nature, glycoproteins are typically formed by linking sugar units to – or -containing side chains of amino acid residues serine, threonine or asparagine using glycosyltransferases, such as the attachment of -linked- -d- -acetylglucosamine ( -GlcNAc) to serine or threonine residues by -GlcNAc transferase. However, this glycosylation can be reversed by intracellular glycosidases, and such a write-and-erase dynamic process makes it challenging to probe the biological functions of glycoproteins. In this context, chemical approaches to generate non-cleavable glycoproteins (such as -glycosylproteins) offer alternative and promising strategies for systematically investigating glycoprotein functions. Nevertheless, post-translational chemical glycosylation of proteins, particularly the attachment of sugar units to proteins by direct anomeric functionalization, is largely unexplored in synthetic carbohydrate and protein chemistry . This may be ascribed to the lack of suitable unprotected glycosyl precursors that are stable yet sufficiently reactive, as well as the stringent requirements for biocompatible conditions, including water compatibility (which quenches heterolytic chemical glycosyl donors), ability to remain non-destructive to biological substrates and low reactivity towards the biogenic functional groups that are present in most biological environments . Owing to the insolubility of Hantzsch ester in the necessary aqueous medium, photoinduced cross-coupling conditions were instead based on the formation of charge-transfer complexes between 2,3,5,6-tetrafluoropyridine-4-thioglycoside and
bis(catecholato)diboron ( ) as reductant (Supplementary Tables 6-8).
After identifying the optimal conditions ( 500 equiv. of , in Tris buffer) as shown in Fig. 6, three mammalian glycoprotein sugars (D-mannose, D-galactose and -acetylglucosamine) were selected to react with dehydroalanine (Dha)-tagged proteins with varying architectures and functions, including histone H 3 (a small -helical nuclear protein), PanC (Mycobacterium tuberculosis pantothenate synthetase enzyme) , PstS (a bacterial phosphate transport protein) and Ss G (an TIM (triose-phosphate isomerase) barrel enzyme) . In the event, all the examined proteins were found to be competent glycosyl radical acceptors under the established conditions, with the desired -alkyl glycosylproteins secured in good to excellent yields across the board regardless of their size and fold. The stereochemistry of the newly formed bond at the anomeric carbon ( selectivity) is presumed to be identical to that of small-molecule glycosylation (Fig. 4). Notably, histone H3-GlcNAc-Ala10 generates a non-cleavable mimetic of the reported epigenetic mark GlcNAc-Ser10 (ref. 61); access to this glycoprotein conjugate may shed light on the poorly understood biological role of this post-translational modification process. Similar efficiencies were also observed in the reactions of different thioglycosyl donors with each given protein (about 85% conversion for eH3-Dha9, about 80% conversion for H3-Dha10, about 55% conversion for TEV H3-Dha2, about conversion for PanC-Dha44 and about conversion for PstS-Dha57). About 5% of a minor product featuring two units of GlcNAc addition was detected for PstS-GlcNAc-Ala57, which we ascribe to non-specific glycosylation of lysine residues (Supplementary Table 9 and Supplementary Fig. 15). Similar to the examples in Figs. 2b, 4 and 5, traceless activation by in situ formation of the -glycosyl intermediates could be implemented without compromising on protein glycosylation efficiency, thereby exemplifying the power of our protecting-group-free ‘cap and glycosylate’ approach allowing native sugars to be directly used for glycosylating proteins post-translationally.

Any methods, additional references, Nature Portfolio reporting summaries, source data, extended data, supplementary information, acknowledgements, peer review information; details of author contributions and competing interests; and statements of data and code availability are available at https://doi.org/10.1038/s41586-024-07548-0.

Publisher’s note Springer Nature remains neutral with regard to jurisdictional claims in published maps and institutional affiliations.

Open Access This article is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License, which permits use, sharing, adaptation, distribution and reproduction in any medium or format, as long as you give appropriate credit to the original author(s) and the source, provide a link to the Creative Commons licence, and indicate if changes were made. The images or other third party material in this article are included in the article’s Creative Commons licence, unless indicated otherwise in a credit line to the material. If material is not included in the article’s Creative Commons licence and your intended use is not permitted by statutory regulation or exceeds the permitted use, you will need to obtain permission directly from the copyright holder. To view a copy of this licence, visit http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.
(c) The Author(s) 2024

The crystallographic data are available free of charge from the Cambridge Crystallographic Data Centre under reference no. CCDC-2263895 (S2).MS/MS raw data files have been uploaded to the PRIDE repository under reference no. PXD046389. All other data are available in the main text or the Supplementary Information.

Acknowledgements This research was supported by the Ministry of Education of Singapore Academic Research Fund Tier 2: A-8000941-00-00 (M.J.K.) and Engineering and Physical Sciences Research Council: V011359/1 (P) (B.G.D.). The Rosalind Franklin Institute is funded by the UK Research and Innovation through the Engineering and Physical Sciences Research Council. J. Wu assisted with LC-MS analysis and preparative HPLC purification for small-molecule glycosylation. D. Jiang assisted with the UV-vis absorption spectroscopic experiments. K. P. Loh assisted with the cyclic voltammetry measurements. G. K. Tan assisted with the X-ray crystallographic measurements. The graphic in Fig. 1a was created with BioRender.com.

Author contributions M.J.K., B.G.D. and Y.J. conceived the work. Y.J., Y.W., Q.-Y.Z., G.-Q.S., Y.Z., W.-Q.L. and N.S. conducted the optimization and reaction scope studies. Y.J. and X.-P.F. conducted the protein glycosylation studies. N.L. and S.M. performed the LC-MS/MS experiments. M.J.K. and B.G.D. directed the research. M.J.K., B.G.D. and Y.J. wrote the paper with input from all authors.

Competing interests Patents have been filed that might afford authors royalties were they to be licensed.

Supplementary information The online version contains supplementary material available at https://doi.org/10.1038/s41586-024-07548-0.
Correspondence and requests for materials should be addressed to Benjamin G. Davis or Ming Joo Koh.
Peer review information Nature thanks the anonymous reviewers for their contribution to the peer review of this work.
Reprints and permissions information is available at http://www.nature.com/reprints.