التوصيل غير الجراحي للبيومكرومولكولات عبر الجلد باستخدام الكيتوزان المعدل بالفلوركربون لعلاج الميلانوما المناعي واللقاحات الفيروسية

النتائج

تحضير مجمعات النانو FCS/البروتين وتقييم قدراتها عبر الجلد خارج الجسم

أ

ب

ف

ج

ح

أنا

ن

ساي 5.5-أوفا

FITC-FCS

مُدمَج

آلية النقل عبر الجلد للمعقدات النانوية المحتوية على FCS

التطبيق الموضعي لمركبات النانو FCS/الأجسام المضادة لعلاج الميلانوما

لإدارة في الجسم الحي لمركبات النانو المعتمدة على FCS الخاصة بنا، مرهم فارغ (أكوافور تم خلط مادة (بشكل رئيسي الفازلين) مع المحلول للحفاظ على الرطوبة لفترة طويلة. ستتحول المراهم الشفافة إلى مراهم تشبه الحليب عند خلطها مع المحاليل. يمكن امتصاص المراهم التي تشبه الحليب خلال 12 ساعة بعد الإعطاء الموضعي لتحقيق توصيل كامل عبر الجلد. لذلك، تم تطبيق الإعطاء لمدة 12 ساعة فقط للعلاج في الجسم الحي للجرعة المطبقة القياسية. لفحص سلوك اختراق الأجسام المضادة المعقدة مع FCS، تم مسح الأورام من الفئران التي تم دهنها بالمراهم المحتوية على نظير مشع. الموسوم IgG ) أو FCS/ تم جمعها لت quantification الأجسام المضادة المنقولة في نقاط زمنية مختلفة (الشكل S9). كما هو موضح في الشكل 3b، مقارنةً بـ free الأجسام المضادة IgG في المرهم المطبق عبر الجلد، أظهر تراكمًا أعلى بشكل ملحوظ في الورم، بينما بدت النشاطات الإشعاعية في الأعضاء الأخرى أقل بكثير. في الوقت نفسه، كما هو موضح في الشكل 3c، وجدنا أن تراكم FCS/IgG في الورم بلغ ذروته عند أكثر من جرعة الحقن لكل جرام من الأنسجة (%ID/g) بعد 12 ساعة

تم تطبيق المرهم (حوالي تم تحديد ID في الورم الكلي في الشكل S 10). عند إزالة المرهم بعد 12 ساعة، انخفض مستوى IgG في الورم قليلاً بعد 24 ساعة. في الوقت نفسه، تم إجراء اختبار ELISA أيضًا للكشف عن تراكم IgG في الورم في تركيبة FCS/IgG المطبقة موضعياً على الأورام في المرهم. كما هو موضح في الشكل S11، أظهر اختبار ELISA نتائج مشابهة لبيانات توزيع الإشعاع المعتمدة على التتبع، حيث يمكن توصيل IgG بكفاءة إلى
الورم خلال 12 ساعة بمساعدة منصة توصيل عبر الجلد باستخدام مجمعات FCS/IgG النانوية. من ناحية أخرى، تم تضمين الأورام مع FCS/IgG-Cy5.5 لقطع الورم. كما هو موضح في الشكل 3d، كانت الإشارات الفلورية لـ IgG-Cy5.5 في الورم تزداد تدريجياً وتوزع بشكل متساوٍ داخل الورم بأكمله خلال 12 ساعة، مما يدل على النقل المستمر للأجسام المضادة من مرهم FCS/IgG-Cy5.5 إلى الورم. لذلك، فإن التراكم

التطبيق الموضعي لمركبات FCS/S1/polyIC للتطعيم عبر الجلد

الشكل 3 | الإيصال عبر الجلد لـ aPDL1 لعلاج أورام الميلانوما B16F10. أ رسم تخطيطي يوضح الإدارة الموضعية عبر الجلد لـ FCS/aPDL1 لعلاج أورام الميلانوما B16F10. تراكم FCS/ I-IgG في الورم في فترات زمنية مختلفة ( ). ج توزيع FCS في الجسم I-IgG بعد 12 ساعة بناءً على قياس النشاط الإشعاعي. تم توضيح التحليل الكلي للتراكم والتوزيع الحيوي في الشكل S10 ( صور تمثيلية متداخلة تظهر تراكم FCS/IgG-Cy5.5 في الورم في فترات زمنية مختلفة ). مقياس الرسم: . منحنيات نمو الورم للفئران في مجموعات مختلفة ( تم إيقاف منحنيات النمو عندما توفيت الفأر الأول في المجموعة المعنية، أو عندما تجاوز حجم ورمها . قياس

الشكل 4 | التأثير الغير مباشر الناتج عن توصيل الأجسام المضادة المشتركة عبر الجلد. أ رسم توضيحي تخطيطي لتوصيل aPDL1 وaCTLA4 عبر الجلد لتثبيط نمو كل من الأورام الأولية والبعيدة. ب-هـ منحنيات نمو الورم للأورام الأولية والبعيدة بعد علاجات مختلفة ( ). تم إيقاف منحنيات النمو عندما ماتت الفأرة الأولى في المجموعة المعنية، أو عندما تجاوز حجم ورم الفأرة الأولى . مخططات تدفق تمثيلية (ف) والتقدير المتعلق لـ

خلايا T و خلايا T في الأورام البعيدة بعد علاجات مختلفة ( ). تقدير لـ خلايا (i) وTregs (CD3 Foxp3 ) (j) في الأورام البعيدة بعد علاجات مختلفة ( ). تم توضيح مخططات تدفق تمثيلية في الشكل S21. تم تقديم البيانات كمتوسط انحراف معياري. تم حساب الدلالة الإحصائية عبر ANOVA أحادي الاتجاه مع اختبار Tukey بعد ذلك. . يتم توفير بيانات المصدر كملف بيانات المصدر.

(الشكل 5a). لاحظ أن poly IC كـ RNA مزدوج الشريطة هو منبه لمستقبلات Toll-like 3 (TLR 3) وقد تم استخدامه بشكل شائع كمعزز مناعي . كما قمنا بتحسين نسبة FCS: المستضد: PolyIC في لقاح FCS/S1/ PolyIC. في هذه التجربة، تم استخدام OVA كمستضد معدل لتحسين التركيبة. كما هو موضح في الشكل 5c، d، أظهر FCS/OVA/polyIC بنسب كتلة مختلفة أحجامًا متغيرة بحوالي 200 نانومتر وزيادة في الجهد الزتاوي مع زيادة FCS.

قدرة اختراق المركبات النانوية المعتمدة على FCS في نماذج الأرانب والخنازير

في هذه الأثناء، تم إجراء اختبارات الاختراق خارج الجسم أيضًا على جلود الخنازير. تم الحصول على جلود الخنازير من ظهر الخنازير الصغيرة في عمر ثلاثة أشهر وتمت إزالة جميع طبقة الدهون تحت الجلد لتقييم أكثر دقة. تم قياس مقاومات الجلد قبل وبعد الاختبار لتأكيد سلامة الجلد (الشكل S30). وبالمثل، أظهر اختبار انتشار فرانز أن FCS/IgG حقق أيضًا قدرة على الانتقال عبر الجلد تصل إلى (مجموع البروتينات التي تم اختراقها واحتجازها داخل الجلد). قد تكون الفعالية الأكبر ناتجة عن حجم بصيلات الشعر والغدد العرقية الأكبر في الخنازير. بالإضافة إلى ذلك،

أظهرت الصورة المجسمة لشرائح جلد الخنازير أيضًا اختراقًا كبيرًا للأجسام المضادة IgG المعلّمة بالفلوروسنت في منطقة الأدمة لجلود الخنازير التي تم تطبيقها موضعيًا باستخدام FCS/IgG-Cy5.5 (الشكل 6i، j). بشكل جماعي، أظهرت مجمعات البروتينات النانوية FCS/ نجاحًا في توصيل البروتينات عبر الجلد إلى الأدمة والمناطق تحت الجلد لجلود الفئران والأرانب والخنازير.

نقاش

طرق

بيان أخلاقي

المواد، خطوط الخلايا، ونماذج الحيوانات

تركيب الكيتوزان المعدل بالفلوروكربون

تحضير النانومركبات المعتمدة على FCS

كفاءة توصيل عبر الجلد

تحضير مرهم عبر الجلد قائم على FCS وإدارته في الجسم الحي

توسيم، استقرار، وتوزيع حيوي داخل الكائن الحي

علاج في الجسم الحي للورم الميلانيني

تلطيخ المناعة الفلورية

تحليل خلايا T في أعضاء مختلفة

مستوى الأجسام المضادة الخاصة بـ S1

ملخص التقرير

توفر البيانات

References

1. Prausnitz, M. R. & Langer, R. Transdermal drug delivery. Nat. Biotechnol. 26, 1261-1268 (2008).
2. Prausnitz, M. R., Mitragotri, S. & Langer, R. Current status and future potential of transdermal drug delivery. Nat. Rev. Drug Discov. 3, 115-124 (2004).
3. Alkilani, A., McCrudden, M. T. & Donnelly, R. Transdermal drug delivery: innovative pharmaceutical developments based on disruption of the barrier properties of the stratum corneum. Pharmaceutics 7, 438-470 (2015).
4. Prausnitz, M. R. Microneedles for transdermal drug delivery. Adv. Drug Deliv. Rev. 56, 581-587 (2004).
5. Naik, A., Kalia, Y. N. & Guy, R. H. Transdermal drug delivery: overcoming the skin’s barrier function. Pharm. Sci. Technol. Today 3, 318-326 (2000).
6. Karande, P., Jain, A., Ergun, K., Kispersky, V. & Mitragotri, S. Design principles of chemical penetration enhancers for transdermal drug delivery. Proc. Natl Acad. Sci. USA 102, 4688-4693 (2005).
7. Amjadi, M., Mostaghaci, B. & Sitti, M. Recent advances in skin penetration enhancers for transdermal gene and drug delivery. Curr. Gene Ther. 17, 139-146 (2017).
8. Ahn, D.-G. et al. Current status of epidemiology, diagnosis, therapeutics, and vaccines for novel coronavirus disease 2019 (COVID19). J. Microbiol. Biotechnol. 30, 313-324 (2020).
9. Ita, K. Transdermal delivery of vaccines-recent progress and critical issues. Biomed. Pharmacother. 83, 1080-1088 (2016).
10. Nasrollahi, S. A., Taghibiglou, C., Azizi, E. & Farboud, E. S. Cellpenetrating peptides as a novel transdermal drug delivery system. Chem. Biol. Drug Des. 80, 639-646 (2012).
11. Desai, P., Patlolla, R. R. & Singh, M. Interaction of nanoparticles and cell-penetrating peptides with skin for transdermal drug delivery. Mol. Membr. Biol. 27, 247-259 (2010).
12. Tadros, A. R. et al. STAR particles for enhanced topical drug and vaccine delivery. Nat. Med. 26, 341-347 (2020).
13. Zheng, D. et al. Topical delivery of siRNA-based spherical nucleic acid nanoparticle conjugates for gene regulation. Proc. Natl Acad. Sci. USA 109, 11975-11980 (2012).
14. Chen, Y. et al. Transdermal protein delivery by a coadministered peptide identified via phage display. Nat. Biotechnol. 24, 455-460 (2006).
15. Marwah, H., Garg, T., Goyal, A. K. & Rath, G. Permeation enhancer strategies in transdermal drug delivery. Drug Deliv. 23, 564-578 (2016).
16. Cross, S. & Roberts, M. Physical enhancement of transdermal drug application: is delivery technology keeping up with pharmaceutical development? Curr. Drug Deliv. 1, 81-92 (2004).
17. Nanda, A., Nanda, S. & Khan Ghilzai, N. Current developments using emerging transdermal technologies in physical enhancement methods. Curr. Drug Deliv. 3, 233-242 (2006).
18. Smith, T. R. F. et al. Immunogenicity of a DNA vaccine candidate for COVID-19. Nat. Commun. 11, 2601 (2020).
19. Xia, D. et al. An ultra-low-cost electroporator with microneedle electrodes (ePatch) for SARS-CoV-2 vaccination. Proc. Natl Acad. Sci. USA 118, e2110817118 (2021).
20. Tran, K. T. M. et al. Transdermal microneedles for the programmable burst release of multiple vaccine payloads. Nat. Biomed. Eng. 5, 998-1007 (2020).
21. Lu, B. et al. lonic liquid transdermal delivery system: progress, prospects, and challenges. J. Mol. Liq. 351, 118643 (2022).
22. Song, X. et al. Transcutaneous tumor vaccination combined with anti-programmed death-1 monoclonal antibody treatment produces a synergistic antitumor effect. Acta Biomater. 140, 247-260 (2022).
23. Yang, X. et al. Galactosylated chitosan-modified ethosomes combined with silk fibroin nanofibers is useful in transcutaneous immunization. J. Controlled Release 327, 88-99 (2020).
24. Shariatinia, Z. Pharmaceutical applications of chitosan. Adv. Colloid Interface Sci. 263, 131-194 (2019).
25. Li, G. et al. Fluorinated chitosan to enhance transmucosal delivery of sonosensitizer-conjugated catalase for sonodynamic bladder cancer treatment post-intravesical instillation. ACS Nano 14, 1586-1599 (2020).
26. Zhou, X. et al. Nano-formulations for transdermal drug delivery: a review. Chin. Chem. Lett. 29, 1713-1724 (2018).
27. Niu, X.-Q. et al. Mechanism investigation of ethosomes transdermal permeation. Int J. Pharm. X 1, 100027 (2019).
28. Lueßen, H. L. et al. Bioadhesive polymers for the peroral delivery of peptide drugs. J. Controlled Release 29, 329-338 (1994).
29. Illum, L., Farraj, N. F. & Davis, S. S. Chitosan as a novel nasal delivery system for peptide drugs. Pharm. Res. 11, 1186-1189 (1994).
30. Antonescu, I. E. et al. The permeation of acamprosate is predominantly caused by paracellular diffusion across cell monolayers: a paracellular modeling approach. Mol. Pharm. 16, 4636-4650 (2019).
31. Bittermann, K. & Goss, K.-U. Predicting apparent passive permeability of CaCo-2 and MDCK cell-monolayers: a mechanistic model. PLoS ONE 12, e0190319 (2017).
32. Ahmadi, S. et al. A human-origin probiotic cocktail ameliorates aging-related leaky gut and inflammation via modulating the microbiota/taurine/tight junction axis. JCI Insight 5, e132055 (2020).
33. Robert-Paganin, J., Pylypenko, O., Kikuti, C., Sweeney, H. L. & Houdusse, A. Force generation by myosin motors: a structural perspective. Chem. Rev. 120, 5-35 (2020).
34. Kováčik, A., Kopečná, M. & Vávrová, K. Permeation enhancers in transdermal drug delivery: benefits and limitations. Expert Opin. Drug Deliv. 17, 145-155 (2020).
35. Fan, K. et al. Ferritin nanocarrier traverses the blood brain barrier and kills glioma. ACS Nano 12, 4105-4115 (2018).
36. Liu, Y. et al. A brief review for fluorinated carbon: synthesis, properties and applications. Nanotechnol. Rev. 8, 573-586 (2019).
37. Lee, Y.-S. Syntheses and properties of fluorinated carbon materials. J. Fluor Chem. 128, 392-403 (2007).
38. Miller, A. J. & Mihm, M. C. Melanoma. N. Engl. J. Med. 355, 51-65 (2006).
39. Franklin, C., Livingstone, E., Roesch, A., Schilling, B. & Schadendorf, D. Immunotherapy in melanoma: recent advances and future directions. Eur. J. Surg. Oncol. 43, 604-611 (2017).
40. Martin-Liberal, J., Kordbacheh, T. & Larkin, J. Safety of pembrolizumab for the treatment of melanoma. Expert Opin. Drug Saf. 14, 957-964 (2015).
41. Cao, . et al. Granzyme and perforin are important for regulatory cell-mediated suppression of tumor clearance. Immunity 27, 635-646 (2007).
42. Wei, S. C. et al. Distinct cellular mechanisms underlie anti-CTLA-4 and anti-PD-1 checkpoint blockade. Cell 170, 1120-1133.e17 (2017).
43. Seidel, J. A., Otsuka, A. & Kabashima, K. Anti-PD-1 and anti-CTLA-4 therapies in cancer: mechanisms of action, efficacy, and limitations. Front Oncol. 8, 86 (2018).
44. Dammeijer, F. et al. The PD-1/PD-L1-checkpoint restrains T cell immunity in tumor-draining lymph nodes. Cancer Cell 38, 685-700.e8 (2020).
45. Jiang, W. et al. Exhausted CD8+T cells in the tumor immune microenvironment: new pathways to therapy. Front Immunol. 11, 622509 (2021).
46. Pielenhofer, J., Sohl, J., Windbergs, M., Langguth, P. & Radsak, M. P. Current progress in particle-based systems for transdermal vaccine delivery. Front. Immunol. 11, 266 (2020).
47. Corbett, K. S. et al. SARS-CoV-2 mRNA vaccine design enabled by prototype pathogen preparedness. Nature 586, 567-571 (2020).
48. Elia, U. et al. Design of SARS-CoV-2 hFc-Conjugated ReceptorBinding Domain mRNA Vaccine Delivered via Lipid Nanoparticles. ACS Nano 15, 9627-9637 (2021).
49. Zhang, N.-N. et al. A thermostable mRNA vaccine against COVID-19. Cell 182, 1271-1283.e16 (2020).
50. Chakraborty, C., Bhattacharya, M. & Dhama, K. SARS-CoV-2 vaccines, vaccine development technologies, and significant efforts in vaccine development during the pandemic: the lessons learned might help to fight against the next pandemic. Vaccines 11, 682 (2023).
51. Cheng, Y. & Xu, F. Anticancer function of polyinosinic-polycytidylic acid. Cancer Biol. Ther. 10, 1219-1223 (2010).
52. Rydyznski Moderbacher, C. et al. Antigen-specific adaptive immunity to SARS-CoV-2 in acute COVID-19 and associations with age and disease severity. Cell 183, 996-1012.e19 (2020).
53. Shi, J., Li, Y., Chang, W., Zhang, X. & Wang, F.-S. Current progress in host innate and adaptive immunity against hepatitis C virus infection. Hepatol. Int 11, 374-383 (2017).
54. Rahe, M. & Murtaugh, M. Mechanisms of adaptive immunity to porcine reproductive and respiratory syndrome virus. Viruses 9, 148 (2017).
55. Schudel, A., Francis, D. M. & Thomas, S. N. Material design for lymph node drug delivery. Nat. Rev. Mater. 4, 415-428 (2019).
56. Davies, M. & Duffield, E. A. Safety of checkpoint inhibitors for cancer treatment: strategies for patient monitoring and management of immune-mediated adverse events. Immunotargets Ther. 6, 51-71 (2017).

شكر وتقدير

مساهمات المؤلفين

المصالح المتنافسة

معلومات إضافية

Non-invasive transdermal delivery of biomacromolecules with fluorocarbon-modified chitosan for melanoma immunotherapy and viral vaccines

Results

Preparation of FCS/protein nanocomplexes and ex vivo evaluation of their transdermal abilities

a

b

f

g

h

i

n

Cy5.5-OVA

FITC-FCS

Merged

Transdermal mechanism of FCS-containing nanocomplexes

Topical application of FCS/antibody nanocomplexes for melanoma treatment

For in vivo administration of our FCS-based nanocomplexes, blank ointment (Aquaphor , mainly petrolatum) was mixed with the solution to keep moisture for a long time. The transparent blank ointment would turn into milk-like ointment when mixed with solutions. The milk-like ointment could be absorbed in 12 h after topical administration for full transdermal delivery. Therefore, the administration was applied only for 12 h for in vivo treatment for a standard applied dosage. To examine the topical penetration behavior of antibodies complexed with FCS, tumors from the mice swiped with ointment containing radioisotope labeled IgG ( ) or FCS/ were collected for quantification of transmitted antibodies at different time points (Fig. S9). As shown in Fig. 3b, compared with free I-IgG in the transdermally applied ointment, showed dramatically higher accumulation in the tumor, while the radioactivities in other organs appeared to be much lower. Meanwhile, as shown in Fig. 3c, we found that the tumor accumulation of FCS/IgG showed the peaked level at over of injected dose per gram tissue (%ID/g) at 12 h post

the ointment was applied (about ID in the total tumor in Figure S 10 ). As the ointment was removed at 12 h , the IgG level in the tumor decreased slightly at 24 h . Meanwhile, the ELISA assay was also conducted to detect the tumor accumulation of IgG in the FCS/IgG formulation topically applied to tumors in the ointment. As shown in Fig. S11, the ELISA assay showed similar results with the radiolabelingbased biodistribution data that IgG could be efficiently delivered into
the tumor within 12 h with the aid of transdermal delivery platform using FCS/IgG nanocomplexes. On the other hand, the tumors with FCS/IgG-Cy5.5 were imbedded for tumor slicing. As illustrated in Fig. 3d, the fluorescent signals of IgG-Cy5.5 in the tumor were gradually increased and evenly disbursed inside the whole tumor within 12 h , demonstrating the continuous transmission of antibodies from the FCS/IgG-Cy5.5 ointment into the tumor. Therefore, the accumulation

Topical application of FCS/S1/polyIC nanocomplexes for transdermal vaccination

Fig. 3 | Transdermal delivery of aPDL1 for the treatment of B16F10 melanoma tumors. a Schematic illusions illustrating the localized transdermal administration of FCS/aPDL1 for the treatment of B16F10 melanoma tumors. The accumulation of FCS/ I-IgG in the tumor at different time intervals ( ). c Biodistribution of FCS I-IgG at 12 h based on radioactivity measurement. The total accumulation and biodistribution analysis was illustrated in Fig. S10 ( ). d Representative confocal images showing the accumulation of FCS/IgG-Cy5.5 in the tumor at different time intervals ( ). Scale bar: . e Tumor growth curves of mice in different groups ( ). Growth curves were stopped when the first mouse in the related group was dead, or its tumor size exceeded . f Quantification of