DOI: https://doi.org/10.1364/boe.601121
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/40894605
تاريخ النشر: 2026-05-29
المؤلف: Andrew E. S. Barentine وآخرون
الموضوع الرئيسي: تقنيات المجهر الفلوري المتقدمة
نظرة عامة
تصف هذه القسم مخطط كشف جديد مصمم لتحديد موضع دوال انتشار النقاط لزوج الحلزون في مجهرية تحديد المواقع الجزيئية الفردية ثلاثية الأبعاد (SMLM) أو تتبعها. تستخدم الطريقة المقترحة مرشحات قابلة للتوجيه لاستخراج كل من الموضع ثنائي الأبعاد واتجاه الفص (الذي يتوافق مع الموضع المحوري) للجزيئات بكفاءة. ومن الجدير بالذكر أن هذه الطريقة تتطلب فقط 7 عمليات تلافيف، مما يقلل بشكل كبير من التعقيد الحسابي مقارنة بالطرق المعتمدة على التعلم العميق، التي تتطلب عادةً عددًا أكبر بكثير من عمليات التلافيف.
لتحسين تحليل SMLM، يدمج المؤلفون هذا المخطط للكشف مع عملية ملائمة تستخدم نموذج غاوسي مزدوج مُعَلم بشكل مثالي. علاوة على ذلك، قاموا بتطوير كلا العنصرين كإضافة لبيئة المجهر مفتوحة المصدر PYthon Microscopy Environment (PYME)، مما يسهل الوصول إليها واستخدامها للباحثين في هذا المجال. يمثل هذا العمل تقدمًا كبيرًا في كفاءة تحليل SMLM، مما قد يحسن من سرعة ودقة دراسات تتبع الجزيئات الفردية.
نقاش
في هذا القسم، يناقش المؤلفون تنفيذ إضافة للكشف لبيئة المجهر PYthon (PYME)، والتي تستخدم ملاءمة غاوسية مزدوجة لتعزيز نسبة الإشارة إلى الضوضاء (SNR) وتقدير الخلفية. تتضمن الإضافة روتينات المعايرة لتحسين معلمة المرشح $\sigma_f$ بناءً على دالة انتشار النقاط لزوج الحلزون (DH PSF) في مجموعة المعايرة. كما تتضمن وحدة تحول الاتجاه الملائم إلى موضع المصدر المحوري، مما يسمح بتقدير عدم اليقين للمعلمات مثل زاوية الاتجاه $\theta$، الموضع المحوري $z$، ومقاييس أخرى ذات صلة.
يبرز المؤلفون توفر تقديرات عدم اليقين لمختلف المعلمات في PYMEVisualize، مما يساعد في تصفية المواقع. يشيرون إلى أن التصفية بناءً على انحراف الموضع المركزي الملائم عن الموضع المكتشف في البداية تزيل بشكل فعال الاكتشافات الزائفة، خاصة حول المصادر الساطعة مثل الكرات المرجعية. يعبر المؤلفون عن تفاؤلهم بأن هذا البرنامج سيكون مفيدًا للمستخدمين الذين يعملون مع DH PSFs ويقترحون أن تحسينًا إضافيًا لعمليات الكشف والملاءمة قد يمكّن من تقديرات سريعة للمواقع ثلاثية الأبعاد، مما سيكون مفيدًا للتطبيقات في الوقت الحقيقي مثل تصحيح الانجراف في تجارب التتبع. بالإضافة إلى ذلك، يقترحون إمكانية تطوير تقنيات تقدير الاتجاه باستخدام مرشحات قابلة للتوجيه مصممة لـ DH أو PSFs أخرى مهندسة.
DOI: https://doi.org/10.1364/boe.601121
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/40894605
Publication Date: 2026-05-29
Author(s): Andrew E. S. Barentine et al.
Primary Topic: Advanced Fluorescence Microscopy Techniques
Overview
This section describes a novel detection scheme designed for the localization of Double Helix point-spread functions in 3D single-molecule localization microscopy (SMLM) or tracking. The proposed method utilizes steerable filters to efficiently extract both the 2D position and lobe orientation (which corresponds to the axial position) of the molecules. Notably, this approach requires only 7 convolutions, significantly reducing computational complexity compared to deep learning-based methods, which typically demand a much larger number of convolutions.
To enhance the SMLM analysis, the authors integrate this detection scheme with a fitting process that employs an optimally parameterized double Gaussian model. Furthermore, they have developed both components as a plugin for the open-source PYthon Microscopy Environment (PYME), facilitating accessibility and usability for researchers in the field. This work represents a significant advancement in the efficiency of SMLM analysis, potentially improving the speed and accuracy of single-molecule tracking studies.
Discussion
In this section, the authors discuss the implementation of a detection plugin for the PYthon Microsopy Environment (PYME), which utilizes a double Gaussian fit to enhance signal-to-noise ratio (SNR) thresholding and background estimation. The plugin incorporates calibration routines to optimize the filter parameter $\sigma_f$ based on a double-helix point spread function (DH PSF) calibration z-stack. It also includes a module that converts fitted orientation to axial emitter position, allowing for straightforward uncertainty estimation of parameters such as orientation angle $\theta$, axial position $z$, and other relevant metrics.
The authors highlight the availability of uncertainty estimates for various parameters in PYMEVisualize, which aids in filtering localizations. They note that filtering based on the deviation of the fitted center position from the initially detected position effectively removes spurious detections, particularly around bright emitters like fiducial beads. The authors express optimism that this software will be beneficial for users working with DH PSFs and suggest that further optimization of the detection and fitting processes could enable rapid 3D position estimates, which would be advantageous for real-time applications such as drift correction in tracking experiments. Additionally, they propose the potential development of orientation estimation techniques using steerable filters tailored to DH or other engineered PSFs.