DOI: https://doi.org/10.3389/fvets.2025.1730229
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/41613769
تاريخ النشر: 2026-01-14
المؤلف: Chaoqun Yan وآخرون
الموضوع الرئيسي: البحوث حول العدوى الميكروبية والأمراض
نظرة عامة
في هذه الدراسة، يتناول المؤلفون التحديات المرتبطة بأساليب التشخيص الحالية لباستوريلا مولتوسيدا (Pm)، وهو مسبب رئيسي للأمراض التنفسية في الأغنام. تعيق التقنيات التقليدية مثل عزل البكتيريا، ELISA، وPCR بسبب انخفاض الإنتاجية والتعقيد، مما يجعلها غير عملية للتطبيقات الميدانية. للتغلب على هذه القيود، طور الباحثون طريقة سريعة وحساسة للكشف تدمج بين تضخيم البوليميراز المعاد التركيب (RPA) وتقنية CRISPR/Cas12a، مستهدفة جين kmt1، الذي يعتبر “المعيار الذهبي” للكشف عن Pm.
أظهر الاختبار المحسن حد كشف قدره $5 \times 10^{-1}$ نسخ/μL، مع الحصول على النتائج في أقل من 30 دقيقة. عند اختباره على 102 عينة سريرية، حققت طريقة RPA-CRISPR/Cas12a معدل كشف إيجابي قدره 40.20% (41/102)، متفوقة بشكل كبير على PCR التقليدي، الذي كان لديه معدل إيجابي أقل بمقدار 4.1 مرة. تقدم هذه الطريقة المبتكرة حلاً واعدًا للكشف السريع وغير المعتمد على الأجهزة عن Pm في البيئات السريرية، مما قد يقلل من المراضة والوفيات في مجموعات الأغنام المتأثرة.
مقدمة
تناقش مقدمة ورقة البحث التأثير الكبير ل*باستوريلا مولتوسيدا* (Pm)، وهي بكتيريا سالبة الغرام مسؤولة عن مجموعة من الأمراض المعدية في الماشية، بما في ذلك الإنتان النزفي الحاد، الذي يشكل تهديدات اقتصادية خطيرة بسبب ظهوره السريع ومعدلات الوفيات العالية. تتطلب أساليب التشخيص الحالية، على الرغم من فعاليتها، غالبًا ظروف مختبرية متخصصة غير قابلة للتطبيق في البيئات ذات الموارد المحدودة. يتم تسليط الضوء على تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) باعتباره المعيار الذهبي للكشف بسبب خصوصيته وموثوقيته، ولكن اعتماده على معدات متطورة يحد من قابليته للاستخدام الميداني.
لمعالجة هذه التحديات، تقدم الورقة طريقة كشف مبتكرة تدمج بين تضخيم البوليميراز المعاد التركيب (RPA) ونظام CRISPR/Cas12a. RPA هي تقنية سريعة وفعالة من حيث التكلفة تعمل عند درجة حرارة ثابتة، مما يسمح بتضخيم سريع للحمض النووي. تعزز التكامل مع CRISPR/Cas12a الحساسية والبساطة في عملية التشخيص، مما يجعلها مناسبة للاستخدام في الموقع. توضح الدراسة تحسين بريميرات RPA المستهدفة لجين *kmt1* من Pm، وفحص مرشحي RNA CRISPR، والتقييم المنهجي لحساسية وخصوصية الاختبار. تم اختبار جدوى الطريقة على عينات سريرية، مما يظهر إمكاناتها كأداة تشخيصية سريعة وموثوقة ل*P. مولتوسيدا* في البيئات ذات الموارد المنخفضة.
طرق
في هذه الدراسة، استخدم المؤلفون مجموعة تضخيم البوليميراز المعاد التركيب (RPA) للتضخيم المتساوي الحرارة، المستمدة من شركة Amp-Future Biotech Co., Ltd. (تشانغتشو، الصين). تم الحصول على بريميرات RPA اللازمة، وRNA CRISPR (crRNAs)، وبروبيات الحمض النووي أحادي السلسلة (ssDNA) من شركة Tsingke Biotechnology Co., Ltd. (بكين، الصين). بالإضافة إلى ذلك، تم الحصول على إنزيم EnGen® Lb Cas12a (Cpf1) من New England BioLabs (بكين، الصين)، بينما تم تزويد مجموعة استخراج الحمض النووي من شركة ONOBATE Biotech Co., Ltd. (شيانغيانغ، الصين). كانت هذه المواد ضرورية للإجراءات التجريبية التي أجريت في البحث.
نتائج
يقدم قسم “النتائج” في ورقة البحث النتائج الرئيسية المستمدة من التجارب أو التحليلات التي تم إجراؤها. يسلط الضوء على النتائج المهمة التي تدعم الفرضيات أو أسئلة البحث المطروحة سابقًا في الدراسة. يتم عادةً توضيح البيانات من خلال أشكال مختلفة من التمثيل، مثل الجداول، الرسوم البيانية، أو المعادلات، التي توفر تصورًا واضحًا للنتائج.
قد يتضمن القسم أيضًا تحليلات إحصائية تتحقق من النتائج، مما يشير إلى موثوقية وأهمية النتائج. على سبيل المثال، قد يتم الإبلاغ عن قيم p أو فترات الثقة لإظهار الأهمية الإحصائية للتأثيرات الملحوظة. بشكل عام، يخدم هذا القسم لنقل الاكتشافات الأساسية للبحث، مما يمهد الطريق للنقاش والتفسير اللاحق.
نقاش
في هذه الدراسة، تم تطوير طريقة كشف جديدة RPA-CRISPR/Cas12a لتحديد *باستوريلا مولتوسيدا* (Pm) في عينات سريرية من الماشية، وخاصة الأغنام في شينجيانغ، الصين. تدمج الطريقة بين تضخيم البوليميراز المعاد التركيب (RPA) وتقنية CRISPR/Cas12a، مما يسمح بالكشف السريع والحساس دون الحاجة إلى معدات مختبرية متطورة. شمل عملية التحسين تصميم بريميرات RPA محددة لجين kmt1 من Pm، وتحديد ظروف التفاعل المثلى (38 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة)، واختيار تسلسلات crRNA الفعالة لتنشيط Cas12a. أظهر نظام الكشف النهائي 100% خصوصية وحساسية قدرها 5 × 10⁻¹ نسخ/μL، متفوقًا بشكل كبير على طرق PCR التقليدية.
كشفت الاختبارات السريرية عن معدل كشف قدره 40.2% بين 102 عينة مسحة أنفية، مما يشير إلى انتشار أعلى لـ Pm مما تم الإبلاغ عنه سابقًا. كانت التوافق بين طريقة RPA-CRISPR/Cas12a وPCR 100%، مما يؤكد موثوقية النهج الجديد. تسلط هذه الدراسة الضوء على إمكانات نظام RPA-CRISPR/Cas12a كأداة عملية للتشخيص الميداني، مع معالجة قيود PCR التقليدي من حيث السرعة والحساسية ومتطلبات التشغيل. ستركز الأعمال المستقبلية على تحسين بروتوكولات معالجة العينات والتحقق من الطريقة مقابل المعايير الذهبية الحالية لتأسيس قابليتها السريرية بشكل أكبر.
DOI: https://doi.org/10.3389/fvets.2025.1730229
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/41613769
Publication Date: 2026-01-14
Author(s): Chaoqun Yan et al.
Primary Topic: Microbial infections and disease research
Overview
In this study, the authors address the challenges associated with current diagnostic methods for Pasteurella multocida (Pm), a significant pathogen responsible for respiratory diseases in sheep. Traditional techniques such as bacterial isolation, ELISA, and PCR are hindered by low throughput and complexity, making them impractical for field applications. To overcome these limitations, the researchers developed a rapid and sensitive detection method that integrates recombinase polymerase amplification (RPA) with CRISPR/Cas12a technology, targeting the kmt1 gene, which is considered the “gold standard” for Pm detection.
The optimized assay demonstrated a detection limit of $5 \times 10^{-1}$ copies/μL, with results obtained in under 30 minutes. When tested on 102 clinical samples, the RPA-CRISPR/Cas12a method achieved a positive detection rate of 40.20% (41/102), significantly outperforming traditional PCR, which had a positive rate 4.1 times lower. This innovative approach presents a promising solution for rapid and instrument-free detection of Pm in clinical settings, potentially reducing morbidity and mortality in affected sheep populations.
Introduction
The introduction of the research paper discusses the significant impact of *Pasteurella multocida* (Pm), a gram-negative bacterium responsible for various infectious diseases in livestock, including acute hemorrhagic septicemia, which poses severe economic threats due to its rapid onset and high mortality rates. Current diagnostic methods, while effective, often require specialized laboratory conditions that are not feasible in resource-limited settings. Polymerase chain reaction (PCR) is highlighted as the gold standard for detection due to its specificity and reliability, but its dependence on sophisticated equipment limits its field applicability.
To address these challenges, the paper introduces an innovative detection method that integrates recombinase polymerase amplification (RPA) with the CRISPR/Cas12a system. RPA is a rapid, cost-effective technique that operates at a constant temperature, allowing for quick DNA amplification. The integration with CRISPR/Cas12a enhances the sensitivity and simplicity of the diagnostic process, making it suitable for onsite use. The study details the optimization of RPA primers targeting the *kmt1* gene of Pm, the screening of candidate CRISPR RNAs, and the systematic evaluation of assay sensitivity and specificity. The method’s feasibility was tested on clinical samples, demonstrating its potential as a rapid and reliable diagnostic tool for *P. multocida* in low-resource environments.
Methods
In this study, the authors utilized a recombinase polymerase amplification (RPA) kit for isothermal amplification, sourced from Amp-Future Biotech Co., Ltd. (Changzhou, China). The necessary RPA primers, CRISPR RNA (crRNAs), and single-stranded DNA (ssDNA) probes were procured from Tsingke Biotechnology Co., Ltd. (Beijing, China). Additionally, the enzyme EnGen® Lb Cas12a (Cpf1) was obtained from New England BioLabs (Beijing, China), while the DNA extraction kit was supplied by ONOBATE Biotech Co., Ltd. (Xianyang, China). These materials were essential for the experimental procedures conducted in the research.
Results
The “Results” section of the research paper presents key findings derived from the conducted experiments or analyses. It highlights significant outcomes that support the hypotheses or research questions posed earlier in the study. The data is typically illustrated through various forms of representation, such as tables, graphs, or equations, which provide a clear visualization of the results.
The section may also include statistical analyses that validate the findings, indicating the reliability and significance of the results. For instance, p-values or confidence intervals might be reported to demonstrate the statistical significance of observed effects. Overall, this section serves to convey the core discoveries of the research, laying the groundwork for subsequent discussion and interpretation.
Discussion
In this study, a novel RPA-CRISPR/Cas12a detection method was developed for identifying *Pasteurella multocida* (Pm) in clinical samples from livestock, particularly sheep in Xinjiang, China. The method integrates recombinase polymerase amplification (RPA) with CRISPR/Cas12a technology, allowing for rapid and sensitive detection without the need for sophisticated laboratory equipment. The optimization process involved designing specific RPA primers for the Pm kmt1 gene, determining optimal reaction conditions (38 °C for 15 minutes), and selecting effective crRNA sequences for Cas12a activation. The final detection system demonstrated 100% specificity and a sensitivity of 5 × 10⁻¹ copies/μL, significantly outperforming traditional PCR methods.
Clinical testing revealed a detection rate of 40.2% among 102 nasal swab samples, indicating a higher prevalence of Pm than previously reported. The concordance between the RPA-CRISPR/Cas12a method and PCR was 100%, confirming the reliability of the new approach. This study highlights the potential of the RPA-CRISPR/Cas12a system as a practical tool for field diagnostics, addressing the limitations of conventional PCR in terms of speed, sensitivity, and operational requirements. Future work will focus on optimizing sample processing protocols and validating the method against existing gold standards to further establish its clinical applicability.