المركبات الإندولية المستمدة من الميكروبيوتا تخفف الالتهاب المعوي وتعدل الميكروبيوم من خلال التغذية المتبادلة بين الميكروبات Microbiota-derived indoles alleviate intestinal inflammation and modulate microbiome by microbial cross-feeding

المجلة: Microbiome، المجلد: 12، العدد: 1
DOI: https://doi.org/10.1186/s40168-024-01750-y
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38504383
تاريخ النشر: 2024-03-19

المركبات الإندولية المستمدة من الميكروبيوتا تخفف الالتهاب المعوي وتعدل الميكروبيوم من خلال التغذية المتبادلة بين الميكروبات

غانغ وانغ يوشين فان غولونغ تشانغ شوانغ كاي يونغهانغ ما ليجي يانغ يومينغ وانغ هايتاو يو شيان قياو و شيانغفانغ زينغ

الملخص

الخلفية: تلعب تفاعلات المضيف والميكروبات دورًا حاسمًا في الحفاظ على التوازن الداخلي وقابلية الإصابة بالأمراض، وتعتبر نواتج التمثيل الغذائي للتريبتوفان الميكروبية من المنظمات القوية لفيزيولوجيا المضيف. ومع ذلك، لا يزال غير واضح ما إذا كانت هذه النواتج وكيفية تأثيرها على تفاعلات المضيف والميكروبات، خاصة من حيث التواصل بين الميكروبات. النتائج: هنا، أظهرنا أن حمض الإندول-3-لاكتك (ILA) هو جزيء رئيسي تنتجه بكتيريا اللاكتوباسيلس في الحماية من الالتهابات المعوية وتصحيح اختلال الميكروبات. على وجه التحديد، تقوم بكتيريا اللاكتوباسيلس بتمثيل التريبتوفان إلى ILA، مما يعزز التعبير عن إنزيمات بكتيرية رئيسية مرتبطة بتمثيل التريبتوفان، مما يؤدي إلى تخليق نواتج إندول أخرى بما في ذلك حمض الإندول-3-بروبيونيك (IPA) وحمض الإندول-3-أسيتيك (IAA). من الجدير بالذكر أن ILA وIPA وIAA تمتلك القدرة على تخفيف الالتهابات المعوية وتعديل الميكروبات المعوية في نماذج التهاب القولون العفوي المستحث بـ DSS وIL-10-/-. يزيد ILA من وفرة البكتيريا الممثلة للتريبتوفان (مثل Clostridium)، بالإضافة إلى التعبير عن mRNA لإنزيمات أكيل-CoA ديهيدروجيناز وإندول لاكتات ديهيدروجيناز في الجسم الحي وفي المختبر، مما يؤدي إلى زيادة إنتاج IPA وIAA. علاوة على ذلك، فإن سلالة متحورة من بكتيريا اللاكتوباسيلس تفشل في الحماية من الالتهابات وإنتاج نواتج أخرى. كان التغذية المتبادلة الموجهة بواسطة ILA تعتمد على الميكروبات وزادت بشكل خاص من إنتاج نواتج الإندول تحت ظروف اختلال الميكروبات المستحثة بواسطة Citrobacter rodentium أو DSS، ولكن ليس من اضطراب الميكروبات بالمضادات الحيوية. الخلاصة: مجتمعة، نبرز الآليات التي من خلالها يتحكم التواصل بين الميكروبات والمضيف بشكل تعاوني في التوازن الداخلي المعوي من خلال الإندولات المستمدة من الميكروبات التي تتوسط التواصل بين الميكروبات. قد تسهم هذه النتائج في تطوير نواتج مستمدة من الميكروبات أو “ما بعد الحيوية” المستهدفة كتدخلات محتملة لعلاج أو الوقاية من الأمراض المدفوعة باختلال الميكروبات.

الكلمات الرئيسية: مستقلبات التريبتوفان الميكروبية، مشتقات الإندول، التهاب الأمعاء، اللاكتوباسيلس

الخلفية

يتميز اختلال التوازن الميكروبي المعوي بعدم توازن الميكروبات المرتبطة بالالتهاب، والإجهاد التأكسدي، ومجموعة متنوعة من الأمراض بما في ذلك الاضطرابات الأيضية ومرض الأمعاء الالتهابي (IBD). تقوم المستقلبات التي تفرزها أو تعدلها الميكروبات أو المضيف بتسهيل التفاعلات بين المضيف والميكروبات. تشكل هذه المستقلبات شبكة معقدة وتعمل معًا للحفاظ على وظائف المضيف والميكروبات وترابطهما. لقد ظهرت زراعة الميكروبات البرازية (FMT) كعلاج واعد للأمراض الناتجة عن اختلال التوازن [1]، وقد تكون الاستراتيجيات التي تهدف إلى استعادة توازن الميكروبات المعوية قادرة على تخفيف هذه الحالات. كما تم الإبلاغ عن أن نقل ميكروبات الأفراد الملتهبين إلى مستقبلين من النوع البري، الخالي من الجراثيم، يزيد من قابليتهم للإصابة بالتهاب القولون [2]. على الرغم من أن المستقلبات تشارك في تنظيم نظام المناعة لدى المضيف كجزيئات إشارة وتؤثر على فعالية العلاج الكيميائي للسرطان وأيض المضيف من خلال تنشيط مسارات الإشارة ذات الصلة [3-5]، إلا أن الآليات التي تنظم بها هذه الجزيئات الصغيرة الميكروبيوم المعوي لا تزال غير مفهومة جيدًا.
التربتوفان هو حمض أميني أساسي لتخليق البروتين ويمثل مقدمة لمجموعة متنوعة من المستقلبات التي تعتبر حيوية لتمثيل المضيف والفيزيولوجيا [6]. يمكن أن يتم استقلاب التربتوفان بواسطة المضيف عبر الكينورينين أو السيروتونين. ) المسارات أو بواسطة الميكروبات المعوية عبر مسار الإندول [5]. هناك أدلة متزايدة على أن مشتقات الإندول التي يتم استقلابها بواسطة ميكروبات مختلفة مثل الإندول-3-لاكتات (ILA) والإندول-3-حمض البروبيونيك (IPA) والإندول-3-أسيتات (IAA) لها تأثير عميق على مناعة المضيف ووظيفة الأمعاء [2،5]. لقد أظهرت هذه المستقلبات المشتقة من التربتوفان أنها تعزز الحاجز المعوي، وتحمي من مسببات الأمراض، وتؤثر على استقلاب المضيف من خلال الارتباط بمستقبل الهيدروكربون العطري (AhR) أو مستقبل البريغنان X (PXR) [2، 7-10]. تنظم بعض البروبيوتيك التوازن المعوي من خلال تنشيط AhR الناتج عن مشتقات الإندول. على سبيل المثال، يعزز Lactobacillus reuteri تمايز وتوسع الخلايا التوليدية المناعية الفموية. الخلايا اللمفاوية التائية داخل الظهارة من خلال إنتاج ILA [11]، والتي قادرة على تثبيط استقطاب خلايا Th17 في المختبر [12]. بالإضافة إلى ذلك، تقوم بكتيريا البيفيدوبكتيريوم في حليب الثدي بإفراز ILA وتساعد في تنظيم نضوج جهاز المناعة في مراحل الحياة المبكرة [13].
عادةً ما يكون تعافي الميكروبات غير المتوازنة أو تحسين المرض المرتبط مصحوبًا بزيادة في عدة مستقلبات خاصة، مثل الأحماض قصيرة السلسلة (SCFAs) ومشتقات الإندول [14، 15]، ومع ذلك، لا يزال غير معروف ما إذا كان هذا هو التأثير المباشر لهذه المستقلبات المتزايدة المنتجة في الجسم. سواء وكيف تمارس هذه المستقلبات أنشطة الإشارة بين البكتيريا لتنظيم
يجب توضيح الميكروبيوم أيضًا. في الدراسة الحالية، اخترنا Lactobacillus reuteri، وهو بروبيوتيك لديه القدرة على تعديل المناعة المعوية وميكروبيوتا الأمعاء، للتحقيق في دور وآليات الإندولات في الوساطة بين تفاعلات المضيف والميكروبيوتا والتواصل بين الميكروبات. وجدنا أن ILA هو جزيء رئيسي من Lactobacillus في تخفيف الالتهاب وتعديل ميكروبيوتا الأمعاء. زاد ILA من تعبير الإنزيمات ذات الصلة المشاركة في استقلاب التربتوفان عبر التغذية المتبادلة بين البكتيريا وعزز من تخليق مستقلبات التربتوفان الميكروبية بما في ذلك IPA وIAA في الجسم الحي وفي المختبر. كانت تنظيم ميكروبيوتا الأمعاء بواسطة ILA تعتمد على الميكروبيوتا وزادت بشكل خاص من مستويات الإندولات في ظل ظروف اختلال التوازن الميكروبي الناتج عن Citrobacter rodentium أو DSS، ولكن ليس في حالة تدمير الميكروبيوتا بالمضادات الحيوية. كانت التأثيرات المضادة للالتهابات وتقوية حاجز الأمعاء لـ IPA منظمة مباشرة بواسطة تنشيط PXR، بينما كانت تأثيرات IAA تعتمد على الميكروبيوتا. معًا، اقترحت هذه النتائج بشكل جماعي أن التواصل بين الميكروبات الذي يتوسطه ILA يعدل التفاعل بين الميكروبيوم والمضيف ويضبط التوازن المعوي بالتعاون مع إندولات أخرى مشتقة من الميكروبيوتا.

طرق

دراسات الحيوانات والبيان الأخلاقي

تم الحصول على فئران C57BL/6 (من 6 إلى 8 أسابيع من العمر) من بكين HFK للعلوم الحيوية، بينما تم شراء الفئران (من 6 إلى 8 أسابيع) من شركة جوانغتشو سياغن للعلوم الحيوية. تم تربية جميع الفئران تحت دورة ضوء/ظلام مدتها 12 ساعة وتم تغذيتها بنظام غذائي قياسي ومياه متاحة بحرية.

سلالات بكتيرية والتحضير

تم عزل L. reuteri I5007 من الغشاء المخاطي القولوني لخراريج الخنازير الصحية أثناء الفطام وتم تأكيد ذلك من خلال تسلسل الجينوم الكامل (معرف NCBI: 1340495)؛ وقد وُجد أن هذا السلالة مقاومة للكلورامفينيكول والكاناميسين والستربتوميسين. تم زراعة L. reuteri I5007، وL. reuteri I5007 الطافرة، وL. johnsonii، وL. plantarum، وL. delbrueckii، وL. rhamnosus GG في وسط MRS (شركة سولار بيو للعلوم والتكنولوجيا، بكين، الصين) في لمدة 20 ساعة تحت ظروف لاهوائية. تم جمع خلايا البكتيريا عن طريق الطرد المركزي في لمدة 15 دقيقة. ميت بالحرارة . ريوتيري I 5007 تم تحضيره بالتسخين عند لم يتم الكشف عن مستعمرات بعد 48 ساعة من الزراعة عند بعد المعالجة الحرارية. تم زراعة Clostridium sporogenes (ATCC 15579؛ مجموعة الثقافة الأمريكية) في وسط ثيوغليكولات السائل في جو لا هوائي عند تم تلقيح C. rodentium (ATCC 51459؛ مجموعة الثقافة الأمريكية) في مرق LB وزرعه في هزاز طوال الليل عند ثم تم طرد الثقافة الليلية في جهاز الطرد المركزي بسرعة 12,000
سرعة دوران 15 دقيقة، غسلت مرة واحدة، وأعيد تعليقها عند CFU/mL في PBS. تم زراعة L. reuteri 5007 بشكل لا هوائي مع أو بدون تريبتوفان في ، أو 1 مللي مول في لمدة 20 ساعة قبل قياس مشتقات الإندول في السائل الفائق.

التركيب المتجانس

تم إنشاء سلالة L. reuteri I5007 التي تعاني من نقص ArAT من خلال إعادة التركيب المتجانس كما هو موصوف سابقًا [16]. باختصار، تم استنساخ قطع DNA بطول 871 قاعدة و850 قاعدة بشكل منفصل من تسلسلات الجين ArAT لـ L. reuteri I5007، ثم تم دمجها مع قطعة جين مقاومة للإريثروميسين تم تضخيمها من بلازميد pMG36e. تم استنساخ الحمض النووي المؤتلف في بلازميد pLCNICK-2179 باستخدام استنساخ TA. تم إدخال البلازميد الناتج في خلايا “ . ريوتيري I 5007 من خلال التحفيز الكهربائي، تلاه زراعة على أطباق أجار وسط MRS تحتوي على الإريثروميسين. تم الحصول على سلالة معطلة لجين ArAT وتم تأكيد غياب جين ArAT بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) لحمض نووي ريبوزي منقوص الأكسجين الجيني البكتيري.

زراعة الميكروبات القولونية

تم تجميع محتويات القولون الطازجة من المتبرعين وخلطها 5 مرات وتخفيفها بمحلول ملحي معقم يحتوي على الجلسرين. تم طرد العينات المجمعة في جهاز الطرد المركزي عند لمدة 3 دقائق عند ، وتم جمع السائل العلوي وتخزينه في قبل زراعة الميكروبات القولونية (CMT)، تم استبدال الجلسرين في كل عينة بمحلول PBS عن طريق الطرد المركزي وتم عد عدد الخلايا الميكروبية الحية باستخدام صبغة الميثيلين الأزرق [16].

التهاب القولون الناتج عن DSS

تم إعطاء فئران C57BL/6 نظام دعم القرار (DSS) ، MP Biomedicals) في مياه الشرب لمدة 7 أيام. تم تغيير الماء كل يومين. تم وزن الحيوانات يوميًا طوال الفترة. تم تقييم DAI لتقدير شدة التهاب القولون كما تم وصفه سابقًا [17].

علاج بالمضادات الحيوية

تم إعطاء الفئران كوكتيل مضاد حيوي من سيبروفلوكساسين فانكومايسين ) وميترونيدازول ( ) [18] في مياه الشرب لمدة أسبوعين قبل العلاجات الأخرى. تم تجديد المياه كل أسبوع.

تقييم نفاذية الأمعاء

تم إذابة إيزوثيوسيانات الفلورسئين (FITC، 4 كيلودالتون، سيغما) – ديكستران في محلول فوسفات البفر (PBS) عند بعد 6 ساعات من الصيام، تم إعطاء الفئران عن طريق الفم تم جمع الدم بعد 4 ساعات وتم تحضير المصل. كانت الفلورية لكل عينة مصل هي
تم القياس عند طول موجة تحفيز قدره 490 نانومتر وطول موجة انبعاث قدره 530 نانومتر.

تحليل نسيجي وتقييم خلايا الكأس

تم لف نسيج القولون، وثبّت بـ بارافورمالدهيد لمدة 24 ساعة، مدفون في شمع البارافين، مقطع (5) ) ، وصبغت بالهيماتوكسيلين والإيوزين (H&E) أو الأزرق الألكياني. تم تقييم التحليل المرضي للأقسام الملونة بـ H&E بشكل عشوائي من قبل محققين مستقلين اثنين. كان نظام التقييم كما يلي: حجم القرحة ( لا شيء، أقل من أكثر من 3 مم)، شدة الالتهاب ( لا شيء، خفيف معتدل، و شديد)، درجة تليف ( لا شيء، خفيف معتدل، و شديد)، مدى تلف الظهارة/الجيب ( لا شيء، قاعدي قاعدي فقدان التشفير تدمير الكهف والظهارة السطحية)، وعمق الإصابة ( لا شيء، طبقة مخاطية الأدمة تحت المخاطية طبقة العضلات، الطبقة المصلية).

زراعة لاهوائية للميكروبات

تم الحصول على السائل الطافي الخالي من الخلايا (CFS) من L. reuteri عن طريق الطرد المركزي لثقافة البكتيريا عند لمدة 15 دقيقة، تليها الترشيح من خلال تصفية وتخفيف إلى مع الثقافة المقابلة. لزراعة الميكروبات القولونية اللاهوائية في المختبر، تم خلط حوالي 100 ملغ من محتوى القولون في 5 مل من وسط BHI تحت ظروف لاهوائية. وسط MRS ( )، CFS ( )، أو ILA ( 1 مليمول ) تم إضافته بعد ذلك إلى الثقافة البكتيرية وتم حضنها لمدّة 12 ساعة في ظروف لاهوائية عند في نظام كيس غاز باك EZ اللاهوائي. تم زراعة C. sporogenes مع أو بدون إضافة التربتوفان ( الضغط و CFS من . ريوتيري I5007 أو الطافرة الناقصة لـ ArAT ل. ريوتيري I5007 ( )، ILA لمدة 24 ساعة عند في جو خالٍ من الأكسجين.

عزل اللمفاويات وقياس التدفق الخلوي

تم جمع العقد اللمفية المساريقية (MLNs) وتحضيرها كتعليق خلايا مفردة. ثم تم تمرير العقد اللمفية المساريقية عبر تم تصفية وإعادة تعليقها في محلول FACS لتحليلات تدفق الخلايا. تم عزل خلايا السلف اللمفاوي الشائع (CLP) كما هو موصوف سابقًا [19]. باختصار، تم فتح القولون طوليًا وغسله لإزالة المحتويات عن طريق كشطه برفق بمحلول PBS. ثم تم تقطيع الأنسجة إلى قطع صغيرة وتم حضنها في HBSS معقم مسبقًا ومُسخن (بدون و ) يحتوي على مصل الجنين البقري (FBS)، 10 مللي مول EDTA، و5 مللي مول ديثيوثريتال (DTT) لمدة 30 دقيقة عند في حمام مائي مهتز. تم استعادة الخلايا، بما في ذلك خلايا المناعة والخلايا المعوية، عن طريق الترشيح من خلال مرشح. ثم تم فصل الخلايا عن بعضها البعض في محلول HBSS المسخن مسبقًا (مع و ) يحتوي على الجلوتامين بنسيلين-ستربتوميسين، 10 مللي مولار هيبز كولاجيناز
د، ديباز DNase I لمدة 45 في بينما كانت تهتز. تم تصفية تعليقات الخلايا من خلال مصفاة الخلايا في محلول PBS معقم مسبق التبريد، تليها الطرد المركزي في تدرج بيركول لمدة 20 دقيقة عند في تم الحصول على CLPs من خلال جمع الخلايا عند الواجهة وغسلها مرتين في محلول FACS لتحليل تدفق الخلايا.
للكشف عن خلايا Th1 و Th2 و Th17F و Th17A، تم تحفيز اللمفاويات لمدة 4 ساعات بـ PM (سيغما) و أيونوميسين (سيغما) في وجود جولجي ستوب (بي دي بيوساينس). تم أولاً صبغ الخلايا لسطح CD4 ثم تم تثبيتها واختراقها باستخدام مجموعة BD Cytofix/Cytoperm، تلتها صبغة داخلية مع الأجسام المضادة التالية: PerCP/Cy5.5-IL-4، FITC-IFN- ، AF647-IL-17F، و PE/Cy7-IL-17A. لت quantifying خلايا Treg، تم استخدام مجموعة True-Nuclear Transcription Factor Buffer Set (BioLegend) لتوسيم الخلايا باستخدام anti-CD4-PE، anti-CD25-FITC، و anti-FoxP3-Alexa Fluor. كانت النسبة المئوية لكل تم قياس نوع الخلية باستخدام جهاز BD FACS Celesta وبرنامج تحليل FlowJo (BD Biosciences). تم ضبط التعويض باستخدام كرات UltraComp eBeads.

تحليل البقعة الغربية

تم تحلل أنسجة القولون باستخدام محلول استخراج RIPA (Solarbio، الصين) الذي يحتوي على خليط مثبطات البروتياز بنسبة 1%. بعد ذلك، تم الطرد المركزي عند لمدة 15 دقيقة عند تم جمع السائل العلوي وتم قياس تركيز البروتين الكلي باستخدام مجموعة اختبار بروتين حمض البيكينكونينيك (BCA) (Solarbio، الصين). تم فصل البروتينات بواسطة الرحلان الكهربائي في هلام بولي أكريلاميد SDS وتم نقلها إلى أغشية بولي فينيليدين فلوريد (PVDF) (Millipore، الولايات المتحدة الأمريكية). تم حجب الأغشية بـ حليب خالي من الدسم لمدة 1.5 ساعة وتم حضنه مع الأجسام المضادة الأولية ضد PXR (أبكام، الولايات المتحدة الأمريكية)، E-cadherin (تكنولوجيا الإشارة الخلوية، الولايات المتحدة الأمريكية)، Cyp1a1 (تكنولوجيا الإشارة الخلوية، الولايات المتحدة الأمريكية)، و occludin (تكنولوجيا الإشارة الخلوية، الولايات المتحدة الأمريكية) طوال الليل في تم غسل الأغشية وحضنها مع أجسام مضادة ثانوية موسومة بـ HRP في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين، تلتها عملية الكشف عن الإشارة باستخدام مجموعة ECL (Solarbio، الصين).

استخراج RNA وPCR الكمي

تم استخراج RNA الكلي من الخلايا والأنسجة باستخدام كاشف TRIzol (تاكارا، اليابان). تم تحديد تركيز RNA باستخدام جهاز NanoDrop 2000 (ثيرمو فيشر ساينتيفيك، ويلمنجتون، ديلاوير، الولايات المتحدة الأمريكية). تم إجراء PCR الكمي كما هو موصوف سابقًا [20] باستخدام بادئات محددة للجينات وجين الجليسرالدهيد-3-فوسفات ديهيدروجيناز (GAPDH) كجين مرجعي (الملف الإضافي 2: الجدول S2). تم تحديد مستوى التعبير النسبي لـ mRNA لكل جين مستهدف باستخدام طريقة.

إليزا

تم قياس السيتوكينات الالتهابية في مصل الدم وعينات الأنسجة القولونية باستخدام مجموعات الاختبار المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) (كوسابيو، بالتيمور، ماريلاند، الولايات المتحدة الأمريكية) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة.

تحديد نواتج استقلاب التربتوفان

تم تجانس محتويات القولون (20 ملغ) في 200 الماء ومختلط بـ الميثانول المبرد مسبقًا الذي يحتوي على معيار داخلي (1-ميثيل-تريبتوفان، 2.0 عينات المصل و CFS ) تم خلطها مع ميثانول يحتوي على 1-ميثيل-تريبتوفان. ثم تم خلط المزيج بواسطة جهاز الخلط الدوار لمدة 5 دقائق وتم الطرد المركزي عند لمدة 10 دقائق عند تم تجفيف السائل العلوي تحت الفراغ وإعادة تكوينه بـ من الميثانول وتم الطرد المركزي عند لمدة 15 دقيقة عند قبل تحليل UHPLC-MS/MS. تم استخدام جهاز Agilent 1290 Infinity II UHPLC متصل بجهاز قياس الطيف الكتلي الثلاثي الرباعي (QQQ) Agilent 6470A لتحليل مستقلبات التربتوفان. كانت المرحلة المتنقلة تتكون من حمض الفورميك في الماء (A) والميثانول (B). تم إجراء الفصل الكروماتوغرافي باستخدام برنامج إزاحة تدرج للكشف عن مستقلبات التريبتوفان على النحو التالي: ; ، “ كان برنامج الإيلاج المتدرج للكشف عن AAA كما يلي: ، و كانت درجة حرارة العمود ومعدل التدفق كان . للتحليل، تم تأين الإيلاوت من العمود بواسطة مصدر تأين الرذاذ الكهربائي في الوضع الإيجابي (ESI +) تحت الإعدادات التالية: درجة حرارة الغاز: تدفق الغاز: جهاز الاستنشاق: 45 رطل لكل بوصة مربعة، سخان شينث غاز: تدفق الغاز الغلاف: ، وجهد الشعيرات: 4000 فولت. تم استخدام المراقبة الديناميكية المتعددة للتفاعلات (dMRM) للتحليل الكمي. تم الحصول على البيانات ومعالجتها في برنامج Agilent MassHunter (الإصدار B.04.00).

استخراج الحمض النووي، تسلسل جين 16S rRNA، وتحليل البيانات

تم استخراج الحمض النووي الميكروبي الكلي من محتويات القولون باستخدام مجموعة QIAamp DNA Stool Mini Kit (Qiagen، هيلدن، ألمانيا) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. تم قياس كمية الحمض النووي المستخرج باستخدام جهاز NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific، ويلمنجتون، ديلاوير، الولايات المتحدة الأمريكية). تم تضخيم المنطقة المتغيرة V3-V4 من جين 16S rRNA باستخدام بادئات عالمية 338 F. -GTGCCAGCMGCCGCGG-3′) و 806R ( -CCGTCA ATTCMTTTRAGTTT-3′). تم إجراء الرحلان الكهربائي في هلام الأجاروز لتأكيد حجم منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل. تم قياس كمية الأمبليكون، وتجميعها، وتسلسلها على
نظام Illumina MiSeq (Illumina، سان دييغو، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية) لقراءات الطرفين. تم إجراء تحليل التسلسل باستخدام خط أنابيب UNOISE من خلال USEARCH v10.0 [21] و VSEARCH v2.15 [22]. باختصار، تم دمج تسلسلات الطرفين، وتصفيتها من حيث الجودة، وإزالة التعقيد باستخدام VSEARCH. تم إجراء إزالة الضوضاء وإزالة الشيميرا باستخدام UNOISE3 لتصحيح أخطاء التسلسل. تم تعيين التسلسلات المجمعة مرة أخرى إلى التسلسلات الخالية من الشيميرا التي تم إزالة الضوضاء منها كـ OTUs مع الهوية. تم تصنيف تصنيف الميزات باستخدام خوارزمية USEARCH SINTAX في إصدار التدريب RDP 16 [23]. تم تقليل تسلسلات القراءة لجميع العينات إلى العينة ذات أقل عدد من القراءات لتعويض الفرق في عمق التسلسل. تم تحديد التنوع من جدول OTU المخفف استنادًا إلى الغنى ومؤشرات سيمبسون وشانون. تم تقدير التنوع من مسافات براى-كورتيس، التي تم استخدامها لبناء مصفوفات المسافة وتم الإبلاغ عنها وفقًا لتحليل المكونات الرئيسية (PCoA). تم استخدام PICRUSt2 للتنبؤ بالمسارات المعدلة في KEGG استنادًا إلى بيانات تسلسل 16S [24]. بالنسبة لتحليل الوفرة التفاضلية وتحليل الارتباط، تم إزالة جميع الأنواع البكتيرية التي كانت وفرتها النسبية أقل من 0.01% وكانت موجودة في أقل من 20% من العينات.

تحليل الميتا ترانسكريبتوم

تم استخراج RNA الميكروبات الكلي من محتويات القولون باستخدام E.Z.N.A. مجموعة ميدي لاستخراج RNA من التربة (أوميغا بيو-تيك، الولايات المتحدة الأمريكية) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. تم قياس تركيز RNA ونقاوته باستخدام جهاز نانو دروب 2000 (ثيرمو فيشر ساينتيفيك، الولايات المتحدة الأمريكية). فقط العينات التي تحتوي على رقم سلامة RNA (RIN) تم استخدامها لإنشاء المكتبات. تم إخضاع RNA الكلي لإزالة RNA الريبوسوم باستخدام مجموعة إزالة RNA الريبوسوم Ribo-Zero (إيلومينا، سان دييغو، الولايات المتحدة الأمريكية). TruSeq تم استخدام مجموعة تحضير عينات RNA (إيلومينا) لبناء مكتبات cDNA. تم إجراء تسلسل مزدوج النهاية باستخدام المكتبات المشفرة على منصة إيلومينا HiSeq 2500 في شركة مايجور بيو للتكنولوجيا الحيوية (شنغهاي، الصين) باستخدام مجموعة HiSeq 4000 PE Cluster ومجموعات HiSeq 4000 SBS وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة.
تمت معالجة قراءات التسلسل الخام أولاً من خلال مراقبة الجودة باستخدام Trimmomatic [25]، ثم تم محاذاة القراءات النظيفة إلى جينوم الفأر وقاعدة بيانات سيلفا باستخدام Bowtie2 [26] لاستبعاد تلوث الحمض النووي الريبي المضيف والريبوسومي. تم تجميع القراءات المصفاة من الميتا ترانسكريبتوم بشكل ديو نو لكل عينة باستخدام Trinity (v2.2.0) [27]. تم تجميع جميع الكتل باستخدام CD-HIT (v 4.5.8) [28] للحصول على الجينات الفردية. تم تقدير وفرة الجينات الفردية في كل عينة من خلال حساب قيمة النسخ لكل مليون (TPM) بناءً على عدد القراءات المحاذاة باستخدام Salmon (v 0.9.1) [29]. تم التنبؤ بتسلسلات ترميز البروتين من الكتل باستخدام MetaGeneMark [30]. للتعليق الوظيفي، تم استخدام تسلسلات البروتين.
تمت التوصيفات مقابل تلك الخاصة بالجينات المحفوظة تطوريًا في المجموعات المتجانسة غير المشروطة (eggNOG) باستخدام DIAMOND (الإصدار 0.8.23) [31] تحت الإعدادات الافتراضية. تم تحديد الثراء التفاضلي للجينات والوظائف بواسطة DESeq2 [32]. تم محاذاة التصنيفات التصنيفية ضد قاعدة بيانات تصنيف NCBI باستخدام DIAMOND (الإصدار 0.8.23) [31] مع المعلمات الافتراضية. ثم تم تحليل نتائج blastx باستخدام خوارزمية LCA الخاصة بـ MEGAN [33].

تسلسل RNA وتحليل البيانات

تم استخراج وتنقية RNA الكلي من نسيج القولون باستخدام مادة TRIzol (Invitrogen). تم استخدام العينات التي كانت RIN>7 فقط لتحليل تسلسل RNA. TruSeq تم استخدام مجموعة تحضير عينات RNA (إلومينا، الولايات المتحدة الأمريكية) لبناء مكتبات cDNA. تم تسلسل المكتبات المشفرة على منصة إلومينا HiSeq 2500 في شركة مايجور بيو للتكنولوجيا الحيوية (شنغهاي، الصين). تم أولاً التحكم في جودة قراءات التسلسل الخام ذات الطرفين بواسطة FastQC وتمت محاكاتها على الجينوم الخاص بالفأر باستخدام hisat2 (الإصدار 2.1.0) [34]. كانت النسخ ذات التعبير المنخفض مع عدد متوسط تمت إزالتها. تم إجراء تحليل التعبير الجيني التفاضلي باستخدام حزمة DESeq2 [32]. تم تعريف الجينات المعبر عنها تفاضليًا (DEGs) على أنها الجينات التي لديها تغيير لا يقل عن الضعف ومعدل اكتشاف خاطئ <0.05. تم إجراء تحليل إثراء الوظائف لمسارات KEGG للجينات المعبر عنها تفاضليًا وتحليل إثراء مجموعة الجينات (GSEA) لترتيب الجينات باستخدام clusterProfiler [35].

تحليل شبكة الارتباط الموزون

لتحديد وحدات الجينات المضيفة المتزامنة والأنواع البكتيرية في بيانات تسلسل RNA-seq و16S rDNA، قمنا بتطبيق حزمة R WGCNA [36]. قامت مصفوفة الارتباط بت quantifying الترابط بين الجينات أو الأنواع ثم قامت بتعيينها إلى وحدات التزامن. تم إزالة الجينات أو الأنواع التي لم تظهر مقاييس تزامن عالية بما يكفي مع أي وحدة. تم اشتقاق الشبكة الموقعة بناءً على طريقة الارتباط الوسيط الثنائي (bicor). تم استخدام معيار الطوبولوجيا الخالية من المقياس لاختيار عتبات ناعمة تبلغ 12 و5 لارتباطات الجينات والأنواع، على التوالي. لتحديد وحدات الجينات أو الأنواع الأكثر صلة في سياق التهاب القولون، تم اختبار الارتباطات بين مستقلبات التريبتوفان في المصل وكل وحدة باستخدام ترتيب سبيرمان.

تحليل مجموعات البيانات الميتا ترانسكريبتومية لالتهاب الأمعاء البشري

تم استخدام مجموعات بيانات الميتا ترانسكريبتوميك المتاحة للجمهور لتحديد الفروق في الجينات الميكروبية في مسارات الأيض للتريبتوفان. تم الحصول على مجموعات البيانات من أرشيف قراءة التسلسل (مشروع البيولوجيا: PRJNA389280)، الذي يتكون من مشروع الميكروبيوم البشري HMP2.
قراءات تسلسل الميتا ترانسكريبتوم في قاعدة بيانات الأمراض المعوية الالتهابية متعددة الأوميات [37]. كانت القراءات المستخدمة في الدراسة الحالية من 46 مريضًا بمرض كرون (CD)، و21 مريضًا بالتهاب القولون التقرحي (UC)، و11 شخصًا سليمًا. تم معالجة البيانات وتحليلها بطريقة مشابهة لبيانات الميتا ترانسكريبتوم الفأر كما هو موضح أعلاه. بالنسبة لمجموعة مرضى التهاب الأمعاء، تم تطبيق نماذج التأثيرات المختلطة الخطية لتحديد وفرة الجينات الميكروبية المعبر عنها بشكل مختلف كما يلي: الجين (التداخل) + التشخيص + المضادات الحيوية + العلاج الكيميائي + مثبط المناعة. تم ترميز التشخيص كمتغير فئوي (مرض كرون، التهاب القولون التقرحي، غير التهاب الأمعاء) مع غير التهاب الأمعاء كحالة مرجعية. تم ترميز العلاجات الطبية الثلاثة كمتغيرات ثنائية مع عدم الاستخدام كحالة مرجعية. تم تحويل قيم وفرة الجينات إلى اللوغاريتم وتمت معالجتها لتكون خالية من الصفر قبل النمذجة الخطية. جميع تم تعديل قيم المقارنات المتعددة في التحليل أعلاه لتناسب معدل الاكتشاف الخاطئ (FDR). تم تحديد عتبة الدلالة عند ( ، ** , *** , **** ); غير دالة؛ كان يُعتبر اتجاهًا.

تحليل الإحصائيات

تم استخدام QIIME v.2.0 و GraphPad Prism (v 6.0) وبرنامج R (v 3.6.1) للتحليل الإحصائي. تم تقييم الفرق في وفرة البكتيريا باستخدام تحليل التباين الأحادي (ANOVA) واختبار توكي بعد ذلك للبيانات ذات التوزيع الطبيعي أو اختبار كروسكال-واليس للبيانات ذات التوزيع غير الطبيعي أو غير المعلمي. اعتُبر ذا دلالة إحصائية. عند الاقتضاء، تم تصحيح القيم لاختبارات متعددة باستخدام معدل الاكتشاف الخاطئ لبن-جاميني-هوشبرغ (FDR) مع قيمة قطع تبلغ 0.1.

النتائج

الـ L. reuteri 15007 يحمي الفئران من التهاب القولون من خلال تعديل الميكروبيوم المعوي

لقد أظهرنا سابقًا ريوتيري 5007 قادر على تحسين التهاب القولون وتصحيح الميكروبيوم في الفئران والخنازير. لتحقيق ما إذا كانت الميكروبات المعوية تشارك في تخفيف التهاب القولون بواسطة L. reuteri، تم استخدام نموذج زراعة ميكروبات القولون (CMT) لاستعادة التهاب القولون (الملف الإضافي 1: الشكل S1A). باختصار، تم إعطاء الفئران عن طريق الفم L. reuteri I5007 لمدة 3 أسابيع، تلاها تحفيز التهاب القولون باستخدام DSS لمدة أسبوع آخر. ثم تم السماح للفئران بالتعافي الكامل من التهاب القولون لمدة 12 يومًا قبل جولة ثانية من علاج DSS لمدة 7 أيام وزراعة متبادلة للميكروبات القولونية للفئران المعالجة بـ DSS التي تم إعطاؤها مع وبدون. . ريوتيري I5007. كما هو متوقع، خفف L. reuteri I5007 بشكل كبير من مؤشر نشاط المرض (DAI) والآفات القولونية في الجولة الأولى من علاج DSS، بينما استعادة الصحة المعوية بالكامل بعد 12 يومًا في كلا الحالتين
مجموعات من الفئران المعالجة بـ DSS (الملف الإضافي 1: الشكل S1BD). من المثير للاهتمام أن الميكروبات المعوية للفئران المعالجة بـ DSS قد استعادت بشكل كبير حالتها الطبيعية، بينما كانت تلك الخاصة بـ ظلّت الفئران المدعمة بـ .reuteri 15007 مختلفة بشكل ملحوظ ” ) في اليوم 40 حتى بعد 12 يومًا من التعافي (الملف الإضافي 1: الشكل S1E). ظل مؤشرات التنوع للميكروبات القولونية كما هو موضح من خلال الغنى ومؤشر شانون منخفضة بشكل كبير في الفئران المعالجة بـ DSS التي تم إعطاؤها . ريوتيري في اليوم 40 (الملف الإضافي 1: الشكل S1F).
زراعة ميكروبيوتا القولون في اليوم 28 من الفئران التي تم إعطاؤها ريوتيري زادت بشكل كبير من البقاء وعكست فقدان الوزن لدى الفئران المعالجة بـ DSS. ) (الملف الإضافي 1: الشكل S2A و B). وبالمثل، أظهرت الفئران المعالجة بـ DSS والتي تلقت ميكروبيوتا مدعمة بـ L. reuteri انخفاضًا في درجات المرض وزيادة في طول القولون (الملف الإضافي 1: الشكل S2C-E). علاوة على ذلك، فإن الميكروبيوتا القولونية من الفئران المدعمة بـ L. reuteri قللت بشكل كبير من خلايا Th17A وزادت من خلايا T التنظيمية في الغشاء المخاطي للقولون والعقد اللمفاوية المساريقية ( ) (الملف الإضافي 1: الشكل S2F-I). بشكل جماعي، تشير النتائج إلى أن الميكروبات المعوية من المحتمل أن تكون متورطة في الحماية التي يوفرها L. reuteri ضد الالتهاب المعوي.

يرتبط التأثير الوقائي لـ L. reuteri بإنتاج مشتقات الإندول

تم إجراء تحليل حجم التأثير لتحليل التمييز الخطي (LEfSe) لتحديد البكتيريا القولونية الرئيسية المتزايدة في الفئران المعالجة بـ DSS مع أو بدون إدارة L. reuteri 15007. أظهرت النتائج أن 30 نوعًا من البكتيريا كانت متزايدة بشكل ملحوظ بواسطة . ريوتيري 15007 (LDA ) (الشكل 1A). من المثير للاهتمام أن تلك الأنواع البكتيرية الغنية كانت في الغالب من جنس الكلوستريديوم (الكلوستريديوم XlVa، الكلوستريديوم XlVb، والكلوستريديوم ” )، والتي يُعرف عنها أنها قادرة على استقلاب التريبتوفان [39]. وبشكل متسق، أدى DSS إلى إضعاف استقلاب الميكروبات للتريبتوفان بشكل كبير كما يتضح من انخفاض مستويات مشتقات الإندول مثل إندول-3-كاربالديهيد (ICA) وIPA وIAA في المصل ( على العكس، يبدو أن استقلاب التربتوفان في المضيف قد زاد، حيث أظهر زيادة ملحوظة في نشاط إنزيمات إندولامين 2،3-ديوكسيجيناز (IDO). ) (الشكل 1B)، الإنزيمات الرئيسية المشاركة في مسار الكينورينين [40]. من ناحية أخرى، أعادت إدارة L. reuteri بشكل كبير تركيزات السيروم من ICA وIAA وIPA بالإضافة إلى نشاط IDO في الفئران المعالجة بـ DSS إلى مستويات صحية (الشكل 1B). من المثير للاهتمام، استعادت روتيري أيضًا مستويات السيروم من 5-HT والتريبتوفان، ولكن دون تأثير على الكينورينين أو ILA (الملف الإضافي 1: الشكل S3A).
تسلسل RNA للأنسجة القولونية حدد أيضًا 4680 جينًا معبرًا عنه بشكل مختلف استجابةً لـ
ل. ريوتيري 15007 في الفئران المعالجة بـ DSS (الشكل 1C). أظهرت تحليل إثراء مسار KEGG وتحليل إثراء مجموعة الجينات (GSEA) أن أدى إعطاء ريوتيري إلى تقليل مسارات الالتهاب المرتبطة مثل إشارات TNF و NF-кB (الملف الإضافي 1: الشكل S3B و C). كشفت تحليل الارتباط لعدم التشابه في المسافات أن IPA كانت في أقوى ارتباط مع كل من الميكروبيوتا وتعبير الجينات المضيفة، بينما كان IAA مرتبطًا بشكل كبير فقط مع تركيبة الميكروبيوتا (الشكل 1D).
كما هو متوقع، تعبير (المعروف أيضًا باسم Nr1i2)، مستقبل لـ IPA [41]، وزادت جينات أهداف PXR Ugt1a1 و Cyp3a11 بشكل ملحوظ في القولون لدى الفئران المعالجة بـ DSS استجابةً لـ L. reuteri (الشكل 1E). IAA هو ربيطة AhR تعزز إنتاج IL-22 [2،42]. ومع ذلك، فشلت تحليلات RNA-seq واختبارات RT-PCR في الكشف عن اختلافات ملحوظة في التعبير القولوني لـ Ahr و Cyp1a1 مع وبدون L. reuteri (الشكل 1C، الملف الإضافي 1: الشكل S3D، الملف الإضافي 2: الجدول S1). لم يتأثر مستوى IL-22 في المصل بـ . ريوتيري أيضًا (الملف الإضافي 1: الشكل S3D). أظهرت تحليل شبكة التعبير الجيني المشترك الموزون أن هناك جينات مضيفة شائعة ووحدات تصنيف بكتيرية كانت مرتبطة بشكل كبير مع IPA وIAA (الملف الإضافي 1: الشكل S3E وF).

كلا من IPA و IAA يحسنان التهاب القولون الناتج عن DSS

لتقييم التأثير الوقائي لمستقلبات التريبتوفان الميكروبية الرئيسية على الالتهاب المعوي ووظيفة الحاجز المخاطي بشكل مباشر، 20 و تم إعطاء IAA أو IPA بشكل منفصل للفئران مع أو بدون علاج DSS لمدة 7 أيام (الملف الإضافي 1: الشكل S4A). عكس كل من IPA و IAA بشكل كبير فقدان الوزن الناتج عن DSS، وزاد من طول القولون، وقلل من الأمراض القولونية، وزاد من خلايا الجوبلت، وانخفض و تعبير الجينات في القولون، مع زيادة تعبير البروتين لـ E-cadherin و occludin (الملف الإضافي 1: الشكل S4B-G)، مما يشير إلى أن كل من IAA و IPA قادران على تخفيف الالتهاب المعوي وتعزيز وظيفة الحاجز المخاطي. مشابه لـ .
ريوتيري، فشلت IAA في تعزيز التعبير عن و Cyp1a1، بينما زاد IPA بشكل كبير من تعبير (الملف الإضافي 1: الشكل S4H).
أظهر تحليل الميكروبيوم القولوني أن IAA غيرت بشكل كبير كل من – و -تنوعات الميكروبات القولونية في الفئران المعالجة بـ DSS، بينما كان لـ IPA تأثير هامشي فقط (الملف الإضافي 1: الشكل S5A وB)، مما يشير إلى أن الميكروبات يتم تنظيمها بشكل مختلف بواسطة IPA وIAA. لتقييم ما إذا كانت الحماية التي يوفرها IPA وIAA للفئران المعالجة بـ DSS تعتمد على الميكروبات المعوية، تم معالجة الفئران بالمضادات الحيوية لمدة أسبوعين لتقليل الميكروبات المعوية، تلاها إعطاء فموي لـ IPA أو IAA أو مزيج من IPA وIAA مع أو بدون معالجة بـ DSS (الشكل 2A). من الواضح أن IPA أو مزيج IPA/IAA كان قادرًا على حماية الفئران المعالجة بالمضادات الحيوية من التهاب القولون الناتج عن DSS، بينما تم إلغاء التأثير الوقائي لـ IAA، كما يتضح من فقدان الوزن، طول القولون، حاجز الأمعاء، والالتهاب (الشكل 2B-G)، مما يشير إلى مشاركة مختلفة للميكروبات المعوية في حماية الفئران من الالتهاب المعوي بواسطة IPA وIAA.

الـ L. reuteri يغير من استقلاب التريبتوفان الميكروبي من خلال تخليق ILA

على الرغم من أن L. reuteri زادت بشكل كبير من تركيزات السيروم من IPA و IAA في الفئران المعالجة بـ DSS (الشكل 1B)، تم العثور على أن ILA، ولكن ليس ICA أو IPA أو IAA، تم تصنيعه بواسطة . ريوتيري والعديد من أنواع اللاكتوباسيلس الأخرى (الملف الإضافي 1: الشكل S6A)، متسقة مع الملاحظات السابقة حول اللاكتوباسيلس والبيفيدوبكتيريوم [13]. مكملات التريبتوفان من كما زادت ثقافة L. reuteri بشكل كبير من تخليق ILA (الملف الإضافي 1: الشكل S6B). ينطوي استقلاب التربتوفان الميكروبي على تفاعلات إنزيمية متعددة، وILA هو وسيط حاسم (الشكل 3A). أظهر التحليل الميتا ترانسكريبتومي لميكروبات القولون من الفئران المعالجة بـ DSS والمكملة أو غير المكملة بـ L. reuteri 15007 أنه، بينما قام DSS بتقليل تعبير معظم الجينات البكتيرية المعنية في استقلاب التربتوفان، زادت L. reuteri بشكل كبير من mRNA.
الشكل 1 (انظر الشرح في الصفحة السابقة.)
الشكل 2 IPA و IAA يحسنان التهاب القولون الناتج عن DSS. أ مخطط تجريبي لتجربة الفئران ( تم إعطاء فئران C57BL/6 التي تبلغ من العمر ستة أسابيع مزيجًا من المضادات الحيوية لمدة أسبوعين، تلاها إعطاء عن طريق الفم لـ IPA و/أو IAA يوميًا مع أو بدون تم استخدام DSS في مياه الشرب لمدة 7 أيام أخرى. تم تقييم شدة التهاب القولون من خلال تحديد التغيرات في وزن الجسم. ) وطول القولون ( مستويات مصل FITC-dextran بين مجموعات مختلفة من الفئران ( ). تغييرات خلايا الكأس في القولون لدى الفئران. تُظهر اللوحة اليسرى عدد خلايا الكأس لكل كريبت في القولون، وتُظهر اللوحة اليمنى صورًا تمثيلية لصبغة الألكيان الأزرق لخلايا الكأس داخل الطبقة المخاطية الداخلية لمقاطع القولون. F مستويات IL-6 و IL-1 في نسيج القولون باستخدام ELISA ). ج تم تحديد مستويات بروتينات الأوكلاودين و E-cadherin بواسطة تقنية الويسترن بلوتينغ ; غير مهم
تعبير إنزيم أسيل-CoA ديهيدروجيناز (ACD)، إنزيم إندول لاكتات ديهيدروجيناز (ILD)، وإنزيم إندول أسيتياميد هيدراز (IAAH)، مع انخفاض تعبير إنزيم إندول بايروفات ديكاربوكسيلاز (ID) (الشكل 3B، C)، مما يشير إلى أن . يفضل روتيري تخليق ILA و IPA و IAA. بالإضافة إلى ذلك، زادت الوفرة النسبية للكلوستريديوم، الذي يشفر كل من ACD و IAAH، عند إدارة ريوتيري (الشكل 3D، E).

ILA يحسن التهاب القولون الناتج عن DSS ويغير تركيبة الميكروبات المعوية

لتقييم فعالية ILA بشكل مباشر في تخفيف الالتهاب المعوي، تم إعطاء الفئران المعالجة بـ DSS عن طريق الفم
تم إعطاؤه يوميًا مع أو بدون ILA لمدة أسبوع. عكس ILA بشكل كبير فقدان الوزن الناتج عن DSS (الملف الإضافي 1: الشكل S7A) وتقليل طول القولون (الملف الإضافي 1: الشكل S7B). وبشكل متسق، قمع ILA بشكل كبير إنتاج TNF- الناتج عن DSS. و في المصل (الملف الإضافي 1: الشكل S7C). كما تم تقليل درجات الهستولوجيا القولونية بشكل كبير في الفئران المعالجة بـ ILA (الملف الإضافي 1: الشكل S7D)، كما يتضح من تقليل التقرحات، والوذمة، وتلف الغدد، وتسلل الخلايا المناعية في طبقة الظهارة المعوية (الملف الإضافي 1: الشكل S7E). كما أعاد ILA جزئيًا تقليل الغنى ومؤشر شانون الناتج عن DSS (الملف الإضافي 1: الشكل S7F) لميكروبيوتا القولون.
الشكل 3. L. reuteri يغير تعبير الإنزيمات الرئيسية المشاركة في الأيض الميكروبي للتريبتوفان. تم إعطاء فئران C57BL/6 التي تبلغ من العمر ستة أسابيع عن طريق الفم. من PBS مع أو بدون L. reuteri I5007 ( CFU/mL) يوميًا لمدة 3 أسابيع، تليها أسبوع من إدارة DSS في مياه الشرب لتحفيز التهاب القولون (انظر الشكل S1A للمخطط التجريبي). تم إجراء الميتا ترانسكرپتومكس مع الميكروبيوتا القولونية المجمعة في اليوم 28. A المسارات الأيضية الرئيسية والإنزيمات المشاركة في استقلاب التربتوفان الميكروبي. B مخطط PCoA لمسافة براى-كورتيس يظهر الفروق في وظيفة الميكروبيوتا القولونية. C الفروق في مستويات التعبير عن mRNA للإنزيمات الرئيسية المشاركة في استقلاب التربتوفان الميكروبي بين ثلاث مجموعات من الفئران. تم إجراء الإحصائيات باستخدام DESeq2. *p < 0.05، **p < 0.01، ***p < 0.001، **** ; غير مهم
من الجدير بالذكر أن ILA تسببت أيضًا في فصل واضح للميكروبات المعوية في الأمعاء الغليظة لدى الفئران المعالجة بـ DSS (الملف الإضافي 1: الشكل S7G). على مستوى الجنس، أعادت ILA نسبة وفرة Clostridium_XIVa (من 6.3 إلى ) و Lactobacillus ( من 0.45 إلى ) في الفئران المعالجة بـ DSS (الملف الإضافي 1: الشكل S7H).
لفحص ما إذا كان التأثير الوقائي لـ ILA يعتمد على الميكروبيوم المعوي، تم معالجة الفئران بالمضادات الحيوية لمدة أسبوعين لتقليل الميكروبيوم المعوي، تلاها علاج DSS مع أو بدون مكملات ILA (الملف الإضافي 1: الشكل S8A). أظهرت النتائج أن التأثيرات الوقائية لـ ILA على فقدان الوزن وتقليل طول القولون قد انخفضت بشكل كبير في الفئران التي تم تقليل الميكروبيوم لديها، مقارنة بالفئران التقليدية (الملف الإضافي 1: الشكل S8B-E). من المعروف أن ILA تمارس تأثيرها الوقائي من خلال تنشيط AhR [11، 13]. لفحص ما إذا كان تثبيط AhR دوائيًا يلغي تحسين ILA للالتهاب المعوي، تم إعطاء الفئران CH223191، وهو مثبط لـ AhR، مع ILA خلال
علاج DSS (الملف الإضافي 1: الشكل S8F). لدهشتنا، قدمت ILA حماية كبيرة حتى في وجود CH223191، كما يتضح من فقدان الوزن، وطول القولون، وعلم الأمراض النسيجي (الملف الإضافي 1: الشكل S8G-J). لذلك، نستنتج أن تعديل الميكروبيوتا قد يكون مسارًا آخر لتنشيط AhR لكي يمارس IAA تأثيره الوقائي على الالتهاب المعوي.
ILA و IPA و IAA تخفف الالتهاب المعوي في فئران.
IL- من المعروف أن الفئران تطور التهاب القولون بشكل عفوي [43]. لتأكيد ما إذا كانت ILA و IPA و IAA قادرة على حماية الفئران من الالتهاب المعوي في نموذج مختلف لالتهاب القولون، تم إعطاء ILA أو IPA أو IAA عن طريق الفم إلى IL- الفئران لمدة 4 أسابيع. كل من ILA و IPA قاما بتثبيط التعبير القولوني بشكل كبير عن و الـ mRNA، بينما كان لـ IAA تأثير أقل (الشكل 4A). كما كانت ILA و IPA قادرتين على استعادة TNF- و LPS إلى مستويات صحية في القولون، مع تأثير طفيف لوحظ مع IAA
(الشكل 4B). بشكل عام، تشير هذه النتائج إلى أن ILA و IPA أكثر كفاءة من IAA في حماية الفئران من الالتهاب المعوي في كل من DSS و IL- نماذج الفئران لالتهاب القولون. بالإضافة إلى ذلك، غيرت ILA و IPA الميكروبات المعوية في القولون الفئران بشكل أكثر دراماتيكية من IAA (الشكل 4C). من المهم أن مكملات ILA زادت بشكل ملحوظ من الوفرة النسبية لبكتيريا Lactobacillus (من 6.45 إلى )، بينما بيفيدوبكتيريوم المدعوم بـ IPA (من 0.01 إلى ) وأكرمانسيا (من 0.21 إلى ) (الشكل 4D). زادت ILA و IPA أيضًا من الوفرة النسبية لـ Blautia (من 0.06 إلى و على التوالي). كشفت شبكات التعايش عن أن بلافوتيا وبيفيدوباكتيريوم هما من الأنواع البكتيرية الرئيسية في الشبكات الميكروبية استجابةً لـ ILA وIPA (الشكل 4E). ومن الجدير بالذكر أن IPA كان لديه أكثر الشبكات تعقيدًا من الميزات الميكروبية (الشكل 4E). مجتمعة، تشير هذه النتائج إلى أن الميكروبات المعوية من المحتمل أن تكون متورطة في تخفيف التهاب القولون الذي يتم بوساطة ILA وIPA.

ILA تزيد من إنتاج IPA وIAA من خلال التغذية المتبادلة الميكروبية سواء في الجسم الحي أو في المختبر

لأن ILA كانت المركب الوحيد من التربتوفان الذي تم تصنيعه بواسطة L. reuteri (الملف الإضافي 1: الشكل S6)، فإن زيادة تصنيع IPA وIAA في الفئران المعالجة بـ DSS والمكملة بـ L. reuteri كانت على الأرجح نتيجة لاستخدام ILA كركيزة من قبل بكتيريا الأمعاء الأخرى. لتأكيد ما إذا كانت ILA تزيد من إنتاج IPA وIAA من خلال التغذية المتبادلة الميكروبية، قمنا بتincubating ILA مع الميكروبات القولونية لفئران معالجة بـ DSS ووجدنا أن ILA زادت بشكل كبير من مستويات IPA وIAA (الشكل 5A). أظهر تحليل الميكروبيوم أن ILA غيرت بشكل ملحوظ تركيب الميكروبات (الشكل 5B). أظهر التنبؤ الوظيفي الميتاجينومي بواسطة PICRUSt2 أن تعبير ACD وID وArAT زاد استجابةً لـ ILA (الشكل 5C). كشفت شبكة التواجد المشترك أن ACD كان له أعلى درجة من التفاعلات، مما يظهر ارتباطًا إيجابيًا قويًا مع عدة أجناس بكتيرية مختلفة غنية بشكل ملحوظ (الشكل 5D). علاوة على ذلك، فإن الإدارة الفموية لـ ILA للفئران المعالجة بـ DSS زادت أيضًا بشكل كبير من تعبير ACD وIAAH في الميكروبات القولونية كما تم التنبؤ به بواسطة PICRUSt2 (الشكل 5E، F). لت
للمزيد من التحقق من أن ILA تعزز إنتاج مشتقات الإندول الأخرى، قمنا بزراعة التريبتوفان معًا، . ريوتيري I5007، CFS و ILA مع C. سبوروجينيس، وهو بكتيريا منتجة لمركب IPA بشكل محدد. كما هو متوقع، ILA و CFS من زاد .reuteri بشكل ملحوظ من إنتاج IPA، ولكن ليس IAA (الشكل 5G). بشكل جماعي، تشير هذه البيانات إلى أن ILA قد تُستخدم من قبل البكتيريا كركيزة لإنتاج IPA وIAA.
لمزيد من الفحص حول ما إذا كانت ILA تعزز إنتاج IPA وIAA من خلال التغذية المتبادلة الميكروبية في الجسم الحي، قمنا بمعالجة الفئران بالمضادات الحيوية لاستنفاد الميكروبات المعوية، تلاها تكميل مع خلايا ميتة بالحرارة أو -نقص سلالة متحورة من ريوتيري ) مع أو بدون إعطاء ILA عن طريق الفم (الشكل 6A). كل من المحترق حرارياً و فشلت L. reuteri في حماية الفئران من التهاب القولون الناتج عن DSS (الشكل 6B، C). ومن الجدير بالذكر أن الكائنات الحية الميتة بالحرارة و لا يمكن لـ L. reuteri تعزيز إنتاج IPA وIAA، بينما يؤدي إعطاء ILA للفئران التي تتلقى كميات ميتة من الحرارة أو أدى السلالة الطافرة إلى زيادة في تخليق كلا المستقلبين في محتوى القولون (الشكل 6D، E). أكدت هذه النتائج أن ILA هو المستقلب الرئيسي للتريبتوفان الذي تنتجه L. reuteri والذي يكون مسؤولاً عن التخليق الميكروبي لـ IPA وIAA في الجهاز الهضمي.
للتأكد بشكل أكبر مما إذا كان ILA يعزز إنتاج IPA وIAA اعتمادًا على الميكروبيوتا المعوية، قمنا إما بتعطيل الميكروبيوتا بالمضادات الحيوية أو تحفيز اختلال التوازن الميكروبي باستخدام Citrobacter rodentium أو DSS مع أو بدون الإدارة الفموية لـ ILA (الشكل 6F). أظهر تحليل الميكروبيوم أن ILA لم يكن له تأثير على الميكروبات. – و -تنوع الفئران الصحية، أو الفئران المعرضة لتحدي C. rodentium، أو الفئران المعالجة بالمضادات الحيوية (الشكل 6G، H). ومن الجدير بالذكر أن ILA ظلت فعالة إلى حد كبير في كلا نموذجَي الفئران غير المتوازنة. وقد زادت ILA بشكل كبير من IPA وIAA في الفئران المعالجة بـ DSS ( )، مع ميل قوي ( لزيادة IPA و IAA في الفئران التي تعرضت لتحدي C. rodentium؛ ومع ذلك، فشلت ILA في تعزيز تخليق أي من IPA أو IAA في الفئران المعالجة بالمضادات الحيوية (الشكل 6G، H)، مما يشير بوضوح إلى أن الميكروبات المعوية مطلوبة لتخليق IPA و IAA الناتج عن ILA. بشكل جماعي، تشير هذه النتائج إلى أن ILA تعزز إنتاج IPA و IAA من خلال التغذية المتبادلة بين الميكروبات.
الشكل 4 (انظر الشرح في الصفحة السابقة.)
الشكل 5 ILA يعزز الإنتاج الميكروبي لـ IPA و IAA في المختبر. تم زراعة الميكروبات المعوية تحت ظروف لاهوائية مع أو بدون إضافة وسط de Man Rogosa Sharpe (MRS) أو السائل الخالي من الخلايا (CFS) من L. reuteri I5007، أو ILA لمدة 12 ساعة في تركيزات IPA و IAA في السائل الفائق للثقافة اللاهوائية للميكروبات المعوية القولونية رسم بياني لـ PCoA لمسافة براى-كورتيس بين مجموعات العلاج المختلفة ). ج. الوفرة النسبية لثلاثة إنزيمات رئيسية تشارك في استقلاب التربتوفان الميكروبي كما تم التنبؤ به بواسطة PICRUSt2. د. تحليل الشبكة للأجناس البكتيرية والإنزيمات الغنية بشكل مختلف. تشير الحواف التي تمثل الارتباطات المهمة وفقًا لسبيرمان إلى و . سمك كل خط يتناسب مع حجم الارتباط. يوضح الرسم البياني الدائري الوفرة النسبية (%) للأجناس البكتيرية أو الإنزيمات بين المجموعات المختلفة. ArAT، الأحماض الأمينية العطرية الأمينotransferase؛ ID، إنزيمات إزالة الكربوكسيل من الإندولبيوفات. تم التنبؤ بالوفرة النسبية لإنزيم أسيل-CoA ديهيدروجيناز (ACD) (E) وإنزيم هيدروكسي الإندول أسيتاميد (IAAH) (F) بواسطة PICRUSt2 بين الفئران المعالجة بـ DSS التي تم إعطاؤها مع أو بدون ILA (انظر أسطورة الشكل S7 للحصول على تفاصيل التجربة). G تم زراعة C. sporogenes مع أو بدون إضافة التريبتوفان، L. reuteri I5007، الطفرة غير المتحملة لـ ArAT L. reuteri I5007(AL.R)، CFS من L. reuteri I5007 أو L.R، ILA لمدة 24 ساعة في ; غير مهم

التغيرات في استقلاب التريبتوفان الميكروبي لدى مرضى التهاب الأمعاء

مماثل لملاحظاتنا في التهاب القولون الناتج عن DSS (الشكل 1B)، يتم تعزيز استقلاب التربتوفان في المضيف
ومع ذلك، فإنه من غير الواضح ما إذا كان استقلاب الميكروبات للتريبتوفان مثبطًا في مرضى التهاب الأمعاء كما هو الحال في الفئران المعالجة بـ DSS. لفحص مستويات التعبير للجينات البكتيرية الرئيسية
الشكل 6 ILA يعزز التخليق الميكروبي لـ IPA و IAA. أ مخطط تجريبي لفحص دور التغذية المتبادلة تم استنفاد الميكروبيوم المعوي بعد أسبوعين من إعطاء المضادات الحيوية في مياه الشرب، تلاها إعطاء فموي لطفرات ناقصة من ArAT. ) أو L. reuteri الميت حرارياً لمدة أسبوعين آخرين مع أو بدون إعطاء فموي لـ ILA في الأسبوع الثاني. تم تحفيز التهاب القولون عن طريق إضافة 3% DSS في مياه الشرب في الأسبوع الخامس. تم تقييم شدة التهاب القولون من خلال تحديد التغيرات في وزن الجسم (B) وطول القولون (C). تم قياس تركيزات IAA (D) و IPA (E) في محتويات القولون. F مخطط تجريبي لتقييم دور الميكروبيوتا المعوية في تخليق IPA و IAA بواسطة ILA. تم إعطاء الفئران مزيجًا من المضادات الحيوية أو بدونها لمدة يومين، تلاها تحفيز خلل التوازن الميكروبي لمدة أسبوع. أو 8). تم استخدام ثلاثة نماذج مختلفة من اختلال التوازن الميكروبي بما في ذلك 3% DSS في مياه الشرب، ومزيج من المضادات الحيوية في مياه الشرب، والتحدي اليومي عن طريق الفم مع C. rodentium. غنى GRichness ومؤشر شانون للميكروبات القولونية بين مجموعات مختلفة من الفئران في اليوم التاسع. H رسم PCoA لمسافة براى-كورتيس. تُظهر المقارنات بين تركيزات IAA (I) وIPA (J) في محتويات القولون بين المجموعات. . * ; غير مهم
المسؤول عن استقلاب التريبتوفان في مرضى التهاب الأمعاء، قمنا باسترجاع مجموعات بيانات التوصيف الميتا ترانسكريبتومي من مجموعة HMP2 IBDMDB، التي تشمل عينات البراز من كل من التهاب القولون التقرحي (UC، ) ومرض كرون (CD، ) المرضى بالإضافة إلى الأصحاء أظهر مخطط PCoA أن ملف الميكروبات المسؤول عن استقلاب التربتوفان يختلف عن الأفراد الأصحاء، دون وجود فرق واضح بين مرضى التهاب القولون التقرحي ومرضى داء كرون (الملف الإضافي 1: الشكل S9A). من بين الجينات الميكروبية الأيضية، أظهر ACD فقط انخفاضًا ملحوظًا في الأفراد الذين يعانون من التهاب القولون التقرحي (الملف الإضافي 1: الشكل S9B). تم إنتاج ACD بشكل رئيسي بواسطة Faecalibacterium.
“(21.9%)، روزبورية (20.7%)، وبريفوتيلا (7.5%) في عينات البراز، وكانت وفرتها منخفضة بشكل ملحوظ في مرضى التهاب الأمعاء (الشكل S9C و9E). على مستوى الأنواع، كانت البكتيريا الثلاثة الأكثر وفرة تشمل روزبورية سب. CAG:18_43_25 (13.2%)، فاسيكاليباكتيريوم براوزنيتزي ( ) و Prevotella copri ( )، كانت منخفضة بشكل ملحوظ في مرضى التهاب الأمعاء (الملف الإضافي 1: الشكل S9D و F). إن قمع ACD والبكتيريا المنتجة لـ ACD يتماشى مع ملاحظة سابقة حول تقليل IPA في اختلال التوازن الميكروبي الناتج عن التهاب الأمعاء [46]. بشكل جماعي، تشير هذه النتائج بقوة إلى أن استقلاب التربتوفان بواسطة الميكروبات المعوية من المحتمل أن يكون منخفضًا في مرضى التهاب الأمعاء.

نقاش

في هذه الدراسة، نحدد آلية جزيئية تساهم من خلالها المستقلبات في تعديل بيئة الأمعاء المتعايشة. على وجه التحديد، تلعب مستقلبات التربتوفان الميكروبية ILA دورًا حاسمًا في الوساطة بين الميكروبات وتتحكم بشكل تعاوني في توازن الأمعاء مع الإندولات المستمدة من الميكروبات الأخرى. تظهر نتائجنا أن ILA زادت من استقلاب التربتوفان الميكروبي وتعزز من تخليق IPA وIAA في الجسم الحي وفي المختبر. كما حددنا عدة بكتيريا مثل Clostridium لتحويل ILA إلى IPA وIAA من خلال تحفيز التعبير عن عدة إنزيمات أساسية لاستقلاب التربتوفان. علاوة على ذلك، فإن التغذية المتبادلة الميكروبية التي تتوسطها ILA تعتمد على الميكروبيوتا وتعزز بشكل خاص مستويات الإندولات في ظل ظروف اختلال التوازن الميكروبي الناتج عن Citrobacter rodentium أو DSS، ولكن ليس في حالة اضطراب الميكروبيوتا باستخدام المضادات الحيوية.
يتماشى مع دراسة سابقة [47]، وجدنا أن L. reuteri يزيد بشكل كبير من Clostridium XIVa وClostridium IV، اللذان هما المسؤولان عن تكاثر فوكس ب خلايا Treg في الغشاء المخاطي القولوني [48]. زراعة الميكروبيوم القولوني لـ الفئران التي تم إعطاؤها ريوتيري أعادت تجسيد التأثير الوقائي لـ . ريوتيري ضد التهاب القولون في الفئران المعالجة بـ DSS. أظهر تحليل الميتابولوميات أن الـ L. reuteri يعكس ضعف استقلاب التربتوفان الميكروبي في الفئران المصابة بالتهاب القولون من خلال تعزيز التعبير عن إنزيمات الاستقلاب مما يؤدي إلى زيادة تخليق IPA وIAA. تتفق بياناتنا مع تقرير سابق [41]، حيث أظهرت أن IPA يعزز بشكل كبير سلامة الحاجز الظهاري ويقلل الالتهاب في نموذجين مختلفين من التهاب الأمعاء بما في ذلك التهاب القولون الناتج عن DSS والتهاب القولون التلقائي IL-10-/-. أظهرت نتائجنا أن IAA قد يخفف التهاب القولون من خلال تعديل الميكروبيوم المعوي ولا يعتمد فقط على تنشيط AhR في الفئران المعالجة بـ DSS. كما أفادت الأبحاث السابقة أن فعالية العلاج الكيميائي لـ IAA تعتمد على الميويلوبيروكسيداز المستمد من الخلايا المناعية، وليس على إشارات AhR [4]. ومن الجدير بالذكر أن L. reuteri زادت من مستويات النسخ لـ PXR والجينات ذات الصلة دون تنشيط AhR وجيناته المستهدفة. تشير هذه البيانات إلى أن الخصائص الواقية لـ IAA ضد التهاب القولون قد تعتمد على الميكروبيوم المعوي، بينما تعتمد خصائص IPA على تنشيط PXR.
الآلية الجزيئية الأساسية لـ ILA في الحفاظ على توازن الأمعاء غير معروفة إلى حد كبير. تشير بياناتنا إلى أن ILA يقلل من الالتهاب المعوي والأمراض المرتبطة بالتهاب القولون الناتج عن DSS. من المعروف أن ILA يثبط الالتهاب عن طريق تقليل مستويات السيتوكينات المؤيدة للالتهاب من خلال تنشيط AhR. ومع ذلك، أظهرنا أن التأثير الوقائي لـ ILA يتأثر بشكل كبير بمضاد AhR في المعالجة بـ DSS.
الفئران. كشفت تحليلات الميكروبيوتا لدينا أن ILA غيرت بشكل ملحوظ الميكروبيوتا المعوية، مع زيادة كبيرة في Clostridium XIVa، وهو بكتيريا رئيسية تقوم بتمثيل التربتوفان. بالإضافة إلى ذلك، لم تستجب الفئران المصابة بالتهاب القولون المعالجة بالمضادات الحيوية بشكل إيجابي لإدارة ILA. علاوة على ذلك، خفف ILA الالتهاب المعوي وغير تركيب الميكروبيوتا في IL- الفئران. تشير هذه النتائج إلى أن ILA تحمي من التهاب القولون والالتهاب المعوي من خلال تعديل الميكروبيوم المعوي، وهو ما يتماشى مع تقرير سابق يفيد بأن تتميز تمايز اللمفاويات داخل الظهارة المعوية المعتمد على ريوتيري بكونه معتمدًا على ILA ويعتمد على وجود الميكروبات المعوية.
التغذية المتبادلة بين البكتيريا هي استخدام المستقلبات من بكتيريا واحدة بواسطة أخرى، وهي ظاهرة شائعة في المجتمعات الطبيعية وتزيد من تنوع الميكروبيوم المعوي. لقد أظهرنا في الدراسة لأول مرة أن Lactobacillus لديه القدرة على تعديل المناعة المعوية والميكروبيوم المعوي من خلال تخليق ILA، وهو مستقلب وسيط “أساسي” في مسارات استقلاب التربتوفان البكتيري. أولاً، تم الكشف عن ILA، وليس IAA أو IPA، في السائل الفائق لـ L. reuteri وأنواع Lactobacillus الأخرى. ثانياً، أدى ILA إلى تحفيز تخليق IPA وIAA في كل من الثقافة اللاهوائية للميكروبيوم القولوني وميكروبيوم القولون للفئران المعالجة بـ DSS. ثالثاً، تم إثراء ACD وIAAH، وهما إنزيمان بكتيريان أساسيان متورطان في تخليق IPA وIAA، والبكتيريا المعروفة بترميز هذه الإنزيمات (مثل Roseburia وFaecalibacterium وClostridium)، استجابةً لإعطاء ILA أو L. reuteri المنتج لـ ILA. رابعاً، فقد سلالة متحورة من L. reuteri تفتقر إلى ArAT، وهو إنزيم بكتيري رئيسي مسؤول عن تحويل التربتوفان إلى ILA، قدرتها على إنتاج IPA وIAA أو حماية الفئران من التهاب القولون الناتج عن DSS. تشير هذه الأدلة المستقلة مجتمعة إلى أن ILA من المحتمل جداً أن يتم استقلابه بواسطة البكتيريا من خلال التغذية المتبادلة لإنتاج IPA وIAA.
وفقًا لنتائجنا، تم إظهار أن بكتيريا البيفيدوبكتيريوم المنتجة لـ ILA مرتبطة إيجابيًا بمستويات IPA في المصل، خاصة بين الأفراد غير المستمرين في إنتاج اللاكتاز [39]. أظهرت دراسة أخرى باستخدام الفئران الجنوطوبية زيادة في تركيزات كل من IAA وIPA بعد تلقيحها بـ GUT-108، وهو تجمع من 17 سلالة بكتيرية حية [39]، مما يشير إلى أن إنتاج IAA وIPA يمكن أن يتم بشكل تعاوني بواسطة البكتيريا المعوية. كما تم الإبلاغ عن ارتباط إيجابي قوي بين تناول الألياف ومستويات IPA المتداولة، على الرغم من أن IPA لا يتم اشتقاقه من تخمير الألياف [39، 52]. من المحتمل أن يؤدي تناول الألياف العالية إلى إثراء بعض البكتيريا المولدة للتريبتوفان مثل الكلوستريديوم لإنتاج IPA من خلال التغذية المتبادلة بين البكتيريا.
معًا، من المحتمل أن يتم استخدام ILA بواسطة البكتيريا المعوية لتعزيز إنتاج IPA وIAA.
تم الإبلاغ عن أن فعالية العلاج الكيميائي للسرطان أو الاستجابة للتدخلات البروبيوتيك تتأثر بشدة بميكروبيوتا الأمعاء لدى الأفراد. بشكل متسق، كانت تنظيم الميكروبيوم المعوي بواسطة ILA معتمدة على الميكروبيوتا وزادت بشكل خاص من مستويات الإندولات في ظروف اختلال التوازن الميكروبي مع Citrobacter rodentium أو DSS، ولكن ليس في حالة تدمير الميكروبيوتا بالمضادات الحيوية. قد يكون هذا مرتبطًا بتقليل بعض البكتيريا المحددة التي تقوم بتمثيل التربتوفان. باستخدام نهج الميتا ترانسكروم، أكدنا اختلال التوازن في بكتيريا تمثيل التربتوفان، وتم تقليل التعبير عن أسيل-CoA ديهيدروجيناز، الذي يتطلب لإنتاج IPA، بشكل كبير في مرضى التهاب الأمعاء.
لذلك، تشير دراستنا إلى أن تركيبة الميكروبيوتا ووظيفتها قد يتم تنظيمها من خلال الأساليب البروبيوتيك. قد يمكّن علاج المستقلبات الذي يتوسط المستقلبات المشتقة من الميكروبيوتا من التحكم بشكل أفضل في تفاعلات المضيف والميكروبيوتا. قد يساعد استخدام العوامل الذاتية التي تصحح الميكروبيوتا من حالة المرض إلى حالة صحية في التغلب على التباين الكبير بين الأفراد، والذي يحد حاليًا من فعالية العلاجات الدوائية أو التدخلات البروبيوتيك. قد توفر المستقلبات المشتقة من الميكروبيوتا أو “البوستبيوتيك” المستهدفة أساليب جديدة للوقاية أو العلاج من الأمراض الناتجة عن اختلال التوازن الميكروبي.

الاختصارات

AhR مستقبل الهيدروكربون العطري
ACD ديهيدروجيناز أسيل-CoA
أرات أمينوترانسفيراز الأحماض الأمينية العطرية
قرص مضغوط مرض كرون
متلازمة التعب المزمن السائل الطافح الخالي من الخلايا
CLP سلف اللمفاويات المشترك
CMT زراعة ميكروبات القولون
داي مؤشر نشاط المرض
تحليل المسار الجيني تحليل إثراء مجموعة الجينات
IAA حمض الإندول-3-أسيتيك
IAAH هيدرازين إندول أسيتاميد
IBD مرض الأمعاء الالتهابي
ICA إندول-3-كاربالديهيد
هوية ديكربوكسيلاز إندول بيوفريت
إيدو إنزيمات إندولامين 2,3-ديوكسيجيناز
إل إنترلوكين
إلى حمض الإندول-3-لاكتك
ILD ديهيدروجيناز إندول لاكتات
IPA حمض الإندول-3-بروبيونيك
كيج موسوعة كيوتو للجينات والجينومات
ضربة قاضية ضربة قاضية
ليفس حجم تأثير تحليل التمييز الخطي
ل. ريوتيري لاكتوباسيلس ريوتيري
MLNs الغدد اللمفاوية المساريقية
PBS محلول ملحي معزز بالفوسفات
تفاعل البوليميراز المتسلسل تفاعل البوليميراز المتسلسل
PXR مستقبل الحمل X
تسلسل RNA تسلسل RNA
الرنا الريبوسومي الرنا الريبوسومي
ث خلايا ت المساعدة
UC التهاب القولون التقرحي
WT النوع البري
س. سبوروجينيس كلوستريديوم سبوروجينيس

معلومات إضافية

تحتوي النسخة الإلكترونية على مواد إضافية متاحة علىhttps://doi. org/10.1186/s40168-024-01750-y.
الملف الإضافي 1: الشكل S1. L. reuteri يحمي الفئران من التهاب القولون الناتج عن DSS. (A) مخطط تجريبي لنموذج زراعة ميكروبات القولون (CMT) لالتهاب القولون-الشفاء-التهاب القولون. تم إعطاء فئران C57BL/6 التي تبلغ من العمر ستة أسابيع عن طريق الفم من PBS مع أو بدون . ريوتيري 15007 ( ) يوميًا لمدة ثلاثة أسابيع، تليها أسبوع من إدارة 3% DSS في مياه الشرب لتحفيز التهاب القولون ثم فترة استرداد ذاتي لمدة 12 يومًا. من اليوم 40 إلى 47، تم تحفيز جولة ثانية من التهاب القولون باستخدام 2% DSS في مياه الشرب لمدة أسبوع، تليها CMT متبادلة. تم تغذية الفئران في مجموعة DSS ببكتيريا القولون من اليوم 28 من مجموعة DSS_15007، بينما تم إعطاء الفئران في مجموعة DSS_15007 ميكروبيوتا القولون من اليوم 28 من مجموعة DSS. (B) التغيرات الديناميكية في مؤشر نشاط المرض (DAI) من اليوم 21 إلى 40. (C) الدرجات النسيجية القولونية للفئران ( ). (D) صور تمثيلية لصبغة الهيماتوكسيلين والإيوزين لأقسام القولون. (E) تحليل PCoA لمسافات براى-كورتيس للميكروبات القولونية بين ثلاث مجموعات من الفئران في اليوم 40. (F) تنوع ألفا (مؤشرات الغنى وشانون) للميكروبات القولونية ( ) في اليوم 40. يتم عرض القيمة المتوسطة لكل مجموعة. ****p <0.0001، ***p <0.001، ; ns، غير مهم. الشكل S2. الميكروبات المعوية للفئران المدعمة بـ L. reuteri تحمي الفئران من التهاب القولون الناتج عن DSS. تصميم التجربة راجع الأسطورة في الشكل التكميلية 1A للحصول على تفاصيل التجربة. البقاء (A) وتغيرات وزن الجسم (B) للفئران ( تم تسجيلها بين اليوم 47-51. تم إجراء التحليل الإحصائي مع تغييرات الوزن باستخدام تحليل التباين الأحادي واختبار توكي بعد الاختبار. **p < 0.01 تشير إلى اختلافات كبيرة بين مجموعتي DSS_FI5007 و 15007_FDSS في اليومين 47 و 48. درجة النسيج (C) والصور التمثيلية (D) لأقسام القولون الملونة بالهيماتوكسيليين والإيوزين لمجموعات مختلفة من الفئران في اليوم 51. ). (E) أطوال القولون لمجموعات مختلفة من الفئران في اليوم 51 ( تم تحديد أعداد خلايا Th17A (F) وأعداد خلايا Treg (G) في خلايا السلف اللمفاوي المشترك (CLP) بالإضافة إلى أعداد خلايا Th17A (H) وأعداد خلايا Treg (I) في العقد اللمفاوية المساريقية (MLNs) بواسطة تحليل تدفق الخلايا. ; ns، غير مهم. الشكل S3. يؤثر L. reuteri على مستويات مستقلبات التريبتوفان وتعبير الجينات المرتبطة بـ AhR. تصميم التجربة راجع الشكل التوضيحي 1A للحصول على تفاصيل تجريبية. (A) تركيزات المصل من مستقلبات التريبتوفان (كينورينين، تريبتوفان، 5-HT، وILA) ( ) في اليوم 28 في نهاية التجربة. (B) مخطط انتشار لنتائج إثراء مسار موسوعة كيوتو للجينات والجنوم (KEGG) للجينات المعبر عنها بشكل مختلف. يشير عامل الثراء إلى عدد الجينات المعبر عنها بشكل مختلف الموجودة في مسار KEGG. يمثل اللون أهمية الفرق. (C) تظهر نتائج تحليل إثراء مجموعة الجينات (GSEA) إثراء سلبياً لمجموعات الجينات المرتبطة بالالتهاب، والتي تغيرت بعد . علاج reuteri مقارنة بمجموعة DSS. (D) التغيرات في AhR وجيناته المستهدفة (Cyp1a1 و IL-22) في القولون لدى الفئران ( ). (E) مخطط تحليل المكونات الرئيسية (PCA) للملفات الوظيفية مع وحدات الجينات. (F) تحليل شبكة الارتباط بين الجينات المعبر عنها بشكل مختلف والبكتيريا بناءً على ارتباط سبيرمان. تشير الاتصالات الحمراء إلى ارتباط إيجابي ( , FDR 0.05) وتمثل الاتصالات الزرقاء ارتباطات سلبية ( , FDR 0.05)، بينما تشير الاتصالات الرمادية إلى عدم وجود ارتباط (FDR > 0.05). * ; ns، غير مهم. الشكل S4. تحسن IPA وIAA التهاب القولون الناتج عن DSS في الفئران. (A) تصميم التجربة ( ). تم تحفيز التهاب القولون عن طريق توفير 3% DSS في مياه الشرب للفئران لمدة 7 أيام مع أو بدون إعطاء فموي لـ 20 أو IPA أو IAA. (B) تغييرات في وزن الجسم خلال التجربة. (C) طول القولون لدى الفئران بين مجموعات مختلفة من الفئران في اليوم 7. (D) درجة نسيجية (اللوحة العليا) وصور تمثيلية لصبغة الهيماتوكسيليين والإيوزين (اللوحة السفلية) من مقاطع القولون في اليوم 7. تمثل القضبان المقياس . (E) تغييرات في خلايا الكأس في القولون لدى الفئران ( ). تظهر اللوحة العليا خلايا الكأس لكل كريبت في القولون، وتظهر اللوحة السفلية صور تمثيلية لصبغة الألكيان الأزرق لخلايا الكأس في الطبقة المخاطية الداخلية لمقاطع القولون. (F) مستويات IL-1 و TNF-a mRNAs في القولون ( ) تم تقييمها باستخدام RT-qPCR. (G) تعبير بروتينات الأوكلاودين وE-cadherin ( ) تم تحديده بواسطة Western blotting. (H) تعبير القولون
تعبير AhR وCyp1a1 وPxr mRNAs ( ) بواسطة RT-qPCR. * ; ns، غير مهم. الشكل S5. تحفز IPA وIAA تحولاً في تركيب الميكروبات القولونية لدى الفئران. تم تحفيز التهاب القولون عن طريق توفير 3% DSS في مياه الشرب للفئران لمدة 7 أيام مع أو بدون إعطاء فموي لـ 20 أو IPA أو IAA. (A) مخططات الصندوق للتنوع (الثراء، مؤشرات سيمبسون وشانون) للميكروبات القولونية في اليوم . يتم عرض الوسائط للبيانات. تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام اختبار ويلكوكسون. ; ns، غير مهم. (B) مخطط PCoA لمسافة براى-كورتيس لتقييم -تنوع الميكروبات القولونية في اليوم بين مجموعات مختلفة من الفئران. الشكل S6. قياس مشتقات الإندول في السائل الفائق الخالي من الخلايا. (A) تم زراعة أنواع مختلفة من Lactobacillus تحت ظروف لاهوائية مع إضافة 10% من وسط دي مان روغوسا شارب (MRS) لمدة 20 ساعة عند , تلاها قياس أربعة مشتقات إندول مختلفة في السائل الفائق لكل زراعة لاهوائية. (B) تم حضن L. reuteri 15007 مع تركيزات مختلفة من التريبتوفان تحت ظروف لاهوائية لمدة 20 ساعة عند , تلاها قياس ILA في السائل الفائق. الشكل S7. يخفف ILA التهاب القولون الناتج عن DSS ويغير تركيب الميكروبات المعوية. تم إعطاء فئران C57BL/6 التي تبلغ من العمر ستة أسابيع عن طريق الفم من PBS مع أو بدون ILA يومياً لمدة أسبوع. تم تحفيز التهاب القولون عن طريق إضافة DSS في مياه الشرب. (A) تغييرات في وزن الجسم بين ثلاث مجموعات من الفئران ( ). (B) طول القولون لدى الفئران بين ثلاث مجموعات من الفئران ( ). (C) مستويات TNF- و IL-1 في المصل ( ). (D) درجات نسيجية للقولون ( ). (E) صور تمثيلية لصبغة الهيماتوكسيليين والإيوزين لمقاطع القولون. (F) الثراء ومؤشر شانون للميكروبات القولونية بين ثلاث مجموعات من الفئران. (G) مخطط PCoA لمسافة براى-كورتيس بين ثلاث مجموعات من الفئران. (H) الوفرة النسبية لأعلى 15 جنساً. , **p , *** , و . الشكل S8. يخفف ILA ويغير تركيب الميكروبات القولونية لدى الفئران المعالجة بـ DSS. (A) تصميم التجربة. تم استنفاد الميكروبات المعوية لفئران C57BL/6 التي تبلغ من العمر 6 أسابيع ( ) باستخدام كوكتيل من المضادات الحيوية في مياه الشرب لمدة أسبوعين، تلاها 3% DSS في مياه الشرب مع أو بدون إعطاء فموي لـ ILA يومياً لمدة أسبوع آخر. (B) تغييرات الوزن بين اليوم 14-21. (C) طول القولون لدى الفئران بين مجموعات مختلفة. تم عرض درجة نسيجية (D) وصور تمثيلية لصبغة الهيماتوكسيليين والإيوزين لمقاطع القولون (E). (F) تصميم التجربة. تم إعطاء الفئران ( 5) عن طريق الفم مع أو بدون ILA لمدة أسبوع، تلاها تحفيز التهاب القولون باستخدام 3% DSS في مياه الشرب لمدة أسبوع آخر مع أو بدون مكملات فموية لـ ILA أو CH223191. (G) تغييرات في وزن الجسم بين اليوم 7-14 بين مجموعات مختلفة من الفئران. (H) طول القولون لدى الفئران في اليوم 14 في مجموعات مختلفة. تم عرض درجة نسيجية (I) وصور تمثيلية لصبغة الهيماتوكسيليين والإيوزين لمقاطع القولون (J). , **p , و , ns، غير مهم. الشكل S9. تتغير البكتيريا والإنزيمات البكتيرية المشاركة في الأيض الميكروبي للتريبتوفان في مرضى IBD. تم استرجاع قراءات تسلسل الميتا ترانسكريبتوم البشري HMP2 لـ 46 مريضاً بمرض كرون (CD) و21 مريضاً بالتهاب القولون التقرحي (UC) و11 من الأصحاء (غير IBD) من قاعدة بيانات الأمراض المعوية الالتهابية متعددة الأوميات. (A) مخطط PCoA لمسافة براى-كورتيس على طول مرضى CD وUC والأصحاء. (B) الوفرة المعدلة من أسيل-CoA ديهيدروجيناز (ACD) بين مرضى CD وUC والأصحاء. تم تحديد الأهمية الإحصائية من نماذج التأثيرات المختلطة الخطية. . (C) توزيع ACD في أعلى 10 أجناس (C) وأنواع (D). التغيرات في أعلى 10 أجناس بكتيرية تعبر عن ACD (E) وأنواع (F) بين مرضى CD وUC والأصحاء.
ملف إضافي 2: الجدول S2. تسلسلات البرايمر المستخدمة في الدراسة الحالية.

شكر وتقدير

نشكر البروفيسور جونجون وانغ من جامعة الزراعة الصينية على توفير L. johnsonii وL. delbrueckii وبروفيسور هوي صن من جامعة جيلين الزراعية على توفير L. rhamnosus GG وL. plantarum.

مساهمات المؤلفين

SYQ وXFZ تصوروا وصمموا الدراسة. قام XYW وYHM بإجراء التجارب. جمع YMW وHTY العينات. قام LUY وSC بتحليل العينات. قام GW وXYF بتحليل البيانات. كتب GW المخطوطة. قام XFZ وLGZ وGW بمراجعة المخطوطة. قرأ جميع المؤلفين ووافقوا على المخطوطة النهائية.

تمويل

تم دعم هذا العمل من قبل البرنامج الوطني الرئيسي للبحث والتطوير في الصين (2022YFC2105001)، وصندوق العلوم الوطنية للعلماء الشباب المتميزين (رقم 32202721)، وبرنامج ما بعد الدكتوراه الوطني للموهوبين المبتكرين في الصين (رقم BX20220342)، ومؤسسة العلوم ما بعد الدكتوراه في الصين (رقم 2022M723419)، ومؤسسة العلوم الطبيعية الوطنية في الصين (رقم U180220167).

توفر البيانات والمواد

تم إيداع بيانات تسلسل 16 S rDNA والميتا ترانسكريبتوم في الدراسة الحالية في قاعدة بيانات NCBI Sequence Read Archive تحت أرقام الوصول PRJNA782376 وPRJNA782681.

إعلانات

تمت الموافقة على جميع تجارب الفئران من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية في جامعة الزراعة الصينية (بكين، CAU20150925-2).
غير قابل للتطبيق.

المصالح المتنافسة

يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح متنافسة.

تفاصيل المؤلف

المختبر الوطني الرئيسي لتغذية الحيوانات، كلية علوم وتكنولوجيا الحيوانات، جامعة الزراعة الصينية، بكين 100193، الصين. مختبر بكين الرئيسي للإضافات الغذائية البيولوجية، جامعة الزراعة الصينية، بكين 100193، الصين. معهد أبحاث التكنولوجيا المتقدمة لجامعة الزراعة الصينية في شنتشن، شنتشن 518116، الصين. قسم علوم الحيوان والأغذية، جامعة ولاية أوكلاهوما، ستيلووتر، OK 74078، الولايات المتحدة الأمريكية.
تاريخ الاستلام: 23 مارس 2023 تاريخ القبول: 3 يناير 2024
تم النشر على الإنترنت: 19 مارس 2024

References

  1. Fang H, Fu L, Wang J. Protocol for fecal microbiota transplantation in inflammatory bowel disease: a systematic review and meta-analysis. Biomed Res Int. 2018;2018:8941340.
  2. Lamas B, Richard ML, Leducq V, Pham H-P, Michel M-L, Da Costa G, et al. CARD9 impacts colitis by altering gut microbiota metabolism of tryptophan into aryl hydrocarbon receptor ligands. Nat Med. 2016;22:598-605.
  3. Koh A, De Vadder F, Kovatcheva-Datchary P, et al. From dietary fiber to host physiology: short-chain fatty acids as key bacterial metabolites. Cell. 2016;165:1332-45.
  4. Tintelnot J, Xu Y, Lesker TR, et al. Microbiota-derived 3-IAA influences chemotherapy efficacy in pancreatic cancer. Nature. 2023;615:168-74.
  5. Wang G, Huang S, Wang Y, et al. Bridging intestinal immunity and gut microbiota by metabolites. Cell Mol Life Sci. 2019;76:3917-37.
  6. Roth W, Zadeh K, Vekariya R, et al. Tryptophan metabolism and gut-brain homeostasis. Int J Mol Sci. 2021;22:2973.
  7. Dodd D, Spitzer MH, Van Treuren W, et al. A gut bacterial pathway metabolizes aromatic amino acids into nine circulating metabolites. Nature. 2017;551:648-52.
  8. Zelante T, lannitti RG, Cunha C, et al. Tryptophan catabolites from microbiota engage aryl hydrocarbon receptor and balance mucosal reactivity via interleukin-22. Immunity. 2013;39:372-85.
  9. Krishnan S, Ding Y, Saedi N, et al. Gut microbiota-derived tryptophan metabolites modulate inflammatory response in hepatocytes and macrophages. Cell Rep. 2018;23:1099-111.
  10. , et al. Rewiring the altered tryptophan metabolism as a novel therapeutic strategy in inflammatory bowel diseases. Gut. 2023;72. Available from: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/ 36270778/. Cited 2023 Nov 21.
  11. Cervantes-Barragan L, Chai JN, Tianero MD, et al. Lactobacillus reuteri induces gut intraepithelial CD4+CD8aa+T cells. Science. 2017;357:806-10.
  12. Wilck N, Matus MG, Kearney SM, et al. Salt-responsive gut commensal modulates TH17 axis and disease. Nature. 2017;551:585-9.
  13. Laursen MF, Sakanaka M, von Burg N, et al. Bifidobacterium species associated with breastfeeding produce aromatic lactic acids in the infant gut. Nat Microbiol. 2021;6:1367-82.
  14. Wang G, Huang S, Cai S, et al. Lactobacillus reuteri ameliorates intestinal inflammation and modulates gut microbiota and metabolic disorders in dextran sulfate sodium-induced colitis in mice. Nutrients. 2020;12:2298.
  15. Zhu H, Cao C, Wu Z, et al. The probiotic L. casei Zhang slows the progression of acute and chronic kidney disease. Cell Metab. 2021;33:1926-1942.e8.
  16. Hu J, Ma L, Nie Y, et al. A microbiota-derived bacteriocin targets the host to confer diarrhea resistance in early-weaned piglets. Cell Host Microbe. 2018;24:817-832.e8.
  17. Stillie R, Stadnyk AW. Role of TNF receptors, TNFR1 and TNFR2, in dextran sodium sulfate-induced colitis. Inflamm Bowel Dis. 2009;15:1515-25.
  18. Suez J, Zmora N, Zilberman-Schapira G, et al. Post-antibiotic gut mucosal microbiome reconstitution is impaired by probiotics and improved by autologous FMT. Cell. 2018;174:1406-1423.e16.
  19. Weigmann B, Tubbe I, Seidel D, et al. Isolation and subsequent analysis of murine lamina propria mononuclear cells from colonic tissue. Nat Protoc. 2007;2:2307-11.
  20. Liu H, Hou C, Wang G, et al. Lactobacillus reuteri I5007 modulates intestinal host defense peptide expression in the model of IPEC-J2 cells and neonatal piglets. Nutrients. 2017;9:559.
  21. Edgar RC. Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST. Bioinformatics. 2010;26:2460-1.
  22. Rognes T, Flouri T, Nichols B, et al. VSEARCH: a versatile open source tool for metagenomics. PeerJ. 2016;4:e2584.
  23. Cole JR, Wang Q, Fish JA, et al. Ribosomal Database Project: data and tools for high throughput rRNA analysis. Nucleic Acids Res. 2014;42:D633-42.
  24. Douglas GM, Maffei VJ, Zaneveld JR, et al. PICRUSt2 for prediction of metagenome functions. Nat Biotechnol. 2020;38:685-8.
  25. Bolger AM, Lohse M, Usadel B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 2014;30:2114-20.
  26. Langmead B, Salzberg SL. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat Methods. 2012;9:357-9.
  27. Grabherr MG, Haas BJ, Yassour M, et al. Full-length transcriptome assembly from RNA-Seq data without a reference genome. Nat Biotechnol. 2011;29:644-52.
  28. Li W, Godzik A. Cd-hit: a fast program for clustering and comparing large sets of protein or nucleotide sequences. Bioinformatics. 2006;22:1658-9.
  29. Patro R, Duggal G, Love MI, et al. Salmon provides fast and bias-aware quantification of transcript expression. Nat Methods. 2017;14:417-9.
  30. Zhu W, Lomsadze A, Borodovsky M. Ab initio gene identification in metagenomic sequences. Nucleic Acids Res. 2010;38:e132-e132.
  31. Buchfink B, Xie C, Huson DH. Fast and sensitive protein alignment using DIAMOND. Nat Methods. 2015;12:59-60.
  32. Love MI, Huber W, Anders S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol. 2014;15:550.
  33. Huson DH, Auch AF, Qi J, et al. MEGAN analysis of metagenomic data. Genome Res. 2007;17:377-86.
  34. Kim D, Langmead B, Salzberg SL. HISAT: a fast spliced aligner with low memory requirements. Nat Methods. 2015;12:357-60.
  35. Yu G, Wang L-G, Han Y, et al. clusterProfiler: an R package for comparing biological themes among gene clusters. OMICS. 2012;16:284-7.
  36. Langfelder P, Zhang B, Horvath S. Defining clusters from a hierarchical cluster tree: the Dynamic Tree Cut package for R. Bioinformatics. 2008;24:719-20.
  37. IBDMDB Investigators, Lloyd-Price J, Arze C, et al. Multi-omics of the gut microbial ecosystem in inflammatory bowel diseases. Nature. 2019;569:655-62.
  38. Wang G, Wang X, Ma Y, et al. Lactobacillus reuteri improves the development and maturation of fecal microbiota in piglets through mother-to-infant microbe and metabolite vertical transmission. Microbiome. 2022;10:211.
  39. Qi Q, Li J, Yu B, et al. Host and gut microbial tryptophan metabolism and type 2 diabetes: an integrative analysis of host genetics, diet, gut microbiome and circulating metabolites in cohort studies. Gut. 2022;71:1095-105.
  40. Platten M, Wick W, Van den Eynde BJ. Tryptophan catabolism in cancer: beyond IDO and tryptophan depletion. Cancer Res. 2012;72:5435-40.
  41. Venkatesh M, Mukherjee S, Wang H, et al. Symbiotic bacterial metabolites regulate gastrointestinal barrier function via the xenobiotic sensor PXR and Toll-like receptor 4. Immunity. 2014;41:296-310.
  42. Lee JS, Cella M, McDonald KG, et al. AHR drives the development of gut ILC22 cells and postnatal lymphoid tissues via pathways dependent on and independent of Notch. Nat Immunol. 2012;13:144-51.
  43. Wilson MS, Ramalingam TR, Rivollier A, et al. Colitis and intestinal inflammation in IL10-/- mice results from IL-13Ra2-mediated attenuation of IL-13 activity. Gastroenterology. 2011;140:254-64.
  44. Nikolaus S, Schulte B, Al-Massad N, et al. Increased tryptophan metabolism is associated with activity of inflammatory bowel diseases. Gastroenterology. 2017;153:1504-1516.e2.
  45. Schirmer M, Franzosa EA, Lloyd-Price J, et al. Dynamics of metatranscription in the inflammatory bowel disease gut microbiome. Nat Microbiol. 2018;3:337-46.
  46. Investigators IBDMDB, Lloyd-Price J, Arze C, Ananthakrishnan AN, et al. Multi-omics of the gut microbial ecosystem in inflammatory bowel diseases. Nature. 2019;569:655-62.
  47. Jang YJ, Kim W-K, Han DH, et al. Lactobacillus fermentum species ameliorate dextran sulfate sodium-induced colitis by regulating the immune response and altering gut microbiota. Gut Microbes. 2019;10:696-711.
  48. Atarashi K, Tanoue T, Oshima K, et al. Treg induction by a rationally selected mixture of Clostridia strains from the human microbiota. Nature. 2013;500:232-6.
  49. Ehrlich AM, Pacheco AR, Henrick BM, et al. Indole-3-lactic acid associated with Bifidobacterium-dominated microbiota significantly decreases inflammation in intestinal epithelial cells. BMC Microbiol. 2020;20:357.
  50. Zelezniak A, Andrejev S, Ponomarova O, et al. Metabolic dependencies drive species co-occurrence in diverse microbial communities. Proc Natl Acad Sci U S A. 2015;112:6449-54.
  51. Meng D, Sommella E, Salviati E, et al. Indole-3-lactic acid, a metabolite of tryptophan, secreted by Bifidobacterium longum subspecies infantis is anti-inflammatory in the immature intestine. Pediatr Res. 2020;88:209-17.
  52. Menni C, Hernandez MM, Vital M, et al. Circulating levels of the antioxidant indoleproprionic acid are associated with higher gut microbiome diversity. Gut Microbes. 2019;10:688-95.
  53. Zmora N, Zilberman-Schapira G, Suez J, et al. Personalized gut mucosal colonization resistance to empiric probiotics is associated with unique host and microbiome features. Cell. 2018;174:1388-1405.e21.

ملاحظة الناشر

تظل Springer Nature محايدة فيما يتعلق بالمطالبات القضائية في الخرائط المنشورة والانتماءات المؤسسية.

  1. *المراسلة:
    شيانغفانغ زينغ
    ziyangzxf@163.com
    القائمة الكاملة لمعلومات المؤلف متاحة في نهاية المقال
  2. (انظر الشكل في الصفحة التالية.)
    الشكل 1 L. reuteri يغير تركيبة الميكروبيوم المعوي ومستقلب التريبتوفان الميكروبي. A إثراء تفاضلي للميكروبيوم القولوني للفئران استجابةً لـ . مكملات reuteri في اليوم 28 (انظر أسطورة الشكل S1A للمخطط التجريبي). يتم عرض التصنيفات التصنيفية للبكتيريا في اللوحة اليسرى. الفراغات هي تصنيفات غير محددة. يتم تصنيف 36 تصنيفًا بكتيريًا مختلفًا بناءً على تقدير الانخفاض المتوسط في الدقة استنادًا إلى تحليل الغابة العشوائية. تُظهر اللوحة اليمنى تحليل LEfSe لـ 36 تصنيفًا بكتيريًا. ب تركيزات المصل من المستقلبات في استقلاب التريبتوفان بين ثلاث مجموعات من الفئران ( ). ج مخطط البركان يظهر التعبير الجيني التفاضلي في القولون للفئران المعالجة بـ DSS مع أو بدون مكملات L. reuteri. كل نقطة حمراء تشير إلى جين تم تنظيمه بشكل كبير، بينما تمثل النقطة الزرقاء جينًا تم تنظيمه بشكل كبير لأسفل، مع كل نقطة رمادية تظهر جينًا بلا فرق كبير. د المقارنات الزوجية لمستقلبات التريبتوفان، مع تدرج لوني يدل على معامل ارتباط سبيرمان. الارتباط بين ملفات التعبير البكتيرية/ الجينية وكل مستقلب باستخدام اختبارات مانتل الجزئية. عرض الحافة يتناسب مع إحصائية R لمانتل للارتباطات المسافة المقابلة، ولون الحافة يدل على الأهمية الإحصائية. هـ اختبار PCR في الوقت الحقيقي يظهر تعبير Pxr وجيناته المستهدفة ،
  3. و
    (انظر الشكل في الصفحة التالية.) الشكل 4 مشتقات الإندول تخفف الالتهاب المعوي في الفئران. تم تغذية الفئران بعمر ستة أسابيع يوميًا عن طريق الفم مع أو بدون ILA ( )، IPA ( )، أو IAA ( ) لمدة 4 أسابيع ( ). تم أيضًا تغذية الفئران البرية المتجانسة (WT) يوميًا لمدة 4 أسابيع كضوابط سلبية. أ مستويات التعبير الجيني للـ mRNA في القولون للسيتوكينات المسببة للالتهابات (IL-6 و IL-1 ) ( ) بواسطة RT-qPCR. ب مستويات TNF-a و LPS في القولون ( ) باستخدام ELISA. ج مخطط PCoA لمسافة Bray-Curtis للميكروبيوم القولوني بين مجموعات مختلفة من الفئران. د خريطة حرارية تظهر الوفرة النسبية لأجناس بكتيرية مختلفة. هـ تحليل شبكة التواجد المشترك لأجناس بكتيرية بين مجموعات مختلفة من الفئران. الحواف التي تمثل ارتباطات SparCC الهامة تشير إلى و . كل خط أزرق فاتح يمثل ارتباطًا سلبيًا كبيرًا، بينما يمثل كل خط أحمر فاتح ارتباطًا إيجابيًا كبيرًا. حجم النقاط يمثل درجة العقدة. سمك الخط يتناسب مع درجة الارتباط. ; ns، غير مهم

Journal: Microbiome, Volume: 12, Issue: 1
DOI: https://doi.org/10.1186/s40168-024-01750-y
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38504383
Publication Date: 2024-03-19

Microbiota-derived indoles alleviate intestinal inflammation and modulate microbiome by microbial cross-feeding

Gang Wang , Yuxin Fan , Guolong Zhang , Shuang Cai , Yonghang Ma , Lijie Yang , Yuming Wang , Haitao Yu , Shiyan Qiao and Xiangfang Zeng

Abstract

Background The host-microbiota interaction plays a crucial role in maintaining homeostasis and disease susceptibility, and microbial tryptophan metabolites are potent modulators of host physiology. However, whether and how these metabolites mediate host-microbiota interactions, particularly in terms of inter-microbial communication, remains unclear. Results Here, we have demonstrated that indole-3-lactic acid (ILA) is a key molecule produced by Lactobacillus in protecting against intestinal inflammation and correcting microbial dysbiosis. Specifically, Lactobacillus metabolizes tryptophan into ILA, thereby augmenting the expression of key bacterial enzymes implicated in tryptophan metabolism, leading to the synthesis of other indole derivatives including indole-3-propionic acid (IPA) and indole-3-acetic acid (IAA). Notably, ILA, IPA, and IAA possess the ability to mitigate intestinal inflammation and modulate the gut microbiota in both DSS-induced and IL-10-/- spontaneous colitis models. ILA increases the abundance of tryptophanmetabolizing bacteria (e.g., Clostridium), as well as the mRNA expression of acyl-CoA dehydrogenase and indolelactate dehydrogenase in vivo and in vitro, resulting in an augmented production of IPA and IAA. Furthermore, a mutant strain of Lactobacillus fails to protect against inflammation and producing other derivatives. ILA-mediated microbial cross-feeding was microbiota-dependent and specifically enhanced indole derivatives production under conditions of dysbiosis induced by Citrobacter rodentium or DSS, but not of microbiota disruption with antibiotics. Conclusion Taken together, we highlight mechanisms by which microbiome-host crosstalk cooperatively control intestinal homoeostasis through microbiota-derived indoles mediating the inter-microbial communication. These findings may contribute to the development of microbiota-derived metabolites or targeted “postbiotic” as potential interventions for the treatment or prevention of dysbiosis-driven diseases.

Keywords Microbial tryptophan metabolites, Indole derivatives, Intestinal inflammation, Lactobacillus

Background

Intestinal dysbiosis characterized by microbiota imbalance is associated with inflammation, oxidative stress and a variety of diseases including metabolic disorders and inflammatory bowel disease (IBD). Metabolites secreted or modified by the microbiota or host mediate host-microbiota interactions. They constitute a complicated network and co-together maintain the functions of the host, the microbiota and their interdependence. Fecal microbiota transplantation (FMT) has emerged a promising therapy for dysbiosis-driven diseases [1], and strategies to restore gut microbiota homeostasis may have potential to alleviate these conditions. It has also been reported that transferring the microbiota of inflamed individuals to wild-type, germ-free receptors increases their susceptibility to colitis [2]. Although metabolites are involved in regulating the host immune system as signaling molecules and affect the efficacy of cancer chemotherapy and host metabolism through activating relevant signaling pathways [3-5], the mechanisms by which these small molecules regulate the intestinal microbiome remain poorly understood.
Tryptophan is an essential amino acid for protein synthesis and a precursor to various metabolites that are crucial for host metabolism and physiology [6]. Tryptophan can be metabolized by the host via the kynurenine or serotonin ( ) pathways or by the gut microbiota via the indole pathway [5]. There is growing evidence that indole derivatives metabolized by various microbiota such as indole-3-lactate (ILA), indole-3-propionic acid (IPA), and indole-3-acetate (IAA), have a profound impact on host immunity and intestinal function [ 2,5 ]. These microbiota-derived tryptophan metabolites have been shown to strengthen the intestinal barrier, protect against pathogens, and influence host metabolism by binding to the aryl hydrocarbon receptor (AhR) or pregnane X receptor (PXR) [2, 7-10]. Some probiotics regulate intestinal homeostasis through indole deriva-tive-induced AhR activation. For example, Lactobacillus reuteri promotes the differentiation and expansion of oral tolerogenic intraepithelial T lymphocytes through the production of ILA [11], which is capable of inhibiting the polarization of Th17 cells in vitro [12]. Additionally, Bifidobacterium in breastmilk secretes ILA and helps regulate immune system maturation in early life [13].
The recovery of dysbiotic microbiota or amelioration of associated disease is usually accompanied by an increase of several special metabolites, such as short-chain acids (SCFAs) and indole derivatives [14, 15], yet whether it is the direct effect of these increased metabolites produced in vivo still unknown. Whether and how these metabolites exert inter-bacterial signaling activities to regulate
the microbiome likewise needs to be elucidated. In the present study, we chose Lactobacillus reuteri, a probiotic with the ability to modulate intestinal immunity and gut microbiota, to investigate the role and mechanisms of indoles in mediating host-microbiota interactions and inter-microbial communication. We found that ILA is a key molecule of Lactobacillus in the alleviation of inflammation and modulation of the gut microbiota. ILA increased the expression of relevant enzymes involved tryptophan metabolism via bacterial cross-feeding and promoted the synthesis of microbial tryptophan metabolites including IPA and IAA in vivo and in vitro. The regulation of the intestinal microbiota by ILA was micro-biota-dependent and specifically increasing indoles levels under conditions of dybiosis induced by Citrobacter rodentium or DSS, but not of microbiota disruption with antibiotics. The anti-inflammatory and intestinal bar-rier-strengthening effects of IPA were directly regulated by PXR activation, while those of IAA were microbi-ota-dependent. Together, these results collectively suggested ILA-mediated the inter-microbial communication modulates the microbiome-host crosstalk and controls intestinal homeostasis in conjunction with other micro-biota-derived indoles.

Methods

Animal studies and ethical statement

C57BL/6 mice (6-8 weeks old) were obtained from Beijing HFK Bioscience, while mice (6-8 weeks old) were purchased from Guangzhou Cyagen Biosciences. All mice were housed under a 12-h light/dark cycle and fed a standard chow diet and water ad libitum.

Bacterial strains and preparation

L. reuteri I5007 was isolated from the colonic mucosa of healthy weaning piglets and further confirmed through whole-genome sequencing (NCBI ID: 1340495); this strain was found to be chloramphenicol, kanamycin, and streptomycin-resistant. L. reuteri I5007, mutant L. reuteri I5007, L. johnsonii, L. plantarum, L. delbrueckii, and L. rhamnosus GG were cultured in MRS medium (Solarbio Science and Technology Co., Beijing, China) at for 20 h under anaerobic conditions. Bacterial cells were collected by centrifugation at for 15 min . Heatkilled . reuteri I 5007 was prepared by heating at for 20 min . No colonies were detected after 48 h of culture at after heat treatment. Clostridium sporogenes (ATCC 15579; American Type Culture Collection) was cultured in fluid thioglycolate medium in an anaerobic atmosphere at for 24 h. C. rodentium (ATCC 51459; American Type Culture Collection) was inoculated into LB broth and cultured in a shaker overnight at . Overnight culture was then centrifuged at 12,000
rpm for 15 min , washed once, and resuspended at CFU/mL in PBS. L. reuteri 5007 was cultured anaerobically with or without tryptophan at , or 1 mM at for 20 h prior to measurement of indole derivatives in the supernatant.

Homologous recombination

ArAT-deficient strain of L. reuteri I5007 was constructed by homologous recombination as described previously [16]. Briefly, 871-bp and 850-bp DNA fragments were separately cloned from the upstream and downstream sequences of the ArAT gene of L. reuteri I5007 and then fused with an erythromycin resistance gene fragment amplified from the pMG36e plasmid. Recombinant DNA was cloned into the pLCNICK-2179 plasmid using TA cloning. The resulting plasmid was inserted into competent . reuteri I 5007 through electroporation, followed by plating onto the MRS medium agar plates containing erythromycin. An ArAT-knockout strain was obtained and confirmed for the absence of the ArAT gene by PCR of bacterial genomic DNA.

Colonic microbiota transplantation

Fresh donor colonic contents were pooled and homogenized 5 times and diluted with sterile saline containing glycerol. The pooled samples were centrifuged at for 3 min at , and the supernatant was collected and stored at . Prior to colonic microbiota transplantation (CMT), glycerol in each sample was replaced with PBS by centrifugation and the number of live microbial cells was counted using methylene blue staining [16].

DSS-induced colitis

C57BL/6 mice were given DSS ( , MP Biomedicals) in drinking water for 7 days. Water was changed every 2 days. The animals were weighed daily for the entire duration. The DAI was evaluated to assess the severity of colitis as previously described [17].

Antibiotic treatment

Mice were given an antibiotic cocktail of ciprofloxa , vancomycin ( ), and metronidazole ( ) [18] in drinking water for 2 weeks prior to other treatments. Water was replenished every week.

Intestinal permeability assessment

Fluorescein isothiocyanate (FITC, 4 kDa , Sigma)-dextran was dissolved in PBS at . After 6 h of fasting, mice were orally administered with FITCdextran. Blood was collected after 4 h and serum was prepared. The fluorescence of each serum sample was
measured at an excitation wavelength of 490 nm and an emission wavelength of 530 nm .

Histological analysis and goblet cell evaluation

The colon tissue was rolled, fixed with paraformaldehyde for 24 h , embedded in paraffin wax, sliced ( 5 ), and stained with hematoxylin and eosin (H&E) or alcian blue. The pathological analysis of H&E-stained sections was scored blindly by two independent investigators. The scoring system was as follows: ulcer size ( none, less than more than 3 mm ), severity of inflammation ( none, mild, moderate, and severe), fibrotic degree ( none, mild, moderate, and severe), extent of epithelial/crypt damage ( none, basal basal crypt loss, crypt and surface epithelial destruction), and injury depth ( none, mucous layer, submucosa, muscle layer, serous layer).

Anaerobic culture of the microbiota

Cell-free supernatant (CFS) of L. reuteri was obtained by centrifugation of the bacterial culture at for 15 min , followed by filtration through a filter and dilution to with the corresponding culture. For in vitro anaerobic culture of colonic microbiota, approximately 100 mg of the colonic content was vortexed in 5 ml BHI medium under anaerobic conditions. MRS medium ( ), CFS ( ), or ILA ( 1 mM ) was then added to the bacterial culture and anaerobically incubated for 12 h at in a GasPak EZ Anaerobe Pouch system. C. sporogenes was co-cultured with or without an addition of tryptophan ( ), the strain and CFS of . reuteri I5007 or ArAT-deficient mutant L. reuteri I5007 ( ), ILA for 24 h at in an anaerobic atmosphere.

Isolation of lymphocytes and flow cytometry

The mesenteric lymph nodes (MLNs) were collected and prepared as single-cell suspensions. The MLNs were then passed through a filter and resuspended in FACS buffer for flow cytometric analyses. Common lymphoid progenitor (CLP) cells were isolated as previously described [19]. Briefly, the colon was opened up longitudinally and washed to remove the contents by scraping gently with PBS. The tissue were then diced into small pieces and incubated in prewarmed sterile HBSS (without and ) containing fetal bovine serum (FBS), 10 mM EDTA, and 5 mM dithiothreitol (DTT) for 30 min at in a shaking water bath. The cells, including immune cells and enterocytes, were recovered by filtration through a filter. Cells were then dissociated from each other in prewarmed HBSS (with and ) containing L-glutamine, penicil-lin-streptomycin, 10 mM HEPES, collagenase
D, Dispase, and DNase I for 45 at while shaking. Cell suspensions were filtered through a cell strainer into precooled sterile PBS, followed by centrifugation in a Percoll gradient for 20 min at at . CLPs were obtained by collecting the cells at the interface and washing twice in FACS buffer for flow cytometric analysis.
For detection of Th1, Th2, Th17F, and Th17A cells, lymphocytes were stimulated for 4 h with PMA (Sigma) and ionomycin (Sigma) in the presence of GolgiStop (BD Biosciences). Cells were first stained for surface CD4 and then fixed and permeabilized with a BD Cytofix/Cytoperm Kit, followed by intracellular staining with the following antibodies: PerCP/Cy5.5-IL-4, FITC-IFN- , AF647-IL-17F, and PE/Cy7-IL-17A. To quantify Treg cells, a True-Nuclear Transcription Factor Buffer Set (BioLegend) was used to label cells with anti-CD4-PE, anti-CD25-FITC, and anti-FoxP3-Alexa Fluor. The percentage of each cell type was measured with BD FACS Celesta and FlowJo analysis software (BD Biosciences). Compensation was set using UltraComp eBeads.

Western blot analysis

The colonic tissues were lysed with RIPA extraction buffer (Solarbio, China) containing a 1% protease inhibitor cocktail. Following centrifugation at for 15 min at , the supernatant was collected and the total protein concentration was quantified using a bicinchoninic acid (BCA) protein assay kit (Solarbio, China). Proteins were separated by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and transferred onto polyvinylidene difluoride (PVDF) membranes (Millipore, USA). The membranes were blocked with skim milk for 1.5 h and incubated with primary antibodies against PXR (Abcam, USA), E-cadherin (Cell Signaling Technology, USA), Cyp1a1 (Cell Signaling Technology, USA), and occludin (Cell Signaling Technology, USA) overnight at . The membranes were washed and incubated with HRPlabeled secondary antibodies at room temperature for 2 h , followed by signal detection with an ECL Kit (Solarbio, China).

RNA extraction and quantitative PCR

Total RNA from cells and tissue was extracted using TRIzol reagent (Takara, Japan). The concentration of RNA was determined with NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE, USA). Quantitative PCR was performed as previously described [20] using gene-specific primers and glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) as the reference gene (Additional file 2: Table S2). The relative mRNA expression level of each target gene was determined using the method.

ELISA

Inflammatory cytokines in the serum and colonic tissue samples were measured with enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kits (Cusabio, Baltimore, MD, USA) according to the manufacturer’s instructions.

Determination of tryptophan metabolites

The colonic contents ( 20 mg ) were homogenized in 200 water and mixed with of precooled methanol containing internal standard (1-methyl-tryptophan, 2.0 . Serum and CFS samples ( ) were mixed with methanol containing 1-methyl-tryptophan. The mixture was then vortexed for 5 min and centrifuged at for 10 min at . The supernatant was vac-uum-dried and reconstituted with of methanol and centrifuged at for 15 min at prior to the UHPLC-MS/MS analysis. An Agilent 1290 Infinity II UHPLC coupled to an Agilent 6470A triple quadrupole (QQQ) mass spectrometer was used for tryptophan metabolite analysis. The mobile phase consisted of formic acid in water (A) and methanol (B). Chromatographic separation was conducted using a gradient elution program for the detection of tryptophan metabolites as follows: ; , . The gradient elution program for the detection of AAAs was as follows: , and . The column temperature was , and the flow rate was . For analysis, the eluate from the column was ionized by an electrospray ionization source in positive mode (ESI + ) under the following settings: gas temperature: , gas flow: , nebulizer: 45 psi , ShenthGasHeater: , SheathGasFlow: , and capillary voltage: 4000 V . Dynamic multiple reaction monitoring (dMRM) was used for quantitative analysis. Data were acquired and processed in Agilent MassHunter software (version B.04.00).

DNA extraction, 16S rRNA gene sequencing, and data analysis

Total microbial DNA was extracted from the colonic contents using the QIAamp DNA Stool Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany) according to the manufacturer’s instructions. Extracted DNA was quantified using a NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE, USA). The V3-V4 hypervariable region of the 16S rRNA gene was amplified using universal primers 338 F ( -GTGCCAGCMGCCGCGG-3′) and 806R ( -CCGTCA ATTCMTTTRAGTTT-3′). Agarose gel electrophoresis was performed to confirm the size of PCR products. Amplicons were quantified, pooled, and sequenced on
the Illumina MiSeq system (Illumina, San Diego, CA, USA) for paired-end reads. Sequence analysis was performed using the UNOISE pipeline through USEARCH v10.0 [21] and VSEARCH v2.15 [22]. Briefly, paired-end sequences were merged, quality filtered, and decomplexed using VSEARCH. Denoising and chimera removal were conducted using UNOISE3 to correct for sequencing errors. Assembled sequences were mapped back to the denoised chimera-free sequences as OTUs with identity. The taxonomy of the features was classified using the USEARCH SINTAX algorithm in RDP training version 16 [23]. The sequencing reads of all samples were rarefied to the sample with the lowest reads to compensate for the difference in the sequencing depth. The -diversity was determined from the rarefied OTU table based on the richness, Simpson, and Shannon indices. The -diversity was estimated from the Bray-Curtis distances, which were applied to build distance matrices and reported according to the PCoA. PICRUSt2 was used to predict altered KEGG pathways based on 16S sequencing data [24]. For differential abundance analysis and association analysis, all bacterial taxa with a relative abundance of < 0.01% and present in < 20% of samples were removed.

Metatranscriptomic analysis

Total microbial RNA was extracted from the colonic contents using the E.Z.N.A. Soil RNA Midi Kit (Omega Bio-Tek, USA) following the manufacturer’s instructions. The RNA concentration and purity were quantified using a NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific, USA). Only samples with an RNA integrity number (RIN) were used to generate libraries. Total RNA was subjected to ribosomal RNA removal using the Ribo-Zero rRNA Removal Kit (Illumina, San Diego, USA). TruSeq RNA Sample Prep Kit (Illumina) was used to construct cDNA libraries. Paired-end sequencing was performed with the barcoded libraries on the Illumina HiSeq 2500 platform at Majorbio Bio-Pharm Technology (Shanghai, China) using the HiSeq 4000 PE Cluster Kit and HiSeq 4000 SBS Kits according to the manufacturer’s instructions.
Raw sequencing reads first went through quality control using Trimmomatic [25], and clean reads were then aligned to the mouse genome and the Silva database with Bowtie2 [26] to exclude host and ribosomal RNA contamination. Quality-filtered metatranscriptomic reads were de novo assembled for each sample with Trinity (v2.2.0) [27]. All contigs were clustered using CD-HIT (v 4.5.8) [28] to obtain unigenes. The abundance of unigenes in each sample was estimated by calculating the transcripts per million (TPM) value based on the number of aligned reads using Salmon (v 0.9.1) [29]. Protein coding sequences were predicted from contigs using MetaGeneMark [30]. For functional annotation, protein sequences
were annotated against those of evolutionarily conserved genes in the nonsupervised orthologous groups (eggNOG) using DIAMOND (v.0.8.23) [31] under default settings. Differential enrichment of genes and functions were determined by DESeq2 [32]. Taxonomic classifications were aligned against the NCBI taxonomy database using DIAMOND (v.0.8.23) [31] with default parameters. Then, the blastx results were analyzed using the longReads LCA algorithm of MEGAN [33].

RNA sequencing and data analysis

Total RNA from the colonic tissue was extracted and purified using TRIzol reagent (Invitrogen). Only those samples with RIN>7 were used for RNA-seq. TruSeq RNA Sample Prep kit (Illumina, USA) was used to construct cDNA libraries. The barcoded libraries were sequenced on the Illumina HiSeq 2500 platform at Majorbio Bio-Pharm Technology (Shanghai, China). Paired-end raw sequencing reads were first quality-controlled by FastQC and mapped to the mouse genome using hisat2 (v 2.1.0) [34]. The low-expression transcripts with an average count were removed. Analysis of differential gene expression was performed using the DESeq2 package [32]. Differentially expressed genes (DEGs) were defined as genes with a minimum twofold change and a false discovery rate<0.05. KEGG pathway functional enrichment analysis of DEGs and gene set enrichment analysis (GSEA) of gene ranks were performed using clusterProfiler [35].

Weighted correlation network analysis

To identify modules of coabundant host genes and bacterial taxa in RNA-seq and 16 S rDNA sequencing data, we applied the R package WGCNA [36]. The correlation matrix quantified the interconnectedness between genes or taxa and then assigned them to coabundance modules. The genes or taxa that did not show high enough coexpression metrics with any module were removed. The signed network was derived based on a biweight midcorrelation (bicor) method. A scale-free topology criterion was used to choose soft thresholds of 12 and 5 for gene and taxon correlations, respectively. To identify the modules of genes or taxa that were most relevant in the context of colonic inflammation, correlations between serum tryptophan metabolites and each module were tested with Spearman rank.

Analysis of the human IBD metatranscriptomic datasets

Publicly available IBD metatranscriptomic datasets were used to determine the differences in microbial genes in tryptophan metabolic pathways. The datasets were obtained from the Sequence Read Archive (BioProject: PRJNA389280), which consists of the human HMP2
metatranscriptomic sequencing reads in the Inflammatory Bowel Disease Multiomics Database [37]. The reads used in the present study were from 46 patients with Crohn’s disease (CD), 21 patients with ulcerative colitis (UC), and 11 healthy controls. The data was processed and analyzed similarly to the mouse metatranscriptomic data as described above. For the IBD cohort, linear mixed effect models were further applied to determine the abundance of diagnosed microbial DEGs as follows: gene (intercept) + diagnosis + antibiotics + chemotherapy + immunosuppressant. Diagnosis was coded as a categorical variable (CD, UC, non-IBD) with non-IBD as the reference state. The three medical treatments were coded as binary covariates with nonuse as the reference state. Gene abundance values were log-transformed and zero-smoothed prior to linear modeling. All values of multiple comparisons in the analysis above were adjusted to FDR. The threshold of significance was set at ( , ** , *** , **** ); ns, not significant; was considered a trend.

Statistics analysis

QIIME v.2.0, GraphPad Prism (v 6.0), and the R program (v 3.6.1) were used for statistical analysis. The difference in bacterial abundance was evaluated using one-way ANOVA and Tukey’s post hoc test for data with a normal distribution or the Kruskal-Wallis test for data with a nonnormal or nonparametric distribution. was considered statistically significant. When applicable, values were corrected for multiple testing with the Ben-jamini-Hochberg false discovery rate (FDR) with a cutoff value of 0.1 .

Results

L. reuteri 15007 protects mice from colitis through modulating the intestinal microbiota

We previously showed . reuteri 5007 to be capable of ameliorating colitis and correcting microbiota in mice and sows . To investigate whether the intestinal microbiota is involved in L. reuteri-mediated alleviation of colitis, a colitis-recovery-colitis-colonic microbiota transplantation (CMT) model was employed (Additional file 1: Fig. S1A). Briefly, mice were orally administered with or without L. reuteri I5007 for 3 weeks, followed by induction of colitis with DSS for another week. Mice were then allowed to fully recover from colitis for 12 days before a second round of 7-day DSS treatment and reciprocal transplantation of the colonic microbiota of DSStreated mice administered with and without . reuteri I5007. As expected, L. reuteri I5007 significantly alleviated the disease activity index (DAI) and colonic pathology in the first round of DSS treatment, while recovery for 12 days completely restored intestinal health in both
groups of DSS-treated mice (Additional file 1: Fig. S1BD). Interestingly, the colonic microbiota of DSS-treated mice was largely restored to normal, while that of . reuteri 15007-supplemented mice remained significantly divergent ( ) on day 40 even after 12 days of recovery (Additional file 1: Fig. S1E). The -diversity indices of the colonic microbiota as indicated by richness and Shannon Index remained drastically reduced in DSS-treated mice administered with . reuteri on day 40 (Additional file 1: Fig. S1F).
Transplantation of day-28 colonic microbiota from . reuteri-administered mice significantly increased the survival and reversed the weight loss of DSS-treated mice ( ) (Additional file 1: Fig. S2A and B). Similarly, DSS-treated mice receiving L. reuteri-supplemented microbiota showed decreased pathology scores and increased colon length (Additional file 1: Fig. S2C-E). Moreover, the colonic microbiota from L. reuteri-supplemented mice significantly decreased Th17A cells and increased regulatory T cells in the colonic lamina propria and mesenteric lymph nodes ( ) (Additional file 1: Fig. S2F-I). Collectively, the results suggested that the intestinal microbiota is likely to be involved in L. reuterimediated protection against intestinal inflammation.

Protective effect of L. reuteri is associated with the production of indole derivatives

Linear discriminant analysis effect size (LEfSe) analysis was further performed to identify the major colonic bacteria enriched in DSS-treated mice with or without L. reuteri 15007 administration. The results showed that 30 bacterial taxa were significantly enriched by . reuteri 15007 (LDA ) (Fig. 1A). Interestingly, those enriched bacterial taxa were mostly Clostridium (Clostridium XlVa, Clostridium XlVb, and Clostridium ), which are known to be capable of metabolizing tryptophan [39]. Consistently, DSS significantly impaired microbial metabolism of tryptophan as evidenced by reduced levels of indole derivatives such as indole-3-carbaldehyde (ICA), IPA, and IAA in the serum ( ). Conversely, the host metabolism of tryptophan appeared to be enhanced, showing a significant increase in the activity of indoleamine 2,3-dioxygenases (IDO) ( ) (Fig. 1B), key enzymes involved in the kynurenine pathway [40]. On the other hand, administration of L. reuteri largely restored the serum concentrations of ICA, IAA, and IPA as well as the IDO activity in DSStreated mice to healthy levels (Fig. 1B). Interestingly, . reuteri also restored the serum levels of 5-HT and tryptophan, but with no impact on kynurenine or ILA (Additional file 1: Fig. S3A).
RNA sequencing of the colonic tissue further identified 4680 differentially expressed genes in response to
L. reuteri 15007 in DSS-treated mice (Fig. 1C). KEGG pathway enrichment and gene set enrichment analysis (GSEA) showed that . reuteri administration downregulated inflammation-related pathways such as TNF and NF-кB signaling (Additional file 1: Fig. S3B and C). The correlation analysis of distance dissimilarities further revealed IPA to be in the strongest correlation with both the microbiota and host gene expression, while IAA was significantly correlated only with the microbiota composition (Fig. 1D).
As expected, the expression of (also known as Nr1i2), a receptor for IPA [41], and PXR target genes Ugt1a1 and Cyp3a11 increased markedly in the colon of DSS-treated mice in response to L. reuteri (Fig. 1E). IAA is an AhR ligand that promotes IL-22 production [2,42]. However, RNA-seq analysis and RT-PCR assays failed to reveal conspicuous differences in the colonic expression of Ahr and Cyp1a1 with and without L. reuteri (Fig. 1C, Additional file 1: Fig. S3D, Additional file 2: Table S1). The serum level of IL-22 was unaffected by . reuteri as well (Additional file 1: Fig. S3D). Weighted gene coexpression network analysis showed that there were common host genes and bacterial taxa modules that were significantly correlated with IPA and IAA (Additional file 1: Fig. S3E and F).

Both IPA and IAA ameliorate DSS-induced colitis

To directly evaluate the protective effect of major microbial tryptophan metabolites on intestinal inflammation and mucosal barrier function, 20 and IAA or IPA were separately administered to mice with or without DSS treatment for 7 days (Additional file 1: Fig. S4A). Both IPA and IAA significantly reversed DSS-induced weight loss, increased colon length, reduced colonic pathology, increased goblet cells, and decreased and gene expression in the colon, while augmenting the protein expression of E-cadherin and occludin (Additional file 1: Fig. S4B-G), suggesting that both IAA and IPA are capable of alleviating intestinal inflammation and enhancing mucosal barrier function. Similar to .
reuteri, IAA failed to enhance the expression of and Cyp1a1, while IPA significantly increased the expression of (Additional file 1: Fig. S4H).
Colonic microbiome analysis further revealed that IAA significantly altered both – and -diversities of the colonic microbiota of DSS-treated mice, while IPA only had a marginal effect (Additional file 1: Fig. S5A and B), suggesting that the microbiota is differentially regulated by IPA and IAA. To further assess whether IPA- and IAA-mediated protection of DSS-treated mice is dependent upon the intestinal microbiota, mice were treated with antibiotics for 2 weeks to deplete the intestinal microbiota, followed by oral administration of IPA, IAA, or a mixture of IPA and IAA with or without DSS treatment (Fig. 2A). Clearly, IPA or the IPA/IAA mixture was capable of protecting antibiotic-treated mice from DSSinduced colitis, while the protective effect of IAA, as indicated by weight loss, the colon length, intestine barrier, and inflammation was abrogated (Fig. 2B-G), suggestive of a differential involvement of the intestinal microbiota in the protection of mice from intestinal inflammation by IPA and IAA.

L. reuteri alters the microbial tryptophan metabolism through synthesis of ILA

Although L. reuteri significantly increased the serum concentrations of IPA and IAA in DSS-treated mice (Fig. 1B), ILA, but not ICA, IPA, or IAA, was found to be synthesized by . reuteri and several other Lactobacillus species (Additional file 1: Fig. S6A), consistent with earlier observations with Lactobacillus and Bifidobacterium [13]. Tryptophan supplementation of the . reuteri culture also significantly increased ILA synthesis (Additional file 1: Fig. S6B). Microbial tryptophan metabolism involves multiple enzymatic reactions, and ILA is a critical intermediate (Fig. 3A). Metatranscriptomic analysis of the colonic microbiota from DSS-treated mice supplemented with or without L. reuteri 15007 revealed that, while DSS suppressed the expression of most bacterial genes involved in tryptophan metabolism, L. reuteri significantly increased the mRNA
Fig. 1 (See legend on previous page.)
Fig. 2 IPA and IAA ameliorate DSS-induced colitis. A Experimental scheme of the mouse trial ( ). Six-week-old C57BL/6 mice were administered with a cocktail of antibiotics for 2 weeks, followed by oral administration of IPA and/or IAA daily with or without DSS in drinking water for another 7 days. The severity of colitis was assessed by determining the changes in body weight ( ) and colon length ( ). D Serum FITC-dextran levels among different groups of mice ( ). E Goblet cell changes in the colon of mice. The left panel shows the goblet cells per crypt of the colon, and the right panel shows representative images of alcian blue staining for goblet cells within the inner mucus layer of colonic sections. F Levels of IL-6 and IL-1 in the colonic tissue using ELISA ( ). G The levels of occludin and E-cadherin proteins determined by Western blotting ; ns, not significant
expression of acyl-CoA dehydrogenase (ACD), indolelactate dehydrogenase (ILD), and indoleacetamide hydrolase (IAAH), with reduced expression of indolepyruvate decarboxylase (ID) (Fig. 3B, C), suggesting that . reuteri prefers the synthesis of ILA, IPA, and IAA. Additionally, the relative abundance of Clostridium, which encodes both ACD and IAAH, was increased upon . reuteri administration (Fig. 3D, E).

ILA ameliorates DSS-induced colitis and alters the intestinal microbiota composition

To directly assess the efficacy of ILA in alleviating intestinal inflammation, DSS-treated mice were orally
administered daily with or without ILA for a week. ILA significantly reversed DSS-induced weight loss (Additional file 1: Fig. S7A) and colon length shortening (Additional file 1: Fig. S7B). Consistently, ILA significantly suppressed DSS-induced production of TNF- and in the serum (Additional file 1: Fig. S7C). Colonic histological scores were also significantly reduced in ILA-treated mice (Additional file 1: Fig. S7D), as indicated by lessened ulceration, edema, crypt damage, and immune cell infiltration of the intestinal epithelial layer (Additional file 1: Fig. S7E). ILA also partially restored DSS-induced reduction of richness and Shannon index (Additional file 1: Fig. S7F) of the colonic microbiota.
Fig. 3 L. reuteri alters the expression of major enzymes involved in microbial metabolism of tryptophan. Six-week-old C57BL/6 mice were orally gavaged with of PBS with or without L. reuteri I5007 ( CFU/mL) daily for 3 weeks, followed by a week of DSS administration in drinking water to induce colitis (See Figure S1A for experimental scheme). Metatranscriptomics was performed with the colonic microbiota collected on day 28. A Major metabolic pathways and enzymes involved in microbial tryptophan metabolism. B PCoA plot of the Bray-Curtis distance showing the differences in the colonic microbiota function. C The differences in mRNA expression levels of major enzymes involved in microbial tryptophan metabolism among three groups of mice. Statistics was performed using DESeq2. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, **** ; ns, not significant
Notably, ILA further caused a clear segregation of the colonic microbiota in DSS-treated mice (Additional file 1: Fig. S7G). At the genus level, ILA restored relative abundance of Clostridium_XIVa (from 6.3 to ) and Lactobacillus (from 0.45 to ) in DSS-treated mice (Additional file 1: Fig. S7H).
To further examine whether the protective effect of ILA is dependent upon the intestinal microbiota, mice were treated with antibiotics for 2 weeks to deplete the intestinal microbiota, followed by DSS treatment with or without ILA supplementation (Additional file 1: Fig. S8A). The results showed that the protective effects of ILA on weight loss and colon shortening were significantly diminished in the microbiota-depleted mice, relative to the conventional mice (Additional file 1: Fig. S8B-E). ILA is known to exert its protective effect by activating AhR [11, 13]. To examine whether pharmacologic inhibition of AhR abrogates ILA-mediated amelioration of intestinal inflammation, mice were administrated with CH223191, an AhR inhibitor, together with ILA during
DSS treatment (Additional file 1: Fig. S8F). To our surprise, ILA conferred significant protection even in the presence of CH223191, as indicated by weight loss, the colon length, and histopathology (Additional file 1: Fig. S8G-J). Therefore, we conclude that the microbiota modulation may be another pathway to AhR activation for IAA to exert the protective effect on intestinal inflammation.
ILA, IPA, and IAA alleviate intestinal inflammation in mice.
IL- mice are known to spontaneously develop colitis [43]. To confirm whether ILA, IPA, and IAA are capable of protecting mice from intestinal inflammation in a different colitis model, ILA, IPA, or IAA was orally administered to IL- mice for 4 weeks. Both ILA and IPA significantly suppressed the colonic expression of and mRNA, while IAA has a lesser effect (Fig. 4A). ILA and IPA were also capable of restoring TNF- and LPS to healthy levels in the colon, with a marginal effect observed with IAA
(Fig. 4B). Overall, these results suggested that ILA and IPA are more efficient than IAA in protecting mice from intestinal inflammation in both DSS and IL- murine models of colitis. Additionally, ILA and IPA altered the colonic microbiota of mice more drastically than IAA (Fig. 4C). Importantly, ILA supplementation markedly elevated relative abundance of Lactobacillus (from 6.45 to ), while IPA enriched Bifidobacterium (from 0.01 to ) and Akkermansia (from 0.21 to ) (Fig. 4D). ILA and IPA also increased relative abundance of Blautia (from 0.06 to and , respectively). The co-occurrence networks revealed Blautia and Bifidobacterium to be key bacterial taxa in the microbial networks in response to ILA and IPA (Fig. 4E). Notably, IPA had the most complex network of the microbial features (Fig. 4E). Taken together, these results suggested that the intestinal microbiota is likely involved in ILA- and IPA-mediated alleviation of colitis.

ILA increases IPA and IAA production through microbial cross-feeding both in vivo and in vitro

Because only ILA was the only tryptophan metabolite synthesized by L. reuteri (Additional file 1: Fig. S6), enhanced synthesis of IPA and IAA in L. reuteri- supplemented DSS mice was likely a result of utilization of ILA as a substrate by other intestinal bacteria. To directly confirm whether ILA increases IPA and IAA production through microbial cross-feeding, we incubated ILA with the colonic microbiota of DSS-treated mice and found ILA significantly increased IPA and IAA levels (Fig. 5A). The microbiome analysis indicated that ILA markedly altered the composition of the microbiota (Fig. 5B). Functional metagenomic prediction by PICRUSt2 showed that the expression of ACD, ID, and ArAT increased in response to ILA (Fig. 5C). The coabundance network revealed that ACD had the highest degree of the interactions showing a strong positive correlation with several differentially enriched bacterial genera (Fig. 5D). Furthermore, oral administration of ILA to DSS-treated mice also significantly increased the ACD and IAAH expression in the colonic microbiota as predicted by PICRUSt2 (Fig. 5E, F). To
further verify that ILA promotes the production of other indole derivatives, we co-cultured tryptophan, . reuteri I5007, CFS and ILA with C. sporogenes, which is a specific IPA-producing bacterium. As expected, ILA and CFS of . reuteri markedly increased the production of IPA, but not IAA (Fig. 5G). Collectively, these data suggested that ILA may be utilized by bacteria as a substrate to produce IPA and IAA.
To further examine whether ILA promotes IPA and IAA production through microbial cross-feeding in vivo, we treated mice with antibiotics to deplete the intestinal microbiota, followed by supplementation of heat-killed or an -deficient . reuteri mutant strain ( ) with or without oral administration of ILA (Fig. 6A). Both heat-killed and L. reuteri failed to protect mice against DSS-induced colitis (Fig. 6B, C). Notably, the heat-killed and L. reuteri cannot promote the production of IPA and IAA, while administration of ILA to mice receiving heat-killed or mutant strain led to increased syntheses of both metabolites in the colonic content (Fig. 6D, E). These results confirmed that ILA is the major tryptophan metabolite produced by L. reuteri to be responsible for microbial synthesis of IPA and IAA in the GI tract.
To further verify whether ILA enhances IPA and IAA production dependent upon the intestinal microbiota, we either disrupted the microbiota with antibiotics or induced dybiosis with Citrobacter rodentium or DSS with or without oral administration of ILA (Fig. 6F). The microbiome analysis showed that ILA had no impact on microbial – and -diversity of healthy, C. rodentium-challenged, or antibiotic-treated mice (Fig. 6G, H). Notably, ILA remained largely effective in both dysbiotic mouse models. ILA significantly enhanced IPA and IAA in DSS-treated mice ( ), with a strong tendency ( ) to increase IPA and IAA in C. rodentium-challenged mice; however, ILA failed to promote the synthesis of either IPA or IAA in the antibiotic-treated mice (Fig. 6G, H), suggesting clearly that the intestinal microbiota is required for ILA-induced IPA and IAA synthesis. Collectively, these results indicated that ILA enhances IPA and IAA production through microbial cross-feeding.
Fig. 4 (See legend on previous page.)
Fig. 5 ILA promotes the microbial production of IPA and IAA in vitro. The colonic microbiota was cultured under anaerobic conditions with or without an addition of de Man Rogosa Sharpe (MRS) medium, cell-free supernatant (CFS) of L. reuteri I5007, or ILA for 12 h at . A The concentrations of IPA and IAA in the anaerobic culture supernatant of the colonic microbiota . B PCoA plot of the Bray-Curtis distance among different treatment groups ( ). C Relative abundance of three major enzymes involved in microbial tryptophan metabolism as predicted by PICRUSt2. D Network analysis of differentially enriched bacterial genera and enzymes. Edges representing significant Spearman’s correlations indicate and . The thickness of each line is proportional to the magnitude of the correlation. The pie chart shows the relative abundance (%) of bacterial genera or enzymes among different groups. ArAT, aromatic amino acid aminotransferase; ID, indolepyruvate decarboxylases. Relative abundances of acyl-CoA dehydrogenase (ACD) (E) and indoleacetamide hydrolase (IAAH) (F) predicted by PICRUSt2 among DSS-treated mice administered with or without ILA (see the Figure S7 legend for experimental details). G The C. sporogenes was cultured with or without an addition of Tryptophan, L. reuteri I5007, ArAT-deficient mutant L. reuteri I5007(AL.R), CFS of L. reuteri I5007 or L.R, ILA for 24 h at ; ns, not significant

Alterations in microbial tryptophan metabolism in IBD patients

Similar to our observations in DSS-induced colitis (Fig. 1B), host tryptophan metabolism is enhanced
in IBD patients [44]. However, it is unclear whether microbial metabolism of tryptophan is suppressed in IBD patients as in DSS-treated mice. To examine the expression levels of the major bacterial genes
Fig. 6 ILA promotes the microbial synthesis of IPA and IAA. A Experimental scheme to examine the role of cross-feeding . The intestinal microbiota was depleted by 2 weeks of antibiotic administration in the drinking water, followed by oral gavage of ArAT-deficient mutant ( ) or heat-killed L. reuteri for another 2 weeks with or without oral administration of ILA in the second week. Colitis was induced by adding 3% DSS in drinking water in the fifth week. Colitis severity was assessed by determining the changes in body weight (B) and colon length (C). The concentrations of IAA (D) and IPA (E) were measured in the colon contents. F Experimental scheme to evaluate the role of the intestinal microbiota on ILA-mediated synthesis of IPA and IAA. Mice were administered with or without a cocktail of antibiotics for 2 days, followed by induction of dysbiosis for a week ( or 8). Three different dysbiosis models were employed including 3% DSS in drinking water, antibiotic cocktail in drinking water, and oral daily challenged with C. rodentium. GRichness and Shannon Index of the colonic microbiota among different groups of mice on day 9. H PCoA plot of the Bray-Curtis distance. Comparisons of the concentrations of IAA (I) and IPA (J) in the colon contents among groups are shown . * ; ns, not significant
responsible for tryptophan metabolism in IBD patients, we retrieved the metatranscriptomic profiling datasets from the HMP2 IBDMDB cohort, which includes the stool samples from both ulcerative colitis (UC, ) and Crohn’s disease (CD, ) patients as well as healthy controls [45]. PCoA plot showed that the microbiota profile responsible for tryptophan metabolism are different from healthy controls, with no obvious difference between UC and CD patients (Additional file 1: Fig. S9A). Among the microbial metabolic genes, only ACD showed a significant reduction in individuals with UC (Additional file 1: Fig. S9B). ACD was mainly produced by Faecalibacterium
(21.9%), Roseburia (20.7%), and Prevotella (7.5%) in the stool samples, and their abundances were substantially reduced in IBD patients (Figure S9C and 9E). At the species level, three most abundant bacteria including Roseburia sp. CAG:18_43_25 (13.2%), Faecalibacterium prausnitzii ( ), and Prevotella copri ( ), were markedly reduced in IBD patients (Additional file 1: Fig. S9D and F). Suppression of ACD and ACDproducing bacteria is consistent with an earlier observation on IPA reduction in IBD-induced dysbiosis [46]. Collectively, these results strongly suggested that tryptophan metabolism by the intestinal microbiota is very likely to be reduced in IBD patients.

Discussion

In this study, we characterize a molecular mechanism whereby metabolites contribute to the modulation of a symbiotic intestinal microenvironment. Specifically, microbial tryptophan metabolites ILA play a critical role in mediating inter-microbial communication and cooperatively control intestinal homeostasis with other micro-biota-derived indoles. Our results demonstrate that ILA increased microbial tryptophan metabolism and promotes the synthesis of IPA and IAA in vivo and in vitro. We further identified several bacteria such as Clostridium to metabolize ILA to IPA and IAA by inducing the expression of several core tryptophan-metabolizing enzymes. Furthermore, ILA-mediated microbial crossfeeing is microbiota-dependent and specifically enhanced indoles levels under conditions of dybiosis inducing by Citrobacter rodentium or DSS, but not of microbiota disruption with antibiotics.
Consistent with an earlier study [47], we found that L. reuteri dramatically enriches Clostridium XIVa and Clostridium IV, which are responsible for the proliferation of Foxp Treg cells in the colonic mucosa [48]. Transplantation of the colonic microbiota of . reuteri-administered mice recapitulated the protective effect of . reuteri against colitis in DSS-treated mice. The metabolomics analysis revealed that . reuteri reverses the impaired microbial tryptophan metabolism in colitis mice by enhancing the expression of metabolizing enzymes leading to increased IPA and IAA syntheses. In agreement with a previous report [41], our data indicated that IPA significantly enhances epithelial barrier integrity and decreases inflammation in two different murine models of intestinal inflammation including DSSinduced colitis and IL-10-/- spontaneous colitis. Our results showed that IAA may alleviate colitis by modulating the intestinal microbiota and does not rely exclusively on the activation of AhR in DSS mice. The previous research also reported that the chemotherapy efficacy of IAA is licensed by immune cell-derived myeloperoxidase, but not by AhR signaling [4]. Notably, L. reuteri elevated the transcript levels of PXR and related genes without activating AhR and its target genes. These data suggested that the protective properties of IAA against colitis may be dependent upon the intestinal microbiota, but those of IPA rely on PXR activation.
The underlying molecular mechanism of ILA in maintaining intestinal homeostasis is largely unknown [49]. Our data indicated that ILA reduces the intestinal inflammation and pathologies in DSS-induced colitis. ILA is known to inhibit inflammation by decreasing proinflammatory cytokine levels via activation of AhR [13, 49]. However, we showed that the protective effect of ILA is largely unaffected by an AhR antagonist in DSS-treated
mice. Our microbiota analysis further revealed that ILA markedly altered the intestinal microbiota, with a significant enrichment of Clostridium XIVa, a major tryptophan-metabolizing bacterium [39]. Additionally, antibiotic-treated colitis mice failed to respond positively to ILA administration. Furthermore, ILA alleviated the intestinal inflammation and altered the microbiota composition in IL- mice. These results suggested that ILA protects against colitis and intestinal inflammation by modulating the intestinal microbiota, consistent with an earlier report that . reuteri-mediated differentiation of the intestinal intraepithelial lymphocytes is ILAdependent and relies on the presence of the intestinal microbiota [11].
Bacterial cross-feeding is the utilization of metabolites from one bacterium by another, which is ubiquitous in natural communities and increases the diversity of the intestinal microbiota [50]. We showed in the study for the first time that Lactobacillus with the ability of modulating intestinal immunity and gut microbiota through the synthesis of ILA, which is a “core” intermediate metabolite in the bacterial tryptophan metabolism pathways [51]. First, ILA, but not IAA or IPA, was detected in the supernatant of L. reuteri and other Lactobacillus species. Second, ILA induced IPA and IAA syntheses in both anaerobic culture of the colonic microbiota and the colonic microbiota of DSS-treated mice. Thirdly, ACD and IAAH, two core bacterial enzymes involved in the synthesis of IPA and IAA, and the bacteria known to encode these enzymes (e.g., Roseburia, Faecalibacterium, and Clostridium) [5], were enriched in response to administration of ILA or ILA-producing L. reuteri. Fourthly, a mutant strain of L. reuteri deficient in ArAT, a major bacterial enzyme responsible for the conversion of tryptophan to ILA [11], lost its ability to produce IPA and IAA or protect mice against DSS-induced colitis. These independent lines of evidence collectively suggested that ILA is very likely to be metabolized by bacteria through cross-feeding to produce IPA and IAA.
In accordance with our results, ILA-producing Bifidobacterium has been shown to be positively associated with serum IPA levels especially among lactase nonpersistent individuals [39]. Another study using gnotobiotic mice showed increased concentrations of both IAA and IPA after inoculation with GUT-108, a consortium of 17 live bacterial strains [39], indicating that the production of IAA and IPA could be accomplished cooperatively by intestinal bacteria. A strong positive association between fiber intake and circulating IPA levels was also reported, although IPA is not derived from fiber fermentation [39, 52]. It is plausible that high fiber intake enriches certain tryptophan-metabolizing bacteria such as Clostridium to produce IPA through cross-feeding among bacteria.
Taken together, ILA is likely to be utilized by intestinal bacteria to promote IPA and IAA production.
The efficacy of cancer chemotherapy or the response to probiotic interventions has been reported to be strongly influenced by individuals intestinal microbiota [4, 53]. Consistently, the regulation of the intestinal microbiome by ILA was microbiota-dependent and specifically enhanced indoles levels under conditions of dybiosis with Citrobacter rodentium or DSS inducing, but not of microbiota disruption with antibiotics. This may be related to the reduction of some specific tryptophan-metabolizing bacteria. Using metatranscriptome approach, we confirmed dysbiosis of tryptophan-metabolizing bacteria and the expression of acyl-CoA dehydrogenase, which is required for producing IPA [7], is drastically diminished in IBD patients.
Therefore, our study suggests that microbiota composition and function may be regulated by probiotic approaches. The metabolite treatment mediating downstream microbiota-derived metabolites may more enable to control the host-microbiota interactions. Utilizing the endogenous factors correcting the microbiota from disease to a healthy state may help overcome the strong inter-individual variability, which currently limits the effectiveness of drug treatments or probiotic interventions. The microbiota-derived metabolites or targeted “postbiotic” may provide novel prevention or treatment approaches of dysbiosis-driven diseases.

Abbreviations

AhR Aryl hydrocarbon receptor
ACD Acyl-CoA dehydrogenase
ArAT Aromatic amino acid aminotransferase
CD Crohn’s disease
CFS Cell-free supernatant
CLP Common lymphoid progenitor
CMT Colonic microbiota transplantation
DAI Disease activity index
GSEA Gene set enrichment analysis
IAA Indole-3-acetic acid
IAAH Indoleacetamide hydrolase
IBD Inflammatory bowel disease
ICA Indole-3-carbaldehyde
ID Indolepyruvate decarboxylase
IDO Indoleamine 2,3-dioxygenases
IL Interleukin
ILA Indole-3-lactic acid
ILD Indolelactate dehydrogenase
IPA Indole-3-propionic acid
KEGG Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes
KO Knockout
LEfSe Linear discriminant analysis effect size
L. reuteri Lactobacillus reuteri
MLNs Mesenteric lymph nodes
PBS Phosphate-buffered saline
PCR Polymerase chain reaction
PXR Pregnane X receptor
RNA-seq RNA sequencing
rRNA Ribosomal RNA
Th T helper
UC Ulcerative colitis
WT Wild-type
C. sporogenes Clostridium sporogenes

Supplementary Information

The online version contains supplementary material available at https://doi. org/10.1186/s40168-024-01750-y.
Additional file 1: Figure S1. L. reuteri protects mice from DSS-induced colitis. (A) Experimental scheme of a colitis-recovery-colitis-colonic microbiota transplantation (CMT) model ( ). Six-week-old C57BL/6 mice were orally gavaged with of PBS with or without . reuteri 15007 ( ) daily for three weeks, followed by a week of 3% DSS administration in drinking water to induce colitis and then a 12-day self-recovery period. From day 40-47, a second round of colitis was induced with 2% DSS in drinking water for a week, followed by reciprocal CMT. The mice in the DSS group were gavaged with day-28 colonic bacteria from the DSS_15007 group, while the mice in the DSS_15007 group were administered with day-28 colonic microbiota from the DSS group. (B) Dynamic changes in the disease activity index (DAI) score from day 21 to 40. (C) Colonic histological scores of mice ( ). (D) Representative images of hematoxylin and eosin staining of the colonic sections. (E) PCoA analysis of the Bray-Curtis distances of the colonic microbiota among three groups of mice on day 40. (F) The a-diversity (Richness and Shannon indices) of the colonic microbiota ( ) on day 40. The median value of each group is shown. ****p <0.0001, ***p <0.001, ; ns, not significant. Figure S2. The colonic microbiota of L. reuteri-supplemented mice protects mice from DSS-induced colitis. Trial design saw the Supplementary Figure 1A legend for experimental details. The survival (A) and body weight changes (B) of mice ( ) were recorded between day 47-51. Statistical analysis was performed with weight changes using one-way ANOVA and Tukey’s post-hoc test. **p < 0.01 indicates significant differences between DSS_FI5007 and 15007_FDSS groups on days 47 and 48. The histological score (C) and representative images (D) of hematoxylin and eosin-stained colonic sections of different groups of mice on day 51 ( ). (E) The colon lengths of different groups of mice on day 51 ( ). Total Th17A cell numbers (F) and Treg cell numbers (G) in the common lymphoid progenitor (CLP) cells as well as Th17A cell numbers (H) and Treg cell numbers (I) in mesenteric lymph nodes (MLNs) were determined by flow cytometry ; ns, not significant. Figure S3. L. reuteri affects the levels of tryptophan metabolites and the expression of AhR-related genes. Trial design saw the Supplementary Figure 1A legend for experimental details. (A) Serum concentrations of tryptophan metabolites (kynurenine, tryptophan, 5-HT, and ILA) ( ) on day 28 at the end of the trial. (B) Scatter plot of Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) pathway enrichment results of differentially expressed genes. The rich factor indicates the number of differentially expressed genes located in the KEGG pathway. The color represents the significance of the difference. (C) Gene set enrichment analysis (GSEA) results show negative enrichment of inflammation-related gene sets, which were changed after . reuteri treatment compared with the DSS group. (D) Changes in AhR and its target genes (Cyp1a1 and IL-22) in the colon of mice ( ). (E) Principal component analysis (PCA) plot of functional profiles with gene modules. (F) Correlation network analysis between differentially expressed genes and bacteria based on Spearman’s correlation. Red connections indicate a positive correlation ( , FDR 0.05 ) and blue connections represent negative correlations ( , FDR 0.05 ), while gray connections indicate no correlation (FDR > 0.05). * ; ns, not significant. Figure S4. IPA and IAA ameliorate DSS-induced colitis in mice. (A) Trial design ( ). Colitis was induced by providing 3% DSS in the drinking water of mice for 7 days with or without oral administration of 20 or IPA or IAA. (B) Body weight changes during the trial. (C) The colon length of mice among different groups of mice on day 7. (D) Histological score (upper panel) and representative images of hematoxylin and eosin staining (lower panel) of the colonic sections on day 7 . Scale bars represent . (E) Goblet cell changes in the colon of mice ( ). The upper panel shows the goblet cells per crypt of the colon, and the lower panel shows representative images of alcian blue staining for goblet cells in the inner mucus layer of colonic sections. (F) Levels of IL-1 and TNF-a mRNAs in the colon ( ) assessed using RT-qPCR. (G) Expression of the occludin and E-cadherin proteins ( ) determined by Western blotting. (H) Colonic
expression of the AhR, Cyp1a1 and Pxr mRNAs ( ) by RT-qPCR. * ; ns, not significant. Figure S5. IPA and IAA induce a shift in the colonic microbiota composition of mice. Colitis was induced by providing 3% DSS in the drinking water of mice for 7 days with or without oral administration of 20 or IPA or IAA. (A) Boxplots of a-diversity (richness, Simpson, and Shannon indices) of the colonic microbiota on day . The medians of the data are shown. The statistical analysis was performed using the Wilcoxon rank-sum test. ; ns, not significant. (B) PCoA plot of the Bray-Curtis distance to assess of -diversity of the colonic microbiota on day among different groups of mice. Figure S6. Measurement of indole derivatives in the cell-free supernatant. (A) Different Lactobacillus species were cultured under anaerobic conditions with an addition of 10% de Man Rogosa Sharpe (MRS) medium for 20 h at , followed by measurement of four different indole derivatives in the supernatant of each anaerobic culture. (B) L. reuteri 15007 was incubated with different concentrations of tryptophan under anaerobic conditions for 20 h at , followed by measurement of ILA in the supernatant. Figure S7. ILA alleviates DSS-induced colitis and alters the intestinal microbiota composition. Six-week-old C57BL/6 mice were orally gavaged with of PBS with or without ILA daily for one week. Colitis was induced by adding DSS in drinking water. (A) Body weight changes among three groups of mice ( ). (B) The colon length of mice among three groups of mice ( ). (C) Levels of TNF- and IL-1 in the serum ( ). (D) Histological scores of the colon ( ). (E) Representative images of hematoxylin and eosin staining of the colonic sections. (F) Richness and Shannon index of the colonic microbiota among three groups of mice. (G) PCoA plot of the Bray-Curtis distance among three groups of mice. (H) Relative abundance of top 15 genera. , **p , *** , and . Figure S8. ILA alleviates alters the colonic microbiota composition of DSS-treated mice. (A) Trial design. The intestinal microbiota of 6-week-old C57BL/6 mice ( ) was depleted with a cocktail of antibiotics in drinking water for two weeks, followed by 3% DSS in drinking water with or without oral gavage of ILA daily for another week. (B) Weight changes between day 14-21. (C) The colon length of mice among different groups. Histological score (D) and representative images of hematoxylin and eosin staining of the colonic sections (E) were shown. (F) Trial design. Mice ( 5) were orally administered with or without ILA for a week, followed by induction of colitis with 3% DSS in drinking water for another week with or without oral supplementation of ILA or CH223191. (G) Body weight changes between day 7-14 among different groups of mice. (H) The colon length of mice on day 14 in different groups. Histological score (I) and representative images of hematoxylin and eosin staining of the colonic sections (J) were shown. , **p , and , ns, not significant. Figure S9. Bacterial and bacterial enzymes involved in microbial metabolism of tryptophan are altered in IBD patients. Human HMP2 metatranscriptomic sequencing reads of 46 Crohn’s disease (CD) patients, 21 ulcerative colitis (UC) patients, and 11 healthy controls (nonIBD) were retrieved from the Inflammatory Bowel Disease Multiomics Database. (A) PCoA plot of the Bray-Curtis distance along CD, UC, and healthy patients. (B) Normalized abundances of acyl-CoA dehydrogenase (ACD) among CD, UC, and healthy patients. Statistical significance was determined from linear mixed effects models. . (C) Distribution of ACD in the top 10 genera (C) and species (D). The changes of top 10 ACD-expressing bacterial genera (E) and species (F) among CD, UC, and healthy patients.
Additional file 2: Table S2. Primer sequences used in the present study.

Acknowledgements

We thank Professor Junjun Wang from China Agricultural University for kindly providing L. johnsonii and L. delbrueckii and Professor Hui Sun from Jilin Agricultural University for kindly providing L. rhamnosus GG and L. plantarum.

Authors’ contributions

SYQ and XFZ conceived and designed the study. XYW and YHM conducted the experiments. YMW and HTY collected the samples. LUY and SC performed the analysis of the samples. GW and XYF analyzed the data. GW wrote the manuscript. XFZ, LGZ and GW revised the manuscript. All authors read and approved the final manuscript.

Funding

This work was supported by the National Key Research and Development Program of China (2022YFC2105001), the National Science Fund for Distinguished Young Scholars (no. 32202721), China National Postdoctoral Program for Innovative Talents (no. BX20220342), China Postdoctoral Science Foundation (no. 2022M723419), and the National Natural Science Foundation of China (no. U180220167).

Availability of data and materials

16 S rDNA and metatranscriptomic sequencing data in the present study have been deposited in the NCBI Sequence Read Archive database under accession numbers PRJNA782376 and PRJNA782681.

Declarations

All mouse experiments were approved by the Institutional Animal Care and Use Committee of China Agricultural University (Beijing, CAU20150925-2).
Not applicable.

Competing interests

The authors declare no competing interests.

Author details

State Key Laboratory of Animal Nutrition, College of Animal Science and Technology, China Agricultural University, Beijing 100193, China. Beijing Key Laboratory of Biological Feed Additive, China Agricultural University, Beijing 100193, China. Frontier Technology Research Institute of China Agricultural University in Shenzhen, Shenzhen 518116, China. Department of Animal and Food Sciences, Oklahoma State University, Stillwater, OK 74078, USA.
Received: 23 March 2023 Accepted: 3 January 2024
Published online: 19 March 2024

References

  1. Fang H, Fu L, Wang J. Protocol for fecal microbiota transplantation in inflammatory bowel disease: a systematic review and meta-analysis. Biomed Res Int. 2018;2018:8941340.
  2. Lamas B, Richard ML, Leducq V, Pham H-P, Michel M-L, Da Costa G, et al. CARD9 impacts colitis by altering gut microbiota metabolism of tryptophan into aryl hydrocarbon receptor ligands. Nat Med. 2016;22:598-605.
  3. Koh A, De Vadder F, Kovatcheva-Datchary P, et al. From dietary fiber to host physiology: short-chain fatty acids as key bacterial metabolites. Cell. 2016;165:1332-45.
  4. Tintelnot J, Xu Y, Lesker TR, et al. Microbiota-derived 3-IAA influences chemotherapy efficacy in pancreatic cancer. Nature. 2023;615:168-74.
  5. Wang G, Huang S, Wang Y, et al. Bridging intestinal immunity and gut microbiota by metabolites. Cell Mol Life Sci. 2019;76:3917-37.
  6. Roth W, Zadeh K, Vekariya R, et al. Tryptophan metabolism and gut-brain homeostasis. Int J Mol Sci. 2021;22:2973.
  7. Dodd D, Spitzer MH, Van Treuren W, et al. A gut bacterial pathway metabolizes aromatic amino acids into nine circulating metabolites. Nature. 2017;551:648-52.
  8. Zelante T, lannitti RG, Cunha C, et al. Tryptophan catabolites from microbiota engage aryl hydrocarbon receptor and balance mucosal reactivity via interleukin-22. Immunity. 2013;39:372-85.
  9. Krishnan S, Ding Y, Saedi N, et al. Gut microbiota-derived tryptophan metabolites modulate inflammatory response in hepatocytes and macrophages. Cell Rep. 2018;23:1099-111.
  10. , et al. Rewiring the altered tryptophan metabolism as a novel therapeutic strategy in inflammatory bowel diseases. Gut. 2023;72. Available from: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/ 36270778/. Cited 2023 Nov 21.
  11. Cervantes-Barragan L, Chai JN, Tianero MD, et al. Lactobacillus reuteri induces gut intraepithelial CD4+CD8aa+T cells. Science. 2017;357:806-10.
  12. Wilck N, Matus MG, Kearney SM, et al. Salt-responsive gut commensal modulates TH17 axis and disease. Nature. 2017;551:585-9.
  13. Laursen MF, Sakanaka M, von Burg N, et al. Bifidobacterium species associated with breastfeeding produce aromatic lactic acids in the infant gut. Nat Microbiol. 2021;6:1367-82.
  14. Wang G, Huang S, Cai S, et al. Lactobacillus reuteri ameliorates intestinal inflammation and modulates gut microbiota and metabolic disorders in dextran sulfate sodium-induced colitis in mice. Nutrients. 2020;12:2298.
  15. Zhu H, Cao C, Wu Z, et al. The probiotic L. casei Zhang slows the progression of acute and chronic kidney disease. Cell Metab. 2021;33:1926-1942.e8.
  16. Hu J, Ma L, Nie Y, et al. A microbiota-derived bacteriocin targets the host to confer diarrhea resistance in early-weaned piglets. Cell Host Microbe. 2018;24:817-832.e8.
  17. Stillie R, Stadnyk AW. Role of TNF receptors, TNFR1 and TNFR2, in dextran sodium sulfate-induced colitis. Inflamm Bowel Dis. 2009;15:1515-25.
  18. Suez J, Zmora N, Zilberman-Schapira G, et al. Post-antibiotic gut mucosal microbiome reconstitution is impaired by probiotics and improved by autologous FMT. Cell. 2018;174:1406-1423.e16.
  19. Weigmann B, Tubbe I, Seidel D, et al. Isolation and subsequent analysis of murine lamina propria mononuclear cells from colonic tissue. Nat Protoc. 2007;2:2307-11.
  20. Liu H, Hou C, Wang G, et al. Lactobacillus reuteri I5007 modulates intestinal host defense peptide expression in the model of IPEC-J2 cells and neonatal piglets. Nutrients. 2017;9:559.
  21. Edgar RC. Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST. Bioinformatics. 2010;26:2460-1.
  22. Rognes T, Flouri T, Nichols B, et al. VSEARCH: a versatile open source tool for metagenomics. PeerJ. 2016;4:e2584.
  23. Cole JR, Wang Q, Fish JA, et al. Ribosomal Database Project: data and tools for high throughput rRNA analysis. Nucleic Acids Res. 2014;42:D633-42.
  24. Douglas GM, Maffei VJ, Zaneveld JR, et al. PICRUSt2 for prediction of metagenome functions. Nat Biotechnol. 2020;38:685-8.
  25. Bolger AM, Lohse M, Usadel B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 2014;30:2114-20.
  26. Langmead B, Salzberg SL. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat Methods. 2012;9:357-9.
  27. Grabherr MG, Haas BJ, Yassour M, et al. Full-length transcriptome assembly from RNA-Seq data without a reference genome. Nat Biotechnol. 2011;29:644-52.
  28. Li W, Godzik A. Cd-hit: a fast program for clustering and comparing large sets of protein or nucleotide sequences. Bioinformatics. 2006;22:1658-9.
  29. Patro R, Duggal G, Love MI, et al. Salmon provides fast and bias-aware quantification of transcript expression. Nat Methods. 2017;14:417-9.
  30. Zhu W, Lomsadze A, Borodovsky M. Ab initio gene identification in metagenomic sequences. Nucleic Acids Res. 2010;38:e132-e132.
  31. Buchfink B, Xie C, Huson DH. Fast and sensitive protein alignment using DIAMOND. Nat Methods. 2015;12:59-60.
  32. Love MI, Huber W, Anders S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol. 2014;15:550.
  33. Huson DH, Auch AF, Qi J, et al. MEGAN analysis of metagenomic data. Genome Res. 2007;17:377-86.
  34. Kim D, Langmead B, Salzberg SL. HISAT: a fast spliced aligner with low memory requirements. Nat Methods. 2015;12:357-60.
  35. Yu G, Wang L-G, Han Y, et al. clusterProfiler: an R package for comparing biological themes among gene clusters. OMICS. 2012;16:284-7.
  36. Langfelder P, Zhang B, Horvath S. Defining clusters from a hierarchical cluster tree: the Dynamic Tree Cut package for R. Bioinformatics. 2008;24:719-20.
  37. IBDMDB Investigators, Lloyd-Price J, Arze C, et al. Multi-omics of the gut microbial ecosystem in inflammatory bowel diseases. Nature. 2019;569:655-62.
  38. Wang G, Wang X, Ma Y, et al. Lactobacillus reuteri improves the development and maturation of fecal microbiota in piglets through mother-to-infant microbe and metabolite vertical transmission. Microbiome. 2022;10:211.
  39. Qi Q, Li J, Yu B, et al. Host and gut microbial tryptophan metabolism and type 2 diabetes: an integrative analysis of host genetics, diet, gut microbiome and circulating metabolites in cohort studies. Gut. 2022;71:1095-105.
  40. Platten M, Wick W, Van den Eynde BJ. Tryptophan catabolism in cancer: beyond IDO and tryptophan depletion. Cancer Res. 2012;72:5435-40.
  41. Venkatesh M, Mukherjee S, Wang H, et al. Symbiotic bacterial metabolites regulate gastrointestinal barrier function via the xenobiotic sensor PXR and Toll-like receptor 4. Immunity. 2014;41:296-310.
  42. Lee JS, Cella M, McDonald KG, et al. AHR drives the development of gut ILC22 cells and postnatal lymphoid tissues via pathways dependent on and independent of Notch. Nat Immunol. 2012;13:144-51.
  43. Wilson MS, Ramalingam TR, Rivollier A, et al. Colitis and intestinal inflammation in IL10-/- mice results from IL-13Ra2-mediated attenuation of IL-13 activity. Gastroenterology. 2011;140:254-64.
  44. Nikolaus S, Schulte B, Al-Massad N, et al. Increased tryptophan metabolism is associated with activity of inflammatory bowel diseases. Gastroenterology. 2017;153:1504-1516.e2.
  45. Schirmer M, Franzosa EA, Lloyd-Price J, et al. Dynamics of metatranscription in the inflammatory bowel disease gut microbiome. Nat Microbiol. 2018;3:337-46.
  46. Investigators IBDMDB, Lloyd-Price J, Arze C, Ananthakrishnan AN, et al. Multi-omics of the gut microbial ecosystem in inflammatory bowel diseases. Nature. 2019;569:655-62.
  47. Jang YJ, Kim W-K, Han DH, et al. Lactobacillus fermentum species ameliorate dextran sulfate sodium-induced colitis by regulating the immune response and altering gut microbiota. Gut Microbes. 2019;10:696-711.
  48. Atarashi K, Tanoue T, Oshima K, et al. Treg induction by a rationally selected mixture of Clostridia strains from the human microbiota. Nature. 2013;500:232-6.
  49. Ehrlich AM, Pacheco AR, Henrick BM, et al. Indole-3-lactic acid associated with Bifidobacterium-dominated microbiota significantly decreases inflammation in intestinal epithelial cells. BMC Microbiol. 2020;20:357.
  50. Zelezniak A, Andrejev S, Ponomarova O, et al. Metabolic dependencies drive species co-occurrence in diverse microbial communities. Proc Natl Acad Sci U S A. 2015;112:6449-54.
  51. Meng D, Sommella E, Salviati E, et al. Indole-3-lactic acid, a metabolite of tryptophan, secreted by Bifidobacterium longum subspecies infantis is anti-inflammatory in the immature intestine. Pediatr Res. 2020;88:209-17.
  52. Menni C, Hernandez MM, Vital M, et al. Circulating levels of the antioxidant indoleproprionic acid are associated with higher gut microbiome diversity. Gut Microbes. 2019;10:688-95.
  53. Zmora N, Zilberman-Schapira G, Suez J, et al. Personalized gut mucosal colonization resistance to empiric probiotics is associated with unique host and microbiome features. Cell. 2018;174:1388-1405.e21.

Publisher’s Note

Springer Nature remains neutral with regard to jurisdictional claims in published maps and institutional affiliations.

  1. *Correspondence:
    Xiangfang Zeng
    ziyangzxf@163.com
    Full list of author information is available at the end of the article
  2. (See figure on next page.)
    Fig. 1 L. reuteri alters the intestinal microbiota composition and microbial tryptophan metabolite. A Differential enrichment of the mouse colonic microbiota in response to . reuteri supplementation on day 28 (see the Figure S1A legend for the experimental scheme). The taxonomic classifications of the bacteria are shown in the left panel. Blanks are unassigned taxa. The 36 differentially enriched bacterial taxa are ranked by estimating the mean decrease in accuracy based on random forest analysis. The right panel shows the LEfSe analysis of the 36 bacterial taxa. B Serum concentrations of metabolites in tryptophan metabolism among three groups of mice ( ). C Volcano plot showing differential gene expression in the colon of DSS-treated mice with or without L. reuteri supplementation. Each red dot indicates a significantly upregulated gene, while a blue dot represents a significantly downregulated gene, with each gray dot showing a gene with no significant difference. D Pairwise comparisons of tryptophan metabolites, with a color gradient denoting Spearman’s correlation coefficient. The correlation between the bacterial/ gene expression profiles and each metabolite using partial Mantel tests. The edge width corresponds to Mantel’s R statistic for the corresponding distance correlations, and the edge color denotes statistical significance. E Real-time PCR assay showing the expression of Pxr and its target genes , and
  3. (See figure on next page.)
    Fig. 4 Indole derivatives alleviate intestinal inflammation in mice. Six-week-old mice were orally gavaged daily with or without ILA ( ), IPA ( ), or IAA ( ) for 4 weeks ( ). Congenic wild-type (WT) mice were also gavaged daily for 4 weeks as negative controls. A Colonic mRNA expression levels of proinflammatory cytokines (IL-6 and IL-1 ) ( ) by RT-qPCR. B The levels of TNF-a and LPS in the colon ( ) using ELISA. C PCoA plot of the Bray-Curtis distance of the colonic microbiota among different groups of mice. D Heatmap showing the relative abundance of different bacterial genera. E Co-occurrence network analysis of bacterial genera among different groups of mice. Edges representing significant SparCC correlations indicate and . Each light blue line represents a significant negative correlation, while each light red line represents a significant positive correlation. The size of the points represents the degree of the node. The thickness of the line is proportional to the degree of correlation. ; ns, not significant