DOI: https://doi.org/10.1186/s13036-025-00614-9
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/41507964
تاريخ النشر: 2026-01-08
المؤلف: Changchuan Ye وآخرون
الموضوع الرئيسي: هندسة التمثيل الغذائي الميكروبي والإنتاج الحيوي
نظرة عامة
**نظرة عامة**
فيتامين K2 (VK2)، وهو مشتق من الميناكوينون، ضروري لمنع هشاشة العظام وتكلس القلب والأوعية الدموية، مما أثار اهتمامًا في إنتاجه الصناعي وتقليل التكاليف. تركز هذه الدراسة على هندسة سلالات *Escherichia coli* لتعزيز إنتاج VK2 من خلال الهندسة الأيضية وتقنيات حذف الجينات المعتمدة على CRISPR/Cas9. في البداية، تم تطوير سلالة مؤتلفة لإنتاج الميناكوينول-8 (MKH2-8) من خلال التعبير المفرط عن الإنزيمات المحددة لمعدل التفاعل menA و ubiE. أدى التعبير المفرط اللاحق عن الجينات wrbA و qorB و menF إلى تحديد السلالة MUW، التي حققت إنتاج VK2 قدره 301.96 ملغ/لتر بعد 48 ساعة من التخمير. أدت المزيد من تحسينات الوسط وحذف الجينات المستهدف إلى السلالة السائدة ΔB:MUW، التي أنتجت 723.59 ملغ/لتر من VK2، وفي النهاية، أدى التعبير المفرط عن جين ispB في السلالة ΔB:MUWI إلى تحقيق إنتاج ملحوظ قدره 1355.29 ملغ/لتر في مفاعل سعة 5 لترات.
في الختام، توضح هذه الأبحاث فعالية الهندسة الأيضية العقلانية وتحسين التعبير الجيني في تطوير سلالات *E. coli* التنافسية لإنتاج VK2. يبرز الإنتاج المحقق البالغ 1355.29 ملغ/لتر في التخمير الدفعي الإمكانية لمزيد من تحسين العملية. قد تكون المنهجيات المستخدمة في هذه الدراسة قابلة للتطبيق أيضًا على الإنتاج الفعال لمستقلبات أخرى، مما يظهر تأثيرًا أوسع على التطبيقات البيولوجية.
مقدمة
تستعرض مقدمة هذه الورقة البحثية التقدمات الكبيرة في علم الأحياء الاصطناعي، لا سيما في الإنتاج الحيوي للوقود والمواد الكيميائية والمواد من الكتلة الحيوية. على مدى العقدين الماضيين، انتقل هذا المجال من الأبحاث الأساسية إلى التطبيقات العملية، مدفوعًا بالابتكارات في الهندسة الأيضية وتحرير الجينات وعلم الأحياء النظامية. ومن الجدير بالذكر أن *Escherichia coli* قد ظهرت كمصنع خلوى ميكروبي مفضل بسبب نموها السريع، ووراثتها الموصوفة جيدًا، وسهولة تعديلها، مما يجعلها نموذجًا لدراسة الإنتاج الميكروبي وآليات التنظيم.
تسلط الورقة الضوء على أهمية فيتامين K2 (VK2)، وبشكل خاص الميناكوينون-8 (MK-8)، في وظائف فسيولوجية مختلفة، بما في ذلك استقلاب العظام والحماية العصبية. يتضمن تخليق VK2 في *E. coli* عدة مسارات أيضية، وتهدف الدراسة إلى تعزيز إنتاج MK-8 في ظل ظروف هوائية من خلال تحسين مسار تخليق الميناكوينون. يقترح المؤلفون هندسة سلالة من *E. coli*، تُدعى BW25113-T7، والتي أظهرت سابقًا تعبيرًا فعالًا عن البروتين، لزيادة تراكم MKH2-8، وهو شكل مختزل من MK-8. تستخدم هذه الأبحاث استراتيجيات الهندسة الأيضية العقلانية لإنشاء سلالات *E. coli* ذات أنماط وراثية محددة يمكنها إنتاج VK2 بشكل فعال، مع معالجة الأهمية البيولوجية لـ VK2 والتحديات المرتبطة بإنتاجه.
طرق
تستعرض قسم “المواد والطرق” تصميم التجارب والإجراءات المستخدمة في الدراسة. يوضح المواد المحددة المستخدمة، بما في ذلك أي مواد كيميائية أو أدوات أو تقنيات تم استخدامها لجمع البيانات. يتم وصف المنهجية بطريقة منهجية، مما يضمن إمكانية تكرار التجارب. يشمل ذلك معايير اختيار العينات، والبروتوكولات المتبعة لجمع البيانات، وأي تحليلات إحصائية تم إجراؤها لتفسير النتائج.
بالإضافة إلى ذلك، قد يسلط القسم الضوء على أي ضوابط تم تنفيذها للتحقق من النتائج وتقليل التحيزات المحتملة. يتم التأكيد على استخدام الاختبارات الإحصائية المناسبة لضمان قوة الاستنتاجات المستخلصة من البيانات. بشكل عام، يعد هذا القسم دليلًا شاملاً للإطار التجريبي، مما يسمح بالتقييم النقدي والتكرار من قبل باحثين آخرين في هذا المجال.
نتائج
في هذه الدراسة، طور الباحثون سلالة من *E. coli* (BW25113-T7) قادرة على إنتاج فيتامين K2 (VK2) من خلال التعبير المفرط عن جيني menA و ubiE، اللذان هما حاسمان لتخليق VK2. يشفر جين menA إنزيمًا يسهل نقل سلسلة جانبية أوكتابرينيل إلى حمض 1،4-ديهيدروكسي-2-نافثويك (DHNA)، بينما يشفر ubiE ميثيل ترانسفيراز ثنائي الوظيفة يشارك في تخليق يوبكوينول وميناكوينول. تم بناء البلازميد pET-menA-ubiE لتمكين التعبير المنظم عن هذه الجينات، مما أدى إلى تراكيز VK2 قدرها 302.76 ملغ/لتر و232.29 ملغ/لتر بعد 24 و48 ساعة من التخمير، على التوالي.
لزيادة إنتاج VK2 بشكل أكبر، قام الباحثون أيضًا بالتعبير المفرط عن الجينات qorB و wrbA و menF، التي تشارك في مسار تخليق الميناكوينول. ومع ذلك، أشارت النتائج إلى أن السلالات التي تحمل هذه البلازميدات الإضافية (MUF و MUQ و MUW) أظهرت انخفاضًا في تراكم VK2 بعد 24 ساعة. ومن الجدير بالذكر أن السلالة MUW أظهرت اتجاهًا إيجابيًا في إنتاج VK2 بعد 48 ساعة، محققة تركيزًا قدره 301.96 ملغ/لتر، بينما أظهرت السلالات الأخرى انخفاضًا في الإنتاج. تشير هذه النتائج إلى أنه بينما يمكن أن يعيق التعبير المفرط عن الجينات الإضافية في البداية تراكم VK2، قد تعزز بعض التركيبات الإنتاج في النهاية على مدى فترات تخمير ممتدة.
مناقشة
في هذه الدراسة، طور المؤلفون استراتيجية هندسة أيضية لتعزيز إنتاج فيتامين K2 (VK2) في *Escherichia coli*، باستخدام سلالة BW25113-T7 بشكل خاص. من خلال استخدام تقنية CRISPR/Cas9، نجحوا في حذف جيني entB و pabC، اللذان يتنافسان على المواد الأولية في مسار تخليق الميناكوينول. أدى حذف entB إلى زيادة كبيرة في تراكم VK2، محققًا إنتاجًا قدره 747.61 ملغ/لتر، بينما لم يؤدِ حذف pabC بمفرده إلى تحسينات كبيرة. تم تحسين السلالة المهندسة، المسماة ΔB:MUW، بشكل أكبر من خلال التعبير المفرط عن جين ispB، الذي يشارك في تخليق سلسلة جانبية إيزوبرينويد اللازمة لإنتاج الميناكوينول. أدت هذه التعديلات إلى إنتاج VK2 ملحوظ قدره 1355.29 ملغ/لتر خلال التخمير الدفعي.
تسلط النتائج الضوء على فعالية حذف الجينات المستهدف واستراتيجيات التعبير المفرط في توجيه التدفق الأيضي نحو المنتجات المرغوبة. تؤكد الدراسة على أهمية تحسين ظروف الثقافة وتركيب الوسط، حيث وُجد أن التعديلات في تركيز الجلوكوز وإزالة مستخلص الخميرة قد حسنت إنتاج VK2. بشكل عام، تُظهر الأبحاث تطبيقًا ناجحًا لتقنيات الهندسة الأيضية لتحسين التخليق الحيوي للمركبات النشطة بيولوجيًا في الأنظمة الميكروبية، مما يمهد الطريق لمزيد من التحسينات وإمكانيات التطبيقات الصناعية.
DOI: https://doi.org/10.1186/s13036-025-00614-9
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/41507964
Publication Date: 2026-01-08
Author(s): Changchuan Ye et al.
Primary Topic: Microbial Metabolic Engineering and Bioproduction
Overview
**Overview**
Vitamin K2 (VK2), a menaquinone derivative, is crucial for preventing osteoporosis and cardiovascular calcification, prompting interest in its industrial production and cost reduction. This study focuses on engineering *Escherichia coli* strains to enhance VK2 yield through metabolic engineering and CRISPR/Cas9-mediated gene knockout techniques. Initially, a recombinant strain was developed to produce menaquinol-8 (MKH2-8) by overexpressing the rate-limiting enzymes menA and ubiE. Subsequent overexpression of genes wrbA, qorB, and menF led to the identification of strain MUW, which achieved a VK2 yield of 301.96 mg/L after 48 hours of fermentation. Further optimization of the medium and targeted gene knockouts resulted in the dominant strain ΔB:MUW, yielding 723.59 mg/L of VK2, and ultimately, overexpression of the ispB gene in strain ΔB:MUWI achieved a remarkable yield of 1355.29 mg/L in a 5 L fermenter.
In conclusion, this research illustrates the effectiveness of rational metabolic engineering and gene expression optimization in developing competitive *E. coli* strains for VK2 production. The achieved yield of 1355.29 mg/L in batch fermentation highlights the potential for further process optimization. The methodologies employed in this study may also be applicable to the efficient production of other metabolites, showcasing a broader impact on biotechnological applications.
Introduction
The introduction of this research paper outlines the significant advancements in synthetic biology, particularly in the bio-based production of fuels, chemicals, and materials from biomass. Over the past two decades, the field has transitioned from foundational research to practical applications, driven by innovations in metabolic engineering, gene editing, and systems biology. Notably, Escherichia coli has emerged as a preferred microbial cell factory due to its rapid growth, well-characterized genetics, and ease of manipulation, making it a model organism for studying microbial production and regulatory mechanisms.
The paper highlights the importance of Vitamin K2 (VK2), specifically menaquinone-8 (MK-8), in various physiological functions, including bone metabolism and neuroprotection. The synthesis of VK2 in E. coli involves several metabolic pathways, and the study aims to enhance MK-8 production under aerobic conditions by optimizing the menaquinone synthesis pathway. The authors propose to engineer a strain of E. coli, named BW25113-T7, which has previously shown efficient protein expression, to increase the accumulation of MKH2-8, a reduced form of MK-8. This research employs rational metabolic engineering strategies to create E. coli strains with defined genotypes that can effectively produce VK2, addressing both the biological significance of VK2 and the challenges associated with its production.
Methods
The “Materials and Methods” section outlines the experimental design and procedures utilized in the study. It details the specific materials employed, including any reagents, instruments, or technologies used to gather data. The methodology is described in a systematic manner, ensuring reproducibility of the experiments. This includes the selection criteria for samples, the protocols followed for data collection, and any statistical analyses performed to interpret the results.
Additionally, the section may highlight any controls implemented to validate the findings and mitigate potential biases. The use of appropriate statistical tests is emphasized to ensure the robustness of the conclusions drawn from the data. Overall, this section serves as a comprehensive guide to the experimental framework, allowing for critical evaluation and replication by other researchers in the field.
Results
In this study, the researchers developed a strain of *E. coli* (BW25113-T7) capable of producing vitamin K2 (VK2) through the overexpression of the menA and ubiE genes, which are critical for VK2 biosynthesis. The menA gene encodes an enzyme that facilitates the transfer of an octaprenyl side chain to 1,4-dihydroxy-2-naphthoic acid (DHNA), while ubiE encodes a bifunctional methyltransferase involved in the synthesis of ubiquinol and menaquinol. The plasmid pET-menA-ubiE was constructed to enable the regulated expression of these genes, leading to VK2 titers of 302.76 mg/L and 232.29 mg/L after 24 and 48 hours of fermentation, respectively.
To further enhance VK2 production, the researchers also overexpressed the genes qorB, wrbA, and menF, which are involved in the menaquinol biosynthesis pathway. However, the results indicated that strains carrying these additional plasmids (MUF, MUQ, and MUW) showed a decrease in VK2 accumulation after 24 hours. Notably, strain MUW demonstrated a positive trend in VK2 production after 48 hours, achieving a concentration of 301.96 mg/L, while the other strains exhibited declining yields. These findings suggest that while additional gene overexpression can initially hinder VK2 accumulation, certain combinations may ultimately enhance production over extended fermentation periods.
Discussion
In this study, the authors developed a metabolic engineering strategy to enhance the production of vitamin K2 (VK2) in Escherichia coli, specifically using the BW25113-T7 strain. By employing CRISPR/Cas9 technology, they successfully knocked out the entB and pabC genes, which compete for precursors in the menaquinol synthesis pathway. The knockout of entB significantly increased VK2 accumulation, achieving a yield of 747.61 mg/L, while the pabC knockout alone did not yield significant improvements. The engineered strain, designated ΔB:MUW, was further optimized by overexpressing the ispB gene, which is involved in synthesizing the isoprenoid side chain necessary for menaquinol production. This modification led to a remarkable VK2 yield of 1355.29 mg/L during batch fermentation.
The findings highlight the effectiveness of targeted gene knockouts and overexpression strategies in redirecting metabolic flux towards desired products. The study underscores the importance of optimizing culture conditions and medium composition, as adjustments in glucose concentration and the removal of yeast extract were found to enhance VK2 production. Overall, the research demonstrates a successful application of metabolic engineering techniques to improve the biosynthesis of bioactive compounds in microbial systems, paving the way for further optimization and potential industrial applications.