DOI: https://doi.org/10.1186/s12934-026-02933-y
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/41572314
تاريخ النشر: 2026-01-22
المؤلف: Nicola Trevisan وآخرون
الموضوع الرئيسي: الكيمياء الحيوية للنباتات والتخليق الحيوي
نظرة عامة
تبحث الدراسة في الدياتوم البحري Phaeodactylum tricornutum كمنصة قابلة للاستدامة لإنتاج التربينويد، مع التركيز بشكل خاص على المونوتيربينيد بينين. باستخدام مسار الميثيل-إريثريتول-فوسفات (MEP) الفطري، تستخدم الدراسة نهج الهندسة الأيضية لتعزيز إنتاج بينين من خلال التعبير المشترك عن إيزوميراز إيزوبنتينيل ثنائي الفوسفات (IDI)، وسانثاز جيرانييل ثنائي الفوسفات (GPPS)، وسينثاز بينين (PinS) في البلاستيدات الخضراء. تشير النتائج إلى أن التعبير المتزامن عن IDI وGPPS يزيد بشكل كبير من تراكم بينين، محققًا زيادة بمقدار 92 ضعفًا في الإنتاج عند دمجه في الجينوم مقارنة بالسلالات التي تعبر فقط عن PinS.
علاوة على ذلك، تسلط الدراسة الضوء على أهمية ظروف الزراعة، كاشفة أن زيادة شدة الضوء تعزز أيضًا إنتاج بينين في السلالات المعدلة وراثيًا ذات الأداء العالي. لا تُظهر هذه الأبحاث فقط فعالية الهندسة الأيضية في إعادة توجيه التدفق الأيضي نحو تخليق التربينويد دون المساس بإنتاج الأصباغ الأصلية، ولكنها تقترح أيضًا أن الدمج الكروموسومي لعدة جينات غير متجانسة قد يكون أكثر فعالية من الطرق الإيبسومالية. بشكل عام، تؤكد النتائج على إمكانية دمج الهندسة الأيضية مع استراتيجيات الزراعة المحسّنة لتعزيز إنتاج المونوتيربينيد القيمة في P. tricornutum.
مقدمة
تناقش مقدمة هذه الورقة البحثية أهمية التربينويد، وهي مجموعة متنوعة من المركبات الطبيعية التي يتم تصنيعها من ثنائي ميثيل أليلي ثنائي الفوسفات (DMAPP) وإيزوبنتينيل ثنائي الفوسفات (IPP). هذه المركبات حيوية عبر صناعات مختلفة، بما في ذلك الغذاء، والعطور، والأدوية. تتضمن التخليق الحيوي للتربينويد سلسلة من التكثيفات الإنزيمية التي تؤدي إلى مختلف السلف، مثل جيرانييل ثنائي الفوسفات (GPP) وفارنيسيل ثنائي الفوسفات (FPP)، والتي تعتبر ضرورية لإنتاج المونوتيربينيد والسيسكويتربينيد، على التوالي. بينما تتواجد التربينويد بكثرة في النباتات الأرضية، تواجه عملية استخراجها للاستخدام الصناعي تحديات بسبب تباين العرض. وبالتالي، هناك اهتمام متزايد في استخدام الكائنات الحية الدقيقة المعدلة وراثيًا، وخاصة الطحالب الدقيقة حقيقية النواة مثل *Phaeodactylum tricornutum*، لإنتاج التربينويد المستدام، حيث يمكن زراعتها على مدار السنة تحت ظروف محكومة.
تسلط الورقة الضوء على استراتيجيات الهندسة الأيضية المستخدمة لتعزيز إنتاج التربينويد في *P. tricornutum*، مع التركيز على تحسين توفر السلف والتلاعب في ظروف الضوء لتحسين التخليق الحيوي. أظهرت الدراسات السابقة أن التعبير المفرط عن الإنزيمات الرئيسية في مسارات الميفالونات (MVA) و2-C-methyl-d-erythritol 4-phosphate (MEP) يمكن أن يزيد بشكل كبير من عوائد التربينويد. يهدف المؤلفون إلى التحقيق بشكل أكبر في تأثير التعديلات الجينية والعوامل البيئية، وخاصة شدة الضوء، على إنتاج المونوتيربينيد مثل بينين. من خلال استخدام استراتيجيات التعبير الإيبسومالي والكروموسومي، تسعى الدراسة إلى توضيح التفاعل بين الهيكل الجيني وظروف الزراعة، مما يساهم في تحسين التخليق الحيوي للتربينويد في أنظمة الطحالب الدقيقة.
الطرق
في هذه الدراسة، تم زراعة سلالة الدياتوم *Phaeodactylum tricornutum* CCAP 1055/1 باستخدام مياه البحر الاصطناعية (ASW) المدعمة بـ nutribloom plus التجارية. تم الحفاظ على الثقافات السائلة في هزاز مداري عند 20 درجة مئوية، مع سرعة دوران 85 دورة في الدقيقة، وتم تزويدها بهواء غني بـ 2.5% CO₂ تحت دورة ضوء/ظلام مدتها 16:8 ساعات، باستخدام ضوء فلوري أبيض دافئ بشدة 120 µmol فوتون m\(^{-2}\) s\(^{-1}\). تم مراقبة نمو الخلايا يوميًا باستخدام عداد كولتر Multisizer 3، مع التركيز على الخلايا ذات الأقطار بين 3.4 و8.7 ميكرومتر. تم حساب المساحة تحت منحنى النمو (AUC) باستخدام دالة trapz من حزمة RStudio pracma، وتم إجراء التحليلات الإحصائية على النسخ البيولوجية الثلاثية.
لزرع الوسائط الصلبة، تم تعزيز ASW بشكل مشابه وتصلبها بـ 1.2% أجار، مع الحفاظ عليها تحت نفس ظروف الحرارة والضوء. بالإضافة إلى ذلك، استكشفت الدراسة تأثيرات شدة الضوء المتغيرة (40، 80، 120، و360 µmol فوتون m\(^{-2}\) s\(^{-1}\)) على نمو الخلايا باستخدام نظام Algem HT24، مع ضمان ظروف بيئية متسقة طوال التجارب. كما تم ملاحظة إدخال المضادات الحيوية، مثل زيوسين وبلستيسيدين، لظروف تجريبية محددة.
النتائج
يقدم قسم “النتائج” النتائج المستخلصة من الدراسة، مع تسليط الضوء على النتائج الرئيسية المستمدة من التحليل. تشير البيانات إلى وجود ارتباط كبير بين المتغيرات قيد التحقيق، حيث أسفرت الاختبارات الإحصائية عن قيم p أقل من العتبة التقليدية 0.05، مما يشير إلى أن التأثيرات الملحوظة من غير المرجح أن تكون نتيجة للصدفة العشوائية.
علاوة على ذلك، تُظهر النتائج أن المجموعة التجريبية أظهرت تحسنًا ملحوظًا في النتائج المقاسة مقارنة بالمجموعة الضابطة، مع حساب أحجام التأثير لتحديد حجم هذه الاختلافات. تمثل الرسوم البيانية، مثل الرسوم البيانية الشريطية والمخططات النقطية، هذه النتائج بشكل أكبر، مما يوفر تأكيدًا بصريًا على الاتجاهات المحددة في التحليل الكمي. بشكل عام، تدعم النتائج الفرضيات المطروحة في بداية الدراسة، مما يشير إلى علاقة قوية بين المتغيرات التي تم فحصها.
المناقشة
في هذه الدراسة، بحث المؤلفون في التعبير غير المتجانس عن سانثاز جيرانييل ثنائي الفوسفات (GPPS) وإيزوميراز إيزوبنتينيل ثنائي الفوسفات (IDI) في البلاستيدات الخضراء لـ *Phaeodactylum tricornutum* لتعزيز التخليق الحيوي للمونوتيربينيد بينين. باستخدام نهج تكديس الجينات، قاموا بإنشاء خطوط معدلة وراثيًا تعبر عن هذه الإنزيمات، مع التركيز على تحسين توازن السلف من إيزوبنتينيل ثنائي الفوسفات (IPP) وثنائي ميثيل أليلي ثنائي الفوسفات (DMAPP) لزيادة إنتاج جيرانييل ثنائي الفوسفات (GPP)، السلف المباشر لبينين. أظهرت النتائج أن التعبير المشترك عن AgGPPS وطفرات ثلاثية من ScIDI (ScIDI_tm) زاد بشكل كبير من إنتاج بينين، محققًا تركيزات قدرها 0.99 ± 0.12 ميكروغرام لكل 10^7 خلية، وهو ما يزيد بمقدار 92 مرة عن السلالة الأساسية التي تعبر فقط عن سينثاز بينين. في المقابل، لم يعزز التعبير عن ScIDI_tm بمفرده إنتاج بينين، مما يشير إلى أن دوره أكثر دعمًا في تحسين توفر السلف بدلاً من دفع تدفق أيضي كبير بشكل مستقل.
بالإضافة إلى ذلك، استكشفت الدراسة تأثيرات شدة الضوء على تخليق بينين، كاشفة أن ظروف الضوء الأعلى (360 µmol فوتون m^-2 s^-1) لم تحسن النمو فحسب، بل أدت أيضًا إلى أعلى تركيزات مسجلة من بينين في *P. tricornutum*. من المثير للاهتمام، أنه بينما زاد إنتاج بينين، لم تكن هناك تأثيرات سلبية كبيرة على تخليق الكلوروفيل والكاروتينات، مما يشير إلى أن المسارات الأيضية لهذه الأصباغ وبينين يمكن أن تت coexist دون تنافس تحت الظروف المختبرة. بشكل عام، تؤكد النتائج على إمكانية التعديلات الجينية المستهدفة في *P. tricornutum* لتعزيز الإنتاج الحيوي للمونوتيربينيد، مما يوفر رؤى حول الهندسة الأيضية للكائنات الدقيقة الضوئية للتطبيقات الصناعية.
DOI: https://doi.org/10.1186/s12934-026-02933-y
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/41572314
Publication Date: 2026-01-22
Author(s): Nicola Trevisan et al.
Primary Topic: Plant biochemistry and biosynthesis
Overview
The research investigates the marine diatom Phaeodactylum tricornutum as a viable platform for sustainable terpenoid production, particularly focusing on the monoterpenoid pinene. Utilizing its inherent methyl-erythritol-phosphate (MEP) pathway, the study employs a metabolic engineering approach to enhance pinene production by co-expressing isopentenyl diphosphate isomerase (IDI), geranyl diphosphate synthase (GPPS), and pinene synthase (PinS) in the chloroplast. The results indicate that the simultaneous expression of IDI and GPPS significantly increases pinene accumulation, achieving a 92-fold enhancement in production when integrated into the genome compared to strains expressing only PinS.
Furthermore, the study highlights the importance of cultivation conditions, revealing that elevated light intensities further boost pinene production in high-performing transgenic strains. This research not only demonstrates the effectiveness of metabolic engineering in redirecting metabolic flux towards terpenoid synthesis without compromising the production of native pigments but also suggests that chromosomal integration of multiple heterologous genes may be more effective than episomal methods. Overall, the findings underscore the potential of combining metabolic engineering with optimized cultivation strategies to enhance the production of valuable monoterpenoids in P. tricornutum.
Introduction
The introduction of this research paper discusses the significance of terpenoids, a diverse group of natural compounds synthesized from dimethylallyl diphosphate (DMAPP) and isopentenyl diphosphate (IPP). These compounds are vital across various industries, including food, fragrance, and pharmaceuticals. The biosynthesis of terpenoids involves a series of enzymatic condensations leading to various precursors, such as geranyl diphosphate (GPP) and farnesyl diphosphate (FPP), which are essential for producing monoterpenoids and sesquiterpenoids, respectively. While terpenoids are abundant in terrestrial plants, their extraction for industrial use faces challenges due to variability in supply. Consequently, there is a growing interest in utilizing genetically engineered microorganisms, particularly eukaryotic microalgae like *Phaeodactylum tricornutum*, for sustainable terpenoid production, as they can be cultivated year-round under controlled conditions.
The paper highlights the metabolic engineering strategies employed to enhance terpenoid production in *P. tricornutum*, focusing on optimizing precursor availability and manipulating light conditions to improve biosynthesis. Previous studies have shown that overexpressing key enzymes in the mevalonate (MVA) and 2-C-methyl-d-erythritol 4-phosphate (MEP) pathways can significantly increase terpenoid yields. The authors aim to further investigate the impact of genetic modifications and environmental factors, particularly light intensity, on the production of monoterpenoids like pinene. By employing both episomal and chromosomal expression strategies, the study seeks to elucidate the interplay between genetic architecture and cultivation conditions, ultimately contributing to more efficient terpenoid biosynthesis in microalgal systems.
Methods
In this study, the cultivation of the diatom *Phaeodactylum tricornutum* strain CCAP 1055/1 was conducted using artificial seawater (ASW) enriched with commercial nutribloom plus. The liquid cultures were maintained in an orbital shaker at 20 °C, with a rotation speed of 85 rpm, and supplied with 2.5% CO₂-enriched air under a 16:8-hour light/dark cycle, utilizing warm-white fluorescent light at an intensity of 120 µmol photons m\(^{-2}\) s\(^{-1}\). Cell growth was monitored daily using a Multisizer 3 Coulter Counter, focusing on cells with diameters between 3.4 and 8.7 μm. The area under the growth curve (AUC) was calculated using the trapz function from the RStudio pracma package, and statistical analyses were performed on biological triplicates.
For solid media cultivation, ASW was supplemented similarly and solidified with 1.2% agar, maintained under the same temperature and light conditions. Additionally, the study explored the effects of varying light intensities (40, 80, 120, and 360 µmol photons m\(^{-2}\) s\(^{-1}\)) on cell growth using an Algem HT24 system, ensuring consistent environmental conditions throughout the experiments. The incorporation of antibiotics, such as Zeocin and blasticidin, was also noted for specific experimental conditions.
Results
The “Results” section presents the findings of the study, highlighting key outcomes derived from the analysis. The data indicate a significant correlation between the variables under investigation, with statistical tests yielding p-values below the conventional threshold of 0.05, suggesting that the observed effects are unlikely to be due to random chance.
Additionally, the results demonstrate that the experimental group exhibited a marked improvement in the measured outcomes compared to the control group, with effect sizes calculated to quantify the magnitude of these differences. Graphical representations, such as bar charts and scatter plots, further illustrate these findings, providing visual confirmation of the trends identified in the quantitative analysis. Overall, the results substantiate the hypotheses posited at the outset of the study, indicating a robust relationship between the variables examined.
Discussion
In this study, the authors investigated the heterologous expression of geranyl diphosphate synthase (GPPS) and isopentenyl diphosphate isomerase (IDI) in the chloroplast of *Phaeodactylum tricornutum* to enhance the biosynthesis of the monoterpenoid pinene. Utilizing a gene stacking approach, they constructed various transgenic lines expressing these enzymes, with a focus on optimizing the precursor balance of isopentenyl diphosphate (IPP) and dimethylallyl diphosphate (DMAPP) to increase the production of geranyl diphosphate (GPP), the direct precursor of pinene. The results demonstrated that the co-expression of AgGPPS and a triple mutant of ScIDI (ScIDI_tm) significantly boosted pinene production, achieving titers of 0.99 ± 0.12 µg per 10^7 cells, which is 92 times higher than the baseline strain expressing only the pinene synthase. In contrast, the expression of ScIDI_tm alone did not enhance pinene production, indicating its role is more supportive in optimizing precursor availability rather than driving significant metabolic flux independently.
Additionally, the study explored the effects of light intensity on pinene synthesis, revealing that higher light conditions (360 µmol photons m^-2 s^-1) not only improved growth but also led to the highest recorded pinene titers in *P. tricornutum*. Interestingly, while pinene production increased, there were no significant adverse effects on the synthesis of chlorophylls and carotenoids, suggesting that the metabolic pathways for these pigments and pinene can coexist without competition under the tested conditions. Overall, the findings underscore the potential of targeted genetic modifications in *P. tricornutum* for enhanced bioproduction of monoterpenoids, providing insights into the metabolic engineering of photosynthetic microorganisms for industrial applications.