الهندسة المتسارعة للإنزيمات بواسطة التعبير الخالي من الخلايا الموجه بتعلم الآلة

النتائج

استكشاف مشهد التخليق البيوكاتاليتيكي لـ McbA

هندسة البروتين الخالي من الخلايا لفحص مكتبات البروتين المعرفة بالتسلسل بسرعة

مع تحديد التحولات الكيميائية المحددة من تقييمنا لتنوع الركيزة الإنزيمية، أردنا بعد ذلك توليد كميات كبيرة من بيانات علاقة التسلسل-الوظيفة لإنزيمات McbA الطافرة لتدريب نماذج ML للتنبؤ بالمتغيرات عالية النشاط.

تعبير خالي من الخلايا موجه بواسطة ML لهندسة البروتين

تم تقييم أداء توقع النموذج أولاً باستخدام المكسب التراكمي المخفض المنظم (NDCG) مقياس تقييم يقيم النماذج بناءً على قدرتها على تصنيف المتغيرات عالية اللياقة بشكل صحيح (متماشياً مع هدفنا التجريبي في اكتشاف المتغيرات عالية اللياقة مع الحد الأدنى من عبء الفحص)، والذي تطابق بشكل عام مع النتائج من معامل ارتباط سبيرمان (الشكل S15). تفوقت النماذج المعززة على نموذج الانحدار المتدرج وحده عند تقييمها باستخدام NDCG. كما حاولنا دمج المتنبئين في ميزات المتغيرات لدينا (مثل التنبؤات من كل من ESM-1b و EVmutation)، لكن لم يُلاحظ أي زيادة في أداء النموذج. أخيرًا، اختبرنا ضرورة مجموعة بيانات تشبع الموقع بالكامل ( ) لتدريب النماذج لتحقيق أداء تنبؤي عالٍ ولتقييم ما إذا كانت مجموعات البيانات الأصغر المستخدمة عادة في هندسة البروتين ستكون كافية. لقد احتفظنا بالمتغيرات في مجموعة التدريب لتعكس استراتيجيات هندسة البروتين الشائعة التي لا تبحث بشكل شامل في فضاء التسلسل، بما في ذلك مكتبات الكودون المخفضة (NDT و NRT مسحات الأحماض الأمينية الفردية (هنا، نجمع بين المسحات الشائعة لاستخدام الجلايسين، الألانين، البرولين، والسيستين)، والأبجديات المختصرة التي تجمع بشكل طبيعي الأحماض الأمينية حسب الخصائص الفيزيائية والكيميائية (BLOSUM عند تدريب نفس نموذج الانحدار ال Ridge المعزز باستخدام ترميزات جورجييف، أشار هذا التحليل إلى أن استخدام جميع البيانات المجمعة من مجموعة بيانات تشبع الموقع يوفر قوة تنبؤية أكبر (الشكل 4A، B). يمكن أن يُعزى ذلك على الأرجح إلى طبيعة مجموعات البيانات الغنية التي تحتوي في الغالب على طفرات ذات نشاط غير صفري (64/77 للموكلاوبيميد و62/77 للميتوكلوبراميد)، مما يمنع وجود “ثغرات” في مجموعات التدريب. المضي قدمًا، قررنا استخدام مجموعة بيانات تشبع الموقع ونموذج EVmutation المعزز مع ترميزات جورجييف نظرًا للأداء التنبؤي القوي بين كلاهما.

الشكل 3 | توليد سريع لبيانات مشهد ملاءمة التسلسل لتوجيه التطور الموجه لـ McbA باستخدام التعلم الآلي. مخطط سير العمل: يتم تدريب نموذج الانحدار الخطي المراقب على بيانات نسبة التحويل لأربعة مواقع قابلة للتغيير تم اختيارها من HSS، مع ميزات التسلسل التي تتكون من ترميز الأحماض الأمينية معززة بتوقع بدون تدريب لملاءمة الإنزيم. من مجموعة تدريب من نستنتج من الطفرات الفردية الطفرات ذات الرتبة الأعلى ونختبر أعلى 25 توقعًا. تم مقارنة اختيار الصفر مع جميع استراتيجيات الترميز (يظهر جورجييف) و
مرتبة حسب NDCG. شاشة النقاط الساخنة لـ 64 بقايا محددة في McbA تظهر نسبة التحويل المئوية للتغير موكلوبيميد ميتوكلوبراميد، ودي سينشوكائين تم تطبيعهما إلى WT ; يشير اللون الأزرق إلى نسبة تحويل منخفضة، بينما يشير اللون الأحمر إلى نسبة تحويل عالية). تم تمييز أعلى أربعة مواقع قابلة للتغيير، أو النقاط الساخنة، باللون البرتقالي وعليها نجوم. تُستخدم هذه المواقع كمجموعة تدريب للتحقق من النموذج. تم تقديم نتائج التحقق الكاملة في الشكل S15. تم توفير بيانات المصدر كملف بيانات مصدر.

تنويع البيوكاتاليست المدعوم بالذكاء الاصطناعي للأدوية عالية القيمة

قمنا أيضًا بمقارنة مدى كفاءة بعض متغيرات الإنزيم في أداء كل خطوة من خطوات التفاعل (الشكل S24). على سبيل المثال، يبدو أن wt-McbA بارع في خطوة الأدينيلation لدواء التروكسيبيد (الأدينيلating 3,4,5-trimethoxybenzoic acid)، لكنه غير قادر على تحفيز تكوين رابطة الأميد (الشكل 5G). يمكن لمتغير الإنزيم المهندَس بعد ذلك قبول الأمين، مما يؤدي إلى انخفاض كبير في الوسط الملحوظ. بشكل غير متوقع، كانت متغيرات McbA المهندَسة لكل منتج مستهدف

نقاش

طرق

تجميع الحمض النووي الخالي من الخلايا والتعبير الجيني

تعبير وتنقية البروتينات المؤتلفة

اختبار نشاط muGFP

اختبار نشاط أميد سينثيتاز

اختبار تخليق الأميد وتجديد ATP

التحضير على نطاق واسع لتخليق الموكليبيميد

تحليلات LC-MS

تحديد درجة انصهار

حركيات الإنزيمات

ترميزات الأحماض الأمينية

تنبؤات بدون تدريب مسبق

التطور الموجه المدعوم بتعلم الآلة

جمع البيانات وتحليلها

ملخص التقرير

توفر البيانات

توفر الشيفرة

References

1. Schwander, T., von Borzyskowski, L. S., Burgener, S., Cortina, N. S. & Erb, T. J. A synthetic pathway for the fixation of carbon dioxide in vitro. Science 354, 900-904 (2016).
2. Sarai, N. S. et al. Directed evolution of enzymatic silicon-carbon bond cleavage in siloxanes. Science 383, 438-443 (2024).
3. Fryszkowska, A. et al. A chemoenzymatic strategy for site-selective functionalization of native peptides and proteins. Science 376, 1321-1327 (2022).
4. Arnold, F. H. Design by directed evolution. Acc. Chem. Res 31, 125-131 (1998).
5. Packer, M. S. & Liu, D. R. Methods for the directed evolution of proteins. Nat. Rev. Genet 16, 379-394 (2015).
6. Miton, C. M. & Tokuriki, N. How mutational epistasis impairs predictability in protein evolution and design. Protein Sci. 25, 1260-1272 (2016).
7. Rix, G. et al. Scalable continuous evolution for the generation of diverse enzyme variants encompassing promiscuous activities. Nat. Commun. 11, 5644 (2020).
8. Kalvet, I. et al. Design of heme enzymes with a tunable substrate binding pocket adjacent to an open metal coordination site. J. Am. Chem. Soc. 145, 14307-14315 (2023).
9. Chu, A. E., Lu, T. & Huang, P.-S. Sparks of function by de novo protein design. Nat. Biotechnol. 42, 203-215 (2024).
10. Yeh, A. H.-W. et al. De novo design of luciferases using deep learning. Nature 614, 774-780 (2023).
11. Yang, K. K., Wu, Z. & Arnold, F. H. Machine-learning-guided directed evolution for protein engineering. Nat. Methods 16, 687-694 (2019).
12. Freschlin, C. R., Fahlberg, S. A. & Romero, P. A. Machine learning to navigate fitness landscapes for protein engineering. Curr. Opin. Biotech. 75, 102713 (2022).
13. Zhang, S. et al. EvoAI enables extreme compression and reconstruction of the protein sequence space. Res. Sq. rs.3.rs-3930833. https://doi.org/10.21203/rs.3.rs-3930833/v1 (2024).
14. Wittmann, B. J., Yue, Y. & Arnold, F. H. Informed training set design enables efficient machine learning-assisted directed protein evolution. Cell Syst. 12, 1026-1045.e7 (2021).
15. Bell, E. L. et al. Directed evolution of an efficient and thermostable PET depolymerase. Nat. Catal. 5, 673-681 (2022).
16. Silverman, A. D., Karim, A. S. & Jewett, M. C. Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications. Nat. Rev. Genet. 21, 151-170 (2020).
17. Karim, A. S. et al. In vitro prototyping and rapid optimization of biosynthetic enzymes for cell design. Nat. Chem. Biol. 16, 912-919 (2020).
18. Hunt, A. C. et al. A rapid cell-free expression and screening platform for antibody discovery. Nat. Commun. 14, 3897 (2023).
19. Hunt, A. C. et al. Multivalent designed proteins neutralize SARS-CoV-2 variants of concern and confer protection against infection in mice. Sci. Transl. Med. 14, eabn1252-eabn1252 (2022).
20. Rapp, J. T., Bremer, B. J. & Romero, P. A. Self-driving laboratories to autonomously navigate the protein fitness landscape. Nat. Chem. Eng. 1, 97-107 (2024).
21. Fallah-Araghi, A., Baret, J.-C., Ryckelynck, M. & Griffiths, A. D. A completely in vitro ultrahigh-throughput droplet-based microfluidic screening system for protein engineering and directed evolution. Lab Chip 12, 882-891 (2012).
22. Ao, Y. et al. Structure- and data-driven protein engineering of transaminases for improving activity and stereoselectivity. Angew. Chem. Int. Ed. 62, e202301660 (2023).
23. Yu, T. et al. Enzyme function prediction using contrastive learning. Science 379, 1358-1363 (2023).
24. Wang, X. et al. Multi-modal deep learning enables efficient and accurate annotation of enzymatic active sites. Nat. Commun. 15, 7348 (2024).
25. Pattabiraman, V. R. & Bode, J. W. Rethinking amide bond synthesis. Nature 480, 471-479 (2011).
26. Bryan, M. C. et al. Key Green Chemistry research areas from a pharmaceutical manufacturers’ perspective revisited. Green. Chem. 20, 5082-5103 (2018).
27. Boström, J., Brown, D. G., Young, R. J. & Keserü, G. M. Expanding the medicinal chemistry synthetic toolbox. Nat. Rev. Drug Discov. 17, 709-727 (2018).
28. Sabatini, M. T., Boulton, Lee, T., Sneddon, H. F. & Sheppard, T. D. A green chemistry perspective on catalytic amide bond formation. Nat. Catal. 2, 10-17 (2019).
29. Lubberink, M., Finnigan, W. & Flitsch, S. L. Biocatalytic amide bond formation. Green Chem. https://doi.org/10.1039/d3gc00456b (2023).
30. Wu, S., Snajdrova, R., Moore, J. C., Baldenius, K. & Bornscheuer, U. T. Biocatalysis: enzymatic synthesis for industrial applications. Angew. Chem. Int. Ed. 60, 88-119 (2021).
31. Winn, M. et al. Discovery, characterization and engineering of ligases for amide synthesis. Nature 593, 391-398 (2021).
32. Schnepel, C. et al. Thioester-mediated biocatalytic amide bond synthesis with in situ thiol recycling. Nat. Catal. 6, 89-99 (2023).
33. Petchey, M. et al. The broad aryl acid specificity of the amide bond synthetase mcba suggests potential for the biocatalytic synthesis of amides. Angew. Chem. Int. Ed. 57, 11584-11588 (2018).
34. Chen, Q. et al. Discovery of McbB, an enzyme catalyzing the carboline skeleton construction in the marinacarboline biosynthetic Pathway. Angew. Chem. Int. Ed. 52, 9980-9984 (2013).
35. Tang, Q. et al. Broad spectrum enantioselective amide bond synthetase from Streptoalloteichus hindustanus. ACS Catal. 14, 1021-1029 (2024).
36. Petchey, M. R., Rowlinson, B., Lloyd, R. C., Fairlamb, I. J. S. & Grogan, G. Biocatalytic synthesis of moclobemide using the amide bond synthetase McbA coupled with an ATP recycling system. ACS Catal. 10, 4659-4663 (2020).
37. Jewett, M. C. & Swartz, J. R. Mimicking the Escherichia coli cytoplasmic environment activates long-lived and efficient cell-free protein synthesis. Biotechnol. Bioeng. 86, 19-26 (2004).
38. Scott, D. J. et al. A novel ultra-stable, monomeric green fluorescent protein for direct volumetric imaging of whole organs using CLARITY. Sci. Rep.-uk 8, 667 (2018).
39. Yong, K. J. & Scott, D. J. Rapid directed evolution of stabilized proteins with cellular high-throughput encapsulation solubilization and screening (CHESS). Biotechnol. Bioeng. 112, 438-446 (2015).
40. Pédelacq, J.-D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C. & Waldo, G. S . Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nat. Biotechnol. 24, 79-88 (2006).
41. Hsu, C., Nisonoff, H., Fannjiang, C. & Listgarten, J. Learning protein fitness models from evolutionary and assay-labeled data. Nat. Biotechnol. 1-9. https://doi.org/10.1038/s41587-021-01146-5 (2022).
42. Georgiev, A. G. Interpretable numerical descriptors of amino acid space. J. Comput Biol. 16, 703-723 (2009).
43. Mei, H., Liao, Z. H., Zhou, Y. & Li, S. Z. A new set of amino acid descriptors and its application in peptide QSARs. Pept. Sci. 80, 775-786 (2005).
44. Sandberg, M., Eriksson, L., Jonsson, J., Sjöström, M. & Wold, S. New chemical descriptors relevant for the design of biologically active peptides. a multivariate characterization of 87 amino acids. J. Med Chem. 41, 2481-2491 (1998).
45. Barley, M. H., Turner, N. J. & Goodacre, R. Improved descriptors for the quantitative structure-activity relationship modeling of peptides and proteins. J. Chem. Inf. Model 58, 234-243 (2018).
46. Rives, A. et al. Biological structure and function emerge from scaling unsupervised learning to 250 million protein sequences. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 118, e2016239118 (2021).
47. Hopf, T. A. et al. Mutation effects predicted from sequence covariation. Nat. Biotechnol. 35, 128-135 (2017).
48. Laimer, J., Hofer, H., Fritz, M., Wegenkittl, S. & Lackner, P. MAESTRO -multi agent stability prediction upon point mutations. BMC Bioinform. 16, 116 (2015).
49. Järvelin, K. & Kekäläinen, J. Cumulated gain-based evaluation of IR techniques. ACM Trans. Inf. Syst. (TOIS) 20, 422-446 (2002).
50. Reetz, M. T., Kahakeaw, D. & Lohmer, R. Addressing the numbers problem in directed evolution. Chembiochem 9, 1797-1804 (2008).
51. Aslan, A. S., Birmingham, W. R., Karagüler, N. G., Turner, N. J. & Binay, B. Semi-rational design of Geobacillus stearothermophilus L-lactate dehydrogenase to access various chiral -hydroxy acids. Appl. Biochem. Biotech. 179, 474-484 (2016).
52. Gray, V. E., Hause, R. J. & Fowler, D. M. Analysis of large-scale mutagenesis data to assess the impact of single amino acid substitutions. Genetics 207, 53-61 (2017).
53. Murphy, L. R., Wallqvist, A. & Levy, R. M. Simplified amino acid alphabets for protein fold recognition and implications for folding. Protein Eng. Des. Sel. 13, 149-152 (2000).
54. O’Kane, P. T., Dudley, Q. M., McMillan, A. K., Jewett, M. C. & Mrksich, M. High-throughput mapping of CoA metabolites by SAMDI-MS to optimize the cell-free biosynthesis of HMG-CoA. Sci. Adv. 5, eaaw9180 (2019).
55. Goldenzweig, A. et al. Automated structure- and sequence-based design of proteins for high bacterial expression and stability. Mol. Cell 63, 337-346 (2016).
56. Mansoor, S., Baek, M., Juergens, D., Watson, J. L. & Baker, D. Zeroshot mutation effect prediction on protein stability and function using RoseTTAFold. Protein Science. 32, e4780 (2023).
57. Biswas, S., Khimulya, G., Alley, E. C., Esvelt, K. M. & Church, G. M. Low-N protein engineering with data-efficient deep learning. Nat. Methods 18, 389-396 (2021).
58. Lauko, A. et al. Computational design of serine hydrolases. bioRxiv 2024.08.29.610411. https://doi.org/10.1101/2024.08.29. 610411 (2024).
59. Kightlinger, W. et al. Design of glycosylation sites by rapid synthesis and analysis of glycosyltransferases. Nat. Chem. Biol. 14, 627-635 (2018).
60. Gibson, D. G. et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat. Methods 6, 343-345 (2009).
61. Kwon, Y.-C. & Jewett, M. C. High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis. Sci. Rep. 5, 8663 (2015).
62. Jewett, M. C., Calhoun, K. A., Voloshin, A., Wuu, J. J. & Swartz, J. R. An integrated cell-free metabolic platform for protein production and synthetic biology. Mol. Syst. Biol. 4, 220-220 (2008).
63. Jewett, M. C. & Swartz, J. R. Substrate replenishment extends protein synthesis with an in vitro translation system designed to mimic the cytoplasm. Biotechnol. Bioeng. 87, 465-471 (2004).
64. Tavanti, M., Hosford, J., Lloyd, R. C. & Brown, M. J. B. ATP regeneration by a single polyphosphate kinase powers multigram-scale aldehyde synthesis in vitro. Green Chem. 23, 828-837 (2020).
65. Lavayssiere, M. & Lamaty, F. Amidation by reactive extrusion for the synthesis of active pharmaceutical ingredients teriflunomide and moclobemide. Chem. Commun. 59, 3439-3442 (2023).
66. Vornholt, T. et al. Systematic engineering of artificial metalloenzymes for new-to-nature reactions. Sci. Adv. 7, eabe4208 (2021).
67. Hellberg, S., Sjoestroem, M., Skagerberg, B. & Wold, S. Peptide quantitative structure-activity relationships, a multivariate approach. J. Med Chem. 30, 1126-1135 (1987).
68. Pettersen, E. F. et al. UCSF ChimeraX: structure visualization for researchers, educators, and developers. Protein Sci. 30, 70-82 (2021).
69. Zubi, Y. S. et al. Metal-responsive regulation of enzyme catalysis using genetically encoded chemical switches. Nat. Commun. 13, 1864 (2022).
70. Landwehr, G. et al. Accelerated enzyme engineering by machinelearning guided cell-free expression. accelerated-enzymeengineering. https://doi.org/10.5281/zenodo. 14262332 (2024).
71. Alford, R. F. et al. The Rosetta all-atom energy function for macromolecular modeling and design. J. Chem. Theory Comput. 13, 3031-3048 (2017).

شكر وتقدير

مساهمات المؤلفين

المصالح المتنافسة

معلومات إضافية

Accelerated enzyme engineering by machine-learning guided cell-free expression

Results

Exploring the biocatalytic synthesis landscape of McbA

Cell-free protein engineering to rapidly screen sequence-defined protein libraries

With specific chemical transformations identified from our evaluation of enzymatic substrate promiscuity, we next wanted to quickly generate large amounts of sequence-function relationship data of mutant McbA enzymes for training ML models to predict high-activity variants.

ML-guided, cell-free expression for protein engineering

Model prediction performance was first evaluated using the normalized discounted cumulative gain (NDCG) , an evaluation metric that scores models on their ability to correctly rank highfitness variants (aligning with our experimental goal of discovering high-fitness variants with minimal screening burden), which generally matched results from the Spearman rank correlation coefficient (Fig. S15). The augmented models outperformed the ridge regression model alone when evaluated with NDCG. We also tried combining predictors in our variant features (e.g., predictions from both ESM-1b and EVmutation), but no increase in model performance was observed. Lastly, we tested the necessity of the entire site saturation dataset ( ) for training models to achieve high predictive performance and to evaluate whether smaller datasets commonly used in protein engineering would be sufficient. We withheld variants in the training set to reflect common protein engineering strategies that do not exhaustively search the sequence space, including reduced codon libraries (NDT and NRT ), single amino acid scans (here, we combine the commonly used glycine, alanine, proline, and cysteine scans), and reduced alphabets that naturally group amino acids by physiochemical properties (BLOSUM ). When training the same augmented ridge regression model with Georgiev encodings, this analysis indicated that utilizing all the data gathered from the site saturation dataset provides more predictive power (Fig. 4A, B). This can likely be attributed to the nature of the rich datasets mostly containing mutants with non-zero activity (64/77 for moclobemide and 62/77 for metoclopramide), preventing “holes” in training sets . Moving forward, we decided to use the site saturation dataset and the augmented EVmutation model with Georgiev encodings given the strong predictive performance among both

Fig. 3 | Rapid generation of sequence-fitness landscape data for ML-guided directed evolution of McbA. A Workflow schematic: a supervised ridge regression model is trained on percent conversion data of four mutable sites selected from the HSS, with sequence features consisting of an amino acid encoding augmented with a zero-shot prediction of enzyme fitness. From a training set of single mutants, we extrapolate higher order mutations and test the top 25 predictions. Zero shot selection was compared against all encoding strategies (Georgiev is shown) and
ranked by NDCG. Hot spot screen of 64 identified residues in McbA showing foldchange percent conversion of moclobemide, metoclopramide, and D cinchocaine normalized to WT ( ; blue indicates low percent conversion, red indicates high percent conversion). The top four highly mutable sites, or hot spots, are highlighted in orange and starred. They are used as the training set for model validation. Full validation results are provided in Fig. S15. Source data are provided as a Source Data file.

ML-guided biocatalytic diversification for high-value pharmaceuticals

We also compared how efficiently some enzyme variants perform each reaction step (Fig. S24). For example, wt-McbA appears to be proficient at the adenylation step for troxipide (adenylating 3,4,5-trimethoxybenzoic acid), but unable to catalyze amide bond formation (Fig. 5G). The engineered enzyme variant can subsequently accept the amine, leading to a large decrease in the observed intermediate. Serendipitously, the engineered McbA variants for each target product

Discussion

Methods

Cell-free DNA assembly and gene expression

Expression and purification of recombinant proteins

muGFP activity assay

Amide synthetase activity assay

Amide synthetase & ATP regeneration assay

Preparative scale biosynthesis of moclobemide