DOI: https://doi.org/10.3389/fimmu.2025.1719452
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/41601675
تاريخ النشر: 2026-01-12
المؤلف: De M وآخرون
الموضوع الرئيسي: أبحاث خلايا الجذع متعددة القدرات
نظرة عامة
تقدم البحث بروتوكولًا شاملاً لتفريق خلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات البشرية (hiPSCs) إلى ماكروفاجات وظيفية (iMacs)، معالجًا النقص الحالي في الطرق الفعالة والمتوافقة مع ممارسات التصنيع الجيدة (GMP). قامت الدراسة بتقييم منهجي لمختلف تركيبات الوسائط، تركيزات السيتوكينات، كثافات الزراعة، وأنظمة الثقافة (2D مقابل 3D) لتحسين عملية التفريق. شمل البروتوكول تشكيل أجسام جنينية (EBs) من خلال الاهتزاز في ثقافة ثلاثية الأبعاد، مما أدى إلى توليد سلالات دموية، والتي تم استقطابها لاحقًا إلى M1 أو M2 iMacs. تم تقييم عملية التفريق بدقة باستخدام قياس التدفق، ELISA لإفراز السيتوكينات، والتحليل المورفولوجي عبر صبغة ماي-غرونوالد جيمسا.
حقق البروتوكول المحسن نقاءً متوسطًا قدره 98% من iMacs القابلة للحياة ودرجة تفريق قدرها 250X من hiPSC واحد، مما يدل على قابلية التوسع والصلابة. تشير النتائج الرئيسية إلى أن ثقافة التعليق المعتمدة على EB أنتجت أعلى عدد من الخلايا، حيث كانت M-CSF حاسمة طوال عملية التفريق. بالإضافة إلى ذلك، عززت الظروف الخالية من المصفوفة وكثافات الزراعة المثلى بشكل كبير كفاءة تفريق الماكروفاجات. حافظ نظام ثقافة G-Rex على عوائد عالية خلال الانتقال من السلالات المكونة للدم إلى الماكروفاجات، مما يجعله مناسبًا للإنتاج على نطاق واسع. بشكل عام، يضع هذا العمل أساسًا قويًا لاستخدام الماكروفاجات المستمدة من hiPSC في الأبحاث المناعية والتطبيقات العلاجية المحتملة.
مقدمة
تسلط المقدمة الضوء على الدور المحوري للماكروفاجات في المناعة الفطرية، الالتهاب، واستتباب الأنسجة، مع التأكيد على وظيفتها المزدوجة كأهداف علاجية وقراءات خلوية في مختلف الأمراض، بما في ذلك السرطان والاضطرابات التنكسية العصبية. أظهرت ظهور علاجات مستقبلات المستضدات الهجينة (CAR)، وخاصة خلايا CAR-T وCAR-NK، وعدًا في علاج السرطان، ومع ذلك لا تزال التحديات مثل متلازمة إطلاق السيتوكين والتجنب المناعي قائمة. تقدم CAR-macrophages (CAR-Macs) حلاً جديدًا، مستفيدة من قدرة الماكروفاجات الطبيعية على التسلل إلى الأورام والقدرات البلعومية لمعالجة هذه التحديات، بينما تظهر أيضًا إمكانات في علاج الأمراض غير الورمية.
لتسهيل الإنتاج على نطاق واسع من الماكروفاجات الوظيفية للتطبيقات العلاجية، يُقترح استخدام خلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات البشرية (hiPSCs). توفر hiPSCs قدرة غير محدودة على التكاثر والتفريق، وتعزز متغيراتها المتجانسة HLA التوافق المناعي للعلاجات الألوغينية. تناقش المقدمة الانتقال من أنظمة الثقافة التقليدية ثنائية الأبعاد إلى استراتيجيات قائمة على الأجسام الجنينية (EB) ثلاثية الأبعاد، والتي تحاكي الظروف الفسيولوجية بشكل أفضل وتحسن كفاءة التفريق. ومع ذلك، لا تزال التحديات مثل إجهاد القص السائل وانتشار المغذيات في المفاعلات الحيوية قائمة. يقترح المؤلفون بروتوكولًا قابلًا للتوسع وخاليًا من الزرع يدمج الثقافة ثلاثية الأبعاد مع نظام Gas-permeable Rapid Expansion (G-Rex) لتحسين تفريق hiPSCs إلى ماكروفاجات وظيفية، مما يضمن ملاءمتها لكل من الأبحاث والتطبيقات السريرية.
طرق
تحدد قسم “المواد والطرق” تصميم التجربة والإجراءات المستخدمة في الدراسة. يوضح المواد المحددة المستخدمة، بما في ذلك أي مواد كيميائية، معدات، وعينات بيولوجية، بالإضافة إلى مصادرها وطرق تحضيرها. يصف القسم أيضًا المنهجيات المطبقة لجمع البيانات وتحليلها، مما يضمن إمكانية إعادة الإنتاج والشفافية في عملية البحث.
بالإضافة إلى ذلك، قد يتضمن القسم معلومات حول التقنيات الإحصائية المستخدمة لتفسير البيانات، مثل اختبار الفرضيات أو تحليل الانحدار، جنبًا إلى جنب مع أي أدوات برمجية مستخدمة. بشكل عام، يعد هذا القسم حاسمًا لفهم الإطار التجريبي والتحقق من النتائج المقدمة في الدراسة.
نتائج
في هذه الدراسة، هدفنا إلى تحسين إنتاج الماكروفاجات المستقطبة M1 من خلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs) من خلال بروتوكول مناسب للإنتاج القابل للتوسع والمتوافق مع ممارسات التصنيع الجيدة (GMP) للتطبيقات السريرية. ركز نهجنا على هدفين رئيسيين: أولاً، تطوير بروتوكول خالٍ من المغذيات باستخدام وسائط ومواد خالية من الزرع المتاحة في تركيبات GMP؛ ثانيًا، تكييف كل مرحلة إنتاج إما للنمو في التعليق، مما يسهل قابلية التوسع في مفاعلات الاهتزاز ثلاثية الأبعاد، أو الالتصاق على أسطح غير مطلية، مما يمكّن من قابلية التوسع في مفاعلات من نوع G-Rex.
بالإضافة إلى ذلك، حددنا كثافات الزراعة المثلى اللازمة لتحقيق أعلى درجة توسع مع تقليل مساحة سطح الثقافة وحجم الوسائط. هذه النتائج حاسمة لإنشاء عملية تصنيع قابلة للتطبيق وفعالة للماكروفاجات المستقطبة M1، مما يعزز الإمكانية لتطبيقها في الدراسات السريرية.
مناقشة
في هذه الدراسة، نجح المؤلفون في إنشاء وتحسين بروتوكول قابل للتوسع لتفريق خلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات البشرية (hiPSCs) إلى ماكروفاجات وظيفية عبر خلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs) والسلالات المكونة للدم (MPs). باستخدام ثلاثة خطوط hiPSC متجانسة من الدرجة السريرية، حددوا الظروف المثلى لكل مرحلة تفريق، بما في ذلك استخدام طلاءات محددة، تركيبات الوسائط، وكثافات الزراعة. من الجدير بالذكر أن دمج الثقافة الخلوية ثلاثية الأبعاد مع منصة G-Rex تم تسليط الضوء عليه كتحسين كبير، مما يسهل الإنتاج على نطاق واسع مع الحفاظ على الصلة الفسيولوجية في عملية التفريق.
تشير النتائج إلى أن تفريق HSCs إلى MPs هو الأكثر كفاءة في بيئة الثقافة ثلاثية الأبعاد، خاصة عند استخدام كثافة زراعة محددة قدرها 25,000 CD34+ HSCs جنبًا إلى جنب مع الأجسام الجنينية (EBs). علاوة على ذلك، تم تحسين الانتقال من MPs إلى ماكروفاجات M0 في كل من الإعدادات ثنائية وثلاثية الأبعاد، حيث أظهر نظام G-Rex أداءً متفوقًا. أظهرت الماكروفاجات الناتجة M0 تعبيرًا عاليًا عن علامات السطح الرئيسية وقدرات وظيفية، بما في ذلك إنتاج السيتوكينات والبلعمة، مما يؤكد إمكاناتها للتطبيقات العلاجية. بشكل عام، تسهم هذه الأبحاث في تطوير مصادر موثوقة من الماكروفاجات من الدرجة السريرية لمختلف تطبيقات العلاج الخلوي، مع معالجة تحديات الرفض الألوغيني وتعزيز الاستمرارية في الجسم الحي من خلال استراتيجيات مطابقة HLA.
DOI: https://doi.org/10.3389/fimmu.2025.1719452
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/41601675
Publication Date: 2026-01-12
Author(s): De M et al.
Primary Topic: Pluripotent Stem Cells Research
Overview
The research presents a comprehensive protocol for differentiating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) into functional macrophages (iMacs), addressing the current lack of efficient and GMP-compatible methods. The study systematically evaluated various media compositions, cytokine concentrations, seeding densities, and culture regimens (2D vs. 3D) to optimize the differentiation process. The protocol involved the formation of embryoid bodies (EBs) through agitation in a 3D culture, leading to the generation of hematopoietic progenitors, which were subsequently polarized into M1 or M2 iMacs. The differentiation process was rigorously assessed using flow cytometry, ELISA for cytokine secretion, and morphological analysis via May-Grünwald Giemsa staining.
The optimized protocol achieved a mean purity of 98% viable iMacs and a differentiation fold of 250X from a single hiPSC, demonstrating scalability and robustness. Key findings indicate that the EB-based suspension culture yielded the highest cell numbers, with M-CSF being crucial throughout the differentiation. Additionally, matrix-free conditions and optimal seeding densities significantly enhanced macrophage differentiation efficiency. The G-Rex culture system maintained high yields during the transition from myeloid progenitors to macrophages, making it suitable for large-scale production. Overall, this work lays a solid foundation for utilizing hiPSC-derived macrophages in immunological research and potential therapeutic applications.
Introduction
The introduction highlights the pivotal role of macrophages in innate immunity, inflammation, and tissue homeostasis, emphasizing their dual function as therapeutic targets and cellular readouts in various diseases, including cancer and neurodegenerative disorders. The emergence of chimeric antigen receptor (CAR) therapies, particularly CAR-T and CAR-NK cells, has shown promise in cancer treatment, yet challenges such as cytokine release syndrome and immune evasion persist. CAR-macrophages (CAR-Macs) present a novel solution, leveraging macrophages’ natural tumor infiltration and phagocytic capabilities to address these challenges, while also showing potential in treating non-tumor diseases.
To facilitate the large-scale production of functional macrophages for therapeutic applications, the use of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) is proposed. hiPSCs offer unlimited proliferation and differentiation potential, and their HLA-homozygous variants enhance immunocompatibility for allogenic therapies. The introduction discusses the transition from traditional 2D culture systems to 3D embryoid body (EB)-based strategies, which better mimic physiological conditions and improve differentiation efficiency. However, challenges such as fluid shear stress and nutrient diffusion in bioreactors remain. The authors propose a scalable, xeno-free protocol that integrates 3D culture with the Gas-permeable Rapid Expansion (G-Rex) system to optimize the differentiation of hiPSCs into functional macrophages, ensuring their suitability for both research and clinical applications.
Methods
The “Materials and Methods” section outlines the experimental design and procedures employed in the study. It details the specific materials used, including any reagents, equipment, and biological samples, as well as their sources and preparation methods. The section also describes the methodologies applied for data collection and analysis, ensuring reproducibility and transparency in the research process.
Additionally, the section may include information on the statistical techniques utilized to interpret the data, such as hypothesis testing or regression analysis, along with any software tools employed. Overall, this section is crucial for understanding the experimental framework and validating the findings presented in the study.
Results
In this study, we aimed to optimize the production of M1 polarized macrophages from induced pluripotent stem cells (iPSCs) through a protocol suitable for scalable and Good Manufacturing Practice (GMP) compliant production for clinical applications. Our approach focused on two primary objectives: first, the development of a feeder-free protocol utilizing xeno-free media and reagents that are available in GMP formulations; second, the adaptation of each production stage for either suspension growth, facilitating scalability in 3D agitation bioreactors, or adhesion on non-coated surfaces, enabling scalability in G-Rex type bioreactors.
Additionally, we determined the optimal seeding densities necessary to achieve the highest expansion fold while minimizing the culture surface area and media volume. These findings are critical for establishing a feasible and efficient manufacturing process for M1 polarized macrophages, thereby enhancing the potential for their application in clinical studies.
Discussion
In this study, the authors successfully established and optimized a scalable protocol for differentiating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) into functional macrophages via hematopoietic stem cells (HSCs) and myeloid progenitors (MPs). Utilizing three clinical-grade HLA-homozygous hiPSC lines, they identified optimal conditions for each differentiation stage, including the use of specific coatings, media compositions, and seeding densities. Notably, the combination of 3D cell culture with the G-Rex platform was highlighted as a significant advancement, facilitating large-scale production while maintaining physiological relevance in the differentiation process.
The findings indicate that the differentiation of HSCs into MPs is most efficient in a 3D culture environment, particularly when utilizing a specific seeding density of 25,000 CD34+ HSCs alongside embryoid bodies (EBs). Furthermore, the transition from MPs to M0 macrophages was optimized in both 2D and 3D settings, with the G-Rex system demonstrating superior performance. The resulting M0 macrophages exhibited high expression of key surface markers and functional capabilities, including cytokine production and phagocytosis, confirming their potential for therapeutic applications. Overall, this research contributes to the development of reliable, clinical-grade macrophage sources for various cell therapy applications, addressing the challenges of allo-rejection and enhancing in vivo persistence through HLA-matching strategies.