DOI: https://doi.org/10.1038/s44259-025-00180-6
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/41629675
تاريخ النشر: 2026-02-02
المؤلف: Yoshiko Miyahara وآخرون
الموضوع الرئيسي: علم الوراثة البكتيرية والتكنولوجيا الحيوية
طرق
في هذه الدراسة، تم استخدام سلالات مختلفة من الإشريكية القولونية، بما في ذلك سلالة الإشريكية القولونية المسببة للعدوى البولية (UPEC) سلالة CFT073، وسلالة الإشريكية القولونية النزفية (EHEC) سلالة CIP 105917، وسلالة الإشريكية القولونية المعدلة في المختبر سلالة MG1655. تم تحويل هذه السلالات باستخدام بلازميد (pZA32-YFP) للتعبير عن بروتين فلوري أصفر (YFP) للتحليل المجهري وتحليل الصور. تم زراعة البكتيريا في وسط لوريا-بيرتاني (LB) ميلر أو وسط M9 الحد الأدنى عند 37 درجة مئوية حتى وصلت إلى مرحلة النمو الأسي، وبعد ذلك تم تخزين عينات منها عند -80 درجة مئوية في الجلسرين.
لبناء سلالات تقريرية، استخدم الباحثون طريقة معدلة تتضمن الجين λred القابل للتحفيز بواسطة الأرابينوز المحمل بواسطة البلازميد pKD46. تم زراعة سلالة CFT073 وتحفيزها لتسهيل الاندماجات الكروموسومية، تحديدًا rpoS-mCherry و tolC-mCherry، باستخدام منتجات PCR المعززة من pUC19. تم تأكيد الاندماجات من خلال النقل وإزالة كاسيتات مقاومة المضادات الحيوية باستخدام البلازميد pCP20. بالإضافة إلى ذلك، تم إنشاء طفرات حذف لـ rpoS عن طريق تعزيز كاسيت مقاومة الكاناميسين وتأكيد الحذف من خلال PCR. تم التحقق من جميع السلالات من خلال التسلسل والاختبارات الوظيفية لضمان الدقة في التعديلات الجينية.
نتائج
في هذه الدراسة، بحث المؤلفون في بقاء سلالة UPEC CFT073 استجابةً للأمبيسيلين، مقارنةً بسلوكها مع سلالة الإشريكية القولونية المعروفة جيدًا MG1655. وُجد أن الحد الأدنى من التركيز المثبط (MIC) للأمبيسيلين كان مشابهًا لكلا السلالتين (6.5 ± 1.6 ميكروغرام مل$^{-1}$ لـ CFT073 و 6.2 ± 1.7 ميكروغرام مل$^{-1}$ لـ MG1655، P > 0.05). أظهرت تجارب القتل الزمني أن CFT073 أظهرت تكرار بقاء مشابهًا لـ MG1655 عند تعرضها لـ 50 ميكروغرام مل$^{-1}$ من الأمبيسيلين. استخدمت الدراسة إعدادًا ميكروفلويديًا لتتبع ديناميات الخلايا الفردية، مما كشف أن CFT073 أظهرت حركيات انحلال ثنائية الطور بمعدلات 0.051 دقيقة$^{-1}$ خلال المرحلة المبكرة و 0.013 دقيقة$^{-1}$ خلال المرحلة المتأخرة من الانحلال.
على عكس الفكرة السائدة بأن “المستمرين” هم أساسًا خلايا بطيئة النمو أو غير نامية، أشارت النتائج إلى أن معظم الخلايا الباقية (20 من 24) كانت تنمو بنشاط قبل التعرض للمضاد الحيوي. بالإضافة إلى ذلك، لم تظهر الناجون اختلافات كبيرة في حجم الولادة مقارنةً بالذين لم ينجوا، ولم تكن نسلهم مقاومة للأمبيسيلين. تشير النتائج إلى أن الانتقال إلى حالة بطيئة النمو ليس ضروريًا ولا كافيًا للبقاء خلال علاج الأمبيسيلين، حيث لوحظت أنماط مشابهة في سلالة الإشريكية القولونية النزفية CIP 105917. بشكل عام، تتحدى هذه الأبحاث النماذج الحالية المتعلقة ببقاء البكتيريا وتبرز تعقيد تفاعلات المضادات الحيوية على مستوى الخلية الفردية.
مناقشة
تبحث الدراسة في تأثير α-methylglucoside (αMG) على نمو واستمرارية المضادات الحيوية لسلالة الإشريكية القولونية المسببة للعدوى البولية (UPEC) سلالة CFT073 في كل من الثقافات الدفعة وأنظمة الميكروفلويد. أدى إضافة αMG إلى تقليل معدل نمو CFT073 بشكل كبير، مما أدى إلى زيادة ملحوظة في الاستمرارية ضد الأمبيسيلين، مع زيادة معدلات البقاء بمقدار 250 إلى 700 مرة بعد التعرض المطول. بينما أشارت التحليلات على مستوى السكان إلى أن النمو البطيء مرتبط بمعدلات بقاء أعلى، كشفت الدراسات على مستوى الخلايا الفردية عن ارتباط ضئيل بين معدلات النمو الفردية ونتائج البقاء، مما يشير إلى أن آليات الاستمرارية أكثر تعقيدًا مما كان يُفهم سابقًا.
أظهر التحليل الإضافي أن مستويات RpoS، المرتبطة غالبًا باستجابات الإجهاد، لم ترتبط بالبقاء ضد الأمبيسيلين، حيث أظهر كل من الناجين وغير الناجين تعبيرًا مشابهًا لـ RpoS قبل التعرض للمضاد الحيوي. بالإضافة إلى ذلك، لم تؤثر نشاطات الطرد، على الرغم من ارتفاعها في الظروف التي تعزز النمو البطيء، بشكل كبير على بقاء الخلايا الفردية ضد الأمبيسيلين. تبرز الدراسة تباين استجابات البكتيريا للإجهاد الناتج عن المضادات الحيوية، مما يكشف أن كل من الخلايا النامية وغير النامية يمكن أن تظهر الاستمرارية، وتؤكد أهمية استخدام طرق استرداد أكثر لطفًا، مثل اختبار العدد الأكثر احتمالًا (MPN)، لتقييم بقاء البكتيريا بدقة بعد العلاج بالمضادات الحيوية. بشكل عام، تتحدى هذه النتائج الآراء التقليدية حول السكون والاستمرارية البكتيرية، مما يشير إلى أن الخلايا النامية بنشاط يمكن أن تساهم أيضًا في تحمل المضادات الحيوية.
DOI: https://doi.org/10.1038/s44259-025-00180-6
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/41629675
Publication Date: 2026-02-02
Author(s): Yoshiko Miyahara et al.
Primary Topic: Bacterial Genetics and Biotechnology
Methods
In this study, various strains of Escherichia coli, including uropathogenic E. coli (UPEC) strain CFT073, enterohemorrhagic E. coli (EHEC) strain CIP 105917, and lab-adapted E. coli strain MG1655, were utilized. These strains were transformed with a plasmid (pZA32-YFP) to express yellow fluorescent protein (YFP) for microscopy and image analysis. The bacteria were cultured in Luria-Bertani (LB) Miller medium or M9 minimal medium at 37 °C until they reached the exponential growth phase, after which aliquots were stored at -80 °C in glycerol.
To construct reporter strains, the researchers employed a modified method involving the arabinose-inducible λred gene carried by plasmid pKD46. The CFT073 strain was cultured and induced to facilitate chromosomal fusions, specifically rpoS-mCherry and tolC-mCherry, using PCR products amplified from pUC19. The fusions were confirmed through transduction and subsequent removal of antibiotic resistance cassettes using plasmid pCP20. Additionally, a deletion mutant of rpoS was created by amplifying a kanamycin resistance cassette and confirming the deletion through PCR. All strains were validated by sequencing and functional assays to ensure accuracy in the genetic modifications.
Results
In this study, the authors investigated the persistence of the UPEC strain CFT073 in response to ampicillin, comparing its behavior to the well-characterized E. coli strain MG1655. The minimum inhibitory concentration (MIC) of ampicillin was found to be similar for both strains (6.5 ± 1.6 μg ml$^{-1}$ for CFT073 and 6.2 ± 1.7 μg ml$^{-1}$ for MG1655, P > 0.05). Time-kill experiments demonstrated that CFT073 exhibited a survival frequency comparable to MG1655 when exposed to 50 μg ml$^{-1}$ ampicillin. The study employed a microfluidic setup to track single-cell dynamics, revealing that CFT073 displayed biphasic lysis kinetics with rates of 0.051 min$^{-1}$ during the early phase and 0.013 min$^{-1}$ during the late phase of lysis.
Contrary to the prevailing notion that “persisters” are primarily slow-growing or non-growing cells, the findings indicated that most surviving cells (20 out of 24) were actively growing prior to antibiotic exposure. Additionally, survivors did not exhibit significant differences in birth size compared to non-survivors, and their progeny were not resistant to ampicillin. The results suggest that a transition to a slow-growing state is neither necessary nor sufficient for survival during ampicillin treatment, as similar patterns were observed in the enterohemorrhagic E. coli strain CIP 105917. Overall, this research challenges existing paradigms regarding bacterial persistence and highlights the complexity of antibiotic interactions at the single-cell level.
Discussion
The research investigates the influence of α-methylglucoside (αMG) on the growth and antibiotic persistence of uropathogenic E. coli (UPEC) strain CFT073 in both batch cultures and microfluidic systems. The addition of αMG significantly reduced the growth rate of CFT073, resulting in a marked increase in persistence against ampicillin, with survival rates enhanced by 250 to 700-fold after prolonged exposure. While population-level analyses indicated that slower growth correlated with higher survival rates, single-cell studies revealed minimal correlation between individual growth rates and survival outcomes, suggesting that persistence mechanisms are more complex than previously understood.
Further analysis showed that RpoS levels, often associated with stress responses, did not correlate with survival against ampicillin, as both survivors and non-survivors exhibited similar RpoS expression prior to antibiotic exposure. Additionally, efflux activity, while elevated in conditions promoting slower growth, did not significantly impact individual cell survival against ampicillin. The study highlights the heterogeneity of bacterial responses to antibiotic stress, revealing that both growing and non-growing cells can exhibit persistence, and emphasizes the importance of using gentler recovery methods, such as the Most Probable Number (MPN) assay, to accurately assess bacterial survival post-antibiotic treatment. Overall, these findings challenge traditional views on bacterial dormancy and persistence, suggesting that actively growing cells can also contribute to antibiotic tolerance.