https://doi.org/10.1038/s41586-024-07752-y
تاريخ الاستلام: 28 أكتوبر 2022
تم القبول: 25 يونيو 2024
نُشر على الإنترنت: 24 يوليو 2024
الوصول المفتوح

نتيجة مرغوبة من العلاج المناعي للسرطان هي إنتاج مستضدات محددة للأورام الخلايا التائية السيتوليتية (CTLs) القادرة على تدمير الأورام. بينما يتم تعزيز تحفيز هذه الخلايا الفعالة غالبًا بواسطة ‘المساعدين’ خلايا يمكن أن يتم تثبيط هذه العملية بواسطة تنظيمي خلايا تشير الدراسات الحديثة إلى أن الأساليب التقليدية قد لا تكون الخلايا هي الوحيدة المثبطة للمناعة سكان خلايا T المقيمين في الأورام التي تنمو بشكل متزايد “، لكن تحديد أصول وطبيعة ووظيفة الأخيرة كان تحديًا. وقد وضع هذا قيودًا نظرية وعملية على العلاج المناعي للسرطان بشكل عام وعلى لقاحات النيوأنتيجين الخاصة بالسرطان بشكل خاص. قدرة CD4 تم إثبات أن خلايا Tr1 تحافظ على التسامح في المناعة الذاتية والعدوى المزمنة. وقد تم اقتراح أن تساهم في تثبيط المناعة المرتبطة بالسرطان ومع ذلك، لم يتم تعريف خلايا Tr1 بناءً على عامل النسخ الرئيسي، بل تم التعرف عليها على أنها خلايا مثبطة تنتج IL-10 وتكون سلبية لـ FOXP3. . هنا نستخدم نماذج ساركوما الفئران المتجانسة والمميزة لدينا لإظهار أنه، بينما تعزز لقاحات المستضدات الجديدة (SLP) الاصطناعية التي تحتوي على مستضدات جديدة محددة للورم من نوع MHC-I ومدخلات منخفضة من مستضدات جديدة محددة للورم من نوع MHC-II بشكل فعال رفض الورم، فإن اللقاحات المماثلة
التعبير عن كميات كبيرة من نفس مستضدات MHC-II الجديدة بشكل غير متوقع يؤدي إلى تثبيط المناعة خلايا متميزة عن الخلايا التي تثبط القضاء على الورم. نحن نميز هذه الخلايا كخلايا Tr1 سيتوليتية، ونقدم رؤى حول تطورها وآليات عملها، ونعتمد استراتيجيات لتجاوز نشاطها المثبط. نحن نظهر أيضًا أن هناك CD4 مشابهة يمكن العثور على مجموعة خلايا T في الأورام المتزايدة في الفئران حيث تصبح غير حساسة لعلاج anti-PD1 وفي المرضى البشر المصابين بالسرطان الذين يستجيبون بشكل ضعيف لعلاج نقاط التفتيش المناعية (ICT) ولقاحات السرطان. نحن نثبت أن القضاء على هذه الخلايا أو تثبيط وظيفتها يجعل العلاج المناعي للسرطان أكثر فعالية. وبالتالي، لا توثق هذه الدراسة فقط وظيفة جديدة لـ CD4 المعروف. تحت مجموعة خلايا T ولكنها توفر أيضًا استراتيجية لتجاوز تأثيراتها المثبطة على رفض الورم.

لقد حددنا سابقًا المستضدات الجديدة الفريدة من نوع MHC-I و MHC-II المعبر عنها في ثلاثة من خطوط ساركوما الميثيل كولانثرين (MCA) الخاصة بنا.

الشكل 1 | جرعات عالية من neoAg MHC-II تثبط فعالية اللقاحات SLP المضادة للورم وبعض ICTs. أ، نسبة بقاء الفئران الحاملة لورم T3 بعد العلاجات باستخدام لقاحات تحتوي على جرعات ثابتة (1.5 نانوغرام) من SLP mItgb1 بالإضافة إلى جرعات مختلفة من SLP mLama4/mAlg8 أو IrrVax. ب، نسبة بقاء الفئران الحاملة لورم T3 بعد العلاجات باستخدام لقاحات تحتوي على جرعات ثابتة من كل بالإضافة إلى جرعات مختلفة من mItgb1SLP.c، نسبة بقاء الفئران الحاملة لورم F244 بعد العلاج باللقاحات التي تحتوي على جرعات ثابتة من mPex14 SLP ( لكل فأر) بالإضافة إلى جرعات مختلفة من mPlec SLP. د، نسبة بقاء الفئران الحاملة للورم 1956 بعد العلاج باللقاحات التي تحتوي على جرعات ثابتة من لكل فأر) بالإضافة إلى جرعات مختلفة من mCs SLP أو IrrVax. الأرقام الموجودة فوق كل عمود تمثل عدد الفئران التي رفضت الأورام من إجمالي عدد الفئران المستخدمة.
(الجدول التكميلي 1) أظهر أن الرفض المناعي لكل ورم يعتمد على و استجابات الخلايا تجاه النيوأنتيجينات المعبر عنها بشكل فريد في كل خط ورمي، وأظهرت أيضًا أن الفعالية المثلى للرفض تتطلب وجود كل من النيوأنتيجينات MHC-I وMHC-II في الأورام واللقاحات. لقد أثارت اهتمامنا التأثيرات العميقة التي الخلايا كانت على المناعة الوقائية المعتمدة على الخلايا ضد ساركوما MCA التي لا تعبر عن بروتينات MHC-II، وبالتالي قررنا دراسة الاعتماد المتبادل بين استجابات neoAg لمستضدات MHC-I وMHC-II في تعزيز الفعالية المضادة للورم. اقتربنا من هذا السؤال من خلال تحديد جرعات neoAg لمستضدات MHC-I وMHC-II سواء بشكل منفرد أو معًا التي تحفز الفعالية المضادة للورم بشكل مثالي. كانت لقاحات SLP الخاصة بـ T3 التي تتكون فقط من MHC-I الخاص بـ T3 (G1254V mLama4 بالإضافة إلى A506T mAlg8) أو MHC-II (N710Y mItgb1) بالإضافة إلى مساعد poly-ICLC أو اللقاحات غير ذات الصلة التي تحتوي على SLP لفيروس الورم الحليمي البشري (HPV) (IrrVax) غير فعالة في تحفيز رفض T3 عند إعطائها بعد 6 أيام من حقن خلايا الورم (الشكل 1a، b). ومع ذلك، كانت اللقاحات الخاصة بـ T3 التي تحتوي على neoAgs لمستضدات MHC-I بجرعات تتراوح بين 150 نانوغرام و مع الجرعات المنخفضة المستمرة من mItgb1 SLP (1.5 نانوغرام) تم تحفيز رفض الورم في nearly جميع الفئران الحاملة للورم (الشكل 1a، b). بالمقابل، عندما تم تثبيت جرعات SLPs الخاصة بـ T3 MHC-I neoAg عند 150 نانوغرام وتم تغيير جرعة SLPs الخاصة بـ T3 MHC-II neoAg، لوحظ منحنى استجابة جرعة على شكل جرس يظهر أقصى حماية في 42 من 50 من الفئران الملقحة عند جرعات 1.5 نانوغرام من -لقاح mltgb1 SLP المقيد (المشار إليه فيما بعد باسم LDVax؛ الشكل 1b). اللقاحات التي تحتوي على نفس جرعة SLP MHC-I المحددة لـ T3 بالإضافة إلى جرعات أعلى من SLP mItgb1،
على سبيل المثال، 150 نانوغرام، أدى إلى القليل أو عدم وجود فعالية مضادة للورم (يشار إليها فيما بعد باسم HDVax). وبالتالي، فإن الجرعات العالية من MHC-IISLP المحددة للورم تجعل اللقاحات المحددة لـ T3 غير فعالة.

لمعالجة ما إذا كانت عدم فعالية لقاح T3 المحدد لـ HDVax قابلة للتعميم على أورام أخرى متميزة من الناحية المستضدية، استخدمنا لقاحات تحتوي على المستضدات الجديدة الرئيسية المقيدة بمركب التوافق النسيجي الرئيسي من الفئة الأولى (MHC-I) والفئة الثانية (MHC-II) لنموذجي ساركوما MCA آخرين: F244 (الذي يعبر عن -طفرة G122A المقيدة في بروتين الغشاء البيروكسيزومي 14 (mPex14) و D2944YI-A -طفرة مقيدة في بليكتين-1 (mPlec) و1956 (تعبير عن -متحور M 50 I المقيد في الوحدة الفرعية للبروتيازوم 26S، غير ATPase 6 (mPsmd6) و I-A -طفرة R144S المقيدة في سينثاز السترات (mCs) (الجدول التكميلي 1). كما هو موضح مع HDVax المحدد لـ T3 وأورام T3، تم ملاحظة نفس نوع المنحنى على شكل جرس لمستضدات النيو (MHC-II) مع أورام F244 و1956 وHDVax المحدد لها (الشكل 1c,d).

لتحديد ما إذا كان HDVax يثبط العلاج المناعي بنشاط، قمنا بتقييم تأثير T3-HDVax على فعالية الأجسام المضادة المضادة لـ PD1 و41BB أو CTLA4، حيث أن كل من هذه الأجسام المضادة، عند إعطائها كعلاج وحيد، أدت إلى رفض كامل للأورام T3 في الجسم الحي.

الشكل 2 | تثبيط HDVax محدد لمستضدات النيو (MHC-II) في الورم. أ، نمو ورم T3 و F244 في الجانبين المتقابلين من ذكور الفئران 129S6 WT التي تم تطعيمها وعلاجها بمضاد PD1 ( ، ممثل لتجربتين). D0، اليوم نمو الورم في الفئران التي تتلقى خلايا T الكلية ) من الفئران المعالجة بـ LDVax فقط أو بالإضافة إلى CD25-negative mltgb1-specific CD4 خلايا T مرتبة من الفئران المعالجة بـ HDVax البيانات في اللوحات يتم عرضها كمتوسط قطر الورم تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام تحليل التباين الثنائي، مع تصحيح المقارنات المتعددة باستخدام اختبار المقارنات المتعددة لسيداك. ج-هـ، CD4 تم تنقية خلايا T وتحفيزها
كما هو موضح. تم تقييم إنتاج IL-2 في السائل الفائق باستخدام MultiPlex ( ، المجمعة من تجربتين؛ د). تُظهر خريطة الحرارة مستويات إنتاج السيتوكينات المختلفة (المشار إليها على المحور؛ هـ). الأرقام في اللوحة تمثل متوسط نسختين بيولوجيتين مستقلتين (تمثل تجربتين). التردد ( ) والأرقام ( ) من -خلايا CD8 المحددة الخلايا التائية المستحثة في الأورام من النوع T3 التي تم جمعها في اليوم الثالث عشر ، ممثل لثلاث تجارب) موضحة أيضًا. البيانات في الألواح د، ف، ج معبر عنها كمتوسط s.e.m.; تم إجراء الإحصائيات باستخدام تحليل التباين الأحادي، مع تصحيح المقارنات المتعددة باستخدام طريقة توكي.
(الشكل 1e). لم يؤثر دمج ICT و LDVax على فعالية الأجسام المضادة المعطلة للأورام. على العكس من ذلك، ألغى T3-HDVax رفض الورم في جميع الفئران المعالجة بـ anti-PD1 أو anti-4-1BB، لكنه لم يلغي رفض الورم الناتج عن anti-CTLA4. تم الحصول على نتائج مماثلة باستخدام نماذج الورم F244 و 1956 ولقاحاتها النيوأنتيجينية المعنية (الشكل 1f,g)، مما يدل على أن علاج HDVax يمنع أنواع معينة من ICT. وقد تم تفسير الملاحظة الأخيرة من خلال التجارب اللاحقة.

لاختبار خصوصية المستضد لتثبيط HDVax، تم حقن خلايا ساركوما T3 وخلايا ساركوما F244 المتطابقة جنسيًا والمختلفة من الناحية المستضدية في جوانب متقابلة من فئران 129S6 البرية (WT) غير المدربة. بعد ثلاثة أيام، تم علاج الفئران بمضاد PD1 بالإضافة إلى إما HPV-LDVax غير ذي الصلة أو HPV-HDVax، T3-LDVax أو T3-HDVax، أو F244-LDVax أو

تمت مراقبة نمو الورم باستخدام F244-HDVax. لم يمنع كل من LDVax أو علاج HPV-HDVax غير ذي الصلة رفض الأورام T3 أو F244 الناتج عن anti-PD1 (الشكل 2a، الألواح الثلاثة العليا واللوحة السفلى اليسرى). ومع ذلك، فإن علاج T3-HDVax منع بشكل انتقائي رفض الأورام T3 المعتمد على anti-PD1 ولكن ليس الأورام F244 (الشكل 2a، اللوحة السفلى الوسطى). وعلى العكس، فإن علاج F244-HDVax منع بشكل انتقائي رفض الأورام F244 المعتمد على anti-PD1 ولكن ليس الأورام T3 (الشكل 2a، اللوحة السفلى اليمنى). وبالتالي، فإن التأثير المثبط لـ HDVax مرتبط بشكل خاص بـ MHC-II neoAg المعبر عنه بواسطة كل خط ورمي.

لاختبار رسمي ما إذا كان التثبيط ناتجًا عن تحفيز مثبط للمناعة الخلايا، أنشأنا نظام نقل خلايا T التبني (ACT) في Rag2 الفئران (انظر الطرق). ACT من مستنفد من الخلايا
نقل خلايا T من فئران WT المعالجة بـ LDVax إلى فئران Rag2-/- الحاملة لورم T3 والمناعية الناقصة كان كافياً لتحفيز رفض T3 (الشكل 2b). ومع ذلك، فإن خلط خلايا T المستحثة بواسطة HDVax، CD4 محدد mItgb1 خالي من الخلايا الخلايا التائية مع خلايا التأثير المستحثة بواسطة LDVax ألغت رفض ورم T3. هذه البيانات اقترحت أن HDVax يحفز سكان الخلايا متميز عن الكلاسيكي الخلايا، التي تمتلك نشاطًا مثبطًا للمناعة قويًا.

تكرار والأعداد المطلقة لخلايا CD4 المحددة بـ mItgb1 كانت الخلايا اللمفاوية المتسللة إلى الورم (TILs) من الفئران المعالجة بـ HDVax أو LDVax مشابهة (الشكل البياني الموسع 1a، b). كشفت تحليلات تدفق السيتومتر أن التردد والأعداد المطلقة لـ الخلايا في CD4 المحددة بـ mltgb1 انخفضت TILs أو الطحال بشكل مماثل بعد علاج HDVax أو LDVax مقارنةً بالتحكمات المعالجة بـ PBS (الشكل 1c، d من البيانات الموسعة). لوحظت نتائج مماثلة مع الفئران الحاملة لورم F244 المعالجة بـ F244-HDVax أو F244-LDVax (الشكل 1e من البيانات الموسعة). كشفت تحليلات السيتوكين المتعددة عن أنماط مميزة من CD4 تم تحفيز TILs بواسطة LDVax مقابل HDVax. بينما تم تحفيز CD4 الخاص بـ mItgb1 بواسطة T3-LDVax أنتجت خلايا T IL-2 عند تحفيزها بخلايا الطحال المحملة بـ mItgb1، CD4 المحددة بـ mItgb1 الناتجة عن T3-HDVax فشلت خلايا T في إنتاج IL-2 (الشكل 2c، d). بالإضافة إلى ذلك، بينما أدت لقاحات T3-LDVax إلى تحفيز CD4 خلايا T أنتجت مستويات عالية من IFN TNF و GM-CSF (الشكل 2e)، CD4 المستحث بواسطة T3-HDVax خلايا T أنتجت مستويات عالية من IL-10 و TGF ، IL-5 و IL-27. تم تكرار هذه النتائج من خلال تحليلات صبغ الخلايا داخلية (الشكل 1f، g من البيانات الموسعة). علاوة على ذلك، بينما كانت خلايا CD4 الخاصة بـ mItgb1 تم جمع TILs من الفئران المعالجة بـ T3-LDVax والتي أظهرت مستويات مرتفعة من CD40L بعد تحفيز المستضد (LDVax: ; بي بي إس: فقط جزء صغير من CD4 الخاص بـ mItgb1 المستحث بواسطة T3-HDVax المنبه بمولد الضد تعبّر TILs عن CD40L (HDVax: ؛ الشكل التوضيحي الممتد 1h، i).

متسق مع التعبير المرتفع المعتمد على T3-LDVax لـ CD40L على CD4 أظهرت خلايا الدندريت من نفس الفئران تعبيرًا أعلى قليلاً ولكنه معزز بشكل ملحوظ عن CD86 و CD70 مقارنة بالخلايا المماثلة من الفئران المعالجة بـ T3-HDVax. لم تُلاحظ فروق ذات دلالة إحصائية في مستويات التعبير عن CD40 على خلايا الدندريت (الشكل البياني الممتد 2a، b). ومن الجدير بالذكر أن عدد خلايا cDC1s قد انخفض بمقدار 2.9 مرة في الأورام من الفئران الحاملة لـ T3 المعالجة بـ T3-HDVax مقارنة بـ PBS (الشكل البياني الممتد 2c). لوحظ فقط انخفاض طفيف في عدد خلايا cDC2s، ولم يكن هذا ذا دلالة إحصائية.

توافقًا مع الاستجابة غير الطبيعية للسيتوكينات وانخفاض استعادة خلايا cDC1 من الفئران المعالجة بـ T3-HDVax، فإن الترددات والأعداد المطلقة لخلايا CD8 المحددة لـ mLama4 كانت TILs أقل بكثير من CD8 تم حصاد TILs من الفئران المعالجة بـ T3-LDVax (الشكل 2f، g والشكل البياني الموسع 2d). علاوة على ذلك، CD8 المحدد لـ mLama4 عبّرت TILs من الفئران المعالجة بـ T3-HDVax عن مستويات عالية من علامات الإرهاق (PD1، CD39، TIM3، LAG3 و TOX) وأنتجت كميات منخفضة من IFN. و TNF مقارنة مع مجموعات سكانية مشابهة من الفئران الحاملة للأورام المعالجة بـ T3-LDVax (الشكل البياني الموسع 2d-h). لم تُلاحظ أي اختلافات في TIM3 TCF1 السكان الفرعيون (الشكل 2i من البيانات الموسعة). كشفت هذه النتائج أنه بينما ينتج T3-LDVax CD4 محدد للورم تقوم خلايا T التي تنتج مواد تعزز الاستجابة المناعية لمكافحة الأورام، حيث يحفز T3-HDVax خلايا CD4 المحددة للأورام. خلايا T التي تقلل من النشاط المضاد للورم.

لتعريف أفضل لـ CD4 المثبط الناتج عن HDVax خلايا T، قمنا بإجراء تسلسل RNA على مستوى الخلية الواحدة (scRNA-seq) على CD4 المحدد بـ mItgb1 تيلز من الفئران المعالجة بـ T3-HDVax أو T3-LDVax أو PBS. تجميع غير متحيز باستخدام تقنيات الاقتراب والتقريب الموحد (UMAP) لخلية CD4 المحددة بـ mItgb1 كشفت TILs عن 11 مجموعة خلوية (المجموعة 0 إلى المجموعة C10) بتوقيعات جينية مميزة (الشكل 3a,b). وجدنا أن
أدى التطعيم بحد ذاته إلى تقليل ثلاثي في تكرار تجمعات TILs في العنقود 0 (مساعدات جريبية) مجموعة خلايا (Bcl6 و Cxcr5 )) و العنقود 5 ( مجموعة خلايا (Foxp3 و Cd25 “)) في الأورام من الفئران التي تلقت إما T3-HDVax أو T3-LDVax مقارنةً بـ PBS. على النقيض من ذلك، كانت نسب الخلايا التي تشغل المجموعات 1-4 و6 و8 متأثرة بشكل مختلف بجرعة ببتيد MHC-II المستخدمة في اللقاح. كانت المجموعتان 2 و8 أكثر كثافة بعد T3-LDVax مقارنةً بـ T3-HDVax أو علاج PBS، في حين كانت المجموعات 3 و4 و6 أكثر كثافة بعد علاج T3-HDVax مقارنةً بـ LDVax أو علاج PBS. بينما أحدث T3-HDVax زيادات طفيفة فقط في الكثافة في المجموعتين 4 و6 مقارنةً بـ T3-LDVax أو علاج PBS، كانت كثافة الخلايا في المجموعة زاد إلى أقصى حد وأظهر أكبر الفروقات بين HDVax و LDVax أو PBS.

كشفت التحليلات الإضافية أن T3-HDVax أدى إلى CD4 تم التعبير عن TILs بمستويات مرتفعة نسبيًا من و السير النسخ الجينية ومستويات منخفضة نسبيًا من نسخ Lag3 وCd2OO وHavcr2 وTigit مقارنة بتلك التي تم تحفيزها بواسطة T3-LDVax أو PBS (الشكل البياني الممتد 3a). CD4 أظهرت الخلايا التائية من الفئران المعالجة بـ T3-HDVax أيضًا مستويات أقل من mRNA لجينات Ifng وTnf وCd28 وCd4Ol وعوامل النسخ المرتبطة بالخلايا التائية المساعدة. استقطاب الخلايا، على سبيل المثال، Bhlhe4O، مقارنةً مع TILs من الفئران المعالجة بـ T3-LDVax أو الفئران المعالجة بـ PBS (الشكل البياني الممتد 3b). كما أظهر تحليل إثراء مجموعة جينات Il2 (GSEA) أن الخلايا المستحثة بواسطة HDVa أظهرت عيوبًا في توقيع IL-2 (الشكل البياني الممتد 3c)، وأعربت عن مستويات منخفضة من عوامل النسخ مثل Stat5b وRora وNfatc، وأظهرت زيادة في التعبير عن جين cMaf الذي يثبط إنتاج IL-2. مقارنة مع الخلايا المقابلة بعد علاج T3-LDVax (الشكل البياني الممتد 3d).

للتحقق من هذه الملاحظات، قمنا بتقييم مستويات البروتينات المقابلة في خلايا CD4 المحددة للأورام. تمت دراسة TILs وسكان الخلايا الطحالية من الفئران المعالجة بـ T3-HDVax و T3-LDVax أو PBS. أكدت هذه التحليلات أن CD4 الخاص بـ mItgb1 كانت TILs موجودة بترددات وأعداد أعلى بخمسة أضعاف في الفئران المعالجة بـ T3-HDVax مقارنةً بـ TILs من الفئران المعالجة بـ T3-LDVax أو PBS (الشكل البياني الموسع 3e، f). كما لوحظ فرق يتراوح بين 2-3 أضعاف في الخلايا الطحالية من الفئران التي تلقت T3-HDVax مقارنةً بـ T3-LDVax أو PBS. تم ملاحظة نتائج مماثلة باستخدام فئران تحمل ورم F244 المعالجة بـ F244-HDVax، F244-LDVax أو PBS (الشكل البياني الموسع 3g، h). في كلا نموذجَي الورم T3 وF244، كانت خلايا المجموعة 3 المستحثة بواسطة HDVax تعبر عن مستويات أعلى من بروتين CTLA4 مقارنةً بالخلايا في جميع المجموعات الأخرى، باستثناء المجموعة 5 (CD25 الكلاسيكي). الخلايا؛ الشكل البياني الممتد 3i). العلاج بمضاد CTLA4 ولكن ليس بمضاد PD1 قضى على الخلايا من المجموعة 3 والمجموعة 5 في TILs من الفئران المعالجة بـ HDVax (الشكل البياني الممتد 3j). يفسر هذا الاكتشاف لماذا لم يقم HDVax بتثبيط فعالية مضاد الأورام لمضاد CTLA4، لأن الأجسام المضادة الأحادية النسيلة لمضاد CTLA4 (9D9) المستخدمة في الدراسة تستنفد كلا من الخلايا و CD4 المثبط الناتج عن HDVax خلايا T (الشكل 1e، f).

على الرغم من أن هذه النتائج أشارت إلى أن خلايا HDVax المثبطة كانت محلية في المجموعة 3، إلا أنها لم تحدد البروتينات السطحية على هذه الخلايا التي ستسمح بعزلها. لذلك، قمنا بإنشاء استراتيجية فرز حيث قمنا بإزالة خلايا T من CD4 المحددة للورم. مجموعة خلايا T التي عبرت عن جينات علامات السطح غير الموجودة في خلايا المجموعة 3 (أي Cd25 و Cd200 و Cd153)، وتم فرز الخلايا المتبقية إيجابيًا للتعبير عن CD39 (الشكل البياني الممتد 4a). سمح لنا هذا النهج بإنشاء ثلاث مجموعات خلوية: (1) خلايا المجموعة 3 المنقاة جزئيًا (CD25 CD200 و CD39 “), (2) CD25 عنقود خلايا (أكثر من فوكس بي )، و (3) غير العنقودي الخلايا (CD25 CD200 CD153 و “; الشكل البياني الموسع 4b، c). تم اختبار هذه المجموعات الخلوية بعد ذلك لقدرتها على تثبيط رفض T3. تم رفض أورام T3 في الفئران Rag2-/ التي تتلقى خلايا T الفعالة المستحثة بواسطة T3-LDVax التي تفتقر إلى الخلايا، سواء بمفردها أو بالاشتراك مع خلايا غير متجمعة محددة T3 المستحثة بواسطة HDVax

3/5 خلايا (الشكل 3ج). بالمقابل، لم ترفض خلطات خلايا T الفعالة المستحثة بواسطة LDVax بالإضافة إلى خلايا المجموعة 3 المحددة بواسطة HDVax الأورام T3 (الشكل 3ج). تحتوي الخلطات المماثلة على مجموعة كلاسيكية
الأورام على إجمالي الفئران المستخدمة المجمعة من تجربتين. البيانات في الألواح ج، و هي معبّرة كمتوسط قطر الورم س.م. ويمثلان ثلاثة واثنين من التجارب، على التوالي. تم إجراء الإحصائيات باستخدام تحليل التباين الثنائي، مع تصحيح المقارنات المتعددة باستخدام اختبار المقارنة المتعددة لسيداك. البيانات في الألواح تُعبر كمتوسط s.e.m. تمثل تجربتين؛ تم إجراء الإحصائيات باستخدام ANOVA أحادي الاتجاه، مع تصحيح المقارنات المتعددة باستخدام طريقة توكي. ج، GSEA مقارنة توقيع الجين لخلايا الكتلة 3 (تسلسل RNA الكلي) بتوقيع الجين لمختلف مجموعات الخلايا. الخط الأحمر يظهر أقصى انحراف عن الصفر للمنحنى، والذي يعادل بشكل أساسي درجة الإثراء في هذه الحالات. تم استخدام درجة الإثراء لتحديد تحديد القيمة لكل مجموعة جينات بواسطة اختبار التبديل. NES، درجة الإثراء المنظم. k، مخطط صندوقي يوضح تكرار خلايا Tr1-like بين المستجيبين وغير المستجيبين ضمن مجموعة بيانات Sade-Feldman وآخرون (يسار) والفوائد السريرية المستدامة (DCBs) أو غير DCBs ضمن مجموعة بيانات Awad وآخرون (يمين). تم إجراء الإحصائيات باستخدام -اختبارات دون افتراض تساوي التباينات. الـ القيم في مجموعة بيانات سادي-فيلدمن وآخرون كانت ، د.ف. ؛ لم يتم العثور على فرق كبير في مجموعة بيانات عوض وآخرون ( تُعرض البيانات كرسوم بيانية صندوقية تمتد من النسبة المئوية 25 إلى 75، مع وجود الوسيط في المنتصف والشعيرات التي تت correspond إلى القيم الدنيا والقصوى.
الخلايا بدلاً من مجموعة 3 من الخلايا التي تم تثبيطها جزئيًا فقط في رفض الورم. كما هو متوقع، فإن خلطات من خلايا T الفعالة المستحثة بواسطة T3-LDVax بالإضافة إلى إما خلايا مجموعة 3 المحددة بواسطة LDVax أو متعددة النسائل
لم تقم خلايا T من الفئران المعالجة بـ T3-HDVax والتي تفتقر إلى خصوصية mItgb1 بقمع رفض T3 (الشكل 4d من البيانات الموسعة). وبالتالي، فإن الخلايا المستحثة بواسطة HDVax والمخصصة للورم التي تشغل العنقود 3 ضرورية وكافية لتسهيل تثبيط الفعالية المضادة للورم.

لتعريف أفضل للخلايا المثبطة للمناعة التي تشكل العنقود 3 واستخلاص رؤى حول أصولها وآلية عملها، قمنا بتعريض العنقود 3 المستخلص من HDVax، والعنقود 5 ( الخلايا) وغير المجمعة تمت مقارنة تجمعات الخلايا مع تسلسل RNA العميق وقارنت النسخ الجينية لها. أكدت تحليلات مخطط البركان أن خلايا المجموعة 3 تعبر عن مستويات عالية من Gzmb و Ccl5 (الشكل 3d). لم يتم مشاركة هذه السمة من قبل خلايا أو غير متجمعة الخلايا. أظهرت خلايا المجموعة 3 المستحثة بواسطة T3-HDVax أيضًا زيادة انتقائية في التعبير عن علامتين سطحتين معروفتين بأن لهما أنشطة مثبطة للمناعة: Lilrb4 (الذي يشفر ILT3، CD85k أو gp49b) وسما4ا أظهرت تحليلات تدفق الخلايا أن خلايا HDVax المجموعة 3 يمكن تقسيمها إلى أربع تحت مجموعات بناءً على التعبير الفردي أو المزدوج لبروتينات LILRB4 وSEMA4a (الشكل 3e والشكل الإضافي 4e-g). نقل الخلايا المعتمد على HDVax المحفز لـ LILRB4 SEMA4a أو LILRB4 سيما4 CD4 المحدد لـ mItgb1 تمت إزالة خلايا T بشكل مماثل لرفض ورم T3 في اختبار Rag2-/ ACT (الشكل 3f). بالمقابل، لم تقم الخلايا الإيجابية الوحيدة لـ SEMA4a أو الخلايا السلبية المزدوجة بتثبيط رفض الورم.

بينما أسست هذه النتائج علامات سطحية حددت الخلايا المثبطة، تساءلنا عما إذا كانت موجودة في الأورام المتزايدة بشكل تدريجي التي أصبحت غير حساسة لمضاد PD1. في الواقع، زادت نسبة TILs FOXP3_LILRB4 + في الأورام T3 المتزايدة بشكل تدريجي وغير المعالجة (الشكل 3g، h)، وارتبط ظهورها ببدء المقاومة لمضاد PD1 (الشكل 3i). زيادات مماثلة في لم يتم ملاحظة الخلايا تحت هذه الظروف. تكشف هذه النتائج، جنبًا إلى جنب مع بيانات تسلسل RNA أحادي الخلية، أن تعبير LILRB4 يحدد غير- CD4 المثبط للخلايا سكان خلايا T التي تحفزها HDVax والتي تتطور أيضًا في الأورام المتزايدة بشكل تدريجي غير المعالجة حيث تتطور مقاومة للعلاج المناعي.

أظهر تحليل GSEA أن خلايا المجموعة 3 تعرض توقيعًا جينيًا مميزًا يميزها عن خلايا FOXP3+ خلايا خلايا ومُستَنفَذ مُنبه بشكل مزمن خلايا T (الشكل البياني الموسع 5a). ظلت الخلايا المثبطة المستحثة بواسطة HDVax FOXP3 بعد 10 أيام من الحضانة مع سيتوكينات مختلفة في المختبر (الشكل 5b من البيانات الموسعة). بالإضافة إلى ذلك، لم تكن الخلايا المستحثة بواسطة HDVax مشتقة من الخلايا كما يتضح من عدم وجود أنماط تكرارية مشتركة لمستقبلات الخلايا التائية في الكتلة 3 والكتلة 5 ودراسات تتبع السلالة في الجسم الحي باستخدام فئران تتبع سلالة FOXP3 (الشكل 5c,d من البيانات الموسعة). وبالتالي، لم تكن خلايا المجموعة 3 سابقة لـ، ولا متمايزة من، الخلايا. وعلى العكس، فإن توقيع الجين للخلايا في المجموعة 3 تداخل بشكل كبير مع تلك المبلغ عنها لخلايا Tr 1 في الفئران والبشر. و سامة للخلايا خلايا (الشكل 3j). بالإضافة إلى ذلك، كانت نسبة خلايا Tr1-like أعلى في المرضى الذين يظهرون مقاومة للعلاج بمضادات PD1 واللقاحات الشخصية ضد السرطان (الشكل 3k). بينما يتم استخدام تعبير LAG3 و CD49b (الذي يُستخدم أحيانًا لتعريف خلايا Tr1) لم تكن مختلفة في TILs للفئران المعالجة بـ HDVax مقارنة بالفئران المعالجة بـ LDVax، حيث كانت هذه العلامات معبرة بشكل انتقائي على CD4 المحدد بـ mItgb1. خلايا T في طحال الفئران المعالجة بـ T3-HDVax، ولكن ليس في الفئران المعالجة بـ T3-LDVax (الشكل 5e من البيانات الموسعة). LILRB4 المستحثة بواسطة T3-HDVax خلية المجموعة 3 أنتجت كميات عالية من IL-10 وكميات منخفضة من IL-2 (علامات خلايا Tr1)، بالإضافة إلى مستويات منخفضة من TNF و GM-CSF مقارنة بـ LILRB4. خلايا العنقود 3 خلايا أو غير متجمعة الخلايا (الشكل البياني الموسع 5 ج). TGF تم إنتاجه بشكل رئيسي بواسطة غير العنقودي الخلايا و الخلايا (الشكل 5f من البيانات الموسعة). لم يُنقذ حجب IL-10 باستخدام مضاد IL-10 أو مضاد IL-10R تثبيط HDVax (الشكل 5h,i من البيانات الموسعة)، مما يشير إلى أن IL-10 لم يكن كافياً لعرقلة الفعالية المضادة للورم.

تشير هذه البيانات إلى أن HDVax والأورام التي تنمو بشكل تدريجي وتصبح غير حساسة لعلاج anti-PD1 تفعل ذلك جزئيًا بسبب إفراز FOXP3- CD4 المثبط. خلايا Tr1.

استنادًا إلى الاكتشاف بأن خلايا Tr1 المثبطة تعبر عن بروتين LILRB4 على سطحها، تساءلنا عما إذا كان جسم مضاد وحيد النسيلة الذي تم الإبلاغ عنه مؤخرًا والذي يحجب LILRB4 يمكن أن تلغي الإجراءات القمعية لهذه الخلايا. كما هو متوقع، في الفئران Rag2-/، أدى نقل خلايا T الفعالة المستحثة بواسطة T3-LDVax إلى رفض T3، وخلط خلايا T الفعالة مع خلايا Tr1 المستحثة بواسطة T3-HDVax أعاق الرفض (الشكل 4a). بينما لم يعكس إضافة الأجسام المضادة الأحادية النسيلة الضابطة إلى الخليط الأخير تثبيط رفض الورم، فإن إضافة الأجسام المضادة المضادة لـ LILRB4 سهلت رفض الورم. وبالمثل، بينما أدى نقل خلايا المجموعة 3 المستحثة بواسطة HDVax من الفئران WT إلى تثبيط رفض الورم في هذا الاختبار، فإن نقل خلايا الكتلة 3 من Lilrb4 لم تمنع الفئران رفض الورم (الشكل التوضيحي 6a). علاوة على ذلك، نمت أورام T3 بشكل متزايد في الفئران البرية المعالجة بـ T3-HDVax والأجسام المضادة الأحادية التحكم، ولكن تم رفضها في الفئران البرية التي تلقت مجموعة من T3-HDVax + مضاد LILRB4 (الشكل 4b). تم ملاحظة نتائج مماثلة باستخدام نماذج الساركومة F244 و1956 مع علاجات HDVax الخاصة بهما (الشكل التوضيحي 6b وc، على التوالي).

سألنا بعد ذلك عما إذا كان علاج مضاد LILRB4 قد أثار تغييرات في النمط الظاهري و/أو الوظيفي في خلايا Tr1 المستحثة بواسطة HDVax الخاصة بالورم. وقد أكدنا أن مضاد LILRB4 لم يقم بتقليل عدد خلايا CD4 التي تعبر عن LILRB4. تيلز في الجسم الحي (الشكل البياني الموسع 6d). أدى العلاج بهذا الجسم المضاد وحيد النسيلة إلى تقليل مستويات GZMB/CCL5 المعبر عنها لكل CD4 تم حصاد خلايا T من الفئران الحاملة لورم T3 (الشكل 4c، d) أو F244 (الشكل 6e من البيانات الموسعة). تم تسجيل انخفاض مماثل في خلايا CD4 التي تعبر عن GZMB/CCL5. تمت ملاحظة TILs عند إجراء مقارنة بين فئران WT الحاملة للأورام من عام 1956 وفئران ذات تعطيل مستهدف لجين Lilrb4 (الشكل 6f من البيانات الموسعة). تشير هذه النتائج إلى وجود صلة بين التعبير الخلوي عن LILRB4 و GZMB.

لاختبار دور GZMB في العملية المثبطة المعتمدة على Tr1، قمنا بإجراء اختبار Rag2-‘ ACT باستخدام خلايا المجموعة 3 المشتقة من WT المعالج بـ T3-HDVax مقابل Gzmb. الفئران بعد التأكيد أولاً على مستويات مماثلة من تعبير LILRB4 في الخلايا المشتقة من كل سلالة. بينما أظهرت خلايا المجموعة 3 المستحثة بواسطة T3-HDVax من الفئران WT تثبيطًا قويًا لرفض الورم، فإن Gzmb المستحث بواسطة T3-HDVax أظهرت خلايا المجموعة 3 قدرة مثبطة مخفضة (الشكل 4e).

ثم قمنا بتقييم قدرة مضاد LILRB4 على التأثير في تحفيز CD4 الأخرى منتجات مشتقة من خلايا T التي تقدم المساعدة للاستجابات المضادة للورم. أعاد حجب LILRB4 إنتاج IL-2 في الخلايا المستحثة بواسطة HDVax (الشكل 4f، g) وزاد من تعبيرها عن IFN. TNF و CD40L في كل من نماذج الأورام T3 و F244 (الشكل 6g,j من البيانات الموسعة). بالتزامن مع هذه التغيرات، زاد مضاد LILRB4 من عدد خلايا CD8 الخاصة بـ mLama4. تمت ملاحظة خلايا TILs وانخفاض التعبير عن علامات الإرهاق PD1 وLAG3 وTIM3. تم تكرار نتائج مماثلة باستخدام أورام F244 وF244-HDVax (الشكل البياني الممتد 7a-e). وبالتالي، في الفئران، يتم تمييز خلايا Tr1-like المثبطة بتعبير LILRB4، وتُعكس قدرتها المثبطة إما عن طريق حجب الأجسام المضادة وحيدة النسيلة أو الحذف الجيني للبروتين الذي، بدوره، يقلل من تعبير GZMB ويزيد من تعبير IL-2 وجزيئات أخرى تسهل الفعالية المضادة للأورام.

قدرة مضاد LILRB4 على استعادة إنتاج IL-2 في CD4 المستحث بواسطة HDVax دفعتنا خلايا T إلى التساؤل عما إذا كان تكميل IL-2 سيعيد فعالية وظيفة الخلايا ورفض الورم. على الرغم من أن IL-2 البري هو علاج معتمد لبعض أنواع السرطان، إلا أن استخدامه السريري محدود بسبب تأثيراته المتعددة السلبية وسمّيته العالية. . لذلك استخدمنا متغير IL-2 المستهدف بشكل خاص لخلايا T (CD8-IL-2) الذي يرتبط بشكل انتقائي بـ الخلايا ولكن ليس إلى الخلايا، خلايا القاتل الطبيعي أو

الشكل 4 | علاج مضاد لـ LILRB4 يعكس تحفيز HDVax لـ GZMB/CCL5 وكبح إنتاج IL-2. أ، نمو ورم T3 في فئران Rag2-/ التي تتلقى خلايا T من فئران تم علاجها بـ LDVax بالإضافة إلى CD4 المحدد لـ mItgb1 الذي تم تحفيزه بواسطة HDVax والذي لا يحتوي على CD25. خلايا T (حوالي ) تليها معالجة بالأجسام المضادة الأحادية النسيلة المضادة لـ LILRB4 أو التحكم (CTRL) ( (PBS)، 5 (LDVax و anti-LILB4) و 8 لمضاد التحكم mAb).b، نمو ورم T3 في الفئران WT المعالجة بـ HDVax وحده أو مع anti-LILRB4 ( (PBS) و 10 لمجموعات أخرى). ج، مخططات تدفق تمثيلية تظهر تعبير GZMB/CCL5 في CD4 تيلز المحملة على CD4 . د، التردد (أعلى) والأرقام (أسفل) ل CD4 الذي يعبر عن GZMB/CCL5 الخلايا التائية المستحثة في الأورام من النوع T3 بعد 7 أيام من العلاج ). e، 1956 نمو الورم في فئران Rag2-/- التي تتلقى خلايا T من فئران LDVax WT وخلايا CD4 الخاصة بـ mItgb1 السلبية لـ CD25 المستحثة بواسطة HDVax خلايا T (حوالي ) من WT أو Gzmb فئران
( لـ PBS و LDVax، و 7 لمجموعات أخرى). ف، تظهر مخططات تدفق الخلايا التمثيلية تعبير IL-2 في CD4 تكرار الخلايا التي تعبر عن IL-2 في CD4 خلايا T في عدة فئران ). نمو ورم T3 في الفئران البرية المعالجة كما هو موضح ومفصل في الطرق ( ). تم علاج الفئران الحاملة لورم T3 كما هو موضح في اللوحة ، وتكرار ( ) والأرقام ( ) من CD8 الخاص بـ mLama4 الخلايا التائية المستحثة، ونسبة خلايا CD8 المحددة لـ mLama4 الخلايا الشبيهة بـ Tr1 تم تقييم TILs في اليوم الثالث عشر ). البيانات في الألواح يتم التعبير عنها كمتوسط قطر الورم س.م. ويمثل ثلاثة واثنين واثنين وثلاثة تجارب، على التوالي؛ تم إجراء الإحصائيات باستخدام تحليل التباين الثنائي، مع تصحيح المقارنات المتعددة باستخدام اختبار المقارنة المتعددة لسيداك. البيانات في الألواح تظهر كمتوسط يمثل s.e.m. ثلاثة، ثلاثة، اثنان وثلاثة تجارب، على التوالي؛ تم إجراء الإحصائيات باستخدام تحليل التباين الأحادي، مع تصحيح المقارنات المتعددة باستخدام طريقة توكي.
CD4 التقليدي خلايا T . CD8-IL-2 يوسع بشكل انتقائي CD8 خلايا T في الفئران والرئيسيات وتحافظ على وظيفة CTL دون التسبب في السمية . لا T3-HDVax ولا الجرعات العلاجية المنخفضة من CD8-IL-2 ( أدى إلى رفض الورم في الفئران الحاملة لـ T3 كعلاجات أحادية. بالمقابل، أدى الجمع بين T3-HDVax وجرعات تحت علاجية من CD8-IL-2 إلى رفض ورم T3 (الشكل 4h). كان دمج IrrVax مع CD8-IL-2 غير فعال. كانت المعالجة بالجمع
لم تؤدِ WT IL-2 و T3-HDVax أو Irr-HDVax إلى رفض الورم ولكنها تسببت في سمية كبيرة، كما يتضح من فقدان الوزن في الفئران المعالجة. تم ملاحظة نتائج مشابهة باستخدام نماذج الورم F244 و 1956 (الشكل 8a و b في البيانات الموسعة، على التوالي).

بعد العلاج بـ HDVax بالإضافة إلى CD8-IL-2، لوحظ زيادة بمقدار 2.5 مرة في التردد (الشكل 4i والشكل الإضافي 8c) والأعداد المطلقة (الشكل 4j) من خلايا CD8 الخاصة بـ mLama4. تمت ملاحظة TILs. بالإضافة إلى ذلك،

الشكل 5 | تتولد خلايا شبيهة بـ Tr1 نتيجة تقديم مستضد cDC2 المفضل بواسطة HDVax وتقتل cDC1 بطريقة تعتمد على GZMB. أ، بروتوكول الفرز وإنتاج IL-2 بواسطة هجين محدد لـ mItgb1 ( ، تمثل تجربتين). ب، تكرار تعبير NIR في cDC1 ( ) بعد الحضانة مع تحت المجموعات المصنفة من CD4 المستحثة بواسطة HDVax خلايا T المستخرجة من الفئران WT (المعالجة بـ HDVax بالإضافة إلى الأجسام المضادة التحكمية أو anti-LILRB4) أو فئران ( ، تمثل ثلاثة تجارب). ج، مخططات تدفق الخلايا التمثيلية تظهر cDC1 و cDC2 في أورام T3 التي تم تصنيفها مسبقًا على و تكرار (أعلى) والأعداد (أسفل) من cDC1 في أورام T3 التي تم تقييمها بعد 5 أيام من التطعيم ، تمثل ثلاثة تجارب). هـ، التردد (أعلى) والأعداد (أسفل) لـ LILRB4 CD25 فوكس بي 3 CD4 خلايا T في عام 1956 تم جمع TILs من WT أو محمل بالأورام
فئران بعد التطعيم ( ، تمثل ثلاثة تجارب). ف، التردد (أعلى) والأعداد (أسفل) من cDC1 في أورام 1956 في WT و الفئران التي تم تقييمها بعد 5 أيام من التطعيم ، تمثل ثلاثة تجارب). ج، 1956 نمو الورم في WT و فئران تم تطعيمها بـ 1956 HDVax، LDVax أو IrrVax في اليومين 5 و 16. هـ، 1956 نمو الورم في WT و الفئران المعالجة بـ من مضاد PD1 في الأيام 12 و15 و18 ( ، تمثل تجربتين). البيانات في الألواح تُعبر كمتوسط بيانات s.e.m. في اللوحات يتم التعبير عنها كمتوسط قطر الورم تم إجراء الإحصائيات في اللوحة د باستخدام تحليل التباين الأحادي، مع تصحيح المقارنات المتعددة باستخدام طريقة توكي. الإحصائيات في اللوحات تم تحديدها بواسطة تحليل التباين ثنائي الاتجاه، مع تصحيح المقارنات المتعددة باستخدام اختبار المقارنات المتعددة لسيداك.

كان علاج CD8-IL-2 مرتبطًا بزيادات كبيرة في نسبة تحويل TILs إلى خلايا شبيهة بـ Tr1 (الشكل 4k). تم ملاحظة نتائج مماثلة أيضًا في نموذج ورم F244 (الشكل التمديدي 8d-f). وبالتالي، استهداف ميوتيني IL-2 إلى تتجاوز خلايا T تثبيط HDVax من خلال زيادة تكرار السيتوتوكسية المحددة بمستضد. الخلايا، مما يؤدي إلى تراجع الورم.

نظرنا في إمكانية أن تعكس النتائج المختلفة بين HDVax و LDVax اختلافات في خلايا تقديم المستضد (APCs) التي تقدم المItgb1 neoAg. استكشفنا هذه الإمكانية من خلال تطعيم الفئران السليمة إما بـ T3-LDVax أو T3-HDVax، وعزل
مجموعات مختلفة من خلايا APC في نقاط زمنية مختلفة واختبار قدرتها على تقديم mItgb1 إلى هجين خلايا T محددة بـ mItgb1 باستخدام T3-LDVax، لاحظنا أن كل من cDC1s و cDC2s قدمت النيوبيبتيد mItgb1 إلى نفس الدرجة تقريبًا (الشكل 9a من البيانات الموسعة). بالمقابل، باستخدام T3-HDVax، برزت مجموعة cDC2 كأهم خلايا تقديم المستضد (الشكل 5a). يتماشى هذا مع النتيجة، حيث أن HDVax وليس LDVax أثار استجابات قوية للأجسام المضادة تجاه ببتيد mItgb1 (الشكل 9b،c من البيانات الموسعة). كما هو متوقع، فإن خلايا Tr1 المستحثة بواسطة HDVax عبرت عن مستويات عالية من GZMB و perforin (الشكل 3c والشكل 9d من البيانات الموسعة)، مما يشير إلى أنها قد تظهر على الأقل بعض وظائفها المثبطة من خلال قتل خلايا تقديم المستضد التي تعبر عن MHC-II. نظرًا لأن خلايا T3 لا تعبر أبدًا عن MHC-II، فقد اعتبرنا إمكانية أن تكون الخلايا المستهدفة لـ Tr1 السامة هي cDC1 لأنها تقدم كل من مستضدات الورم MHC-I وMHC-II. لذلك، فهي بشكل خاص
مهم للاستجابة المضادة للأورام. أظهرت اختبارات القتل في المختبر أن خلايا Tr1 المستحثة بواسطة T3-HDVax ولكن ليس خلايا CD4 غير Tr1 قتلت خلايا T خلايا cDC1 المحملة بـ mltgb1 ولكنها لم تقتل خلايا cDC2 بطريقة تعتمد على GZMB (الشكل 5b والشكل الإضافي 9e، f). من الجدير بالذكر أن خلايا Tr1 التي تم جمعها من الفئران المعالجة بـ T3-HDVax في وجود مضاد LILRB4 أظهرت نشاط قتل في المختبر منخفض. بالإضافة إلى ذلك، تم تقليل تردد وعدد خلايا cDC1 المستعادة من الفئران الحاملة للأورام المعالجة بـ T3-HDVax بمقدار 4.5 مرة مقارنة بالفئران المعالجة بـ T3-LDVax أو PBS. تم استعادة استعادة CDC1 جزئيًا عندما تم دمج T3-HDVax مع علاج مضاد LILRB4 (الشكل 5c، d والشكل الإضافي 9g) أو عندما تم إعطاء HDVax لـ Lilrb4. الفئران (الشكل 9h من البيانات الموسعة). وبالمثل، فإن العلاج بمضاد CTLA4، الذي يستنفد خلايا Tr1 و الخلايا (الشكل الإضافي 3j)، استعادة تعافي cDC1s في فئران T3-HDVax (الشكل الإضافي 9i). لم يُلاحظ أي انخفاض في استعادة cDC1 في الفئران المعالجة بـ T3-HDVax Gzmb. الفئران (الشكل 9j من البيانات الموسعة). وبالتالي، فإن اللقاحات التي تحتوي على جرعات عالية من neoAg MHC-II تفضل تقديم المستضد بشكل أساسي بواسطة cDC2s، مما يؤدي إلى تكوين خلايا Tr1 السامة التي تقتل cDC1s التي تقدم مستضدات الأورام بطريقة تعتمد على GZMB.

افترضنا أن الإزالة الجينية لخلايا cDC2s/الوحيدات في الفئران قد تقلل من إنتاج خلايا Tr1 وتلغي التأثير المثبط لـ HDVax. لذلك، قمنا بحقن 1956 خلية ساركوما في فئران C57BL/6 WT أو فئران C57BL/6 التي تفتقر إلى خلايا cDC2s/الوحيدات. ) ولكن لا يزال قادرًا على توليد على عكس الفئران WT، تم علاجها بـ 1956-HDVax لم تُظهر الفئران زيادة في تكرار خلايا Tr1 (الشكل 5e) ولا انخفاضًا في استعادة cDC1 (الشكل 5f). كما هو متوقع، نمت أورام 1956 بشكل تدريجي سواء في الفئران غير المعالجة أو في الفئران المعالجة بـ Irr-HDVax من النوع البري. الفئران، وتم رفضها في كلا السلالتين عندما تم علاج الفئران الحاملة للأورام بـ 1956-LDVax. 1956-HDVax أدى إلى رفض الورم في الفئران ولكن ليس في الفئران WT (الشكل 5g). من الجدير بالذكر أن تردد خلايا Tr1 كان مماثلاً في كل من الفئران WT والفئران التي تفتقر إلى cDC1s (IRF8 فئران) (الشكل 10ب من البيانات الموسعة).

كما لاحظنا زيادة في خلايا Tr1 في الساركوما المتزايدة بشكل تدريجي حيث فقدت حساسيتها لمضاد PD1 (الشكل. )، قمنا بمقارنة مظهر هذه الخلايا في أورام عام 1956 التي تنمو في WT مقابل الفئران. تراكمت خلايا Tr1 في الأورام المتزايدة بشكل تدريجي 1956 في الفئران WT حيث أصبحت غير حساسة لمضاد PD1. بالمقابل، لم تتراكم خلايا Tr1 في أورام 1956 التي تنمو في الفئران (الشكل 10c، d من البيانات الموسعة). أخيرًا، أدى مضاد PD1 إلى رفض أورام 1956 التي تم تأسيسها منذ 12 يومًا في الفئران ولكن ليس في فئران WT (الشكل 5h)، مما يشير إلى أن الفعالية المعززة لمضاد PD1 في غياب cDC2s و/أو العدلات كانت متجسدة، على الأقل جزئيًا، من خلال الفشل في توليد خلايا Tr1 السامة للخلايا. تكشف هذه النتائج أنه تحت ظروف HDVax، تقوم cDC2s و/أو العدلات بتحفيز خلايا Tr1 CD4 السامة للخلايا. خلايا T التي تقتل أو تضر بسلامة/استقرار cDC1s، مما يؤدي إلى عيوب في تطوير/نضوج الخلايا السامة. استجابات خلايا T، مما يضعف التأثيرات المضادة للورم للمناعة.

يظهر العمل المقدم هنا أن فعالية لقاحات البيبتيدات النيوأنتيجينية الخاصة بالأورام تعتمد بشكل كبير على جرعة النيوأنتيجين MHC-II الموجودة في اللقاح. لقد أظهرنا أن الجرعة الزائدة من النيوبيبتيد MHC-II المعبر عنه بواسطة الورم في اللقاح يمكن أن تعكس فعالية اللقاح تمامًا. هذه الملاحظة مهمة جدًا وفي وقتها، حيث يتم الآن السعي بنشاط نحو لقاحات السرطان العلاجية كعلاج مناعي شخصي للسرطان. لم نفهم بعد القواعد التي تحكم كميات مستضدات MHC-II الجديدة اللازمة لتحقيق فعالية لقاح مثالية، كما أننا لا نقترح أن يتم تحديد ذلك تجريبيًا لكل ورم من أورام المرضى. بدلاً من ذلك، نركز على تحديد طبيعة المثبطات.
تم توليد خلايا T في ظل ظروف تطعيم غير فعالة ثم تم التحقق من استراتيجيات لتجاوز الآثار الضارة للجرعات العالية من MHC-II neoAg على الاستجابة المضادة للورم. باستخدام هذا النهج، أظهرنا أن تثبيط فعالية مضادات الورم بواسطة HDVax يرجع إلى تحفيز خلايا Tr1 المحددة لمستضدات الورم السيتوليتية التي تقتل cDC1s في المختبر وفي الجسم الحي. وبالتالي، يحدد عملنا وظيفة مثبطة حاسمة ل CD4 المعروف. مجموعة فرعية من خلايا T التي لم ترتبط عمومًا بالعلاج المناعي للسرطان أو هروب المناعة من السرطان. إن إثباتنا أن خلايا Tr1 تصبح قابلة للاكتشاف في الأورام التي تنمو بشكل متزايد مع مقاومتها للعلاج المضاد لـ PD1 يشير بقوة إلى أن الخلايا المستحثة بواسطة HDVax هي نظائر لتلك التي تظهر خلال نمو الورم المتقدم، وبالتالي، فهي مشاركون ذوو صلة فسيولوجية في قمع المناعة المرتبط بالسرطان. ثم قمنا بتحديد الآليات التي يتم من خلالها تحفيز خلايا Tr1 وأظهرنا ثلاث استراتيجيات بديلة لتجاوز نشاطها في الجسم الحي.

لقد أظهرنا أيضًا أن العلامات الظاهرية على خلايا Tr1 تختلف بناءً على المواقع التشريحية التي يتم عزلها منها. وبالتالي، بينما يتم تمييز خلايا Tr1-like المستحثة بواسطة HDVax في الطحال بشكل مختلف من خلال تعبير CD49b و LAG3 (المرجع 39)، فإن الخلايا في TILs تفتقر إلى التعبير التفاضلي عن هذه العلامات لكنها لا تزال تحتفظ بالقدرة على إنتاج IL-10، السيتوكين المميز لخلايا Tr1. بالمقابل، يحدد تعبير LILRB4 بوضوح خلايا Tr1-like في الفئران من كل من الطحال وبيئة الورم الدقيقة. ومع ذلك، بينما يتم ترميز LILRB4 في الفئران بواسطة جين Gb49b واحد، فإنه ينتمي إلى عائلة أكثر تعقيدًا في البشر تتكون من خمسة جينات مختلفة. ستكون الجهود المبذولة لتعريف النظير البشري هدفًا أساسيًا للعمل المستقبلي وقد توفر أداة لتحديد وجود مثل هذه الخلايا بسهولة لدى المرضى المصابين بالسرطان. هذا مهم لأن خلايا Tr1 المثبطة المستحثة بواسطة HDVax وخلايا CD4 المساعدة المستحثة بواسطة LDVax. تعبّر عن مستويات مشابهة من CD39، مما يشير إلى أن عوامل أخرى تتجاوز CD39 مطلوبة للتفريق بين CD4 خلايا T التي تثبط مقابل تعزز رفض الورم .

أظهرت الأعمال الأخيرة من قبل آخرين أن بعض مستضدات الأورام، التي تُسمى مثبطات، يمكن أن تقمع فعالية اللقاحات المضادة للسرطان وanti-PD1 (المرجع 56)، وأن وظيفتها المثبطة كانت نتيجة لخصائصها الهيكلية الكامنة ولكن غير المحددة. تميز هذه التصنيف المثبطات عن مستضدات MHC-II الجديدة المقدمة في الدراسة الحالية، التي ترتبط خصائصها المنشطة مقابل المثبطة بجرعاتها. تثير دراستنا إمكانية أن أي مستضد جديد من MHC-II يمكن أن يكون شبيهاً بالمثبط عندما يتم إنتاجه أو إطلاقه بمستويات مرتفعة، مما يوسع تعريف المثبط. سيكون من الضروري أيضاً في المستقبل استكشاف ما إذا كانت تحفيز خلايا Tr1 يعتمد على نوع منصة اللقاح المستخدمة (على سبيل المثال، اللقاحات القائمة على الببتيد مقابل اللقاحات القائمة على الحمض النووي مقابل اللقاحات القائمة على الحمض النووي الريبي). ستتناول الدراسات المستقبلية هذه الأسئلة. ومع ذلك، فإن تحديد خلايا Tr1 ووظيفتها البيولوجية المثبطة للمناعة في السرطان وتقديم ثلاث استراتيجيات لتجاوز وظائفها المثبطة توفر أهدافاً جديدة محتملة لتحسين فعالية العلاجات المناعية للسرطان بشكل عام.

أي طرق، مراجع إضافية، ملخصات تقارير Nature Portfolio، بيانات المصدر، بيانات موسعة، معلومات تكميلية، شكر وتقدير، معلومات مراجعة الأقران؛ تفاصيل مساهمات المؤلفين والمصالح المتنافسة؛ وبيانات توفر البيانات والرموز متاحة علىhttps://doi.org/10.1038/s41586-024-07752-y.

4. ختري، ر.، كوكس، ت.، ياسايكو، س. أ. ورامسديل، ف. دور أساسي لسكورفين في CD4 CD25 خلايا تنظيم T. نات. مناعه. 4، 337-342 (2003).
5. ثورنتون، أ. م. وشيفاش، إ. م. CD4 تقوم خلايا T المناعية التنظيمية بتثبيط تنشيط خلايا T متعددة النسائل في المختبر عن طريق تثبيط إنتاج الإنترلوكين 2. J. Exp. Med. 188، 287-296 (1998).
6. إيشويلر، س. وآخرون. خلايا تنظيم T الجريبية داخل الورم تحد من فعالية علاج PD-1. نات. إيمونول. 22، 1052-1063 (2021).
7. زاباسودي، ر. وآخرون. مثبطات غير تقليدية CD4+Foxp3-PD-1 خلايا T كعلامة حيوية لنشاط حجب نقاط التفتيش المناعية. خلية السرطان 34، 1017-1032.e7 (2018).
8. ألسباتش، إ. وآخرون. تشكل النيوانتجينات MHC-II مناعة الورم واستجابة للعلاج المناعي. ناتشر 574، 696-701 (2019).
9. أهريندس، ت. وآخرون. CD4 يساعد الخلية على منح برنامج تأثير الخلايا التائية السامة للخلايا بما في ذلك تقليل مستقبلات التثبيط المساعدة وزيادة القدرة على التوغل في الأنسجة. المناعة 47، 848-861.e5 (2017).
10. بينيت، س. ر.، كاربوني، ف. ر.، كاراماليس، ف.، ميلر، ج. ف. وهيث، و. ر. تحفيز لـ استجابة الخلايا التائية السامة للخلايا عن طريق التحفيز المتبادل تتطلب التعرف المتبادل مساعدة الخلايا. ج. تجريب. ميد. 186، 65-70 (1997).
11. أوسندورب، ف.، مينغيدي، إ.، كامبس، م.، فيليوس، ر. وملييف، ج. س. متطلبات خلايا T المساعدة المحددة للتحفيز الأمثل للخلايا السامة. الخلايا اللمفاوية ضد الأورام السلبية لمركب التوافق النسيجي الرئيسي من الفئة الثانية. J. Exp. Med. 187، 693-702 (1998).
12. كلارنيت، ج. ب. وآخرون. CD8 المتفاعل مع FBL سامة للخلايا و CD4 تتعرف الخلايا اللمفاوية التائية المساعدة على مستضدات مميزة مشفرة بواسطة فيروس لوكيميا الفئران فريد. ج. التجريبية. ميد. 169، 457-467 (1989).
13. دولينا، ج. س. وآخرون. مرتبط تطعيم الخلايا النيوأنتيجينية يتغلب على مقاومة حجب نقاط التفتيش المناعية ويمكّن من تراجع الورم. J. Clin. Invest. 133، e164258 (2023).
14. بوت، سي.، أبيتو، ل. وكوتشرو، ف. ك. خلايا T التنظيمية من النوع 1 (Tr1) في المناعة الذاتية. سيمين. إيمونول. 23، 202-208 (2011).
15. كوتش، ك. وآخرون. زيادة تكرار خلايا T التنظيمية من النوع 1 CD49b/LAG-3+ في الأفراد المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية. أبحاث الإيدز. الفيروسات العكسية البشرية 31، 1238-1246 (2015).
16. مكغويرك، ب.، مككان، ج. & ميلز، ك. هـ. خلايا تنظيمية T محددة مسببة للأمراض يتم تحفيزها في الجهاز التنفسي بواسطة جزيء بكتيري يحفز إنتاج الإنترلوكين 10 بواسطة الخلايا الشجرية: استراتيجية جديدة للتملص من استجابات T المساعدة من النوع 1 الواقية بواسطة بوردتيلا السعال الديكي. ج. تجريبي. ميد. 195، 221-231 (2002).
17. بيرغمان، سي. وآخرون. خلايا تنظيم المناعة من النوع 1 في سرطان الخلايا الحرشفية للرأس والعنق: آليات القمع والتوسع في المرض المتقدم. أبحاث السرطان السريرية 14، 3706-3715 (2008).
18. غروكس، هـ. وآخرون. CD4 مجموعة فرعية من خلايا T تثبط استجابات خلايا T المحددة للمستضد وتمنع التهاب القولون. ناتشر 389، 737-742 (1997).
19. غوبين، م. م. وآخرون. تستهدف علاجات المناعة ضد السرطان عن طريق حجب نقاط التفتيش المستضدات الطافرة المحددة للأورام. ناتشر 515، 577-581 (2014).
20. مينغ، و. وآخرون. تحسين اكتشاف نيوأنتيجين الورم بواسطة مطياف الكتلة بتقنية التنقل الأيوني ذات الموجات غير المتناظرة عالية المجال. أبحاث مناعة السرطان.https://doi.org/10.1158/2326-6066.CIR-23-0900 (2024).
21. غوبين، م. م. وآخرون. التحليل عالي الأبعاد يحدد إعادة تشكيل حجرة النخاع والعقد اللمفاوية خلال العلاج الناجح لسرطان نقاط التفتيش المناعية. خلية 175، 1014-1030.e19 (2018).
22. غابريشوفا، ل. وآخرون. c-Maf يتحكم في الاستجابات المناعية من خلال تنظيم شبكات الجينات الخاصة بالأمراض وكبح IL-2 في CD4 خلايا T. مناعة طبيعية. 19، 497-507 (2018).
23. شارما، ن.، أتولاجبي، أ. ت.، جي، ز. وأليسون، ج. ب. LILRB4 يثبط المناعة في الأورام الصلبة ويعتبر هدفًا محتملاً للعلاج المناعي. ج. إكسب. ميد. 218، e20201811 (2021).
24. سلا، م. وآخرون. مستقبل مثبط جديد (ILT3) معبر عنه على وحيدات النوى، البلعميات، والخلايا الشجرية المعنية في معالجة المستضدات. ج. تجريبي. طب. 185، 1743-1751 (1997).
25. تشانغ، سي. سي. وآخرون. تحمّل خلايا الدندريت بواسطة الخلايا: الدور الحاسم لمستقبلات التثبيط ILT3 وILT4. نات. مناعه. 3، 237-243 (2002).
26. مانافالان، ج. س. وآخرون. التعبير العالي عن ILT3 وILT4 هو سمة عامة للخلايا التغصنية التوليرية. زراعة. المناعة 11، 245-258 (2003).
27. تشابوفال، س. ب. وآخرون. سيميورين 4A يثبت نمط الخلايا التائية التنظيمية البشرية عبر بلكسين B1. إيميونهورايزونز 3، 71-87 (2019).
28. ديلغوف، ج. م. وآخرون. يتم الحفاظ على استقرار ووظيفة خلايا T التنظيمية بواسطة محور نيوروبيلين-1-سيمفورين-4أ. ناتشر 501، 252-256 (2013).
29. جاجلياني، ن. وآخرون. تتحول خلايا Th17 إلى خلايا T تنظيمية خلال انتهاء الالتهاب. ناتشر 523، 221-225 (2015).
30. تشوي، ج. وآخرون. Bcl-6 هو عامل النسخ المحوري لخلايا المساعدة الجريبية T عبر دوائر مثبط المثبط. نات. إيمونول. 21، 777-789 (2020).
31. كروفورد، أ. وآخرون. الأساس الجزيئي والنسخي لـ CD4 خلل وظيفة خلايا T خلال العدوى المزمنة. المناعة 40، 289-302 (2014).
32. فان دير فيكن، ج. وآخرون. تتبع وراثي يكشف عن وظيفة تعتمد على عامل النسخ Foxp3 ووظيفة مستقلة عن Foxp3 للنوع المحفز طرفياً الخلايا. المناعة 55، 1173-1184.e7 (2022).
33. زانغ، هـ. وآخرون. شبكة النسخ المدفوعة بواسطة IL-27 تحدد منظمات تعبير IL-10 عبر مجموعات خلايا T المساعدة. تقرير الخلية. 33، 108433 (2020).
34. هاينمان، سي. وآخرون. IL-27 و IL-12 يعارضان IL-23 المؤيد للالتهابات في خلايا T عن طريق تحفيز Blimp1. نات. كوم. 5، 3770 (2014).
35. كوك، ل. وآخرون. الوظائف المثبطة والمُعَادِلة للأمعاء لخلايا تنظيم T من النوع 1 البشرية. أمراض الجهاز الهضمي 157، 1584-1598 (2019).
36. سليدزينسكا، أ. وآخرون. خلايا T التنظيمية تقيد اكتساب الوظيفة السامة للخلايا المعتمدة على الإنترلوكين-2 و blimp-1 بواسطة CD4 خلايا T. المناعة 52، 151-166.e6 (2020).
37. سادي-فيلدمان، م. وآخرون. تحديد حالات خلايا T المرتبطة بالاستجابة للعلاج المناعي عبر نقاط التفتيش في الميلانوما. خلية 175، 998-1013.e20 (2018).
38. عوض، م. م. وآخرون. لقاح النيوانتجين الشخصي NEO-PV-O1 مع العلاج الكيميائي ومضاد PD-1 كعلاج خط أول لسرطان الرئة غير صغير الخلايا غير الحرشفي. خلية السرطان 40، 1010-1026.e11 (2022).
39. جاجلياني، ن. وآخرون. التعبير المشترك عن CD49b وLAG-3 يحدد خلايا T التنظيمية من النوع 1 في البشر والفئران. نات. ميد. 19، 739-746 (2013).
40. باتشيلا، ل. أ.، مادسن، ل. ت. ودينز، ج. إ. سمية وفائدة استراتيجيات الجرعات المختلفة للإنترلوكين-2 في الميلانوما النقيلي وسرطان الخلايا الكلوية. ج. ممارسات متقدمة. أونكول. 6، 212-221 (2015).
41. موينيهان، ك. د. وآخرون. IL-2 المستهدف إلى الخلايا تعزز استجابات فعالة قوية للخلايا التائية ومناعة مضادة للأورام قوية. اكتشاف السرطان.https://doi.org/10.1158/2159-8290.CD-23-1266 (2024).
42. ماغناني، سي. إف. وآخرون. قتل خلايا APCs النخاعية عبر HLA الفئة I، CD2 وCD226 يحدد آلية جديدة من القمع بواسطة خلايا Tr1 البشرية. المجلة الأوروبية للمناعة 41، 1652-1662 (2011).
43. فيريس، س.ت. وآخرون. خلايا cDC1 تهيئ وتُرخص بواسطة خلايا T CD4 + لتحفيز المناعة المضادة للأورام. ناتشر 584، 624-629 (2020).
44. هوانغ، إكس. وآخرون. الاستخدام المختلف لمُعززات المثبط النسخي زيب2 يميز بين تكوين الدم البالغ والجنيني. المناعة 54، 1417-1432.e7 (2021).
45. ليو، تي. تي. وآخرون. إلغاء تطوير cDC2 بواسطة طفرات ثلاثية داخل معزز Zeb2. ناتشر 607، 142-148 (2022).
46. دوراي، ف. وآخرون. التنشيط الخفي لمُعزز Irf8 يحكم تحديد مصير cDC1. نات. إيمونول. 20، 1161-1173 (2019).
47. أوت، ب. أ. وآخرون. لقاح نيوأنتيجين شخصي مثير للمناعة للمرضى المصابين بالميلانوما. ناتشر 547، 217-221 (2017).
48. ويبر، ج. س. وآخرون. العلاج الفردي للنيوانتيجين mRNA-4157 (V940) بالإضافة إلى بيمبروليزوماب مقابل العلاج الأحادي ببيمبروليزوماب في الميلانوما المستأصلة (KEYNOTE-942): دراسة عشوائية، المرحلة 2ب. لانسيت 403، 632-644 (2024).
49. شاهين، U. وآخرون. لقاحات RNA المخصصة تحفز مناعة علاجية متعددة التخصصات ضد السرطان. ناتشر 547، 222-226 (2017).
50. كارينو، ب. م. وآخرون. علاج السرطان المناعي. لقاح الخلايا الجذعية يزيد من نطاق وتنوع خلايا T الخاصة بالنيوانتجين الميلانيني. ساينس 348، 803-808 (2015).
51. ساكسانا، م.، فان دير بورغ، س. هـ.، ميليف، س. ج. م. & بهاردواج، ن. لقاحات السرطان العلاجية. نات. ريف. كانسر 21، 360-378 (2021).
52. Zheng، ل. وآخرون. المشهد الخلوي الفردي للسرطان الشامل لخلايا T المتسللة إلى الورم. ساينس 374، abe6474 (2021).
53. أرم، ج. ب.، نوانكوا، س. & أوستن، ك. ف. التعرف الجزيئي على عائلة جديدة من أعضاء عائلة الأجسام المضادة البشرية التي تمتلك أنماط تثبيط تعتمد على التيروزين لمستقبلات المناعة وتشابه مستقبل التثبيط الفأري gp49B1. مجلة المناعة 159، 2342-2349 (1997).
54. بالانكا، سي. سي. وآخرون. حجب PD-1 يستعيد نشاط المساعدين للخلايا المناعية المتسللة إلى الورم والتي تعاني من الإرهاق PD-1 سي دي 39 خلايا T CD4. JCI Insighthttps://doi.org/10.1172/jci.insight. 142513 (2021).
55. مارتينيز-غوميز، سي. وآخرون. PD- المتعبة المتداولة قرص مضغوط تعتبر خلايا CD4 T المساعدة محددة لمستضدات الورم وتتنبأ بالاستجابة لحجب محور PD-1/PD-L1. السرطاناتhttps://doi.org/10.3390/cancers14153679 (2022).
56. لام، هـ. وآخرون. طريقة اختيار مستضد تجريبية تحدد المستضدات الجديدة التي إما تحفز استجابات واسعة من خلايا T المضادة للورم أو تدفع نمو الورم. اكتشاف السرطان. 11، 696-713 (2021).

ملاحظة الناشر: تظل شركة سبرينغر ناتشر محايدة فيما يتعلق بالمطالبات القضائية في الخرائط المنشورة والانتماءات المؤسسية.

الوصول المفتوح هذه المقالة مرخصة بموجب رخصة المشاع الإبداعي النسب 4.0 الدولية، التي تسمح بالاستخدام والمشاركة والتكيف والتوزيع وإعادة الإنتاج بأي وسيلة أو صيغة، طالما أنك تعطي الائتمان المناسب للمؤلفين الأصليين والمصدر، وتوفر رابطًا لرخصة المشاع الإبداعي، وتوضح ما إذا كانت هناك تغييرات قد أُجريت. الصور أو المواد الأخرى من طرف ثالث في هذه المقالة مشمولة في رخصة المشاع الإبداعي الخاصة بالمقالة، ما لم يُشار إلى خلاف ذلك في سطر الائتمان للمواد. إذا لم تكن المادة مشمولة في رخصة المشاع الإبداعي الخاصة بالمقالة وكان استخدامك المقصود غير مسموح به بموجب اللوائح القانونية أو يتجاوز الاستخدام المسموح به، فسيتعين عليك الحصول على إذن مباشرة من صاحب حقوق الطبع والنشر. لعرض نسخة من هذه الرخصة، قم بزيارةhttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.
(ج) المؤلف(ون) 2024

فئران
تم شراء ذكور الفئران WT 129S6 (للتجارب التي تتضمن خلايا T3 و F244) وإناث الفئران C57BL/6 (للتجارب التي تتضمن خلايا 1956) من مزرعة تاكونيك ومؤسسة تشارلز ريفر، على التوالي. على خلفية C57BL/6 وفئران Rag2-/(على خلفيتي 129S6 و C57BL/6) تم تربيتها وإيواؤها في منشأتنا الخالية من مسببات الأمراض المحددة. نقص cDC2 ونقص cDC1 (IRF8 تم الحصول على الفئران من سلالة C57BL/6 من K. Murphy (جامعة واشنطن في سانت لويس). تم الحصول على فئران knockout لـ Lilrb4a (التي تشفر gp49b) من M. Colonna (جامعة واشنطن في سانت لويس) وتم إنتاجها بواسطة مركز هندسة الجينوم والخلايا الجذعية المستحثة (GEiC) ونواة الفئران المعدلة وراثيًا وknockout والحقن الدقيق، قسم علم الأمراض والمناعة، في جامعة واشنطن في سانت لويس. تم إدخال RNA دليلي واحد (cctttagttgcagctcatccata) وبروتينات Cas9 عن طريق التحفيز الكهربائي في الزيغوتات قبل نقلها إلى إناث فئران B6/J الحوامل زيفيًا. تم فحص المؤسسين الناتجين باستخدام تسلسل الجيل التالي (NGS). تم تربية مؤسس ذكر لديه حذف مكون من 21 نيوكليوتيد في الإكسون 4 مع إناث فئران B6/J التي تم الحصول عليها من مختبر جاكسون (JAX stock #000664) لعدة أجيال، وتم تزاوج الفئران الهجينة F1 لإنتاج knockout. تم تأكيد سلامة الجين المتجانس بشدة Lilrb4b بواسطة NGS. تم تأكيد غياب تعبير بروتين LILRB4A في وحيدات الدم والعدلات بواسطة قياس التدفق باستخدام الأجسام المضادة H1.1. استنساخ (BioLegend). تم الحصول على فئران eGFP لتتبع السلالة على خلفية C57BL/6 من J. Kipnis (جامعة واشنطن في سانت لويس). تم استخدام الفئران بين 8 و 10 أسابيع من العمر. تم إجراء جميع التجارب الحية في منشأتنا الخالية من مسببات الأمراض المحددة باستخدام إجراءات معتمدة من لجنة الدراسات الحيوانية المعتمدة من AAALAC في جامعة واشنطن في سانت لويس واتبعت جميع اللوائح الأخلاقية ذات الصلة.

T3 و F244 و 1956 هي خلايا ساركوما مستحثة بواسطة MCA تم إنشاؤها سابقًا في مختبرنا في ذكور فئران 129S6 (خطوط خلايا T3 و F244) وإناث فئران C57BL/6 (خط خلايا 1956). تم زراعة خلايا الورم في وسط RPMI (Hyclone) معززة بـ 10% من مصل العجل الجيني (Hyclone). كانت جميع خطوط الخلايا المستخدمة سلبية بالنسبة للميكوبلازما وعوامل العدوى الأخرى. من أجل حقن الورم، تم جمع خلايا الورم عن طريق التحلل بالإنزيم، وغسلها ثلاث مرات بمحلول PBS وإعادة تعليقها في محلول PBS بكثافة خلايا لكل مليلتر. ثم، تم حقنها تحت الجلد في الجوانب الخلفية لفئران متلقية متجانسة. تم تحديد نمو الورم في الفئران الفردية باستخدام الكالبرات وعبر التعبير عنه كمتوسط لقطرين عموديين. تم euthanizing الفئران عندما وصل قطر الورم إلى 20 مم في أي اتجاه.

تم وصف T3 neoAgs سابقًا وتم إدراجها في الجدول التكميلي 1. تم استخدام ببتيد فيروس الورم الحليمي البشري (DKCLKFYSKISEYRHY CYSLYGTTL) كأنتيجين غير ذي صلة بالأورام الساركوما. تم شراء جميع الببتيدات من Peptide 2.0 أو Genscript مع نقاء محدد يزيد عن كانت مستويات الإندوتوكسين في جميع الببتيدات المختبرة أقل من (لينكو). تم خلط الجرعات المحددة من الببتيد مع حمض البوليمر الإينوسينيك-البوليمر السيتيدينيك المعقد مع البوليمر-ل-لايسين والكاربوكسي ميثيل السليلوز (البوليمر-ICLC؛ أونكوفير) المخفف في محلول فوسفات البفر. من أجل التطعيم العلاجي، تم حقن الفئران الحاملة للأورام عن طريق الوريد أو تحت الجلد باللقاحات. في اليومين 6 و 17 بعد زراعة الورم. في التجارب التي استخدمت مزيج التطعيم والعلاج المناعي، تم إعطاء اللقاحات عن طريق الوريد في اليومين 3 أو 6 بعد زراعة الورم. في تجارب الفرز، تم خلط مضاد CD40 مع الجرعة الثانية من اللقاح لزيادة إنتاج المستضد المحدد. خلايا T.

للعلاج داخل الجسم الحي، تم شراء أجسام مضادة أحادية النسيلة خالية من LPS وخالية من مسببات الأمراض ضد PD1 (IgG2a من الجرذان، النسخة RMP1-14)، وضد CTLA4 (IgG2b من الفئران، النسخة 9D9) أو ضد 4-1BB (IgG2a من الجرذان، النسخة 3H3) من شركة Leinco Technologies. تم تطعيم الفئران الحاملة للأورام في اليوم الثالث بعد زراعة الورم ثم تم حقنها عن طريق البطن بـ كل جسم مضاد في الأيام 3 و6 و9. لتقييم دور IL-10 في تثبيط HDVax، تم شراء أجسام مضادة أحادية النسيلة لـ IL-10 (IgGl من الجرذان، النسخة JES5-2A5) و IL-10R (IgG1 من الجرذان، النسخة 1b1.3A) من Bioxcell وتم حقنها مع HDVax. لعلاج حجب anti-IL-10، تم معالجة الفئران بـ يوم واحد قبل زراعة الورم، تلتها معالجة كل 3 أيام طوال مدة التجربة. بالنسبة لحجب IL-10R، تم معالجة الفئران بجرعة 1 ملغ لكل فأر كل 7 أيام، بدءًا من يوم واحد قبل حقن الورم. تم توفير الأجسام المضادة الأحادية النسيلة المحايدة ولكن غير المستنفدة المحددة لـ LILRB4 (النسخة # 2F1.F9.E6) من قبل ن. شارما وج. أليسون (جامعة تكساس (مركز أندرسون للسرطان))، وتم معالجة الفئران بـ في الأيام 3 و 6 و 9 بعد تلقيح الورم.

تلطيخ التترايمر لخلايا CD8+ T الخاصة بـ mLama4 وخلايا CD4 الخاصة بـ mItgb1 تم إجراء خلايا T كما هو موصوف سابقًا . خلايا TILs أو خلايا الطحال ( مليون) تم تحضين محلول FACS مع ببتيد mLama4 المسمى بـ PE/APC- رباعي لمدة 20 دقيقة. ثم، مزيج مضاد الأجسام الرئيسي الذي يتكون من CD90.2 و CD4 و CD11b وصبغة حية/ميتة (NIR) في تم إضافة محلول FACS إلى كل بئر وتم حضنه لمدة 30 دقيقة عند تم الحصول على التترايمرات من مختبر مراقبة المناعة في مركز بورسكي بجامعة واشنطن في مدرسة الطب في سانت لويس.

كانت الأجسام المضادة المتدفقة: IFN ” (XMG1.2; 1:100; 505808)، TNF (MP6-XT22; 1:100; 506323)، CD200 (OX-90; 1:200; 123820)، PD1 (29F.1A12; 1:200; 135228)، CCL5 (2E9/CCL5; 1:500; 149106)، GZMB (QA16A02; 1:50; 372216)، TIM3 (RMT3-23; 1:200;119723)، CD25 (PC61; 1:100; 102036)، CD154 (MR1; 1:100; 106506)، CD152 (UC10-4B9; 1:100; 106318)، CD4 (RM4-5; 1:500)، IL-2 (Jes6-5H4; 1:50; 503826)، LILRB4 (H1.1; 1:200; 144904)، CD11b (M1/70; 1:800; 101226)، XCR1 (ZET; 1:100; 148206)، MHC-II (M5/114.15.2; 1:1000; 107641)، CD11c (N418; 1:200; 117336)، CD172a (P84; 1:500; 144008)، صبغة حيوية قابلة للإصلاح Zombie NIR (1:500; 423106)، CD86 (GL-1; 1:200; 105042)، CD80 (16-10A1; 1:200; 104712) و CD40 (FGK45; 1:100; 157506) جميعها من BioLegend؛ CD90.2 (53-2.1; 1:800; 565257)، CD45 (HI30; 1:800; 563791)، CD39 (Y23-1185; 1:400; 567105)، CD153 (RM153; 1:200; 740751)، CD70 (FR70; 1:100; 740741) و CD8 (53.6.7; 1:200; 564920) من BD Biosc

تم حصاد TILs بعد 7 أيام من التطعيم، وتم صبغها بـ mItgbl-I-A تترايمر تم تحضيره بواسطة مختبر مراقبة المناعة في جامعة واشنطن في سانت لويس باستخدام ببتيد mItgb1 المرتبط تساهميًا بـ -سلسلة، وإجمالي CD4 المحدد بـ mItgb1 تم فرز الخلايا (الشكل 2ج) أو الخلايا التي تشغل مجموعات مختلفة (الشكل 3ج) بواسطة تحليل تدفق الخلايا. تم فرز الخلايا ( تم تحفيزها في وسط خالٍ من المصل بـ خلايا الطحال المشعة (المعزولة من فئران غير محصنة) التي تم تنشيطها بـ تم قياس إفراز العديد من السيتوكينات باستخدام تقنية التدفق بعد .h الحضانة
لوحة السيتوكين المخصصة ProcartaPlex (تقنيات لوميكس) وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة.

لتحديد استجابات الأجسام المضادة للببتيد mItgb1، تم طلاء ألواح ELISA بـ إما mItgb1 أو SLP غير ذي صلة في بين عشية وضحاها. تم غسل الأطباق وحجبها بـ مصل الماعز لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة، ثم أضيفت تخفيفات مختلفة من المصل من فئران LDVax أو HDVax لـ تم غسل الأطباق مرة أخرى وتخزينها مع جسم مضاد من الماعز مرتبط بالبيروكسيداز لإجمالي IgG الفأري (H + L) (115-035-003، جاكسون إيمونوريسيرش) أو مواد ثانوية محددة لنوع الأيزوتوب مختلفة مرتبطة بالبيروكسيداز من الفجل لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة، تلتها إضافة متتابعة لمادة الركيزة تيترا ميثيل بنزيدين (TMB). تم إيقاف التفاعل عن طريق التحمض، وتم قياس الكثافة الضوئية لكل بئر عند 405 نانومتر.

لإجراء تجارب نقل التبني إلى فئران Rag2-/، تم تطعيم فئران WT بلقاح LDVax، وبعد 9 أيام، تم نقل 5 ملايين خلية T إجمالاً إلى فئران Rag2-/- التي تم حقنها بـ خلايا الورم قبل يوم واحد. لعزل CD4 المحدد بـ mItgb1 تم جمع الخلايا من فئران HDVax، وTILs والطحال من الفئران المعالجة بـ HDVax، و تم إثراء الخلايا باستخدام CD4 طقم عزل الخلايا من ميلتيني (130-117-043) ملون بتترايمر ميتجب1، وCD25-negative mItgb1-specific CD4 تم تنقية خلايا T باستخدام تقنية تحليل التدفق الخلوي. نصف مليون من خلايا CD4 المحددة بـ mItgb1 تم حقن خلايا T داخل الورم (في ) إلى فئران Rag2-‘ الحاملة لورم T3.

لترتيب ونقل الأفراد من المجموعات الفردية، تم إثراء الخلايا بواسطة اختيار الخرز الإيجابي وتم صبغها بـ mItgb1-I-Ab تترايمرات، CD25، CD200، CD153 و CD39. تم فرز الخلايا بناءً على التعبير الإيجابي لـ CD25، وتم تعريف الخلايا غير المجموعة 3/5 من خلال التعبير السلبي لـ CD25 والتعبير الإيجابي لـ CD200 و/أو CD153. تم فرز خلايا المجموعة 3 بناءً على التعبير السلبي لـ CD25 وCD200 وCD153 والتعبير الإيجابي لـ CD39. تم استخدام عدد متساوٍ من الخلايا ( الخلايا) التي تم فرزها من هذه المجموعات تم إعادة تعليقها في تم حقن PBS داخل الورم. لتصنيف الخلايا التي تعبر عن LILRB4 و SEMA4، تم استخدام CD25 و CD200 و CD39 لتحديد الخلايا في المجموعة 3، و تم حقن الخلايا في فئران Rag2-/- الحاملة لورم T3 التي تلقت أيضًا خلايا T الكلية المستنفدة من الخلايا من فئران LDVax.

خلايا الطحال تم حصادها من الفئران الساذجة وتم تعريضها للإشعاع (30 غيغا) وتم تنبيهها بـ ببتيد، وTILs ) تم إضافتها لاحقًا، وتم حضن تعليق الخلايا عند تم إضافة GolgiPlug (BD Biosciences) بعد ساعة واحدة وتم حضنه لمدة 4 ساعات أخرى. تم صبغ الخلايا لعلامات سطحية مختلفة، بما في ذلك علامة الحياة/الموت (NIR)، ثم تم اختراقها باستخدام مجموعة اختراق الخلايا الداخلية (BD Biosciences)، تلاها صبغ لـ IFN. TNF و CD40L (النسخة؛ SA047C3؛ 157010، BioLegend).

تم تطعيم فئران WT الساذجة عن طريق الوريد بلقاح HDVax الذي يتكون من من mItgb1 SLP و بولي-ICLC (HDVax). في الوقت المحدد، تم جمع الطحال والعقد اللمفاوية وهضمها بوجود الكولاجيناز. تم فرز خلايا APCs باستخدام تقنية FACS إلى أربع مجموعات فرعية مختلفة: و .APCs مرتبة ( ) تم حضنها مع خلايا الهجين المحددة لـ mItgb1 في ألواح ELISPOT المطلية مسبقًا بـ IL-2 (IMMUNOSPOT). بعد أربع وعشرين ساعة، تم تطوير الألواح وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة، وتم قياس بقع IL-2 باستخدام جهاز CTL ImmunoSpot S6.

لعزل الخلايا الشجرية، تم جمع الطحال من الفئران البرية السليمة وتم تكسيره بواسطة هضم الكولاجيناز. CD11c تم إثراء الخلايا
باستخدام مجموعة اختيار إيجابية (130-125-835، ميلتني بيوتيك). تم إثراء CD11c تم تحفيز الخلايا بـ mItgb1 SLP عند وتم حضنه مع CD4 المحدد للأورام تمت زراعة خلايا T بنسبة 1:1 لمدة 12 ساعة. تم غسل الخلايا مرتين بمحلول PBS، وتم صبغها بمؤشرات MHC-II وCD11c وXCR1 وCD172a وصبغة Zombie NIR لتحديد تردد NIR في cDC1s وcDC2s باستخدام تقنية تحليل التدفق الخلوي.

تم توفير CD8-IL-2 من قبل Asher Biotherapeutics تم إنتاج CD8-IL-2 من خلال دمج ميوتين IL-2 الذي لا يرتبط بـ IL-2R. ويظهر ارتباطًا مخفضًا بشكل ملحوظ مع IL-2R تم ربط هذا المتغير بعد ذلك بمضاد أحادي التكافؤ مضاد للفأر CD8. تم تحقيق ربط IL-2 أحادي التكافؤ باستخدام تقنية زوج الشحن ثنائي الخصوصية، و تم إلغاء الربط من خلال تغيير منطقة الربط للأجسام المضادة المضادة لـ CD8. تم التعبير عن CD8-IL-2 في خلايا HEK293 وتم تنقيته عبر كروماتوغرافيا الارتباط بالبروتين A، تليها كروماتوغرافيا تبادل الأيونات ثم كروماتوغرافيا فصل الحجم. الجرعات العلاجية ( ) من CD8-IL-2 أدى إلى نشاط مضاد للأورام بشكل كبير (حوالي معدل الاستجابة) ضد أورام T3 التي تم تأسيسها لمدة 8 أيام عندما أصبحت غير حساسة لعلاج مضاد PD1. في الدراسة الحالية، تم إعطاء CD8-IL-2 بجرعة دون العلاج مخفف في PBS وتم حقنه داخل الصفاق. تم شراء WT IL-2 (202-IL/CF) من (R&D Systems). تم علاج كل فأر بـ 25,000 وحدة دولية في PBS تم حقنها داخل الصفاق يوميًا لمدة 5 أيام.

تجميع UMAP وفصل الخلايا الكلية والخلايا المحددة للمستضد. تم علاج الفئران الحاملة لورم T3 بـ HDVax أو LDVax أو PBS بعد 6 أيام من زراعة الورم. بعد سبعة أيام، تم إعداد تعليقات خلوية مفردة من TILs (مجمعة من سبعة فئران لكل مجموعة). إجمالي CD4 تم إثراء خلايا T باستخدام CD4 مجموعة اختيار إيجابي لخلايا T (ميلتيني). CD4 الغني تم تقسيم خلايا T إلى قسمين. تم وسم أحد القسمين بـ TCR (TotalSeq-C0120 مضاد لمستقبلات TCR الفأرية أجسام مضادة سلسلة، 109259، BioLegend) واستخدمت كمصدر لإجمالي CD4 خلايا T. تم وسم الجزء الآخر بـ CD90.2 (أجسام مضادة مضادة للفأر CD90.2 TotalSeq-C0075، 105353، BioLegend) واستخدم لعزل خلايا محددة لـ mItgb1 بناءً على mItgb1-I-A. تلطيخ التترا مير والفرز بالتدفق. الفئتين (الإجمالية والمحددة بمستضد CD4 تم خلط الخلايا في نسبة وتم تقديمها إلى معهد الجينوم في جامعة واشنطن لإنشاء مكتبات 10 X باستخدام تم استخدام تسلسل RNA أحادي الخلية v 2. تم استخدام المحاذاة، وتعيين الرموز الشريطية، وعدّ المعرفات الجزيئية الفريدة باستخدام Cell Ranger (v6.1.1) لإعداد مصفوفات العد لمكتبة التعبير الجيني باستخدام الجينوم الفأري (GRCm38) كمرجع. تم تصفية رموز الباركود في جميع العينات التي تمثل خلايا منخفضة الجودة باستخدام استراتيجية الانعطاف القياسية المتاحة في Cell Ranger. للتحليل اللاحق، تم استخدام حزمة Seurat (الإصدار 4.0.4)؛ وتمت تصفية الجينات المعبر عنها في أقل من ثلاث خلايا من مصفوفات التعبير، وتمت إزالة الخلايا التي تحتوي على أقل من 200 جين معبر عنه. تم حساب نسبة الجينات الميتوكوندرية لجميع الخلايا، وتمت تصفية الخلايا التي كانت تحتوي على نسبة ميتوكوندرية أكثر من أعلى فترة ثقة لنسبة الميتوكوندرية المقاسة. تم تطبيع كل عينة باستخدام دالة SCTransform مع محتوى الميتوكوندريا كمتغير للتراجع عنه في تحليل انحدار خطي غير منتظم ثانٍ. لأغراض الدمج، تم تحديد الجينات المتغيرة عبر العينات بواسطة دالة SelectIntegrationFeatures مع عدد من الميزات يساوي 2000. ثم، تم إعداد الكائن للدمج (دالة PrepSCTIntegration)، وتم العثور على المراسي (دالة FindIntegrationAnchors) وتم دمج العينات في الكائن الكامل (دالة IntegrateData). تم استخدام تحليل المكونات الرئيسية (PCA) لتقليل الأبعاد، وتم استخدام أول 20 مكونًا رئيسيًا لاحقًا لتوليد تقليل الأبعاد باستخدام UMAP من خلال وظيفة RunUMAP. تم تنفيذ إجراء التجميع بواسطة FindNeighbors و FindClusters.
مع مجموعة من الدقة (من 0.2 إلى 1.0، مع 0.2 كخطوة) وأول 20 مكونًا رئيسيًا كمدخلات. تم تطبيع بيانات العلامات المشتقة من الأجسام المضادة (ADT) بواسطة طريقة تحويل النسبة اللوغاريتمية المركزية، وتم قياسها وتحويلها إلى فضاء PCA الخاص بها. أخيرًا، تم تعريف الخلايا على أنها خلايا محددة لـ mItgb1 وخلايا إجمالية (تتكون في الغالب من خلايا غير محددة لـ mItgb1) بناءً على القيمة المقاسة للـ ADTs المقابلة. تم تنظيف كل كائن بشكل تكراري من الثنائيات وكذلك الخلايا ذات الجودة المنخفضة.

تم محاذاة بيانات TCR إلى الجينوم المرجعي للفأر GRCm38 وتم عدها باستخدام Cell Ranger (الإصدار 6.1.1) سير عمل vdj. تم تحويل كائن Seurat إلى تنسيق h5ad، وتم دمج الخلايا التي اجتازت مراقبة الجودة لمستويات التعبير الجيني وTCR في الكائنات (خلايا محددة mItgb1 والخلايا الكلية). تم تنفيذ التحليلات اللاحقة، بما في ذلك تحليل توسع الكلونات وتقدير أزواج جينات VDJ المستخدمة، باستخدام مجموعة أدوات scirpy. تم حساب نسب الكلونات المشتركة والفريدة مع تم عد الخلايا (العنقود 5). تم إجراء تحليلات TCR باستخدام حزمة Immunarch.

ثلاث مجموعات تم تطعيم الفئران الحاملة لورم T3 بـ HDVax، وبعد 7 أيام تم قياس CD4 تم إثراء خلايا T من TILs باستخدام CD4 الفأري من ميلتيني. طقم عزل خلايا T، مصبوغ بـ mItgb1-I-A رباعي ثم تم فرزه إلى ثلاث نسخ من CD25 ( الخلايا)، (غير- الخلايا/غير المجمعة 3) و (العنقود 3). تم تحلل الخلايا، وتم استخراج الرنا المرسال باستخدام Nucleospin RNA Plus (740990.50، تاكارا). تم تسلسل الرنا بواسطة معهد جينوم جامعة واشنطن. باختصار، تم تحديد سلامة الرنا الكلي باستخدام جهاز تحليل البيولوجيا من أجيلنت. تم إعداد المكتبة باستخدام 10 نانوغرام من الرنا الكلي مع درجة رقم سلامة الرنا (RIN) أكبر من 8.0. تم إعداد الحمض النووي مزدوج الشريطة (ds-cDNA) باستخدام مجموعة SMARTer Ultra Low RNA لتسلسل إيلومينا (740990.50، تاكارا) وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة. تم تجزئة cDNA باستخدام جهاز سونيكاتور كوفاريس E220 باستخدام طاقة ذروة حادثة تبلغ 18، وعامل واجب تمت معالجة cDNA بحيث كانت نهاياتها مستقيمة، وتم إضافة قاعدة A إلى النهايات 3’، ثم تم ربط محولات تسلسل Illumina بالنهايات. تم تضخيم الأجزاء المربوطة لمدة 12-14 دورة باستخدام بادئات تحتوي على علامات فريدة مزدوجة. تم تسلسل الأجزاء على جهاز Illumina NovaSeq-6000 باستخدام قراءات مزدوجة الطرف تمتد 150 قاعدة. بالنسبة للتحليل، تم محاذاة البيانات الخام وعدها إلى الجينوم المرجعي GRCm 38.101 بواسطة سير عمل Dragen من خدمة GTAC@MGI. للتحليل اللاحق، تم اختيار 12,000 جين بأعلى عدد من العد عبر العينات. تم تطبيع جميع العينات بواسطة تحويل اللوغاريتم المنتظم (وظيفة rlogTransformation) وتحويل تثبيت التباين (وظيفة vst)، والتي تم إنجازها في حزمة DESeq2 (v1.30.1). تم تشغيل PCA بناءً على مخرجات vst، ولم يتم تحديد أي نقاط شاذة. تم تقليص قيم التغير النسبي لجميع المقارنات (CD25 مقابل CD39، وCD200 مقابل CD39) بواسطة دالة IfcShrink، وتم استخدام ناتجها لبناء مخطط البركان. .

لتقييم أهمية الإثراء للجينات ذات التعبير العالي ضمن المجموعة 3، حددنا أعلى 200 جين معبر عنه بشكل مختلف من مجموعة بيانات RNA-seq الكثيفة (الجدول التكميلي 2). بعد ذلك، قمنا بإجراء تحليل دقيق للتعبير الجيني المختلف باستخدام حزمة limma على بيانات العد المعيارية المستمدة من مجموعات بيانات متاحة للجمهور. على وجه التحديد، قمنا بإجراء المقارنات الزوجية التالية.

لـ CD4 السامة للخلايا تم تحليل بيانات GSE141540، وتم إجراء مقارنة لـ خلايا T خلية-سياق مقابل تم إجراء الخلية. بالنسبة لتوقيع جين Tr1، تم الحصول على GSE158703 و GSE139990، و
مقارنة Tr1-IL-10 ضد أو تم إجراء مقارنة بين Tr1 و naive، على التوالي.

لـ و تم الحصول على توقيع الجين، GSE68242 أو GSE140187، وتم إجراء مقارنة بين FOXP3 مقابل غيره أو WT T في العقد اللمفية. تم إجراء مقارنة بين العقد اللمفاوية غير المدربة. بالنسبة لخلايا CD4 المستنفدة التي تم تحفيزها بشكل مزمن تم تحليل بيانات GSE30431 الخاصة بخلايا T، وتم إجراء مقارنة بين CD4 D30 المزمن وCD4 D30 الحاد. استخدمنا GSEA لتحديد أهمية الثراء لتوقيع الجينات المرتبط بالعناقيد 3. هذه الطريقة تقيم ما إذا كانت توقيعات الجينات المحددة مسبقًا للعناقيد 3 مفرطة التمثيل إحصائيًا أو ناقصة التمثيل ضمن قوائم الجينات المعبر عنها بشكل مختلف المستمدة من مجموعات بيانات RNA-seq العامة المتاحة لكل CD4. نوع فرعي من خلايا T.

لتحديد تردد خلايا Tr1-like في المرضى المصابين بالسرطان، نقوم أولاً بتقسيم الخلايا التي تم التحكم في جودتها من كل مخطوطة إلى الخلايا. بعد ذلك، استخدمنا AUC ell لتحديد أي الخلايا تتطابق مع مجموعة جينات Tr1 البشرية. بعد ذلك، حددنا نسبة خلايا Tr1 ضمن خلايا CD4. تعداد خلايا T لكل مريض. قمنا باختبار الفروق في نسب خلايا Tr1 بين المستجيبين وغير المستجيبين باستخدام اختبار ستودنت. -اختبارات دون افتراض تساوي التباينات. هناك فرق كبير في نسبة خلايا Tr1 بين المستجيبين وغير المستجيبين من مجموعة بيانات سادي-فيلدمان وآخرون. ، د.ف. لم يكن هناك فرق كبير في مجموعة بيانات عوض وآخرون. ).

تم استخدام دالة FindMarkers للعثور على الجينات المحددة لكل من عينات LDVax و HDVax. المتوسط تم استخدام قيم التغير المطوي كمدخل في GSEA المنفذ في حزمة R fgsea (الإصدار 1.16.0). تم استخدام ثلاثة وأربعين جينًا مرتبطًا بمسار إشارة IL-2 لرسم غنى مجموعة الجينات. بالنسبة لمخططات الكمان، تم حساب التعبير الملخص لجينات إشارات IL-2 باستخدام اختبار sctransform (SCT) (فتحة البيانات)، وتم قياسه وتقسيمه على عدد الجينات في المسار.

تم استخدام برنامج GraphPad Prism (الإصدار 10.2.2) لإجراء جميع التحليلات الإحصائية. تم تحديد الدلالة باستخدام تحليل التباين الأحادي مع مقارنات متعددة تم تصحيحها بطريقة توكي ما لم يُذكر خلاف ذلك في أساطير الأشكال.

معلومات إضافية حول تصميم البحث متاحة في ملخص تقارير مجموعة نيتشر المرتبط بهذه المقالة.

تم إيداع بيانات تسلسل RNA الضخم وبيانات تسلسل RNA أحادي الخلية باستخدام رقم الوصول GSE268302؛ يمكن استخدام GSE268300 (تسلسل RNA الضخم) أو GSE268301 (تسلسل RNA أحادي الخلية) للوصول إلى البيانات الخام. تتوفر خطوط الأنابيب مع الشيفرة لمعالجة وتحليل بيانات تسلسل RNA الضخم وبيانات تسلسل RNA أحادي الخلية فيhttps://github.com/vdsukhov/neoantigen_vaccines_2024تم توفير بيانات المصدر مع هذه الورقة.
57. وانغ، ل. ل.، تشو، د. ت.، دوكون، أ. أ. ويوكوياما، و. م. التعبير القابل للتحفيز لمستقبل gp49B المثبط على خلايا NK. مجلة المناعة 164، 5215-5220 (2000).
58. زينغ، ج. إكس. وآخرون. التوصيف الرقمي المتوازي بشكل كبير للتعبير الجيني للخلايا الفردية. نات. كوميونيك. 8، 14049 (2017).
59. ستيوارت، ت. وآخرون. التكامل الشامل لبيانات الخلايا المفردة. خلية 177، 1888-1902.e21 (2019).
60. لوف، م. آي.، هوبر، و. & أندرس، س. تقدير معتدل لتغير الطي والتشتت لبيانات RNA-seq باستخدام DESeq2. جينوم بيو. 15، 550 (2014).
61. أيبار، س. وآخرون. SCENIC: استنتاج الشبكة التنظيمية على مستوى الخلية الواحدة والتجميع. نات. ميثودز 14، 1083-1086 (2017).
62. ستورم، ج. وآخرون. سكيري: امتداد لسكاني لتحليل بيانات تسلسل مستقبلات الخلايا التائية أحادية الخلية. المعلوماتية الحيوية 36، 4817-4818 (2020).

الشكر والتقدير نشكر جميع أعضاء مختبر شرايبر على المناقشات وتقديم الدعم الفني؛ ل. يانغ و د. بيندر من مختبر المناعة.
(IML) الذي قدم التترايمرات لـ MHC-I و MHC-II neoAgs وأجرى تقييمات السيتوكين متعددة المعلمات؛ مركز هندسة الجينوم والخلايا الجذعية المستحثة (GEiC) في جامعة واشنطن في سانت لويس لخدمات التحقق من RNA الدليل؛ م. وايت لتوليد فئران Lilrb4aknockout؛ و ج. كيبنيس و ج. ج. دافانزو لتوفير فئران تتبع سلالة FOXP3. تم دعم هذا العمل من خلال منح لـ R.D.S. من المعهد الوطني للسرطان التابع للمعاهد الوطنية للصحة في الولايات المتحدة (RO1CA190700)، معهد باركر لعلاج السرطان المناعي، ومنحة بحثية ترجمة فريق أحلام تقارب مؤسسة سرطان البنكرياس Stand Up to Cancer-Lustgarten Foundation. Stand Up to Cancer هو برنامج تابع لمؤسسة صناعة الترفيه يديره الجمعية الأمريكية لأبحاث السرطان. K.M.M. مدعوم من المعاهد الوطنية للصحة (RO1Al150297، RO1CA248919، R21AI164142، RO1Al162643 و R21Al163421). M.C. مدعوم من مركز موارد أبحاث الأمراض الروماتيزمية في جامعة واشنطن (NIH/NIAMS P3OARO73752). H.S. تم دعمه من خلال منحة تدريب ما بعد الدكتوراه (T32CA009547) من المعهد الوطني للسرطان. M.F. تم دعمه من قبل وزارة العلوم والتعليم العالي في الاتحاد الروسي (الاتفاق رقم 075-15-2022-301). J.P.W. مدعوم من المعهد الوطني للسرطان التابع للمعاهد الوطنية للصحة (5K08CA245215). يتم دعم IML من قبل مركز أندرو م. وجين ن. بورسكي لعلم المناعة البشري وبرامج العلاج المناعي ومركز ألفين ج. سيتيمان الشامل للسرطان. الأخير مدعوم من منحة دعم مركز السرطان من المعهد الوطني للسرطان التابع للمعاهد الوطنية للصحة (P30CA91842).

مساهمات المؤلفين: قام H.S. و R.D.S. بتصميم التجارب وتفسير النتائج وكتابة المخطوطة. قام H.S. بإجراء التجارب وجمع البيانات. قام Y.T. و J.P.W. بتحديد neoAgs في أورام 1956 و F244 على التوالي. قام V.S. و M.F. بإجراء تحليلات scRNA-seq و bulk RNA-seq و GSEA تحت إشراف M.N.A. قام T.-T.L. و K.M.M. بإنشاء وتوفير الفئران. قام D.K. و S.B. و M.C. بتوليد وتوفير الفئران المعدلة وراثيًا Lilrb4-knockout. قدم N.S. و J.P.A. الأجسام المضادة الأحادية النسيلة LILRB4 المحايدة. قدم C.D.A. و J.M.W. و Y.S. و H.K. المساعدة الفنية طوال الدراسة. أشرف K.C.F.S. على الدراسات التي أجريت في IML. قدم A.M.S. بوليمر-ICLC من الدرجة السريرية. قدم K.D.M. و Y.A.Y. و I.D. CD8-IL-2. شارك T.N.S. في تطوير CD8-IL-2. جميع المؤلفين
ساهم في التطوير النهائي للمخطوطة ووافق على النتائج والاستنتاجات.

المصالح المتنافسة: R.D.S. هو أحد المؤسسين، وعضو في مجلس الاستشارات العلمية، ومساهم ومتلقٍ للحقوق من Asher Biotherapeutics، وهو عضو مدفوع في مجلس الاستشارات العلمية لشركات A2 Biotherapeutics وNGM Biopharmaceuticals وBioLegend وSensei Biotherapeutics وNeuvogen وBlueSphere Biopharmaceuticals. K.M.M. هو عضو في مجلس الاستشارات العلمية لشركة Harbour Biomed. J.P.A. يتلقى أتعاب استشارية من Achelois وAdaptive Biotechnologies وApricity وBioAtla وBioNTech وCandel Therapeutics وCodiak وDragonfly وEarli وEnable Medicine وHummingbird وImaginAb وJounce وLava Therapeutics وLytix وMarker وPBM Capital وPhenomic AI وPolaris Pharma وTime Bioventures وTrained Therapeutix وTwo Bear Capital وVenn Biosciences؛ ويمتلك أسهماً في Achelois وAdaptive Biotechnologies وApricity وBioAtla وBioNTech وCandel Therapeutics وCodiak وDragonfly وEarli وEnable Medicine وHummingbird وImaginAb وJounce وLava Therapeutics وLytix وMarker وPBM Capital وPhenomic AI وPolaris Pharma وTime Bioventures وTrained Therapeutix وTwo Bear Capital وVenn Biosciences. T.N.S. هو أحد المؤسسين، وعضو في مجلس الاستشارات العلمية، ومساهم في Asher Biotherapeutics وNeogene Therapeutics، وأحد المؤسسين ومساهم في Cell Control Bio، ومستشار ومساهم في Third Rock Ventures، وعضو في مجلس الاستشارات العلمية لشركات Allogene Therapeutics وCelsius وMerus وScenic Biotech. K.D.M. وY.A.Y. وI.D. هم موظفون بدوام كامل في Asher Biotherapeutics. R.B. وH.A.C. هما موظفان بدوام كامل في Natera, Inc. جميع المؤلفين الآخرين يعلنون عدم وجود مصالح متنافسة.

معلومات إضافية النسخة الإلكترونية تحتوي على مواد إضافية متاحة فيhttps://doi.org/10.1038/s41586-024-07752-y.
يجب توجيه المراسلات والطلبات للحصول على المواد إلى روبرت د. شرايبر. تشكر مجلة نيتشر أكسل كالييس والمراجعين الآخرين المجهولين على مساهمتهم في مراجعة الأقران لهذا العمل.
معلومات إعادة الطباعة والتصاريح متاحة علىhttp://www.nature.com/reprints.

الشكل البياني الممتد 1|الملفات الظاهرية الناتجة عن HDVax مقابل LDVax الخلايا. أ، مخططات تدفق تمثيلية تظهر صبغ التترايمر mitgbl في CD4 تيلز. ب، التردد (يسار) والأعداد (يمين) من CD4 المحدد لـ mItgb1 تم تقييم TILs في أورام T3 في اليوم 13 ، تمثل خمسة تجارب). ج، مخططات تدفق الخلايا التمثيلية تظهر صبغ CD25 و Foxp3 في CD4 المحدد بـ mItgb1 تيلز. د، تردد CD25 فوكس بي 3 الخلايا في mItgb1-specific الخلايا في TILs (يسار) والطحال (يمين) من الفئران الحاملة لورم T3 ، تمثل خمسة تجارب). هـ، تردد CD25 فوكس بي 3 تريغس في CD4 خلايا T في الأورام (يسار) والطحال (يمين) لفئران F244 الحاملة للأورام ،
تمثيل ثلاثة تجارب). ف، مخططات تدفق تمثيلية تظهر تكرار IFN TNF في CD4 تيلز. تكرار IFN- TNF- التعبير عن CD4 تيلز في عدة فئران “، مستمدة من تجربتين). ح، مخططات تدفق تمثيلية تظهر تعبير CD40L في CD4 TILs. أنا، تردد تعبير CD40L في CD4 تيلز الأورام T3 بعد التنشيط في المختبر ، مجمعة من تجربتين). البيانات في جميع الألواح معروضة كمتوسطات س.م. تم حساب القيم باستخدام تحليل التباين الأحادي مع تصحيحات المقارنات المتعددة باستخدام طريقة توكي.

الشكل البياني الموسع 2 | توصيف الخلايا الشجرية و CD8 TILs في الفئران المعالجة بـ HDVax و LDVax و PBS. أ، مخططات تدفق تمثيلية تظهر استراتيجية التصفية لـ cDC1 و cDC2. ب، تعبير CD86 و CD70 و MHC-II و CD40 على سطح الخلايا الشجرية (CD45 CD90.2 CD11c MHC-II ) في أورام T3 التي تم جمعها بعد 5 أيام من التطعيم ( ، تمثل تجربتين). ج، أعداد cDC1 (في الأعلى) و cDC2 (في الأسفل) في أورام T3 التي تم تقييمها بعد خمسة أيام من التطعيم ( تمثل ثلاثة تجارب).
مخططات تدفق الخلايا التمثيلية التي تظهر استراتيجية التصفية لـ CD8 المحدد لـ mLama4 تيلز في اليوم 13 ت3 تيلز. هـ-، تردد CD8 المحدد لـ mLama4 تيلز
التعبير عن e، TOX f، PD-1/CD39 و g، TIM-3/LAG3 ( ، تمثل تجربتين). تكرار الخلايا التي تعبر عن IFN- TNF- في CD8 المحدد الخلايا التائية بعد التنشيط في المختبر مع خلايا الطحال المنشطة بـ mLama4 SLP في وجود سدادة غولجي تليها صبغة داخل الخلايا ( ، مجمعة من ثلاثة تجارب). i، تردد CD8 المحدد بـ mLama4 تظهر TILs TIM3 و TCF-1. البيانات في جميع اللوحات معبّرة كمتوسطات س.م. تم حساب القيم باستخدام تحليل التباين الأحادي مع تصحيحات المقارنات المتعددة باستخدام طريقة توكي.

الشكل 3 من البيانات الموسعة | الناتج عن HDVax تفتقر خلايا T إلى توقيع جين Th1 وتعبر عن مستويات عالية من GZMB و CCL5. أ-ب، مخططات كمان تظهر مستويات التعبير عن عدة جينات متورطة في الإرهاق أو توقيع المؤثر Th1 في بيانات scRNAseq المحددة لـ mItgbl. ج، GSEA تظهر التعبير النسبي للجينات المشاركة في مسار إشارة IL-2. د، مخططات violing تظهر مستويات التعبير لعوامل النسخ المختلفة المشاركة في إشارة IL-2 في بيانات scRNAseq المحددة لـ mItgb1. هـ-و، التردد (يسار) والأعداد (يمين) من CD4 المعبر عن CCL5/GZMB خلايا T في ، TILs و طحال الفئران الحاملة لورم T3 بعد 5-7 أيام من التطعيمات (TILs) و 5 (الطحال) وتمثل ثلاث تجارب). ج-ح، التردد (يسار) والأعداد (يمين) من

CD4 الذي يعبر عن CCL5/GZMB خلايا T في ، TILs و طحال الفئران WT الحاملة لورم F244 بعد سبعة أيام من التطعيمات يمثلان تجربتين). i، تردد CTLA-4 في مجموعات مختلفة من CD4 الخاصة بـ mItgb1 تيلز من فئران WT الحاملة لورم T3 ، تمثل ثلاثة تجارب). تكرار تعبير CCL5/GZMB في CD4 تيلز من فئران WT الحاملة لورم T3 المعالجة بـ HDVax بالإضافة إلى PD-1 أو CTLA-4 تمثل ثلاثة تجارب). تُعرض البيانات في جميع الألواح كمتوسطات تم إجراء الإحصائيات باستخدام تحليل التباين الأحادي مع تصحيحات المقارنات المتعددة بطريقة توكي في e-h و j، وتم إجراء تحليل التباين الثنائي مع اختبار تصحيح المقارنات المتعددة بطريقة سيداك للإحصائيات في .

الشكل 4 من البيانات الموسعة | استراتيجية التصفية والفرز لتغنيص خلايا المجموعة 3 بشكل جزئي. أ، رسم بياني يوضح تعبير مجموعة متنوعة من الجينات متراكبًا على CD4 المحدد mItgb1 توزيع TILs UMAP. ب، مخططات تدفق الخلايا التمثيلية توضح استراتيجية الفرز لمجموعات مختلفة في CD4 المحدد بواسطة mItgb1 TILs. ج، رسم بياني تمثيلي لتدفق الخلايا يوضح تعبير CD25 وCD39 وFoxp3 في مجموعات مختلفة بعد الفرز. د، نمو T3 في فئران RAG2-/- التي تلقت خلايا T الكلية من فئران WT المعالجة بـ LDVax. ) وحده أو زائد؛ خلايا المجموعة 3 المستحثة بواسطة LDVax؛ المستحثة بواسطة HDVax،

CD25-negative محدد mItgb1؛ أو متعدد النسائل (غير محدد mItgb1) CD4 خلايا T ). البيانات معبّرة كمتوسط قطر الورم س.م. ، تجربتين). تم حساب القيم باستخدام تحليل التباين ثنائي الاتجاه مصححًا باختبار المقارنات المتعددة لسيداك. على سبيل المثال، تكرار LILRB4 إيجابي مفرد، LILRB4/SEMA4a إيجابي مزدوج أو SEMA4a إيجابي مفرد يعبر عن CD4 المحدد بـ mItgb1. TILs ( تمثل ثلاثة تجارب). يتم التعبير عن البيانات كمتوسط تم إجراء الإحصائيات باستخدام تحليل التباين الأحادي مع تصحيحات المقارنات المتعددة بطريقة توكي.

الشكل 5 من البيانات الموسعة | الخلايا التي تشكل العنقود-3 متميزة عن خلايا Tregs. أ، تحليل GSEA يقارن توقيع الجينات لخلايا العنقود-3 (تسلسل RNA الكلي) بتوقيع الجينات لمختلف CD4 مجموعات خلايا T. تم استخدام درجة الثراء لتحديد -تحديد القيمة لكل مجموعة جينات بواسطة اختبار التبديل. ب، رسم بياني لتدفق الخلايا يظهر صبغ CD25 وFoxp3 في خلايا Tregs المفروزة والخلايا التي تشغل الكتلة-3 بعد 10 أيام من الحضانة في المختبر مع IL-2 فقط ( )، أو زائد IL-10 و أو . يمثل التجربة تجربتين. ج، أنماط تكرار مستقبلات الخلايا التائية في كل مجموعة من I- الناتجة عن HDVax -mItgb1 محدد CD4 تم تحديد T بواسطة TCRseq ومقارنتها مع أنواع TCR في الخلايا التي تشغل الكتلة-3. د، تردد الخلايا التي تعبر عن في Tregs (CD25 فوكس بي 3 ) أو CD25 LILRB4 CD4 خلايا T بعد علاجات مختلفة في الطحال وTILs ، تمثل تجربة واحدة). هـ، تردد الخلايا التي تعبر عن LAG3 و CD49b في الكتلة-3 أو غير الكتلة-3/5 من محدد mItgb1 الخلايا بعد علاجات مختلفة في الطحال و TILs تمثل ثلاثة تجارب). البيانات معبّرة كمتوسط قطر الورم تم إجراء s.e.m. والإحصائيات بواسطة تحليل التباين الثنائي الاتجاه مصحح باستخدام طريقة سيداكس المتعددة
اختبارات المقارنات. CD4 المعزولة حديثًا تم تحفيز خلايا T من مجموعات مختلفة بـ mltgb1 SLP لمدة 72 ساعة، وإنتاج الأشكال النشطة من TGF تم تقييمه بواسطة Multiplex (نسخ بيولوجية) في الكتلة – 5 و 3 تكرارات في جميع الكتل الأخرى وكل القيم هي متوسط تكرارين تقنيين، تمثل تجربتين). الإحصائيات في و تمت باستخدام تحليل التباين الأحادي مع تصحيحات المقارنات المتعددة باستخدام طريقة توكي. ج، خريطة حرارية تظهر مستويات إنتاج السيتوكينات المختلفة (المشار إليها على المحور السيني للخريطة الحرارية). الأرقام تمثل متوسط ثلاث تكرارات بيولوجية مستقلة وتمثل تجربتين. ح، نمو ورم T3 في الفئران WT المعالجة بـ HDVax أو لقاحات غير ذات صلة في اليوم السادس و IL-10 (-1، 4، 7، 10 و 14) بعد حقن الورم T3 ( ، تمثل تجربتين). i، نمو ورم T3 في الفئران WT المعالجة بـ HDVax في اليوم الثالث و IL-10R (-1,5,11 و 18) بعد زراعة الورم ، تمثل تجربة واحدة). البيانات في و معبرًا عنه كمتوسط قطر الورم س.م. تم حساب القيم باستخدام تحليل التباين ثنائي الاتجاه مصححًا باختبار المقارنات المتعددة لسيداك.