DOI: https://doi.org/10.1038/s41413-024-00341-9
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39103355
تاريخ النشر: 2024-08-05
المؤلف: Lena Batoon وآخرون
الموضوع الرئيسي: البلعمة وتنظيم المناعة
نظرة عامة
تبحث هذه الدراسة في دور موت الخلايا المبرمج في الخلايا العظمية، مع التركيز بشكل خاص على الخلايا العظمية الناضجة الإيجابية للأوستيوكالسين (OCN+)، في تطوير العظام بعد الولادة باستخدام نموذج فئري مع كاسبيز 9 القابل للتحفيز. تكشف الدراسة أن تحفيز موت الخلايا المبرمج في الخلايا العظمية OCN+ يعزز تشكيل العظام الفقرية ويزيد من سلف الخلايا العظمية، بينما لم يؤثر نهج مشابه يستهدف الخلايا الإيجابية للأوستريكس على حجم العظام أو كثافتها. ومن الجدير بالذكر أن الزيادة في تراكم العظام لم تحسن القوة الميكانيكية بسبب الاضطرابات في الشبكة اللقونية.
تشير النتائج إلى أن موت الخلايا العظمية يحفز عملية الإيفيروسيتوز من قبل البلعميات العظمية، مما يساهم بدوره في زيادة سلف الخلايا العظمية. سلط التحليل النسخي للبلعميات الإيفيروسيتية الضوء على توقيع مميز، بما في ذلك التعبير عن VEGFA. علاوة على ذلك، أظهرت التجارب التي تتضمن استنفاد البلعميات انخفاضًا كبيرًا في سلف الخلايا العظمية الإيجابية لمستقبل اللبتين والإيجابية للأوستريكس، مما يبرز الدور الحاسم للبلعميات في الوساطة بين تأثيرات موت الخلايا العظمية. بشكل عام، تؤكد هذه الدراسة على أهمية دوران الخلايا العظمية من خلال موت الخلايا المبرمج والإيفيروسيتوز في تشكيل العظام وتقترح طرق علاجية محتملة لتعزيز بناء العظام في البيئات السريرية.
مقدمة
تناقش المقدمة الدور الحاسم لموت الخلايا المبرمج في التطور الطبيعي وتوازن الأنسجة، مع تسليط الضوء على وظيفته في تنظيم تجمعات الخلايا العصبية في قشرة الثدييات والتخلص من خلايا T الذاتية التفاعل في الغدة الصعترية. تشير إلى أن حوالي 200-300 مليار خلية تمر بموت الخلايا المبرمج يوميًا في جسم الإنسان، حيث يتم إدارة هذه العملية بكفاءة من خلال “الإيفيروسيتوز”، الذي يتم بشكل أساسي بواسطة البلعميات. لا يقتصر هذا الآلية على إزالة الخلايا المبرمجة المحتملة الالتهابية ولكنها تعزز أيضًا مسارات الإشارات المؤيدة للحل. ومع ذلك، لا يزال دور الإيفيروسيتوز في الديناميات الهيكلية، وخاصة فيما يتعلق بالخلايا العظمية، غير مستكشف بشكل كافٍ.
تتخصص الخلايا العظمية، التي تعتبر ضرورية لإيداع مصفوفة العظام وتكلسها، من الخلايا السلفية العظمية المتأثرة بعوامل مثل عامل النسخ الأوستريكس (OSX). بينما تم النظر إلى موت الخلايا العظمية تقليديًا على أنه ضار بصحة العظام بسبب تأثيره السلبي المزعوم على تشكيل العظام وإعادة تشكيلها، تهدف المؤلفون إلى التحقيق في دوره الوظيفي في تطوير العظام بعد الولادة. يقدمون نموذج فئري جديد يتميز بكاسبيز-9 القابل للتحفيز (iCasp9) لتحفيز موت الخلايا بشكل انتقائي دون الاستجابات الالتهابية المرتبطة باستراتيجيات الإزالة الأخرى. يسمح هذا النموذج بفحص أكثر دقة لدور دوران الخلايا العظمية من خلال موت الخلايا المبرمج والإيفيروسيتوز، مما يكشف في النهاية عن أهميته في تشكيل العظام.
طرق
تفصل قسم الطرق التصميم التجريبي والإجراءات المستخدمة في الدراسة، مع التركيز على إنشاء ومعالجة نماذج فئران معدلة وراثيًا مختلفة. تم تربية فئران iCasp9 المتجانسة مع فئران أوستيوكالسين (OCN)-Cre وفئران أوستريكس (OSX)-Cre لإنشاء خطوط OCNCre-iCasp9 وOSXCre-iCasp9. بالإضافة إلى ذلك، تم تطوير فئران LepRCre-Tom للتجارب المحددة. التزمت جميع إجراءات الحيوانات بالإرشادات الأخلاقية التي وضعتها جامعة ميتشيغان وجامعة كوينزلاند. تم عزل خلايا النخاع العظمي السدى (BMSCs) من فئران OCN-Cre -/- وتم معالجتها إما بمركب أو AP (250 نانومول/لتر) لتقييم حيوية الخلايا وتكلسها مع مرور الوقت، باستخدام تقنيات مثل صبغة فون كوسا وتصوير الخلايا الحية/الميتة.
استخدمت الدراسة نماذج استنفاد البلعميات باستخدام ليفوسوم الكلودرونات ونموذج الفأر CD169-DTR، مع إعطاء العلاجات لتقييم التأثيرات على نسيج العظام. تم إجراء قياسات ديناميكية للتاريخ النسيجي لتقييم معدلات التكلس، بينما تم قياس المؤشرات الحيوية في المصل باستخدام اختبارات المناعية المرتبطة بالإنزيم (ELISA). تم إجراء التصوير المقطعي المحوسب الدقيق (micro-CT) واختبارات ميكانيكية على العظام الثابتة لتحليل الخصائص الهيكلية. تم استخدام تقنيات المناعة الفلورية وصبغ الأنسجة لتوصيف الأنسجة، مع توفير البيانات من خلال أرشيف قراءة تسلسل NCBI وFigshare. بشكل عام، توفر الطرق الموضحة نهجًا شاملاً لدراسة أدوار التعديلات الجينية المحددة والعلاجات على بيولوجيا العظام.
نتائج
في الدراسة، أدى إعطاء AP (عامل تحفيز موت الخلايا المبرمج) في فئران OCNCre-iCasp9 إلى موت خلايا عظمية انتقائي لـ OCN+ في الفقرات، تم تأكيده من خلال صبغة TUNEL، بينما لم يكن له تأثير كبير على الساق. زاد حقن واحد من 50 ميكروغرام/غ AP بشكل فعال من إشارات الموت الخلوي في الخلايا العظمية الفقرية، لكن هذا التأثير كان مؤقتًا، حيث لم يعد الانخفاض في الخلايا العظمية EGFP+ وOCN+ قابلًا للاكتشاف بعد 48 ساعة من العلاج. كما قامت الدراسة بتقييم دور البلعميات في إزالة الخلايا العظمية المبرمجة، كاشفة عن زيادة في F4/80+ osteomacs على أسطح العظام، مما يدل على تعزيز الإيفيروسيتوز، على الرغم من عدم حدوث تغييرات في العدد الإجمالي للبلعميات أو الخلايا العظمية.
أظهر مزيد من توصيف البلعميات أنه بينما ظل تكرار CD68+ F4/80- من الخلايا العظمية دون تغيير، كان هناك زيادة كبيرة في CD68+ F4/80+ osteomacs المرتبطة بالخلايا العظمية المبرمجة بعد علاج AP. أكدت الصبغات المتعددة والتquantification المدفوعة بالذكاء الاصطناعي أن المزيد من osteomacs احتوت على إشارات EGFP+، مما يدل على زيادة الإيفيروسيتوز. ومع ذلك، لم يتغير العدد الإجمالي للخلايا F4/80+، وأظهر علامة التكاثر Ki67 انخفاضًا في osteomacs المتكاثرة بعد علاج AP، مما يشير إلى أنه على الرغم من تحفيز الإيفيروسيتوز، إلا أنه لم يؤدي إلى زيادة عامة في تكاثر البلعميات في البيئة الفقرية.
مناقشة
تستكشف الدراسة دور موت الخلايا العظمية في تشكيل العظام، كاشفة أن التحفيز المتقطع لموت الخلايا العظمية يمكن أن يعزز بشكل متناقض تشكيل العظام الفقرية على المدى الطويل. باستخدام نموذج الفأر القابل للتحفيز كاسبيز-9 (iCasp9)، أظهر الباحثون أن التحفيز المنضبط لموت الخلايا العظمية أدى إلى زيادة في حجم العظام الفقرية النسبي، ويرجع ذلك أساسًا إلى زيادة سمك التربيق وكثافة المعادن، دون التأثير على معايير العظام الساقية. ومن الجدير بالذكر أن الزيادة في تشكيل العظام كانت مرتبطة بارتفاع في سلف الخلايا العظمية والإيفيروسيتوز البلعمي، مما يشير إلى أن إزالة الخلايا العظمية المبرمجة بواسطة البلعميات قد تحفز تجنيد وتمايز سلف الخلايا العظمية.
على الرغم من الزيادة الملحوظة في حجم العظام، وجدت الدراسة عدم وجود تحسين متناسب في قوة العظام، والذي يُعزى إلى انخفاض في أعداد الخلايا العظمية وزيادة في الفجوات الفارغة داخل العظام التربيقية. تسلط النتائج الضوء على التفاعل المعقد بين موت الخلايا العظمية والديناميات العظمية، مشيرة إلى أنه بينما يُنظر تقليديًا إلى موت الخلايا على أنه ضار بصحة العظام، فإنه قد يلعب أيضًا دورًا حاسمًا في تعزيز تشكيل العظام من خلال آليات تتضمن نشاط البلعميات وديناميات سلف الخلايا العظمية. تؤكد هذه الأبحاث على الحاجة إلى مزيد من الاستكشاف للطرق الخلوية والجزيئية التي تربط بين موت الخلايا، والإيفيروسيتوز، وإعادة تشكيل العظام.
DOI: https://doi.org/10.1038/s41413-024-00341-9
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39103355
Publication Date: 2024-08-05
Author(s): Lena Batoon et al.
Primary Topic: Phagocytosis and Immune Regulation
Overview
This research investigates the role of apoptosis in osteoblasts, particularly focusing on mature osteocalcin-positive (OCN+) osteoblasts, in postnatal bone development using a murine model with inducible Caspase 9. The study reveals that inducing apoptosis in OCN+ osteoblasts enhances vertebral bone formation and increases osteoblast precursors, while a similar approach targeting osterix-positive cells did not affect bone volume or density. Notably, the increase in bone accrual did not improve mechanical strength due to disruptions in the lacunocanalicular network.
The findings indicate that osteoblast apoptosis stimulates efferocytosis by osteal macrophages, which in turn contributes to the increase in osteoblast precursors. Transcriptomic analysis of efferocytic macrophages highlighted a distinct signature, including the expression of VEGFA. Furthermore, experiments involving macrophage depletion demonstrated a significant reduction in leptin receptor-positive and osterix-positive osteoblast precursors, underscoring the critical role of macrophages in mediating the effects of osteoblast apoptosis. Overall, this study emphasizes the importance of osteoblast turnover through apoptosis and efferocytosis in bone formation and suggests potential therapeutic avenues for enhancing bone anabolism in clinical settings.
Introduction
The introduction discusses the critical role of apoptosis in normal development and tissue homeostasis, highlighting its function in regulating neuron populations in the mammalian cortex and eliminating self-reactive T cells in the thymus. It notes that approximately 200-300 billion cells undergo apoptosis daily in the human body, with the process being efficiently managed through “efferocytosis,” primarily performed by macrophages. This mechanism not only clears potentially inflammatory apoptotic cells but also promotes pro-resolution signaling pathways. However, the role of efferocytosis in skeletal dynamics, particularly concerning osteoblasts, remains underexplored.
Osteoblasts, which are essential for bone matrix deposition and mineralization, differentiate from osteoprogenitors influenced by factors such as the transcription factor osterix (OSX). While osteoblast apoptosis has been traditionally viewed as detrimental to bone health due to its perceived negative impact on bone formation and remodeling, the authors aim to investigate its functional role in postnatal bone development. They introduce a novel mouse model featuring Cre-inducible caspase-9 (iCasp9) to selectively induce apoptosis without the inflammatory responses associated with other ablation strategies. This model allows for a more precise examination of osteoblast turnover through apoptosis and efferocytosis, ultimately revealing its significance in bone formation.
Methods
The methods section details the experimental design and procedures used in the study, focusing on the generation and treatment of various genetically modified mouse models. Homozygous iCasp9 mice were bred with Osteocalcin (OCN)-Cre and Osterix (OSX)-Cre mice to create OCNCre-iCasp9 and OSXCre-iCasp9 lines. Additionally, LepRCre-Tom mice were developed for specific experimentation. All animal procedures adhered to ethical guidelines set by the University of Michigan and The University of Queensland. Bone marrow stromal cells (BMSCs) were isolated from OCN-Cre -/- mice and treated with either a vehicle or AP (250 nmol/L) to assess cell viability and mineralization over time, utilizing techniques such as Von Kossa staining and live/dead cell imaging.
The study employed macrophage depletion models using clodronate-liposomes and the CD169-DTR mouse model, with treatments administered to assess the effects on bone tissue. Dynamic histomorphometry was conducted to evaluate mineralization rates, while enzyme-linked immunoassays (ELISA) measured serum biomarkers. Micro-computed tomography (micro-CT) and mechanical testing were performed on fixed bones to analyze structural properties. Immunofluorescence and histological staining techniques were utilized for tissue characterization, with data made available through the NCBI Sequence Read Archive and Figshare. Overall, the methods outlined provide a comprehensive approach to studying the roles of specific genetic modifications and treatments on bone biology.
Results
In the study, the administration of AP (apoptosis-inducing agent) in OCNCre-iCasp9 mice resulted in selective apoptosis of OCN+ osteoblasts in the vertebrae, confirmed by TUNEL staining, while having no significant effect on the tibia. A single injection of 50 µg/g AP effectively increased apoptotic signals in vertebral osteoblasts, but this effect was transient, as the reduction in EGFP+ and OCN+ osteoblasts was no longer detectable 48 hours post-treatment. The study also assessed the role of macrophages in clearing apoptotic osteoblasts, revealing an increase in F4/80+ osteomacs on bone surfaces, indicative of enhanced efferocytosis, despite no changes in the overall number of macrophages or osteoclasts.
Further characterization of macrophages showed that while the frequency of CD68+ F4/80- osteoclasts remained unchanged, there was a significant increase in CD68+ F4/80+ osteomacs associated with apoptotic osteoblasts following AP treatment. Multiplex staining and AI-driven quantification confirmed that more osteomacs contained EGFP+ signals, indicating increased efferocytosis. However, the total number of F4/80+ cells did not change, and the proliferation marker Ki67 showed a decrease in proliferating osteomacs post-AP treatment, suggesting that while efferocytosis was stimulated, it did not lead to an overall increase in macrophage proliferation in the vertebral environment.
Discussion
The study investigates the role of osteoblast apoptosis in bone formation, revealing that long-term pulsed stimulation of osteoblast apoptosis can paradoxically enhance vertebral bone formation. Using an inducible caspase-9 (iCasp9) mouse model, the researchers demonstrated that controlled induction of osteoblast apoptosis led to increased vertebral fractional bone volume, primarily due to enhanced trabecular thickness and mineral density, without affecting tibial bone parameters. Notably, the increase in bone formation was associated with a rise in osteoblast precursors and macrophage efferocytosis, suggesting that the clearance of apoptotic osteoblasts by macrophages may stimulate the recruitment and differentiation of osteoblast precursors.
Despite the observed increase in bone volume, the study found no corresponding improvement in bone strength, attributed to a reduction in osteocyte numbers and an increase in empty lacunae within the trabecular bone. The findings highlight the complex interplay between osteoblast apoptosis and bone dynamics, indicating that while apoptosis is traditionally viewed as detrimental to bone health, it may also play a crucial role in promoting bone formation through mechanisms involving macrophage activity and osteoblast precursor dynamics. This research underscores the need for further exploration of the cellular and molecular pathways linking apoptosis, efferocytosis, and bone remodeling.