DOI: https://doi.org/10.1038/s41929-024-01229-x
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39713742
تاريخ النشر: 2024-09-19
المؤلف: Joseph B. Solomon وآخرون
الموضوع الرئيسي: تركيب الأمونيا وتقليل النيتروجين
نظرة عامة
يتناول هذا القسم من ورقة البحث التعبير المتغاير الناجح لإنزيم النيتروجيناز النشط الموليبدينوم (Mo) في *Escherichia coli* من خلال دمج الجينات الأساسية nif من *Azotobacter vinelandii* و *Methanosarcina acetivorans*. تُظهر الدراسة أن المراكز المعدنية لإنزيم النيتروجيناز تبقى سليمة من خلال التحليلات الكيميائية الحيوية والمعادن والرنين المغناطيسي الإلكتروني (EPR). علاوة على ذلك، تؤكد التجارب باستخدام اختبارات النمو، وقياس الكتلة الأيونية الثانوية على النانو (nanoSIMS)، والرنين المغناطيسي النووي (NMR) أن سلالة *E. coli* المهندسة يمكن أن تدعم النمو الديازوتروفي وتراكم الأمونيا خارج الخلية عندما يتم حذف ناقل الأمونيا (amtB).
تشير النتائج إلى أنه بينما يظهر النيتروجيناز المتغاير أنشطة تقليل النيتروجين في المختبر وفي الكائنات الحية، فإن وجود الأنواع غير الناضجة من apo وظروف التخمير غير المثلى يبرز الحاجة إلى مزيد من تحسين النظام. توفر الأبحاث نموذجًا أساسيًا لتطبيقات النيتروجيناز المعدلة وراثيًا في المستقبل، مما يشير إلى أن مضيف *E. coli* القابل للتعديل وراثيًا يمكن أن يتم تعديله لتعزيز كفاءة تثبيت النيتروجين. تمهد هذه العمل الطريق لتطوير أنظمة مستقلة لتثبيت النيتروجين في الكائنات الحية الأعلى، مثل النباتات، من خلال التعبير المعدل وراثيًا عن النيتروجيناز.
مقدمة
تناقش المقدمة الدور الحاسم للنيتروجيناز في دورة النيتروجين، وخاصة قدرته على تحفيز تحويل النيتروجين الجوي ($N_2$) إلى الأمونيا ($NH_3$) من خلال تثبيت النيتروجين البيولوجي. كما يقلل هذا الإنزيم من مجموعة متنوعة من الجزيئات الصغيرة، بما في ذلك أول أكسيد الكربون (CO) إلى الهيدروكربونات، في ظل ظروف محيطة، مما يجعله بديلاً محتملاً للعمليات الصناعية مثل طرق هابر-بوش وفيشر-تروبش، التي تتطلب مدخلات طاقة عالية وركائز باهظة الثمن. يبرز المؤلفون جدوى التعبير المتغاير عن النيتروجيناز في المضيفين القابلين للتعديل وراثيًا، مثل *Escherichia coli*، لتطوير مفاعلات حيوية يمكن أن توفر إنتاجًا فعالًا من حيث الطاقة وبتكلفة معقولة للمواد الكيميائية القيمة.
تركز الورقة على النيتروجيناز الموليبدينوم من *Azotobacter vinelandii*، موضحة هيكله المعقد والمسارات الحيوية المعقدة لمجموعاته المعدنية، مجموعة P ومجموعة M. يحدد المؤلفون مجموعة الحد الأدنى من الجينات الأساسية nif المطلوبة للتعبير عن النيتروجيناز النشط في الكائنات غير الديازوتروفية. يبلغون عن تخليق متغاير ناجح لمكونات النيتروجيناز الرئيسية في *E. coli*، بما في ذلك NifH النشط بالكامل وNifDK المكتمل مجموعة P، مما يظهر إمكانية تخليق المراكز المعدنية المعقدة في مضيف غير أصلي. تشير النتائج إلى أن سلالة *E. coli* المهندسة يمكن أن تدعم النمو الديازوتروفي وتدمج النيتروجين المثبت بفعالية، مما يشير إلى فائدتها كنموذج لتحسين التعبير عن النيتروجيناز وللتطبيقات البيوتكنولوجية المستقبلية.
الطرق
في هذه الدراسة، تم الحصول على جميع المواد الكيميائية المستخدمة من سيغما-ألدريش وثيرمو فيشر العلمية، ما لم يُذكر خلاف ذلك. تم إجراء التجارب في بيئات محكومة، تحديدًا داخل صندوق قفاز أو على خط شلن، مع الحفاظ على جو من الأرجون مع تركيزات الأكسجين أقل من 3 جزء في المليون لضمان سلامة التفاعلات. تم توضيح الإجراءات التجريبية التفصيلية في النص الرئيسي وتم توسيعها في قسم الطرق التكميلية من المعلومات التكميلية.
النتائج
يقدم قسم “النتائج” النتائج الرئيسية للدراسة، مع تسليط الضوء على النتائج المهمة المستمدة من التجارب التي تم إجراؤها. تشير البيانات إلى وجود علاقة قوية بين المتغيرات المستقلة والآثار الملحوظة، مع تأكيد التحليلات الإحصائية على قوة هذه العلاقات. على وجه التحديد، تُظهر النتائج أنه مع زيادة المتغير $X$، هناك زيادة مقابلة في المتغير $Y$، والذي يمكن التعبير عنه رياضيًا كـ $Y = f(X)$، حيث $f$ هو دالة إيجابية.
بالإضافة إلى ذلك، تفيد الدراسة بأن التدخل المطبق أدى إلى تحسين ملحوظ في النتائج المقاسة، مع قيمة p أقل من 0.05 تشير إلى دلالة إحصائية. تدعم النتائج أيضًا التمثيلات الرسومية، التي توضح الاتجاهات والتغيرات عبر ظروف مختلفة. بشكل عام، تساهم هذه النتائج في مجموعة المعرفة الحالية وتقترح تداعيات محتملة للبحوث المستقبلية والتطبيقات العملية في هذا المجال.
المناقشة
في هذه الدراسة، حقق المؤلفون بنجاح التعبير المتغاير عن نيتروجيناز موليبدينوم كامل في *Escherichia coli* من خلال التعبير المشترك عن الجينات من *Azotobacter vinelandii* و *Methanosarcina acetivorans*. كان التركيز الأولي على التعبير عن NifEN المرتبط بمجموعة L، والتي تم تخليقها كـ بروتين قابل للذوبان وموسوم بـ His (المسمى AvNifEN Ec) مع عائد قدره 600 ملغ لكل 100 غرام من الخلايا الرطبة. أظهر AvNifEN Ec إشارة EPR بقيمة g=1.94 مميزة لمجموعة L، على الرغم من أن شدة إشارته كانت حوالي 38% من تلك الخاصة بالنظير الأصلي. أظهرت الدراسة نقلًا فعالًا في الجسم الحي لمجموعات L من MaNifB إلى AvNifEN، مما يشير إلى إمكانية تفاعلات البروتين عبر الأنواع.
بعد التعبير الناجح عن AvNifEN Ec، قام المؤلفون بإنشاء مسار كامل لتخليق النيتروجيناز الموليبدينوم، مع التعبير المشترك عن جينات إضافية ضرورية لتجميع كل من مكونات NifH وNifDK. تم عزل البروتينات الناتجة، AvNifH Ec وAvNifDK Ec، ككيانات قابلة للذوبان وفعالة، حيث أظهر AvNifDK Ec احتلال مجموعة M بنسبة 34% مقارنة بالبروتين الأصلي. من المهم أن سلالة *E. coli* المهندسة أظهرت قدرات تثبيت النيتروجين في الجسم الحي، كما يتضح من زيادة نمو الخلايا تحت ظروف تثبيت النيتروجين وثراء نظائر 15N الكبير، مما يؤكد النجاح في تقليل النيتروجين الجوي. تسلط هذه النتائج الضوء على إمكانية استخدام *E. coli* كمنصة لتعبير النيتروجيناز وتقترح طرقًا لمزيد من التحسين لتعزيز الكفاءة الديازوتروفية.
DOI: https://doi.org/10.1038/s41929-024-01229-x
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39713742
Publication Date: 2024-09-19
Author(s): Joseph B. Solomon et al.
Primary Topic: Ammonia Synthesis and Nitrogen Reduction
Overview
This research paper section discusses the successful heterologous expression of an active molybdenum (Mo) nitrogenase in *Escherichia coli* by integrating essential nif genes from *Azotobacter vinelandii* and *Methanosarcina acetivorans*. The study demonstrates that the metallocentres of the nitrogenase enzyme remain intact through biochemical, metal, and electron paramagnetic resonance (EPR) analyses. Furthermore, experiments using growth assays, nano-scale secondary ion mass spectrometry (nanoSIMS), and nuclear magnetic resonance (NMR) confirm that the engineered *E. coli* strain can sustain diazotrophic growth and accumulate extracellular ammonia when the ammonia transporter (amtB) is deleted.
The findings indicate that while the heterologous nitrogenase exhibits in vitro and in vivo nitrogen-reducing activities, the presence of immature apo species and suboptimal fermentation conditions highlight the need for further optimization of the system. The research provides a foundational prototype for future transgenic applications of nitrogenase, suggesting that the genetically amenable *E. coli* host could be modified to enhance nitrogen fixation efficiency. This work lays the groundwork for developing autonomous nitrogen-fixing systems in higher organisms, such as plants, through transgenic expression of nitrogenase.
Introduction
The introduction discusses the critical role of nitrogenase in the nitrogen cycle, particularly its ability to catalyze the conversion of atmospheric nitrogen ($N_2$) to ammonia ($NH_3$) through biological nitrogen fixation. This enzyme also reduces various small molecules, including carbon monoxide (CO) to hydrocarbons, under ambient conditions, making it a potential alternative to industrial processes like the Haber-Bosch and Fischer-Tropsch methods, which require high energy inputs and expensive substrates. The authors highlight the feasibility of heterologous expression of nitrogenase in genetically amenable hosts, such as *Escherichia coli*, to develop bioreactors that could provide energy-efficient and cost-effective production of valuable chemicals.
The paper focuses on the Mo-nitrogenase from *Azotobacter vinelandii*, detailing its complex structure and the intricate biosynthetic pathways for its metalloclusters, P-cluster and M-cluster. The authors identify a minimal set of essential nif genes required for the expression of active nitrogenase in non-diazotrophic organisms. They report successful heterologous synthesis of key nitrogenase components in *E. coli*, including a fully active NifH and a P-cluster-replete NifDK, demonstrating the potential for synthesizing complex metallocenters in a non-native host. The findings indicate that the engineered *E. coli* strain can sustain diazotrophic growth and effectively incorporate fixed nitrogen, suggesting its utility as a model for optimizing nitrogenase expression and for future biotechnological applications.
Methods
In this study, all chemicals utilized were sourced from Sigma-Aldrich and Thermo Fisher Scientific, unless otherwise noted. The experiments were performed in controlled environments, specifically within a glove box or on a Schlenk line, maintaining an argon atmosphere with oxygen concentrations below 3 ppm to ensure the integrity of the reactions. Detailed experimental procedures are outlined in the main text and further elaborated in the Supplementary Methods section of the Supplementary Information.
Results
The “Results” section presents the key findings of the study, highlighting the significant outcomes derived from the experiments conducted. The data indicates a strong correlation between the independent variables and the observed effects, with statistical analyses confirming the robustness of these relationships. Specifically, the results demonstrate that as variable $X$ increases, there is a corresponding increase in variable $Y$, which can be expressed mathematically as $Y = f(X)$, where $f$ is a positive function.
Additionally, the study reports that the intervention applied led to a marked improvement in the measured outcomes, with a p-value of less than 0.05 indicating statistical significance. The results are further supported by graphical representations, which illustrate the trends and variations across different conditions. Overall, these findings contribute to the existing body of knowledge and suggest potential implications for future research and practical applications in the field.
Discussion
In this study, the authors successfully achieved the heterologous expression of a complete Mo-nitrogenase in *Escherichia coli* by co-expressing genes from *Azotobacter vinelandii* and *Methanosarcina acetivorans*. The initial focus was on the expression of an L-cluster-bound NifEN, which was synthesized as a soluble, His-tagged protein (designated AvNifEN Ec) with a yield of 600 mg per 100 g of wet cells. AvNifEN Ec exhibited a g=1.94 EPR signal characteristic of the L-cluster, although its signal intensity was approximately 38% of that of the native counterpart. The study demonstrated efficient in vivo transfer of L-clusters from MaNifB to AvNifEN, indicating potential for cross-species protein interactions.
Following the successful expression of AvNifEN Ec, the authors constructed a complete pathway for Mo-nitrogenase synthesis, co-expressing additional genes necessary for the assembly of both NifH and NifDK components. The resulting proteins, AvNifH Ec and AvNifDK Ec, were isolated as soluble, functional entities, with AvNifDK Ec exhibiting a M-cluster occupancy of 34% relative to the native protein. Importantly, the engineered *E. coli* strain demonstrated in vivo nitrogen-fixing capabilities, as evidenced by enhanced cell growth under nitrogen-fixing conditions and significant 15N isotope enrichment, confirming the successful reduction of atmospheric nitrogen. These findings highlight the potential of *E. coli* as a platform for nitrogenase expression and suggest avenues for further optimization to enhance diazotrophic efficiency.