https://doi.org/10.1038/s41586-024-08395-9
تاريخ الاستلام: 26 أكتوبر 2023
مقبول: نوفمبر 2024
نُشر على الإنترنت: 15 يناير 2025
الوصول المفتوح

الأمراض الالتهابية غالبًا ما تكون مزمنة ومتكررة، والعلاجات الحالية لا تزيل عادةً العوامل المسببة للمرض الأساسية. تشارك خلايا T في مجموعة واسعة من الأمراض الالتهابية مثل الصدفية مرض كرون التهاب المريء التصلب المتعدد ، وقد تساهم خلايا T المستنسخة المحددة لمستضدات في مزمنة المرض وعودته، جزئيًا من خلال تشكيل ذاكرة مرضية مستمرة. التهاب الجيوب الأنفية المزمن والربو هما أمراض التهابية في مجرى الهواء غالبًا ما تظهر كحالات مصاحبة. التهاب الجيوب الأنفية المزمن يؤثر على أكثر من من السكان العامين من بين هؤلاء المرضى، سوف تتطور الأورام الأنفية، التي غالبًا ما تتطلب عمليات استئصال جراحية متكررة بسبب ارتفاع معدل التكرار. بينما تت infiltrate خلايا T الوفيرة أنسجة الزوائد الأنفية إن مجموعات خلايا الدم البيضاء التي تؤدي إلى مرض الباثولوجيا وتعزز تكرار المرض ليست مفهومة تمامًا. من خلال مقارنة مجموعات خلايا T في أنسجة الزوائد الأنفية المأخوذة من عمليات جراحية متتالية، نبلغ هنا عن وجود CD8 المستمر. تتواجد نسخ خلايا T التي تحمل ميزات تشبه الذاكرة الفعالة في الأنسجة المخاطية خلال تكرار المرض، وتتميز هذه الخلايا بالتعبير عن التربتاز Granzyme K (GZMK). نجد أن GZMK يقوم بتقطيع العديد من مكونات المكمل، بما في ذلك C2 وC3 وC4 وC5، التي تساهم مجتمعة في تنشيط سلسلة المكمل. خلايا CD8 التي تعبر عن GZMK تشارك الخلايا في هياكل لمفاوية ثانوية منظمة، وتنبئ مستويات GZMK في الأنسجة بشدة المرض والاعتلالات المصاحبة بشكل أفضل من المؤشرات الحيوية المعروفة مثل اليوزينوفيلية والإنترلوكين-5 في الأنسجة. باستخدام نموذج ربو الفئران، نظهر أيضًا أن التعبير عن GZMK تزيد الخلايا من حدة المرض بطريقة تعتمد على النشاط البروتيني لـ GZMK والمكملات. إن الإزالة الجينية أو التثبيط الدوائي لـ GZMK بعد ظهور المرض تخفف بشكل ملحوظ من علم الأمراض النسيجية وتستعيد وظيفة الرئة. عملنا يحدد مجموعة خلايا الذاكرة T التي تعزز التهاب الأنسجة وأمراض الشعب الهوائية المتكررة بواسطة الجزيء الفعال GZMK وتقترح GZMK كهدف علاجي محتمل.

لتحديد ما إذا كانت ذاكرة خلايا T متورطة في تكرار الزوائد الأنفية (NPs)، بحثنا أولاً عن نسخ خلايا T المشتركة في عينات تم الحصول عليها من عمليات جراحية متكررة (الشكل 1a، b). تم إجراء تحليلات مجموعة خلايا T باستخدام عينات مجمدة مزدوجة من ستة مرضى (NP1-6)، مع فترات بين عمليتين جراحيتين تتراوح من 0.2 إلى 3.1 سنوات. تم تضمين أنسجة أنفية من سبعة مرضى خضعوا لجراحة تصحيح الحاجز الأنفي كضوابط صحية (HC1-7) (الشكل 1b والجدول التكميلي 1). تم الحصول على نسخ فردية من مستقبلات خلايا T (TCRs) و تم ترميزها بالباركود وتسلسلها، وتم تجميع المناطق المتغيرة بطول كامل وتعيينها إلى سلالات مختلفة (الشكل 1أ والشكل التوضيحي 2أ، ب). كما
كما هو متوقع، كانت مجموعات خلايا T مميزة بين الأفراد، حيث كان هناك 5 فقط من 1,585 TCRα و1 من 3,888 TCR. سلاسل تُشارك بين مرضى مختلفين (الشكل التوضيحي 2c). على العكس، حددنا باستمرار TCRα وTCR الشائعة. سلاسل في أنسجة NP التي تم الحصول عليها من الجراحتين لنفس المريض (الشكل 1c والشكل التكميلي 2d)، مما يشير إلى أن خلايا من نفس السلالات المستنسخة أعادت استعمار أنسجة NP خلال تكرار المرض. علاوة على ذلك، كانت بعض المستنسخات المستمرة من بين الأكثر هيمنة في كلا العينتين الجراحيتين (الشكل 1c والشكل التكميلي 2)، مما يشير إلى التكاثر المحلي والتوسع.

الشكل 1 | استمرارية نسخ خلايا T في التهاب الأنف المتكرر. أ، سير العمل لتحليل الأنسجة الأنفية التي تمت إزالتها جراحيًا. RT، النسخ العكسي. ب، نظرة عامة على الفترات الجراحية للعينات المزدوجة. انظر الجدول 1 في البيانات الموسعة لمزيد من معلومات المرضى. ج، النسخ المستمرة، التي تم تحديدها بواسطة TCR المتطابق. تسلسلات، تم العثور عليها في عينات جراحية مزدوجة من خلال تحليلات التسلسل الكمي. كل رمز يمثل مستنسخًا واحدًا. UMI، معرف جزيئي فريد. د، هـ، تصور UMAP لـ تجمعات خلايا T (T0-T14) الموجودة في أنسجة NP (د) ووفرتها النسبية في
كل فرد (e). f، g، نسخ خلايا T المستمرة في المرضى NP11-13. f، النسخ التي تحتوي على كل من TCRα و تم تراكب السلاسل المحددة في العينات المزدوجة على UMAP لخلايا T الكلية من نفس المريض. يتم عرض أفضل عشرة مستنسخات فقط. ج، وفرة وتركيب الكتل للمستنسخات الفردية المستمرة التي تم اكتشافها في تحليل scRNA-seq لآخر استئصال للأنف (الأعلى) وتحليل bulk-seq للاستئصال السابق (الأسفل). يتم تصنيف المستنسخات وترقيمها حسب وفرتها في بيانات scRNA-seq.

لاستكشاف إمكانية أن تساهم تجمعات خلايا T المستنسخة في علم الأمراض والانتكاس، قمنا بإجراء تسلسل RNA الرسول على مستوى الخلية الواحدة (scRNA-seq) لعدد إجمالي من CD45 خلايا من سبع عينات جراحية من NP (NP7-13) وأربع عينات جراحية من HC (HC6 و8 و9 و10) (الشكل 1a وb والجدول التكميلي 1). خضع ثلاثة من مرضى NP السبعة (NP11-NP13) لعملية جراحية ثانية لعلاج انتكاسة NP الخاصة بهم في وقت الدراسة، وتم حفظ خزعات NP السابقة من العملية الجراحية الأولى بالتبريد (كريو). من خلال مقارنة تسلسلات TCR من خزعتين NP لكل من هؤلاء المرضى الثلاثة، يمكننا تحديد النسخ الشائعة من خلايا T (الشكل 1b). تم تضمين ما مجموعه 42,466 خلية مناعية في التحليل وتم تجميعها وفقًا لتراكيبها الجينية؛ وتم تحديد مجموعات فرعية من اللمفاويات، والخلايا الشجرية، والوحيدات، وخلايا الماست من خلال تعبير الجينات المميزة الخاصة بها (الشكل التكميلي 1a وb). بعد المناطق المتغيرة الكاملة للطول من تم تجميع مستقبلات TCR (الشكل التوضيحي الممتد 1c)، وتمكن خلايا T الحاملة لمستقبلات وظيفية من التكتل في مجموعات متنوعة في كل من أنسجة HC و NP (الشكل 1d، e، الشكل التوضيحي الممتد 1d، e والجدول التكميلي 2). كما هو متوقع، كانت وفرة خلايا T المساعدة 2 ( تم زيادة مجموعة (T14)، وهي محرك مرض معروف، بشكل ملحوظ في المرضى الذين يعانون من NP مقارنة بمجموعة HC. (الشكل 1f من البيانات الموسعة). بالإضافة إلى ذلك، واحد مجموعة فرعية (T1) وأربعة كانت مجموعات خلايا T (T2 و T7 و T8 و T12) أكثر وفرة أيضًا في أنسجة NP مقارنةً بأنسجة HC (الشكل 1f من البيانات الموسعة).

حددنا 24 و44 و48 من نسخ خلايا T المشتركة في المرضى NP11-NP13، على التوالي. تم تحديد معظم تلك النسخ المشتركة في T0 وT1، اثنان من مجموعات فرعية من الخلايا، بدلاً من الخلايا (الأشكال 1f، g و2a). وبالتالي، يبدو أن تكرار NP مصحوب باستعمار الأنسجة بواسطة CD8 توجد نسخ من خلايا T بالفعل في حلقة المرض السابقة. نظرًا لأن الجراحتين كانتا تفصل بينهما على الأقل 7 أشهر، فمن المحتمل أن تكون تلك الخلايا T مستمدة من ذاكرة مرتبطة بالمرض. الخلايا. من أجل البساطة، نطلق على هذه النسخ المشتركة اسم النسخ المستمرة.

قمنا أيضًا بتوصيف تحت مجموعات خلايا T التي تحتوي على تلك النسخ المستمرة. أظهرت خلايا TO ذاكرة T المقيمة التقليدية ( ) نمط الخلية، يعبر عن جينات أساسية للإقامة في الأنسجة، مثل ITGAE و CD69 و PRDM1 و ZNF683 و RUNX3 (المرجع 12). احتوى مجموعة T1 على عدد قليل نسبيًا من الخلايا ولكن العديد منها تعبر عن خلايا الذاكرة الفعالة T تشمل العلامات KLRG1 و CD27 (الشكل 2أ والشكل البياني الممتد 1هـ). من ناحية أخرى، لم تعبر هذه الخلايا بشكل كبير عن الجينات المرتبطة بالوظائف الفعالة، مثل TBX21 و CX3CR1. كما أن خلايا T1 عبرت عن مستوى نسبي مرتفع من EOMES، وهو عامل نسخ مرتبط بالاستمرارية على المدى الطويل. (الشكل البياني الموسع 1e). تشير هذه البيانات إلى أن النسخ المستمرة هي في الغالب و خلايا شبيهة بـ.

للتحقق مما إذا كانت هذه العلامات السطحية المرتبطة بالإقامة والفعالية لـ TO و T1 يمكن استخدامها لتمييزهما بواسطة تحليل تدفق الخلايا، قمنا بتنقية فرز مختلفة تم فرز مجموعات خلايا T من أنسجة NP (NP14) وأُجريت تحليلات scRNA-seq (الشكل البياني الموسع 2a). عند رسمها على مجموعة البيانات المرجعية (الشكل 1d)، تم فرز كانت السكانية تحتوي بشكل رئيسي على خلايا TO، في حين أن و تمت خريطة الخلايا بشكل رئيسي إلى مجموعة T1 (الشكل 2b,c في البيانات الموسعة).

بعد ذلك، قمنا بمقارنة الوفرة النسبية لـ KLRC1 المرتبطة بـ TO. ITGAE الخلايا، T 1 -المقابلة ITGAE و T1 المقابل -مثل الخلايا في أنسجة HC و NP. قمنا أيضًا بتصنيف أنسجة NP حسب شدة المرض، حيث تم تعريف حالات NP المتكررة أو الربو المصاحب على أنها NP الشديدة (svNP). وجدنا وفرة الـ ITGAE انخفضت مجموعة فرعية بشكل ملحوظ في المرضى الذين يعانون من NP، في حين زادت وفرة KLRG1 المرتبطة بـ T1 بشكل عام زادت الخلايا. نسبة T1 المقيمة، تلك ITGAE الخلايا، التي زادت تدريجياً مع شدة المرض، كانت أكثر وفرة في svNP مقارنة بـ NP (الشكل 2ب-ج).

في محاولة للتنبؤ بمستضدات محتملة تتعرف عليها خلايا T1، قمنا بدمج 37,483 من TCRs المعلّمة من قواعد البيانات العامة. مع تحديد 1,311 T1 TCRs في مجموعة البيانات الخاصة بنا، وأجرينا شبكة
تحليلات باستخدام خوارزمية GLIPH2 حددت نتائجنا 36 مجموعة رئيسية من مستقبلات الخلايا التائية، من بينها 27 تتضمن مستقبلات مع مستضدات معروفة، بما في ذلك البروتينات الفيروسية، والمستضدات الذاتية، والجليادين، وهو مادة مسببة للحساسية تُعرف بشكل متكرر لدى البشر. (الشكل التوضيحي 3).

معظم خلايا T1 هي ITGAE لاختبار العلاقة بين T1 وخلايا T في الدورة الدموية، قمنا بفرز خلايا CD8 من الدم المحيطي تم جمع خلايا T من المرضى NP11 و NP13 لإجراء تحليل تسلسل RNA أحادي الخلية وتحليل TCR (الشكل البياني الممتد 2d). إجمالي 10,897 خلايا CD8 في الدم تم تحليل خلايا T وتصنيفها إلى 14 مجموعة فرعية مختلفة بناءً على ميزات النسخ الجيني (BO-B13؛ الشكل 2d والجدول التكميلي 3)، مما يكشف عن نمط عام لتجمع الخلايا مشابه جدًا بين المريضين. بناءً على تسلسلات TCR، وجدنا عدة نسخ في الدم تتطابق مع النسخ التي تشغل خلايا T1 في الأنسجة لدى كلا المريضين (الشكل 2e والشكل التكميلي 4a). كانت معظم هذه الخلايا الدموية في المجموعة الفرعية B2، مع وجود عدد قليل في B4 وB6 أيضًا (الشكل التكميلي 4b). بعض هذه النسخ المشتركة بين الدم وأنسجة NP كانت نسخًا مستمرة تم رؤيتها بالفعل في أنسجة NP المحفوظة من الجراحة الأولى (الشكل 2f). من بين جميع الدم الخلايا، كانت مجموعة B 2 هي الأكثر تشابهًا مع خلايا الأنسجة T1 (الشكل 2g والشكل التكميلي 4c)، ومع ذلك، كانت تفتقر إلى تعبير توقيعات وأظهرت مستويات أعلى من الجينات المرتبطة بخصائص خلايا T الجذعية، مثل TCF7 وIL7R وSELL (الشكل التوضيحي التكميلي 4d). لذلك، من المحتمل أن تكون خلايا T1 في أنسجة NP مشتقة من خلايا B2 الدموية، وهو نموذج تدعمه أيضًا تحليلات الزمن الزائف (الشكل التوضيحي التكميلي 5a,b).

مجتمعة، تدعم بياناتنا فكرة أن النسخ المستمرة من خزان ذاكرة خلايا T يمكن أن تُستخدم باستمرار في الأنسجة، مما قد يعزز من مرضية المرض وعودته.

بعد ذلك، بحثنا بعناية عن جزيئات التأثير التي قد تستخدمها خلايا T1 في عملية المرض. تعزز السيتوكينات من النوع 2 (مثل IL-4 و IL-5 و IL-13) تجنيد الحمضات، وإعادة تشكيل الأنسجة، وتنشيط خلايا B في مجرى الهواء، مما يمثل المحركات الأكثر رسوخًا لالتهاب الجيوب الأنفية المزمن ومرض الأنسجة الربوي. . ومع ذلك، لم تعبر خلايا T1 عن أي mRNA تقريبًا لسيتوكينات النوع 2 (الشكل 3أ). تعتبر الجرانزيمات جزيئات فعالة مهمة تعبر عنها خلايا CD8 الخلايا. من بين جميع الخلايا في أنسجة NP، كانت خلايا T1 تعبر بشكل فريد عن مستوى عالٍ من نسخ Granzyme K (GZMK) (الشكل 3ب). وقد وُجدت خلايا T التي تعبر عن GZMK في الالتهابات المرتبطة بالشيخوخة ومجموعة متنوعة من الأمراض الالتهابية. من خلال صبغ الخلايا داخلية، كان GZMK معبرًا عنه بشكل كبير في كل من ITGAE و ITGAE نسب من خلايا T1 ولكن ليس في تم إفراز GZMK بواسطة هذه الخلايا عند تحفيز TCR (الشكل 3c). بالإضافة إلى خلايا T، تم التعبير عن GZMK أيضًا بواسطة مجموعة صغيرة من خلايا القاتل الطبيعي (الشكل 1b، d والشكل 3c) التي زادت بشكل ملحوظ في المرضى الذين يعانون من svNP، على الرغم من أن هذه الخلايا كانت أقل وفرة مقارنة بخلايا T1 التي تعبر عن GZMK (الشكل 2e، f والشكل 3c). لاستكشاف الدور المحتمل لـ GZMK في مسببات NP، قمنا بتحليل الأنسجة الأنفية من مجموعة من 148 مريضًا (21 HC، 62 NP و65 svNP) مع تمثيل متوازن للعمر والجنس (الشكل التكميلية 6a-d)، ووجدنا أن مستويات بروتين GZMK في الأنسجة ولكن ليس في المصل كانت مرتفعة في NP وأيضًا في svNP (الشكل 3d والشكل التكميلية 6e). مثلت مستويات GZMK في الأنسجة عامل خطر لـ svNP كما تم التنبؤ به بواسطة نموذج انحدار خطي متعدد تم تعديله للجنس والعمر ومؤشر كتلة الجسم (الجدول التكميلية 2). في الواقع، كانت مستويات GZMK في الأنسجة علامة بيولوجية تنبؤية أفضل لـ svNP من مستويات الإيوزينوفيل في الأنسجة وIL-5، وهما عاملان خطر معروفان جيدًا لـ svNP. (الشكل 3e). بالإضافة إلى ذلك، كانت مستويات GZMK مرتبطة إيجابيًا بوفرة الإيوزينوفيلات النسيجية في المرضى الذين يعانون من svNP (الشكل التوضيحي 2a). مجتمعة، تدعم هذه البيانات إمكانية أن يمكن أن تؤدي الخلايا إلى تفاقم التهاب المسالك الهوائية وتعزز الأمراض الهوائية المتكررة من خلال الإنزيم الفعال GZMK.

للتحقيق فيما إذا كان وكيف يمكن أن يعزز GZMK الالتهاب، قمنا بتوصيف الركائز المحتملة له في أنسجة NP. لهذا الغرض، قمنا بتعبير GZMK البشري المعاد تركيبه من النوع البري وغير النشط سير. طفرة -to-Ala (GZMK-S214A) في خلايا 293-F (الشكل 4a من البيانات الموسعة). تم تأكيد نشاطهم الإنزيمي وعدم نشاطهم في المختبر.
باستخدام الركائز البديلة (الشكل التمديدي 4ب، ج). بعد ذلك، قمنا بترسيب الأجسام المضادة المحتملة للركائز GZMK عن طريق حاضنات مرتبطة بـ GZMK-S214A مع مستخلصات أنسجة NP المأخوذة من ثلاثة مرضى خضعوا لإزالة NP جراحياً. من خلال تحليل البروتينات المسحوبة باستخدام الكروماتوغرافيا السائلة-مطياف الكتلة (الشكل 4أ، ب)، حددنا 161 و1,300 و3,116 بروتينات مرتبطة بـ GZMK من هؤلاء المرضى الثلاثة (NP15-17)، على التوالي (الشكل 4ج و

الجداول التكميلية 1 و 4). من بين تلك 56 بروتينًا التي تشترك فيها جميع المرضى، كانت هناك ركائز معروفة لـ GZMK، بما في ذلك SET و HNRNPK و TUBB. (الشكل 4ج، د). أكدنا انقسام SET من خلال إجراء اختبار هضم في المختبر باستخدام GZMK من النوع البري (الشكل التمديدي 4د). علاوة على ذلك، أكدنا انقسام ركيزة جديدة تم تحديدها، DMBT1، والتي أظهرت أنها تقلل الالتهاب في نموذج التهاب الأنف لدى الفئران. (الشكل 4e من البيانات الموسعة).

كان المكمل C3 من بين الركائز الجديدة التي تم تحديدها. نظرًا لموقعه المركزي في سلسلة المكملات ودوره البارز في تعزيز الالتهاب، قمنا بتوصيف تنشيطه بواسطة GZMK بالتفصيل. باستخدام C3 المنقى من المصل كركيزة اختبار، وجدنا أن GZMK قام بقطع C3 بسهولة (الشكل 4e، f)، مما يظهر كفاءة تحويل C3 بنسبة 35% من C3 المحول الكلاسيكي C4b2a (الشكل التمديدي 4f، g). من خلال تسلسل إدمان والاختبارات المناعية، أكدنا أن موقع القطع كان عند في سلسلة C 3، التي تؤدي إلى إطلاق C 3 a (الشكل 4e، f)، وهو وسيط قوي للالتهابات تم ربطه بأمراض مجرى الهواء الالتهابية. لقد تحققنا أيضًا من أن C3a المحول بواسطة GZMK أدى إلى مستويات مماثلة من فسفرة ERK في خلايا THP1 كما فعل C3a المنقى من المصل أو C3a المحول بواسطة C4b2a (الشكل 4h-j من البيانات الموسعة). مجتمعة، تؤكد هذه البيانات أن GZMK يمكن أن يعمل كإنزيم بروتيني منشط لـ C3 لإنتاج C3a النشط القادر على تعزيز الالتهاب.

نظرًا لأن عدة بروتينات مكملة تم تحديدها كركائز محتملة في تفاعل GZMK-S214A (الجدول التكميلي 4)، قمنا باختبار ما إذا كان GZMK يمكن أن يستهدف عدة خطوات في سلسلة المكملات. باستخدام بروتينات مكملة نقية من المصل كركائز، وجدنا أن GZMK كان قادرًا على قطع C2 إلى C2a وC2b (الشكل البياني الموسع 5a-c)، وC4 إلى C4a وC4b (الشكل البياني الموسع 5d-f). لذلك، يمكن أيضًا من حيث المبدأ أن يعزز GZMK تشكيل المحول الكلاسيكي C3 C4b2a. علاوة على ذلك، GZMK
يمكن أن يقطع C5 (الشكل 5g-i من البيانات الموسعة) بطريقة غير تقليدية لزيادة نشاط معقد هجوم الغشاء (الشكل 5j من البيانات الموسعة). لذلك، يعتبر GZMK جزيءًا فعالًا مؤيدًا للالتهابات يمكن أن يعمل من خلال تنشيط سلسلة المكملات.

قمنا بعد ذلك بإجراء تحليل المناعة النسيجية للأنسجة الأنفية من الأصحاء والمرضى الذين يعانون من التهاب الأنف. بينما كان هناك عدد قليل جداً من CD8 تم العثور على خلايا T في HC، بأعداد كبيرة من تم العثور على خلايا، بما في ذلك تلك التي تعبر عن GZMK، في أنسجة NP، وخاصة من المرضى الذين يعانون من أمراض أكثر شدة؛ حيث شكلت العديد من تلك الخلايا تجمعات حول الأوعية الدموية، مما يذكر بالهياكل اللمفاوية الثلاثية (الشكل التوضيحي الممتد 6a-c). بالإضافة إلى ذلك، كان C3 موجودًا بكثرة في GZMK. مناطق تجمع الخلايا (الشكل التكميلي 7a، b)، تشير إلى تحويل C3 في الموقع بواسطة GZMK. لتوصيف المحتويات الالتهابية في هذه التجمعات من CD8 المعبر عن GZMK الخلايا، قمنا باستئصال الأنسجة المحتوية على التجمعات بواسطة الميكروتشريح بالليزر وأجرينا تسلسل RNA الكمي (الشكل 6d-f من البيانات الموسعة). كما هو متوقع، كانت المستويات الأعلى من و تم العثور عليها في المناطق أكثر من المناطق النسيجية التي تحتوي على القليل الخلايا (الشكل الإضافي 6g والشكل التكميلية 7c، d). المناطق الغنية بالتعبير عن GZMK كما احتوت الخلايا على مستويات أعلى من النسخ المرتبطة بـ الخلايا، خلايا B والخلايا النخاعية (الشكل التوضيحي الممتد 6 ج والجدول التكميلية 5)، ولكن ليس وخلايا T التنظيمية (الشكل التوضيحي 7e). كما احتوت مناطق تجمع الخلايا على مستويات أعلى من الكيموكينات ومستقبلات الكيموكينات المهمة لاستقطاب الخلايا الالتهابية (على سبيل المثال، CXCR3، CXCR4، CCL4 وCCL5) ولتنظيم الهياكل اللمفاوية الثلاثية (على سبيل المثال، CCR7، CXCR5 ورابطة كل منهما). مستويات أعلى من السيتوكينات الالتهابية

الشكل 4 | تحديد ركائز GZMK. أ، سير العمل لاختبار سحب GZMK. ب، جيل ممثل ملون بصبغة كوماتسي زرقاء يظهر البروتينات التي تم سحبها بواسطة GZMK-S214A غير النشط إنزيميًا. البيانات تمثل ثلاث تجارب مستقلة باستخدام عينات مختلفة من المرضى. ج، البروتينات الفريدة والمتداخلة التي تتفاعل مع GZMK والتي تم تحديدها في المرضى NP15-17. د، مخططات النقاط تظهر وفرة البروتينات المشتركة الـ 56 المتفاعلة مع GZMK الموجودة في جميع المرضى ودرجات SEQUEST. انظر الطرق لمزيد من التفاصيل.
تقطيع C3 المنقى من المصل بواسطة GZMK. يتم عرض هلام ملون بصبغة كوماتسي زرقاء (يسار) والرسم التخطيطي الذي يوضح موقع التقطيع (يمين)، كما تم تحديده بواسطة تسلسل إدمان. S، سيرين؛ N، أسباراجين؛ L، ليوسين. f، صور مناعية تظهر تقطيع GZMK لـ C3 المنقى من المصل. البيانات تمثل على الأقل ثلاث تجارب مستقلة (e و f). الصور المصدرية للهلام والصور المناعية مقدمة في الشكل التكميلية 1.
(على سبيل المثال، IL6 و IL16 و IL32 و IL27) تم رؤيتها أيضًا في هذه التجمعات (الشكل التوضيحي الممتد 6g والجدول التكميلية 5).

بشكل عام، شكلت الخلايا التي تعبر عن GZMK حوالي إجمالي الخلايا في هذه التجمعات (الشكل 6g-i من البيانات الموسعة)، حيث الخلايا موجودة أيضًا بكثرة (الشكل 6h,j من البيانات الموسعة)، مما يشير إلى أن مثل هذه الهياكل قد تعزز التواصل بين هذين المسارين لتعزيز نشوء المرض. التحليلات الإحصائية باستخدام CellPhoneDB لم يتوقع تفاعلات قوية بين خلايا T و الخلايا (الشكل التكميلي 8أ). ومع ذلك، فإن خلايا T 1 تعبر بشكل كبير عن الكيميائيات CCL5 وCCL4 (الشكل التكميلي 8ب)، مما قد يساعد في جذب خلايا المناعة من النوع 2 التي تعبر عن CCR1 أو CCR3 أو CCR5. ووفقًا لهذه الفكرة، توقعت تحليلاتنا أن GZMK تتفاعل الخلايا بشكل واسع مع الخلايا الميلويدية المؤيدة للالتهابات، مثل البلاعم (المرجع 10) (الشكل التوضيحي التكميلي 8c-f)، حيث أن هذه الخلايا تعبر عن أزواج متطابقة من مستقبلات الكيموكين (الشكل التوضيحي التكميلي 8g). بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يعمل C3a الذي يتم إنتاجه محليًا بواسطة GZMK كعامل جذب للخلايا الفعالة من النوع 2 التي تعبر عن C3AR، بما في ذلك الحمضات والخلايا البدينة.
(الشكل التوضيحي 8h)، والذي بدوره سيقوم بإفراز السيتوكينات والوسائط الالتهابية لتعزيز تلف الأنسجة والمناعة من النوع 2 .

لاختبار مباشرة ما إذا كان GZMK من CD8 تعمل خلايا T على تعزيز مرض الالتهاب في مجرى الهواء، وقد أنشأنا نموذج ربو في الفئران باستخدام الألبومين البيضوي (OVA) كمستضد. تم تحصين فئران C57BL/6 أولاً باستخدام OVA الممزوج في 50% من الألومنيوم والليبوبوليسكاريد (LPS)، ثم تم تحديها عن طريق استنشاق OVA المتناثر بعد أسبوع. تم تكرار استنشاق OVA مرتين لمحاكاة تكرار المرض، وتم إجراء تحليلات فرز الخلايا المعتمدة على الفلورية (FACS) لخلايا سائل غسل القصبات الهوائية (BALF) بعد يومين من كل تحدٍ (الشكل البياني الموسع 7a، b). تم استقطاب مجموعات متنوعة من خلايا المناعة إلى مجرى الهواء عند تحدي OVA، بما في ذلك الحمضات، العدلات، خلايا، تم تقييد تعبير Gzmk بشكل كبير إلى CD8 الخلايا ولكنها شبه غير قابلة للاكتشاف في CD4 الخلايا التائية، وزادت بشكل تدريجي مع التحديات المتكررة لـ OVA
(الشكل البياني الموسع 7d). من خلال تحليلات تسلسل RNA أحادي الخلية (scRNA-seq) أكدنا تعبير Gzmk في مجموعة فرعية من CD8 في سائل غسيل الشعب الهوائية (BALF). خلايا T، وبعض من هذه الخلايا T التي تعبر عن Gzmk زادت أيضًا من تعبير Itgae (الشكل البياني الممتد 7e، f)، مشابهة جدًا لخلايا T1 في أنسجة NP البشرية.

بعد ذلك، اتبعنا نهج فقدان الوظيفة لفحص تطور التهاب المسالك الهوائية في CD4-cre;Gzmk الفئران، التي تفتقر إلى Gzmk في خلايا T (الشكل التوضيحي الممتد 8a). مقارنةً بـ CD4-cre؛Gzmk تحكم، CD4-cre؛ Gzmk كانت الحيوانات تحمل أعدادًا منخفضة بشكل ملحوظ من الإيوزينوفيلات، العدلات، CD4 تعمل خلايا T، والخلايا الشجرية، والبلعميات في سائل غسيل القصبات الهوائية (الشكل 8b من البيانات الموسعة). تحسنت وظيفة الرئة لدى هذه الفئران الأخيرة، حيث أظهرت تحملًا أفضل تجاه تضيق مجرى الهواء المستحث وانخفاض فرط تنسج خلايا الكأس (الشكل 8c-e من البيانات الموسعة). لذلك، فإن GZMK المستمد من خلايا T يعزز الالتهاب في مجرى الهواء.

لتقييم دور تم أخذ GZMK المشتق من خلايا T، حيث اتبعنا نهجين متكاملين. في المجموعة الأولى من التجارب، قمنا بنقل الخلايا معًا مع أو خلايا T إلى Trrb تكراد الفئران المستقبلة التي تفتقر إلى خلايا T (الشكل 8f من البيانات الموسعة). بعد تحفيز الربو، تم إعادة تكوين تلك الفئران بـ كانت الخلايا تحتوي على أعداد أقل بشكل ملحوظ من الحمضات في سائل غسيل القصبات الهوائية (الشكل 8g من البيانات الموسعة). في المجموعة الثانية من التجارب، قمنا بنقل CD45.1 بشكل تفاعلي. تم نقل خلايا OT-I الخاصة بـ OVA والتي تعبر عن GZMK بشكل مفرط، أو الطفرة غير النشطة GZMK-S213A، أو GZMB إلى مضيفين متجانسين CD45.2 وتم تحفيز الربو الحاد باستخدام OVA (الشكل التمديدي 9a، c). بعد جرعة واحدة من تحدي OVA المستنشقة، وُجدت زيادة في تسرب الخلايا الحمضية إلى مجرى الهواء في المتلقين لخلايا OT-I التي تعبر عن GZMK بشكل مفرط، بينما لم تُحدث خلايا OT-I التي تعبر عن GZMK-S213A غير النشطة أو GZMB أي فرق (الشكل التمديدي 9b، d). لم تتأثر توسع أو تراكم خلايا OT-I T بالتعبير المفرط عن GZMB أو GZMK (الشكل التمديدي 9b، d)، مما يشير إلى أن تنشيط وتكوين الذاكرة لهذه الخلايا لم يتغير بشكل كبير. عندما تم نقلها بالتبني إلى الفئران، كانت خلايا OT-I التي تعبر عن GZMK بشكل مفرط لم تعد قادرة على تعزيز تسرب الحمضات إلى مجرى الهواء (الشكل 9e، f من البيانات الموسعة)، مما يشير إلى أن C3 ضروري في هذه العملية، على الرغم من العيوب المناعية في هذه الحيوانات. منعنا من التحقيق في المزيد من الآثار طويلة الأمد. مجتمعة، تشير نتائجنا إلى أن CD8 المستخلص من خلايا T GZMK يعزز تسرب الإيوزينوفيل إلى مجرى الهواء عن طريق تنشيط C3.

لفحص ما إذا كان استهداف GZMK قد يوفر فوائد علاجية، قمنا بتربية الـ سلالة مع سلالة Rosa26-CreERT2، التي تمكن من تحفيز التاموكسيفين الاستئصال. كما هو موضح في الشكل 5أ، روزا26-كريERT2؛Gzmk تم معالجة الفئران بالتاموكسيفين بعد التطعيم الأولي بـ OVA ولكن قبل أول تحدي استنشاق (المجموعة B) أو بعد الأول ولكن قبل الثاني (المجموعة C). التحكم Rosa26-creERT2;Gzmk تمت معالجة الحيوانات أيضًا بالتاموكسيفين (المجموعة A). بدون علاج التاموكسيفين، روزا26-creERT2؛Gzmk وروزا26-creERT2؛Gzmk تطورت الفئران التهاب مجرى الهواء المقارن (الشكل التوضيحي 9). عندما تم تحفيز حذف Gzmk قبل أي تحدي استنشاق، كان هناك عدد أقل بكثير من الحمضات والعدلات، تم العثور على الخلايا والخلايا الشجرية في سائل غسيل الشعب الهوائية (الشكل 5ب، مقارنة المجموعة ب مع أ). عندما تم تحفيز حذف Gzmk بعد التحدي الأول بالاستنشاق ولكن قبل حدوث نوبة جديدة من نوبة الربو، وُجد عدد أقل بكثير من الحمضات والخلايا الشجرية في خلايا سائل غسيل الشعب الهوائية (الشكل 5ب، مقارنة المجموعة ج مع أ). لتحديد ما إذا كان حذف Gzmk سيؤدي إلى استعادة وظيفة الرئة، قمنا بقياس أحجام الزفير القسري في هذه المجموعات الثلاث من الفئران خلال تحدي الميثاكولين. مقارنة بالمجموعة أ، كانت وظائف الرئة في كل من المجموعة ب والمجموعة ج محسّنة بشكل كبير (الشكل 5ج) وانخفضت فرط تنسج خلايا الكأس (الشكل 5د، هـ).

علاوة على ذلك، اختبرنا أيضًا ما إذا كان تثبيط GZMK عن طريق الأدوية يمكن أن يخفف من الربو في الفئران. بعد تحفيز الربو، تم علاج هذه الفئران كل يومين باستخدام مركب صناعي
دواء يثبط بقوة نشاط GZMK لكل من الإنسان والفأر، D-Phe-Pro-Arg-chloromethylketone (PPACK) ، ولكن ليس مثبط GZMB كاربوبنزوكسي-إيل-غلوتاميك-ثريونين-أسبارتيك-فلوروميثيل كيتون (Z-IETD-FMK) قلل بشكل كبير من تسلل الإيوزينوفيل إلى مجرى الهواء (الشكل التوضيحي الممتد 10a-c). كما قلل PPACK بشكل كبير من فرط تنسج خلايا الجُبَيْبَات وحسن وظيفة الرئة في الربو لدى الفئران (الشكل التوضيحي الممتد 10d-f). مجتمعة، تدعم بياناتنا أن GZMK الناتج عن تعتبر خلايا GZMK محركًا مهمًا لالتهاب مجرى الهواء وتقدم المرض، وأن إزالة أو تثبيط GZMK يمكن أن تكون استراتيجية علاجية مفيدة.

في هذه الدراسة، حددنا مجموعة فرعية من الأنسجة المزروعة، مثل خلايا T التي تعزز التهاب المسالك الهوائية من خلال جزيئها الفعال المميز GZMK. خلايا CD8 التي تعبر عن GZMK تم العثور على خلايا في الأورام وأنسجة الأمراض للعديد من الاضطرابات المناعية الذاتية مثل التهاب المفاصل الروماتويدي والتهاب الكلى الذئبي . ومع ذلك، لم يتم تحديد الأهمية الوظيفية لهذه الخلايا في علم الأمراض المرتبط بالأمراض. من خلال استخدام أساليب فقدان الوظيفة واكتساب الوظيفة في نماذج الربو لدى الفئران، تُظهر دراستنا دورًا محوريًا لخلايا CD8 التي تعبر عن GZMK. الخلايا التائية في تعزيز التهاب المسالك الهوائية.
من المعروف أن الخلايا تلعب أدوارًا تعزز الأمراض أو تنظيمها في الاضطرابات الالتهابية، بشكل أساسي من خلال قتل الخلايا المستهدفة بواسطة GZMB. على سبيل المثال، CD8 التي تعبر عن GZMB تساهم خلايا T في مسببات مرض السكري من النوع الأول من خلال قتل خلايا بيتا. . من ناحية أخرى، مجموعة فرعية من GZMB المعبر عنها تقوم خلايا T بتثبيط المناعة الذاتية من خلال القضاء على خلايا CD4 التفاعلية ذاتيًا خلايا لا يُعرف GZMK كإنزيم سيتوتوكسي رئيسي في قتل الخلايا التائية. يحدد عملنا GZMK كإنزيم بروتيني جديد ينشط سلسلة مكملات، وهو اكتشاف تدعمه أيضًا ورقة بحثية حديثة. لقد حددت الأبحاث السابقة دور المكمل في بقاء خلايا T في حالة التوازن. والتحفيز المساعد . ومع ذلك، تُظهر أعمالنا جزيءًا فعالًا من خلايا T لم يُقدَّر سابقًا في تنشيط نظام المكمل، مما سيساعد في تنسيق تنشيط المناعة التكيفية والفطرية. بالإضافة إلى ذلك، من المحتمل أن تُستخدم GZMK أيضًا بواسطة خلايا مناعية أخرى، مثل خلايا اللمفوية الفطرية، كآلية عامة لتعزيز تنشيط المكمل والاستجابات الالتهابية.

لا يقوم GZMK فقط بتقسيم C3 إلى C3a وC3b، بل يستهدف أيضًا كل من C2 وC4 لتعزيز إنتاج المحول الكلاسيكي C3 C4b2a. بهذه الطرق، يساعد GZMK في إنتاج العامل C3a المؤيد للالتهابات، وهو مادة كيميائية جذابة قوية لخلايا المناعة التي تعبر عن C3AR. في نماذج الحيوانات، نوضح أن GZMK يساهم في التوظيف المبكر للحمضات في المسالك الهوائية بطريقة تعتمد على C3. الحمضات هي عوامل مرضية مهمة يمكن أن تعزز لاحقًا الالتهاب، وتلف الأنسجة، وإعادة تشكيلها من خلال إفراز السيتوكينات والبروتينات الكاتيونية. . بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تشير C3a و C3b في خلايا مناعية مختلفة، بما في ذلك مجموعات فرعية من الخلايا النخاعية والألياف، لتحفيز الاستجابات الالتهابية. من خلال قطع C2 وC4 وC5، يمكن أن يعزز GZMK أيضًا تشكيل معقد الهجوم الغشائي النهائي، مما يؤدي إلى مزيد من تلف الأنسجة والالتهاب. من ناحية أخرى، من المهم أن نلاحظ أن الركائز الأخرى لـ GZMK بما في ذلك DMBT1، وهو منظم سلبي لالتهاب الأنف في الفئران من المحتمل أن تساهم أيضًا في التأثير العام الذي يؤدي إلى تفاقم المرض الناتج عن GZMK.

يبدو أن الفصل بين خلايا TO التي تعبر عن GZMB وخلايا T1 التي تعبر عن GZMK في نسيج NP يعكس انقسام خلايا المساعدة من النوع 1 والنوع 2، والذي يعتمد على تعبير سيتوكينات مميزة. هذه المجموعتان الفرعيتان لديهما تداخل كلوني ضئيل ولكن مرتبطتان بأنواع مختلفة من الدم. المجموعات الفرعية في مجموعة المرضى التي قمنا بتحليلها. نفترض أن هناك اختيارًا لسلالة بين مسارات التأثير GZMB وGZMK قد يتم اتخاذه في وقت مبكر خلال الاستجابة. اقترحت الدراسات الحديثة أن التقليد الجزيئي قد يكون وراء تنشيط الخلايا التائية الشاذة ومرض المناعة الذاتية في الأمراض الالتهابية مثل التصلب المتعدد والتهاب الفقار المقسط. ستشكل خلايا T التي تتعرف على كل من الببتيدات الغريبة والذاتية ذاكرة مناعية نتيجة العدوى.

الشكل 5 | إزالة GZMK تقلل الالتهاب وتستعيد وظيفة الرئة في الربو. أ، إعداد التجربة. ب، أعداد خلايا المناعة المشار إليها في سائل غسيل القصبات الهوائية. كل رمز يشير إلى فأر واحد، والخطوط تمثل المتوسطات. DC، خلية دندريتية. ج، وظيفة الرئة وفرط حساسية المجاري الهوائية استجابةً لجرعات متزايدة من الميثاكولين، تم قياسها بواسطة تقنية التذبذب القسري (انظر الطرق لمزيد من التفاصيل). كل رمز يشير إلى فأر واحد والأشرطة تمثل
يعني. د، علم الأنسجة الرئوية. د، صبغة AB-PAS التمثيلية لشرائح أنسجة الرئة. هـ، المناطق في مجرى الهواء (انظر الطرق لمزيد من التفاصيل). كل رمز يشير إلى فأر واحد، والخطوط تمثل المتوسطات. تم تجميع البيانات من ثلاث تجارب مستقلة، مع تضمين ما لا يقل عن حيوانين في كل مجموعة. القيم بواسطة غير متطابقة ذات جانبين -اختبارات. قضبان القياس، . i.p.، داخل الصفاق؛ i.h.، استنشاق؛ DPI، أيام بعد التحصين.
وأن تصبح ذاتية التفاعل في وقت لاحق من الحياة. تشمل خلايا T1 تلك التي يُتوقع أن تتعرف على المواد المسببة للحساسية، والفيروسات، والبروتينات الذاتية بواسطة GLIPH2، مما يقدم تفسيرًا محتملاً لتوسعها النسلي في نسيج الأنف.

ملاحظتنا أن خلايا T التي تعبر عن GZMK تميل إلى التجمع داخل الهياكل اللمفاوية الثلاثية حيث الخلايا تشير إلى إمكانية أن هذين المسارين قد يتعاونان لتعزيز المرض. الكريات البيض الحمضية والخلايا البدينة التي تم تجنيدها بواسطة C3a الناتج عن GZMK هي مصادر لـ IL-4 و IL-13 (المرجع 47)، والتي تعزز تمايز خلايا المناعة من النوع 2. بالإضافة إلى ذلك، فإن C3a والكيماكينات التي تفرزها GZMK قد تساهم خلايا T بشكل جماعي في استقطاب خلايا المايلويد المسببة للالتهابات، مما يغذي بدوره تنشيط المؤثرات من النوع 2. من ناحية أخرى، وجدنا أيضًا مستويات عالية من GZMK في مجموعة فرعية من المرضى الذين يعانون من svNP دون وجود الإيوزينوفيلية النسيجية وتوقيعات النوع 2، بما في ذلك المريض NP12 الذي قمنا بتحليله بعمق، مما يشير إلى أن GZMK قد يعزز أيضًا الالتهاب في مجرى الهواء بشكل مستقل في هؤلاء المرضى. تدعم هذه الفكرة أيضًا نتائجنا التي تشير إلى أن GZMK النسيجي يتنبأ بشدة المرض بشكل أفضل من توقيعات النوع 2 المعروفة، وتقترح أن العلاجات المستهدفة لـ GZMK قد توفر فوائد إضافية للمرضى الذين يعانون من أمراض غير من النوع 2.

حقيقة أن CD8 الذي يعبر عن GZMK يمكن أن تدور الخلايا، كما هو موثق هنا وفي أماكن أخرى سيوضح لماذا قد لا تكون استئصال الأورام غير المحددة علاجًا شافيًا ويقترح أن الحذف المستهدف لهذه الخلايا يمكن أن يقلل من تكرار المرض. في الواقع، من خلال تحليل مجموعة فريدة من العينات المتطابقة المجمعة من مرضى يعانون من أمراض متكررة، دراستنا
توثق استمرار وإعادة زراعة الخلايا التي تعبر عن GZMK النسخ في الأنسجة المريضة، مما يوفر دليلاً قوياً على الذاكرة المناعية التكيفية في دفع تكرار الأمراض الالتهابية لدى البشر. تسلط النتائج من دراسات الإزالة الجينية والدراسات المثبطة دوائياً في نماذج حيوانية الضوء على استمرار عمل المسارات المعتمدة على GZMK في تقدم المرض وتوفر مبرراً لتطوير علاجات مستهدفة لـ GZMK في السيطرة على الأمراض الالتهابية.

أي طرق، مراجع إضافية، ملخصات تقارير Nature Portfolio، بيانات المصدر، بيانات موسعة، معلومات إضافية، شكر وتقدير، معلومات مراجعة الأقران؛ تفاصيل مساهمات المؤلفين والمصالح المتنافسة؛ وبيانات توفر البيانات والرموز متاحة علىhttps://doi.org/10.1038/s41586-024-08395-9.

5. سكولينا، سي. وآخرون. التصلب المتعدد: خلايا CD8+T المتسللة إلى الدماغ تستمر كامتدادات متطابقة في السائل الدماغي الشوكي والدم. إجراءات الأكاديمية الوطنية للعلوم في الولايات المتحدة الأمريكية 101، 2428-2433 (2004).
6. بابي، هـ. وآخرون. التوسع النسلي لخلايا T من نوع CD8(+) يهيمن على تسلل خلايا T في آفات التصلب المتعدد النشطة كما هو موضح من خلال الميكروتلاعب وتفاعل البوليميراز المتسلسل على مستوى الخلية الواحدة. ج. تجريبي. ميد. 192، 393-404 (2000).
7. جارفيز، د. وآخرون. الربو لدى البالغين وارتباطه بالتهاب الجيوب الأنفية المزمن: مسح GA2LEN في أوروبا. الحساسية 67، 91-98 (2012).
8. باخرت، سي. وآخرون. التهاب الجيوب الأنفية المزمن لدى البالغين. مراجعات الطبيعة. المبادئ التوجيهية للأمراض 6، 86 (2020).
9. شلايمر، ر. ب. المناعة المرضية لالتهاب الجيوب الأنفية المزمن والسلائل الأنفية. مراجعة سنوية في علم الأمراض 12، 331-357 (2017).
10. وانغ، و. وآخرون. تحديد ملف تعريف الخلايا الفردية لآليات التباين الالتهابي في التهاب الجيوب الأنفية المزمن. نات. مناعة. 23، 1484-1494 (2022).
11. ما، ج. وآخرون. تحليل الخلايا الفردية يحدد مجموعات متميزة من خلايا T السامة CD4(+) ومجموعة خلايا TH2 IL-10(+)CD109(+) في الزوائد الأنفية. علوم المناعة.https://doi.org/10.1126/sciimmunol.abg6356 (2021).
12. بوجرت، م.، برايس، د. أ.، ماكاي، ل. ك. وبيتي، م. ر. خلايا الذاكرة CD8+ T البشرية المتداولة والمقيمة في الأنسجة. نات. إيمونول. 24، 1076-1086 (2023).
13. باجايف، د. ف. وآخرون. VDJdb في 2019: توسيع قاعدة البيانات، بنية تحليل جديدة ومجموعة من أنماط مستقبلات الخلايا التائية. أبحاث الأحماض النووية. 48، D1057-D1062 (2020).
14. فيتا، ر. وآخرون. قاعدة بيانات الإيبيتوبي المناعي (IEDB): تحديث 2018. أبحاث الأحماض النووية. 47، D339-D343 (2019).
15. هوانغ، هـ.، وانغ، ج.، روبيلت، ف.، سكرابا، ت. ج. وديفيس، م. م. تحليل استجابة المناعة لجرثومة السل عن طريق تجميع مستقبلات الخلايا التائية باستخدام GLIPH2 وفحص المستضدات على مستوى الجينوم. نات. بيوتكنولوجي. 38، 1194-1202 (2020).
16. يانغ، ف. وآخرون. معدل إيجابية مسببات الحساسية للقمح في السكان المصابين بالحساسية في الصين: مراجعة منهجية وتحليل تلوي. تقارير العلوم 13، 10579 (2023).
17. غاندي، ن. أ. وآخرون. استهداف المحركات القريبة الرئيسية للالتهاب من النوع 2 في المرض. نات. ريف. دراج ديسكوف. 15، 35-50 (2016).
18. . وآخرون. يكشف تحليل الخلايا الفردية عن الدور المسبب للأمراض ومسار التمايز للجرانزيم خلايا T في متلازمة سجوجرن الأولية. رؤية JCIhttps://doi.org/10.1172/jci.insight. 167490 (2023).
19. جونسون، أ. هـ. وآخرون. خلايا T CD8 الإيجابية للجرانزيم K تشكل مجموعة أساسية في الأنسجة البشرية الملتهبة. علوم. ترانسلات. ميد. 14، eabo0686 (2022).
20. موغيلينكو، د. أ. وآخرون. التوصيف الشامل لجهاز المناعة المتقدم في السن يكشف عن خلايا T CD8(+) GZMK(+) المستنسخة كعلامة مميزة محفوظة للالتهاب المرتبط بالشيخوخة. المناعة 54، 99-115 e112 (2021).
21. باي، ج. وآخرون. عوامل التنبؤ بعودة الزوائد الأنفية في التهاب الجيوب الأنفية المزمن مع الزوائد الأنفية. مجلة الحساسية والمناعة السريرية 150، 352-361 e357 (2022).
22. لي، ف. وآخرون. عوامل الخطر المرتبطة بالربو المصاحب لدى المرضى الذين يعانون من التهاب الجيوب الأنفية المزمن مع زوائد أنفية: دراسة مقطعية. BMC طب الرئة 22، 338 (2022).
23. بومان، أ. س.، فان دالين، ك. ر.، كرنك، س.، تن بروك، ت. وبوفنشن، ن. الأدوار داخل الخلوية وخارج الخلوية للجرانزيم ك. فرونت. إيمونول. 12، 677707 (2021).
24. تشاو، ي.، تاو، ق.، وو، ج. وليو، هـ. DMBT1 له تأثير وقائي على التهاب الأنف التحسسي. الأدوية الحيوية. 121، 109675 (2020).
25. ويرنر، يو. وآخرون. ربط المكمل C3 وخلايا B في التهاب الأنف التحسسي. مجلة أبحاث المناعة. 2020، 4832189 (2020).
26. هومبلز، أ. أ. وآخرون. دور لمستقبل الأنفيلاكتوكين C3a في مرحلة الفاعل من الربو. ناتشر 406، 998-1001 (2000).
27. ناكانو، ي. وآخرون. ارتفاع مستوى المكمل C3a في بلازما المرضى الذين يعانون من الربو الحاد الشديد. مجلة الحساسية والمناعة السريرية 112، 525-530 (2003).
28. كريسينجر، م. ج. وآخرون. الثرومبين ينتج منتجات C5 غير المعروفة سابقًا التي تدعم مسار تنشيط المكمل النهائي. بلود 120، 1717-1725 (2012).
29. ساتو، ي.، سيلينا، ك.، فان دن بروك، م.، هيراهارا، ك. وياناجيتا، م. أدوار الهياكل اللمفاوية الثلاثية في الأمراض المزمنة. نات. ريف. نيفرول.https://doi.org/10.1038/s41581-023-00706-z (2023).
30. إفريموفا، م.، فينتو-تورمو، م.، تيشمان، س. أ. & فينتو-تورمو، ر. CellPhoneDB: استنتاج التواصل بين الخلايا من التعبير المشترك لمجمعات الليغاند-المستقبلات متعددة الوحدات. نات. بروتوك. 15، 1484-1506 (2020).
31. زارانتيونيلو، أ.، ريفيل، م.، جرونينوالد، أ. ورومينينا، ل. الوظائف الفعالة المعتمدة على C3 في المكمل. مراجعة المناعة 313، 120-138 (2023).
32. ويلهرم، إ. وآخرون. إنتاج جرانزيم ك النشط تحفيزياً من أجسام إدراج الإشريكية القولونية وتحديد مثبطات جرانزيم ك الفعالة في بلازما الإنسان. مجلة الكيمياء الحيوية. 274، 27331-27337 (1999).
33. ويلهرم، إ.، تشوب، ج. وجين، د. إ. الأنشطة البيولوجية للجرانزيم كيه محفوظة في الفأر وتفسر النشاط المتبقي Z-Lys-SBzl في الفئران التي تفتقر إلى الجرانزيم أ. FEBS Lett. 459، 139-142 (1999).
34. ثورنبرري، ن. أ. وآخرون. نهج تركيبي يحدد خصوصيات أعضاء عائلة الكاسبيز والجرانزيم ب. العلاقات الوظيفية التي تم تأسيسها للوسائط الرئيسية في عملية الموت الخلوي المبرمج. مجلة الكيمياء الحيوية. 272، 17907-17911 (1997).
35. تيبرتي، س. وآخرون. خلايا الذاكرة التائية الفعالة CD8(+) ذات التعبير العالي عن GZMK مرتبطة بوفرة العدلات ذات التعبير العالي عن CD15 في الأورام القولونية غير النقيليّة وتنبئ بنتيجة سريرية سيئة. نات. كوم. 13، 6752 (2022).
36. وانغ، أ. ز. وآخرون. خلايا CD8+T المتسللة إلى الورم الدبقي هي في الغالب مجموعة فعالة موسعة بشكل كلوني من GZMK+. اكتشاف السرطان.https://doi.org/10.1158/2159-8290. CD-23-0913 (2024).
37. كوجا، ر. وآخرون. خلايا T السامة التي تعبر عن غرانزيم K وأمفيريجولين وخلايا B المنشطة خارج الجريبات هي محركات محتملة لمرض IgG4. مجلة الحساسية والمناعة السريرية 153، 1095-1112 (2024).
38. عرازي، أ. وآخرون. مشهد خلايا المناعة في كلى مرضى التهاب الكلية الذئبي. نات. إيمونول. 20، 902-914 (2019).
39. بوتويس، هـ. وآخرون. تعبر تعبيرات KLRG1 و CD103 عن مجموعات فرعية متميزة من خلايا الذاكرة CD8 T المقيمة في الأنسجة المعوية والتي تتأثر بمرض كرون. فرونت. إيمونول. 11، 896 (2020).
40. سكويرا، أ. وآخرون. تستهدف خلايا CTLs قتل خلايا بيتا في مرضى السكري من النوع 1 من خلال التعرف على إبيتوبي ما قبل الإنسولين المنظم بواسطة الجلوكوز. ج. استثمار سريري. 118، 3390-3402 (2008).
41. بينكسي، ج. ج. وآخرون. خلايا T ذاتية التفاعل من نوع CD8 مرتبطة بتدمير خلايا بيتا في داء السكري من النوع 1. وقائع الأكاديمية الوطنية للعلوم في الولايات المتحدة الأمريكية 102، 18425-18430 (2005).
42. جيرتي، س. ف. وآخرون. مجموعة من خلايا T CD8 الشبيهة بالخلايا الجذعية المناعية تحفز مرض السكري من النوع 1. ناتشر 602، 156-161 (2022).
43. لي، ج. وآخرون. خلايا T CD8(+) KIR(+) تثبط خلايا T المسببة للأمراض وتكون نشطة في الأمراض المناعية الذاتية وCOVID-19. ساينس 376، eabi9591 (2022).
44. دونادو، سي. أ. وآخرون. إن إنزيم غرانزيم ك يقود مسارًا جديدًا تم تحديده حديثًا لتنشيط المكمل. مسودة مسبقة على bioRxivhttps://doi.org/10.1101/2024.05.22.595315 (2024).
45. ليشيفسكي، م. ك. وآخرون. تنشيط المكمل داخل الخلايا يحافظ على توازن خلايا T ويساهم في تمايز الفاعلين. المناعة 39، 1143-1157 (2013).
46. أربور، ج. وآخرون. مستقبل المكمل CD46 يعزز وظيفة الخلايا التائية الفعالة البشرية CD8(+) بشكل مثالي عبر استقلاب الأحماض الدهنية. نات. كوميونيك. 9، 4186 (2018).
47. أرنولد، آي. سي. ومونيتز، أ. التكيف المكاني للخلايا الحمضية وأدوارها الناشئة في التوازن الداخلي، العدوى والمرض. مراجعة الطبيعة للمناعة.https://doi.org/10.1038/s41577-024-01048-y (2024).
48. ماستيلوس، د. س.، هاجيشينغاليز، ج. ولامبريس، ج. د. دليل لبيولوجيا المكملات، علم الأمراض والفرص العلاجية. نات. ريف. إيمونول. 24، 118-141 (2024).
49. يانغ، إكس. وآخرون. مستقبلات خلايا T المرتبطة بالذاتيّة المناعية تتعرف على الببتيدات المرتبطة بـ HLA-B*27. ناتشر 612، 771-777 (2022).
50. وانغ، ج. وآخرون. جزيئات HLA-DR15 تشكل معًا مجموعة من خلايا T الذاتية التفاعل في التصلب المتعدد. خلية 183، 1264-1281 e1220 (2020).

ملاحظة الناشر: تظل شركة سبرينجر ناتشر محايدة فيما يتعلق بالمطالبات القضائية في الخرائط المنشورة والانتماءات المؤسسية.

الوصول المفتوح هذه المقالة مرخصة بموجب رخصة المشاع الإبداعي النسبية-غير التجارية-بدون اشتقاقات 4.0 الدولية، التي تسمح بأي استخدام غير تجاري، ومشاركة، وتوزيع، وإعادة إنتاج في أي وسيلة أو صيغة، طالما أنك تعطي الائتمان المناسب للمؤلفين الأصليين والمصدر، وتوفر رابطًا لرخصة المشاع الإبداعي، وتوضح إذا قمت بتعديل المادة المرخصة. ليس لديك إذن بموجب هذه الرخصة لمشاركة المواد المعدلة المشتقة من هذه المقالة أو أجزاء منها. الصور أو المواد الأخرى من طرف ثالث في هذه المقالة مشمولة في رخصة المشاع الإبداعي الخاصة بالمقالة، ما لم يُشار إلى خلاف ذلك في سطر الائتمان للمادة. إذا لم تكن المادة مشمولة في رخصة المشاع الإبداعي الخاصة بالمقالة وكان استخدامك المقصود غير مسموح به بموجب اللوائح القانونية أو يتجاوز الاستخدام المسموح به، فستحتاج إلى الحصول على إذن مباشرة من صاحب حقوق الطبع والنشر. لعرض نسخة من هذه الرخصة، قم بزيارة http:// creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/.
(ج) المؤلف(ون) 2025، نشر مصحح 2025

تم تجنيد ما مجموعه 206 مشاركًا خضعوا لجراحة أنف بين عامي 2011 و2024 من قسم الأنف والحساسية في مستشفى بكين تونغ رين (البيانات الموسعة الجدول 2). من بينهم، تم تشخيص 172 بحالات التهاب الأنف المزمن (NP) و34 بحالات انحراف الحاجز الأنفي (الذين يعتبرون كأشخاص أصحاء في الدراسة الحالية). تم استبعاد المرضى الذين يعانون من نقص المناعة، الحمل، التهاب الجيوب الأنفية المزمن بدون التهاب الأنف المزمن، التهاب الجيوب الأنفية الفطرية التحسسية، التليف الكيسي أو الذين تناولوا الكورتيكوستيرويدات الفموية قبل 4 أسابيع من الجراحة من الدراسة. انظر البيانات الموسعة الجدول 1 لتفاصيل المرضى. تمت الموافقة على الدراسة من قبل لجنة الأخلاقيات الطبية في مستشفى بكين تونغ رين (TREC200927، TRECKY2019-027 وTREC2022-KY127). قدم جميع المشاركين موافقة خطية مستنيرة.

تم تشخيص التهاب الأنف غير التحسسي استنادًا إلى إرشادات ورقة الموقف الأوروبية حول التهاب الجيوب الأنفية والزوائد الأنفية (EPOS) لعام 2007. تم تأكيد تشخيص الربو المصاحب من قبل أطباء الرئة وفقًا للعرض السريري ونتائج اختبارات وظائف الرئة، وذلك وفقًا لإرشادات الاستراتيجية العالمية للربو 2008. لأغراض البحث، تم تقسيم المرضى الذين يعانون من NP بشكل إضافي بناءً على شدة مرضهم، حيث تم وضع أولئك في مجموعة svNP الذين يعانون من تكرار المرض أو الربو المصاحب حتى عام واحد بعد الجراحة، أو كليهما.

تم جمع أنسجة الزوائد من المرضى الذين يعانون من الزوائد الأنفية وأنسجة الزوائد من المرضى الذين يعانون من انحراف الحاجز خلال جراحة الجيوب الأنفية بالمنظار. تم هضم جزء من الأنسجة على الفور إلى تعليق خلايا مفردة لتحليل تسلسل RNA الخلوي الفردي وتحليل تدفق الخلايا. تم تثبيت جزء آخر من الأنسجة إما في 4% من الفورمالدهيد لأغراض علم الأنسجة أو تجميده بسرعة في النيتروجين السائل للتخزين على المدى الطويل في لإجراء تحليل المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) وتحليل التسلسل الجماعي لاحقًا.

تم تقطيع أنسجة أنف بشرية طازجة أولاً إلى قطع صغيرة في وسط معهد روسويل بارك التذكاري (RPMI) المدعوم (إنفيتروجن) الذي يحتوي على 2% من مصل فتي (إنفيتروجن) و2 مللي مول من L-جلوتامين (إنفيتروجن)، البنسلين و ستربتوميسين (إنفيتروجن). تم جمع الأنسجة الأنفية بعد ذلك عن طريق الطرد المركزي وتفتيتها بواسطة جهاز التفكيك gentleMACS (ميلتينيي بيوتيك) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. بعد ذلك، تم جمع الأنسجة الأنفية مرة أخرى عن طريق الطرد المركزي وتم هضمها بشكل إضافي مع كولاجيناز (وورثينغتون) و DNases I (روش) في وسط RPMI المدعوم لمدة 40 دقيقة في تم إعادة تعليق الخلايا المفرج عنها وتصفيتها من خلال منخل الخلايا (BD Bioscience). تم تحلل كريات الدم الحمراء باستخدام فيرساليز (Beckman Coulter).

تم جمع الدم الكامل خلال زيارات المتابعة المنتظمة، وتم عزل الخلايا اللمفاوية المحيطية أحادية النواة (PBMCs) بواسطة الطرد المركزي بتدرج الكثافة باستخدام وسط فصل اللمفاويات البشرية من Biosci (Dakewe) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة.

لإجراء اختبارات التفريغ، تم أولاً إثراء اللمفاويات من خلايا الأنف البشرية عن طريق الطرد المركزي الكثافي. باختصار، تم إعادة تعليق الخلايا في 40% بيركول (GE)، وتم وضعها فوق 70% بيركول ثم تم الطرد المركزي عند لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك، تم تحفيز الخلايا بواسطة مضاد CD3 المرتبط بالطبق. ، استنساخ OKT3) و مضاد CD28 ( أجسام مضادة مثل CD28.2) أو PMA ( ) وأيونومي لمدة 4 ساعات في وجود الأجسام المضادة FITC-anti-LAMP1 (النسخة H4A3، BioLegend)، وموننسين ( ) أُضيف بعد ساعة واحدة.

C57BL/6J (Jax 664)، Rosa26-creERT2 (Jax 8463)، CD45.1 (Jax 2014)، OT-I (Jax 3831)، Cd4-cre (Jax 22071) و Tcrb تكراد (Jax 2122) الفئران كانت في الأصل من مختبر جاكسون. Gzmk الفئران و Gzmk تم الحصول على الفئران (المبنية على خلفية C57BL/6J) من GemPharmatech و Cyagen، على التوالي. تم الحفاظ على جميع الحيوانات في مرافق خالية من مسببات الأمراض المحددة في جامعة تسينغhua (THU)، مع هواء مُرشح، وطعام حبيبي معقم، ونظام مياه مُحمض و دورة ضوء/ظلام 12 ساعة. تم الحفاظ على درجة الحرارة عند ورطوبة عند تم إجراء التجارب وفقًا للإرشادات الحكومية والمؤسسية لرعاية الحيوانات وتمت الموافقة عليها من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية في THU.

لكل تجربة، تم تضمين ما لا يقل عن حيوانين في كل مجموعة، وتم تجميع البيانات من 2-4 تجارب مستقلة. تم تعيين حيوانات متطابقة في الجنس والعمر من الأنماط الجينية المحددة عشوائيًا إلى مجموعات مختلفة في كل تجربة. تم إجراء اختبارات وظيفة رئة الفئران بواسطة باحثين غير عالمين بتخصيص المجموعات. بالنسبة للتحليلات الأخرى التي كانت تعتمد على قياسات آلية ذات طابع شخصي، لم يتم إجراء التعمية.

تم بناء نماذج مرض التهاب مجرى الهواء في الفئران باستخدام طريقتين. في الطريقة الأولى، تم تحفيز الفئران أولاً عن طريق التحصين داخل البطن بـ من OVA (سيغما-ألدريتش) المستحلب في الألوم (إنفيتروجن) مع من LPS (سيغما-ألدريتش). ثم تم تحدي الفئران بواسطة أيروسول OVA ) في غرفة تعرض للجسم بالكامل (Yiyankeji) لمدة 30 دقيقة يوميًا لمدة ثلاثة أيام متتالية بدءًا من أسبوع واحد بعد التطعيم. تم تكرار العملية مرة أو مرتين بفاصل 7 أيام، وتم إجراء التحليلات في الوقت المحدد. من أجل تحفيز حذف Gzmk، تم استخدام Rosa26-creERT2 و تم إعطاء الفئران يوميًا 2 ملغ من التاموكسيفين (ApexBio) المذاب في زيت بذور عباد الشمس (JSENB) لمدة خمسة أيام متتالية في الوقت المحدد. في بعض التجارب، تم استخدام الفئران لتحفيز الربو. تم نقل هذه الفئران بالتبني مع CD4 الطحالي خلايا T و CD8 الطحالي خلايا T من أو فئران، تم تنقيتها بواسطة كرات مغناطيسية (Miltenyi Biotec)، قبل 5 أيام من التحصين داخل الصفاق بمستضد OVA. تم تحضير PPACK (MedChemExpress) و Z-IETD-FMK (Selleck) في PBS يحتوي على 3% DMSO بتركيز لتثبيط نشاط GZMK و GZMB، على التوالي. تم حقن كل فأر داخل الصفاق بـ مثبط كل يومين من 8 إلى 18 يومًا بعد التطعيم كما هو موضح.

بدلاً من ذلك، تم تحفيز التهاب المسالك الهوائية في الحيوانات التي تم نقل خلايا OT-I T إليها. باختصار، تم تحفيز فئران B6 عن طريق التطعيم داخل الصفاق بمستضد OVA كما هو موصوف أعلاه. ثم تم نقل خلايا OT-I إلى الفئران المهيأة بعد 6 أيام من التحصين، والتي تم تعزيزها بـ OVA عن طريق الحقن داخل الصفاق في اليوم التالي. تم تحدي الفئران باستنشاق OVA لمدة ثلاثة أيام متتالية بعد أسبوع، وتم إجراء التحليلات في الوقت المحدد. بالنسبة للتجارب التي تتضمن وحيوانات التحكم المتطابقة، تم استخدام LPS في أول تطعيم OVA و تم نقل خلايا OT-I.

CD8 الطحالي تم عزل خلايا T من فئران OT-I باستخدام كريات ميكروبي CD8a (Miltenyi)، وتم توسيعها في المختبر بواسطة الأجسام المضادة المرتبطة باللوحة المضادة لـ CD3 و CD28 (bioXcell) في وسط RPMI الكامل (Invitrogen) المضاف إليه FBS، 2 مللي مول من L-جلوتامين، البنسلين ستربتوميسين و IL-2 المؤتلف (Peprotech). بعد ذلك، تم نقل هذه الخلايا OT-I باستخدام فيروس رجعي يشفر فقط بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP)، أو GFP مع Gzmk أو Gzmk. أو GFP مع Gzmb. GFP تم فرز خلايا OT-I باستخدام جهاز فرز Arialll (BD) وزراعتها في المختبر لمدة يومين إضافيين قبل نقلها بالتبني إلى الفئران المستقبلة.

تم تخدير الفئران عن طريق الحقن داخل البطن بـ أفيرتين (سيغما-ألدريتش) بجرعة من تم إدخال القنيات في القصبات الهوائية وغسلها ثلاث مرات، في كل مرة مع من PBS بارد. تم طرد BALF المجمعة عند 300 جرام لمدة 3 دقائق، وتم إخضاع كريات الخلايا لتحليلات FACS.

تم غسل خلايا الإنسان المعزولة من الأنسجة الأنفية والدم المحيطي مرة واحدة بمحلول PBS، وتم حجبها بواسطة مواد حجب TruStain البشرية (BioLegend) وتم صبغها بأجسام مضادة سطحية مختلفة في محلول FACS (PBS مع 1% FBS و لمدة 30 دقيقة على الثلج. لتلوين الخلايا داخل الخلايا، تم تثبيت الخلايا وتمريرها باستخدام مجموعة CytoFix/Perm (BD)، وتم تلوينها بأجسام مضادة ضد المستضدات داخل الخلايا لمدة 30 دقيقة على الثلج. تشمل مواد التلوين الزومبي الأصفر، PerCP-Cy5.5-anti-CD45 (النسخة HI30)، PE-anti-CD8 (النسخة HIT8a)، BV711-anti-CD8 (النسخة HIT8a)، APC-Cy7-anti-NCAM (النسخة HCD56)، PE-cy7-anti-KLRG1 (النسخة SA231A2)؛ PE-Cy5-anti-KLRC1 (النسخة S19004C)، FITC-anti-ITGAE (النسخة Ber-ACT8)، PE-Dazzle594-anti-ITGAE (النسخة Ber-ACT8)، BV421-anti-CD27 (النسخة O323)، PE-anti-GZMK (النسخة GM26E7) وAPC-anti-GZMB (النسخة GB11) من BioLegend، APC-H7-anti-CD19 (النسخة SJ25C1) من BD Biosciences. بالنسبة لنماذج الفئران، تم أولاً حجب خلايا BALF بـ الأجسام المضادة (BioXCell)، وتم صبغها بأجسام مضادة مختلفة في محلول FACS على الثلج لمدة 30 دقيقة. تشمل مواد الصبغ AF700-مضاد-CD11c (نسخة HL3، BD)، eFluor660-مضاد-CD3 (نسخة 17A2، eBioscience)، APC-مضاد-I-A (النسخة AF6-120.1، BioLegend)، FITC-مضاد-Ly6G (النسخة IA8، BD)، PE-Cy7-مضاد-CD11b (النسخة M1/70، BD)، PE-مضاد-Siglec-F (النسخة E50-2440، BD)، APC-Cy7-مضاد-CD8 (النسخة 53-6.7، BioLegend)، Percp-Cy5.5-مضاد-CD4 (النسخة RM4-5، BD) و zombie yellow (BioLegend). تم جمع البيانات على جهاز قياس الطيف الكامل Aurora (Cytek). تم تحليل جميع بيانات FACS باستخدام برنامج FlowJo (Treestar).

لتحليلات تسلسل الخلايا المفردة، تم فرز 10,000-20,000 خلية إلى من PBS يحتوي على 1% FBS في أنابيب دقيقة باستخدام جهاز فرز Aria xsIII. بالنسبة لخلايا أنسجة NP البشرية، تم فرز الخلايا كما هو موضح في الشكل 3a من البيانات الموسعة. الخلايا المحيطية البشرية تم إثراء خلايا T أولاً من إجمالي PBMCs، وتم فرزها كما هو موضح في الشكل 3d من البيانات الموسعة. باختصار، تم حضانة PBMCs مع جسم مضاد مضاد للبشر CD8a (نسخة OKT8، إنفيتروجين) على الثلج لمدة 30 دقيقة، وتم عزل الخلايا المرتبطة بالأجسام المضادة باستخدام كريات ميكروبيود المرتبطة بالستربتافيدين (ميلتينيي) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. من أجل تحليلات CD8 في BALF الفئران خلايا T تم فرز الخلايا مع استبعاد الحمضات والعدلات كما هو موضح في الشكل 5b من البيانات الموسعة.

تم تثبيت الأنسجة الأنفية في الفورمالديهايد لمدة 4 ساعات، مجفف في السكروز عند بين عشية وضحاها ومجمدة في مركب Tissue-Tek O.C.T. (ساكورا فينيتيك). مقاطع كريو من تم تحضيرها باستخدام ميكروتوم (لايكا). تم إعادة ترطيب الشرائح في محلول الصبغة ( Tween 20 في 0.1 م Tris- HCl)، وتم حظره باستخدام محلول حجب المناعية (CST) لمدة 30 دقيقة. بعد التلوين بأجسام مضادة مختلفة في محلول التلوين في تم تحضين الأقسام بين عشية وضحاها مع 4′-6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI، تمت معالجة الأنسجة باستخدام محلول التثبيت (Sigma-Aldrich) لمدة 10 دقائق كما هو موضح، وتم تركيبها باستخدام وسط التركيب المائي الفلوري (Sigma-Aldrich). تم التقاط صور لشرائح الأنسجة السليمة باستخدام ماسح الشرائح Zeiss Axio Scan Z1 (Zeiss)؛ بدلاً من ذلك، تم التقاط صور مكبرة لتجمعات خلايا T التي تعبر عن GZMK باستخدام المجهر الضوئي التداخلي LSM 710 (Zeiss). تشمل مواد التلوين PE-anti-GZMK (نسخة GM26E7، BioLegend)، APC-anti-CD8 (نسخة HIT8a، BD)، FITC-anti-KLRG1 (نسخة 2F1/KLRG1، BioLegend)، APC-anti-CD4 (نسخة OKT4، BioLegend)، FITC-anti-PTGDR2 (نسخة BM16، BioLegend) وFITC-anti-complement C3b/iC3b (3E7/C3b، BioLegend).

تم قياس مناطق تجمع خلايا T التي تعبر عن GZMK من صور الأنسجة الممسوحة بشكل مستقل من قبل الباحثين الذين كانوا غير مطلعين على معلومات المرضى باستخدام ZEN (Zeiss). تم قياس أعداد مجموعات الخلايا المختلفة من الصور المجسمة بواسطة Imaris (Bitplane) بناءً على تعبير الجينات المميزة المختلفة.

تم تضمين أنسجة NP الثابتة في البارافين وتم صبغها بالهيماتوكسيلين والإيوزين. تم قياس الأعداد المطلقة للخلايا الحمضية في ثلاثة مجالات مختارة عشوائيًا بتكبير عالي. بواسطة طبيبين أمراض.

تم استخراج الـ RNAs الكلية من الأنسجة الأنفية باستخدام مجموعة HiPure Total RNA Mini Kit (Magen). تم إجراء النسخ العكسي لـ تم إجراء إدخال RNA وفقًا لبروتوكول Smart-seq2 القياسي ، مع التعديلات التالية: تم استبدال بادئ النسخ العكسي polyT ببادئ T30VN ( تم استبدال TSO الأصلي الذي يحتوي على oligo بتبديل القالب (TTT TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3′) بـ TSO يحتوي على معرف جزيئي فريد (UMI) مكون من 26 نيوكليوتيد (5́-CTACACGACGCTCTTCCGATCTN NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTTTCTTATATrGrGrG-3’، حيث يمثل rG ريبوجوانوزين). تم إزالة TSO عن طريق إضافة من Exol (NEB) إلى كل تفاعل النسخ العكسي واحتضان في لمدة 15 دقيقة، والتي تم تعطيلها لاحقًا عن طريق الحضانة عند لمدة 5 دقائق. تم إجراء إثراء TCR على مرحلتين. تم أولاً خلط منتج النسخ العكسي مع من كابا هاي فاي هوت ستارت ريدي ميكس (كابا بيوسيستمز) ب/ت غنية بمقدمة F1 “-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCC CTACACGACGCTC-3′; سانغون بيوتيك”، من كل برايمر خارجي لـ TCR (TCRα، -TGAAGGCGTTTGCACATGCA-3′; TCR ، -TCAGGCAGTATCTGGAGTCATTGAG-3′; سانغون بيوتيك) إلى حجم إجمالي من ، وتمت عملية التضخيم باستخدام البرنامج التالي دورات من تم تنقية منتجات PCR بعد ذلك باستخدام كرات VAHTS لتنظيف الحمض النووي (Vazyme) بنسبة 0.8 إلى 1 (كرات إلى عينة) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. بعد ذلك، تم تنفيذ الخطوة الثانية من إثراء TCR عن طريق خلط المنتجات المنقاة مع من كابا هاي فاي هوت ستارت ريدي ميكس، ب/ت غنية بمقدمة F2 ( -AATGATACGGCGACCACCGA-3′ ; سانغون بيوتيك)، من كل بادئات TCR الداخلية (TCR -AGTCTCTCAGCTGGTACACG-3′; TCR , 5′-TCTGATGGCTCAAACACAGC-3′; سانغون بيوتيك) إلى حجم إجمالي من وزيادة من خلال البرنامج التالي ( ثماني دورات من تم إجراء اختيار الحجم المزدوج الجوانب للمنتجات بواسطة كرات VAHTS DNA Clean، بنسب 0.5 إلى 1 و 0.3 إلى 1 (الكرات إلى العينة) على التوالي. بعد ذلك، تم تاغمنت 1 نانوغرام من المنتجات المنقاة بواسطة إنزيم Tn 5 (Vazyme) في من محلول تفاعل TD (10 مللي مول من تريس-كلوريد pH 7.6، ) في لمدة 10 دقائق. تم خلط التفاعل مع من SDS وتم حضنه عند لمدة 20 دقيقة لتعطيل الترانسبوزاز. تم إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) الفهرسي عن طريق خلط منتج التاجمنت مع من مؤشرات مزدوجة فريدة و من Q5 عالية الدقة ماستر ميكس (NEB)، وتم تضخيمه بالبرنامج التالي ( دورات من ). تم تنقية منتجات PCR باستخدام كرات VAHTS لتنظيف الحمض النووي بنسبة 0.8 إلى 1 (كرات إلى عينة). تم تسلسل المكتبات المُنشأة على نظام Novaseq 6000 (Illumina) في وضع النهاية المزدوجة.

لأنسجة الإنسان الخلايا والأنسجة تم إعداد مكتبات الخلايا الفرعية، scRNA و scTCR باستخدام مجموعات كواشف الخلايا الفردية V(D)J من كروميو (10X Genomics). وكروميو نكست جيم للخلايا الفردية تم استخدام مجموعة كيت v2 (10X Genomics) لبناء المكتبات للبشر
عينات الدم المحيطي وخلايا سائل الشُعب الهوائية من الفئران. تم إجراء تسلسل المكتبة على نظام NovaSeq 6000.

تسلسل RNA لجين GZMK تم إجراء تجميع مناطق الأنسجة الخلوية وفقًا لبروتوكول Geo-seq باختصار، تم تضمين أنسجة NP في مركب Tissue-Tek O.C.T، وتم تجميدها بسرعة بواسطة النيتروجين السائل وقُطعت إلى شرائح متتالية. الـ GZMK تم تأكيد المناطق المجمعة للخلايا أولاً بواسطة صبغة المناعية النسيجية باستخدام DAPI والأجسام المضادة PE-anti-GZMK، ثم تم لصق شريحة مجاورة على شريحة PEN MembraneSlide (رقم الكتالوج 11505151، لايكا) وصبغها بالأرجواني البلوري. تم مطابقة GZMK تم استئصال مناطق الأنسجة المجمعة والخاضعة للرقابة وإضافتها إلى من ثيوسيانات الجوانيدين، وتم حضنه في لمدة 15 دقيقة. ثم تم ترسيب RNA عن طريق خلط العينات مع من الماء المنزوع الأيونات من الإيثانول اللامائي، 1.5 م من خلات الصوديوم (رقم هيدروجيني 6.5) و الجليكوجين تم وضع الخلطات في لمدة 30 دقيقة وتم الطرد المركزي عند لمدة 30 دقيقة عند . بعد الغسل بواسطة الإيثانول، تم إعادة تعليق الـ RNAs المتساقطة في لبناء المكتبة باستخدام بروتوكول Smart-seq2 .

تمت معالجة بيانات التسلسل ورسمها كميًا بواسطة سالمن عينات بمعدلات رسم خرائط أقل من تم استبعادها من التحليلات. تم إجراء تحليلات التعبير التفاضلي بواسطة DESeq2 (المرجع 56)، وتم إجراء تحليل المكونات الرئيسية باستخدام دالة ‘plotPCA’ بعد تحويل استقرار التباين.

تم استخدام CellRanger (الإصدار 3.0) لإنشاء مصفوفة تعبير الجينات لكل خلية، والتي تمت معالجتها لاحقًا بواسطة Seurat (الإصدار 3.0.2). لدمج البيانات، وتقليل الأبعاد، والتجميع، وتحليل التعبير الجيني التفاضلي. لنسج الإنسان CD45 الخلايا، تم دمج بيانات من عينات مختلفة أولاً باستخدام وظيفة ‘دمج’. تحتوي المجموعات الفرعية على تم تحديد الخلايا والخلايا النخاعية، وتم إزالة تأثيرات الدفعة بواسطة وظيفة ‘IntegrateData’. بالنسبة لتحليلات الأنسجة البشرية تم دمج بيانات العينات المختلفة أولاً باستخدام وظيفة ‘merge’، ثم تم استخدام وظائف ‘FindTransferAnchors’ و ‘TransferData’ و ‘MapQuery’ و ‘IntegrateEmbeddings’ في Seurat v.4.3.0.1 لتوقع التجمعات وإسقاط الاستعلام على هيكل تقريب و إسقاط متعدد الأشكال المرجعي (UMAP) بناءً على الأنسجة الكلية. مجموعة بيانات الخلايا. لتحليلات ارتباط النسخ في الشكل 2g، قمنا أولاً بحساب متوسط تعبير الجين في الأنسجة البشرية خلايا ودم تجمعات الخلايا، وتم تصنيف الجينات حسب انحرافاتها المعيارية عبر تجمعات مختلفة. ثم تم استخدام أعلى 2000 جين لتشكيل مصفوفة التعبير المتوسطة، والتي استخدمت لحساب معامل ارتباط رتبة سبيرمان. بالنسبة للمقارنة بين خلايا T1 و B2 الموضحة في البيانات الموسعة الأشكال 5 و 6، قمنا أولاً بتجميع خلايا T1 و CD8 في الدم. الخلايا من NP11 و NP13 بواسطة وظيفة ‘دمج’ في Seurat. ثم تم رسم متوسط UMI لكل جين في المجموعتين وتم حساب معامل ارتباط سبيرمان. بالنسبة لتحليلات المسار، تم أخذ عينات فرعية من النسخ المتطابقة بين الأنسجة والدم واستخدامها لتقليل الأبعاد باستخدام UMAP، وتم حساب الزمن الزائف لهذه الخلايا باستخدام Monocle3 (المرجع 58) (الإصدار 1.3.1). بالنسبة لتحليلات تفاعل الخلايا الموصوفة في الشكل التوضيحي الإضافي 8، تم تقليل كل مجموعة فرعية من خلايا المناعة المشار إليها إلى الخلايا للتحليلات اللاحقة باستخدام دالة ‘subset’ في Seurat. تم إدخال مصفوفة التعبير الجيني في CellphoneDB (v.3) لحساب تفاعلات المستقبلات والليغاندات. تم رسم مخططات الشبكة بواسطة Cytoscape (v.3.10.1) وتم رسم مخططات الفقاعات بواسطة حزمة gglot2.

بالنسبة لخلايا BALF للفئران، قمنا بدمج البيانات من نسختين بيولوجيتين باستخدام وظيفة ‘IntegrateData’ وأجرينا تقليل الأبعاد باستخدام UMAP بالإضافة إلى التجميع. ثم تم إجراء جولة أخرى من تقليل الأبعاد والتجميع للخلايا من أجل مزيد من التحليلات.

بالنسبة لمجموعة بيانات TCR-seq الكبيرة، تمت إزالة الموصلات أولاً بواسطة Cutadapt ، ثم تم تجميع تسلسلات TCR بواسطة TRUST4 (المرجع 61)، الذي حدد أول N16 من N26 داخل أوليغو TSO كـ UMI وأسفر عن ملفات contig مصفاة تحتوي على contigs TCR مجمعة عالية الجودة لكل UMI. تم استبعاد UMIs التي تحتوي على أكثر من contig TCR من التحليلات. بالنسبة لمجموعات بيانات scTCR-seq، تم استخدام CellRanger لتجميع TCRs للخلايا المفردة. تم توضيح contigs TCR باستخدام Igblast. (الإصدار 1.16.0)، وتم استخدام فقط قطع TCR المنتجة التي تحتوي على مناطق VDJ كاملة للتحليل اللاحق. بالإضافة إلى ذلك، تم استخدام خلايا تحتوي على العديد من TCRα أو TCR المنتجة. تمت إزالة الكتل من مجموعة بيانات scTCR. تم تحديد النسخ الشائعة من TCR بين مجموعات البيانات المختلفة من خلال تسلسلات الأحماض النووية CDR3 المشتركة واستخدام V(D)J الجيني الشائع. في حالة بيانات scTCR-seq، كلاهما و تم اعتبار السلاسل. تم رسم مخططات السيرك باستخدام حزمة circlize، وتم تصور بقية الرسوم البيانية باستخدام ggplot2 و Seurat.

لتوقع خصوصية TCR، تم جمع أزواج TCR مع المستضدات المعروفة المعلّمة من قاعدة بيانات VDJdb وقاعدة بيانات الإيبيتوپ المناعي وتم دمجه مع 1,311 T1 TCRs من مجموعة بيانات scTCR-seq الخاصة بنا. تم تحليل قائمة TCR الناتجة باستخدام بوابة الويب GLIPH2 (المرجع 15) (http://50.255.35.37:8080“). تم تجميع TCRs بناءً على كل من التشابه المحلي والعالمي، وتم تصفية المجموعات وفقًا للمعايير التالية: Fisher_score و vb_score تم رسم جميع المجموعات التي تحتوي على TCRs لخلايا T1 باستخدام Cytoscape (الإصدار 3.10.1).

تم وزن الأنسجة الأنفية وخلطها ميكانيكياً باستخدام مطحنة كرات TissueLyser LT (Qiagen). تم إضافة محلول RIPA الذي يحتوي على مجموعة كاملة من مثبطات البروتياز (Roche) إلى المستحلبات. تم تجميد المستخلصات وإذابتها مرتين، ثم تم الطرد المركزي عند لمدة 5 دقائق عند تم استخدام السائل العلوي لقياسات GZMK بواسطة ELISA (ريد دوت بيوتيك) وقياسات IL-5 بواسطة اختبار Luminex xMAP (ثيرمو فيشر) على نظام Bio-Plex 200 (بايو راد). تم إجراء جميع التحليلات وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة.

تم تقييم استجابة مجرى الهواء لدى الفئران باستخدام نظام FlexiVent (SCIREQ) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. تم إجراء عملية فتح القصبة الهوائية والت intubation الرغامي بعد تخدير الفئران بـ بنتوباربيتال الصوديوم (سيغما-ألدريتش). تم قياس مقاومة مجرى الهواء والامتثال عند التعرض المتسلسل لجرعات متزايدة من الميثاكولين (سيغما-ألدريتش) المذاب في محلول ملحي معقم. و ).

تم تثبيت رئتي الفأر الأيسر في الفورمالديهايد لمدة 4 ساعات، تم تجفيفه في 30% سكروز لمدة يومين في درجة حرارة الغرفة وتم تجميده في مركب Tissue-Tek O.C.T. تم تقطيع كتل الأنسجة بالتبريد إلى شرائح، وتم إجراء صبغ ألكيان الأزرق – حمض البيريوكسيد شيف (AB-PAS) باستخدام مجموعة محلول AB-PAS (Servicebio) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. تم الحصول على صور بانورامية لقسم رئة كامل لكل حيوان باستخدام ماسح الشرائح Zeiss Axio Scan Z1، وتم الحصول على مشاهد مكبرة بواسطة ميكروسكوب نيكون إكليبس Ts2R (نيكون). PAS تم قياس المساحات في كل ممر هوائي باستخدام برنامج ImageJ (NIH) بنفس العتبة وتم تطبيعها على محيط الممر الهوائي. تم حساب القيمة المتوسطة من الأربعة ممرات الهوائية ذات أعلى قيمة مطبقة. المساحة لكل قسم، والمخصصة للحيوان المعني.

تم استخراج RNA من خلايا الفئران المفروزة باستخدام التريزول وتم تحويله عكسيًا إلى DNA مكمل (cDNA) بواسطة ماستر ميكس الشامل (abm). تم إجراء PCR الكمي باستخدام بلاستاك كمي

خليط PCR (abm) على نظام CFX Connect للوقت الحقيقي (BioRad). تم إدراج البرايمرات المستخدمة كما يلي: Actb-F 5′-CCTAAGAGGAGGATGGTCGC، Actb-R 5′-CTCAAGTCAGTGTACAGGCCA؛ Gzmk-F 5′-TGTCCAACTGCTTCACCTGGG و Gzmk-R 5′-GCCACCAGAGTCACCCTTGCA. تم تطبيع مستوى Gzmk إلى المستوى .

تم إنتاج وتنقية GZMK البشري المؤتلف كما هو موصوف سابقًا باختصار، تم استنساخ cDNA لجين GZMK البشري في متجه pHL. تم إجراء طفرات PCR لإنتاج الطفرة غير النشطة إنزيميًا GZMK-S214A. تم زراعة خلايا 293-F (المستمدة من Thermo Fisher؛ تم التحقق منها من قبل المزود؛ سلبية الميكوبلازما) في وسط 293-TII (Sino Biological) بتركيز تم زرع خلايا بمعدل 2 × 10^6 خلية لكل مل في الليلة السابقة للتحويل. بعد ذلك، تم خلط البلازميدات مع بولي إيثيلين أمين خطي (وزن جزيئي 40,000، من شركة ياسين للتكنولوجيا الحيوية) بنسبة 1:3، وتم تحويلها إلى خلايا 293-F. تم جمع السوبرناتانت بعد 3 أيام، وتم التقاط الجرانزيمات التي تحتوي على علامة هيستيدين في الطرف C على عمود تقارب النيكل (من شركة ياسين للتكنولوجيا الحيوية). تم هضم البروتينات المستخلصة (التي تحتوي على موقع إنتروميناز مهندَس في الطرف N) بواسطة الإنتروميناز (من شركة بييوتيم للتكنولوجيا الحيوية)، وتم إجراء كروماتوغرافيا تبادل الكاتيونات باستخدام عمود Resource S (من شركة سايتيفا) على نظام AKTA Purifier 10 (من شركة GE) لتنقية البروتين بشكل أكبر.

تم قياس نشاط البروتياز لـ GZMK بواسطة اختبار قائم على FRET (الشكل 4b من البيانات الموسعة) باستخدام ركيزة ببتيد فلوروجينيك اصطناعية، DABCYL-GDGRSIMTE-EDANS (سانغون للتكنولوجيا الحيوية). تم إجراء التفاعلات في 20 مليمول من HEPES، pH 7.0 عند مع بروتياز ركيزة الببتيد. بعد 15 دقيقة، تم مراقبة الفلورية عند 490 نانومتر باستخدام طول موجي للإثارة يبلغ 340 نانومتر باستخدام قارئ Varioskan Flash (ثيرمو فيشر) في لوحة ميكرو 96 بئر. تم استخدام التربسين (بروماجا) كتحكم إيجابي، وتم استخدام الليزوزيم (سيغما-ألدريش) كتحكم سلبي.

تمت بيولوجية GZMK-S214A المنقاة أولاً عن طريق التفاعل مع EZ-Link NHS-LC-Biotin (ثيرمو فيشر) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة، وتم ربطها بخرز الدينابيدين M-280 ستربتافيدين (ثيرمو فيشر). للقيام بذلك، تم موازنة Dynabeads في PBS وتم تحضينها مع بيوتينيلated GZMK-S214A لمدة 30 دقيقة عند تم إعداد مستخلصات NP كما هو موضح باستثناء استخدام محلول تفكيك مختلف (20 مللي مول من تريس، ترايتون X-100) مدعوم بمثبطات البروتياز والفوسفاتاز (بيوتايم للتكنولوجيا الحيوية). بعد ذلك، تمت إزالة الشوائب من المستخلصات من كل عينة بواسطة من دينابيدز في لمدة 4 ساعات، ثم تم تحضين المستخلصات المسبقة التنقية مع كرات دينابيدز البيوتينيل GZMK-S214A طوال الليل عند تم غسل الكريات الديناميكية باستخدام محلول التحلل، وتم استرجاع البروتينات المرتبطة باستخدام 0.1 م جلايسين (رقم هيدروجيني 2.5) وتم تحييدها باستخدام 1 م تريس (رقم هيدروجيني 7.5).

تم فصل البروتينات التي تم سحبها بواسطة GZMK-S214A-Dynabeads أو Dynabeads فقط بواسطة تم إجراء SDS-PAGE وتمت رؤيته بواسطة صبغة كوماتسي الزرقاء اللامعة. تم قطع شرائط البروتين وخضعت لهضم داخل الجل. تم غسل قطع الجل في وتم إزالة الصبغة في في ثم تم حضن البروتينات مع 10 مللي مول من DTT (سيغما-ألدريتش) لمدة 60 دقيقة في تبع ذلك 20 مليمول من MIAA (سيغما-ألدريتش) لمدة 30 دقيقة في الظلام عند درجة حرارة الغرفة. تم إضافة التربسين (بروماجا) بنسبة 1:50 (وزن/وزن)، وتم تحضين المزيج طوال الليل في أخيرًا، تم تنظيف العينات على خرطوشة C18 (شركة وواترز) وكانت جاهزة لتحليلات LC-MS. تم إجراء LC-MS باستخدام نظام UltiMate 3000 UHPLC (ثيرمو فيشر) المتصل بمطياف الكتلة Fusion Lumos Tribrid (ثيرمو فيشر). تم تحليل بيانات مطيافية الكتلة.
باستخدام محرك البحث SEQUEST HT ضد قاعدة بيانات UniProt Swiss-Prot مع برنامج Proteome Discoverer v.2.3 (ثيرمو فيشر). من بين البروتينات المتفاعلة مع GZMK التي تم تحديدها، ظهر 56 في جميع العينات التي تم تحليلها. تم تصنيف هذه البروتينات حسب درجات SEQUEST ونسبة الوفرة (العينة تحكم تم إجراء تحليل تفاعل البروتينات للبروتينات المتفاعلة مع GZMK باستخدام Cytoscape. (الإصدار 3.9.1).

تم فصل الأحماض الأمينية من نوع فينيلثيوهيدانتوين في وضع الطور العكسي من الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء باستخدام الفروق بين أوقات الاحتفاظ للأحماض الأمينية المختلفة، وتم الكشف عن كمية امتصاص الأشعة فوق البنفسجية عند أطوال موجية محددة. تم نقل العينات إلى غشاء بولي فينيل ديفلورايد وتم ضبط خمس دورات. تم تحديد تسلسلات الأحماض الأمينية لكل عينة من الكروماتوغرامات التي تم الحصول عليها في كل تقييم دورة من خلال مقارنة الكروماتوغرامات مع تلك في الدورات السابقة واللاحقة وتحديد أحماض فينيلثيوهيدانتوين الأمينية التي كانت لديها أكبر زيادة في الوفرة.

بروتين SET المؤتلف (Solarbio) ومكملات C2 وC3 وC4 وC5 المنقاة من المصل (Complement Technology) بتركيز تم حضنها مع GZMK المؤتلف في PBS عند للفترة الزمنية المحددة. لاختبار انقسام DMBT1، تم تحضين مستخلصات أنسجة NP مع جرعات متزايدة من GZMK المؤتلف عند لمدة ساعة واحدة. تم إيقاف التفاعلات بإضافة تم تحميل عازلة SDS (مخفضة، TransGen)، ثم تم غلي العينات لمدة 15 دقيقة وحلها بواسطة SDS-PAGE. تم تحميل C3a وC3b وC2a وC4b المنقاة من المصل (Complement Technology) وGZMK المؤتلف بشكل منفصل كضوابط. تم تصور البروتينات المستهدفة إما بواسطة صبغة كوماتسي الزرقاء اللامعة أو تم الكشف عنها بواسطة التحليل المناعي باستخدام أجسام مضادة مختلفة. تشمل الأجسام المضادة المستخدمة مضاد SET (نسخة EPR12973، Abcam)، مضاد GZMK (نسخة EPR24601-164، Abcam)، مضاد C2 (نسخة EPR17979، Abcam)، مضاد C3 (نسخة EPR19394، Abcam)، مضاد C3a/C3a-desArg (نسخة 2991، Hycultbiotech)، مضاد C4. (النسخة C-2، سانتا كروز)، مضاد-C5a/C5a-desArg (النسخة C17/5، أبكام)، مضاد-DMBT1 (النسخة G-4، سانتا كروز)، مضاد-ACTB (النسخة C4، سانتا كروز)، HRP-ماعز-مضاد-فأر IgG ( ) (بيوتايم للتكنولوجيا الحيوية) و HRP-ماعز-مضاد-أرنب IgG (H+L) (بيوتايم للتكنولوجيا الحيوية). تم تطوير المناعية بواسطة كاشف الكشف سوبر ECL (ياسين للتكنولوجيا الحيوية).

للمقارنة بين GZMK ومختلف محولات C3، تم استخدام C3 البشري المنقى من المصل (تكنولوجيا المكملات، ) تم حضنها مع GZMK أو غيرها من المحولات C3 (C3bBb أو C4b2a؛ ) لمدة 20 دقيقة في تم تشكيل C3bBb عن طريق خلط C3b (تكنولوجيا المكملات، ، فيسبوك (تكنولوجيا التكامل، ) و FD (تكنولوجيا التكامل، 500 نانومتر) في محلول HBS-Mg (20 مللي مولار هيبيس، ) لمدة دقيقتين عند وانتهت التفاعل بإضافة 5 مليمول من EDTA. تم تشكيل C4b2a عن طريق حضانة C4b (تكنولوجيا المكملات، )، C1s (تكنولوجيا المكملات، ) و C2 (تكنولوجيا التكامل، ) في PBS مع 2 مللي مول من MgCl2 و 40 مللي مول من NaCl لمدة 5 دقائق عند وانتهت التفاعل بإضافة 2 مللي مول من EDTA. تم قياس كمية C3a المعروضة على الجل الملون بصبغة كوماتسي الزرقاء باستخدام برنامج ImageJ، وتم تطبيع البيانات إلى مجموعة C4b2a.

تم تنقية C3a المحول بواسطة محولات C3 مختلفة عن طريق كروماتوغرافيا الفصل حسب الحجم (SEC). على وجه التحديد، تم فصل منتجات التقطيع بواسطة عمود SEC (Acclaim SEC-1000، ، نظام HPLC من فانكويش (Thermo Fisher) مع جهاز الكشف UV مضبوط للكشف عن الامتصاص عند 280 نانومتر. تم استخدام محلول PBS (pH 7.4) كمرحلة متحركة في معدل التدفق للاستخلاص.

تم جمع كسور SEC تلقائيًا وتركيزها بشكل إضافي بواسطة وحدة الطرد المركزي Amicon ultra (بحد قطع وزن جزيئي 3 كيلودالتون، ميلليبور). تم تأكيد نقاء C3a بواسطة SDS-PAGE. ) وصبغة كوماتسي الزرقاء اللامعة.

تم الحفاظ على خلايا THP1 (المستخرجة من البنية التحتية الوطنية لموارد خطوط الخلايا، الصين؛ تم التحقق منها من قبل المزود؛ سلبية الميكوبلازما) في وسط RPMI-1640 ( FBS، 1% بنسلين و ستربتوميسين) واستخدمت لقياس أنشطة C3a. باختصار، تم تجويع الخلايا من المصل طوال الليل، وتم تحضينها مع من المصادر المشار إليها في لمدة 5 دقائق، وتم تحللها باستخدام محلول RIPA الذي يحتوي على مثبطات البروتياز (روش) ومثبطات الفوسفاتاز (ثيرمو ساينتيفيك). تم إجراء التحليل المناعي باستخدام الأجسام المضادة المضادة للفوسفور-إيرك1/2 (تكنولوجيا الإشارة الخلوية) والأجسام المضادة المضادة لإيرك1/2 (نسخة 137F5، تكنولوجيا الإشارة الخلوية). تم قياس البيانات باستخدام ImageJ وتم تطبيعها بالنسبة للتحكم غير المعالج.

تمت مزج C5b6 البشري المنقى بالمصل (600 pM) أولاً مع GZMK المعاد تركيبه أو التربسين (600 pM) عند للفترة الزمنية المحددة. ثم أضيف مزيج التفاعل إلى كريات الدم الحمراء للدجاج ( لكل مل، Sbjbio) معلق في محلول ملحي مخفف في فيرونال (pH 7.4)، وتم حضنه في لمدة 5 دقائق. بعد ذلك، تم إضافة C7 المنقى من المصل (15 نانومول) إلى كريات الدم الحمراء وتم تحضين المزيج في لمدة 15 دقيقة. أخيرًا، مزيج من المصل المنقى و C 9 تمت إضافتها إلى الخلايا، وتمت الحضانة لاحقًا عند لمدة 30 دقيقة. تم إزالة كريات الدم الحمراء السليمة المتبقية عن طريق الطرد المركزي عند لمدة دقيقتين، وتم تحديد انحلال الدم عن طريق قياس الامتصاص عند 405 نانومتر.

تم إجراء التحليلات الإحصائية بواسطة Prism v. 9 (GraphPad). مان ويتني تم استخدام الاختبارات لحساب قيم من البيانات البشرية، واختبار ستودنت ذو الجانبين تم استخدام اختبارات – لتحليل بيانات الفئران. تم تحليل المتغيرات الفئوية باستخدام اختبار كاي-تربيع. كما تم إجراء تحليل خصائص التشغيل المستقبلية في R (الإصدار 4.3.3) باستخدام حزمة pROC للتنبؤ بعودة الزوائد أو الربو المصاحب. تم إجراء تحليلات الانحدار الخطي المتعدد باستخدام حزمة emmeans في (الإصدار 4.3.3).

معلومات إضافية حول تصميم البحث متاحة في ملخص تقارير مجموعة نيتشر المرتبط بهذه المقالة.

تم إيداع بيانات التسلسل الخام في أرشيف تسلسل الجينوم (GSA) في مركز البيانات الضخمة، معهد بكين للجينوم، الأكاديمية الصينية للعلوم،http://gsa.big.ac.cn) تحت رقم القيد HRA005529 للبيانات البشرية وCRA012671 لبيانات الفئران. بالنسبة لتحليلات GLIPH2، تم الحصول على تسلسلات TCR المعلّمة من VDJdb (https://vdjdb.cdr3.net) وقاعدة بيانات الإيبيتوبي المناعي (https://www.iedb.org).

تم إيداع الشيفرة الأصلية لتحليل بيانات التسلسل في زينودو (https://doi.org/10.5281/zenodo.14030622) .
51. فوكينز، و.، لوند، ف.، مولول، ج. ورقة الموقف الأوروبية حول التهاب الجيوب الأنفية والسلائل الأنفية 2007. رينول. ملحق. 20، 1-136 (2007).
52. باتمان، إ. د. وآخرون. الاستراتيجية العالمية لإدارة الربو والوقاية منه: ملخص تنفيذي لجينا. المجلة الأوروبية للتنفس 31، 143-178 (2008).
53. بيشيلي، س. وآخرون. تسلسل RNA الكامل من خلايا مفردة باستخدام Smart-seq2. نات. بروتوك. 9، 171-181 (2014).
54. تشين، ج. وآخرون. تحليل النسخ الجيني المكاني لعينات الأنسجة المقطوعة بالتبريد باستخدام Geo-seq. بروتوكولات الطبيعة 12، 566-580 (2017).
55. باترو، ر.، دوغال، ج.، لوف، م. آي.، إيريزاري، ر. أ. وكينغسفورد، ج. السلمون يوفر قياسًا سريعًا وواعيًا للتحيز لتعبير النسخ. نات. ميثودز 14، 417-419 (2017).
56. لوف، م. آي.، هوبر، و. & أندرس، س. تقدير معتدل لتغير الطي والتشتت لبيانات RNA-seq باستخدام DESeq2. جينوم بيو. 15، 550 (2014).
57. ستيوارت، ت. وآخرون. التكامل الشامل لبيانات الخلية الواحدة. خلية 177، 1888-1902 e1821 (2019).
58. كاو، ج. وآخرون. المشهد النسخي على مستوى الخلية الواحدة لتكوين الأعضاء في الثدييات. ناتشر 566، 496-502 (2019).
59. شانون، ب. وآخرون. سايتوسيب: بيئة برمجية لنماذج متكاملة لشبكات تفاعل الجزيئات الحيوية. أبحاث الجينوم. 13، 2498-2504 (2003).
60. مارتن، م. كوتادابت يزيل تسلسلات الموصلات من قراءات التسلسل عالي الإنتاجية. EMBnet.Jhttps://doi.org/10.14806/ej.17.1.200 (2011).
61. سونغ، ل. وآخرون. TRUST4: إعادة بناء مجموعة المناعة من بيانات تسلسل RNA من الخلايا الكثيفة والفردية. نات. ميثودز 18، 627-630 (2021).
62. يي، ج.، ما، ن.، مادن، ت. ل. وأوستيل، ج. م. IgBLAST: أداة تحليل تسلسل مجال المتغير للأجسام المضادة. أبحاث الأحماض النووية 41، W34-W40 (2013).
63. دوتي والا، ف. وآخرون. نظام تعبير عالي العائد وفعال من حيث التكلفة للجرانزيمات البشرية في خلايا الثدييات. ج. فيس. إكسب.https://doi.org/10.3791/52911 (2015).
64. جيزهو، ل. وآخرون. الكود الأصلي لتحليل بيانات التسلسل في البحث العلمي ‘خلايا T CD8 التي تعبر عن جرanzيم K تعزز الأمراض الالتهابية الهوائية المتكررة’. زينودوhttps://doi.org/10.5281/zenodo. 14030622 (2024).

الشكر والتقدير نشكر Y. Li في مستشفى تونغرن وB. Li في مستشفى الصداقة الصينية اليابانية على مساعدتهما في اختبارات وظائف الرئة لدى الفئران. نشكر J. Xiao في جامعة بكين على مساعدته في اختبار التحلل الدموي. تم تمويل هذا العمل جزئيًا من قبل البرنامج الوطني الرئيسي للبحث والتطوير في الصين (وزارة العلوم والتكنولوجيا، رقم المنحة 2022 YFC2504100 لـ L.Z.)، والمشروع الوطني للعلوم والتكنولوجيا الكبرى (اللجنة الوطنية للصحة في الصين، أرقام المنح 2023 ZD0519900 لـ J.W. و2023ZD0520300 لـ H.Q.)، وبرنامج البحث العلمي الابتكاري في جامعة تسينغhua (جامعة تسينغhua، H.Q.)، ومؤسسة العلوم الطبيعية الوطنية في الصين (أرقام المنح T2225005 و21927802 لـ J.W.، 32130037 لـ H.Q.، 32422028 لـ X.L.، و81970851 و82271140 لـ F.L.)، ومركز الابتكار التعاوني SXMU-Tsinghua للطب الحدودي (H.Q.)، وبرنامج علماء تشانغجيانغ وفريق البحث الابتكاري (رقم المنحة IRT13082 لـ L.Z.). H.Q. هو باحث جديد في حجر الزاوية.

مساهمات المؤلفين: بدأ H.Q. و L.Z. التعاون وقادا المشروع. قام X.L. و H.Q. بتصميم وتصوّر الدراسة. قام S.D. و X.W. و C.W. بتجنيد المرضى وجمع العينات السريرية تحت إشراف L.Z. أجرى F.L. و J.L. و Y.S. تجارب تتعلق بالعينات البشرية تحت إشراف H.Q. و X.L. أجرى J.L. تحليلات المعلومات الحيوية تحت إشراف J.W. و J.Y. أجرى W.M. تجارب على الفئران تحت إشراف X.L. و H.Q. أجرى F.S. تجارب تحديد الركيزة تحت إشراف J.W. و J.Y. قدم L.Z. أكبر دعم مالي لتمويل الدراسة. قام X.L. و H.Q. بتفسير البيانات وكتابة الورقة بمشاركة جميع المؤلفين.

المصالح المتنافسة: H.Q. هو أحد المؤسسين المشاركين لشركة إيمرجنت بيو ميد سوليوشنز، المحدودة.

معلومات إضافية النسخة الإلكترونية تحتوي على مواد إضافية متاحة علىhttps://doi.org/10.1038/s41586-024-08395-9.
يجب توجيه المراسلات والطلبات للحصول على المواد إلى شين ليو، جيانبين وانغ، لوو تشانغ أو هاي تشي.
تُعرب مجلة Nature عن شكرها لكلوديا كيمبر والمراجعين الآخرين المجهولين على مساهمتهم في مراجعة الأقران لهذا العمل.
معلومات إعادة الطباعة والتصاريح متاحة علىhttp://www.nature.com/reprints.

الشكل التوضيحي الممتد 1 | تسلسل RNA أحادي الخلية والتوصيف لـ خلايا T في الأنسجة الأنفية. أ، تصور UMAP لإجمالي CD45 الخلايا في الأنسجة الأنفية من جميع المرضى الأصحاء ومرضى التهاب الأنف التحسسي الذين تم تحليلهم (متعلق بالشكل 1ب). ب، مستويات التعبير عن CD3D، TRAC، TRDC، NKG7، PTGDR2، CD79A، HLA-DRA، CLEC4C، KIT و GZMK. ج، خلايا مع TCR مكتمل التجميع. و السلاسل مكدسة على إجمالي CD45 الخلايا، تم تصورها بواسطة UMAP. د، مخططات النقاط تظهر تعبير الجينات المحددة في خلايا اللمفوية الفطرية (ILCs)/خلايا T. النسبة ومستوى التعبير
يتم عرضها من خلال حجم النقاط وشدة اللون، على التوالي. e، مخططات النقاط التي تظهر تعبير جينات توقيع خلايا T الفعالة والذاكرة، بناءً على ذلك تم توضيح مجموعات الخلايا الفرعية. يتم الإشارة إلى النسبة ومستوى التعبير من خلال حجم النقاط والألوان، على التوالي. ف، إحصائيات تلخص الوفرة النسبية لمختلف مجموعات الخلايا في الأنسجة الأنفية من و NP ( ) المرضى. كل رمز يدل على مريض واحد، والخطوط تشير إلى المتوسطات. HC، مجموعة التحكم الصحية؛ NP، بوليب الأنف. القيم بواسطة اختبارات مان-ويتني.
ن

ف

الشكل البياني الموسع 2 | تحليلات خلايا CD8 T وخلايا NK من أنسجة NP والدم المحيطي. أ، استراتيجيات التصفية لفرز مجموعات خلايا CD8 T من أنسجة NP. ب-ج، التحقق من مجموعات خلايا CD8 T المختلفة من أنسجة NP بواسطة scRNA-seq. ب، تجميع الخلايا المصفاة الكلية (يسار) أو المجموعات الفردية (يمين). تم مطابقة البيانات مع مجموعة البيانات المرجعية في الشكل 1d. ج، تركيبة كل مجموعة مصفاة.
استراتيجية الفرز لخلايا CD8 T في الدم. e، استراتيجيات الفرز لخلايا NK في أنسجة NP. f، إحصائيات تلخص وفرة خلايا NK في الأنسجة الأنفية في HC ( )، NP ( ) و svNP ( ) المرضى. كل رمز يدل على مريض واحد، والخطوط تشير إلى المتوسطات. القيم بواسطة اختبارات مان-ويتني.

الشكل 3 من البيانات الموسعة | إفراز GZMK بواسطة الخلايا. أ-ب، مخططات FACS التمثيلية (أ) وإحصائيات ملخصة (ب) تظهر التعبير السطحي لـ LAMP1 في مجموعات الخلايا المحددة عند التحفيز. مستويات GZMK داخل الخلايا في LAMP1 الخلايا داخل كل مجموعة فرعية.

تظهر مخططات FACS التمثيلية (ج) وإحصائيات ملخصة (د). PMA، فوسفات 12-ميريستات 13-أسيتات؛ MFI، شدة الفلورة المتوسطة. البيانات تمثل ( و ) أو مجمعة من ( وثلاثة مرضى. القيم بواسطة اختبارات t المزدوجة.

الشكل البياني الممتد 4 | توصيف ركائز GZMK والمقارنة بين GZMK وغيرها من المحولات C3. أ، جيل ممثل ملون بصبغة كوماتسي الزرقاء يظهر GZMK المنقى وGZMK .ب، مخطط لاختبار إنزيم البروتياز القائم على نقل الطاقة بالفلوريسنس (FRET) لتحديد نشاط GZMK. ج، قياسات نشاط GZMK باستخدام الاختبار في (ب). تم تضمين الليزوزيم والتربسين كضوابط سلبية وإيجابية، على التوالي. كل رمز يدل على تكرار تقني. )، وتُعرض البيانات كمتوسط ± الانحراف المعياري. AU، وحدة عشوائية. د، صور تمثيلية لعملية التحليل المناعي تُظهر انقسام SET بواسطة GZMK. هـ، صور تمثيلية لعملية التحليل المناعي تُظهر انقسام DMBT1 النسيجي بواسطة جرعات مختلفة من GZMK، مع -أكتين كعينة للتحكم في معالجة العينات. البيانات تمثل (أ-هـ) على الأقل تجربتين مستقلتين. و، صورة تمثيلية لجيل ملون بصبغة كوماتسي زرقاء تظهر الانقسام
of C3 المنقى من المصل بواسطة GZMK و C3bBb و C4b2a.g، إحصائيات تلخص مستوى C3a المحول بواسطة GZMK و C3bBb، كما تم تطبيعه على C4b2a. كل رمز يدل على تجربة واحدة، والخطوط تدل على المتوسطات. h، تتبع HPLC التمثيلي (يسار) وهلام ملون بصبغة كومياسي الأزرق (يمين) يظهر عزل C3a. تم حضن C3 المنقى من المصل مع GZMK البشري المعاد تركيبه أو C4b2a الم assembled من مكونات منقاة من المصل. mAU، وحدة الامتصاص الملي. i-j، بلوتات المناعة (i) وإحصائيات ملخصة (j) تظهر تنشيط ERK في خلايا THP1 بواسطة C3a من مصادر مختلفة. البيانات تمثل ( و (i) أو مجمعة (g و j) من ثلاثة تجارب مستقلة. كل رمز يدل على تجربة واحدة، والخطوط تدل على المتوسطات. تمت مقارنة القيم باستخدام اختبار t غير المقترن ذو الجانبين. تُعرض الصور المصدر للهلامات واللطخات في الشكل التكميلية 1.

الجيلات الملونة بصبغة كواماسي الزرقاء التي تمثل انقسام GZMK لبروتينات C2 (أ)، C4 (د) وC5 (ز)، كما تم تأكيده بواسطة تسلسل إدمان (ب، هـ و ح) والاختبارات المناعية. و ). يتم الإشارة إلى أوقات الحضانة. اختبارات التحلل لقياس نشاط C5b6 المنقى من المصل مع أو بدون انقسام GZMK (انظر الطرق لمزيد من التفاصيل). تم تحلل كريات الدم الحمراء للدجاج
نتج عن إضافة C5b6 وكمية زائدة من C7 وC8 وC9 المنقاة من المصل. AU، وحدة عشوائية. تشير أشرطة الخطأ إلى المتوسطات ± الانحراف المعياري. كل رمز يدل على تكرار تقني. )، والخطوط تشير إلى المتوسطات. البيانات تمثل على الأقل تجربتين مستقلتين. الصور المصدرية للهلامات واللطخات مقدمة في الشكل التكميلية 1.

الشكل البياني الممتد 6 | خلايا CD8 T التي تعبر عن GZMK تتوضع في الهياكل اللمفاوية الثلاثية. أ-ج، تحليلات IHC لخلايا CD8 T التي تعبر عن GZMK في الأنسجة الأنفية التي تمت إزالتها جراحيًا من الأصحاء أو مجموعات مختلفة من مرضى NP. أ، صور تمثيلية لتلوين GZMK و CD8. المربعات البيضاء تشير إلى المناطق التي تحتوي على تجمعات خلايا CD8 T التي تعبر عن GZMK؛ عرض مكبر لمناطق المربعات البيضاء موفر كإدخالات. مقياس الرسم، للنظرة العامة و لرسوم البيانية الدائرية التي تصنف الأفراد في كل مجموعة إلى أولئك الذين احتوت أنسجتهم المستأصلة جراحياً على تجمعات خلايا CD8 T التي تعبر عن GZMK أو لم تحتوي عليها. يتم الإشارة إلى أعداد الأفراد. كثافات تجمعات خلايا CD8 T التي تعبر عن GZMK في مرضى NP و svNP، مقدمة كتوزيعات نسبية. تحليل التعبير عن المناطق النسيجية التي تحتوي على GZMK وتجمعات الخلايا من خلال تحليل تسلسل RNA الكمي. إعداد التجربة. صورة حقل مضيء لقطاع نسيجي واحد من NP.
(يسار، ملون بصبغة الكريستال البنفسجي) وصورة فلورية لقسم مجاور (يمين، ملون بـ DAPI وأجسام مضادة لـ GZMK) ، مع دوائر وردية وزرقاء تشير إلى تجمعات الخلايا والمناطق الضابطة المستأصلة بواسطة تشريح الميكرو بالليزر. مقياس الرسم، .ف، تحليل المكونات الرئيسية. كل رمز يشير إلى منطقة نسيج واحدة. ج، الجينات المعبر عنها بشكل مختلف المختارة في المجموعة الضابطة و GZMK المناطق. تلوين IHC للعلامات المحددة (h) وإحصائيات ملخصة لوفرة أنواع الخلايا المحددة في المجموعة الضابطة ( ) و GZMK المناطق ( ) يتم عرضها ( و ). شريط القياس، . كل رمز يشير إلى منطقة مختارة واحدة، والخطوط تدل على المتوسطات. تم تضمين مقاطع الأنسجة من ثلاثة (ج) أو أربعة (ط) مرضى في التحليل، وعلى الأقل ثلاثة من الضوابط وGZMK تم اختيار مناطق لكل مريض. القيم بواسطة اختبارات مان-ويتني.

الشكل البياني الموسع 7 | نموذج الربو الفأري. أ، إعداد التجربة. ب، استراتيجيات التصفية لمجموعات الخلايا المناعية المختلفة في سائل غسيل القصبات الهوائية. ج، إحصائيات ملخصة تظهر قياسات مجموعات خلايا سائل غسيل القصبات الهوائية. د، تعبير عن في خلايا T CD8 و CD4 المعزولة من نسيج الرئة بواسطة RT-PCR الكمي. تم تطبيع البيانات على تعبير Atcb. تم تجميع البيانات من تجربتين مستقلتين، مع تضمين ما لا يقل عن حيوانين في كل مجموعة في
تجربة واحدة. القيم بواسطة غير متطابقة ذات جانبين اختبارات. e-f، تحليلات تسلسل RNA المرسال لخلية CD8 T من سائل غسيل القصبات الهوائية (BALF) المجمعة من فئران C57BL/6 بعد التحديات الثانية مع OVA كما هو موضح في a.e، تصور UMAP لثلاثة مجموعات فرعية من خلايا CD8 T في BALF. f، مخططات الكمان تظهر تعبير Cd3e، Cd8a، Gzmk، Itgae. تم دمج البيانات من نسختين بيولوجيتين، كل منهما تحتوي على خلايا BALF مجمعة من 3 فئران.

الشكل 8 من البيانات الموسعة | وظائف GZMK المشتق من خلايا T CD8. أ-هـ، تحفيز التهاب المسالك الهوائية في -كري و الفئران. أ، تصميم التجربة. ب، أعداد خلايا المناعة المشار إليها. ج، وظيفة الرئة للفئران المشار إليها كما تم قياسها بواسطة فرط الحساسية في مجرى الهواء استجابةً لجرعة متزايدة من الميثاكولين باستخدام تقنية التذبذب القسري. كل رمز يشير إلى فأر واحد، والأشرطة تمثل المتوسطات. د، صور تمثيلية لصبغة ألكيان الأزرق مع حمض البيريويد (AB-PAS) لشرائح أنسجة الرئة. مقياس الرسم، .
تحديدات PAS المناطق في مجرى الهواء. ف-ج، الدور الداخلي لخلايا T CD8 لـ GZMK. ف، إعداد التجربة. ج، إحصائيات تلخص عدد الخلايا المناعية المكتشفة في سائل الشطف القصبي. i.p.، داخل الصفاق؛ i.h.، استنشاق؛ DPI، أيام بعد التحصين. كل رمز يشير إلى فأر واحد، والخطوط تمثل المتوسطات. تم تجميع البيانات من تجربتين (د-هـ) أو ثلاث تجارب (ب، ج وج) مستقلة، مع تضمين ما لا يقل عن حيوانين في كل مجموعة. القيم بواسطة غير متطابقة ذات جانبين اختبارات.

الشكل 9 من البيانات الموسعة | GZMK المستمد من خلايا CD8 T يعزز تجنيد الحمضات الهوائية من خلال C3.a-d، تحفيز الالتهاب الهوائي استنادًا إلى النقل التبني لخلايا OT-I T التي تعبر عن Gzmk بشكل مفرط، Gzmk و ب) و و د). و الإعداد التجريبي. و د، أعداد مجموعات الخلايا المناعية المحددة في سائل الشطف القصبي. هـ-و، تحفيز الربو في الحيوانات. د، تجريبي
جدول. إحصائيات تلخص عدد أنواع مختلفة من خلايا المناعة في سائل الغسيل الشعبي. كل رمز يشير إلى فأر واحد، والخطوط تمثل المتوسطات. تم تجميع البيانات من تجربتين (د و ف) أو أربع تجارب (ب) مستقلة، مع تضمين ما لا يقل عن حيوانين في كل مجموعة. القيم بواسطة غير متطابقة ذات جانبين اختبارات.

الشكل البياني الممتد 10 | تأثير مثبطات الجرanzيم. أ، الجدول الزمني التجريبي. تم إعطاء PPACK أو Z-IETD-FMK عن طريق الحقن داخل الصفاق كل يومين خلال الفترة الزمنية المحددة. و إحصائيات ملخصة تظهر عدد أنواع مختلفة من خلايا المناعة في سائل غسيل القصبات الهوائية (BALF) للفئران المعالجة بـ PPACK (ب) أو Z-IETD-FMK (ج). كل رمز يشير إلى فأر واحد، والخطوط تمثل المتوسطات. د، فرط حساسية مجرى الهواء للفئران المعالجة بالسيارة أو PPACK تم قياسها باستخدام تقنية التذبذب القسري. كل رمز يشير إلى فأر واحد، والشرائط
تشير إلى ما يعنيه. e، تمثيل AB-PAS لشرائح أنسجة الرئة للفئران المعالجة بالسيارة أو PPACK. مقياس الرسم، .ف، إحصائيات تلخص المناطق في مجرى الهواء للفئران المشار إليها. كل رمز يشير إلى فأر واحد، والخطوط تمثل المتوسطات. تم تجميع البيانات من تجربتين (ب، ج، هـ و و) أو أربع تجارب (د)، مع تضمين ما لا يقل عن حيوانين في كل مجموعة. القيم بواسطة غير متطابقة ذات جانبين اختبارات.