DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-025-62613-0
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/40804235
تاريخ النشر: 2025-08-13
المؤلف: Zhenyun Du وآخرون
الموضوع الرئيسي: الحويصلات خارج الخلوية في الأمراض
نظرة عامة
تتناول هذه الفقرة دمج تضخيم الدائرة المتدحرجة مع المجهرية التوسعية (RCA-ExM) لتعزيز تحليل الحويصلات خارج الخلوية (EVs) لتشخيص السرطان ومراقبة العلاج. الحويصلات خارج الخلوية، التي هي هياكل محاطة بغشاء على مقياس النانو تفرزها الخلايا، تحمل جزيئات حيوية تعكس الحالات الفسيولوجية والمرضية لخلاياها الأم. تبرز الدراسة التحديات التي تطرحها وفرة الحويصلات خارج الخلوية المنخفضة وتنوع المؤشرات الحيوية، مما يستلزم أساليب مبتكرة لتحليلها. يتيح RCA-ExM تحليل متعدد الأبعاد عالي الدقة للحويصلات الفردية باستخدام المجهر الفلوري القياسي، مما يسهل الكشف الحساس عن المؤشرات الحيوية.
تستخدم المنهجية RCA لتحديد بروتينات غشاء الحويصلات خارج الخلوية وتستفيد من اندماج الحويصلات مع الليبوزوم للكشف عن جزيئات RNA صغيرة محددة (miRNAs) من خلال المنارات الجزيئية ودائرة إنزيمية. يسمح التوسع المدعوم بالهيدروجيل بالكشف عن الحويصلات الفردية. يوضح تطبيق RCA-ExM لت quantifying مستويات miR-21 في الحويصلات خارج الخلوية من بلازما EpCAM+ PD-L1+ من مجموعة سريرية (n = 86) قدرته على تمييز مرضى السرطان عن الأفراد الأصحاء وتصنيف فعالية العلاج المناعي. تؤكد النتائج على إمكانية RCA-ExM في تعزيز تشخيصات خزعة السائل والطب الدقيق من خلال معالجة التنوع التركيبي للحويصلات خارج الخلوية، لا سيما فيما يتعلق بمؤشرات السرطان الحيوية مثل PD-L1 و miR-21.
طرق
في هذا القسم، يوضح المؤلفون المواد المستخدمة في دراستهم، مع التركيز على المصادر وأنواع الكواشف والمركبات المستخدمة. تم الحصول على أوليغونوكليوتيدات ومخازن مختلفة، بما في ذلك 1× TE و 10× TM و 1× TBE، من شركة سانغون للتكنولوجيا الحيوية. بالإضافة إلى ذلك، تم الحصول على الدهون الرئيسية مثل 1،2-ديويلويلي-سن-غليسيرول-3-فوسفات الكولين (DOPC) و 3β[N-(N’، N’-ثنائي ميثيل أمين الإيثان)-كاربامويل] كوليسترول (DC-Chol) من شركة سيغما الكيميائية. تم الحصول على نوكلياز محدد الدوبلكس (DSN) لتضخيم إشارة miR-21 من إيفروجين، بينما تم الحصول على إنزيمات وكواشف أساسية أخرى، بما في ذلك Nb.BbvCI و quick T4 DNA ligase، من نيو إنجلاند بيو لابز.
يسرد القسم أيضًا وسائل زراعة الخلايا المختلفة والمكملات من جيبكو، بالإضافة إلى مواد كيميائية إضافية مثل 3-أمينوبروبيل ثلاثي إيثوكسي سيليان (APTES) وبيرسلفات الأمونيوم (APS) المأخوذة من سيغما-ألدريتش. علاوة على ذلك، تم الحصول على مواد لإعداد التجارب، بما في ذلك بوليديميثيل سيليوكسان (PDMS) وألواح السيليكون، من شركة تشيب تكنولوجي. تؤكد هذه الجرد الشامل للمواد على التحضير الدقيق واختيار الكواشف الضرورية لطرق الدراسة.
النتائج
في هذا القسم، يقدم المؤلفون نتائج نهجهم المتعدد المؤشرات الحيوية لتحليل الحويصلات خارج الخلوية (EVs) المشتقة من خطوط خلوية مختلفة، تحديدًا A375 و U251 و MCF-7 و Jurkat. تضمنت المنهجية التقاط الحويصلات المستهدفة باستخدام أبتامير ألوستيري محدد CD63، تلاها تطبيق مجسات سطحية (SPs) محددة لـ EpCAM و PD-L1، ومنارة جزيئية محددة لـ miR-21 (MB). خضعت الحويصلات الملتقطة لسلسلة من خطوات المعالجة، بما في ذلك وضع العلامات على الهدف، واندماج الليبوزوم، وتضخيم الدائرة المتدحرجة (RCA)، للتحقق من أن ملفات المؤشرات الحيوية للحويصلات المعزولة تتوافق مع تلك الخاصة بخلاياها الأم.
تم تقييم فعالية هذا النهج بشكل أكبر من خلال خلط الحويصلات من خطوط الخلايا الأربعة والتقاطها على شريحة معدلة نانوية. تم حضن هذا المزيج مع تركيبة مسبقة التحسين من SPs الاثنين للكشف المتزامن، تلاها RCA وتقنيات التصوير لتمييز ملفات الإشارة من مجموعات الحويصلات المختلفة. تشير النتائج إلى أن استراتيجية تصنيف المؤشرات الحيوية المتعددة نجحت في حل تجمعات الحويصلات المتميزة، مما يوضح إمكانياتها في التوصيف الدقيق للحويصلات بناءً على أصلها الخلوي.
المناقشة
يوفر اختبار RCA-ExM المقترح نهجًا مبسطًا للكشف عن مؤشرات حيوية متعددة على حويصلات خارج الخلوية الفردية (EVs) المشتقة من خلايا الورم. تتضمن هذه الطريقة ثلاث إجراءات رئيسية: التقاط الحويصلات المستهدفة باستخدام أبتامير ألوستيري، هجينها مع مجس شعرية متغيرة (SP) لتضخيم RCA، واستخدام الليبوزومات التي تحتوي على منارات جزيئية وإنزيمات محددة مزدوجة لتسهيل الكشف الحساس في الموقع عن miRNAs المستهدفة. يقوم الاختبار بكمية فعالة للحويصلات خارج الخلوية المشتقة من الورم مع تقليل المشكلات المتعلقة بتدهور miRNA وتداخل miRNA القابل للذوبان. يتيح دمج RCA مع التوسع بالهيدروجيل التصوير عالي الدقة، مما يسمح بتحليل مفصل للحويصلات الفردية وتنوعها التركيبي، وهو أمر حاسم لتشخيص السرطان وتقييم فعالية العلاج المناعي.
تستخدم استراتيجية التسمية المزدوجة المطورة للكشف عن الحويصلات خارج الخلوية PD-L1+ المشتقة من الورم مركبًا نانويًا للاحتجاز المحدد و SP محدد لـ PD-L1 الذي يخضع لتغيرات شكلية عند التعرف على الهدف، مما يسهل التسمية السريعة للتحليلات اللاحقة. أظهرت هذه الطريقة حساسية محسنة مقارنة بالطرق التقليدية، حيث أكدت قياسات التدفق السيتومتري والمجهر الفلوري خصوصية تسمية PD-L1. بالإضافة إلى ذلك، تم تحسين قدرة الاختبار على الكشف عن miRNAs داخل الحويصلات من خلال آلية نقل الليبوزوم التي تعزز الإشارة، مما يسمح بالكمية الدقيقة لمستويات miRNA المرتبطة بأنماط السرطان المختلفة. تم التحقق من طريقة RCA-ExM باستخدام عينات بلازما من مرضى السرطان، مما كشف عن اختلافات كبيرة في تعبير المؤشرات الحيوية التي تتوافق مع استجابات العلاج، مما يبرز إمكانياتها كأداة قوية لتشخيص السرطان ومراقبة فعالية العلاج.
DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-025-62613-0
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/40804235
Publication Date: 2025-08-13
Author(s): Zhenyun Du et al.
Primary Topic: Extracellular vesicles in disease
Overview
This section discusses the integration of rolling circle amplification with expansion microscopy (RCA-ExM) to enhance the profiling of extracellular vesicles (EVs) for cancer diagnostics and treatment monitoring. EVs, which are nanoscale membrane-bound structures secreted by cells, carry bioactive molecules that reflect the physiological and pathological states of their parent cells. The study highlights the challenges posed by the low abundance and heterogeneity of EV biomarkers, necessitating innovative approaches for their analysis. RCA-ExM enables super-resolution multi-omics profiling of single EVs using standard fluorescence microscopy, facilitating sensitive multimodal detection of biomarkers.
The methodology employs RCA to identify EV membrane proteins and utilizes EV-liposome fusion to detect specific microRNAs (miRNAs) through molecular beacons and an enzyme circuit. Hydrogel-mediated expansion allows for the detection of individual EVs. The application of RCA-ExM to quantify miR-21 levels in EpCAM+ PD-L1+ plasma EVs from a clinical cohort (n = 86) demonstrates its capability to differentiate cancer patients from healthy individuals and categorize immunotherapy efficacy. The findings underscore the potential of RCA-ExM for advancing liquid biopsy-based diagnostics and precision medicine by addressing the compositional heterogeneity of EVs, particularly in relation to cancer biomarkers such as PD-L1 and miR-21.
Methods
In this section, the authors detail the materials utilized in their study, emphasizing the sources and types of reagents and compounds employed. Oligonucleotides and various buffers, including 1× TE, 10× TM, and 1× TBE, were procured from Sangon Biotech Co., Ltd. Additionally, key lipids such as 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) and 3β[N-(N’, N’-dimethylaminoethane)-carbamoyl] cholesterol (DC-Chol) were sourced from Sigma Chemical Co. The duplex-specific nuclease (DSN) for miR-21 signal amplification was obtained from Evrogen, while other essential enzymes and reagents, including Nb.BbvCI and quick T4 DNA ligase, were acquired from New England Biolabs.
The section also lists various cell culture media and supplements from Gibco, along with additional chemicals such as 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) and ammonium persulfate (APS) sourced from Sigma-Aldrich. Furthermore, materials for the experimental setup, including polydimethylsiloxane (PDMS) and silicon wafers, were obtained from Chip Technology Co., Ltd. This comprehensive inventory of materials underscores the meticulous preparation and selection of reagents critical for the study’s methodologies.
Results
In this section, the authors present the results of their multi-biomarker phenotyping approach for analyzing extracellular vesicles (EVs) derived from various cell lines, specifically A375, U251, MCF-7, and Jurkat. The methodology involved capturing target EVs using a CD63-specific allosteric aptamer, followed by the application of surface probes (SPs) specific to EpCAM and PD-L1, and a miR-21-specific molecular beacon (MB). The captured EVs underwent a series of processing steps, including target labeling, liposome conjugation, and rolling circle amplification (RCA), to verify that the biomarker profiles of the isolated EVs corresponded with those of their parental cells.
The effectiveness of this approach was further assessed by mixing EVs from the four cell lines and capturing them on a nanocomplex-modified chip. This mixture was incubated with a preoptimized combination of the two SPs for simultaneous detection, followed by RCA and imaging techniques to distinguish signal profiles from different EV subsets. The results indicate that the multi-biomarker phenotyping strategy successfully resolved distinct EV populations, demonstrating its potential for accurate characterization of EVs based on their cellular origin.
Discussion
The proposed RCA-ExM assay offers a streamlined approach for the detection of multiple biomarkers on single extracellular vesicles (EVs) derived from tumor cells. This method involves three key procedures: capturing target EVs using an allosteric aptamer, hybridizing them with a switch hairpin probe (SP) for RCA amplification, and utilizing liposomes containing molecular beacons and dual-specificity nucleases to facilitate sensitive in situ detection of target miRNAs. The assay effectively quantifies tumor-derived EVs while mitigating issues related to miRNA degradation and soluble miRNA interference. The integration of RCA with hydrogel expansion enables super-resolution imaging, allowing for detailed analysis of single EVs and their compositional heterogeneity, which is critical for cancer diagnostics and evaluating immunotherapy efficacy.
The dual-labeling strategy developed for detecting tumor-derived PD-L1+ EVs employs a nanocomplex for specific capture and a PD-L1-specific SP that undergoes conformational changes upon target recognition, facilitating rapid labeling for subsequent analyses. This approach demonstrated enhanced sensitivity compared to conventional methods, with flow cytometry and fluorescence microscopy confirming the specificity of PD-L1 labeling. Additionally, the assay’s ability to detect miRNAs within EVs was improved through a liposome transfer mechanism that amplifies the signal, allowing for precise quantification of miRNA levels associated with different cancer phenotypes. The RCA-ExM method was validated using plasma samples from cancer patients, revealing significant differences in biomarker expression that correlate with treatment responses, thus highlighting its potential as a powerful tool for cancer diagnostics and monitoring therapeutic efficacy.