© المؤلفون 2024

بشكل عام، أدت هندسة المستقبلات إلى تقدم كبير في العلاجات المناعية للسرطان المعتمدة على خلايا NK. مع معالجة التحديات التقنية، من المحتمل أن تعيد هذه العلاجات المبتكرة تشكيل علاج السرطان المناعي.

الكلمات المفتاحية: خلايا NK؛ العلاج الخلوي؛ هندسة المستقبلات؛ CAR

المناعة الخلوية والجزيئية (2024) 21:315-331؛https://doi.org/10.1038/s41423-024-01145-x

في العقود الأخيرة، ظهرت العلاجات الخلوية المتبناة كطرق واعدة لاستغلال السمية الذاتية للخلايا المناعية وتدمير الخلايا الخبيثة. من بين مرشحي الخلايا المناعية، جذبت خلايا القاتل الطبيعي (NK) اهتمامًا كبيرًا بسبب قدرتها الفريدة على التعرف على وتدمير الخلايا المستهدفة دون تنشيط محدد للمستضد [1]. تمثل خلايا NK، التي تشكل من خلايا الدم المحيطية الوحيدة النواة (PBMCs)، مكونات أساسية في نظام المناعة الفطري. تصنف هذه الخلايا إلى مجموعتين متميزتين، CD56 و CD16، بناءً على التعبير النسبي للعلامات السطحية. مجموعة CD56 CD16 هي في الغالب مناعية وتساهم في إنتاج السيتوكينات، بينما تتميز خلايا NK CD56 CD16 بنشاط سمي قوي [2]. تظهر هذه الخلايا خصائص سامة مشابهة لتلك الخاصة بخلايا T CD8 ولكنها تفتقر إلى معقد CD3/مستقبل خلايا T (TCR). مع ظهور تسلسل RNA أحادي الخلية وقياس التدفق متعدد المعلمات،
تم تحديد مجموعات فرعية جديدة من خلايا NK تتجاوز التصنيف المعتاد بناءً على CD16 و CD56 [3، 4]. من بينها، مجموعة تسمى خلايا NK التكيفية، التي تتميز بغياب تعبير مستقبل الغلوبولين المناعي Fc-epsilon (FCER1G) وزيادة تعبير مجموعة القاتل الطبيعي 2 C (NKG2C)، تظهر خصائص معززة، بما في ذلك زيادة التكاثر، وزيادة التوسع والقدرة السمية. على عكس خلايا T، لا تقتصر خلايا NK على التعرف على معقد التوافق النسيجي الكبير (MHC، المعروف أيضًا بمستضد الكريات البيضاء البشرية (HLA))، ويتطلب تنشيطها مستقبلات متعددة. في الواقع، يعتمد تنشيطها على ضبط دقيق للإشارات المثبطة والمنشطة. لمنع التنشيط غير المرغوب فيه للخلايا السليمة، تعبر خلايا NK عن مستقبلات الغلوبولين المناعي الشبيهة بالخلايا القاتلة (KIRs) والهيتيروديمر مجموعة القاتل الطبيعي 2 A (NKG2A)/CD94، الذي يتفاعل مع جزيئات HLA من الفئة I لتوفير إشارات مثبطة (الشكل 1). على العكس، تمتلك خلايا NK مجموعة من المستقبلات المنشطة، بما في ذلك مجموعة القاتل الطبيعي 2D (NKG2D)، وجزيء DNAX المساعد-1 (DNAM-1)،

ومستقبلات السمية الطبيعية (NCRs)، مثل NKp30 و NKp44 و NKp46 (الشكل 1) [2]. عند تنشيطها بواسطة الخلايا المستهدفة، تحفز خلايا NK آليات متعددة لتدمير الخلايا المستهدفة، مما يؤدي إلى إطلاق حبيبات سيتوبلازمية محملة بالبروتين المثقب والجرانزيم B داخل المشبك المناعي، مما يؤدي إلى تحلل الخلايا المستهدفة. من الجدير بالذكر أن تعبير CD107a يرتفع بعد تنشيط خلايا NK ويرتبط إيجابيًا بإفراز السيتوكينات ونشاط خلايا NK السامة. يمكن أيضًا لخلايا NK أن تتوسط السمية الخلوية المعتمدة على الأجسام المضادة (ADCC) بعد التعرف على الأجسام المضادة المرتبطة بالورم بواسطة مستقبل منخفض الت affinity للجزء الثابت من الأجسام المضادة IgG1 (FcyRIIIa أو CD16)، مما يؤدي إلى بدء مسارات موت الخلايا [5]. أخيرًا، يمكن لخلايا NK أن تمارس قدرتها السمية من خلال التعبير عن ليدين موت حاسمين، بما في ذلك ليد Fas (FasL) و ligand المرتبط بعامل نخر الورم (TNF) (TRAIL)، مما يؤدي إلى موت الخلايا المستهدفة بعد التفاعل مع مستقبلاتها.

نظرًا لقدرتها على قتل خلايا الورم مباشرة، تم اختبار نقل خلايا NK في المرضى الذين يعانون من سرطان متقدم. هنا، نقدم ملخصًا للتحديات التي تواجه علاجات خلايا NK في التجارب السريرية الأولية وكيف تم تطوير استراتيجيات هندسة المستقبلات لمعالجة هذه التحديات.

تم استخدام عدة مصادر لخلايا NK من أجل النقل التبني. تم اعتماد خط خلايا NK-92 للاستخدام السريري من قبل إدارة الغذاء والدواء (FDA) [6]. على الرغم من أن هذا الخط الخلوي يظهر سمية خلوية ضد خلايا الورم، إلا أنه يمتلك قدرة ضعيفة على ADCC لأنه يفتقر إلى مستقبل CD16 [7]. علاوة على ذلك، تتطلب خلايا NK92 الإشعاع للإدارة الآمنة، مما يحد من قوتها واستمراريتها في الجسم الحي [8]. بدلاً من ذلك، يمكن الحصول على خلايا NK الأولية أو اشتقاقها من مصادر متعددة، بما في ذلك الدم المحيطي (PB)، دم الحبل السري (CB)، وخلايا الجذع متعددة القدرات المستحثة (iPSCs) [9]. ومع ذلك، غالبًا ما تكون التوسعة خارج الجسم ضرورية قبل الزرع للحصول على عدد كافٍ من خلايا NK، وهو ما لا يزال يمثل تحديًا. في الواقع، غالبًا ما تكون هناك حاجة إلى جرعات عالية وحقن متعددة. تم اختبار عدة تقنيات تحفيز ليس فقط لتكبير خلايا NK ولكن أيضًا لتعزيز قدرتها السامة للخلايا [10]. ومع ذلك، يتم إضافة العديد من السيتوكينات إلى وسط الثقافة لجعل الخلايا “مدمنة على السيتوكينات”، مما يعيق استمراريتها وتوسعها في الجسم الحي. لذلك، يجب اختيار مصدر خلايا NK، بالإضافة إلى ظروف التحفيز، بعناية من أجل النقل التبني. علاوة على ذلك، أظهرت أيضًا عملية التجميد التأثير على التوسع في الجسم الحي [11].

في البداية، تم إجراء نقل خلايا NK بالاشتراك مع زراعة خلايا الدم الجذعية (HSCT) لعلاج الأورام الدموية. بدلاً من ذلك، تم حقن خلايا NK أيضًا دون زراعة خلايا الدم الجذعية في مرضى اللوكيميا الحادة مع نتائج مخففة. بشكل عام، أقل من من المرضى في تجارب سريرية مختلفة حققوا الشفاء التام [12-14]. والأكثر تشجيعًا، أدى نقل خلايا NK إلى القضاء على المرض المتبقي القابل للقياس في مريضين مصابين بسرطان الدم النخاعي الحاد [15]. كما لوحظت نتائج متباينة في مرضى لمفوما غير هودجكين (NHL)، حيث كان لنقل خلايا NK نشاط سريري كبير في المرضى الذين تم علاجهم بشكل مكثف والذين يعانون من NHL المتقدم في تقرير واحد، ولكن لم يكن له أي تأثير في المرضى الذين خضعوا لزراعة الخلايا الجذعية في دراسة أخرى [16، 17]. بالإضافة إلى الأورام الدموية، تم استخدام علاج خلايا NK أيضًا لعلاج الأورام الصلبة، بما في ذلك سرطان المبيض وسرطان الثدي، مع ملاحظة الشفاء التام في أقل من من المرضى [18، 19]. في معظم التجارب، كانت الفوائد السريرية تدوم غالبًا لبضعة أشهر فقط قبل الانتكاس، على الأرجح بسبب المقاومة أو انخفاض استمرارية خلايا NK. تتراوح استمرارية خلايا NK عادةً من بضعة أيام إلى 4 أشهر، بمتوسط 7 أيام. كان توسيع خلايا NK متغيرًا للغاية، مع عدم ملاحظة أي توسيع لخلايا NK في بعض التجارب [12، 17]. قد تنشأ هذه التباينات من مستويات مختلفة من الاستجابات المضادة للورم، نوع السرطان المدروس، مرحلة المرض، والاختلافات بين الأفراد.

تتمثل إحدى المزايا الرئيسية لعلاج خلايا NK في ملفه الأمني الممتاز. مقارنةً بـ تتميز خلايا T ونقل خلايا NK بعدة مزايا، بما في ذلك انخفاض خطر تحفيز السمية العصبية أو متلازمة إطلاق السيتوكينات (CRS) وإمكانية حقن خلايا متبرع بها. في الواقع، لا تحفز خلايا NK مرض الطعم ضد المضيف (GvHD)، الذي يتمثل بشكل رئيسي بواسطة تعرّف مستقبلات الخلايا التائية (TCR) على مجمعات HLA-peptide الأجنبية، وتحمي الأنسجة السليمة من خلال الإشارة عبر iKIRs وNKG2A. علاوة على ذلك، أظهرت التباينات في KIR أنها تزيد من الاستجابات المضادة للأورام. وبالتالي، يمكن استخدام خلايا NK من المتبرعين الأصحاء بأمان في علاج السرطان، حتى في حالة عدم تطابق HLA بين المتبرع والمستقبل، مما يسمح بإنشاء منتجات “جاهزة للاستخدام”. في معظم الحالات، تكون عمليات نقل خلايا NK آمنة ومتحملة بشكل جيد، مع سمية مرتبطة بالعلاج من الدرجة المنخفضة وقابلة للعكس. ومع ذلك، تم ملاحظة أحداث سلبية من الدرجة العالية بشكل متقطع، خاصة عندما تم إعطاء خلايا NK مع عدة عوامل علاجية تقليدية؛ هذه الاختلافات في النتائج منعت الأطباء من استخلاص استنتاجات. تم تقييم نقل خلايا NK بالاشتراك مع الأجسام المضادة وحيدة النسيلة. في الواقع، يمكن أن تعزز إضافة الأجسام المضادة وحيدة النسيلة من ADCC الذي يتم بوساطة خلايا NK. تم اختبار خلايا NK الغير ذاتية بالاشتراك مع الجسم المضاد وحيد النسيلة المضاد لـ CD20، ريتوكسيماب، في تجربتين سريريتين. كانت المعالجة متحملة بشكل جيد، ولكن فقط المرضى و حقق المرضى في كل تجربة استجابات سريرية موضوعية [21،22]. وقد أظهرت مجموعة من نقل خلايا NK والأجسام المضادة وحيدة النسيلة، بما في ذلك مضاد PD1 ومضاد EGFR ومضاد GD2، بعض الفوائد السريرية [23-28]. ومع ذلك، نادراً ما تم تحقيق الشفاء التام، على الأرجح بسبب المرحلة المتقدمة من المرض. ومن الجدير بالذكر أن دراستين أفادتا بحدوث أحداث سلبية، بما في ذلك نقص الصفائح الدموية، وكبت النخاع العظمي، واعتلال الدماغ [25،27].

على الرغم من الدور المفيد لخلايا NK في علاج السرطان الذي يكمن في قدرتها على قتل خلايا السرطان مباشرة، إلا أن إمكاناتها الكاملة غالبًا ما تعيقها البيئة الدقيقة للورم المثبطة للمناعة والمفتقرة للأكسجين، مما قد يفسر النتائج غير الحاسمة للتجارب السريرية. في الواقع، يمكن أن تمنع البيئة الدقيقة للورم تسلل خلايا NK وتكاثرها، ويمكن أن تعيق الإشارات المنشطة. لمعالجة هذه القيود، تم اقتراح أساليب هندسية لتعزيز قدرات خلايا NK قبل النقل التبني. على الرغم من أن النقل الفيروسي اللين قد برز كاستراتيجية بارزة، إلا أن النوع الزائف لبروتين فيروس التهاب الفم الحويصلي (VSV-G) المستخدم عادة ليس فعالًا بما فيه الكفاية في تعديل خلايا NK، خاصة الخلايا الأولية. هذه القيود تعود جزئيًا إلى الدفاعات داخل الخلوية ضد المكونات الفيروسية.

لذا، هناك حاجة إلى بروتوكولات جديدة فعالة وموحدة. لمعالجة هذه المشكلة، أدى دمج بروتينات RD114 الغليكوبروتينية في جزيئات الفيروسات القهقرية بالتزامن مع Vectofusin-1 إلى زيادة كبيرة في فعالية نقل خلايا NK [31]. بدلاً من ذلك، يوفر التحفيز الكهربائي للـ mRNA/ DNA منصة متعددة الاستخدامات لتحفيز التعبير الجيني في خلايا NK. مؤخرًا، قدمت توسعة تقنيات تحرير الجينات، مثل نظام كريسبر/كاس9 (Crispr/Cas9)، آفاقًا جديدة للتخصيص الجيني الدقيق.

من بين هذه الاستراتيجيات الهندسية، تم تطوير مستقبلات غير موضعية مثبتة على الأغشية لعلاج الخلايا القاتلة الطبيعية المتبنية للتغلب على هروب الورم من المناعة من خلال تعزيز التعرف والسمية الخلوية، بالإضافة إلى تعزيز الاستمرارية والتسلل والمقاومة للبيئة المجهرية للورم.

واحدة من أكثر طرق هندسة مستقبلات المناعة انتشارًا هي خلايا T المستقبلة لمستضدات الكيميرية (CAR T cells)، والتي تتضمن إعادة برمجة خلايا T القاتلة الفعالة باستخدام CARs تستهدف مستضدات الأورام الغشائية. تتعرف هذه المستقبلات على المستضدات من خلال قطع من سلاسل الأجسام المضادة المتغيرة المحددة (scFvs)، والتي يتم دمجها مع مجالات الإشارة والتكامل الخلوي لخلايا T. تم تصميم عدة أجيال من تركيبات CAR مع مجالات إشارة داخلية مختلفة (الشكل 1). في البداية، كانت خلايا CAR من الجيل الأول تحتوي فقط على مجال التحفيز الداخلي CD3. قدمت الأجيال اللاحقة مجالات تكامل إضافية، مثل و/أو CD28، مما يعزز من إمكانياتها. تم اعتماد عدة خلايا CAR-T من قبل إدارة الغذاء والدواء الأمريكية لعلاج الأورام الدموية [32]. بالمقارنة مع خلايا T، تعتبر خلايا NK مرشحة مثيرة للاهتمام لعلاجات CAR بسبب قدرتها الطبيعية على قتل خلايا السرطان دون الاعتماد على التحسس المسبق، وانخفاض خطر متلازمة إطلاق السيتوكينات (CRS) [33، 34] وإمكانية استخدام هذه الخلايا في بيئة متبرع. لقد درست العديد من الدراسات التطبيق المحتمل لعلاجات CAR-NK سواء في البيئات ما قبل السريرية أو السريرية. منذ أول تجربة سريرية تتعلق بخلايا CD33CAR NK-92 في مرضى يعانون من اللوكيميا النقوية الحادة المتكررة أو المقاومة [35]، تم إطلاق العديد من التجارب السريرية التي تشمل خلايا NK المستمدة من خطوط الخلايا، أو الدم المحيطي (PB) أو دم الحبل السري (CB)، مع التركيز على الأورام الدموية وبعض الأورام الصلبة (الجدول 1). على الرغم من أن معظم التجارب لا تزال جارية، إلا أن بعضها قد قدم بالفعل نتائج واعدة. من بينها، FT596، وهو منتج خلايا CAR-NK موجهة لـ CD19 مستمدة من خلايا iPSC، أدى إلى استجابات موضوعية في المرضى الذين يتلقون العلاج الأحادي و4/9 من المرضى الذين يتلقون العلاج المركب مع الأجسام المضادة المضادة لـ CD20 ريتوكسيماب أو أوبينوتوزوماب بعد الدورة الأولى من علاج FT506. عند مستويات الجرعة الواحدة من مليون خلية، 8 من 11 ( أظهر المرضى القابلون للتقييم استجابة موضوعية، بما في ذلك 7 حالات شفاء كامل دون أحداث سلبية كبيرة في دراسة المرحلة الأولى لتصعيد الجرعة المبلغ عنها [36، 37]. وبالمثل، أظهرت خلايا NK المعدلة باستخدام CAR-CD19 وIL15 وجينات الانتحار القابلة للتحريض caspase 9 عدم وجود سمية شديدة مرتبطة بالعلاج وأدت إلى استجابة موضوعية في 8 من 11 (73%) من المرضى الذين يعانون من أورام لمفية من نوع B [38]. مؤخرًا، تم اختبار استراتيجية هندسية مماثلة تتضمن CAR مضاد لـ CD19 وIL-15 في خلايا NK المشتقة من دم الحبل السري وأدت إلى استجابة موضوعية في 18 من 37 ( مرضى يعانون من أورام خلوية بائية CD19 + في مرحلة محاكمة [39].

البنى الكلاسيكية لمستقبلات CAR. تم استخدام مستقبلات CAR من الجيل الأول المكونة من سلسلة CD3 [40، 41] ومُستقبلات CAR من الجيل الثاني المكونة من CD28 وCD3 [38، 42-44]، 4-1BB وCD28 [45]، 4-1BB وCD3 [46، 47]، 4-1BB وCD28 وCD3 [48]، أو CD137 وCD3 [49، 50] لإعادة توجيه خلايا NK ضد خلايا الورم. تم استهداف عدة مستضدات بواسطة مستقبلات CAR، بما في ذلك CD19 وCD20 وCD33 وCD5. بدلاً من ذلك، تم تقييم فعالية الجيلين الثاني والثالث…

تم استكشاف خلايا CAR-NK المولدة لعدة أورام صلبة، بما في ذلك سرطان المبيض وسرطان الثدي، بالإضافة إلى الورم الدبقي، مع نتائج واعدة [51-56]. في الواقع، تم تحفيز الاستجابات السامة للخلايا ضد خلايا الورم التي تعبر عن المستضد المستهدف بعد زراعة مشتركة مع خلايا CAR-NK [51-54]. كانت هذه القتل الذي تم بوساطة خلايا CARNK محددًا، حيث لم يُلاحظ أي تأثير أو تأثير ضئيل على الأنسجة السليمة [51، 54]. علاوة على ذلك، تم تأكيد هذه الفعالية في دراسات ما قبل السريرية التي سيطرت فيها خلايا CAR-NK على نمو الورم وحسنت معدلات البقاء [51-54]. على سبيل المثال، في نماذج زراعة الأورام من الورم الدبقي وسرطان المبيض، تم إطالة بقاء الفئران الحاملة للورم بشكل كبير بعد علاج خلايا CAR-NK، والذي ارتبط بانخفاض في حجم الورم [52،54]. تم الحصول على نتائج مماثلة في نموذج الفئران المحسنة من سرطان البلعوم الأنفي [53].

تركيبات CAR مع مجالات مستقبلات NK. بالإضافة إلى المجالات المشتقة من المستقبلات المعبر عنها في خلايا T، تم دمج مجالات من مستقبلات خلايا NK أيضًا في تركيبات CAR لتحسين تنشيط خلايا NK (الشكل 1). لقد أظهرت العديد من مستقبلات خلايا NK أنها تحل محل مجال التعرف خارج الخلية، والمنطقة عبر الغشاء و/أو المنطقة داخل الخلوية لمستقبلات CAR. بشكل عام، تم تقييم العديد من تكوينات CAR في خلايا NK مع تركيبات مختلفة من المناطق عبر الغشاء، بما في ذلك CD16 وNKp44 وNKp46 وNKG2D، بالإضافة إلى مجالات التحفيز المساعد، مثل 2B4 وDAP10 وDAP12 أو 4-1BB، إما بمفردها أو مجتمعة مع CD37. ومع ذلك، لم يتم التحقيق بشكل منهجي في فوائد دمج مجالات مرتبطة بخلايا NK مقارنة بالمجالات التقليدية في CARs.

من الجدير بالذكر أن CAR خارج الخلية تم استبداله بمستقبل NKG2D، مما سمح بتنشيط خلايا NK استجابةً لاكتشاف روابط NKG2D [57-59]. تم استغلال مستقبل NKG2D عبر الغشاء أيضًا في عدة تركيبات CAR لتعزيز ارتباطه بمستقبلات الإشارة المساعدة وتوسط تنشيط خلايا NK [60-62]. بدلاً من ذلك، أظهرت خلايا NK التي تعبر عن CARs مع كل من مناطق CD16 عبر الغشاء وداخل الخلية أنها تستهدف بشكل فعال أورام سرطان الغدة الرئوية في الجسم الحي [63]. كما أثبت دمج مجالات التنشيط داخل الخلايا لخلايا NK فعاليته. على سبيل المثال، تم تصميم بعض CARs مع مناطق داخل الخلايا بناءً على المستقبلات المنشطة 2B4 [44، 60، 62، 64-66] وNKG2D [61]، والبروتينات المحورية DAP10 [57] وDAP12 [59، 67، 68]، أو مستقبلات Fc FceRy [69] وCD16 [63].

حاول بعض الباحثين مقارنة تأثيرات مجالات مستقبلات المشتقة من NK مع تلك المشتقة من خلايا T في تركيبات CAR. على سبيل المثال، عززت منطقة 2B4 (بمفردها أو مع DNAM1) توسيع واستمرارية خلايا CAR-NK، على عكس إدارة CD28 أو غياب إشارة التحفيز المساعد [65]. كما أدى إضافة مجالات 2B4 بدلاً من 4-1BB إلى زيادة السمية الخلوية [70]. تم تأكيد هذه الملاحظة في ورقة تقارن السمية الخلوية لتركيبة CAR تتكون من نظير CD28، 2B4 ومجالات CD3، مقابل تلك الخاصة بـ CAR مع CD28، و CD3 مجالات داخل الخلايا [71]. كما تم تعزيز التأثير السمي لخلايا CAR-NK مع مجال DAP12 داخل الخلية مقارنةً بذلك مع سلسلة الإشارة CD3 [67]. بالإضافة إلى تأثيراتها على المجالات داخل الخلايا، تم الإبلاغ أيضًا عن أن تعديلات المجال عبر الغشاء تؤثر على وظيفة خلايا CAR-NK. على سبيل المثال، أدى استخدام مجال NKG2D عبر الغشاء مع 4-1BB إلى تعزيز استجابات خلايا NK مقارنةً بـ CAR الذي يحتوي على مجال CD8 عبر الغشاء ومنطقة تنشيط 2B4 [72]. كما تم التحقيق في تأثير استبدال scFv المستخدم عادةً بميدان التعرف على مستقبل NK. على سبيل المثال، أدى استخدام scFv يستهدف روابط NKG2D MICa/b إلى زيادة الاستجابة المضادة للورم مقارنةً بإدخال مجال NKG2D خارج الخلية [73].

بشكل عام، تعتبر مجالات مستقبلات NK قيمة لتحسين تصميمات CAR، وقد يكون تحسين تركيبات المجالات مفيدًا في المستقبل. لتعزيز التعرف على خلايا الورم و
استجابات المناعة بواسطة خلايا NK المهندسة، يمكن أيضًا استخدام مستقبلات تنشيط خلايا NK بالاشتراك مع مستقبلات CAR. من الجدير بالذكر أن خلايا CAR-NK ثنائية الخصوصية التي تم هندستها مع CAR PD1-DAP10 وNKG2D أظهرت سمية خلوية قوية ضد خلايا سرطان المعدة سواء في المختبر أو في الجسم الحي [74]. في الواقع، استغل CAR المضاد-PD1-DAP10 إشارة NKG2D من خلال مجالات DAP10 وأظهر أنه يعزز تنشيط خلايا NK ضد خلايا الورم التي تعبر عن روابط PD1 وNKG2D [74].

تركيبات CAR من الجيل التالي. ظهرت أساليب أكثر تعقيدًا، بما في ذلك الجيل الرابع من خلايا CAR-T، في السنوات الأخيرة (الشكل 1). تم إدخال جين نقل يشفر IL-15 تحت سيطرة عنصر استجابة NFAT، جنبًا إلى جنب مع تركيبة CAR تستهدف CD44 [75]. عند التعرف على المستضد المستهدف بواسطة CAR، تم بدء سلسلة إشارة، مما أدى إلى تنشيط NFAT وإفراز IL-15، مما حسن السمية الخلوية لخلايا NK في نموذج كروي لسرطان الثدي الثلاثي السلبي [75]. بالإضافة إلى ذلك، قد يؤدي دمج جينات نقل السيتوكينات المسببة للالتهابات أو المحفزة للنمو أيضًا إلى تعزيز استجابة خلايا T.

استندت تحسينات إضافية إلى هندسة CARs تستهدف عدة مستضدات لمواجهة هروب الورم (الشكل 1). في الواقع، الأورام متغايرة للغاية وتقاوم العلاجات المستهدفة عبر هروب المستضد. تم وصف العديد من الأمثلة لفقدان المستضد المستهدف بعد علاج CAR-T، بما في ذلك مستضد تمايز الخلايا الصبغية [76]، CD19 [77]، CD22 [77] وBCMA [78]. للسماح بالكشف المتزامن عن عدة علامات ورمية، تم نقل خلايا NK مع mRNAs تشفر كل من CARs CD19 وBCMA. كانت التأثيرات السامة لخلايا NK التي تعبر عن كلا CARs تفوق تلك الخاصة بخلايا NK التي تعبر عن CAR واحد [79]. وبالمثل، تم تطوير تركيبات CAR ثنائية تدمج مجالين مختلفين للتعرف على المستضد في خلايا T وقد يتم اختبارها قريبًا في خلايا NK. قد تزيد هذه الطريقة من صرامة التعرف على الورم وتمنع هروب الورم (أي، حتى إذا فقد مستضد واحد، سيتم اكتشاف المستضد الآخر بواسطة CAR الثاني، ومن غير المرجح أن يفقد كلا المستضدين في نفس الوقت) [80]. من الجدير بالذكر أنه نظرًا لأن خلايا NK يمكن أن تكشف عن خلايا الورم من خلال العديد من المستقبلات المنشطة الذاتية، حتى إذا فقد مستضد CAR المستهدف، قد تحدث استجابات سامة للخلايا من خلال التعرف على روابط أخرى، على عكس خلايا CAR-T. تعتبر CARs المحورية، المشتقة من CARs التقليدية، أيضًا مفيدة بشكل خاص للكشف عن عدة مستضدات لأنها توفر مرونة أكبر في استهداف المستضد (الشكل 1). السمة الفريدة لـ CAR المحوري هي تضمين وحدة محورية بين مجال التعرف على المستضد ومجال الإشارة. تعمل هذه الوحدة المحورية كجسر لربط عملية ربط المستضد بالتفعيل اللاحق لمسارات الإشارة المناعية. تم تنفيذ مثل هذه CARs المحورية في خلايا NK، مثل CAR المضاد-FITC المدمج مع محوري FITC-حمض الفوليك الذي يربط CAR وخلايا الورم التي تعبر عن مستقبل حمض الفوليك ألفا [72]. وبالمثل، تم إعادة توجيه CAR عالمي يتعرف على 2،4-دي نيتروفينيل (DNP) في خلايا NK لاستهداف عدة إبيتوبيات من gp160 باستخدام أجسام مضادة مرتبطة بـ DNP كجزيئات محورية [81].

تم تطوير CARs المعقدة ذات البوابات المنطقية، حيث يتم التحكم في تفعيل التأثيرات العلاجية من خلال تركيبات منطقية من إشارات الإدخال، مما يسمح باستهداف أكثر تحديدًا وقابلية للتكيف لخلايا السرطان (الشكل 1). هذا مهم بشكل خاص لتحسين التمييز بين الأنسجة المريضة والصحية. تم تصميم نهج دائرة جينية للـ CAR ذات بوابة منطقية ‘OR و NOT’ لاستهداف خلايا الأورام اللوكيميا النقوية الحادة التي تعبر عن CD33 أو FLT3 مع الحفاظ على خلايا الجذع الدموية الصحية. تم تحقيق هذه الاستراتيجية من خلال إدخال اثنين من CARs المنشطة تستهدف FLT3 وCD33 (أو CAR ثنائي التكافؤ واحد يستهدف كلا المستضدين) وCAR مثبط محدد لـ EMCN في خلايا NK. تم حماية خلايا NK من القتل الأخوي باستخدام CAR مثبط يتعرف على الذات مع CAR منشط. ومن الجدير بالذكر أنه حتى إذا كانت خلايا NK تعبر بشكل داخلي عن CAR المنشط.

الليغاند CAR، يمكن أيضًا نقل هذا المستضد المستهدف، بعد الارتباط بمستقبلات CAR، من خلايا الورم المستهدفة إلى خلايا NK الفعالة من خلال عملية تُسمى التروغوسيتوز [84]. يمكن أن تؤدي التروغوسيتوز إلى تقليل نشاط خلايا CAR-NK بسبب انخفاض كثافة المستضد الورمي على سطح خلايا الورم، ولكن يمكن أن تؤدي أيضًا إلى القتل الأخوي بعد التعرف الذاتي والانخراط المستمر مع CAR [83، 85]. بهذه الطريقة، يوفر CAR المثبط إشارة “لا تأكلني”، مما يمنع القتل الأخوي لخلايا NK. في المستقبل، قد تمكّن الدوائر المنطقية المعقدة من التفعيل الدينامي والدقيق للاستجابات المناعية ضد خلايا السرطان، مما يوفر نهجًا أكثر تحكمًا وتخصيصًا لعلاج السرطان المناعي. بالإضافة إلى ذلك، تم استخدام مستقبل Syn/notch في خلايا NK92 لتحفيز التعبير عن IL-12 بعد التعرف على الجليبيكان-3 (GP3) [86]. وبالمثل، تم استخدام مستقبل GPC3 Syn/notch المنطقي للتحكم في التعبير عن CAR يستهدف CD147 في نموذج سرطان الكبد الخلوي، مما أدى إلى قتل محدد لخلايا GPC3 + CD147 + ولكن ليس للخلايا الإيجابية لمستضد واحد [9، 87]. يتكون مستقبل Syn/notch من مجال تعرف خارجي، ومجال غشائي عبر الغشاء لبروتين Notch الأساسي، وعامل نسخ داخل الخلية. عند الارتباط بالمستضد المستهدف، يتم إطلاق عامل النسخ ويمكنه تنشيط التعبير عن الجينات السفلية. هذه المنصة قابلة للبرمجة تمامًا من حيث التعرف والجينات الفعالة، مما يوفر إمكانيات متعددة لإعادة برمجة خلايا NK. ستكون هذه القابلية للبرمجة حاسمة لتوليد استجابات معيارية، يمكن أن تتطور مع المرض وتتصدى لهروب الورم. حتى لو كانت تنظيم الدوائر الذاتية هو الهدف النهائي، فقد تم تطوير بوابات منطقية معقدة يتم التحكم فيها خارجيًا بواسطة إشارات يقدمها المستخدم لخلايا T. تتكون منصة SUPRA CAR من نظام CAR مقسم لتشغيل/إيقاف المستضد المستهدف دون الحاجة إلى حقن إضافي لخلايا CAR-T [88]. يجب أن يتصدى هذا المفتاح بشكل فعال لفقدان المستضد من خلال استهداف مستضدات متعددة. علاوة على ذلك، توفر SUPRA CARs أيضًا قوة إشارة قابلة للتعديل، مما يمكن أن يقلل من خطر الإفراط في التنشيط وبالتالي من الأحداث السلبية الخطيرة. حتى لو لم يتم اختبار SUPRA CARs بعد في خلايا NK، إلا أنها متوافقة نظريًا. وبالمثل، يمكن التحكم في VIPER CARs (CARs القابلة للتعديل بواسطة البروتياز المتنوعة) باستخدام مثبطات البروتياز المضادة للفيروسات المعتمدة من FDA، والتي يمكن أن تحفز حالة CAR ON أو OFF [89]. من المثير للاهتمام، أنه يمكن دمج VIPER CARs لإنشاء دوائر معقدة، يمكن نقلها إلى خلايا NK. يمكن أيضًا استخدام المحفزات الصغيرة المعتمدة من FDA للتحكم في الاستجابات العلاجية على مستوى النسخ. على سبيل المثال، تتكون منظمات النسخ الاصطناعية من أصابع الزنك (synZIFTRs) من مجال ربط DNA، ومجال حساس للأدوية، وعامل نسخ [90]. عند التعرض للعقار، تم تحقيق تنشيط الجينات المستهدفة تحت سيطرة المستخدم في خلايا T. علاوة على ذلك، قد يكون هذا النهج مناسبًا لتنشيط عدة برامج خلوية تدفع الاستجابات التآزرية. بشكل عام، يجب أن تساعد مثل هذه المنصات في تحسين استجابات خلايا NK لكل مريض في نقطة زمنية معينة اعتمادًا على مرحلة المرض. في المستقبل، قد تكون الأدوات الموجهة بواسطة الذكاء الاصطناعي (AI) مفيدة للغاية في تكييف هذه العلاجات بناءً على علامات المرض المحددة.

تركيبات CARs مع علاجات أخرى. قد لا يكون علاج المرضى عن طريق نقل خلايا CAR-NK وحده كافياً بسبب المرحلة المتقدمة من المرض ولأن خلايا NK تتعرض للتثبيط في البيئة المستهدفة (مثل TME). يمكن أن يؤدي دمج نقل خلايا CAR-NK مع العلاجات التقليدية مثل العلاج الكيميائي والعلاج الإشعاعي إلى تعزيز الفعالية. على سبيل المثال، العلاج الإشعاعي مفيد ليس فقط لتدمير خلايا الورم بشكل مباشر ولكن أيضًا لإعادة تشكيل TME، لا سيما من خلال تعديل الأوعية الدموية وإفراز السيتوكينات، مما يعزز تسلل خلايا المناعة المهندسة وتوسعها وتنشيطها. كما لوحظ التأثير التآزري لـ CARs والأجسام المضادة وحيدة النسيلة التي تستهدف إما مستقبلات التنشيط، مثل CD16، أو مثبطات نقاط التفتيش المناعية، مثل PDL1 و PD1، أو مستضدات الورم. يمكن إنتاج هذه الأجسام المضادة خارجيًا بواسطة

حقن مباشر أو إنتاج مباشر عن طريق الهندسة الوراثية لخلايا NK [91] أو خلايا الورم [94]. بالإضافة إلى الجينات المضادة للأجسام، تم إدخال جينات السيتوكين أيضًا مع CARs في خلايا NK لتحسين الاستمرارية (كما هو موضح أدناه). بالإضافة إلى ذلك، زادت السمية الخلوية لخلايا CAR-NK بعد دمجها مع الفيروسات المحللة للأورام في نموذج الفأر لانتقال السرطان إلى الدماغ [95]. تؤكد هذه العلاجات المركبة على قيمة الأساليب المعتمدة على CAR التآزرية لتحفيز استجابات أكثر كفاءة ضد مختلف الأورام من خلال تعزيز ليس فقط تنشيط خلايا NK ولكن أيضًا تجنيد خلايا NK واختراقها في البيئة المجهرية للورم.

على الرغم من أن معظم الاستراتيجيات قد ركزت على خلايا CAR-NK، إلا أن العتبة المطلوبة لمولدات المضادات لتفعيل خلايا NK مرتفعة نسبيًا (الجدول 2). علاوة على ذلك، فإن استخدام مثل هذه المستقبلات لا يسمح باستهداف مولدات المضادات داخل الخلايا، إلا إذا كان الـ scFv يتعرف على مركب HLA-peptide. في الواقع، تم وصف ذلك مع CAR يشبه TCR كان محددًا لمولد مضاد ناتج عن طفرة في nucleophosmin-1 تم تقديمه بواسطة HLA-A2 في نموذج لسرطان الدم النخاعي الحاد [96]. يتم معالجة مولدات المضادات داخل الخلايا قبل تقديمها على سطح الخلية MHC. ثم يتم التعرف على هذه الببتيدات بواسطة TCRs محددة تعبر عنها خلايا T. يتكون المركب الكلاسيكي لـ TCR من TCRa و سلاسل وأربع سلاسل إشارة CD3 (واحدة واحد و اثنان ). تم تطبيق هندسة مستقبلات الخلايا التائية بشكل رئيسي على الخلايا التائية [97]، ولكن تعبير مستقبلات الخلايا التائية الذاتية (ما لم يتم إزالتها) يمكن أن يؤدي إلى عدم تطابق السلاسل وظهور هجين بين سلاسل مستقبلات الخلايا التائية الذاتية والغير ذاتية، مما يعيق التعرف على مستقبلات الخلايا التائية ووظيفتها. نظرًا لأن خلايا القاتل الطبيعي لا تحتوي على مستقبلات خلايا تائية ذاتية، فلا يوجد خطر من عدم التطابق بعد إدخال مستقبلات الخلايا التائية. ومع ذلك، فإن تعبير مستقبلات خلايا تائية وظيفية في خلايا القاتل الطبيعي أكثر تعقيدًا من ذلك في الخلايا التائية. إدخال الجينات المنقولة التي تشفر و سلاسل TCR غير كافية لأن التسلسلات التي تشفر سلاسل الإشارة CD3 مطلوبة أيضًا لاستقرار TCR على الغشاء وللإشارات اللاحقة. ومن الجدير بالذكر أن إدخال CD3 غير ضروري لأن خلايا NK تعبر عن هذه الوحدة بشكل طبيعي داخل الخلايا. وتفتقر معظم مجموعات NK إلى مكونات رئيسية أخرى، مثل CD8. السلسلة، المعروفة بتأثيرها على وظيفة وإشارات العديد من مستقبلات الخلايا التائية (TCRs) وغالبًا ما يتم إدراجها مع مستقبلات الخلايا التائية وسلاسل CD3 في خلايا القاتل الطبيعي (NK). مؤخرًا، تم إثبات جدوى استراتيجيات إعادة برمجة مستقبلات الخلايا التائية في خط خلايا NK المعتمد من إدارة الغذاء والدواء الأمريكية NK-92، مما أدى إلى تفريغ الحبيبات، وإنتاج السيتوكينات، وقتل خلايا الورم سواء في المختبر أو في الجسم الحي. لوحظت نتائج مماثلة في خط خلايا NK آخر، وهو خط خلايا YTS، مع مستقبلات TCR تستهدف مستضدًا مرتبطًا بالميلانوما. من المهم أن إضافة مستقبل TCR جديد لم تؤثر سلبًا على الوظائف الذاتية لخلايا NK. على سبيل المثال، لا تزال خلايا NK المهندسة قابلة للتثبيط بواسطة مكونات ذاتية ويمكنها تحفيز النشاط من خلال مستقبلات أخرى (CD16 وNKG2D). على الرغم من أن خطوط خلايا NK هي المصدر الرئيسي لخلايا NK لتطوير خلايا TCR NK، في دراسة واحدة، نجح الباحثون في إعادة برمجة خلايا NK البشرية الأولية. تم إدخال مستقبل TCR محدد لـ BOB1 مع وحدات CD3 من خلال النقل الفيروسي في خلايا NK الأولية، مما أدى إلى سمية خلوية محددة للمستضد وإنتاج السيتوكينات بواسطة خلايا NK-TCR إلى مستوى قابل للمقارنة مع خلايا T CD8 التي تعبر عن نفس مستقبل TCR.
[101]. علاوة على ذلك، بعد الحقن في نموذج فأر لورم النخاع المتعدد، لوحظ انخفاض في نمو الورم [101]. تقدم هذه النتيجة آفاقًا مثيرة للاهتمام للاختبار السريري في السنوات القادمة. ومع ذلك، قد تعيق علاجات NK-TCR العرض الضعيف لمستضدات الورم المرتبطة، والتي قد لا تصل إلى مستوى كافٍ لتحفيز تنشيط خلايا NK. من المثير للاهتمام أن تقارب TCR واهتمامه متشابهان في خلايا T الأولية وفي خطوط خلايا NK، مما يشير إلى أن خصائص TCR معينة يمكن أن تُنقل وتُستخدم لتحسين الاستجابات في خلايا NK [102]. يمكن أيضًا دمج CAR وTCR للحصول على تأثير تآزري. على سبيل المثال، تم تصميم خلايا NK مع TCR محدد لبروتين E7 من HPV16 جنبًا إلى جنب مع CAR محدد لـ TROP2 [103]. كان تركيب CAR يتكون من مجالين مساعدين (CD28 و4-1BB) ولكنه كان يفتقر إلى مجال تنشيط CD3؛ وبالتالي، كان تنشيط CAR ضروريًا ولكنه غير كافٍ لسمية خلايا NK. في الواقع، يعتمد تنشيط خلايا NK على التعرف على إبيتوبي E7، الذي يُعبر عنه حصريًا في خلايا الورم المصابة بـ HPV16، وتزداد السمية من خلال ارتباط CAR بالهدف TROP2 الذي يُعبر عنه في الغالب على خلايا الورم ولكن أيضًا في بعض الأنسجة السليمة. يؤدي الإشارات المجمعة إلى سمية مثالية ومحددة للورم مع الحفاظ على الأنسجة السليمة [103]. تؤسس هذه الاستراتيجية لبوابات منطقية متطورة وتطبيقات أوسع في المستقبل. على سبيل المثال، بدلاً من استخدام مستقبلين متميزين (واحد CAR وواحد TCR)، يمكن بناء مستقبلات هجينة. تم تطوير مثل هذه المستقبلات، سواء كانت مستقلة عن HLA (مستقبل HIT [104] وSTAR [105]) أو معتمدة على HLA (TCAR [106])، بالفعل في خلايا T وقد تُنقل إلى خلايا NK. من الجدير بالذكر أن TCR هجين يتكون من المجالات خارج الخلوية لسلسلة TCRa المدمجة مع مجال CD28 عبر الغشاء متبوعًا بمناطق الإشارة 2B4 وDAP10 وTCR. تم بناء سلسلة ملتحمة مع مجال الغشاء الخلوي CD28 تليها مجالات الإشارة 41BB و CD3 [107]. بعد التعبير في خلايا NK الأولية، تم تحقيق التعرف المحدد للمستضد وتحلل خلايا الورم سواء في المختبر أو في الجسم الحي [107].

بشكل عام، تظهر خلايا NK المعالجة بواسطة TCR مزايا فريدة، من خلال السماح بالتعرف على المستضدات داخل الخلايا، مع مستويات أقل مطلوبة للتفعيل وبدون خطر التزاوج الخاطئ.

بالإضافة إلى التعرف المباشر على خلايا الورم بواسطة مستقبلات مخصصة، يمكن لخلايا NK أن تتوسط في تدمير الخلايا المستهدفة من خلال العمل المنسق للأجسام المضادة عبر ADCC. في الواقع، ترتبط الأجسام المضادة المحددة لمستضدات وتغلف الخلايا المستهدفة، ثم يتم اكتشاف منطقتها الثابتة بواسطة مستقبلات Fc المعبر عنها على خلايا NK. بعد التعرف، تقوم خلايا NK بتحفيز تحلل الخلايا المستهدفة من خلال إطلاق إنزيمات تحللية. يحتوي FcyRIII (المعروف أيضًا باسم CD16) على نوعين من الأليلات، إما فينيل ألانين (F) أو فالين (V) في موضع الحمض الأميني 158. تعطي هذه الأنواع أشكال مستقبلات Fc بخصائص مختلفة: منخفضة الت affinity (CD16a-158-F/F) وعالية الت affinity (CD16a-158-V/N). نظرًا لارتفاع affinity، تم استخدام نوع CD16a-158-V/V بشكل رئيسي في هندسة خلايا NK لتعزيز ADCC. على سبيل المثال، من خلال دمج مستقبل CD16 V158 FcyRIlla عالي affinity مع تعبير IL-2 في خلايا NK92 المهندسة، لوحظ تحلل معزز لخلايا الورم مع تركيبات متنوعة من الأجسام المضادة وحيدة النسيلة والخلايا المستهدفة. تم تأكيد الفعالية العلاجية لزيادة التعبير عن CD16a عالي affinity في خلايا NK KO CD38 في vivo في نموذج المايلوما المتعددة بعد النقل التبني والعلاج مع جسم مضاد داراتوموماب. من المهم، لتعزيز الفعالية، غالبًا ما يتم دمج خلايا NK المهندسة Fc مع الأجسام المضادة وحيدة النسيلة التي تستهدف مستضد مرتبط بالورم. تم تطوير نهج إعادة برمجة NK مماثل بنجاح للتوسط في ADCC لأورام السحايا التي تعبر عن PDL1 في وجود جسم مضاد مضاد لـ PDL1. إحدى القيود في هذه الأساليب هي ميل CD16 إلى الانقسام بواسطة بروتيناز ADAM17، مما يعيق ADCC. ومن الجدير بالذكر أن هناك نوعًا غير قابل للانقسام (أي مقاوم لـ
تم تطوير وتنفيذ (بروتيناز) بنجاح، مما أدى إلى تحسين القتل في النماذج قبل السريرية [112-114].

تم التعبير عن مستقبلات CD16 ذات الألفة العالية أيضًا مع مستقبلات CAR في خلايا NK. ومن الجدير بالذكر أنه تم ملاحظة استقطاب الحبيبات وإطلاق الإنزيمات الليتية في خلايا NK92 التي تعبر عن المتغير عالي الألفة ومركب CAR. بدلاً من ذلك، كما ذُكر أعلاه في القسم 3.1، يمكن دمج مجال CD16 مباشرة في بناء CAR كمجال عبر الغشاء و/أو مجال تحفيزي. وعلى العكس من ذلك، لتعزيز ADCC، يمكن دمج مجال التعرف خارج الخلية لـ CD16a مع مجالات الإشارة والتفعيل. في الواقع، فإن CD28 الشائع و تم ربط المجالات المستخدمة في CARs بـ CD16a، إما بمفردها أو مع مجال الإشارة لـ CD3Ц [45]. يظهر المستقبل الهجين الناتج نشاطًا سميًا معززًا ونشاط ADCC ضد خلايا الورم الإيجابية لـ CD20 في وجود جسم مضاد وحيد النسيلة [45]. كما تم دمج مجالات الإشارة الخاصة بـ NK (2B4 و FcRy و DAP10) مع مجال التعرف على CD16a [116]. تم أيضًا بناء مستقبلات هجينة أكثر تعقيدًا تعتمد على مجالات FCR. على سبيل المثال، يتكون مستقبل ASIMut (مستقبل متعدد السلاسل الاصطناعي المحدد للمستضد) من شريكين: جسم مضاد مثبت على الغشاء مرتبط بـ FceRl. والمناطق خارج الخلوية وعبر الغشاء لـ Iga و Ig مرتبط بـ CD3 مجال الإشارة [117]. بعد زراعة خلايا NK المعدلة مع خلايا الهدف، تم تحفيز تحلل خلايا الهدف بطريقة مشابهة لتفاعل الخلايا القاتلة المعتمدة على الأجسام المضادة (ADCC) [117].

بشكل عام، يحمل الهندسة المستهدفة لمستقبلات خلايا NK إمكانيات كبيرة لتعزيز ADCC وبالتالي تحسين الدقة والفعالية للعلاجات المناعية المعتمدة على خلايا NK ضد السرطان.

تتمثل إحدى القيود الكبيرة للعلاجات الخلوية المتبناة الحالية في ضعف التسلل إلى الأورام، مما يحد من الفعالية [118]. على الرغم من أن بعض مستقبلات الكيميائيات تُعبر عنها على خلايا NK المعزولة حديثًا، إلا أن هذا التعبير يتناقص بعد التوسع خارج الجسم أو التجميد. ظهرت بعض ظروف الثقافة خارج الجسم كاستراتيجيات واعدة لزيادة التعبير عن مستقبلات رئيسية، مثل مستقبل الكيميائيات C-X-C (CXCR) 3، المعروف بأنه يعزز القدرة على الهجرة لخلايا الأورام والخلايا المناعية المنتجة لـ CXCL10 [119]. يسمح هذا التعبير غير المنظم بالاختيار والتضخيم وزيادة التعبير عن المستقبلات قبل حقن خلايا NK. ومع ذلك، حتى ظروف الثقافة المحسّنة غالبًا لا تحفز التعبير عن مستويات كافية من مستقبلات الكيميائيات وليست فعالة لجميع مستقبلات الكيميائيات. وبالتالي، قد يكون الهندسة الوراثية لخلايا NK لدمج مستقبلات كيميائية خارجية تعزز كيميائية الخلايا أكثر صلة بتحسين فعالية العلاجات المتبناة للسرطانات (الجدول 3).

لقد أظهرت عدة مستقبلات أنها تحسن هجرة خلايا NK نحو مواقع الأورام. على سبيل المثال، تم فقدان CXCR2 عند التوسع في المختبر، وتم التعبير عنه بشكل مفرط في خلايا NK عن طريق النقل الفيروسي العكسي، مما أدى إلى تعزيز الهجرة نحو كريات سرطان الخلايا الكلوية [120]. لوحظت نتائج مماثلة في الجسم الحي، حيث عزز التعبير المفرط عن CXCR2 على خلايا NK-92 تسللها إلى النقائل الرئوية [121]. بدلاً من ذلك، تم استخدام نظام CRISPR/Cas9 لزيادة التعبير عن مستقبلات الكيميائيات مثل CXCR2 و IL-2 على خلايا NK، مما أدى إلى زيادة الهجرة إلى مواقع الأورام، وزيادة التكاثر وتحسين قتل الخلايا في نموذج سرطان القولون قبل السريرية [122]. كما أظهرت تعديل CXCR1 نتائج مشجعة. تم الإبلاغ عن أن خلايا NK المعدلة التي تم تصميمها مع CXCR1 و CAR تستهدف الروابط المرتبطة بالأورام NKG2D عززت الهجرة نحو الأورام وزادت من التسلل في الجسم الحي [123]. باستخدام تحرير الجينات CRISPR، تم أيضًا التعبير عن CCR5 بشكل مفرط، بينما تم تقليل التعبير عن CXCR4 في خلايا NK الموسعة، مما أدى إلى تقليل الحركة في الكبد وزيادة المستويات في الدورة الدموية [124]. على النقيض من ذلك، بالنسبة لـ

الأورام الخبيثة الدموية التي تؤثر على نخاع العظام، فإن زيادة التعبير عن CXCR4 مفيدة لتحسين التوجه إلى خلايا الورم. في الواقع، يتم الحفاظ على خلايا NK في نخاع العظام بواسطة CXCR4 من خلال التفاعلات مع روابطه SIP5 (مستقبل السفينغوزين-1 فوسفات 5) و CXCL12، المعروف أيضًا باسم SDF-1 (عامل الخلايا السدوية المشتق من الخلايا). على سبيل المثال، أدى نقل mRNA مع متغير مكتسب لوظيفة CXCR4 (CXCR4 ) إلى تعزيز كبير في توجه خلايا NK إلى نخاع العظام بعد النقل المتبني [125]. تم دمج التعبير المفرط عن CXCR4 أيضًا مع CARs تستهدف إما CD19 أو عامل نمو البشرة (EGFR)vlll في خلايا NK لتعزيز الهجرة نحو خلايا الورم والاحتفاظ بالأنشطة السامة الذاتية والوساطة CAR [68، 126]. كما زاد التعبير المفرط المشترك عن CXCR4 و مستقبل الكيميائيات C-C (CCR) 7 عبر الناقلات الفيروسية البطئية من هجرة خلايا NK إلى خلايا القولون البشرية [127]. كما عزز إدخال CCR7 بمفرده في خلايا NK هجرته نحو الأعضاء اللمفاوية الثانوية. من خلال التحريض الكهربائي للـ mRNA، تم إدخال CCR7 بشكل فعال في خلايا NK البشرية الأولية، مما أدى إلى تحسين كبير في هجرتها في المختبر نحو CCL19 [109]. وبالمثل، أدى نقل ناقل غير فيروسي يحتوي على مستقبل CCR7، جنبًا إلى جنب مع مستقبل CD16 Fc عالي الألفة و CAR مضاد لـ CD19، إلى زيادة البقاء والسيطرة على الورم في الفئران البشرية التي تحمل أورام لمفاوية [128]. كما أدى التعبير عن CCR7 بواسطة تروغوسيتوز في خلايا NK الموسعة إلى هجرة خلايا NK نحو CCL19 و CCL21 في المختبر وفي الجسم الحي (نحو العقد اللمفاوية) [129]. من الجدير بالذكر أن مستقبلات أخرى غير معبر عنها على خلايا NK، مثل CCR4 و CCR2B، التي توجد بشكل طبيعي على خلايا T التنظيمية والوحيدات المقيمة في الورم، تم استخدامها لإعادة برمجة خلايا NK [130].

تم تطوير بعض الاستراتيجيات أيضًا لتعزيز إفراز الكيميائيات، مثل حقن IFN بالتزامن مع الفيروسات المحللة للأورام أو العلاج الإشعاعي، لتسهيل تجنيد خلايا NK [119، 131]. بدلاً من ذلك، يمكن التعبير عن الكيميائيات بشكل اصطناعي في TME. على سبيل المثال، تم تطبيق نهج الجمع، مثل تعديل خلايا NK للتعبير عن CCR5 أثناء إدخال فيروس لقاح يعبر عن الكيميائية CCL5، بنجاح لتعزيز الهجرة [132].

على الرغم من أن معظم النهج قد ركزت على مستقبلات الكيميائيات، فإن مستقبلات أخرى، مثل مستقبل E-prostanoid 3، أدت إلى زيادة التصاق الخلايا والسمية في خلايا NK المعدلة ويجب اختبارها بشكل أكبر [133].

يظهر تكاثر وبقاء خلايا NK بعد النقل المتبني ديناميات مميزة اعتمادًا على مصدرها الخلوي. بينما يؤثر الإشعاع على خطوط خلايا NK قبل النقل على بقائها في الجسم الحي، تحتفظ خلايا NK الأولية بدرجة من الصلة الفسيولوجية والألفة مع بيئة المضيف، مما يعزز بقائها بعد النقل. ومع ذلك، يظل هذا البقاء محدودًا لبضعة أسابيع، مما يتطلب حقنًا متكررة. لزيادة بقاء خلايا NK ونموها خارج الجسم، تم تطوير كوكتيلات السيتوكينات، بما في ذلك تلك التي تحتوي على IL-2 و IL-12 و IL-15 و IL-18 و IL-27. من خلال التعديل الدقيق لعوامل النمو والسيتوكينات وجزيئات الإشارة، يمكن تزويد خلايا NK بخصائص شبيهة بالذاكرة ولها استجابة أكبر عند إعادة التعرض للمستضدات، وبقاء مطول، وزيادة السمية.

من بين هذه العوامل، أظهر IL-15 أنه يعزز تكاثر خلايا NK وتنشيطها بينما يمارس مستوى منخفض من السمية [134، 135]. تم استغلال إدارة هذا السيتوكين بشكل واسع كوسيلة لزيادة طول عمر خلايا NK. بالإضافة إلى الحقن المباشر لـ IL-15، تم تصميم خلايا NK التي تحتوي على جين IL-15 للبقاء في غياب السيتوكينات الخارجية بطريقة ذاتية [136]. أدى إضافة جين IL-15 إلى إطالة بقاء خلايا CAR-NK وسميتها بشكل ملحوظ [38، 44، 137، 138]. في هذا السياق، تم الحصول على نتائج واعدة جدًا
في تجربة سريرية من المرحلة I/II تقييم خلايا CAR-NK المضادة لـ CD19 غير المتطابقة HLA التي تم نقلها بواسطة ناقل فيروسي عكسي يشفر IL-15 في الأورام اللمفاوية. من بين أول 11 مريضًا تم الإبلاغ عنهم، كان 8 ( ) حقق استجابة، بما في ذلك 7 الذين حققوا شفاءً كاملاً. لوحظ التوسع في وقت مبكر يصل إلى 3 أيام بعد الحقن، واستمرت خلايا CAR-NK بمستويات منخفضة لمدة لا تقل عن 12 شهرًا [38]. نظرًا لأن IL-15 يتم إفرازه، تم بناء بروتينات اندماج لتثبيت IL-15 على الغشاء لضمان تأثير مباشر على خلايا NK [139]. دمج IL-15 المرتبط بالغشاء مع مستقبل NKG2D الهجين المدمج مع مجالات التحفيز المساعد (OX40) والإشارة (CD3Z) في خلايا NK زاد من السمية الخلوية، وأطال العمر الداخلي، وعزز الفعالية المضادة للورم في نماذج زراعة سرطان الدم النخاعي الحاد، مما يبرز قيمته كعامل علاجي قوي [139]. بالإضافة إلى ذلك، تم اختبار بروتين اندماج IL-15/IL-15R المرتبط بالغشاء بشكل مكثف بالاشتراك مع CAR في خلايا NK [140]. على سبيل المثال، تم دمج CARs BCMA، مع مستقبلات CD16 غير القابلة للانفصال والأجسام المضادة أحادية النسيلة المضادة لـ CD138، مع هذه الجزيئات الاندماجية في خلايا NK وعززت السمية الخلوية في المختبر وأطالت البقاء في الخلايا المعدلة [114، 141]. من المثير للاهتمام، أنه تم تقييم هذا النهج الاندماجي في تجربة سريرية مع CAR مضاد لـ CD19 ومستقبل CD16 غير القابل للانفصال (بالإضافة إلى الأجسام المضادة أحادية النسيلة) وأدى إلى استجابات جزئية في مرضى لمفوما الخلايا B الكبيرة المنتشرة [37]. بدلاً من ذلك، تم تطوير بروتينات اندماج أخرى، لا سيما بروتين هجين يتكون من IL15 ونطاق CD8a عبر الغشاء [142]. في نماذج الفئران لسرطان الدم والساركوما، أظهرت خلايا NK المهندسة للتعبير عن IL-15 المرتبط بالغشاء سمية خلوية مرتفعة سواء في المختبر أو في الجسم الحي [142].

استراتيجية أخرى لتعزيز البقاء في غياب السيتوكينات الخارجية هي دمج مجالات الإشارة التي تحفز التكاثر مع مجالات التعرف غير المرتبطة. على سبيل المثال، مستقبل IL-2 المقطوع. -سلسلة ( تم إضافة محفزات التيروزين-X-X-جلوتامين (YXXQ) المرتبطة بـ STAT3 إلى CARs المضادة لـ PD-L1 لتعزيز تكاثر الخلايا واستمرارها من خلال تنشيط مسارات الإشارة السفلية [72].

في الختام، فإن تعديل السيتوكينات ومستقبلات السيتوكينات يعد واعدًا للغاية لتعزيز بقاء خلايا NK واستمراريتها، مما يمهد الطريق لفعالية علاجية دائمة.

تحقيق نتائج ناجحة مع علاجات خلايا NK يعتمد ليس فقط على قدرة خلايا المناعة على الهجرة والبقاء داخل البيئة المجهرية المعقدة، ولكن أيضًا على قدرتها على البقاء وظيفية على الرغم من البيئة المثبطة للمناعة.

عامل النمو المحول بيتا (TGF- تلعب دورًا محوريًا في البيئة المجهرية للورم من خلال قمع الاستجابات المناعية التي تتوسطها خلايا NK وتعزيز هروب الورم من المناعة. TGF- يعيق تعبير مستقبلات التنشيط، مثل NKG2D وDNAM1، مما يضعف التعرف على خلايا NK واستهداف خلايا الورم. TGF- يتم التعرف عليه بواسطة مركب يتكون من TGF RI و TGF مستقبلات RII وتسبب مسارات داخل الخلايا تؤدي إلى تثبيط خلايا NK (الشكل 2). لقمع هذا التثبيط، الجزء الداخلي من TGF تم حذف مستقبل RII لإنشاء طافرة سلبية مهيمنة (DNT/ßRII). بعد التعبير في خلايا NK، DNT حمت خلايا NK من TGF- -تثبيط المناعة الوسيط، بينما احتفظوا بقدرتهم على القتل بعد تحفيز الخلايا القاتلة الطبيعية (الشكل 2) [143-145]. في الواقع، بعد التحفيز بواسطة مستقبل NKG2D الداخلي أو مستقبل DNMA1 أو بواسطة مستقبل CAR خارجي، زادت النشاط السيتوليتي، ولا سيما إفراز البيرفورين، والجرانزيم وIFN. [144، 145]، تم الحفاظ عليها. تم تأكيد هذه النتائج في الجسم الحي. أدى نقل خلايا NK-92 المعدلة وراثيًا التي تحتوي على DNT/ßRII إلى تقليل تكاثر الورم والانتقال إلى الرئة وزيادة معدل البقاء على قيد الحياة في نموذج الفأر [146]. تم إحراز تقدم تكنولوجي ليشمل مستقبلات شبيهة بالنوتش الاصطناعية (Syn/Notch)،

كما في “NKCT”، حيث تم تقصير TGF تم دمج مجال RII مع مجال الغشاء الخلوي لـ Notch المرتبط بعامل النسخ RELA (الشكل 2). وقد عززت هذه البروتينات المدمجة التنشيط المباشر لخلايا NK على مستوى النسخ، مما زاد من مقاومتها للبيئة المجهرية للورم وزاد من وظائفها المضادة للورم [147]. هناك مستقبلات هجينة أخرى تدمج مجالات تنشيط و TGF لقد أظهرت مجالات التعرف RII نتائج واعدة في التغلب على TGF- تثبيط المناعة. من بينها، خلايا NK-92 المهندسة التي تعبر عن مستقبل هجين (يسمى TNchimeric)، والذي يتكون من الجزء الخارجي من TGF أظهرت RII والمجالات عبر الغشاء والسيتوبلازمية لـ NKG2D جذبًا كيميائيًا معززًا لخلايا الورم التي تعبر عن TGF- وكانت لديها قدرة معززة على القتل (الشكل 2) [148]. وقد نجح بناء مشابه حيث تم استبدال المجال داخل الخلوي بدافع تنشيط NK DAP12 في بدء تنشيط خلايا NK بعد التعرض لـ TGF- (الشكل 2) [147]. من الجدير بالذكر أن مجالات التنشيط الأخرى، مثل مجالات التنشيط لمستقبلات السيتوكينات المؤيدة للالتهابات، التي تم التحقق منها بالفعل في خلايا T، قد تكون مناسبة لإعادة توجيه TGF- نشاط [149، 150].

بالإضافة إلى السيتوكينات المضادة للالتهابات، تلعب مثبطات نقاط التفتيش المناعية، مثل PD-1/PD-L1، أيضًا دورًا رئيسيًا في تثبيط خلايا المناعة بواسطة البيئة المجاورة للورم. استراتيجيات مشابهة لتلك المستخدمة لـ TGF- ، مثل تطوير المستقبلات المقطوعة، واستبدال المجال الداخلي للمستقبل بوحدة تنشيط أو استخدام CARs مضادة لـ PD-L1 (كما ذُكر أعلاه في القسم 3.1)، قد أظهرت أنها تعكس تثبيط PD1/PDL1 [53، 61، 69، 151]. في الواقع، أدى استخدام PD-1 المقطوع في خلايا NK92 المنقولة إلى تقليل نمو الورم وتحسين معدلات البقاء [152]. يستخدم مستقبل التحويل الشجري القائم على PD1 الخاص بخلايا NK (PD1-CSR) الذي تم تطويره مؤخرًا مجالات الإشارة DAP10 وDAP12 وCD3Z لعكس تأثير PD1 على خلايا NK [74، 153]. بعد الإعطاء في المرضى، لوحظ زيادة في تفريغ خلايا NK وإنتاج السيتوكينات ضد CD138 الذاتي PD-L1 تمت ملاحظة خلايا بلازما خبيثة [153]. بشكل جماعي، تسلط هذه الاستراتيجيات المبتكرة الضوء على التعقيد المتزايد للعلاج الخلوي المتبني في إعادة برمجة خلايا NK للتغلب على تحديات البيئة المجهرية الورمية الداخلية وتعزيز الاستجابات المناعية المضادة للورم.

يمكن تثبيط خلايا NK بواسطة بيئة الورم وقد تم الإبلاغ أيضًا عن أنها تقتل بعضها البعض. لتجنب القتل الأخوي، تم إنشاء طفرات (KOs) للجينات المستهدفة. من أجل
على سبيل المثال، في علاج الأورام الدموية، تم حذف جيني CD38 و CD7 في خلايا CAR-NK المهندسة. ومن المثير للاهتمام، أنه تم تطوير استراتيجية 2 في 1 من خلال إدخال مستقبل CAR في موضع الجين الذي يشفر هدفه، مما سمح بالتعبير عن CAR مع تجنب القتل الأخوي. كما ذُكر أعلاه في القسم 3.1، يمكن أيضًا تنفيذ مستقبلات CAR المثبطة لتجنب القتل الأخوي لخلايا CAR-NK الناتج عن التروغوسيتوز.

بالإضافة إلى ذلك، في حالة النقل الأللوغرافي، يمكن أن يتم القضاء على خلايا NK غير المتطابقة مع HLA من المتبرع بواسطة جهاز المناعة لدى المتلقي. لمواجهة هذا “تأثير المضيف ضد الطعم”، تم إلغاء التعبير السطحي لجزيئات HLA من الفئة الأولى على خلايا NK من المتبرع من خلال KO لبروتين بيتا 2 -ميكروغلوبيولين لمنع القتل بواسطة الخلايا التفاعلية للأللو. خلايا T. لأن فقدان جزيئات HLA من الفئة الأولى يؤدي إلى القتل بواسطة خلايا NK (التحلل الناتج عن ‘الذات المفقودة’)، تم إدخال جزيء HLA-E أحادي السلسلة أيضًا لتثبيط خلايا NK المستقبلة التي تعبر عن CD94/NKG2A أو CD94/NKG2B [158].

نظرًا لأن تنشيط خلايا NK يعتمد على توازن بين الإشارات من المستقبلات المنشطة والمثبطة، فمن المتوقع أيضًا أن يؤدي تعطيل الإشارات من المستقبلات المثبطة إلى تعزيز تنشيط الخلايا دون زيادة نشاط المستقبلات المنشطة. تم استكشاف استراتيجيات لمواجهة تأثير مسارات الإشارات المثبطة، بما في ذلك حذف أو تقليل تعبير هذه المستقبلات المثبطة.

هندسة مستقبلات خلايا NK تحمل وعدًا كبيرًا لإعادة برمجة الاستجابات المناعية تجاه خلايا السرطان. ومع ذلك، لا تزال هناك بعض القيود الرئيسية التي يجب معالجتها، مثل بقاء الخلايا المدخلة، والذي يكون محدودًا للغاية وغالبًا لا يسمح بتأسيس استجابات ذاكرة. من خلال اختيار المتبرع ونمط الخلايا المدخلة بعناية، مثل خلايا NK الشبيهة بالذاكرة المستحثة بواسطة السيتوكينات أو خلايا NK التكيفية، يمكن تحقيق تأثيرات طويلة الأمد ودائمة. بالإضافة إلى ذلك، مع استمرار وجودها في المرضى، يجب أن تكون خلايا NK المهندسة وظيفية وتحقق فوائد علاجية. بالإضافة إلى التثبيط بواسطة البيئة المجهرية للورم، تم ملاحظة آليات مقاومة أخرى، مثل زيادة تعبير HLA-G على خلايا الورم، بعد علاج خلايا CAR-NK ويجب أخذها في الاعتبار. استراتيجية لتعزيز فعالية علاج خلايا NK هي دمج الأهداف المهندسة. في هذا السياق، ستكون الذكاء الاصطناعي مفيدة لتحديد المستقبلات، والمستقبلات المساعدة، أو تركيبات مثبطات نقاط التفتيش لتوليد علاجات خلايا NK من الجيل التالي. على سبيل المثال، السيتوكين-
تم إظهار أن تعطيل SH2 المحتوي على (CISH) يعزز النشاط المضاد للورم لخلايا CAR-NK. بالإضافة إلى طرق الهندسة المتعددة، يمكن أن تساعد الذكاء الاصطناعي في تطوير علاجات مركبة مع العلاجات التقليدية أو العلاجات المناعية الأخرى من خلال التنبؤ باستجابات المرضى. ومن الجدير بالذكر أن المحفزات الخلوية قد حظيت باهتمام كبير في السنوات الأخيرة وتمت الموافقة عليها للاستخدام السريري. يمكنها ربط الروابط، مثل مستضدات الورم، وتنشيط المستقبلات على سطح خلايا NK. يمكن استخدام هذا النوع من الجزيئات لتعزيز تنشيط خلايا NK من خلال ربط المستقبلات المهندسة بخلايا الورم. من المهم أن تظل قضايا السلامة مرتبطة جوهريًا بالعلاجات الهندسية لخلايا NK، مثل التنشيط غير المستهدف. إن ضمان خصوصية علاجات خلايا NK أمر ضروري لتجنب إلحاق الضرر بالأنسجة السليمة، مما قد يؤدي إلى آثار جانبية خطيرة. لتحسين تنشيط خلايا NK واستهداف خلايا السرطان بشكل انتقائي، يجب تطوير دوائر منطقية مضبوطة بدقة. علاوة على ذلك، يجب تطوير نماذج حسابية للتنبؤ وضبط استجابات الخلايا ديناميكيًا. إن الاستخدام المتكرر للناقلات التكاملية لتعديل خلايا NK يأتي أيضًا مع خطر الطفرات الناتجة عن الإدخال، مما قد يؤدي إلى لمفوما خلايا NK. التوصية الحالية من إدارة الغذاء والدواء هي أن يكون عدد نسخ الناقل أقل من 5. علاوة على ذلك، يمكن أيضًا استخدام أدوات التحرير لتوليد انتقالات صبغية. مؤخرًا، تم تطوير عدة بروتوكولات تصنيع للتغلب على بعض القيود المذكورة أعلاه، وإذا تمت الموافقة عليها، يمكن أن تصبح ممارسات قياسية لتقليل فقد الكروموسومات والانتقالات في المنتجات المصنعة. كإجراء احترازي، لضمان تدمير الخلايا المهندسة في حالة حدوث أحداث سلبية، يجب تنفيذ مفتاح أمان كاسبيز قابل للتحفيز. يجب تحديد معايير مراقبة الجودة للتحقق من فعالية الهندسة، والنقاء، والنمط الظاهري، والسرطانية لخلايا NK. في الواقع، اعتمادًا على المتبرع، المصدر (PB أو UCB) وظروف الثقافة، يمكن أن تختلف مجموعات خلايا NK. بالنسبة لهذه النقاط الأخيرة، ستكون التقنيات الجديدة لتوسيع وتعديل وحفظ خلايا NK الأولية بالتبريد خارج الجسم مفيدة للغاية لتكبير الإنتاج للتطبيق السريري، حيث تتطلب الجرعات العالية والحقن المتعددة. من المتوقع أن تحسن التقدم المستقبلي المحقق في علاجات خلايا T، بما في ذلك البنى التحتية المطورة لإنتاج خلايا وناقلات فيروسية، بالإضافة إلى الأدوات المتاحة لهندسة الخلايا (من بينها استراتيجيات التحرير داخل الجسم)، علاج خلايا NK بشكل تآزري. ستوفر التجارب السريرية في المراحل المبكرة أيضًا معلومات قيمة وتعزز تحسين علاجات خلايا NK المستقبلية، التي من المحتمل أن تصل إلى الموافقة السريرية في السنوات القادمة. بشكل عام، لا تحمل هذه التقدمات الرائدة إمكانات هائلة لعلاج السرطان فحسب، بل توسع أيضًا نطاق العلاجات لأمراض أخرى، بما في ذلك العدوى.

الكتابة والتصور: أ.ب، التحقق والمراجعة: ج.ف.-ج. و ن.س، التحقق والمراجعة والتحرير: س.د.

تمويل وظيفة ما بعد الدكتوراه AP من INCa PLBio 2020-095. نشكر بريجيت مانشيب على مراجعة المخطوطة.

N.C. هو موظف في ErVimmune، وA.P. وJ.V.-G. هما مستشاران لـ ErVimmune، وS.D. هو المؤسس ورئيس مجلس إدارة ErVimmune. يعلن المؤلفون أنهم ليس لديهم أي مصالح متنافسة أخرى.

يجب توجيه المراسلات والطلبات للحصول على المواد إلى أودري بيج أو ستيفان ديبيل.

معلومات إعادة الطباعة والإذن متاحة علىhttp://www.nature.com/إعادة طباعة

الوصول المفتوح هذه المقالة مرخصة بموجب رخصة المشاع الإبداعي النسب 4.0 الدولية، التي تسمح بالاستخدام والمشاركة والتكيف والتوزيع وإعادة الإنتاج بأي وسيلة أو صيغة، طالما أنك تعطي الائتمان المناسب للمؤلفين الأصليين والمصدر، وتوفر رابطًا لرخصة المشاع الإبداعي، وتوضح إذا ما تم إجراء تغييرات. الصور أو المواد الأخرى من طرف ثالث في هذه المقالة مشمولة في رخصة المشاع الإبداعي الخاصة بالمقالة، ما لم يُشار إلى خلاف ذلك في سطر الائتمان للمواد. إذا لم تكن المادة مشمولة في رخصة المشاع الإبداعي الخاصة بالمقالة وكان استخدامك المقصود غير مسموح به بموجب اللوائح القانونية أو يتجاوز الاستخدام المسموح به، فسيتعين عليك الحصول على إذن مباشرة من صاحب حقوق الطبع والنشر. لعرض نسخة من هذه الرخصة، قم بزيارة http:// creativecommons.org/licenses/by/4.0/.
© المؤلف(ون) 2024

© The Author(s) 2024

Overall, receptor engineering has led to significant advances in NK cell-based cancer immunotherapies. As technical challenges are addressed, these innovative treatments will likely reshape cancer immunotherapy.

Keywords: NK cells; Cell therapy; Receptor engineering; CAR

Cellular & Molecular Immunology (2024) 21:315-331; https://doi.org/10.1038/s41423-024-01145-x

In recent decades, adoptive cell therapies have emerged as promising approaches for harnessing the endogenous cytotoxicity of immune cells and destroying malignant cells. Among immune cell candidates, natural killer (NK) cells have drawn significant attention due to their unique ability to recognize and eliminate target cells without antigen-specific activation [1]. NK cells, which account for of circulating peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), are integral components of the innate immune system. These cells are classified into two distinct subsets, CD56 and CD16, based on the relative expression of surface markers. The CD56 CD16 subset is predominantly immunomodulatory and contributes to cytokine production, while CD56 CD16 NK cells are characterized by robust cytotoxic activity [2]. These cells exhibit cytotoxic properties similar to those of CD8 T cells but lack the CD3/T-cell receptor (TCR) complex. With the advent of single-cell RNA sequencing and multiparametric flow cytometry,
novel NK cell subpopulations beyond the usual classification have been identified based on CD16 and CD56 [3, 4]. Among them, a subset called adaptive NK cells, which are characterized by a lack of Fc-epsilon receptor Ig (FCER1G) expression and an overexpression of natural killer group 2 C (NKG2C), exhibit enhanced properties, including high proliferation, increased expansion and cytotoxic potential. Unlike T cells, NK cells are not restricted to major histocompatibility complex (MHC, also called human leukocyte antigen (HLA)) recognition, and their activation requires multiple receptors. Indeed, their activation relies on finely tuning inhibitory and activating signals. To prevent the undesirable activation of healthy cells, NK cells express killer cell immunoglobulin-like receptors (KIRs) and the natural killer group 2 A (NKG2A)/CD94 heterodimer, which interacts with HLA class I molecules to provide inhibitory signals (Fig. 1). Conversely, NK cells possess an array of activating receptors, including natural killer group 2D (NKG2D), DNAX accessory molecule-1 (DNAM-1),

and natural cytotoxicity receptors (NCRs), such as NKp30, NKp44, and NKp46 (Fig. 1) [2]. Upon activation by target cells, NK cells trigger multiple mechanisms to eliminate target cells, which induces the release of cytoplasmic granules loaded with perforin and granzyme B within the immunological synapse, thereby inducing the lysis of target cells. Notably, CD107a expression is upregulated following NK cell activation and is positively correlated with cytokine secretion and cytotoxic NK cell activity. NK cells can also mediate antibody-dependent cell cytotoxicity (ADCC) after tumor-bound antibody recognition by the lowaffinity receptor for the constant fragment (Fc) portion of IgG1 antibodies (FcyRIIIa or CD16), thereby initiating cell death pathways [5]. Finally, NK cells can exert their cytotoxic potential through the expression of crucial death ligands, including Fas ligand (FasL) and tumor necrosis factor (TNF)-related apoptosisinducing ligand (TRAIL), leading to target cell apoptosis after interacting with their receptor.

Considering their ability to directly kill tumor cells, adoptive transfer of NK cells has been tested in patients with advanced cancer. Here, we provide a summary of the challenges of NK cell therapies in initial clinical trials and how receptor engineering strategies have been developed to address these challenges.

Several NK cell sources have been used for adoptive transfer. The NK-92 cell line has been approved for clinical application by the Food and Drug Administration (FDA) [6]. Although this cell line displays cytotoxicity against tumor cells, it has poor ADCC potential because it lacks the CD16 receptor [7]. Moreover, NK92 cells require irradiation for safe administration, thus limiting their potency and in vivo persistence [8]. Alternatively, primary NK cells can be obtained or derived from multiple sources, including peripheral blood (PB), cord blood (CB), and induced pluripotent stem cells (iPSCs) [9]. However, ex vivo expansion is often necessary before engraftment to obtain enough NK cells, which remains a challenge. Indeed, high doses and multiple injections are often needed. Several priming techniques have been tested to not only amplify NK cells but also to enhance their cytotoxic potential [10]. However, many cytokines are added to the culture medium to render cells ‘cytokine addicted’, which impairs their in vivo persistence and expansion. Therefore, the source of NK cells, as well as the priming conditions, should be carefully chosen for adoptive transfer. Moreover, cryopreservation has also been shown to impact in vivo expansion [11].

Initially, NK cell transfer was performed in combination with hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) for the treatment of hematological malignancies. Alternatively, NK cells were also injected without HSCT into acute leukemia patients with mitigated results. Overall, fewer than of patients in different clinical trials achieved complete remission [12-14]. More encouragingly, NK cell transfer led to the eradication of measurable residual disease in two patients with acute myeloid leukemia [15]. Heterogeneous results have also been observed in non-Hodgkin lymphoma (NHL) patients, with NK cell transfer having significant clinical activity in heavily pretreated patients with advanced NHL in one report but no effect in HSCT-treated patients in another study [16, 17]. In addition to hematologic tumors, NK cell therapy has also been used to treat solid tumors, including ovarian and breast cancers, with complete remission observed in less than of patients [18, 19]. In most trials, the clinical benefits often lasted only a few months before relapse, likely due to resistance or to low NK cell persistence. NK cell persistence typically ranges from a few days to 4 months, with an average of 7 days. NK cell expansion was highly variable, with no NK cell expansion observed in some trials [12, 17]. This heterogeneity may arise from the different levels of anti-tumor responses, the type of cancer studied, the stage of the disease, and interindividual differences.

A major advantage of NK cell therapy is its excellent safety profile. Compared to classical T cells, NK cell transfer has several advantages, including a lower risk of inducing neurotoxicity or cytokine release syndrome (CRS) and the possibility of injecting allogeneic cells. Indeed, NK cells do not induce graft-versus-host disease (GvHD), which is mainly mediated by a T-cell receptor (TCR) recognition of foreign HLA-peptide complexes, and spare healthy tissue by signaling through iKIRs and NKG2A [20]. Furthermore, KIR mismatches have been shown to increase antitumoral responses. Thus, NK cells from healthy donors can be safely used for cancer therapy, even in the case of HLA mismatch between the donor and recipient, thus allowing for the generation of ‘off-the-shelf’ products. In most cases, NK cell transfers are safe and well tolerated, with low-grade and reversible treatment-related toxicity. However, high-grade adverse events have been sporadically observed, especially when NK cells were co-administered with multiple conventional therapeutic agents; this variation in results has prevented clinicians from drawing conclusions. NK cell transfer has been evaluated in combination with monoclonal antibodies. Indeed, the addition of monoclonal antibodies can potentiate NK-mediated ADCC. Allogeneic NK cells were tested in combination with the anti-CD20 monoclonal antibody rituximab in two clinical trials. The treatment was well tolerated, but only patients and patients in each trial achieved objective clinical responses [21,22]. A combination of NK cell transfer and monoclonal antibodies, including anti-PD1, antiEGFR and anti-GD2, has also shown some clinical benefits [23-28]. However, complete remission was rarely achieved, likely due to the advanced stage of the disease. Notably, two studies reported adverse events, including thrombocytopenia, myelosuppression and encephalopathy [25,27].

Although the beneficial role of NK cells in cancer therapy lies in their ability to directly kill cancer cells, their full potential has frequently been impeded by the locally immunosuppressive and hypoxic tumor microenvironment (TME), which might explain the inconclusive clinical trial outcomes. Indeed, the TME can prevent NK cell infiltration and proliferation and can hinder activating signals. To address these limitations, engineering approaches have been proposed to enhance NK cell capacities prior to adoptive transfer [29]. Although lentiviral transduction has emerged as a prominent strategy, the commonly used vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSV-G) pseudotype is not sufficiently effective at modifying NK cells, especially primary cells [30]. This limitation is partially due to intracellular defenses against viral components.

Thus, new efficient and standardized protocols are needed. To address this problem, the incorporation of RD114 glycoproteins in lentiviral particles in conjunction with Vectofusin-1 significantly increased NK cell transduction efficacy [31]. Alternatively, mRNA/ DNA electroporation offers a versatile platform to induce gene expression in NK cells. Recently, the expansion of genetic editing techniques, such as the clustered regularly interspaced short palindromic repeats/caspase 9 (Crispr/Cas9) system, has offered new perspectives for precise genetic customization.

Among these engineering strategies, membrane-anchored ectopic receptors for adoptive NK cell therapy have been developed to overcome tumor immune evasion by enhancing recognition and cytotoxicity, as well as promoting persistence, infiltration and resistance to the TME.

One of the most widespread immune receptor engineering approaches is chimeric antigen receptor (CAR) T cells, which involve reprogramming effector killer T cells with CARs that target membrane tumor antigens. These receptors recognize antigens through fragments of specific antibody variable chains (scFvs), which are fused to T-cell signaling and costimulatory domains. Several generations of CAR constructs with different intracellular signaling domains have been designed (Fig. 1). Initially, firstgeneration CARs featured only the intracellular CD3了, stimulatory domain. Subsequent generations introduced additional costimulatory domains, such as and/or CD28, thereby enhancing their potential. Several CAR-T cells have been approved by the FDA for the treatment of hematological malignancies [32]. Compared with T cells, NK cells are interesting candidates for CAR therapies due to their natural ability to kill cancer cells without relying on pre-sensitization, the lower risk of cytokine release syndrome (CRS) [33, 34] and the possibility of using these cells in an allogeneic setting. Many studies have investigated the potential application of CAR-NK cell therapies both in preclinical and clinical settings. Since the first clinical trial involving CD33CAR NK-92 cells in patients with relapsed or refractory acute myeloid leukemia [35], many clinical trials involving NK cells derived from cell lines, peripheral blood (PB) or cord blood (CB) have been launched, with a focus on hematological malignancies and certain solid tumors (Table 1). Although most trials are ongoing, some have already provided promising results. Among them, FT596, an iPSC-derived off-the-shelf CD19-directed CAR-NK cell product, induced objective responses in patients receiving monotherapy and 4/9 patients receiving combination therapy with the anti-CD20 antibodies rituximab or obinutuzumab after the first FT506 treatment cycle. At single-dose levels of million cells, 8 of 11 ( ) evaluable patients displayed an objective response, including 7 with complete remissions without major adverse events in a reported dose-escalation phase I study [36, 37]. Similarly, NK cells engineered with a CD19-CAR, IL15, and inducible caspase 9 suicide genes exhibited no severe treatmentrelated toxicity and led to an objective response in 8 out of 11 (73%) patients with B-cell lymphoid malignancies [38]. More recently, a similar engineering strategy involving an anti-CD19 CAR and IL-15 was tested in umbilical cord blood-derived NK cells and led to an objective response in 18 out of 37 ( ) patients with CD19 + B-cell malignancies in a phase trial [39].

Classical CAR constructs. First-generation CARs composed of the CD3了 chain [40, 41] and second-generation CARs composed of CD28 and CD3 [38, 42-44], 4-1BB and CD28 [45], 4-1BB and CD3 [46, 47], 4-1BB, CD28 and CD3 [48], or CD137 and CD3 [49, 50] were applied to redirect NK cells against tumor cells. Several antigens were targeted by the CARs, including CD19, CD20, CD33 and CD5. Alternatively, the efficacy of second- and third-

generation CAR-NK cells has been explored for several solid tumors, including ovarian and breast cancers, as well as glioblastoma, with promising results [51-56]. Indeed, cytotoxic responses against tumor cells expressing the target antigen were triggered following coculture with CAR-NK cells [51-54]. This CARNK cell-mediated killing was specific, as no or only a minimal effect on healthy tissue was observed [51, 54]. Furthermore, this efficacy was confirmed in preclinical studies in which CAR-NK cells controlled tumor growth and improved survival rates [51-54]. For instance, in xenograft models of glioblastoma and ovarian cancers, the survival of tumor-bearing mice was significantly prolonged after CAR-NK cell treatment, which was associated with a decrease in tumor volume [52,54]. Similar results were obtained in a humanized mouse model of nasopharyngeal carcinoma [53].

CAR constructs with NK receptor domains. In addition to domains derived from receptors expressed in T cells, domains from NK cell receptors have also been incorporated into CAR constructs to improve NK cell activation (Fig. 1). Several NK cell receptors have been shown to replace the extracellular recognition domain, the transmembrane region and/or the intracellular region of CAR receptors. Overall, many CAR configurations were assessed in NK cells with various combinations of transmembrane regions, including CD16, NKp44, NKp46, and NKG2D, as well as costimulatory domains, such as 2B4, DAP10, DAP12, or 4-1BB, either alone or combined with CD37. However, the benefits of incorporating NK cell-associated domains over conventional domains in CARs have not been systematically investigated.

Notably, the extracellular CAR was replaced by the NKG2D receptor, thus allowing for NK cell activation in response to the detection of NKG2D ligands [57-59]. The transmembrane NKG2D receptor has also been exploited in several CAR constructs to promote its association with co-signaling receptors and mediate NK cell activation [60-62]. Alternatively, NK cells expressing CARs with both transmembrane and intracellular CD16 regions were shown to effectively target lung adenocarcinoma tumors in vivo [63]. Incorporating the intracellular activating domains of NK cells has also proven effective. For instance, some CARs have been designed with intracellular regions based on the activating receptors 2B4 [44, 60, 62, 64-66] and NKG2D [61], the adapter proteins DAP10 [57] and DAP12 [59, 67, 68], or the Fc receptors FceRy [69] and CD16 [63].

Some researchers have attempted to compare the effects of NKderived receptor domains with those of T-cell-derived receptor domains in CAR constructs. For instance, the 2B4 region (alone or with DNAM1) promoted the expansion and persistence of CAR-NK cells, in contrast to CD28 administration or the absence of a costimulatory signal [65]. The addition of 2B4 domains instead of 4-1BB also resulted in greater cytotoxicity [70]. This observation was confirmed in a paper comparing the cytotoxicity of a CAR construct composed of the CD28 homolog, 2B4 and CD3 domains, versus that of a CAR with CD28, and CD3 intracellular domains [71]. The cytotoxic effect of CAR-NK cells with the DAP12 intracellular domain was also enhanced compared to that with the CD3了 signaling chain [67]. In addition to their effects on intracellular domains, modifications of the transmembrane domain have also been reported to impact CAR-NK cell functionality. For instance, the use of the NKG2D transmembrane domain combined with 4-1BB enhanced the responses of NK cells compared to a CAR harboring the CD8 transmembrane domain and the 2B4 activation region [72]. The effect of replacing the commonly used scFv with an NK receptor recognition domain was also investigated. For instance, the use of an scFv targeting the NKG2D ligands MICa/b led to an increased antitumoral response compared to the insertion of the NKG2D extracellular domain [73].

Overall, NK receptor-based domains are valuable for improving CAR designs, and optimizing domain combinations may be beneficial in the future. To enhance tumor cell recognition and
immune responses by engineered NK cells, NK cell activating receptors can also be used in combination with CAR receptors. Notably, bispecific CAR-NK cells engineered with a PD1-DAP10 CAR and NKG2D exhibited strong cytotoxicity against gastric cancer cells both in vitro and in vivo [74]. Indeed, anti-PD1-DAP10 CAR harnessed NKG2D signaling through the DAP10 domains and was shown to potentiate NK cell activation against PD1 and NKG2D ligand-expressing tumor cells [74].

Next-generation CAR constructs. More sophisticated approaches, including the fourth CAR-T-cell generation, have emerged in recent years (Fig. 1). An IL-15-encoding transgene was inserted under the control of an NFAT responsive element, along with a CAR construct targeting CD44 [75]. Upon recognition of the target antigen by the CAR, a signaling cascade was initiated, leading to NFAT activation and the secretion of IL-15, which improved NK cell cytotoxicity in a triple-negative breast tumor spheroid model [75]. In addition, the incorporation of proinflammatory or proliferationinducing cytokine transgenes may also enhance the T-cell response.

Further improvements were based on engineering CARs targeting multiple antigens to counteract tumor escape (Fig. 1). Indeed, cancers are highly heterogeneous and resist targeted therapies via antigen escape. Many examples of target antigen loss after CAR-T-cell therapy, including melanocyte differentiation antigen [76], CD19 [77], CD22 [77] and BCMA [78], have been described. To allow for the concomitant detection of several tumor markers, NK cells were transfected with mRNAs encoding both CD19 and BCMA CARs. The cytotoxic effects of NK cells expressing both CARs outperformed those of single CARexpressing NK cells [79]. Similarly, dual CAR constructs that integrate two distinct antigen recognition domains have been developed in T cells and might be tested soon in NK cells. This approach may increase the stringency of tumor recognition and prevent tumor evasion (i.e., even if one antigen is lost, the other antigen will still be detected by the second CAR, and it is less likely that both antigens will be lost simultaneously) [80]. Notably, as NK cells can detect tumor cells through many activating endogenous receptors, even if the CAR target antigen is lost, cytotoxic responses may still occur through the recognition of other ligands, contrary to CAR-T cells. Adapter CARs, which are derived from traditional CARs, are also particularly useful for detecting multiple antigens because they provide greater flexibility in antigen targeting (Fig. 1). The unique feature of an adapter CAR is the inclusion of an adapter module between the antigen recognition domain and the signaling domain. This adapter module acts as a bridge to connect the antigen binding process to the subsequent activation of immune signaling pathways. Such adapter CARs have been implemented in NK cells, such as an antiFITC CAR combined with a FITC-folate adapter that links CAR and folate receptor alpha-expressing breast tumor cells [72]. Similarly, a universal CAR recognizing 2,4-dinitrophenyl (DNP) was redirected in NK cells to target several epitopes of gp160 using DNPconjugated antibodies as adapter molecules [81].

More complex logic-gated CARs have been developed in which the activation of therapeutic effects is controlled by logical combinations of input signals, thus allowing more specific and adaptable targeting of cancer cells (Fig. 1). This is particularly important for improving the discrimination between diseased and healthy tissues. An ‘OR and NOT’ logic-gated CAR gene circuit approach was designed to target CD33- or FLT3-expressing acute myeloid leukemia tumor cells while sparing healthy hematopoietic stem cells. This strategy was achieved through the insertion of two activating CARs targeting FLT3 and CD33 (or a single bivalent CAR targeting both antigens) and an EMCN-specific inhibitory CAR in NK cells [82]. NK cells were protected from fratricide by using an NK self-recognizing inhibitory CAR along with an activating CAR [83]. Notably, even if NK cells endogenously express the activating

CAR ligand, this target antigen can also be transferred, following binding with CAR receptors, from target tumor cells to effector NK cells through a process called trogocytosis [84]. Trogocytosis can dampen CAR-NK cell activity due to a decrease in tumor antigen density at the tumor cell surface but can also lead to fratricides after self-recognition and continuous CAR engagement [83, 85]. In this way, the inhibitory CAR provides a ‘don’t eat me’ signal, thereby preventing NK cell fratricide. In the future, complex logicgated circuits may enable the dynamic and precise activation of immune responses against cancer cells, thus offering a more controlled and personalized approach to cancer immunotherapy. In addition, the Syn/notch receptor was used in NK92 cells to trigger the expression of IL-12 following glypican-3 (GP3) recognition [86]. Similarly, a logic-gated GPC3 Syn/notch receptor was used to control the expression of a CAR targeting CD147 in a hepatocellular carcinoma model, leading to the specific killing of GPC3 + CD147 + cells but not single antigen-positive cells [9, 87]. The Syn/notch receptor is composed of an extracellular recognition domain, the transmembrane domain of the Notch core protein and an intracellular transcription factor. Upon binding the target antigen, the transcription factor is released and can activate the expression of downstream genes. This platform is entirely programmable in terms of recognition and effector transgenes, thus offering multiple possibilities for NK cell reprogramming. This programmability will be crucial for generating modular responses, which can evolve with the disease and counteract tumor escape. Even if autonomous circuit regulation is the ultimate goal, complex logic gates exogenously controlled by user-provided cues have been developed for T cells. The SUPRA CAR platform consists of a split CAR system to switch on/off the target antigen without the need for an additional CAR-T-cell injection [88]. This switch should effectively counteract antigenic loss through the targeting of multiple antigens. Moreover, SUPRA CARs also offer tunable signaling strength, which can decrease the risk of overactivation and thus of serious adverse events. Even if SUPRA CARs have not yet been tested in NK cells, they are theoretically compatible. Similarly, VIPER CARs (versatile protease regulatable CARs) can be controlled using FDA-approved antiviral protease inhibitors, which can induce an ON or OFF CAR state [89]. Interestingly, VIPER CARs can be multiplexed to generate complex circuits, which can be transposed to NK cells. FDA-approved small molecule inducers can also be used to control therapeutic responses at the transcription level. For instance, synthetic zinc finger transcription regulators (synZIFTRs) are composed of a DNA-binding domain, a drug-sensitive domain, and a transcription factor [90]. Upon drug exposure, user-controlled activation of target genes has been achieved in T cells. Furthermore, this approach might be suitable for activating several cellular programs that drive synergistic responses. Overall, such platforms should help refine the NK cell responses of each patient at a given time point depending on the stage of disease. In the future, artificial intelligence (AI)-guided tools might be extremely useful for adapting these therapies based on defined disease biomarkers.

Combinations of CARs with other therapies. Treating patients by CAR-NK cell transfer alone may not be sufficient because of the advanced stage of the disease and because NK cells are inhibited in the targeted environment (such as the TME). Combining CARNK cell transfer with conventional therapies such as chemotherapy and radiotherapy could potentiate efficacy. For instance, radiotherapy is useful not only for directly destroying tumor cells but also for reshaping the TME, notably by modifying the vasculature and cytokine secretion, which promote engineered immune cell infiltration, expansion and activation. The synergistic effect of CARs and monoclonal antibodies that target either activating receptors, such as CD16 [91], immune checkpoint inhibitors [92], such as PDL1 and PD1, or tumor antigens [93], was also observed. These antibodies can be externally produced by

direct injection or produced directly by genetically engineering NK cells [91] or tumor cells [94]. In addition to antibody transgenes, cytokine transgenes were also co-introduced with CARs in NK cells to improve persistence (as described below). In addition, the cytotoxicity of CAR-NK cells increased following their combination with oncolytic viruses in a brain metastasis mouse model [95]. These combination treatments underline the value of synergistic CAR-based approaches to trigger more efficient responses against various malignancies by enhancing not only NK cell activation but also NK cell recruitment and infiltration in the TME.

Although most strategies have focused on CAR-NK cells, the threshold of antigens required for NK cell activation is relatively high (Table 2). Moreover, the use of such receptors does not allow the targeting of intracellular antigens, except if the scFv recognizes an HLA-peptide complex. Indeed, this was described with a TCR-like CAR that was specific for a mutated nucleophosmin-1-derived neoepitope presented by HLA-A2 in an acute myeloid leukemia model [96]. Intracellular antigens are processed before being presented on the MHC cell surface. These peptides are then recognized by specific TCRs expressed by T cells. The classical TCR complex is composed of TCRa and chains and four CD3 signaling chains (one , one and two ). TCR engineering has mainly been applied to T cells [97], but the expression of the endogenous TCR (unless it is knocked out) can lead to chain mispairing and chimeras between endogenous and ectopic TCR chains, thus impairing TCR recognition and function. As NK cells do not harbor an endogenous TCR, there is no risk of mispairing after TCR insertion. However, the expression of a functional TCR in NK cells is more complex than that in T cells. The introduction of transgenes encoding the and TCR chains is not sufficient because the sequences encoding the CD3 signaling chains are also required for TCR stabilization at the membrane and for downstream signaling [98]. Notably, only the insertion of CD3 is unnecessary since NK cells naturally express this subunit intracellularly. Other major components are missing in most NK subsets, such as the CD8 chain, which is known to impact the functionality and signaling of many TCRs and is often inserted along with the TCR and CD3 chains in NK cells. Recently, the feasibility of TCR-reprogramming strategies was demonstrated in the FDA-approved NK cell line NK-92, leading to degranulation, cytokine production, and tumor cell killing both in vitro and in vivo [98, 99]. Similar results were observed in another NK cell line, the YTS cell line, with a TCR that targeted an antigen associated with melanoma [100]. Importantly, the addition of a new TCR did not impair the endogenous functions of NKs. For instance, engineered NK cells can still be inhibited by selfcomponents and mediate activation through other receptors (CD16 and NKG2D) [100]. Although NK cell lines are the main source of NK cells for the development of TCR NKs, in one study, researchers successfully reprogrammed human primary NK cells. A BOB1-specific TCR along with the CD3 subunits was introduced by retroviral transduction in primary NK cells, leading to antigenspecific cytotoxicity and cytokine production by NK-TCR cells to a level comparable to that of CD8 T cells expressing the same TCR
[101]. Moreover, after injection in a multiple myeloma mouse model, a reduction in tumor growth was observed [101]. This finding offers interesting perspectives for clinical testing in upcoming years. However, NK-TCR therapies may be hampered by the poor presentation of tumor-associated antigens, which may not reach a sufficient level to mediate NK cell activation. Interestingly, TCR affinity and avidity are similar in primary T cells and in NK cell lines, suggesting that the characteristics of a given TCR could be transposed and used to optimize responses in NK cells [102]. CAR and TCR can also be combined to obtain a synergistic effect. For instance, NK cells have been engineered with a TCR specific to the E7 protein of HPV16 jointly with a CAR specific to TROP2 [103]. The CAR construct comprised two costimulatory domains (CD28 and 4-1BB) but lacked the CD3了 activating domain; thus, CAR activation was necessary but not sufficient for NK cell-mediated cytotoxicity. Indeed, NK cell activation is dependent on E7 epitope recognition, which is exclusively expressed in HPV16-infected tumor cells, and cytotoxicity is enhanced by the binding of CAR to the TROP2 target expressed mostly on tumor cells but also in some healthy tissues. Combined signaling leads to optimal and tumor-specific cytotoxicity while sparing healthy tissues [103]. This strategy lays the foundation for sophisticated logic gates and broader applications in the future. For instance, instead of using two distinct receptors (one CAR and one TCR), hybrid receptors may be constructed. Such receptors, either HLA-independent (HIT receptor [104] and STAR [105]) or HLA-dependent (TCAR [106]), have already been developed in T cells and may be transposed to NK cells. Notably, a chimeric TCR composed of the extracellular domains of the TCRa chain fused to the CD28 transmembrane domain followed by the 2B4 and DAP10 signaling domains and the TCR chain fused to the CD28 transmembrane domain followed by the 41BB and CD3 signaling domains has been constructed [107]. After expression in primary NK cells, antigen-specific recognition and the lysis of tumor cells were achieved both in vitro and in vivo [107].

Overall, TCR-engineered NK cells exhibit unique advantages, by allowing the recognition of intracellular antigens, with lower levels required for activation and no risk of mispairing.

In addition to the direct recognition of tumor cells by dedicated receptors, NK cells can mediate target cell destruction through the coordinated action of antibodies via ADCC. Indeed, antigen-specific antibodies bind and opsonize target cells, and their constant region is then detected by Fc receptors expressed on NK cells. Following recognition, NK cells trigger target cell lysis through the release of lytic enzymes. FcyRIII (also known as CD16) has two allelic variants, with either a phenylalanine (F) or a valine (V) at amino acid position 158. These variants give rise to Fc receptor isoforms with different affinities: low affinity (CD16a-158-F/F) and high affinity (CD16a-158-V/N). Due to its high affinity, the CD16a-158-V/V variant has mainly been used for NK engineering to promote ADCC [108, 109]. For instance, by combining high-affinity CD16 V158 FcyRIlla receptor and IL-2 expression in engineered NK92 cells, enhanced lysis of tumor cells was observed with diverse combinations of monoclonal antibodies and target cells [7]. The therapeutic efficacy of high-affinity CD16a overexpression in CD38 KO NK cells was confirmed in vivo in a multiple myeloma model after adoptive transfer and treatment with a daratumumab antibody [110]. Importantly, to potentiate efficacy, FcRengineered NK cells are often combined with monoclonal antibodies targeting a tumor-associated antigen. A similar NK reprogramming approach was successfully developed to mediate the ADCC of PDL1expressing meningioma tumors in the presence of an anti-PDL1 antibody [111]. One limitation of these approaches is the predisposition of CD16 to ADAM17 proteinase-mediated cleavage, which impairs ADCC. Notably, a noncleavable variant (i.e., resistant to
proteinase) has been developed and successfully implemented, which had improved killing in preclinical models [112-114].

High-affinity CD16 receptors have also been expressed with CAR receptors in NKs. Notably, granule polarization and the release of lytic enzymes were observed in NK92 cells expressing the high-affinity variant and a CAR [115]. Alternatively, as mentioned above in Section 3.1, the CD16 domain can be directly incorporated into a CAR construct as a transmembrane and/or costimulatory domain [63]. Conversely, to potentiate ADCC, the extracellular recognition domain of CD16a can be fused to signaling and activation domains. Indeed, the common CD28 and domains used in CARs have been linked to CD16a, either alone or with the signaling domain of CD3Ц [45]. The resulting chimeric receptor exhibits enhanced cytotoxic activity and ADCC activity against CD20-positive tumor cells in the presence of a monoclonal antibody [45]. NK-specific signaling domains (2B4, FcRy and DAP10) have also been fused with the CD16a recognition domain [116]. More complex chimeric receptors based on FCR domains have also been constructed. For instance, the ASIMut (antigen-specific synthetic immunoglobulinbased multichain) receptor is composed of two partners: a membrane-anchored immunoglobulin fused to FceRl and the extracellular and transmembrane regions of Iga and Ig linked to the CD3 signaling domain [117]. After co-culturing modified NK cells and target cell lysis, ADCC-like lysis of target cells was induced [117].

Overall, the targeted engineering of NK cell receptors holds great potential for enhancing ADCC and thereby improving the precision and efficacy of immune-mediated NK cancer therapies.

A significant limitation of current adoptive cell therapies is poor infiltration into tumors, which limits effectiveness [118]. Although certain chemokine receptors are expressed on freshly isolated NK cells, this expression is attenuated following ex vivo expansion or freezing. Some ex vivo culture conditions have emerged as promising strategies to significantly upregulate the expression of key receptors, such as C-X-C motif chemokine (CXCR) 3, which is known to enhance the migratory capacity of CXCL10-producing tumor and immune cells [119]. This unregulated expression allows for the selection, amplification, and upregulated expression of receptors before NK cell infusion. However, even optimized culture conditions often do not induce the expression of sufficient levels of chemokine receptors and are not efficient for all chemokine receptors. Thus, the genetic engineering of NK cells to integrate ectopic chemokine receptors that enhance their chemotropism may be more relevant for enhancing the efficacy of adoptive therapies for cancers (Table 3).

Several receptors have been shown to improve NK cell migration toward tumor sites. For instance, CXCR2, which is lost upon in vitro expansion, was overexpressed in NK cells by retroviral transduction, leading to enhanced migration toward renal cell carcinoma spheroids [120]. Similar results were observed in vivo, as the overexpression of CXCR2 on NK-92 cells promoted their infiltration into lung metastases [121]. Alternatively, the CRISPR/Cas9 system has been used to upregulate the expression of chemokine receptors such as CXCR2 and IL-2 on NK cells, thereby leading to increased migration to tumor sites, enhanced proliferation and improved cell killing in a preclinical colon cancer model [122]. The modulation of CXCR1 has also demonstrated encouraging results. Modified NK cells engineered with CXCR1 and a CAR targeting tumor-associated NKG2D ligands were reported to enhance migration toward tumors and increase infiltration in vivo [123]. Using CRISPR gene editing, CCR5 was also effectively overexpressed, while CXCR4 expression was downregulated in expanded NK cells, resulting in reduced trafficking in the liver and increased levels in circulation [124]. In contrast, for

hematologic malignancies affecting the bone marrow, upregulation of CXCR4 expression is beneficial for improving homing to tumor cells. Indeed, the retention of NK cells in the bone marrow is mediated by CXCR4 through interactions with its ligands SIP5 (sphingosine-1 phosphate receptor 5) and CXCL12, also known as SDF-1 (stromal cell-derived factor 1). For instance, mRNA transfection with a gain-of-function variant of CXCR4 (CXCR4 ) significantly promoted the homing of NK cells to the bone marrow following adoptive transfer [125]. CXCR4 overexpression has also been combined with CARs targeting either CD19 or epidermal growth factor (EGFR)vlll in NK cells to enhance migration toward tumor cells and the retention of endogenous and CAR-mediated cytotoxic activities [68, 126]. Combined overexpression of CXCR4 and C-C motif chemokine receptor (CCR) 7 via lentiviral vectors further enhanced NK cell migration to human colon cells [127]. The insertion of CCR7 alone into NK cells also promoted their migration toward secondary lymphoid organs. Through mRNA electroporation, CCR7 was effectively introduced into primary human NK cells, leading to a substantial improvement in their in vitro migration toward CCL19 [109]. Similarly, transfection of a nonviral vector containing the CCR7 receptor, along with a highaffinity CD16 Fc receptor and an anti-CD19 CAR, resulted in enhanced survival and superior tumor control in humanized mice bearing lymphoma tumors [128]. Trogocytosis-mediated expression of CCR7 on expanded NK cells also led to NK cell migration toward CCL19 and CCL21 both in vitro and in vivo (toward lymph nodes) [129]. Notably, other receptors not expressed on NK cells, such as CCR4 and CCR2B, which are naturally found on regulatory T cells and tumor-resident monocytes, were used to reprogram NK cells [130].

Some strategies have also been developed to promote chemokine secretion, such as IFN injection, in combination with oncolytic viruses or radiotherapy, to facilitate NK cell recruitment [119, 131]. Alternatively, chemokines can be artificially expressed in the TME. For instance, combination approaches, such as modifying NK cells to express CCR5 while introducing a vaccinia virus expressing the CCL5 chemokine, have been successfully applied to enhance migration [132].

Although most approaches have focused on chemokine receptors, other receptors, such as the E-prostanoid 3 receptor, led to increased cell adhesion and cytotoxicity in modified NK cells and should be further tested [133].

The proliferation and persistence of NK cells following adoptive transfer display distinct dynamics depending on their cellular source. While irradiation of NK cell lines before transfer impacts their in vivo persistence, primary NK cells retain a degree of physiological relevance and familiarity with the host environment, thereby enhancing their persistence after transfer. However, this persistence remains limited to a couple of weeks, thus requiring frequent injections. To increase NK cell survival and growth ex vivo, cytokine cocktails, including those with IL-2, IL-12, IL-15, IL-18, and IL-27, have been developed. Through the meticulous modulation of growth factors, cytokines, and signaling molecules, NK cells can be endowed with memory-like properties and have greater responsiveness upon re-exposure to antigens, prolonged persistence, and augmented cytotoxicity.

Among these factors, IL-15 was shown to promote NK cell proliferation and activation while exerting a low level of toxicity [134, 135]. The administration of this cytokine has been extensively exploited as a means of increasing the longevity of NK cells. In addition to direct IL-15 injections, NK cells harboring an IL-15 transgene have been engineered to survive in the absence of exogenous cytokines in an autocrine manner [136]. The addition of the IL-15 gene notably prolonged CAR-NK cell persistence and cytotoxicity [38, 44, 137, 138]. In this context, very promising
results were obtained in a phase I/II clinical trial evaluating HLAmismatched anti-CD19 CAR-NK cells transduced with a retroviral vector encoding IL-15 in lymphoid tumors. Among the first 11 reported patients, 8 ( ) achieved a response, including 7 who achieved complete remission. Expansion was observed as early as 3 days after infusion, and CAR-NK cells persisted at low levels for at least 12 months [38]. Given that IL-15 is secreted, fusion proteins were constructed to anchor IL-15 at the membrane to ensure direct action on NK cells [139]. The integration of a membranebound IL-15 with a chimeric NKG2D receptor fused with costimulatory (OX40) and signaling (CD3Z) domains in NK cells amplified cytotoxicity, prolonged intrinsic longevity, and enhanced antitumor efficacy in acute myeloid leukemia xenograft models, thus highlighting its value as a potent therapeutic agent [139]. In addition, a membrane-bound IL-15/IL-15R fusion protein was extensively tested in combination with CAR in NK cells [140]. For instance, BCMA CARs, along with noncleavable CD16 receptors and monoclonal anti-CD138 antibodies, were combined with this fusion molecule in NK cells and promoted in vitro cytotoxicity and prolonged persistence in the modified cells [114, 141]. Interestingly, this fusion approach was evaluated in a clinical trial with an anti-CD19 CAR and a noncleavable CD16 receptor (along with monoclonal antibodies) and led to partial responses in diffuse large B-cell lymphoma patients [37]. Alternatively, other fusion proteins have been developed, notably a chimeric protein composed of IL15 and the CD8a transmembrane domain [142]. In leukemia and sarcoma mouse models, NK cells engineered to express this membrane-bound IL-15 exhibited elevated cytotoxicity both in vitro and in vivo [142].

Another strategy to promote survival in the absence of exogenous cytokines is to combine signaling domains that induce proliferation with unrelated recognition domains. For instance, truncated IL-2 receptor -chain ( ) and STAT3-binding tyrosine-X-X-glutamine (YXXQ) motifs were added to anti-PD-L1 CARs to enhance cell proliferation and persistence through the activation of downstream signaling pathways [72].

In conclusion, the modulation of cytokines and cytokine receptors is highly promising for enhancing NK cell survival and persistence, thus paving the way for durable therapeutic efficacy.

Achieving successful outcomes with NK cell therapies hinges not only on the capacity of immune cells to migrate and persist within the intricate TME but also on their ability to remain functional despite the immunosuppressive milieu.

Transforming growth factor-beta (TGF- ) plays a pivotal role in the TME by suppressing NK cell-mediated immune responses and promoting tumor immune escape. TGF- inhibits the expression of activating receptors, such as NKG2D and DNAM1, thereby impairing NK cell recognition and the targeting of tumor cells. TGF- is recognized by a complex formed by the TGF RI and TGF RII receptors and induces intracellular pathways leading to NK cell inhibition (Fig. 2). To suppress this inhibition, the intracellular part of the TGF RII receptor was deleted to generate a dominant-negative mutant (DNT/ßRII). After expression in NK cells, DNT RII protected NK cells from TGF- -mediated immunosuppression, while they retained their killing ability after NK stimulation (Fig. 2) [143-145]. Indeed, following stimulation with the endogenous NKG2D or DNMA1 receptor or with an ectopic CAR receptor, cytolytic activity, and notably the secretion of perforin, granzyme and IFN [144, 145], was preserved. These results were confirmed in vivo. The transfer of genetically modified NK-92 cells that incorporated DNT/ßRII decreased tumor proliferation and lung metastasis and increased the survival rate in a mouse model [146]. Technological advancements have been made to encompass the synthetic Notch-like receptor (Syn/Notch),

as in “NKCT,” where the truncated TGF RII domain is fused to the Notch transmembrane domain coupled to the RELA transcription factor (Fig. 2). This fusion protein promoted the direct activation of NK cells at the transcription level, thereby boosting their resistance to the TME and augmenting their antitumor functions [147]. Other chimeric receptors that integrate activating domains and a TGF RII recognition domain have exhibited promising results in overcoming TGF- immunosuppression. Among them, engineered NK-92 cells expressing a hybrid receptor (named TNchimeric), which is composed of the extracellular part of TGF RII and the transmembrane and intracellular domains of NKG2D, exhibited enhanced chemoattraction to tumor cells expressing TGF- and had enhanced killing ability (Fig. 2) [148]. A similar construct in which the intracellular domain was replaced by a DAP12 NK activation motif successfully initiated NK cell activation following exposure to TGF- (Fig. 2) [147]. Notably, other activating domains, such as the activating domains of proinflammatory cytokine receptors, which have already been validated in T cells, may be suitable for redirecting TGF- activity [149, 150].

In addition to anti-inflammatory cytokines, immune checkpoint inhibitors, such as PD-1/PD-L1, also play a major role in immune cell inhibition by the TME. Strategies similar to those used for TGF- , such as the development of truncated receptors, the replacement of the receptor intracellular domain with an activating unit or the use of anti-PD-L1 CARs (as mentioned above in Section 3.1), have been shown to reverse PD1/PDL1-mediated inhibition [53, 61, 69, 151]. Indeed, the use of truncated PD-1 in transferred NK92 cells led to reduced tumor growth and improved survival rates [152]. The recently developed NK cell-specific PD1-based chimeric switch receptor (PD1-CSR) uses the DAP10, DAP12, and CD3Z signaling domains to reverse the effect of PD1 on NK cells [74, 153]. After administration in patients, an increase in NK cell degranulation and cytokine expression against autologous CD138 PD-L1 malignant plasma cells was observed [153]. Collectively, these innovative strategies highlight the growing complexity of adoptive cell therapy in reprogramming NK cells to overcome the challenges of the endogenous TME and promote antitumor immune responses.

NK cells can be inhibited by the tumor microenvironment and have also been reported to kill each other. To avoid fratricide, knockouts (KOs) of target genes have been generated. For
instance, in the treatment of hematologic malignancies, the CD38 and CD7 genes were deleted in engineered CAR-NK cells [40,114,154,155]. Interestingly, a 2 -in-1 strategy was developed by inserting the CAR receptor in the locus of the gene encoding its target, which allowed for the expression of the CAR while avoiding fratricide [156, 157]. As mentioned above in Section 3.1, inhibitory CAR receptors can also be implemented to avoid trogocytosismediated CAR-NK cell fratricides [83, 85].

In addition, in the case of allogenic transfer, donor HLAmismatched NK cells can be eliminated by the recipient immune system. To counteract this “host-versus-graft effect”, the surface expression of HLA class I molecules on donor NK cells was abolished by beta 2 -microglobulin KO to prevent killing by recipient alloreactive T cells. Because loss of HLA class I molecules induces killing by NK cells (‘missing self’-induced lysis), a single-chain HLA-E molecule was also introduced to inhibit receiver NK cells expressing CD94/NKG2A or CD94/NKG2B [158].

Given that NK cell activation relies on a balance between signals from activating and inhibitory receptors, disrupting signals from inhibitory receptors is also expected to promote cell activation without increasing the activity of activating receptors. Strategies to counteract the impact of inhibitory signaling pathways, including KO or downregulation of the expression of these inhibitory receptors, have been explored [50, 159].

NK cell receptor engineering holds great promise for reprogramming immune responses to cancer cells. Nevertheless, some major limitations remain to be addressed, such as the persistence of infused cells, which is quite limited and often does not allow for the establishment of memory responses. By carefully choosing the donor and the phenotype of infused NK cells, such as cytokineinduced memory-like NK cells or adaptive NK cells, prolonged and durable effects can be achieved [160-163]. In addition, with persistence in patients, engineered NK cells should also be functional and exert therapeutic benefits. In addition to inhibition by the TME, other mechanisms of resistance, such as upregulated HLA-G expression on tumor cells, have been observed following CAR-NK cell therapy and should be taken into consideration [66]. A strategy to boost the efficacy of NK cell therapy is to combine engineered targets. In this context, AI will be useful for identifying receptors, coreceptors, or checkpoint inhibitor KO combinations to generate next-generation NK cell therapies. For instance, cytokine-
inducible SH2-containing (CISH) disruption was shown to potentiate the antitumor activity of CAR-NK cells [164, 165]. In addition to multiple engineering methods, AI can help develop combination treatments with conventional treatments or other immunotherapies by predicting patient responses. Notably, cell engagers have gained much interest in recent years and have been approved for clinical use. They can bridge ligands, such as tumor antigens, and activate receptors on the NK cell surface [166-172]. This kind of molecule could be used to promote NK cell activation by linking engineered receptors to tumor cells. Importantly, safety issues remain intrinsically related to engineered NK cell therapies, such as off-target activation. Ensuring the specificity of NK cell therapies is essential to avoid damaging healthy tissue, which can lead to serious side effects. To refine NK cell activation and selectively target cancer cells, tightly tuned logic-gated circuits should be developed. Moreover, computational models should be developed to predict and dynamically adjust cell responses. The frequent use of integrative vectors to modify NK cells also comes with the risk of insertional mutagenesis, which may lead to NK cell lymphomas. The current FDA recommendation is to have a vector copy number less than 5 [173]. Moreover, editing tools can also be used to generate chromosomal translocations. Recently, several manufacturing protocols have been developed to overcome some of the abovementioned limitations and, if approved, could become standard practices to minimize chromosome loss and translocations in manufactured products [174-176]. As a safeguard, to ensure engineered cell destruction in the event of adverse events, an inducible caspase safety switch should be implemented [38, 177]. Quality control standards must be defined to check the engineering efficacy, purity, phenotype and tumorigenicity of NK cells. Indeed, depending on the donor, the source (PB or UCB) and the culture conditions, NK cell subsets can vary [178]. For these latter points, new techniques to expand, modify and cryopreserve primary NK cells ex vivo would be extremely useful for scaling up production for clinical application, as high doses and multiple injections are required [33]. The future progress achieved in T-cell therapies, including the infrastructures developed for the production of cell and viral vectors, as well as the tools available to engineer cells (among which in vivo editing strategies), are expected to synergistically improve NK cell therapy. Early-stage clinical trials will also provide valuable information and promote optimization for future NK cell therapies, which are likely to reach clinical approval in the coming years. Overall, these pioneering advancements not only hold tremendous potential for cancer treatment but also extend the spectrum of treatments for other diseases, including infections.

Writing and conceptualization: A.P., validation and review: J.V.-G. and N.C., validation, review and editing: S.D.

The AP postdoctoral position is funded by INCa PLBio 2020-095. We thank Brigitte Manship for proofreading the manuscript.

N.C. is an employee of ErVimmune, A.P. and J.V.-G. are consultants for ErVimmune, and S.D. is the founder and chairperson of ErVimmune. The authors declare that they have no other competing interests.

Correspondence and requests for materials should be addressed to Audrey Page or Stéphane Depil.

Reprints and permission information is available at http://www.nature.com/ reprints

Open Access This article is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License, which permits use, sharing, adaptation, distribution and reproduction in any medium or format, as long as you give appropriate credit to the original author(s) and the source, provide a link to the Creative Commons licence, and indicate if changes were made. The images or other third party material in this article are included in the article’s Creative Commons licence, unless indicated otherwise in a credit line to the material. If material is not included in the article’s Creative Commons licence and your intended use is not permitted by statutory regulation or exceeds the permitted use, you will need to obtain permission directly from the copyright holder. To view a copy of this licence, visit http:// creativecommons.org/licenses/by/4.0/.
© The Author(s) 2024