DOI: https://doi.org/10.3389/fpls.2026.1761477
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/41710177
تاريخ النشر: 2026-02-03
المؤلف: Haoran Wang وآخرون
الموضوع الرئيسي: التنوع الجيني وبنية السكان
نظرة عامة
تركز البحث على تحسين تحديد الجينات الوراثية لـ *Robinia pseudoacacia* من خلال تطوير علامات تعدد أشكال النوكليوتيد الفردية (SNP) عالية الجودة، مع معالجة القيود المفروضة على علامات SSR التقليدية. وقد نجحت الدراسة في تحديد 145 موضع SNP عالي الجودة من بيانات إعادة التسلسل، مما أدى إلى تطوير 31 علامة PCR محددة للأليلات التنافسية (KASP) الأساسية. تم استخدام هذه العلامات لتحليل التنوع الجيني وبنية السكان لـ 105 أفراد من *R. pseudoacacia* والأنواع ذات الصلة، مما كشف عن تعدد أشكال كبير بمحتوى معلومات تعدد الأشكال (PIC) قدره 0.335، وتكرار الأليل الصغير (MAF) قدره 0.328، وتنوع الجينات قدره 0.428، ووجود الأليلات المتغايرة قدره 0.357.
أشارت النتائج إلى أنه يمكن تصنيف الأصناف إلى ثلاث مجموعات متميزة بناءً على تحليل بنية السكان، وتحليل المكونات الرئيسية (PCA)، وتحليل الشجرة التطورية. ومن الجدير بالذكر أنه تم بناء ملف تعريف بصمة وراثية سمح بالتمييز الكامل لجميع الأصناف الـ 105 باستخدام 12 فقط من علامات KASP الأساسية. تؤسس هذه الدراسة أساسًا قويًا للبحوث الجينية المستقبلية وتحديد الجينات الوراثية لـ *R. pseudoacacia*، مما يبرز كفاءة علامات KASP، وانخفاض تكلفتها، وقدرتها التمييزية القوية كميزة لتحسين نظام اختبار DUS القياسي لهذه الأنواع.
مقدمة
تناقش مقدمة ورقة البحث أهمية *Robinia pseudoacacia*، وهو شجرة نفضية من عائلة الفاباسيا، والتي تم زراعتها على نطاق واسع عالميًا منذ إدخالها إلى الصين في أواخر القرن التاسع عشر. لقد أسست توسعها السريع واختيار نسخ متفوقة في مختلف المقاطعات منها كنوع بيئي وحشبي حيوي. ومع ذلك، أدى التنوع المتزايد لموارد الجينات الوراثية إلى مشاكل مثل التماثل والاسماء المتشابهة، مما يعقد جهود التربية وتحديد الأصناف. تقتصر طرق التعرف التقليدية على الشكل على ذاتيتها وتأثير العوامل البيئية على تعبير الصفات.
لمعالجة هذه التحديات، تؤكد الدراسة على الحاجة إلى تحديد سريع ودقيق لجينات *R. pseudoacacia*، وهو أمر حاسم لتعزيز كفاءة التربية وحل النزاعات المتعلقة بحقوق الملكية. تبرز الورقة إمكانيات علامات الجينات الوراثية، وخاصة تعدد أشكال النوكليوتيد الفردية (SNPs) وتقنية PCR المحددة للأليلات التنافسية (KASP)، التي تقدم دقة وكفاءة عالية في تحديد الأنماط الجينية. بينما استكشفت الأبحاث السابقة الصفات الظاهرية والتنوع الجيني باستخدام علامات تكرار التسلسل البسيط (SSR)، تهدف هذه الدراسة إلى إنشاء قاعدة بيانات بصمة وراثية قائمة على SNP لـ *R. pseudoacacia*. من خلال فحص علامات SNP لـ 105 أصناف، توفر البحث موردًا أساسيًا لتحليل التنوع الجيني، وتحديد الأصناف، والتربية الجزيئية لهذه الأنواع.
طرق
في هذه الدراسة، اتبع المؤلفون جميع الإرشادات ذات الصلة لجمع وتحليل المواد النباتية، مع التركيز بشكل خاص على 105 أصناف من *Robinia pseudoacacia* والأنواع ذات الصلة التي تم الحصول عليها من مزرعة الغابات المملوكة للدولة في داتشينغشان بمقاطعة شاندونغ، الصين. للتحقق من صحة ملفات بصمة الحمض النووي التي تم بناؤها من هذه الأصناف، تم استخدام 30 صنفًا من الجينات الوراثية من نسل الأصناف النخبوية.
تم إجراء استخراج الحمض النووي باستخدام طريقة بروميد السيتيل تريمثيل الأمونيوم (CTAB)، كما هو موضح من قبل بوريبسكي وآخرون (1997). تم تأكيد سلامة الحمض النووي الجينومي المستخرج من خلال الرحلان الكهربائي في هلام الأجاروز، بينما تم تقييم تركيزه ونقاوته باستخدام مقياس الطيف الضوئي Nanodrop. أشار جهاز Qubit 3.0 إلى أن تركيز الحمض النووي تجاوز 200 نانوغرام/مل، وتم تخفيف العينات بعد ذلك بالماء المقطر المزدوج لتحقيق تركيز نهائي يتراوح بين 20-30 نانوغرام/مل لمزيد من التحليل.
نتائج
أدى تحديد الأنماط الجينية لـ 105 صنفًا باستخدام 31 علامة KASP إلى نتائج ناجحة، كما هو مفصل في الجدول التكميلي S3. أظهر تحليل التنوع الجيني أن جميع العلامات أظهرت أداءً قويًا في تحديد الأنماط الجينية، حيث تراوحت قيم محتوى معلومات تعدد الأشكال (PIC) من 0.245 إلى 0.375 بمتوسط قدره 0.335. تراوحت قيم تكرار الأليل الصغير (MAF) بين 0.173 و0.490، بمتوسط قدره 0.328. بالإضافة إلى ذلك، تراوحت قيم وجود الأليلات المتغايرة من 0.038 إلى 0.598، بينما تراوحت قيم تنوع الجينات من 0.286 إلى 0.500، مع قيم متوسطة قدرها 0.357 و0.428، على التوالي.
من المهم أن تكون معدلات البيانات المفقودة للعلامات جميعها أقل من 5%، حيث أظهرت 10 علامات عدم وجود بيانات مفقودة. تؤكد هذه النتائج على التنوع الجيني العالي الموجود في 31 علامة KASP الأساسية، مما يؤكد ملاءمتها لتحليل التنوع الجيني وتحديد موارد الجينات الوراثية لـ *R. pseudoacacia*.
مناقشة
في هذه الدراسة، تم استخدام نهج شامل لتطوير علامات KASP (PCR المحددة للأليلات التنافسية) للتحليل الجيني لـ *Robinia pseudoacacia* والأنواع ذات الصلة. بدأت العملية بتصفية مواضع SNP من بيانات التسلسل، مع تطبيق معايير صارمة لضمان تعدد الأشكال العالي والدقة. تم تحديد ما مجموعه 145 موضع SNP عالي الجودة، تم اختيار 31 علامة SNP الأساسية منها لتصميم بادئات KASP. أظهرت هذه العلامات تعدد أشكال كبير، حيث كانت قيم تكرار الأليل الصغير (MAF) ومحتوى معلومات تعدد الأشكال (PIC) بمتوسط قدره 0.354 و0.375، على التوالي. أظهر نظام تحديد الأنماط الجينية KASP موثوقية عالية، حيث تجاوزت نسبة الاتساق بين الاختبارات 97%، ونجح في تمييز 105 أصناف من *R. pseudoacacia*.
كشف تحليل الهيكل الجيني عن ثلاثة تجمعات فرعية متميزة بين الأصناف، مما يشير إلى علاقة جينية وثيقة، كما يتضح من متوسط مسافة ناي 0.2706. كما قامت الدراسة ببناء ملفات بصمة الحمض النووي، محققة تمييزًا كاملاً لجميع الأصناف باستخدام 12 زوجًا من البادئات فقط. يبرز هذا الدقة العالية في تحديد الأنماط الجينية إمكانيات علامات KASP المطورة لتحديد الأصناف، وتقييم التنوع الجيني، وإدارة الجينات الوراثية. تشير النتائج إلى أن هذه العلامات يمكن أن تعزز بشكل كبير كفاءة برامج التربية وتساهم في إنشاء معايير اختبار التميز، والتجانس، والاستقرار (DUS) لـ *R. pseudoacacia*. ومع ذلك، يُوصى بمزيد من التحقق عبر ظروف بيئية متنوعة وأجيال قبل الدمج الرسمي في ممارسات حماية الأصناف.
DOI: https://doi.org/10.3389/fpls.2026.1761477
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/41710177
Publication Date: 2026-02-03
Author(s): Haoran Wang et al.
Primary Topic: Genetic diversity and population structure
Overview
The research focuses on improving germplasm identification of *Robinia pseudoacacia* through the development of high-quality single nucleotide polymorphism (SNP) markers, addressing the limitations of traditional SSR markers. The study successfully identified 145 high-quality SNP loci from resequencing data, leading to the development of 31 core kompetitive allele-specific PCR (KASP) markers. These markers were utilized to analyze the genetic diversity and population structure of 105 individuals from *R. pseudoacacia* and related species, revealing significant polymorphism with a polymorphism information content (PIC) of 0.335, minor allele frequency (MAF) of 0.328, gene diversity of 0.428, and heterozygosity of 0.357.
The results indicated that the accessions could be categorized into three distinct groups based on population structure analysis, principal component analysis (PCA), and phylogenetic tree analysis. Notably, a fingerprint profile was constructed that allowed for the complete distinction of all 105 accessions using only 12 of the core KASP markers. This study establishes a robust foundation for future genetic research and germplasm identification of *R. pseudoacacia*, highlighting the KASP markers’ efficiency, low cost, and strong discriminatory ability as advantageous for optimizing the DUS testing standard system for this species.
Introduction
The introduction of the research paper discusses the significance of *Robinia pseudoacacia*, a deciduous tree from the Fabaceae family, which has been widely cultivated globally since its introduction to China in the late 19th century. Its rapid expansion and the selection of superior clones in various provinces have established it as a vital ecological and timber species. However, the increasing diversity of germplasm resources has led to issues such as synonymy and homonymy, complicating breeding efforts and cultivar identification. Traditional morphological identification methods are limited by their subjectivity and the influence of environmental factors on trait expression.
To address these challenges, the study emphasizes the need for rapid and accurate identification of *R. pseudoacacia* germplasm, which is crucial for enhancing breeding efficiency and resolving property rights disputes. The paper highlights the potential of DNA molecular markers, particularly single nucleotide polymorphisms (SNPs) and kompetitive allele-specific PCR (KASP) technology, which offers high accuracy and efficiency in genotyping. While previous research has explored phenotypic traits and genetic diversity using simple sequence repeat (SSR) markers, this study aims to establish a SNP-based DNA fingerprint database for *R. pseudoacacia*. By screening SNP markers for 105 accessions, the research provides a foundational resource for genetic diversity analysis, cultivar identification, and molecular breeding of this species.
Methods
In this study, the authors followed all relevant guidelines for the collection and analysis of plant materials, specifically focusing on 105 accessions of Robinia pseudoacacia and closely related species sourced from Daqingshan State-owned Forest Farm in Shandong Province, China. To validate the DNA fingerprint profiles constructed from these accessions, 30 germplasm accessions of elite cultivar hybrid progenies were utilized.
DNA extraction was performed using the cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) method, as outlined by Porebski et al. (1997). The integrity of the extracted genomic DNA was confirmed through agarose gel electrophoresis, while its concentration and purity were assessed using a Nanodrop spectrophotometer. The Qubit 3.0 instrument indicated that the DNA concentration exceeded 200 ng/mL, and samples were subsequently diluted with double-distilled water to achieve a final concentration of 20-30 ng/mL for further analysis.
Results
The genotyping of 105 accessions using 31 KASP markers yielded successful results, as detailed in Supplementary Table S3. The analysis of genetic diversity demonstrated that all markers exhibited strong genotyping performance, with polymorphism information content (PIC) values ranging from 0.245 to 0.375 and a mean of 0.335. The minor allele frequency (MAF) values varied between 0.173 and 0.490, averaging 0.328. Additionally, heterozygosity values ranged from 0.038 to 0.598, while gene diversity values spanned from 0.286 to 0.500, with mean values of 0.357 and 0.428, respectively.
Importantly, the missing data rates for the markers were all below 5%, with 10 markers showing no missing data. These findings underscore the high genetic diversity present in the 31 core KASP markers, confirming their suitability for genetic diversity analysis and the identification of R. pseudoacacia germplasm resources.
Discussion
In this study, a comprehensive approach was employed to develop KASP (Kompetitive Allele Specific PCR) markers for the genetic analysis of *Robinia pseudoacacia* and its related species. The process began with filtering SNP loci from sequencing data, applying stringent criteria to ensure high polymorphism and accuracy. A total of 145 high-quality SNP loci were identified, from which 31 core SNP markers were selected for KASP primer design. These markers demonstrated significant polymorphism, with mean minor allele frequency (MAF) and polymorphism information content (PIC) values of 0.354 and 0.375, respectively. The KASP genotyping system exhibited high reliability, with an inter-assay consistency rate exceeding 97%, and successfully distinguished 105 accessions of *R. pseudoacacia*.
The genetic structure analysis revealed three distinct subpopulations among the accessions, indicating a close genetic relationship, as evidenced by a mean Nei’s distance of 0.2706. The study also constructed DNA fingerprint profiles, achieving complete discrimination of all accessions using only 12 primer pairs. This high resolution in genotyping underscores the potential of the developed KASP markers for cultivar identification, genetic diversity assessment, and germplasm management. The findings suggest that these markers could significantly enhance the efficiency of breeding programs and contribute to the establishment of distinctness, uniformity, and stability (DUS) testing standards for *R. pseudoacacia*. However, further validation across diverse ecological conditions and generations is recommended before formal integration into cultivar protection practices.