DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-024-07802-5
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39506153
تاريخ النشر: 2024-11-06
المؤلف: Jun Tang وآخرون
الموضوع الرئيسي: الجينوميات السرطانية والتشخيصات
نظرة عامة
يُشكل الحمض النووي خارج الصبغي (ecDNA) تحديات كبيرة في علاج السرطان بسبب دوره في تعزيز نسخ الجينات المسرطنة والتطور الجيني السريع، مما يسهم في مقاومة العلاج وسوء نتائج المرضى. لا تستهدف العلاجات الحالية ecDNA بشكل محدد. تُظهر هذه الدراسة أن تعزيز الصراع بين النسخ والتكرار يمكن أن يقضي بشكل انتقائي على السرطانات المحتوية على ecDNA. تكشف التحليلات أن ecDNA يظهر نسخ RNA شاملة وDNA أحادي السلسلة المرتبط، مما يؤدي إلى زيادة الصراعات بين النسخ والتكرار وضغط التكرار مقارنةً بالحمض النووي الصبغي. ومن الجدير بالذكر أن الوسيط لإصلاح تلف الحمض النووي، pRPA2-S33، يظهر توطينًا مرتفعًا على ecDNA، مما يتوافق مع زيادة في كسور خيوط الحمض النووي المزدوجة وتنشيط كيناز نقطة التفتيش في مرحلة S، CHK1.
تقدم الأبحاث مثبطًا قويًا عن طريق الفم لكيناز CHK1، BBI-2779، الذي يُحدث موت الخلايا بشكل تفضيلي في الأورام المحتوية على ecDNA. في نموذج سرطان المعدة مع تضخيم FGFR2 على ecDNA، يثبط BBI-2779 نمو الورم بفعالية ويتغلب على المقاومة المكتسبة لمثبط pan-FGFR infigratinib، مما يؤدي إلى انكماش كبير في الورم في الفئران. تشير النتائج إلى أن استهداف الصراع بين النسخ والتكرار يمثل استراتيجية واعدة للعلاجات الموجهة نحو ecDNA، مستغلة القتل الاصطناعي لعلاج أنواع مختلفة من السرطانات المميزة بتضخيم ecDNA.
طرق
في هذه الدراسة، تم تصنيف ما مجموعه 1,921 عينة من أطلس جينوم السرطان (TCGA) إلى خمسة أنواع فرعية باستخدام أداة AmpliconSuite (AC)، مع التركيز بشكل خاص على ecDNA، وكسر-دمج-جسر، ومعقد غير دوري، وخطي، وعدم وجود تضخيم. نظرًا للصعوبات في اكتشاف ecDNA من بيانات القراءة القصيرة، تم استبعاد العينات المصنفة ككسر-دمج-جسر أو معقد غير دوري. شملت التحليلات النهائية 232 عينة إيجابية لـ ecDNA (ecDNA +) و582 عينة سلبية لـ ecDNA (ecDNA -) بعد إزالة عينات النقائل وضمان تطابق أصول الأنسجة.
بالنسبة للمكون التجريبي، تم تصنيع قوالب oligos sgRNA المستهدفة لجين CHK1 وتم دمجها في متجه تعبير CRISPR يحتوي على بروتين فلوري أحمر (RFP). تم أيضًا استخدام بلازميد بروتين فلوري أخضر (GFP) غير مستهدف. تم نقل خلايا HeLa الإيجابية والسلبية لـ ecDNA إما مع sgCHK1-RFP أو sgNT-GFP، تلاها اختيار باستخدام البوروميسين. بعد 48 ساعة، تم تحليل نسبة خلايا RFP إلى خلايا GFP باستخدام تحليل التدفق لتقييم تأثير استهداف CHK1. تم تقديم تسلسلات sgRNA المحددة المستخدمة لاستهداف CHK1، مما يشير إلى نهج مركز للتحقيق في دور هذا الجين في سياق ecDNA.
مناقشة
في هذا القسم، يستكشف المؤلفون دور الحمض النووي خارج الصبغي (ecDNA) في النشاط النسخي وضغط التكرار (RS) في خلايا السرطان. باستخدام تسلسل الجري العالمي (GRO-seq) وتسلسل RNA المنزوع من RNA الريبوسومي (Ribo-Zero)، يُظهرون أن ecDNA، خاصة في خط خلايا سرطان القولون COLO320DM، يظهر زيادة تقارب أربعة أضعاف في RNA الناشئ وكثافة قراءة RNA المتراكمة مقارنةً بتضخيم MYC الصبغي في COLO320HSR. هذه الزيادة في النسخ شاملة عبر ecDNA، تؤثر ليس فقط على المناطق المشفرة ولكن أيضًا على النسخ غير المشفرة والنسخ التي لم يتم التعليق عليها سابقًا. كما يُظهر المؤلفون أن هذه النسخ المرتفعة تتوافق مع زيادة تراكم الحمض النووي أحادي السلسلة (ssDNA)، مما يشير إلى بيئة كروماتينية ملائمة لبدء النسخ.
تستكشف الدراسة أيضًا عواقب هذا النشاط النسخي، كاشفةً أنه يؤدي إلى زيادة ضغط التكرار بسبب الصراعات بين النسخ وآلية التكرار. يتجلى ذلك من خلال زيادة مستويات RPA2 الفسفورية (pRPA2-S33)، وهو علامة على RS، في الخلايا المحتوية على ecDNA. يجد المؤلفون أن خلايا الورم الحاملة لـ ecDNA تُظهر اعتمادًا كبيرًا على كيناز نقطة التفتيش في مرحلة S CHK1 لإدارة تلف الحمض النووي، مما يجعلها أكثر عرضة لمثبطات CHK1. تشير النتائج إلى أن استهداف CHK1 قد يكون استراتيجية علاجية واعدة لعلاج السرطانات الإيجابية لـ ecDNA، حيث تُظهر هذه الخلايا ضعفًا فريدًا بسبب صراعات النسخ والتكرار المرتفعة وتلف الحمض النووي الناتج.
DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-024-07802-5
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39506153
Publication Date: 2024-11-06
Author(s): Jun Tang et al.
Primary Topic: Cancer Genomics and Diagnostics
Overview
Extrachromosomal DNA (ecDNA) poses significant challenges in cancer treatment due to its role in promoting oncogene transcription and rapid genomic evolution, which contribute to treatment resistance and poor patient outcomes. Current therapies do not specifically target ecDNA. This study demonstrates that enhancing transcription-replication conflict can selectively eliminate ecDNA-containing cancers. The analysis reveals that ecDNA exhibits pervasive RNA transcription and associated single-stranded DNA, leading to increased transcription-replication conflicts and replication stress compared to chromosomal DNA. Notably, the mediator of DNA damage repair, pRPA2-S33, shows heightened localization on ecDNA, correlating with increased DNA double-strand breaks and activation of the S-phase checkpoint kinase, CHK1.
The research introduces a potent oral CHK1 inhibitor, BBI-2779, which preferentially induces cell death in ecDNA-containing tumors. In a gastric cancer model with FGFR2 amplification on ecDNA, BBI-2779 effectively suppresses tumor growth and overcomes acquired resistance to the pan-FGFR inhibitor infigratinib, leading to significant tumor regression in mice. The findings suggest that targeting transcription-replication conflict represents a promising strategy for ecDNA-directed therapies, exploiting synthetic lethality to treat various cancers characterized by ecDNA amplification.
Methods
In this study, a total of 1,921 samples from The Cancer Genome Atlas (TCGA) were categorized into five subtypes using the AmpliconSuite (AC) tool, specifically focusing on ecDNA, breakage-fusion-bridge, complex non-cyclic, linear, and no amplification. Due to difficulties in detecting ecDNA from short-read data, samples classified as breakage-fusion-bridge or complex non-cyclic were excluded. The final analysis included 232 ecDNA-positive (ecDNA +) and 582 ecDNA-negative (ecDNA -) samples after removing metastasis samples and ensuring matching tissue origins.
For the experimental component, CRISPR sgRNA template oligos targeting the CHK1 gene were synthesized and incorporated into a CRISPR expression vector containing a red fluorescent protein (RFP). A non-targeting green fluorescent protein (GFP) plasmid was also utilized. Both ecDNA + and ecDNA – HeLa cells were transduced with either the sgCHK1-RFP or sgNT-GFP constructs, followed by puromycin selection. After 48 hours, the ratio of RFP to GFP expressing cells was analyzed via flow cytometry to assess the impact of CHK1 targeting. The specific sgRNA sequences used for targeting CHK1 were provided, indicating a focused approach to investigate the role of this gene in the context of ecDNA.
Discussion
In this section, the authors investigate the role of extrachromosomal DNA (ecDNA) in transcriptional activity and replication stress (RS) in cancer cells. Using global run-on sequencing (GRO-seq) and ribosomal RNA-depleted RNA sequencing (Ribo-Zero), they demonstrate that ecDNA, particularly in the COLO320DM colorectal cancer cell line, exhibits a nearly four-fold increase in nascent RNA and accumulated RNA read density compared to the chromosomal MYC amplification in COLO320HSR. This increase in transcription is pervasive across the ecDNA, affecting not only coding regions but also non-coding and previously unannotated transcripts. The authors also show that this elevated transcription correlates with increased single-stranded DNA (ssDNA) accumulation, indicating a permissive chromatin environment for transcription initiation.
The study further explores the consequences of this transcriptional activity, revealing that it leads to heightened RS due to conflicts between transcription and replication machinery. This is evidenced by increased levels of phosphorylated RPA2 (pRPA2-S33), a marker of RS, in ecDNA-containing cells. The authors find that ecDNA-bearing tumor cells exhibit a significant reliance on the S-phase checkpoint kinase CHK1 to manage DNA damage, making them more susceptible to CHK1 inhibitors. The findings suggest that targeting CHK1 could be a promising therapeutic strategy for treating ecDNA-positive cancers, as these cells demonstrate a unique vulnerability due to their elevated transcription-replication conflicts and resultant DNA damage.