المشاع الإبداعي: النسبة 4.0 (CC-BY)
الوصول المفتوح
شاتاباييفا، إ. ORCID:https://orcid.org/0000-0001-91535198كالديبيكوف، د. ب. ORCID:https://orcid.org/0000-0002-7191-5465أولمانوفا، ل.، زهايسانباييفا، ب. أ.، مون، إ. أ.، كينيسوفا، ز. أ. ORCID:https://orcid.org/0000-0003-2768824Xكودايبرغينوف، س. إ. وخوتوريانسكي، ف. ف. ORCID:https://orcid.org/0000-0002-7221-2630 (2024) تعزيز الخصائص اللاصقة للمخاط للجيلاتين من خلال التعديل الكيميائي مع الأنهدريدات غير المشبعة. بيومكرومولكيولز. ISSN 1526-4602 doi: 10.1021/acs.biomac.3c01183 متاح على https://centaur.reading.ac.uk/115238/

من المستحسن الرجوع إلى نسخة الناشر إذا كنت تنوي الاقتباس من العمل. انظر الإرشادات حول الاقتباس.

لربط هذه المقالة برقم DOI:http://dx.doi.org/10.1021/acs.biomac.3c01183
الناشر: الجمعية الكيميائية الأمريكية

اتفاقية المستخدم النهائي.

الأرشيف المركزي في جامعة ريدينغ
مخرجات أبحاث ريدينغ على الإنترنت

استشهد بهذا:https://doi.org/10.1021/acs.biomac.3c01183
اقرأ على الإنترنت
تم التنزيل عبر جامعة ريدينغ في 23 فبراير 2024 الساعة 14:53:45 (UTC).
انظرhttps://pubs.acs.org/sharingguidelinesلخيارات حول كيفية مشاركة المقالات المنشورة بشكل قانوني.

الجيلاتين هو بوليمر حيوي طبيعي مشتق من الكولاجين من خلال التحلل المائي الجزئي والت denaturation الحرارية. يتم استخراج الكولاجين نفسه من العظام والغضاريف والأنسجة الضامة وجلود الحيوانات المذبوحة وقشور الأسماك. تعتبر الجيلاتين واحدة من أهم وأكثر البوليمرات المتعددة الاستخدامات في الصناعة بسبب خصائصها الفيزيائية والكيميائية الفريدة. تعتمد خصائص الجيلاتين على طريقة إنتاجها، والتي يمكن أن تشمل المعالجة الحمضية أو القلوية. الجيلاتين من النوع A المتاحة تجارياً، والتي يتم إنتاجها عبر العملية الحمضية، لها نقطة تعادل كهربائي (IEP) عند بينما يظهر الجيلاتين من النوع B، الذي يتم تصنيعه من خلال العملية القلوية، نقطة التركيز الكهربائي المعكوس عند pH 4.5-5.5. كمواد حيوية قائمة على البروتين، يتمتع الجيلاتين بتوافق حيوي ممتاز، وقابلية للتحلل البيولوجي، وعدم السمية، وعدم المناعية. وقد تم اعتماده كمواد معترف بها بشكل عام على أنها آمنة (GRAS) من قبل إدارة الغذاء والدواء الأمريكية (FDA). يذوب الجيلاتين بسهولة في الماء الدافئ عند ولديه القدرة على تشكيل تقاطعات جسدية-
الهيدروجيلات القابلة للعكس الحراري المرتبطة عند التبريد تحت ج. بالإضافة إلى ذلك، فإنه يظهر نقطة انصهار قريبة من درجة حرارة الجسم. هذه الخصائص المميزة هي العوامل الرئيسية التي تدفع إلى استخدامه الواسع في الصناعات الصيدلانية والغذائية والتجميلية. يستخدم الجيلاتين عادة كمكون رئيسي في العديد من التركيبات، بما في ذلك الكبسولات الصلبة واللينة، تحاميل مهبلية ومستقيمية كشبكات في هندسة الأنسجة والطب التجديدي، كحامل في توصيل الأدوية (مثل الكريات الدقيقة)، وفي العديد من التطبيقات المتعلقة بالصحة الأخرى.

تُعرّف الالتصاق المخاطي بأنه قدرة المواد على الالتصاق بالأغشية المخاطية في الجسم لفترة طويلة من الزمن. تشمل الطرق المعتمدة لإدارة الأدوية عبر الأغشية المخاطية العين (القرنية والملتحمة)، الأنف، الفم (الخد واللسان)، الجهاز الهضمي، المستقيم، المهبل، والداخل المثاني. تقدم توصيل الأدوية عبر الأغشية المخاطية عدة مزايا مهمة، مثل سهولة إدارة شكل الجرعة وطبيعته غير الغازية، وزيادة مدة الإقامة على السطح المخاطي، وتحسين توافر الدواء الحيوي، وتجنب الأيض الكبدي الأول، وتقليل تكرار الجرعات، وإمكانية إنهاء العلاج بسرعة عند الحاجة.

تُستخدم العديد من البوليمرات اللاصقة المخاطية من الجيل الأول (التقليدية) تقليديًا في أشكال الجرعات المختلفة لتوصيل الأدوية عبر الأغشية المخاطية. تشمل هذه الفئة من المواد اللاصقة البوليمرات القابلة للذوبان في الماء من أصول طبيعية وصناعية، مثل الكيتوزان، وجيلان الصمغ، والألجينات، وبوليمرات الكربوبول، ومشتقات السليلوز (مثل السليلوز ميثيل الكربوكسي، وهيدروكسي بروبيل ميثيل السليلوز، وغيرها). تحدث الالتصاق المخاطي في هذه أنظمة توصيل الأدوية من خلال تفاعلات فيزيائية متنوعة (رابطة غير محددة) بين الجزيئات الكبيرة وبروتينات الميوسين الموجودة على الأسطح المخاطية. تشمل هذه التفاعلات بشكل أساسي قوى غير تساهمية، مثل الروابط الهيدروجينية، والجذب الكهروستاتيكي، وقوى فان دير فالس، والتفاعلات الكارهة للماء، وتشابك السلاسل/ الانتشار. عمومًا، تُظهر البوليمرات متعددة الشحنات خصائص لاصقة مخاطية أفضل مقارنة بالبوليمرات غير الأيونية. علاوة على ذلك، قد تختلف آليات التصاق هذه المواد بالأسطح المخاطية اعتمادًا على طبيعة شكل الجرعة. على سبيل المثال، تتأثر خصائص الالتصاق لأشكال الجرعات الصلبة (مثل الأقراص) بعملية الترطيب، بينما تتأثر احتفاظ التركيبات السائلة على الأسطح المخاطية بشكل أكبر بخصائصها الريولوجية.

في العقود القليلة الماضية، تم استكشاف طرق كيميائية مختلفة لتصميم البوليمرات وتركيباتها بخصائص لاصقة محسّنة. يمكن تحقيق هذا التحسين من خلال وظيفة البوليمرات المحبة للماء مع مجموعات لاصقة محددة قادرة على تشكيل روابط تساهمية مع الأنسجة المخاطية تحت الظروف الفسيولوجية. تمثل البوليمرات المحتوية على ثيول، المعروفة أيضًا باسم “ثيومرات”، واحدة من التقدمات البارزة في المواد اللاصقة المخاطية من الجيل الثاني، التي رائدها برنكوبيك شنورش وزملاؤه. تم تعديل هذه البوليمرات من خلال إدخال مجموعات وظيفية ثيول (سلفهيدريل) على سلاسلها الجانبية. تشكل البوليمرات الثيولية جسور ثنائي الكبريتيد من خلال تفاعلات تساهمية (عبر تفاعلات الأكسدة) مع المجالات الفرعية الحاملة للسيستين من بروتينات الغليكوبروتين المخاطية الموجودة على الأسطح المخاطية. يؤدي ذلك إلى تعزيز قدراتها على الالتصاق بالمخاط مما ينتج عنه زيادة مدة بقاء الدواء في موقع التطبيق. ومع ذلك، من الجدير بالذكر أن البوليمرات المحتوية على ثيول عرضة للأكسدة، مما يمكن أن يؤدي إلى تداخل غير مرغوب فيه بين البوليمرات.

تم اقتراح استراتيجيات متنوعة مؤخرًا لتعزيز الخصائص اللاصقة للمركبات البوليمرية المحبة للماء من خلال إدخال مجموعات لاصقة مثل الأكرول. ميثاكريلويل ماليميد كاتيكول بورونات و -هيدروكسي (سلفو) سوكسينيميد إستر. البوليمرات المعالجة بالأكريلويل، التي اقترحها لأول مرة فريق البحث بقيادة بيانكو-بيليد، تم تسليط الضوء على أنها فئة جديدة من المساعدات الصيدلانية مع خصائص لاصقة محسّنة بشكل كبير مقارنةً بنظيراتها غير المعدلة. كما كانت مجموعة خوتوريانسكي رائدة في استخدام المواد المشتقة من الميثاكريلويل والماليميد لتصميم أشكال الجرعات مع تحسينات.
خصائص الالتصاق المخاطي. وتشمل تطوير النانو هلام، الحويصلات الدهنية جزيئات نانوية تركيبات سائلة، الهلام في الموقع وأقراص مطلية بالرش. تستطيع هذه المجموعات الوظيفية غير المشبعة تشكيل روابط تساهمية مع المجالات الفرعية الغنية بالسيستين من بروتينات الغليكوزيل عبر تفاعلات الإضافة من نوع مايكل بتقنية ثيول-إين لتحقيق روابط لاصقة قوية. علاوة على ذلك، فإن الجزيئات الكبيرة المفعلة بـ (ميث) أكريلويل وماليميد لديها استقرار أفضل ضد الأكسدة دون ميل للتشابك بين الجزيئات أو داخلها على عكس البوليمرات المحتوية على ثيول. مؤخرًا، أظهرت الناقلات النانوية المفعلة بالألدهيد أيضًا القدرة على الالتصاق بقوة ببطانة المثانة البولية للخنازير وبالغشاء المخاطي الأنفي للأغنام من خلال تشكيل روابط إيمين مع مجموعات الأمين الأولية الموجودة على سطح الأنسجة المخاطية عبر كيمياء قاعدة شيف.

تقليديًا، تم اعتبار الجيلاتين بوليمرًا ذو خصائص لاصقة مخاطية ضعيفة. تُعزى قدرات الالتصاق للجيلاتين بشكل أساسي إلى طبيعته الأمفوتيرية، مما يؤدي إلى تفاعلات كهربائية ضعيفة مع الأسطح المخاطية مقارنةً بالتفاعلات التساهمية القوية. كانت النتائج المتعلقة بالخصائص الحيوية/المخاطية للجيلاتين موضوع نقاش. وقد أفادت عدة دراسات أن الجيلاتين يظهر لاصقية مخاطية ملائمة، أو أن إضافة الجيلاتين تحسن الخصائص اللاصقة للأنظمة المدروسة إلى حد ما. ومع ذلك، تشير معظم الدراسات إلى أن الجيلاتين النقي يظهر خصائص لاصقة ضعيفة، و/أو أن وجوده لا يساهم بشكل كبير في لزوجة التركيبات. ومع ذلك، يحتوي الجيلاتين على مواقع تفاعلية داخل هيكله الجزيئي، مثل مجموعات الأمين، والمجموعات الكربوكسيلية، ومجموعات الهيدروكسيل، مما يوفر فرصًا للتزاوج مع المجموعات الوظيفية التي يمكن أن تؤدي إلى تغييرات في خصائصه الفيزيائية والكيميائية. مراجعة حديثة من أحمدي وأبو سمه تمت مناقشة استراتيجيات مختلفة لتعزيز الخصائص اللاصقة للمخاط للجيلاتين. إحدى الطرق المقترحة هي إدخال مجموعات الميثاكريلويل في الجيلاتين؛ ومع ذلك، حسب علمنا، لا توجد أدلة قاطعة تدعم تأثيرها الإيجابي على الخصائص اللاصقة للمخاط.

في الدراسة الحالية، نبلغ عن تعديل الجيلاتين من خلال التفاعلات مع ثلاثة أنهدريدات غير مشبعة (الكراتون، الإيتاكون، والميثاكريليك) من أجل تعزيز خصائصه اللاصقة للمخاط. تم توصيف مشتقات الجيلاتين الناتجة بشكل كامل باستخدام تمت دراسة تأثير التعديل الكيميائي على النقطة المعزولة باستخدام قياسات اللزوجة والحركة الكهربائية. تم استخدام مطيافية الرنين المغناطيسي النووي (NMR) ومطيافية الأشعة تحت الحمراء (FTIR) واختبار TNBSA اللوني. تطور التخزين ( ) والخسارة ( تم استخدام ) المودولي ( لتحديد نقاط الجلطة الحرارية القابلة للعكس لكل من الجيلاتين المعدل وغير المعدل. كما تم تقييم الخصائص السمية لهذه المشتقات باستخدام اختبار تهيج الغشاء المخاطي للرخويات (SMIT) واختبار MTT في خلايا خط fibroblasts الرئوية البشرية. تم إعداد شكلين مختلفين من الجرعات مثل الجل الفيزيائي والميكروكريات المجففة بالرش وتم تقييم احتفاظها على الأسطح المخاطية باستخدام الغشاء المخاطي المهبلي الخنزيري والغشاء المخاطي الأنفي للأغنام.

2.1. المواد. أنهدريد الكروتون (CA)، أنهدريد الإيتاكون (IA)، أنهدريد الميثاكريليك (MA)، الجيلاتين من النوع A من جلد الخنازير (قوة الجل) بلوم)، كلوريد البنزالكونيوم (BAC)، أكسيد الديوتيريوم، 3-(4،5-ثنائي ميثيل الثيازول-2-يل)-2،5-ثنائي الفينيل تيترازوليوم بروميد (مادة MTT)، ملح الفلورسئين الصوديوم (NaFl)، محلول الجلutaraldehyde ( في درجة II)، جلايسين، حمض الهيدروكلوريك 1 م
محلول، بيكربونات الصوديوم، دوديكانول سلفات الصوديوم (SDS)، حمض 2،4،6-ثلاثي نيتروبنزين سلفونيك (TNBSA، في ) و صبغة التريبان الأزرق ( تم شراء المحلول من سيغما-ألدريتش (غيلينغهام، المملكة المتحدة). ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)، وسط دلبوكو المعدل (DMEM)، مصل جنين البقر (FBS)، بنسلين-ستربتوميسين ( أقراص محلول ملحي معزز بالفوسفات (PBS) (التي تم استخدامها لتحضير 100 مل من محلول PBS في ماء منزوع الأيونات، pH 7.40، هيدروكسيد الصوديوم، وتربسين-EDTA تم شراء المحلول من شركة فيشر ساينتيفيك (لوغبره، المملكة المتحدة). كانت جميع المواد الكيميائية الأخرى من الدرجة التحليلية واستخدمت دون مزيد من التنقية. تم شراء أنابيب الغسيل مع حد قطع الوزن الجزيئي 1214 كيلودالتون من شركة ميديسيل ميمبرينز المحدودة (لندن، المملكة المتحدة). تم استخدام الماء المقطر طوال التجارب التي تتضمن المحاليل المائية.
2.2. تخليق مشتقات الجيلاتين. تم تعديل الجيلاتين كيميائيًا باستخدام أنهدريدات غير مشبعة مختلفة وفقًا للإجراءات الموصوفة سابقًا مع بعض التعديلات. باختصار، الجيلاتين تم إذابته في 100 مل من محلول PBS (رقم الهيدروجيني 7.40) في حتى تشكلت محلول شفاف متجانس أثناء التحريك. بعد ذلك، أضيفت كميات مرغوبة من أنهدريد الكروتون، أو أنهدريد الإيتاكون، أو أنهدريد الميثاكريليك بالتنقيط إلى محاليل الجيلاتين وتفاعلت لمدة 12 ساعة عند تحت التحريك المستمر لإنتاج مشتقات الجيلاتين المقرونة بالكروتون، أو الإيتاكون، أو الميثاكريلات (المختصرة بـ Gel-CA و Gel-IA و Gel-MA، على التوالي). تم الحفاظ على الرقم الهيدروجيني عند 8.50 طوال التفاعل عن طريق إضافة محلول NaOH بتركيز 4 م. بعد التخفيف بإضافة 50 مل من محلول PBS (الرقم الهيدروجيني 7.40) لإيقاف التفاعل، تم تنقية كل منتج ناتج عن طريق الدياليسيس ضد الماء منزوع الأيونات (5 لترات؛ تم تغيير الماء 8 مرات) لمدة 48 ساعة في الظلام لإزالة الأملاح، والأنهدريدات غير المتفاعلة، والأحماض الناتجة. أخيرًا، تم تجفيف المحلول بالتجميد، مما شكل منتجًا أبيض يشبه الإسفنج، وتم ختمه وتخزينه في الفريزر حتى الاستخدام لاحقًا. تم تلخيص البيانات حول الكميات المتنوعة من الأنهدريدات الموجودة في خليط التفاعل الأولي في الجدول S1 في المعلومات الداعمة.
2.3. تحضير الجسيمات الدقيقة المجففة بالرش. تم إذابة عينات الجيلاتين المعدلة كيميائيًا وغير المعدلة (0.5 جرام) في البداية في 100 مل من المحاليل المائية التي تحتوي على ملح فلوريسئين الصوديوم ( ) في لمدة 60 دقيقة مع التحريك بسرعة 400 دورة في الدقيقة. في تحضير منفصل، من تم إضافة محاليل الجلوتارالدهيد المائية إلى المحاليل القائمة على الجيلاتين وتم تحريكها لمدة 60 دقيقة أخرى بسرعة 400 دورة في الدقيقة. بعد ذلك، تم تجفيف المحاليل الناتجة باستخدام جهاز تجفيف الرذاذ الصغير Büchi Mini Spray Dryer B-290 (Büchi Labortechnik AG، فلافيل، سويسرا) المزود بجهاز إزالة الرطوبة S-396 لإنتاج جزيئات ميكروية قائمة على الجيلاتين محملة بـ NaFl، سواء كانت متشابكة أو غير متشابكة. تم توصيل المحاليل إلى الفوهة بمعدل تغذية باستخدام مضخة بيرستالتية ثم تم تجفيفها بالرش عند درجة حرارة المدخل ودرجة حرارة المخرج . كمعيار، تم ضبط معدل الشفط على لزيادة معدل الفصل في السايكلون؛ تم استخدام النيتروجين المضغوط لتفريق السائل إلى قطرات دقيقة. تم جمع المنتجات الناتجة من التجفيف بالرش، وإغلاقها لحمايتها من إعادة الترطيب، وتغليفها بورق الألمنيوم، وتخزينها في الفريزر حتى إجراء اختبارات إضافية.
2.4. التوصيف. 2.4.1. قياس درجة التFunctionalization. تم تأكيد تعديل الجيلاتين باستخدام طيف الرنين المغناطيسي النووي. عشرون من الجيلاتين ومشتقاته (Gel-CA و Gel-IA و Gel-MA) تم إذابتها في حرارة دافئة تم تسجيل طيف NMR للعينات باستخدام جهاز مطياف NMR Bruker Avance III بتردد 500 ميجاهرتز (Bruker UK Ltd.، كوفنتري، المملكة المتحدة) في مع 128 مسح لكل طيف. قبل التفسير، تم تصحيح الطور لكل طيف ناتج. تم تطبيق تصحيح القاعدة قبل دمج الإشارات ذات الاهتمام.
تم استخدام تحليل الرنين المغناطيسي النووي (NMR) لتحديد درجة التFunctionalization (DoF) لمشتقات الجيلاتين بطريقة مشابهة لما تم وصفه سابقًا. تم تقدير نسبة دمج المجموعات غير المشبعة من خلال مقارنة شدة القمم الناتجة عن الروابط المزدوجة بتلك الخاصة بالبقايا العطرية الموجودة في سلاسل الجيلاتين الجانبية.

تم استخدام اختبار اللونيمتري لحمض 2،4،6-ثلاثي نيترو بنزين سلفونيك (TNBSA)، الذي تم تطويره في الأصل بواسطة حبيب، لتحديد
المجموعات الأمينية الحرة المتبقية بعد تحويل الجيلاتين مع تغييرات طفيفة. باختصار، الجيلاتين ومشتقاته تم إذابتها بشكل منفصل في محلول بيكربونات الصوديوم 0.1 م (رقم الهيدروجيني 8.50). ثم، من محلول TNBSA (محضر بتركيز 0.1 م) تم إضافة (المخزن المؤقت) إلى من كل عينة اختبار وحلها وتم حضنها في لمدة ساعتين مع التحريك برفق. بعد ذلك، من سلفات دوديسيل الصوديوم (SDS) و تم إضافة 1 م HCl إلى كل عينة اختبار لإيقاف التفاعل. ثم تم قياس امتصاص كل محلول عند 335 نانومتر وتم تحديد تركيز الأمينات الأولية الحرة باستخدام منحنى قياسي للجليسين (انظر الشكل S1 في المعلومات الداعمة). تم تحديد كمية المجموعات الأمينية الحرة لتكون 0.434 مللي مول لكل 1 جرام من الجيلاتين. تم حساب درجة الحرية عن طريق طرح كمية الأمينات الحرة المتبقية. المجموعات في كل جيلاتين معدل من كمية الحرة مجموعات في الجيلاتين الأصلي. تم استخدام مطياف UV-vis من شيمادزو UV-1900i (كيوتو، اليابان) لتسجيل طيف الامتصاص UV-vis للعناصر. تم إجراء جميع التجارب مع تقدير درجة الحرية في ثلاث نسخ.
2.4.2. مطيافية تحويل فورييه بالأشعة تحت الحمراء (FTIR). تم تسجيل طيف FTIR للجيلاتين غير المعدل والمعدل باستخدام مطياف FTIR Nicolet iS10 (Thermo Scientific، المملكة المتحدة) مع ملحق iTX للانعكاس الكلي المخفف (ATR) المزود بكريستال ماسي. تم جمع الأطياف من متوسط 32 مسحًا بين 4000 و ، باستخدام وضع النفاذية مع دقة طيفية قدرها .
2.4.3. المجهر الإلكتروني الماسح (SEM). تم فحص شكل وحجم الجسيمات الدقيقة المجففة بالرش المستندة إلى الجيلاتين ومشتقاته المعدلة (Gel-CA و Gel-IA و Gel-MA) باستخدام مجهر إلكتروني ماسح من نوع Zeiss Crossbeam 540 (Carl Zeiss Microscopy GmbH، يينا، ألمانيا) عند جهد تسريع قدره 5 كيلوفولت. تم طلاء العينات بالذهب قبل التصوير. ثم تم تحليل الصور الملتقطة باستخدام برنامج ImageJ (NIH، الولايات المتحدة الأمريكية) لتحديد متوسط قطر الجسيمات الدقيقة.
2.4.4. تحديد النقطة المعزولة كهربائياً (IEP). تم تحديد النقاط المعزولة كهربائياً للجيلاتين المعدل وغير المعدل باستخدام تقنية اللزوجة التقليدية. وحركة الكهربية باستخدام جهاز Zetasizer Nano-ZS90 (مالفرن إنسترومنتس، ورسيسترشاير، المملكة المتحدة)، على التوالي، مع تغيير درجة حموضة المحلول. تم إجراء جميع القياسات في ثلاث نسخ. . باختصار، تم تحضير محلول (w/v) من الجيلاتين أو مشتقاته في ماء منزوع الأيونات عند وتم التحريك حتى الذوبان الكامل. تم تحديد اللزوجة النوعية باستخدام مقياس لزوجة من نوع أوستوالد (بقطر شعري يبلغ 0.86 مم) ويتم التعبير عنها كنسبة لزمن التدفق ( ) إلى الماء ( ):

نقطة التساوي الكهربائي (IEP) تم تحديد ( ) لكل عينة بناءً على الرقم الهيدروجيني الذي أظهرت فيه محلول البوليمر أدنى قيمة لزوجة، مما يشير إلى أن الشحنة الإجمالية للجزيئات الكبيرة قريبة من الصفر عند هذا الرقم الهيدروجيني المحدد.

في تجارب الحركة الكهربائية، تم استخدام معامل انكسار الضوء النموذجي للبروتين 1.45 وامتصاص 0.001 لجميع القياسات في وضع الجهد الزتاوي. تم استخدام اللزوجة (0.8872 سنتي بواز) ومعامل الانكسار (1.33) للماء كمعلمات للتشتت. تم تحليل كل عينة ثلاث مرات. تم معالجة النتائج باستخدام نموذج سمولوشوفسكي. )، ومتوسط حركة الكهربية المتوسطة تم حساب قيم الانحراف المعياري. تم رسم منحنى الحركة الكهربائية مقابل الرقم الهيدروجيني لكل عينة اختبار والنقطة التي يتقاطع فيها المنحنى مع صفر حركة اعتُبرت كـ .
2.4.5. الدراسات الريولوجية. جهاز قياس اللزوجة TA DHR-1 (TA Instruments، نيو كاسل، ديلاوير، الولايات المتحدة الأمريكية) مزود بلوحة بيلتير ذات درجة حرارة متغيرة وجيومتري مخروط-قرص من الفولاذ المقاوم للصدأ. زاوية المخروط ) تم استخدامها لإجراء التجارب الريولوجية. كانت التجارب تهدف إلى تحديد درجات حرارة الجلطة والانصهار لعينات الجيلاتين. في البداية، كانت العينات ( تم تحقيق التوازن في المحاليل المائية عند لمدة 5 دقائق. بعد ذلك، تم تبريد كل عينة من 40 إلى ، تبع
من خلال اختبارات سحب درجة الحرارة من 0 إلى (مسخن) ثم تم تقليله مرة أخرى إلى (مبرد) بمعدل مسح . خلال هذه الاختبارات، التغيرات في معامل التخزين ( ) ومعامل الفقدان ( تم تسجيل ( ) كدالة لدرجة الحرارة عند إجهاد مطبق قدره وتردد (ما يعادل 1.6 هرتز). تم استخدام غطاء فخ المذيب لضمان درجة حرارة موحدة ومنع تبخر الخليط. تم حساب النتائج التي تم الحصول عليها كمتوسط قيم 3 قياسات.
2.5. تقييم السمية. 2.5.1. اختبار حيوية الخلايا في المختبر. تم زراعة خط خلايا الألياف الرئوية البشرية (HPF) في وسط ديلبيكو المعدل (DMEM) المدعوم بـ مصل الجنين البقري (FBS) و ستربتوميسين/بنسلين عند في حاضنة مرطبة مع . عند الوصول إلى التجمع في قوارير زراعة الخلايا T-25، تم جمع الخلايا باستخدام محلول التربسين-EDTA، مزروع في أطباق 96 بئر بكثافة خلايا لكل بئر، وتم الاحتفاظ بها طوال الليل تحت ظروف زراعة قياسية (37 و في الحاضنة المرطبة) لتعزيز ارتباط الخلايا. ثم تم معالجة الخلايا بمحلولات الجيلاتين المعدلة وغير المعدلة (Gel-CA و Gel-IA و Gel-MA) بتركيزات تبلغ 1.3 و في وسط نمو الخلايا. ثم تم حضن الخلايا لمدة 24 ساعة عند في بيئة رطبة الحاضنة. خلايا غير معالجة و تم استخدام محلول DMSO كتحكم سلبي وإيجابي على التوالي. تم استخدام التحكم الإيجابي للتحقق من نشاط الاختبار. بعد التعرض لمحلولات الجيلاتين ومشتقاته، تلقى كل بئر محلول MTT في الظلام، وتمت حضانة الخلايا لمدة 4 ساعات أخرى عند في بيئة رطبة الحاضنة. تم إذابة بلورات الفورمازان التي تم إنتاجها خلال فترة الحضانة عن طريق إضافة ( ) كبريتات الدوديسيل الصوديوم (SDS). تم قياس الامتصاص عند 570 نانومتر باستخدام قارئ الميكرو بلايت Varioskan (ثيرمو ساينتيفيك، الولايات المتحدة الأمريكية). تم حساب نسبة البقاء باستخدام المعادلة التالية:

2.5.2. اختبار تهيج الغشاء المخاطي للرخويات. تم إجراء اختبار تهيج الغشاء المخاطي للرخويات (SMIT) في الجسم الحي باستخدام المنهجية التي تم وصفها سابقًا من قبل مجموعة بحثنا. تم جمع حلزونات Arion lusitanicus في حديقة هاريس (ريدينغ، المملكة المتحدة) وتم الاحتفاظ بها في حاويات بلاستيكية مهواة في درجة حرارة الغرفة. تم إطعامها بالخس والملفوف والخيار لمدة 48 ساعة. بعد ذلك، تم فحص بطانة جسم كل حلزون بعناية، وتم استخدام الحلزونات التي لا تحتوي على إصابات ماكروسكوبية والتي تتميز بوجود نتوءات واضحة وسطح قدم. كانت الحلزونات التي تزن ثم تم اختيارها واحتفظ بها بشكل فردي في قوارير زجاجية سعة 2 لتر مبطنة بمنشفة ورقية مبللة بـ 20 مل من محلول PBS (pH 7.40) وتركها في درجة حرارة الغرفة لمدة 48 ساعة قبل بدء التجارب. كانت القوارير مغطاة بغلاف بلاستيكي مثقوب لضمان تبادل الهواء. ثم تم وزن كل حلزون بشكل فردي ووضعه في طبق بتري بلاستيكي بحجم 90 مم مبطن بورق فلتر ووتمان مبلل بـ 2 مل من محلول العينة. تضمنت عينات الاختبار محلول PBS (التحكم السلبي)، كلوريد البنزالكونيوم (التحكم الإيجابي) المحضر في PBS، بالإضافة إلى محاليل الجيلاتين المعدلة وغير المعدلة التي تم إعدادها في PBS. بعد 60 دقيقة من الاتصال مع عينات الاختبار، تم إزالة الحلزونات من أطباق بتري، وغسلها بـ 10 مل من PBS، وتم مسحها برفق بمنشفة ورقية، ثم تم إعادة وزنها. تم تقدير إنتاج المخاط (MP) بناءً على فقدان وزن جسم الحلزون وتم حسابه باستخدام المعادلة التالية:

أين و هي أوزان الحلزونة قبل وبعد التعرض للمواد المختبرة، على التوالي. تم التعبير عن نتائج التجارب كمتوسط قيم الانحراف المعياري ( ) وتم تقييمه إحصائيًا.
2.6. دراسات الاحتفاظ خارج الجسم على الغشاء المخاطي المهبلي للخنازير والغشاء المخاطي الأنفي للأغنام. 2.6.1. تصميم شكل الجرعة النموذجي. 0.1 تم تحضير المحلول في ماء منزوع الأيونات واستخدم كمركب دوائي نموذجي. ثم، الهلام وطرحه الكروتونوي (Gel-CA) والإيتاكونوي (Gel-IA) والميثاكريلو-
تم إذابة مشتقات الجيلاتين المعدلة (Gel-MA) بشكل منفصل في 10 مل من المحاليل المائية لـ NaFl. تم تحريك الخلطات لمدة 12 ساعة في درجة حرارة الغرفة حتى تشكلت محاليل متجانسة، وتم تغطيتها بورق الألمنيوم، وتخزينها في الثلاجة للاستخدام لاحقًا. تم استخدام هذه التركيبات المعتمدة على الجيلاتين المعدلة وغير المعدلة المحملة بـ NaFl في دراسات الالتصاق المخاطي في المهبل الخنزيري.

يتم وصف تحضير الجسيمات الدقيقة المجففة بالرش المحملة بـ NaFl المستندة إلى الجيلاتين ومشتقاته في القسم 2.3. تم استخدام هذه الجسيمات الدقيقة في دراسات الالتصاق المخاطي في أنف الأغنام. يتم وصف التركيبات لتحضير محاكاة السائل المهبلي (VFS؛ pH 4.0) والسائل الأنفي الاصطناعي (ANF؛ pH 5.80) المستخدمة لغسل الأسطح المخاطية في الجداول S2 و S3 في المعلومات الداعمة، على التوالي. تم الحفاظ على محاليل VFS و ANF عند خلال تجارب الالتصاق المخاطي باستخدام حمام مائي.
2.6.2. تحضير الأنسجة. تم استلام أنسجة المهبل من الخنازير ورؤوس الأغنام من مسالخ P.C. Turner (فارنبورو، المملكة المتحدة) مباشرة بعد ذبح الحيوانات، وتم تعبئتها ونقلها إلى المختبر في حاويات بلاستيكية باردة، واستخدامها خلال 24 ساعة من جمعها. تم تشريح أنسجة المهبل بعناية (مع تجنب الاتصال بالغشاء المخاطي الداخلي) باستخدام شفرات حادة يمكن التخلص منها للحصول على الأقسام.

تم استخراج الأنسجة المخاطية للحاجز الأنفي بعناية من رؤوس الأغنام باستخدام مقصات قطع العظام، ثم تم قطعها إلى قطع مربعة سم مع شفرات حادة قابلة للتخلص منها.
2.6.3. تقنية التدفق المستمر. تم إجراء تجارب لتقييم احتفاظ الغشاء المخاطي بالتركيبات المعتمدة على الجيلاتين المعدل وغير المعدل على أنسجة المهبل الخنازير والأنف الأغنام خارج الجسم باستخدام طريقة التدفق المستمر المعروفة مع تعديلات طفيفة تتعلق بالكشف الفلوري. في البداية، تم تثبيت نسيج مهبلي أو أنفي مقطوع حديثًا على شريحة زجاجية للميكروسكوب مع الجانب المخاطي موجهًا لأعلى، ثم وُضِع على ركيزة مثبتة بزاوية وتم شطفها مسبقًا بـ 1 مل من محلول VFS أو ANF، على التوالي، قبل بدء كل اختبار لالتصاق المخاط الخارجي.

تم التقاط صور الفلورية لسطح الغشاء المخاطي لأنسجة المهبل باستخدام مجهر ستيريو Leica MZ10F (Leica Microsystems، المملكة المتحدة) مزود بكاميرا رقمية Leica DFC3000G مزودة بفلتر بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) (أزرق، ) في تكبير، مع زمن تعرض قدره 10 مللي ثانية و الكسب. في البداية، تم الحصول على صور لأنسجة المهبل الفارغة لتحديد شدة الفلورسنت الخلفية لكل عينة قبل إعطاء المادة الاختبارية. بعد ذلك، تم أخذ عينات مسبقة التسخين ( ) من أي مشتقات الجيلاتين، Gel-CA، Gel-IA، أو Gel-MA المحضرة في ماء منزوع الأيونات يحتوي على أو تحكم في تم إيداع المحلول على السطح المخاطي. ثم تم ري العينات بشكل متكرر بمحلول VFS (رقم الهيدروجين 4.0) بمعدل تدفق باستخدام مضخة حقن. تم الحصول على صور المجهر الفلوري لسطح الغشاء المخاطي لكل عينة مهبلية في نقاط زمنية محددة مسبقًا ثم تم تحليلها باستخدام برنامج ImageJ (NIH، الولايات المتحدة الأمريكية) من خلال قياس كثافة البكسل بعد كل غسلة مع VFS. تم طرح كثافة البكسل للعينات العارية (الغشاء المخاطي المهبلي بدون مادة اختبار فلورية) من كل قياس وتم تحويل البيانات إلى قيم كثافة طبيعية باستخدام المعادلة التالية:

أين هو شدة الفلورسنت الخلفية لعينة نسيج معينة (نسيج فارغ)؛ يشير إلى شدة الفلورية الأولية لتلك العينة (عينة الأنسجة التي تم تطبيق مادة فلورية لاصقة عليها قبل بدء أول غسيل؛ وقد اعتُبر هذا كنقطة زمنية صفرية مع شدة الفلورية)؛ و يمثل شدة الفلورة لعينة الأنسجة تلك مع المادة الفلورية اللاصقة بعد كل دورة غسيل. ثم تم تحويل هذه الشدات الفلورية إلى قيم % احتفاظ مخاطي.

بالإضافة إلى ذلك، تم تقييم أداء اللصق المخاطي للجزيئات الدقيقة القائمة على الجيلاتين المعدلة وغير المعدلة المجففة بالرش باستخدام

يرجى ملاحظة أن الهيكل التخطيطي يعرض فقط احتمالين لتفاعل الأنهيدريد مع الأمين الأولي. مجموعات من الليسين/الهيدروكسيليسين (وهي الجوانب التفاعلية) في هيكل الجيلاتين. في الواقع، يمكن أن يتفاعل أيضًا مع أي مجموعات هيدروكسيل (-OH) موجودة في الجيلاتين بسبب زيادة وقت التفاعل وقد يؤدي ذلك إلى زيادة درجة الحرية.
نفس تقنية التدفق من خلال الزجاج كما هو موصوف أعلاه مع بعض التعديلات. تم استخدام عينات من الجسيمات الدقيقة غير المتشابكة فقط في هذه التجربة. حوالي 100 ملغ من الجسيمات الدقيقة القائمة على الجيلاتين (تتضمن الجيلاتين، Gel-CA، Gel-IA، أو Gel-MA) تحتوي على 1 تم تطبيقها على الغشاء المخاطي الأنفي للأغنام خارج الجسم، والذي كان مثبتًا بالفعل على شريحة زجاجية، موضوعة على أنبوب طرد مركزي من نوع فالكون مقطوع إلى نصفين مائل بزاوية تم بعد ذلك تقطير محلول ANF (pH 5.80) على الغشاء المخاطي الأنفي بمعدل تدفق باستخدام مضخة حقن (كان إجمالي وقت الغسيل 30 دقيقة). تم تعيين معدل التدفق المذكور عمدًا أعلى من معدل إنتاج السوائل الأنفية الفسيولوجي لأسباب عملية. تم إجراء هذا التعديل لتسريع التجارب وضمان إمكانية إجرائها ضمن إطار زمني معقول. بعد ذلك، تم جمع محلول ANF المتدفق عبر الغشاء المخاطي الأنفي في فترات زمنية محددة مسبقًا. تم أخذ عينات من سلسلة من محاليل ANF المجمعة بعد كل دورة غسيل للتحليل لتحديد كمية الجسيمات الدقيقة المحملة بـ NaFl التي تم غسلها من سطح الغشاء المخاطي. تم إجراء التحليل باستخدام مقياس الطيف الفلوري Varian Cary Eclipse (سانتا كلارا، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية) في و تمت عملية التقدير بناءً على منحنى قياسي لـ NaFl (انظر الشكل S2 في المعلومات الداعمة) من خلال الحسابات، التي وفرت كمية التركيبات المحتفظ بها على الغشاء المخاطي الأنفي للأغنام.
2.6.4. طريقة الشد (الانفصال). تم استخدام جهاز تحليل القوام TA.XT Plus (Stable Micro Systems Ltd.، ساري، المملكة المتحدة) الذي يعمل في وضع اختبار اللصق لتقييم أداء اللصق المخاطي للجزيئات الدقيقة المجففة بالرش المستندة إلى الجيلاتين ومشتقاته. تم استخدام عينات من الجزيئات الدقيقة المتشابكة وغير المتشابكة في هذه التجربة لتقييم مساهمة انتشار الجزيئات الكبيرة والقدرة على التكوين.
طبقة متداخلة مع المخاط في الالتصاق المخاطي. تم استخدام أنسجة أنف الأغنام المعزولة حديثًا خلال 24 ساعة من الاسترجاع لهذا التجربة. كما تم الإبلاغ عنه سابقًا وتم تعديله ببعض التغييرات، تم تأمين قسم من نسيج أنف الأغنام بحيث يكون الجانب المخاطي متجهًا لأسفل على سطح مسبار أسطواني مصمم خصيصًا. تم بعد ذلك ربط هذا المسبار بذراع متنقل لجهاز تحليل القوام. تم تثبيت قطعة أخرى من نسيج الأنف بحيث يكون الجانب المخاطي متجهًا لأعلى بشكل آمن على جهاز الالتصاق المخاطي لجهاز تحليل القوام. قبل كل قياس، تم شطف أنسجة الأنف مسبقًا بـ 1 مل من محلول ANF (رقم الهيدروجين 5.80). بعد ذلك، تم إعطاء ملغ من كل تركيبة ميكروبارتكل قائمة على الجيلاتين المجفف بالرش للغشاء المخاطي الأنفي المثبت على الجهاز. ثم تم خفض المجس الأسطواني المتحرك الذي يحمل الأنسجة الأنفية الفارغة لإقامة اتصال مع السطح المخاطي المقابل. تم استخدام البيانات المستمدة من تجارب الانفصال لتقييم قوة الالتصاق المخاطي وإجمالي عمل الالتصاق. تم تطبيق إعدادات المعدات التالية: اختبار سرعة الضغط. ; اختبار السرعة ثانية؛ سرعة ما بعد الاختبار القوة المطبقة ; وقت الاتصال 120 ثانية; نوع الزناد كان “تلقائي”; قوة الزناد ; وارجع المسافة 10 مم.

تم إجراء جميع التجارب لتقييم احتفاظ التركيبات على الغشاء المخاطي المهبلي الخنزيري خارج الجسم والغشاء المخاطي الأنفي للأغنام في و الرطوبة النسبية داخل الحاضنة لمحاكاة الظروف الفسيولوجية. تم إجراء جميع القياسات ثلاث مرات، والمتوسط تم حساب قيم الانحراف المعياري ثم تم تقييمها إحصائيًا.
2.7. التحليل الإحصائي. تم إجراء جميع القياسات في الدراسة الحالية ثلاث مرات على الأقل وتم التعبير عن البيانات كمتوسط قيم الانحراف المعياري. تم إجراء التحليلات الإحصائية باستخدام برنامج GraphPad Prism (الإصدار 8.0؛ سان

دييغو، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية). تم مقارنة البيانات وتقييمها من حيث الأهمية باستخدام اختبار الطالب ذو الذيلين. -اختبار وتحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA) مع اختبار بونفيروني بعد الاختبار (لنتائج اختبار SMIT وتجارب الالتصاق المخاطي). بالنسبة لاختبار MTT، تم استخدام تحليل التباين أحادي الاتجاه مع مقارنات متعددة لدونيت لمقارنة المجموعات الضابطة والمعالجة، بينما داخل المجموعات المعالجة، تم استخدام اختبار الطالب ذو الطرفين. تم تطبيق اختبار لمقارنة الجيلاتين ومشتقاته. اعتُبرت الفروق الإحصائية ذات دلالة عند مستوى .

3.1. التخليق والتوصيف. توفر وجود مواقع تفاعلية في جزيئات الجيلاتين، مثل الأمينات والمجموعات الكربوكسيلية والهيدروكسيلية، فرصة للتعديل الكيميائي مما يؤدي إلى تغييرات في خصائصه الفيزيائية والكيميائية. في هذا العمل، تم تخليق جيلاتين مضاف إليه الكروتون، والإيتاكون، والميثاكريلات عن طريق تفاعل هذا البوليمر الحيوي مع أنهدريدات الكروتون، والإيتاكون، والميثاكريليك، على التوالي، بنسب تغذية مختلفة بالنسبة للأمينات الحرة على هيكل الجيلاتين (المخطط 1). بعد التنقية عن طريق الدياليسيس والتجفيف بالتجميد، تم توصيف مشتقات الجيلاتين باستخدام طيف الرنين المغناطيسي النووي (الشكل 1). عرضت الطيف الأربعة الإشارات المميزة التي تت correspond إلى بروتونات الأحماض الأمينية العطرية في الجيلاتين عند إلى 7.50 جزء في المليون. درجة التFunctionalization
تم تحديد (DoF) من خلال مقارنة تكاملات قمم الهيدروجين المزدوجة المميزة لكل بديل جيلاتين معدل وتكامل المنطقة المقابلة للقمم المجمعة لبروتونات الأروماتية للفينيل ألانين والتيروزين، حيث كانت إشاراتهم بمثابة مرجع. بناءً على في تحليل NMR لطيف الجيلاتين المعدل، يمكن ملاحظة إشارات جديدة: بروتونات من ميثيليدين مميز. ظهرت مجموعة ) عند 5.50 و 5.72 جزء في المليون وقمة تتوافق مع مجموعة الميثيل ( – )، لوحظ عند 1.98 جزء في المليون، من وظائف الميثاكريلويل على الجيلاتين المعدل (Gel-MA)؛ قمم مميزة عند 6.00 و 6.83 جزء في المليون تُنسب إلى ميثينين ( بروتونات وقمة عند 1.91 جزء في المليون تُنسب إلى الميثيل ) مجموعة من مجموعات الكروتونويل (جل-CA)؛ قمم بروتون جديدة تنتمي إلى الميثيليدين ( – مجموعة تم تحديدها عند 5.54 و 6.01 جزء في المليون وقمة عند 3.21 جزء في المليون مخصصة للمثيلين مجموعة من مجموعات الإيتاكونويل (Gel-IA). تؤكد جميع طيف العينات المعدلة من الجيلاتين نجاح التعديل مع كل أنهدريد عند جميع النسب المولية. تُظهر طيفيات الرنين المغناطيسي النووي للجيلاتين الأصلي ومشتقاته بنسب مولية مختلفة بالإضافة إلى الأنهدريدات في الأشكال S3-S7 في المعلومات الداعمة.

جل-ما، جل-كا، وجل-يا هي جيلاتينات ميثاكريلويل، كروتونويل، وإيتاكونويل على التوالي؛ DoF، درجة التFunctionalization؛ اختبار TNBSA، اختبار حمض 2،4،6-ثلاثي نيتروبنزين سلفونيك؛ IEP، النقطة المعزولة كهربائياً؛ ND، غير قابل للكشف. تشير اللواحق إلى الفائض المولي من الأنهيدريدات المضافة بالنسبة لعدد مجموعات الأمين الحرة في الجيلاتين. كمية المجموعات غير المشبعة المدمجة. يتم تقديم النتائج كمتوسط قيم الانحراف المعياري تم تحديد إجمالي كمية مجموعات الأمينو الحرة في الجيلاتين الأصلي على أنها .

في حالة Gel-IA، أكد انخفاض إشارة ميثيلين الليسين عند 3.06 جزء في المليون مع زيادة كمية IA في التفاعل تعديل بقايا الليسين على الهيكل العظمي للجيلاتين، بينما في التفاعل مع CA و MA عند جميع النسب المولية، اختفت إشارات الليسين، مما يشير إلى التحويل الكامل للمجموعات الأمينية. يمكن أن يُعزى ذلك على الأرجح إلى زيادة تفاعل CA و MA مقارنة بـ IA. نظرًا لأن التفاعل يحدث في بيئة مائية، ستتفاعل الأنهدريدات، ومع ذلك، ستتفاعل نظائر الكروتونيك والميثاكريليك بشكل أسرع، مما يؤدي إلى استهلاك أعلى للمواد المتفاعلة. علاوة على ذلك، أدت التفاعلات مع MA إلى مشتقات، تعرض طيفها قمم صغيرة إضافية عند 6.17 جزء في المليون، مما يشير إلى أنه بالإضافة إلى التفاعل مع بقايا الليسين، يتم إدخال بعض مجموعات الميثاكريلويل من خلال التفاعلات مع مجموعات جانبية أخرى في الجيلاتين، مثل مجموعات الهيدروكسيل، بسبب زيادة وقت التفاعل. تلخص الجدول 1 البيانات حول درجة التFunctionalization (DoF) للجيلاتين بناءً على النسب المولية المحددة من خلال كليهما الكمي. تحليل الرنين المغناطيسي النووي واختبار TNBSA بالإضافة إلى عوائد المنتج.

تم تحديد قيم درجات الحرية أيضًا باستخدام منحنى قياسي للجليسين من خلال اختبار TNBSA (انظر الشكل S1 في المعلومات الداعمة). وُجد أن إجمالي كمية مجموعات الأمين الحرة في الجيلاتين النقي هو ، وهو ما يتوافق بشكل جيد مع البيانات المنشورة سابقًا. تم طرح كمية الأمينات الحرة المتبقية بعد تحويل الجيلاتين من كمية الأمينات الحرة مجموعات في جيلاتين أصلي لحساب كمية المجموعات غير المشبعة المدخلة (الجدول 1).

تم تأكيد تحويل الجيلاتين بشكل إضافي باستخدام مطيافية FTIR (انظر الشكل S8 في المعلومات الداعمة). أظهر تحليل FTIR للطيف بوضوح قمم الامتصاص الرئيسية: يظهر طيف الجيلاتين الأصلي وجود النطاق العريض ( ) مع ذروة قصوى عند وكتف في تمثيل غير المتماثل والمتماثل اهتزازات الشد (أميد A)، على التوالي، والتي تتداخل مع اهتزاز -OH في نفس المنطقة. القمم عند 2935 و 2872 تتوافق مع اهتزازات التمدد غير المتماثلة والمتماثلة في المجموعات. نطاقات الامتصاص المميزة عند 1630 و 1523 و مكلفون بـ تمدد (أميد I) انحناء زائد تمدد (أميد II)، و تمديد مرتبط بـ اهتزازات الانحناء (أميد III) على التوالي، وهي متوافقة بشكل جيد
مع بيانات FTIR عن الجيلاتين المبلغ عنها في الأدبيات. القمم عند 1439 و ترجع إلى انحناء CH والذروة عند يمثل تمدد. أدى إدخال مجموعات الكروتونويل والإيتاكونويل والميثاكريلويل إلى حدوث تحولات صغيرة في نطاقات الأميد للجيلاتين نحو ترددات أعلى. توجد نطاق امتصاص نموذجي لمجموعات الفينيل ( يجب أن يكون اهتزاز تمدد C مرئيًا عند ومع ذلك، في حالتنا، تداخل هذا مع إشارة الأميد I (انظر الشكل S8 في المعلومات الداعمة). ومع ذلك، زادت شدة قمم الأميد I و II و III، وهو ما يمكن أن يُعزى إلى الروابط الأميد المدمجة مع اهتزاز التمدد. بشكل عام، تم الحصول على طيف الأشعة تحت الحمراء مشابه لمجموعات مختلفة من الجيلاتين المعدل، مما يشير إلى قيود طيفية FTIR في تأكيد فعالية تحويل الجيلاتين عند تحضير مجموعات متنوعة.

الطبيعة الأمفوتيرية للجلاتين تعود إلى وجود مجموعات الأمين والمجموعات الكربوكسيلية الموجودة في الأحماض الأمينية في السلاسل الجزيئية الكبيرة. عند قيم pH أقل من نقطة التعادل الكهربائي (IEP)، تحمل الجزيئات الكبيرة للجلاتين شحنة موجبة؛ بينما عند IEP هم مشحونون بشحنة سالبة. عند جيلاتين IEP له شحنة صافية تساوي صفر. تمثل نقطة IEP أيضًا النقطة التي تتبنى فيها سلاسل البوليمر المتعدد الشكل أكثر أشكالها كثافة مما يؤدي إلى الحد الأدنى من اللزوجة في المحاليل.

في هذه الدراسة، تم تحديد نقاط IEP لكل من الجيلاتين المشتق وغير المشتق باستخدام قياسات الحركة الكهربائية ومتابعة التغيرات في لزوجة المحلول كدالة لـ pH. المحاليل المائية ( ) من الجيلاتين ومشتقاته المعدلة تم معايرتها عن طريق إضافة كميات متغيرة من الحمض (0.03 M HCl) أو القاعدة (0.02 M NaOH)، وتم متابعة التغيرات الناتجة في pH باستخدام مقياس pH. تم تقدير نقاط IEP للعينات من خلال تحديد قيمة pH التي تقاطع عندها منحنى الحركة الكهربائية الصفر (الشكل 2) أو عندما أظهر محلول البوليمر المتعدد الشكل الحد الأدنى من اللزوجة النوعية (انظر الشكل S9 في المعلومات الداعمة). وُجد أن الجيلاتين الأصلي (النوع A) المستخرج من جلد الخنزير له من pH 7.0، وهو ضمن النطاق المحدد من قبل الشركة المصنعة. كان من المتوقع أن يؤدي إدخال مجموعات الأنهدريد غير المشبعة في جزء الليسين من الجيلاتين إلى خفض النقطة الكهربائية بشكل كبير. في الواقع، أدى إدخال مجموعات CA و IA و MA، وفقدان الأمينات الأولية لليسين، إلى تقليل نقطة IEP لمشتقات الجيلاتين المعدلة إلى أقل من

التي تشير إلى التعديل الكيميائي الناجح لهذا البوليمر الحيوي (الجدول 1). التغيرات الملحوظة في IEP خلال اشتقاق الجيلاتين تتأثر بوضوح بعاملين: درجة تفعيل الجيلاتين وطبيعة المجموعات الوظيفية المدخلة. يؤدي إدخال مجموعات الإيتاكونويل إلى تقليل أكثر وضوحًا في IEP. يُعزى هذا التأثير إلى وجود مجموعة حمض كربوكسيلي إضافية داخل جزء الإيتاكونويل.

من المعروف أن محاليل الجيلاتين في الماء تظهر انتقالات من الحالة السائلة إلى الحالة الهلامية عند انخفاض درجة الحرارة. تم دراسة هذا السلوك للجيلاتين الأصلي ومشتقاته الجديدة باستخدام
قياسات الريولوجيا. التغيرات الريولوجية التي تحدث مع المحاليل المائية من الجيلاتين الأصلي ومشتقاته المعدلة كيميائيًا (Gel-CA و Gel-IA و GelMA) عند تغيرات في درجة الحرارة معروضة في الأشكال S10 و S11 في المعلومات الداعمة. بالنظر إلى اتجاه البيانات التي تم الحصول عليها، يمكن تحديد كل من نقاط الانصهار ( ) ونقاط التجلط ( ) من خلال أخذ درجة حرارة تقاطع بين معامل التخزين ( ) ومعامل الفقدان تُعزى درجة حرارة التقاطع إلى درجة حرارة الانتقال من “الهلام إلى السائل” أو “السائل إلى الهلام”، مما يشير إلى الانتقال من تشكيل شبكة مرنة إلى محلول عند التسخين أو تشكيل هلام مرتبط جسديًا، على التوالي. وُجد أن الجيلاتين الأصلي (النوع A، من جلد الخنزير) أظهر عند و عند خلال دورات التسخين والتبريد، على التوالي. البيانات التي تم الحصول عليها حول درجات حرارة الانصهار والتجلط للجيلاتين الأصلي تتفق جيدًا مع البيانات المبلغ عنها في الأدبيات. تمت ملاحظة درجات حرارة التجلط والانصهار لمشتقات الجيلاتين أن لها ارتباطًا جيدًا مع درجة تفعيلها (DoF). تم الكشف عن نقاط و الأدنى لمشتقات الجيلاتين ذات DoF الأكبر، مما يشير إلى أن التعديل الكيميائي يؤثر على خصائص التجلط للجيلاتين. تم تقديم درجات حرارة الانصهار والتجلط لهذه البوليمرات الحيوية في الجدول 2.

Gel-MA و Gel-CA و Gel-IA هي جيلاتين ميثاكريلويل وكروتونويليت وإيتاكونويليت، على التوالي.
3.2. علم السموم. 3.2.1. حيوية الخلايا. تم دراسة السمية الخلوية في المختبر للجيلاتين ومشتقاته المعدلة (Gel-CA و Gel-IA و Gel-MA) باستخدام اختبار MTT مع خلايا الألياف الرئوية البشرية (HPF). يعتمد الاختبار على قدرة الميتوكوندريا في الخلايا الحية على تقليل 3-(4،5-ثنائي ميثيل ثيازول-2-يل)-2،5-ثنائي فينيل تيترازوليوم بروميد (MTT)، وهي مادة صفراء، إلى بلورات فورمازان غير قابلة للذوبان (لون بنفسجي). تتيح هذه التقنية حساب عدد الخلايا الحية بعد المعالجة بالمادة الاختبارية. تم معالجة خلايا HPF بالجيلاتين، Gel-CA و Gel-MA محاليل بتركيزات 1.3 و في وسائط نمو الخلايا لمدة 24 ساعة. كانت مجموعة التحكم السلبية تتكون من خلايا غير معالجة اعتبرت كـ من الخلايا الحية. يعرض الشكل 3 البيانات حول حيوية الخلايا في وجود الجيلاتين المعدل وغير المعدل. أظهرت نتائج MTT أن حيوية الخلايا متقاربة للجيلاتين ومشتقاته المعدلة كيميائيًا

المشتقات المعدلة حيث لم تكن هناك فروق ذات دلالة إحصائية في الحيوية بين هذه البوليمرات الحيوية ( ) مقابل التحكم بعد 24 ساعة من المعالجة في التركيزات المدروسة. من بين المشتقات المدروسة، أظهر فقط Gel-IA انخفاضًا طفيفًا في حيوية الخلايا عند تركيز إلى 81.1 . ومع ذلك، وفقًا لمعايير ISO التي وضعتها أهداف التنمية المستدامة للأمم المتحدة (SDGs؛ ISO 10993-5:2009) يعتبر المادة للاستخدام الطبي آمنة طالما أن حيوية الخلايا في المختبر هي وأعلى. تظهر نتائجنا أن مستوى حيوية الخلايا ظل مرتفعًا ( ) بعد المعالجة مع جميع البوليمرات الحيوية عند التركيزات المعطاة (الشكل 3).

نظرًا لأن الجيلاتين يعتبر مادة آمنة، في الخطوة التالية، قارننا حيوية الخلايا المعالجة بالجيلاتين مع المجموعة المعالجة بمشتقاته المعدلة. لم تظهر Gel-MA و GelCA وكذلك الجيلاتين النقي فرقًا كبيرًا في الحيوية ( ). علاوة على ذلك، يمكن رؤية أن حيوية الجيلاتين كانت أعلى من تلك الخاصة بمجموعة التحكم. يمكن الافتراض أن الجيلاتين النقي عند تركيز أقل يظهر بعض القدرة على تسهيل تكاثر الخلايا. تتفق نتائجنا جيدًا مع التقارير السابقة، ويمكن اعتبار الجيلاتين ومشتقاته المعدلة آمنة في هذا الصدد.

في معظم الحالات، لم يكن الفرق بين الجيلاتين ومشتقاته المعدلة ذا دلالة إحصائية ( ، مما يشير إلى أن التعديل الكيميائي للجيلاتين بمجموعات غير مشبعة لا يسبب زيادة في سمية البوليمر. يمكن الاستنتاج أن GelCA و Gel-IA و Gel-MA التي تم تصنيعها غير سامة ومناسبة لمزيد من التطوير في التطبيقات الصيدلانية.
3.2.2. تهيج الغشاء المخاطي. تم تطوير اختبار تهيج الغشاء المخاطي للرخويات (SMIT) في الأصل بواسطة أدريانس وزملائه وقد تم التحقق منه كطريقة بديلة وموثوقة لتقييم قدرة التهيج المخاطي لمختلف المواد الكيميائية، والمساعدات، ومستحضرات التجميل، والتركيبات، والمكونات النشطة. تم تطبيق هذه التقنية في العديد من الدراسات، بما في ذلك تقييم التهيج الأنفي والمهبلي. يستخدم SMIT الرخويات الأرضية، التي لا تحميها التشريعات التي تتحكم في تجارب الحيوانات وتعتبر
لديها وعي محدود. إفراز المخاط ضروري للرخويات لمساعدتها في الحركة ومنع الجفاف. كما أنها تطلق المخاط وتفقد وزن الجسم عند ملامستها للمهيجات. عندما يتضرر غشاءها المخاطي، تنتج الرخويات بروتينات وإنزيمات إضافية. يوفر الاختبار نقاط نهاية قابلة للقياس لتصنيف المواد الاختبارية إلى غير مهيجة ( )، خفيفة ( 10)، معتدل (نسبة MP% 10-17.5)، أو مهيج بشدة (نسبة MP% 17.5) بناءً على مستويات إنتاج المخاط. بشكل عام، تسبب المهيجات الخفيفة زيادة في إنتاج المخاط؛ ومع ذلك، فإن المهيجات القوية تؤدي إلى تآكل الأنسجة بالإضافة إلى زيادة إنتاج المخاط.

يتم استخدام النسخة المعدلة من هذا الاختبار بشكل روتيني من قبل مجموعة البحث لدينا لتقييم التوافق الحيوي لمختلف المواد المضافة البوليمرية. تقدم الشكل 4 البيانات حول

نسبة إنتاج المخاط (MP%) بواسطة قواقع أريون لوسيتانيكوس بعد 60 دقيقة من التعرض لورق الترشيح المنقوع في محاليل الجيلاتين ومشتقاته المعدلة بالإضافة إلى الضوابط الإيجابية والسلبية. جميع المواد الاختبارية المستخدمة في هذا الاختبار تم إذابتها في محلول ملحي مخفف بالفوسفات (PBS؛ pH 7.40). تم إعداد عينات قائمة على الجيلاتين عند ، حيث أنه عند هذه التركيزات كانت هذه العينات قادرة على تشكيل طبقة هلامية رقيقة على سطح ورق الترشيح. الحلزونات الموضوعة في أظهر محلول BAC (التحكم الإيجابي؛ pH 7.36) انزعاجًا شديدًا، مما أدى إلى إنتاج كميات أكبر بكثير من المخاط الملون بالأصفر حتى البرتقالي. ) من أولئك المعرضين لمحلول PBS (التحكم السلبي؛ pH 7.40 ) بمستوى منخفض جداً من MP% ( ). هذه النتائج تتوافق بشكل جيد مع الدراسات السابقة. قيم إنتاج المخاط المسجلة للرخويات المعرضة للجيلاتين، Gel-MA جل-CA ، و Gel-IA كانوا 1 ، و ، على التوالي. كانت إفرازات المخاط عديمة اللون، مما يعد مؤشراً جيداً أولياً للتوافق الحيوي. لا توجد فروق ذات دلالة إحصائية ) في النسبة المئوية MP% لوحظت بين القيم المسجلة للسيطرة السلبية ومواد الاختبار القائمة على الجيلاتين، مما يوضح الطبيعة غير المهيجة لكل من الجيلاتين و

الجيلاتين المعدل. توفر النتائج رؤى قيمة حول التوافق الحيوي لمشتقات الجيلاتين وتقترح أنه يمكن استخدامها في تطبيقات متنوعة دون التسبب في تهيج الغشاء المخاطي. تقدم الأشكال S12 و S13 في المعلومات الداعمة توضيحًا تخطيطيًا مفصلًا لإجراء اختبار SMIT وصورًا لزواحف Arion lusitanicus المعرضة للمواد المختبرة، على التوالي.

أنسجة المهبل الخنزيري. يُفضل غالبًا استخدام الطريق المهبلي لإعطاء الأدوية لعلاج محلي لمختلف الاضطرابات والعدوى النسائية. يتمتع الإعطاء المحلي بإمكانية تحسين امتصاص الأدوية وتوصيلها إلى الأنسجة المستهدفة مع تقليل الآثار الجانبية. ومع ذلك، يتطلب إعطاء الأدوية عبر المهبل التغلب على عدة عقبات لتحقيق امتصاص فعال للأدوية واحتفاظ بها. يحد الظهارة المهبلية، التي تتكون من عدة طبقات من الخلايا المعبأة بإحكام، من اختراق الأدوية. علاوة على ذلك، فإن وجود طبقة سميكة من المخاط داخل تجويف المهبل يعيق أيضًا انتشار الأدوية إلى الأنسجة الأساسية. تعمل طبقة المخاط، المكونة من الجليكوبروتينات والميوسينات، كحاجز واقي لزج ومرن، حيث تقوم بتنظيف وتزييت ظهارة الجهاز التناسلي للمساعدة في القضاء على مسببات الأمراض والمواد الغريبة. علاوة على ذلك، قد تؤثر الخصائص الفيزيائية والكيميائية للسائل المهبلي، بما في ذلك حجمه ولزوجته ودرجة حموضته، أيضًا بشكل غير ملائم على امتصاص الأدوية واحتفاظها. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تؤثر عوامل مثل الفسيولوجيا المهبلية، والعمر، ودورة الطمث، واضطرابات الجهاز التناسلي، ومعايير التركيب أيضًا على معدل ومدى امتصاص الأدوية في تجويف المهبل. تشكل هذه العوامل التشريحية مجتمعة تحديات في تحقيق توصيل فعال للأدوية عند إعطائها عن طريق المهبل.

في هذه الدراسة، تم دراسة الاستخدام المحتمل للجيلاتين ومشتقاته المعالجة بالكروتونويلايت، والإيتاكونويلايت، والميثاكريلويل في توصيل الأدوية عبر المهبل باستخدام اختبار في المختبر يعتمد على التدفق مع الكشف الفلوري. الـ
تم إعداد التركيبات باستخدام فلوريسئين الصوديوم (NaFl)، وهو علامة فلورية تسهل الكشف والقياس السهل لمستويات الاحتفاظ بالغشاء المخاطي. لقد تم استخدام هذه الطريقة على نطاق واسع لدراسة احتفاظ التركيبات المختلفة على أسطح مخاطية مختلفة، بما في ذلك الأنسجة المهبلية. تم التحقق من فعالية هذه التقنية مقارنةً بأساليب أخرى معتمدة تُستخدم لتقييم الخصائص اللاصقة للمخاط.

باختصار، الجيلاتين المحتوي على NaFl ومشتقاته المعدلة كيميائيًا (Gel-CA ، و Gel-MA )، بالإضافة إلى محلول NaFl الحر، تم تطبيقه على سطح الغشاء المخاطي المهبلي الخنزيري خارج الجسم وترك لي equilibrate في ثم تم ري السطح المخاطي بأحجام متفاوتة من محاكاة السائل المهبلي (VFS؛ pH 4.0؛ معدل التدفق )، وتم تحديد وجود التركيبة على السطح المخاطي باستخدام مجهر الفلورية. كان الحجم الإجمالي لـ VFS المستخدم في تجربة الغسل هذه يهدف إلى محاكاة كمية الإفرازات المهبلية الطبيعية لدى النساء الأصحاء يوميًا). تُظهر الصور المجهرية الفلورية النموذجية لاحتفاظ هذه التركيبات المأخوذة بعد كل غسلة مع VFS في الشكل 5. يمكن قياس احتفاظ الغشاء المخاطي من خلال قياس التغير في كثافة بكسل الصورة مع مرور الوقت لإعطاء نسبة الفلورية بالنسبة للوقت الأولي (الشكل 6). ساعد تحليل الصور في الكشف عن أن دمج مجموعات الكروتونويل، والإيتاكونويل، والميثاكريلويل في هيكل الجيلاتين عزز بشكل كبير احتفاظ التركيبة على الغشاء المخاطي المهبلي الخنزيري المقطوع حديثًا. من بين الجيلاتين المعدل، Gel-MA أظهرت أداءً متفوقًا في الالتصاق المخاطي مقارنة بالجيلاتين الأصلي ) ومحلول الفلورسئين الصوديوم خلال تجربة الغسيل. كما هو متوقع، أظهرت المحاليل الخالية من البوليمر من NaFl (التي عملت كتحكم غير لاصق للمخاط) احتفاظًا أقل بكثير وتم غسلها بسرعة من السطح المخاطي، مع فقط تمت ملاحظة الفلورية عند الانتهاء من دورة الغسيل الكاملة. تقليديًا، يُعتبر الجيلاتين الطبيعي بوليمرًا ذو خصائص ضعيفة.

قدرات الاحتفاظ والنتائج التي تم الحصول عليها خلال تجارب الالتصاق المخاطي خارج الجسم دعمت هذا التقييم.

وبالتالي، أظهرت الجيلاتين النقي التصاقًا أضعف بكثير مع الغشاء المخاطي المهبلي مقارنةً بنظائرها المعدلة: جيل-ما. ; جل-IA ; وجيل ومع ذلك، فإن الاحتفاظ أكبر مقارنةً بمحلول NaFl ). لوحظ أن Gel-IA أظهرت احتفاظًا صغيرًا ولكنه أكبر بشكل ملحوظ ) على الغشاء المخاطي المهبلي بالمقارنة مع خلال تجربة الالتصاق المخاطي. ومع ذلك، لم يكن هناك فرق ذو دلالة إحصائية تم العثور عليه بين هذه التركيبات في نهاية اختبار الغسل (الشكل 6). من الجدير بالذكر أن Gel-MA أظهرت أداءً أفضل في الالتصاق المخاطي ( ) مقارنةً بالجيلاتين المعدل الآخر (Gel-CA و Gel . لقد أبلغنا سابقًا أن البوليمرات المعدلة بمجموعات الميثاكريلويل أظهرت تحسنًا كبيرًا في الالتصاق على مختلف الأسطح المخاطية وأظهرت أداءً مشابهًا أو حتى أفضل في الالتصاق المخاطي عند درجات أعلى من التعديل مقارنةً بالكيتوزان، الذي يُعتبر عادةً “المعيار الذهبي” للبوليمرات اللاصقة/التحكم الإيجابي في هذا المجال.
كما هو متوقع، ينخفض احتفاظ جميع التركيبات على مدار عملية الغسيل، ومع ذلك، يتم ملاحظة الاتجاه التالي: Gel- الجيلاتين NaFl. وفقًا لهذه النتائج، من المعقول أن نفترض أن الأداء الممتاز في الالتصاق المخاطي لهذه التركيبات يعود إلى تفاعلها مع الأسطح المخاطية عبر ثلاث آليات، كما هو موضح في الشكل 7: (i) قدرة المجموعات الوظيفية غير المشبعة (الميثاكريلويل، الكروتونويل، الإيتاكونويل) من الجيلاتين المعدل على تشكيل روابط تساهمية مع مجموعات الثيول الموجودة في طبقة المخاط من خلال إضافة من نوع مايكل

رد الفعل؛ (ii) التفاعل الكهروستاتيكي بين مجموعات الأمين الأولية البروتونية المتبقية داخل الجيلاتين المعدل والميوسينات المشحونة سلبًا الموجودة على السطح المخاطي؛ و (iii) الروابط الهيدروجينية بين مجموعات الهيدروكسيل، الكربوكسيل من الجيلاتين وموحدات بروتين الميوسين.

تساهم التفاعلات الكهروستاتيكية للجزيئات الكبيرة الأمفوتيرية في الالتصاق المخاطي بشكل كبير في اعتمادها على درجة حموضة المحلول وموقعها النسبي مقابل نقطة التكافؤ للبوليمر الأمفولي. هذا، بدوره، يعتمد على درجة تعديل الجيلاتين وطبيعة المجموعات الوظيفية المدخلة. بالنظر إلى أن تجارب الاحتفاظ أجريت في VFS عند درجة حموضة 4.0، فإن الجيلاتين غير المعدل فقط سيحمل شحنة إيجابية قوية تحت هذه الظروف، نظرًا لنقطة التكافؤ الخاصة به عند 7.0. تظهر مشتقات الجيلاتين التي تحتوي على مجموعات الميثاكريلويل قيم نقطة التكافؤ بين 4.2-4.3، مما يؤدي إلى شحنات إيجابية ضعيفة فقط. تمتلك المشتقات التي تحتوي على مجموعات الكروتونويل والإيتاكونويل قيم نقطة التكافؤ تتراوح بين 2.5-3.2 و3.5-3.8، على التوالي، مما يجعل هذه البوليمرات مشحونة سلبًا خلال تجارب الاحتفاظ. وبالتالي، من المعقول أن نستنتج أن الربط الكهروستاتيكي لمشتقات الجيلاتين مع السطح المهبلي ليس العامل الرئيسي الذي يساهم في الالتصاق المخاطي.
3.3.2. الاحتفاظ على أنسجة أنف الأغنام الحية. يوفر الإعطاء داخل الأنف وسيلة غير جراحية لتوصيل الأدوية. تعمل العوامل العلاجية التي يتم توصيلها إلى تجويف الأنف محليًا وتوفر هدفًا مباشرًا للجهاز العصبي المركزي. يتراوح الإنتاج اليومي المتوقع للمخاط الأنفي بين 0.1 و (أو من 20 إلى 40 مل) في الظروف العادية. ومع ذلك، يمكن أن يتأثر مقدار إفراز المخاط الدقيق بعوامل مختلفة مثل الظروف البيئية، والحساسية، والعدوى، والاختلافات الفردية، بالإضافة إلى الموقع المحدد والمنطقة من الغشاء المخاطي الأنفي البشري. يعتبر تطهير المخاط عملية فسيولوجية معقدة وديناميكية تساعد في الحفاظ على نظافة الممرات الهوائية العليا والسفلى والدفاع ضد الجسيمات والجراثيم المحمولة جواً. يتم ذلك من خلال تفاعل المخاط الأنفي وضربات الأهداب. تتحرك الموجات المنسقة من الأهداب الصغيرة الشبيهة بالشعر تدريجيًا بالمخاط الكثيف من مقدمة الأنف إلى البلعوم الأنفي، حيث يمكن ابتلاعه أو طرده. بالإضافة إلى ذلك، يكون المخاط الأنفي حمضيًا قليلاً ( ) لمنع العدوى التنفسية. تعمل آلية الحماية للجهاز التنفسي بكفاءة ويمكن أن تحد بشكل كبير من وقت بقاء المواد العلاجية عند إعطائها عبر الأنف. تم تصميم أشكال الجرعات اللاصقة المخاطية لمواجهة آلية التطهير من خلال الالتصاق بالسطح المخاطي، وبالتالي إطالة وقت الاحتفاظ وتحسين امتصاص الدواء الفعال.

تستخدم التركيبات الدقيقة عادةً في توصيل الأدوية عبر الأنف. لذلك، في هذه الدراسة، تم صياغة الجيلاتين ومشتقاته كجزيئات دقيقة مع NaFl كدواء نموذجي. تم تصميم نوعين من الجزيئات الدقيقة مع وبدون استخدام عامل ربط لتقييم دور ربط الجيلاتين على خصائص احتفاظها في الأنف. تم إنتاج جزيئات دقيقة محملة بـ NaFl مرتبطة وغير مرتبطة بناءً على الجيلاتين ومشتقاته المعدلة (Gel-CA؛ Gel-IA وGel-MA) بنجاح باستخدام تقنية التجفيف بالرش. كان الاختلاف بين الجزيئات المرتبطة وغير المرتبطة هو إضافة الجلوتارالدهيد، الذي يسهل ربط جزيئات الجيلاتين الكبيرة. تم تحديد مورفولوجيا سطح هذه الجزيئات الدقيقة باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح (SEM). كانت الجزيئات الدقيقة التي تم جمعها بعد التجفيف بالرش كروية وقدمت
ملمس سطح مجعد، خالية من البلورات، المسام، والشقوق (انظر الأشكال S14 وS15 في المعلومات الداعمة). أدت جميع التركيبات إلى جزيئات دقيقة ذات مورفولوجيات مشابهة وكان متوسط أقطار الجزيئات ، والتي كانت ضمن النطاق المتوقع للجزيئات الدقيقة الناتجة عن تقنيات التجفيف بالرش الشائعة.

في هذه التجربة، قمنا بتقييم إمكانيات الجزيئات الدقيقة المعتمدة على الجيلاتين المعدل وغير المعدل كتركيبات لاصقة مخاطية لتطبيقها في توصيل الأدوية عبر الأنف. تمت دراسة خصائص الاحتفاظ لهذه التركيبات باستخدام نفس طريقة التدفق في المختبر كما هو موضح أعلاه مع بعض التعديلات. تم استخدام عينات الجزيئات الدقيقة غير المرتبطة فقط في هذه التجربة. الغرض من استخدام الجزيئات الدقيقة غير المرتبطة هو تسهيل التصاقها من خلال السماح لها بالانتفاخ ببطء والذوبان عند ملامستها للسطح المخاطي الرطب عند تطبيقها/استنشاقها. باختصار، من عينات الجزيئات الدقيقة المعتمدة على الجيلاتين المعدل وغير المعدل التي تحتوي على NaFl تم إيداعها على الغشاء المخاطي الأنفي للأغنام الحية. تم إجراء التجربة عند في حاضنة. خلال هذه التجربة، تم جمع محلول ANF المتدفق على الغشاء المخاطي الأنفي خلال كل دورة غسيل في نقاط زمنية محددة مسبقًا. بعد ذلك، تم تحليل هذه العينات باستخدام مقياس الطيف الفلوري. باستخدام البيانات المكتسبة وإنشاء منحنى قياسي للجزيئات الدقيقة مع NaFl، يمكن حساب كمية شكل الجرعة التي تم غسلها من الغشاء المخاطي الأنفي. وبالتالي، من خلال الحسابات العكسية، يمكن تقدير كمية التركيبات المحتفظ بها على الغشاء المخاطي الأنفي للأغنام (الشكل 8). جميع العينات

أظهرت انخفاضًا في الفلورية المحددة خلال عملية الغسيل، مما يشير إلى إزالة التركيبات الجزيئية الدقيقة المعتمدة على الجيلاتين من السطح المخاطي. ومع ذلك، أظهرت الجزيئات الدقيقة من الجيلاتين الميثاكريلويل (Gel-MA ) التصاقًا أقوى ( ) مع الغشاء المخاطي الأنفي مقارنةً بمشتقات الجيلاتين المعدلة الأخرى (Gel-CA و Gel-IA ). مرة أخرى، أظهر الجيلاتين النقي أداءً أقل

أداء الالتصاق المخاطي في مقابل نظيراتها المعدلة: Gel-MA ; Gel-CA ; و . من المثير للاهتمام، لم يتم ملاحظة أي فرق ذو دلالة إحصائية ( ) بين الجل و Gel-IA التركيبات طوال العملية التجريبية، حيث أظهرت ملف احتفاظ مشابه. بشكل عام، تتماشى هذه الملاحظات مع النتائج السابقة وتشير إلى أن المشتقات الثلاثة من البوليمر الحيوي التي تم فحصها لها احتفاظ أكبر على الغشاء المخاطي الأنفي مقارنة بالجيلاتين الأصلي بسبب خصائصها المعززة من حيث الالتصاق بالمخاط.

لدعم النتائج التي تم الحصول عليها من طريقة التدفق في المختبر، تم استخدام اختبار الشد لتقييم التصاق الجسيمات الدقيقة المستندة إلى الجيلاتين المتقاطع وغير المتقاطع ومشتقاتها المعدلة كيميائيًا على الغشاء المخاطي الأنفي للأغنام المقطوعة حديثًا. تعتبر طريقة الشد واحدة من التقنيات المستخدمة على نطاق واسع والمثبتة لتقييم خصائص الالتصاق بالمخاط لأشكال الجرعات المختلفة. تتضمن هذه الطريقة تقريب المواد اللاصقة البوليمرية من الأنسجة المخاطية مع سحبها لاحقًا، تليها تسجيل وتحليل ملفات الانفصال الناتجة. يتم تحديد أداء الالتصاق بالمخاط لأشكال الجرعات من خلال مجموعة من معلمين مهمين: قياس أقصى قوة للانفصال المطلوبة لفصل شكل الجرعة عن الغشاء المخاطي؛ والعمل الكلي للالتصاق، الذي يُعرف بأنه المساحة تحت منحنى قوة الانفصال مقابل المسافة المقابلة (انظر الأشكال S16 و S17 في

المعلومات الداعمة لملفات الانفصال النموذجية للمواد الاختبارية).

الشكل 9 يوضح قيم أقصى قوة للانفصال ( ) والعمل الكلي للالتصاق ( )، كما تم حسابه من دراسات اختبار الشد لكل من الجسيمات الدقيقة المستندة إلى الجيلاتين المتقاطع وغير المتقاطع. أظهرت التركيبات المعدلة كيميائيًا من الجيلاتين (Gel-MA و Gel-IA ) أداءً متفوقًا في الالتصاق بالمخاط ( مع تعبير عن قيم أعلى من و عند مقارنتها بالجيلاتين الأصلي ضمن الجسيمات الدقيقة غير المتقاطعة. وقد تبين أن العينات المستندة إلى الجسيمات الدقيقة Gel-CA 6 غير المتقاطعة أظهرت أقل أداء في الاحتفاظ مقارنةً بنظيراتها Gel-MA و Gel-IA التي أظهرت قيمة أقل من . لم يتم ملاحظة أي فرق ذو دلالة إحصائية في بين Gel-MA و Gel-IA ، ومع ذلك، أظهرت Gel-IA قيمة أعلى من مقارنةً بـ Gel-MA و Gel-CA .

من المثير للاهتمام، لم يتم ملاحظة أي اختلافات ذات دلالة إحصائية بين الجسيمات الدقيقة من الجيلاتين المعدل المتقاطع ( و Gel-IA )، حيث أظهرت ملفات و مشابهة جدًا، مما يشير إلى أداء لاصق بالمخاط قابل للمقارنة بين هذه الأنواع من أشكال الجرعات. بشكل عام، أظهر الجيلاتين الأصلي أسوأ خصائص الالتصاق بالمخاط مقارنةً بنظائره المعدلة ضمن كل من الجسيمات الدقيقة المتقاطعة وغير المتقاطعة.

أدت إضافة مجموعات وظيفية غير مشبعة من الكروتونويل والإيتاكونويل والميثاكريلويل إلى هيكل الجيلاتين إلى تعزيز كبير في أداء الالتصاق بالمخاط لجميع التركيبات المستندة إلى الجسيمات الدقيقة Gel-IA و Gel-CA و Gel-MA. ترتبط قدرة عينات الجيلاتين المعدلة كيميائيًا على الالتصاق جيدًا بالأنسجة المخاطية بتفاعل المجموعات الوظيفية غير المشبعة مع مجموعات الثيول في المجالات الفرعية الغنية بالسيستين الموجودة في الميوسين عبر تفاعل إضافة ثيول-إين ميخايل لتشكيل روابط تساهمية، والتي تحدث في ظل ظروف ذات صلة فسيولوجيًا (الشكل 7). هذه عملية سريعة تسمح بإقامة التصاق محسّن في فترة معقولة بعد إعطاء شكل الجرعة على السطح المخاطي. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن ترتبط مجموعات الأمين الأولية البروتونية المتبقية داخل هيكل الجيلاتين المعدل أيضًا بالميوسين من خلال تفاعلات كهرستاتيكية حيث أن درجة حموضة محلول ANF المستخدم حمضية ضعيفة (درجة حموضة 5.80).

أظهرت الجسيمات الدقيقة المكونة من الجيلاتين المتقاطع والمشتقات خصائص لاصقة بالمخاط أقل مقارنةً بالجسيمات المعدة باستخدام البوليمرات غير المتقاطعة. وهذا يشير إلى أن قابلية انتشار الجزيئات الكبيرة تلعب دورًا كبيرًا في الالتصاق بالمخاط. لا يمكن للجزيئات الكبيرة المتقاطعة الانتشار بحرية وتشكيل طبقة متداخلة مع المخاط، مما يقلل من قدرة الجسيمات الدقيقة على الالتصاق بالسطح المخاطي. تتماشى هذه النتيجة بشكل جيد مع نظرية انتشار الالتصاق بالمخاط.

في هذه الدراسة، نبلغ عن تخليق وتوصيف الجيلاتين المعدل بالكروتونويل والإيتاكونويل والميثاكريلويل (Gel-CA و Gel-IA و Gel-MA، على التوالي) مع خصائص لاصقة بالمخاط محسّنة. تم تأكيد التعديل باستخدام تقنيات طيف NMR و FTIR واختبار TNBSA وتم حساب درجة التوظيف. تم أيضًا دراسة تأثير التعديل على نقطة التكافؤ، اللزوجة وخصائص الجل القابلة للعكس حراريًا للجيلاتين. أظهرت جميع الجيلاتينات المشتقة خصائص لاصقة بالمخاط متفوقة مقارنةً بالجيلاتين الأصلي. إن إدخال الأنهدريدات غير المشبعة في الجيلاتين ليس ضارًا لخصائصها السمية كما تم تقييمه باستخدام اختبار SMIT في الجسم الحي واختبار MTT في خلايا HPF. يمكن اعتبار الجيلاتينات المعدلة مع مجموعات وظيفية غير مشبعة كمواد مساعدة جديدة ذات خصائص لاصقة بالمخاط محسّنة لتشكيل أشكال جرعات لاصقة بالمخاط لتوصيل الأدوية المهبلية والأنفية. يمكن أن تجد Gel-CA و Gel-IA و Gel-MA أيضًا تطبيقات في مجالات أخرى من توصيل الأدوية عبر الغشاء المخاطي، على سبيل المثال، عند تشكيلها كأفلام أو جلات أو جزيئات دقيقة أو نانوية.

المعلومات الداعمة متاحة مجانًا على https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.biomac.3c01183.

نسب التغذية لتخليق الجيلاتين المعدل بالكروتونويل أو الإيتاكونويل أو الميثاكريلويل؛ تركيبة محاكاة السائل المهبلي (VFS) والسائل الأنفي الاصطناعي (ANF)؛ منحنى قياسي من الجلايسين يستخدم لتحديد كمية مجموعات الأمين الحرة في الجيلاتين المعدل وغير المعدل؛ منحنى قياسي من الفلورسئين؛ طيف NMR للأنهدريدات غير المشبعة؛ طيف NMR و FTIR للجيلاتين الأصلي ومشتقاته المعدلة؛ صور مجهرية إلكترونية مسح
(SEM) للجسيمات الدقيقة المجففة بالرش المستندة إلى عينات الجيلاتين المعدلة وغير المعدلة؛ منحنيات اللزوجة المحددة مقابل منحنيات درجة الحموضة لتحديد نقاط التكافؤ؛ منحنيات تخزين وفقدان المودول المستخدمة لتحديد نقاط الجل القابلة للعكس حراريًا؛ توضيح تخطيطي لاختبار تهيج الغشاء المخاطي (SMIT) باستخدام نوع Arion lusitanicus؛ صور نموذجية لإنتاج المخاط بواسطة رخويات Arion lusitanicus عند الاتصال بالمواد الاختبارية؛ ملفات انفصال نموذجية للمواد الاختبارية (PDF)

فيتالي ف. خوتوريانسكي – مدرسة ريدينغ للصيدلة، جامعة ريدينغ، وايتكنيتس RG6 6DX ريدينغ، المملكة المتحدة؛ © orcid.org/0000-0002-7221-2630; البريد الإلكتروني: v.khutoryanskiy@reading.ac.uk
داولت ب. كالديبيكوف – مدرسة ريدينغ للصيدلة، جامعة ريدينغ، وايتكنيتس RG6 6DX ريدينغ، المملكة المتحدة؛ قسم الكيمياء والتكنولوجيا الكيميائية، جامعة الفارابي كازاخستان الوطنية، 050040 ألماتي، كازاخستان؛ معهد مواد البوليمر والتكنولوجيا، 050019 ألماتي، كازاخستان؛ © orcid.org/ 0000-0002-7191-5465; البريد الإلكتروني: dauletchem@gmail.com, d.kaldybekov@reading.ac.uk

إلفيرا أ. شتاباييفا – مدرسة ريدينغ للصيدلة، جامعة ريدينغ، وايتكنيتس RG6 6DX ريدينغ، المملكة المتحدة؛ قسم الكيمياء والتكنولوجيا الكيميائية، جامعة الفارابي كازاخستان الوطنية، 050040 ألماتي، كازاخستان؛ © orcid.org/0000-0001-9153-5198
ليلى أولمانوفا – مدرسة العلوم والإنسانية، جامعة نازارباييف، 010000 أستانا، كازاخستان
بالنور أ. زهايسنباييفا – مدرسة الهندسة والعلوم الرقمية، جامعة نازارباييف، 010000 أستانا، كازاخستان
إلينا أ. مون – مدرسة العلوم والإنسانية، جامعة نازارباييف، 010000 أستانا، كازاخستان
زارينا أ. كينيسوفا – قسم الكيمياء والتكنولوجيا الكيميائية، جامعة الفارابي كازاخستان الوطنية، 050040 ألماتي، كازاخستان؛ © orcid.org/0000-0003-2768-824X
سركيت إ. كودايبرغينوف – معهد مواد البوليمر والتكنولوجيا، 050019 ألماتي، كازاخستان
معلومات الاتصال الكاملة متاحة على:
https://pubs.acs.org/10.1021/acs.biomac.3c01183

تم كتابة المخطوطة من خلال مساهمات جميع المؤلفين. جميع المؤلفين قد وافقوا على النسخة النهائية من المخطوطة.

يعلن المؤلفون عدم وجود مصلحة مالية متنافسة.

يُعرب المؤلفون عن شكرهم للجنة العلوم بوزارة العلوم والتعليم العالي في جمهورية كازاخستان (رقم المنحة AP14869167) على الدعم المالي لهذا البحث. كما يود المؤلفون أن يشكروا الدكتور سام أسبينال على مساعدته وتدريبه على آلة التجفيف بالرش. كما يُشكر P.C. Turner Abattoirs (فارنبورو، المملكة المتحدة) على
توفير أنسجة المهبل الخنزير وأنسجة أنف الأغنام لتجارب الالتصاق المخاطي. V.V.K. يشكر الجمعية الملكية على زمالته الصناعية (IF ).

ANF، سائل أنفي صناعي؛ BAC، كلوريد البنزالكونيوم؛ CA، أنهدريد الكروتون؛ , أكسيد الديوتيريوم؛ DoF، درجة التوظيف؛ DMEM، وسط دلبوكو المعدل؛ DMSO، ثنائي ميثيل سلفوكسيد؛ FBS، مصل جنين البقر؛ NaFI، ملح الصوديوم الفلورسيني؛ جل، جيلاتين؛ Gel-CA، جيلاتين كروتونويليتد؛ Gel-IA، جيلاتين إيتاكونويليتد؛ Gel-MA، جيلاتين ميثاكريلويلتد؛ IA، أنهدريد الإيتاكون؛ MA، أنهدريد الميثاكريليك؛ MP، إنتاج المخاط؛ مفاعل MTT، 3-(4،5-ثنائي ميثيل ثيازول-2-يل)-2،5-ثنائي الفينيل تيترازوليوم بروميد؛ PBS، محلول ملحي معزول بالفوسفات؛ SMIT، اختبار تهيج الغشاء المخاطي للرخويات؛ اختبار TNBSA، اختبار حمض 2،4،6-ثلاثي نيتروبنزين سلفونيك؛ VFS، محاكاة سائل المهبل

(1) Karim, A. A.; Bhat, R. Fish Gelatin: Properties, Challenges, and Prospects as an Alternative to Mammalian Gelatins. Food Hydrocolloids 2009, 23 (3), 563-576.
(2) Schrieber, R.; Gareis, H. Gelatine Handbook: Theory and Industrial Practice; Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA: Weinheim, 2007.
(3) Alipal, J.; Mohd Pu’ad, N. A. S.; Lee, T. C.; Nayan, N. H. M.; Sahari, N.; Basri, H.; Idris, M. I.; Abdullah, H. Z. A Review of Gelatin: Properties, Sources, Process, Applications, and Commercialisation. Mater. Today: Proc. 2021, 42, 240-250.
(4) Gullapalli, R. P.; Mazzitelli, C. L. Gelatin and Non-Gelatin Capsule Dosage Forms. J. Pharm. Sci. 2017, 106 (6), 1453-1465.
(5) Osmałek, T.; Froelich, A.; Jadach, B.; Tatarek, A.; Gadzinski, P.; Falana, A.; Gralinska, K.; Ekert, M.; Puri, V.; Wrotynska-Barczynska, J.; Michniak-Kohn, B. Recent Advances in Polymer-Based Vaginal Drug Delivery Systems. Pharmaceutics 2021, 13 (6), 884.
(6) Bhagat, V.; Becker, M. L. Degradable Adhesives for Surgery and Tissue Engineering. Biomacromolecules 2017, 18 (10), 3009-3039.
(7) De Clercq, K.; Schelfhout, C.; Bracke, M.; De Wever, O.; Van Bockstal, M.; Ceelen, W.; Remon, J. P.; Vervaet, C. GenipinCrosslinked Gelatin Microspheres as a Strategy to Prevent Postsurgical Peritoneal Adhesions: In Vitro and in Vivo Characterization. Biomaterials 2016, 96, 33-46.
(8) Yuk, H.; Varela, C. E.; Nabzdyk, C. S.; Mao, X.; Padera, R. F.; Roche, E. T.; Zhao, X. Dry Double-Sided Tape for Adhesion of Wet Tissues and Devices. Nature 2019, 575, 169-174.
(9) Li, C.; Marton, I.; Harari, D.; Shemesh, M.; Kalchenko, V.; Pardo, M.; Schreiber, G.; Rudich, Y. Gelatin Stabilizes Nebulized Proteins in Pulmonary Drug Delivery against COVID-19. ACS Biomater. Sci. Eng. 2022, 8 (6), 2553-2563.
(10) Khutoryanskiy, V. V. Advances in Mucoadhesion and Mucoadhesive Polymers. Macromol. Biosci. 2011, 11 (6), 748-764.
(11) Serra, L.; Doménech, J.; Peppas, N. A. Engineering Design and Molecular Dynamics of Mucoadhesive Drug Delivery Systems as Targeting Agents. Eur. J. Pharm. Biopharm. 2009, 71 (3), 519-528.
(12) Bernkop-Schnürch, A. Thiomers: A New Generation of Mucoadhesive Polymers. Adv. Drug Delivery Rev. 2005, 57 (11), 1569-1582.
(13) Laffleur, F.; Bernkop-Schnürch, A. Thiomers: Promising Platform for Macromolecular Drug Delivery. Future Med. Chem. 2012, 4, 2205-2216.
(14) Laffleur, F.; Hörmann, N.; Gust, R.; Ganner, A. Synthesis, Characterization and Evaluation of Hyaluronic Acid-Based Polymers for Nasal Delivery. Int. J. Pharm. 2023, 631, No. 122496.
(15) Davidovich-Pinhas, M.; Bianco-Peled, H. Novel Mucoadhesive System Based on Sulfhydryl-Acrylate Interactions. J. Mater. Sci.: Mater. Med. 2010, 21 (7), 2027-2034.
(16) Kolawole, O. M.; Lau, W. M.; Khutoryanskiy, V. V. Methacrylated Chitosan as a Polymer with Enhanced Mucoadhesive Properties for Transmucosal Drug Delivery. Int. J. Pharm. 2018, 550 (1-2), 123-129.
(17) Tonglairoum, P.; Brannigan, R. P.; Opanasopit, P.; Khutoryanskiy, V. V. Maleimide-Bearing Nanogels as Novel Mucoadhesive Materials for Drug Delivery. J. Mater. Chem. B 2016, 4 (40), 6581-6587.
(18) Kim, K.; Kim, K.; Ryu, J. H.; Lee, H. Chitosan-Catechol: A Polymer with Long-Lasting Mucoadhesive Properties. Biomaterials 2015, 52 (1), 161-170.
(19) Prosperi-Porta, G.; Kedzior, S.; Muirhead, B.; Sheardown, H. Phenylboronic-Acid-Based Polymeric Micelles for Mucoadhesive Anterior Segment Ocular Drug Delivery. Biomacromolecules 2016, 17 (4), 1449-1457.
(20) Menzel, C.; Hauser, M.; Frey, A.; Jelkmann, M.; Laffleur, F.; Götzfried, S. K.; Gust, R.; Bernkop-Schnürch, A. Covalently Binding Mucoadhesive Polymers: N-Hydroxysuccinimide Grafted Polyacrylates. Eur. J. Pharm. Biopharm. 2019, 139, 161-167.
(21) Eshel-Green, T.; Bianco-Peled, H. Mucoadhesive Acrylated Block Copolymers Micelles for the Delivery of Hydrophobic Drugs. Colloids Surf., B 2016, 139, 42-51.
(22) Kaldybekov, D. B.; Tonglairoum, P.; Opanasopit, P.; Khutoryanskiy, V. V. Mucoadhesive Maleimide-Functionalised Liposomes for Drug Delivery to Urinary Bladder. Eur. J. Pharm. Sci. 2018, 111, 83-90.
(23) Kaldybekov, D. B.; Filippov, S. K.; Radulescu, A.; Khutoryanskiy, V. V. Maleimide-Functionalised PLGA-PEG Nanoparticles as Mucoadhesive Carriers for Intravesical Drug Delivery. Eur. J. Pharm. Biopharm. 2019, 143, 24-34.
(24) Shan, X.; Aspinall, S.; Kaldybekov, D. B.; Buang, F.; Williams, A. C.; Khutoryanskiy, V. V. Synthesis and Evaluation of Methacrylated Poly(2-Ethyl-2-Oxazoline) as a Mucoadhesive Polymer for Nasal Drug Delivery. ACS Appl. Polym. Mater. 2021, 3 (11), 5882-5892.
(25) Agibayeva, L. E.; Kaldybekov, D. B.; Porfiryeva, N. N.; Garipova, V. R.; Mangazbayeva, R. A.; Moustafine, R. I.; Semina, I. I.; Mun, G. A.; Kudaibergenov, S. E.; Khutoryanskiy, V. V. Gellan Gum and Its Methacrylated Derivatives as in Situ Gelling Mucoadhesive Formulations of Pilocarpine: In Vitro and in Vivo Studies. Int. J. Pharm. 2020, 577, No. 119093.
(26) Buang, F.; Fu, M.; Chatzifragkou, A.; Amin, M. C. I. M.; Khutoryanskiy, V. V. Hydroxyethyl Cellulose Functionalised with Maleimide Groups as a New Excipient with Enhanced Mucoadhesive Properties. Int. J. Pharm. 2023, 642, No. 123113.
(27) Brotherton, E. E.; Neal, T. J.; Kaldybekov, D. B.; Smallridge, M. J.; Khutoryanskiy, V. V.; Armes, S. P. Aldehyde-Functional Thermoresponsive Diblock Copolymer Worm Gels Exhibit Strong Mucoadhesion. Chem. Sci. 2022, 13, 6888-6898.
(28) Hunter, S. J.; Abu Elella, M. H.; Johnson, E. C.; Taramova, L.; Brotherton, E. E.; Armes, S. P.; Khutoryanskiy, V. V.; Smallridge, M. J. Mucoadhesive Pickering Nanoemulsions via Dynamic Covalent Chemistry. J. Colloid Interface Sci. 2023, 651, 334-345.
(29) Bonferoni, M. C.; Chetoni, P.; Giunchedi, P.; Rossi, S.; Ferrari, F.; Burgalassi, S.; Caramella, C. Carrageenan-Gelatin Mucoadhesive Systems for Ion-Exchange Based Ophthalmic Delivery: In Vitro and Preliminary in Vivo Studies. Eur. J. Pharm. Biopharm. 2004, 57 (3), 465-472.
(30) Padhi, J. R.; Nayak, D.; Nanda, A.; Rauta, P. R.; Ashe, S.; Nayak, B. Development of Highly Biocompatible Gelatin & ICarrageenan Based Composite Hydrogels: In Depth Physiochemical Analysis for Biomedical Applications. Carbohydr. Polym. 2016, 153, 292-301.
(31) Liu, Y.; Cheong NG, S.; Yu, J.; Tsai, W. B. Modification and Crosslinking of Gelatin-Based Biomaterials as Tissue Adhesives. Colloids Surf., B 2019, 174, 316-323.
(32) Jovanović, M.; Tomić, N.; Cvijić, S.; Stojanović, D.; Ibrić, S.; Uskoković, P. Mucoadhesive Gelatin Buccal Films with Propranolol Hydrochloride: Evaluation of Mechanical, Mucoadhesive, and Biopharmaceutical Properties. Pharmaceutics 2021, 13 (2), 273.
(33) Abruzzo, A.; Bigucci, F.; Cerchiara, T.; Cruciani, F.; Vitali, B.; Luppi, B. Mucoadhesive Chitosan/Gelatin Films for Buccal Delivery of Propranolol Hydrochloride. Carbohydr. Polym. 2012, 87 (1), 581588.
(34) Abruzzo, A.; Cerchiara, T.; Bigucci, F.; Gallucci, M. C.; Luppi, B. Mucoadhesive Buccal Tablets Based on Chitosan/Gelatin Microparticles for Delivery of Propranolol Hydrochloride. J. Pharm. Sci. 2015, 104 (12), 4365-4372.
(35) Trastullo, R.; Abruzzo, A.; Saladini, B.; Gallucci, M. C.; Cerchiara, T.; Luppi, B.; Bigucci, F. Design and Evaluation of Buccal Films as Paediatric Dosage Form for Transmucosal Delivery of Ondansetron. Eur. J. Pharm. Biopharm. 2016, 105, 115-121.
(36) Mahaling, B.; Katti, D. S. Understanding the Influence of Surface Properties of Nanoparticles and Penetration Enhancers for Improving Bioavailability in Eye Tissues In Vivo. Int. J. Pharm. 2016, 501, 1-9.
(37) Giordani, B.; Abruzzo, A.; Prata, C.; Nicoletta, F. P.; Dalena, F.; Cerchiara, T.; Luppi, B.; Bigucci, F. Ondansetron Buccal Administration for Paediatric Use: A Comparison between Films and Wafers. Int. J. Pharm. 2020, 580, No. 119228.
(38) Kudaibergenov, S. E. Synthetic and Natural Polyampholytes: Structural and Behavioral Similarity. Polym. Adv. Technol. 2021, 32 (3), 906-918.
(39) Ahmady, A.; Abu Samah, N. H. A Review: Gelatine as a Bioadhesive Material for Medical and Pharmaceutical Applications. Int. J. Pharm. 2021, 608, No. 121037.
(40) Van Den Bulcke, A. I.; Bogdanov, B.; De Rooze, N.; Schacht, E. H.; Cornelissen, M.; Berghmans, H. Structural and Rheological Properties of Methacrylamide Modified Gelatin Hydrogels. Biomacromolecules 2000, 1(1), 31-38.
(41) Claaßen, C.; Claaßen, M. H.; Truffault, V.; Sewald, L.; Tovar, G. E. M.; Borchers, K.; Southan, A. Quantification of Substitution of Gelatin Methacryloyl: Best Practice and Current Pitfalls. Biomacromolecules 2018, 19 (1), 42-52.
(42) Brinkman, W. T.; Nagapudi, K.; Thomas, B. S.; Chaikof, E. L. Photo-Cross-Linking of Type I Collagen Gels in the Presence of Smooth Muscle Cells: Mechanical Properties, Cell Viability, and Function. Biomacromolecules 2003, 4 (4), 890-895.
(43) Nichol, J. W.; Koshy, S. T.; Bae, H.; Hwang, C. M.; Yamanlar, S.; Khademhosseini, A. Cell-Laden Microengineered Gelatin Methacrylate Hydrogels. Biomaterials 2010, 31 (21), 5536-5544.
(44) Norris, S. C. P.; Delgado, S. M.; Kasko, A. M. Mechanically Robust Photodegradable Gelatin Hydrogels for 3D Cell Culture and in Situ Mechanical Modification. Polym. Chem. 2019, 10 (23), 31803193.
(45) Habeeb, A. F. S. A. Determination of Free Amino Groups in Proteins by Trinitrobenzenesulfonic Acid. Anal. Biochem. 1966, 14 (3), 328-336.
(46) Lee, B. H.; Shirahama, H.; Cho, N. J.; Tan, L. P. Efficient and Controllable Synthesis of Highly Substituted Gelatin Methacrylamide for Mechanically Stiff Hydrogels. RSC Adv. 2015, 5 (128), 106094106097.
(47) Zhu, M.; Wang, Y.; Ferracci, G.; Zheng, J.; Cho, N. J.; Lee, B. H. Gelatin Methacryloyl and Its Hydrogels with an Exceptional Degree of Controllability and Batch-to-Batch Consistency. Sci. Rep. 2019, 9, 6863.
(48) Benson, J. E. Viscometric Determination of the Isoelectric Point of a Protein. J. Chem. Educ. 1963, 40 (9), 468-469.
(49) Khutoryanskaya, O. V.; Morrison, P. W. J.; Seilkhanov, S. K.; Mussin, M. N.; Ozhmukhametova, E. K.; Rakhypbekov, T. K.; Khutoryanskiy, V. V. Hydrogen-Bonded Complexes and Blends of Poly(Acrylic Acid) and Methylcellulose: Nanoparticles and Mucoadhesive Films for Ocular Delivery of Riboflavin. Macromol. Biosci. 2014, 14 (2), 225-234.
(50) Irmukhametova, G. S.; Mun, G. A.; Khutoryanskiy, V. V. Thiolated Mucoadhesive and PEGylated Nonmucoadhesive Organosilica Nanoparticles from 3-Mercaptopropyltrimethoxysilane. Langmuir 2011, 27 (15), 9551-9556.
(51) Mun, E. A.; Williams, A. C.; Khutoryanskiy, V. V. Adhesion of Thiolated Silica Nanoparticles to Urinary Bladder Mucosa: Effects of PEGylation, Thiol Content and Particle Size. Int. J. Pharm. 2016, 512 (1), 32-38.
(52) Porfiryeva, N. N.; Nasibullin, S. F.; Abdullina, S. G.; Tukhbatullina, I. K.; Moustafine, R. I.; Khutoryanskiy, V. V. Acrylated Eudragit® E PO as a Novel Polymeric Excipient with Enhanced Mucoadhesive Properties for Application in Nasal Drug Delivery. Int. J. Pharm. 2019, 562, 241-248.
(53) Haddow, P. J.; da Silva, M. A.; Kaldybekov, D. B.; Dreiss, C. A.; Hoffman, E.; Hutter, V.; Khutoryanskiy, V. V.; Kirton, S. B.; Mahmoudi, N.; McAuley, W. J.; Cook, M. T. Polymer Architecture Effects on Poly( -diethyl acrylamide)- -Poly(ethylene glycol)- Poly( -diethyl acrylamide) Thermoreversible Gels and Their Evaluation as a Healthcare Material. Macromol. Biosci. 2022, 22 (3), No. 2100432.
(54) Kolawole, O. M.; Lau, W. M.; Khutoryanskiy, V. V. Synthesis and Evaluation of Boronated Chitosan as a Mucoadhesive Polymer for Intravesical Drug Delivery. J. Pharm. Sci. 2019, 108 (9), 3046-3053.
(55) Hoch, E.; Schuh, C.; Hirth, T.; Tovar, G. E. M.; Borchers, K. Stiff Gelatin Hydrogels Can Be Photo-Chemically Synthesized from Low Viscous Gelatin Solutions Using Molecularly Functionalized Gelatin with a High Degree of Methacrylation. J. Mater. Sci. Mater. Med. 2012, 23 (11), 2607-2617.
(56) Kim, S.; Nimni, M. E.; Yang, Z.; Han, B. Chitosan/GelatinBased Films Crosslinked by Proanthocyanidin. J. Biomed. Mater. Res. 2005, 75B (2), 442-450.
(57) Barth, A. Infrared Spectroscopy of Proteins. Biochim. Biophys. Acta – Bioenerg. 2007, 1767 (9), 1073-1101.
(58) Hashim, D. M.; Man, Y. B. C.; Norakasha, R.; Shuhaimi, M.; Salmah, Y.; Syahariza, Z. A. Potential Use of Fourier Transform Infrared Spectroscopy for Differentiation of Bovine and Porcine Gelatins. Food Chem. 2010, 118 (3), 856-860.
(59) Cebi, N.; Durak, M. Z.; Toker, O. S.; Sagdic, O.; Arici, M. An Evaluation of Fourier Transforms Infrared Spectroscopy Method for the Classification and Discrimination of Bovine, Porcine and Fish Gelatins. Food Chem. 2016, 190, 1109-1115.
(60) Rahali, K.; Ben Messaoud, G.; Kahn, C. J. F.; SanchezGonzalez, L.; Kaci, M.; Cleymand, F.; Fleutot, S.; Linder, M.; Desobry, S.; Arab-Tehrany, E. Synthesis and Characterization of Nanofunctionalized Gelatin Methacrylate Hydrogels. Int. J. Mol. Sci. 2017, 18 (12), 2675.
(61) Sheppard, S. E.; Houck, R. C. The Structure of Gelatin Sols and Gels. III. J. Phys. Chem. 1930, 34 (10), 2187-2201.
(62) Johlin, J. M. The Isoelectric Point of Gelatin and Its Relation to the Minimum Physical Properties of Gelatin. J. Biol. Chem. 1930, 86 (1), 231-243.
(63) Lowe, A. B.; McCormick, C. L. Synthesis and Solution Properties of Zwitterionic Polymers. Chem. Rev. 2002, 102 (11), 4177-4190.
(64) Gudmundsson, M. Rheological Properties of Fish Gelatins. J. Food Sci. 2002, 67 (6), 2172-2176.
(65) Goudoulas, T. B.; Germann, N. Phase Transition Kinetics and Rheology of Gelatin-Alginate Mixtures. Food Hydrocolloids 2017, 66, 49-60.
(66) Boran, G.; Mulvaney, S. J.; Regenstein, J. M. Rheological Properties of Gelatin from Silver Carp Skin Compared to Commercially Available Gelatins from Different Sources. J. Food Sci. 2010, 75 (8), E565-E571.
(67) ISO 10993-5:2009(en), Biological evaluation of medical devices – Part 5: Tests for in vitro cytotoxicity. https://www.iso.org/ obp/ui/#iso:std:iso:10993:-5:ed-3:v1:en (accessed 2022-09-03).
(68) Elzoghby, A. O.; Samy, W. M.; Elgindy, N. A. Protein-Based Nanocarriers as Promising Drug and Gene Delivery Systems. J. Controlled Release 2012, 161 (1), 38-49.
(69) Suresh, D.; Suresh, A.; Kannan, R. Engineering Biomolecular Systems: Controlling the Self-Assembly of Gelatin to Form UltraSmall Bioactive Nanomaterials. Bioact. Mater. 2022, 18, 321-336.
(70) Ulubayram, K.; Aksu, E.; Gurhan, S. I. D.; Serbetci, K.; Hasirci, N. Cytotoxicity Evaluation of Gelatin Sponges Prepared with Different Cross-Linking Agents. J. Biomater. Sci. Polym. Ed. 2002, 13 (11), 1203-1219.
(71) Won, Y.-W.; Kim, Y.-H. Preparation and Cytotoxicity Comparison of Type a Gelatin Nanoparticles with Recombinant Human Gelatin Nanoparticles. Macromol. Res. 2009, 17 (7), 464468.
(72) Shin, H.; Olsen, B. D.; Khademhosseini, A. The Mechanical Properties and Cytotoxicity of Cell-Laden Double-Network Hydrogels Based on Photocrosslinkable Gelatin and Gellan Gum Biomacromolecules. Biomaterials 2012, 33 (11), 3143-3152.
(73) Adriaens, E.; Remon, J. P. Gastropods as an Evaluation Tool for Screening the Irritating Potency of Absorption Enhancers and Drugs. Pharm. Res. 1999, 16 (8), 1240-1244.
(74) Adriaens, E.; Dierckens, K.; Bauters, T. G. M.; Nelis, H. J.; Van Goethem, F.; Vanparys, P.; Remon, J. P. The Mucosal Toxicity of Different Benzalkonium Chloride Analogues Evaluated with an Alternative Test Using Slugs. Pharm. Res. 2001, 18 (7), 937-942.
(75) Callens, C.; Adriaens, E.; Dierckens, K.; Remon, J. P. Toxicological Evaluation of a Bioadhesive Nasal Powder Containing a Starch and Carbopol® 974 P on Rabbit Nasal Mucosa and Slug Mucosa. J. Controlled Release 2001, 76 (1-2), 81-91.
(76) Ceulemans, J.; Vermeire, A.; Adriaens, E.; Remon, J. P.; Ludwig, A. Evaluation of a Mucoadhesive Tablet for Ocular Use. J. Controlled Release 2001, 77 (3), 333-344.
(77) Adriaens, E.; Ameye, D.; Dhondt, M. M. M.; Foreman, P.; Remon, J. P. Evaluation of the Mucosal Irritation Potency of Co-Spray Dried Amioca®/Poly(Acrylic Acid) and Amioca®/Carbopol® 974P Mixtures. J. Controlled Release 2003, 88 (3), 393-399.
(78) Dhondt, M.; Adriaens, E.; Roey, J.; Remon, J. The Evaluation of the Local Tolerance of Vaginal Formulations Containing Dapivirine Using the Slug Mucosal Irritation Test and the Rabbit Vaginal Irritation Test. Eur. J. Pharm. Biopharm. 2005, 60 (3), 419425.
(79) Adriaens, E.; Remon, J. P. Mucosal Irritation Potential of Personal Lubricants Relates to Product Osmolality as Detected by the Slug Mucosal Irritation Assay. Sex. Transm. Dis. 2008, 35 (5), 512516.
(80) Adriaens, E.; Bytheway, H.; De Wever, B.; Eschrich, D.; Guest, R.; Hansen, E.; Vanparys, P.; Schoeters, G.; Warren, N.; Weltens, R.; Whittingham, A.; Remon, J. P. Successful Prevalidation of the Slug Mucosal Irritation Test to Assess the Eye Irritation Potency of Chemicals. Toxicol. In Vitro 2008, 22 (5), 1285-1296.
(81) Lenoir, J.; Adriaens, E.; Remon, J. P. New Aspects of the Slug Mucosal Irritation Assay: Predicting Nasal Stinging, Itching and Burning Sensations. J. Appl. Toxicol. 2011, 31 (7), 640-648.
(82) Lenoir, J.; Bachert, C.; Remon, J. P.; Adriaens, E. The Slug Mucosal Irritation (SMI) Assay: A Tool for the Evaluation of Nasal Discomfort. Toxicol. In Vitro 2013, 27 (6), 1954-1961.
(83) Petit, J. Y.; Doré, V.; Marignac, G.; Perrot, S. Assessment of Ocular Discomfort Caused by 5 Shampoos Using the Slug Mucosal Irritation Test. Toxicol. In Vitro 2017, 40, 243-247.
(84) Balls, M.; Goldberg, A. M.; Fentem, J. H.; Broadhead, C. L.; Burch, R. L.; Festing, M. F. W.; Frazier, J. M.; Hendriksen, C. F. M.; Jennings, M.; van der Kamp, M. D. O.; Morton, D. B.; Rowan, A. N.; Russell, C.; Russell, W. M. S.; Spielmann, H.; Stephens, M. L.; Stokes, W. S.; Straughan, D. W.; Yager, J. D.; Zurlo, J.; van Zutphen, B. F. M. The Three Rs: The Way Forward: The Report and Recommendations of ECVAM Workshop 11. Altern. to Lab. Anim. 1995, 23 (6), 838866.
(85) Moiseev, R. V.; Steele, F.; Khutoryanskiy, V. V. Polyaphron Formulations Stabilised with Different Water-Soluble Polymers for Ocular Drug Delivery. Pharmaceutics 2022, 14 (5), 926.
(86) Hussain, A.; Ahsan, F. The Vagina as a Route for Systemic Drug Delivery. J. Controlled Release 2005, 103 (2), 301-313.
(87) Krogstad, E. A.; Rathbone, M. J.; Woodrow, K. A. Vaginal Drug Delivery. In Focal Controlled Drug Delivery. Advances in Delivery Science
and Technology; Domb, A. J., Khan, W., Eds.; Springer: Boston, MA, 2014; pp 607-651.
(88) Shapiro, R. L.; DeLong, K.; Zulfiqar, F.; Carter, D.; Better, M.; Ensign, L. M. In Vitro and Ex Vivo Models for Evaluating Vaginal Drug Delivery Systems. Adv. Drug Delivery Rev. 2022, 191, No. 114543.
(89) Davidovich-Pinhas, M.; Bianco-Peled, H. Methods to Study Mucoadhesive Dosage Forms. In Mucoadhesive Materials and Drug Delivery Systems; Khutoryanskiy, V. V., Ed.; John Wiley & Sons, Ltd: Chichester, U.K., 2014; pp 175-196.
(90) Eschenbach, D. A.; Thwin, S. S.; Patton, D. L.; Hooton, T. M.; Stapleton, A. E.; Agnew, K.; Winter, C.; Meier, A.; Stamm, W. E. Influence of the Normal Menstrual Cycle on Vaginal Tissue, Discharge, and Microflora. Clin. Infect. Dis. 2000, 30 (6), 901-907.
(91) Sogias, I. A.; Williams, A. C.; Khutoryanskiy, V. V. Why Is Chitosan Mucoadhesive? Biomacromolecules 2008, 9 (7), 1837-1842.
(92) Fu, M.; Filippov, S. K.; Williams, A. C.; Khutoryanskiy, V. V. On the Mucoadhesive Properties of Synthetic and Natural Polyampholytes. J. Colloid Interface Sci. 2024, 659, 849-858.
(93) Lale, A. M.; Mason, J. D. T.; Jones, N. S. Mucociliary Transport and Its Assessment: A Review. Clin. Otolaryngol. Allied Sci. 1998, 23 (5), 388-396.
(94) Sahin-Yilmaz, A.; Naclerio, R. M. Anatomy and Physiology of the Upper Airway. Proc. Am. Thorac. Soc. 2011, 8 (1), 31-39.
(95) Beule, A. G. Physiology and Pathophysiology of Respiratory Mucosa of the Nose and the Paranasal Sinuses. GMS Curr. Top. Otorhinolaryngol. Head Neck Surg. 2010, 9, Doc07.
(96) Chavda, V. P.; Jogi, G.; Shah, N.; Athalye, M. N.; Bamaniya, N.; K Vora, L.; Cláudia Paiva-Santos, A. Advanced Particulate CarrierMediated Technologies for Nasal Drug Delivery. J. Drug Delivery Sci. Technol. 2022, 74, No. 103569.
(97) Favaro-Trindade, C. S.; Santana, A. S.; Monterrey-Quintero, E. S.; Trindade, M. A.; Netto, F. M. The Use of Spray Drying Technology to Reduce Bitter Taste of Casein Hydrolysate. Food Hydrocolloids 2010, 24 (4), 336-340.
(98) Osman, R.; Kan, P. L.; Awad, G.; Mortada, N.; El-Shamy, A. E.; Alpar, O. Spray Dried Inhalable Ciprofloxacin Powder with Improved Aerosolisation and Antimicrobial Activity. Int. J. Pharm. 2013, 449 (12), 44-58.