https://doi.org/10.1038/s41586-025-08974-4
تاريخ الاستلام: 25 مارس 2024
تم القبول: 3 أبريل 2025
نُشر على الإنترنت: 7 مايو 2025
الوصول المفتوح
تحقق من التحديثات

الحديد يحفز أكسدة الدهون في الأغشية البيولوجية ويعزز شكلًا من أشكال موت الخلايا يسمى الفيروبتوز. تحديد مكان حدوث هذه الكيمياء في الخلية يمكن أن يُفيد في تصميم أدوية قادرة على تحفيز أو تثبيط الفيروبتوز في سياقات مرضية مختلفة. وقد كشفت الأساليب الجينية عن مثبطات الفيروبتوز. ؛ بالمقابل، يمكن للجزيئات الصغيرة أن توفر تحكمًا مكانيًا وزمنيًا في الكيمياء التي تعمل. . هنا نوضح أن مثبط الفيروبتوزيس ليبروكستاتين-1 يمارس تأثيرات واقية للخلايا من خلال تعطيل الحديد في الليزوزومات. كما نوضح أن المحفز للفيروبتوزيس RSL3 يبدأ أكسدة الدهون الغشائية في الليزوزومات. قمنا بتصميم منشط جزيئي صغير للحديد الليزوزومي – فنتوميسين-1 – لتحفيز التحلل الأكسيدي للفوسفوليبيدات وفي النهاية الفيروبتوزيس. فنتوميسين-1 قادر على قتل CD44 الغني بالحديد. خلايا الساركوما الأولية والأدينوكارسينوما القناة البنكرياسية، التي يمكن أن تعزز الانتقال وتغذي تحمل الأدوية. في مثل هذه الخلايا، ينظم الحديد تكيف الخلايا. بينما يمنح القابلية للفيروبتوسيس تكتسب خلايا الساركوما المعرضة لجرعات غير مميتة من الفينتوميسين-1 حالة مقاومة للفيروبتوز تتميز بتقليل علامات الميزانشيم وتنشيط استجابة تلف الغشاء. يمكن لهذا المحلل للفوسفوليبيد القضاء على خلايا السرطان المقاومة للأدوية في المختبر ويقلل من نمو الأورام داخل العقد اللمفاوية في نموذج فأر لانتشار سرطان الثدي. معًا، تُظهر هذه النتائج أن التحكم في تفاعل الحديد يوفر فوائد علاجية، وتؤسس الحديد الليزوزومي كهدف قابل للعلاج وتبرز قيمة استهداف حالات الخلايا. .

يتفاعل الحديد مع البيروكسيدات لإنتاج جذر حُر مركزي بالأكسجين. في الخلية، يمكن أن يبدأ مثل هذا العملية وينشر سلسلة من التفاعلات الجذرية التي تؤدي إلى منتجات عضوية مؤكسدة، وهي كيمياء تُعرف بشكل عام بتفاعل فنتون. الدهون الكيميائية التفاعلية في الأغشية البيولوجية هي ركائز مثالية لمثل هذه التفاعلات وقد تم الإشارة إليها في عملية الفيروبتوسيس. يمكن أن يؤدي تراكم الفوسفوليبيدات التالفة في النهاية إلى فقدان سلامة الغشاء مع تغير
وظائف العضيات وإطلاق أنواع مختلفة من الكيانات الكيميائية في الخلية، والتي يمكن أن تسبب مزيدًا من العيوب الخلوية وموت الخلايا. تتضمن الفيروبتوزيس عضيات مميزة. بما في ذلك البيروكسيومات الميتوكوندريا الشبكة الإندوبلازمية (ER) والليزوزومات . ومع ذلك، فإنه من غير الواضح حاليًا ما إذا كانت العضيات الفردية تساهم في الفيروبتوز من خلال إعاقة إشارات الخلايا، أو الأيض، أو تخليق جزيئات حيوية معينة، أو ما إذا كانت الدهون الغشائية

تعتبر هذه الحُجرات أيضًا ركائز مباشرة للأكسدة المعتمدة على الحديد التي تؤدي إلى موت الخلايا. وقد أظهرت الدراسات أن خلايا السرطان تحتاج إلى ليسوزومات وظيفية لتخضع لعملية الفيروبتوز. . تسلط هذه النتيجة الضوء على أهمية استيراد الحديد الخلوي وتدعم الفكرة القائلة بأن الحديد له دور في تعزيز موت الخلايا. إن تثبيط الحركة الدوائية للحديد من الجسيمات الحالة يعزز أكسدة الدهون في أغشية الجسيمات الحالة. ، مما يشير إلى أن مجموعة الحديد النشطة في هذا العضية يمكن أن تحفز الفيروبتوز. يمكن أن تحفز المركبات الاصطناعية من الإندوبيروكسيدات، وهي بدائل للدهون المؤكسدة التي تميل إلى التراكم في الشبكة الإندوبلازمية، الفيروبتوز، مما يقترح أن تأكسد الدهون يمكن أن ينتشر من خلال هذه العضية. ومع ذلك، فإنه غير واضح حاليًا أين يتم بدء أكسدة الدهون الغشائية بواسطة الحديد في الخلية قبل أن تنتشر عبر الدهون الغشائية القريبة الأخرى.

قمنا بتحديد المواقع تحت الخلوية لعمل ليبروكستاتين-1 (Lip-1)، وهو جزيء صغير يحمي الخلايا من الموت الناتج عن تعطيل مثبطات الفيروبتوز. قمنا بتسمية نظير يحتوي على الألكاين قابل للنقر من Lip-1 (المسمى cLip-1) باستخدام كيمياء النقر داخل الخلايا وأجرينا مجهرية الفلورسنت. في خطوط الخلايا المختلفة. كشفت النتائج عن تراكم الليزوزومات في خلايا الساركوما الليفية HT-1080، وفي خلايا سرطان القناة البنكرياسية البشرية الأولية (PDAC)، وفي خلايا الأورام الدائرة في الرئة والقولون، وفي خلايا سرطان الثدي في الفئران 4T1 (الشكل 1 أ والشكل الممتد 1 أ-و). من الجدير بالذكر أن cLip-1 المعلم تم اكتشافه فقط في الحجرة الإندوليزوزومية، حتى عند تركيز أعلى من الجرعة الفعالة. تدعم هذه النتيجة الفكرة القائلة بأن Lip-1 يمارس نشاطه المضاد للفيروبوتوز في هذه العضية. في الجسم الحي، زاد cLip-1 من بقاء الفئران التي تم تحفيز الفشل الكلوي الحاد فيها من خلال الحذف الجيني لـ الذي يشفر مثبط الفيروبتوزيس بيروكسيداز الجلوتاثيون (الشكل 1ب). أظهر وسم cLip-1 في أنسجة الفئران تراكمه في الكلى، حيث تزامن مع علامة ليفوسوم في الأنابيب القريبة من الكلى (الشكل 1ج والشكل التمديدي 1ز). في المختبر، منع cLip-1 أكسدة الدهون الغشائية وحمى الخلايا من آثار النقص الجيني في Gpx4 أو التثبيط الدوائي لـ GPX4 باستخدام RSL3، مما يعيد تجسيد النشاط البيولوجي لـ Lip-1 (الشكل التمديدي 1ح-ي). هذه البيانات تؤكد أن cLip-1 هو بديل مناسب لـ Lip-1 للتحقيق في الفيروبتوز.

الكلاتير الحديدي الضيق ديفيروكسامين (DFO) يحمي الخلايا من الموت الخلوي الناتج عن الإراستين. بالمقابل، يظهر Lip-1 خصائص مضادة للأكسدة قادرة على التقاط الجذور الحرة (RTA) في المختبر. . ومع ذلك، على عكس معظم RTAs التي تعيق الفيروبتوز، مثل لا يتبع ليب-1 الاتجاه العام للعديد من مثبطات الفيروبتوز، حيث أن نشاط RTA مرتبط ارتباطًا وثيقًا بتثبيط الفيروبتوز. . تشير هذه النتيجة إلى أن خصائص أخرى لـ Lip-1 تساهم في تأثيراته المضادة للفيروبتوز. في خلايا السرطان، يمكن أن يتم امتصاص الحديد عن طريق الإندوسيتوز. وينظم انتقالات حالة الخلية وتكاثر الخلايا . لأن cLip-1 يتراكم في الليزوزومات ويحتوي على ذرات نيتروجين قابلة للتفاعل مع الحديد، قمنا بالتحقيق في إمكانية أن خصائص تثبيط الفيروبتوز قد تنتج عن تعطيل الحديد في هذه العضية. أظهرت مطيافية الرنين المغناطيسي النووي (NMR) أن Lip-1 يتفاعل مع الحديد(III) بنسب 1:1 و 2:1 (الشكل 1d). أدى تيترا Lip-1 مع كلوريد الحديد(III) إلى توسيع الإشارة مع تحول في الأسفل لإشارات البروتونات المجاورة لذرات النيتروجين في Lip-1، مما يدل على حدوث تنسيق مع أزواج النيتروجين الوحيدة مع الحمض لويس. بالمقابل، ظلت إشارات البروتونات للنفتالين، الذي تم استخدامه كتحكم داخلي لعدم احتوائه على ذرات غير متجانسة، غير متأثرة (الشكل 1k من البيانات الموسعة). علاوة على ذلك، أدى إضافة حمض برونستيد إلى Lip-1 إلى تحولات مميزة في الأسفل لإشارات البروتونات، مما يدل على بروتنة ذرات النيتروجين (الشكل 1e). من الجدير بالذكر أن توسيع خط إشارات البروتونات لوحظ فقط في وجود المعدن البارامغناطيسي (الشكل 11-n من البيانات الموسعة). علاوة على ذلك، لم تؤدي إضافة حمض ثلاثي فلورو الأسيتيك (TFA) إلى محلول من الحديد(III) و Lip-1 إلى إزاحة الحديد بالكامل من Lip-1، كما هو موضح بـ
تحولات كيميائية أعادت تلخيص تأثيرات الأحماض لويس وبرونستيد. تشير هذه البيانات إلى أن ارتباط Lip-1 بالحديد يمكن أن يحدث في ظروف حمضية، مثل تلك الموجودة في الليزوزومات. أدت إضافة هيدروكسيد الصوديوم إلى استعادة التحولات الكيميائية لـ Lip-1 غير المرتبط، وهو نتيجة تُظهر الطبيعة القابلة للعكس لتفاعلات Lip-1 مع الحديد (الشكل التمديدي 1o). أنتجت نمذجة جزيئية باستخدام حساب تحويل فورييه المنفصل عدة أوضاع ارتباط محتملة بين الحديد وLip-1، بما في ذلك معقدات الحديد الرباعية الجزيئية الثنائية التي تشمل وظائف البيبيريدين، والأميدين، والأنيلين لـ Lip-1 (الشكل 1f والمعلومات التكميلية).

الجهد الكهربائي الدوري، الذي يُستخدم لتحديد الجهد الاختزالي للمعادن في المحلول “، أشار إلى أن Lip-1 و DFO يغيران خصائص الأكسدة والاختزال للحديد (الشكل 1g). كضوابط، قمنا بدراسة اثنين من النظائر الاصطناعية الأخرى لـ Lip-1: metcLip-1 و alcLip-1. في metcLip-1، تم ميثلة الأمينات العطرية، مما أثر سلبًا على نشاط RTA. بالمقابل، alcLip-1 هو نظير أليفاتي يحتوي على أمينات لها ثابت تفكك حمضي سالب لوغاريتمي أعلى. ) القيمة مقارنة بنظيراتها العطرية. كان من المتوقع أن يكون هذا النظير مؤينًا بالكامل عند درجة الحموضة المحايدة وبالتالي يظهر ميلًا أقل لدخول الخلايا والتراكم في الليزوزومات (الشكل 2a من البيانات الموسعة). أظهر وسم metcLip-1 في الخلايا نمط تلوين مشابه لذلك الخاص بـ cLip-1 المسمى، مما يدل على التوضع المشترك مع علامة ليزوزومية. بالمقابل، أظهر alcLip-1 المسمى فلوريسنس ضعيف (الشكل 2b من البيانات الموسعة). أشارت نتائج الفولتمترية الدورية أيضًا إلى أن metcLip-1 غيرت الجهد الكهروكيميائي للحديد بشكل أكبر من alcLip-1 (الشكل 2c من البيانات الموسعة). وبشكل متسق، حمى metcLip-1 الخلايا من أكسدة الدهون الغشائية الناتجة عن RSL3 بشكل أقوى من alcLip-1 (الشكل 2d من البيانات الموسعة)، ولم يظهر أي من metcLip-1 أو alcLip-1 خصائص RTA في المختبر (الشكل 2e من البيانات الموسعة). تم وسم مشتق يحتوي على الألكاين من DFO (cDFO) في الخلايا كما كشفت عن إشارات ليفوسومية، مما قدم دعماً للنشاط المؤيد للفيروبتوز في هذه العضية (الشكل 2f من البيانات الموسعة). كما وُجدت إشارات cDFO في نواة الخلية، مما يفسر جزئياً سمية هذا الخالب للحديد ونمطه الظاهري المميز مقارنةً بجزيئات صغيرة أخرى تتفاعل مع الحديد، بما في ذلك Lip-1.

في نظام خالٍ من الخلايا، قلل Lip-1 من الفلورية لمسبار فلوري محدد للحديد (III) في وجود الحديد (III). (الشكل 2g من البيانات الموسعة). أدى علاج الخلايا بالهيدروكسي كلوروكين أو بافيلوميسين-A1، اللذان يزيدان من درجة حموضة الليسوزوم ويمنعان تفريغ الحديد (III) من حامليه الداخليين، إلى تقليل مخزونات الحديد (III) الخلوي القابل للتخلب والحديد (II) الليسوزومي التفاعلي، كما تم قياسه باستخدام مجسات فلورية محددة. . هذه العلاجات أيضًا حمت الخلايا من أكسدة الدهون الغشائية الناتجة عن RSL3 في خلايا السرطان (الشكل 1h-j والبيانات الموسعة الشكل. تم الحصول على نتائج مماثلة مع Lip-1، والتي كانت متسقة مع التفاعلات المباشرة لهذه المركب مع الحديد الليزوزومي (الشكل 1h-j وبيانات ممتدة الشكل 2h-j). بعد العلاج بـ RSL3 لمدة ساعة واحدة، تم الكشف عن أكسدة الدهون الغشائية بشكل رئيسي في الليزوزومات، كما تم تقييمه من خلال مستويات فلورية من Liperfluo وBodipy 665/676 (الشكل 1k وبيانات ممتدة الأشكال 2k و3a). بالمقابل، أدى العلاج بـ RSL3 لمدة 4 ساعات إلى نمط تلوين للدهون الغشائية المؤكسدة التي تزامنت بشكل رئيسي مع علامة بيولوجية ملونة فلوريسنتياً للشبكة الإندوبلازمية (بيانات ممتدة الشكل 3b). تشير بياناتنا إلى أن بدء تفاعل السلسلة الجذرية يحدث مبكراً في الحجرة الإندوليزوزومية، حيث يمكن العثور على الحديد النشط في حالة الأكسدة. يمكن أن تنتشر هذه التفاعل السلسلي الجذري بعد ذلك إلى الدهون الغشائية للعضيات الأخرى في الجوار، بما في ذلك الشبكة الإندوبلازمية. دعمًا لهذه الفرضية، أدى علاج الخلايا بمحفزات الفيروبتوسيس المعروفة إلى استنفاد الجلوتاثيون وزيادة مستويات الجذور الحرة المرتكزة على الأكسجين في الليزوزومات (الشكل 3c-e من البيانات الموسعة). معًا، تشير هذه البيانات إلى أن الحديد الليزوزومي له دور مركزي في تحفيز الفيروبتوسيس.

خلايا السرطان التي اكتسبت حالة خلوية مقاومة للأدوية (DTP) تكون عرضة للفيروبتوز. تتميز خلايا سرطان DTP

الشكل 1 | الحديد الليزوزومي يحفز أكسدة الدهون الغشائية. أ، مخطط (يسار)، صور (وسط) وقياس (يمين) لتوسيم cLip-1 في الخلايا. تجارب مستقلة في خلايا HT-1080. البيانات هي المتوسط ± الانحراف المعياري. Asc، أسكوربات؛ Lys.، ليسوزوم؛ PFA، بارافورمالدهيد. ب، منحنيات بقاء كابلان-ماير لـ Rosa26-CreERT2؛ Gpx4 الفئران المعالجة بـ cLip-1 لكل كيلوجرام في اليوم عن طريق الحقن داخل البطن؛ الفئران لكل مجموعة). اختبار مانتل-كوكس لوج-رانك. الأسهم تشير إلى توقيت حقنتي التاموكسيفين. متوسط أيام البقاء على قيد الحياة موضح. ج، صور فلورية لـ cLip-1 المعلم في الأنابيب القريبة الكلوية لـ Rosa26-CreERT2;Gpx4 فأر بعد 7 أيام من علاج التاموكسيفين. الصور تمثل فئران. د، طيف الرنين المغناطيسي النووي لـ Lip-1 المعياري مع (أحمر، 2:1 ليب-1 إلى الحديد؛ أخضر، 1:1 ليب-1 إلى الحديد). هـ، طيف الرنين المغناطيسي النووي لـ Lip-1 المضاف إليه ثم TFA. الطيف المرجعي الأزرق هو Lip-1 + 3 معادلة TFA.f، أوضاع الربط المحتملة لـ Lip-1 والحديد المستمدة من النمذجة الجزيئية.g، الفولتمترية الدورية لـ حل مع Lip-1 (يسار) أو DFO (يمين) (إمكانات الاختزال موضحة بالأسهم الوردية). SCE، إلكترود الكالوميل المشبع. ح-ك، البيانات خاصة بخلايا HT-1080. ح، تحليل تدفق الخلايا.
تمت معالجته بالمركبات المحددة لمدة 15 دقيقة ثم بمسبار الحديد (III) RPE لـ تجارب مستقلة. وحدة عشوائية؛ MFI، متوسط شدة الفلورة. i، قياس التدفق الخلوي للخلايا المعالجة بالمركبات المحددة لمدة 15 دقيقة ثم مع مجس الحديد (II) HMRhoNox-M لمدة 15 دقيقة. تجارب مستقلة. قياس تدفق الخلايا المعالجة بـ RSL3 (1 ساعة) ومع بافيلوميسين-A1 (Baf-A1) أو هيدروكسي كلوروكوين (HCQ) ساعتين قبل. تجارب مستقلة. تحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA). ك، تصوير الفلورسنت لـ Liperfluo في خلايا تم علاجها بـ RSL3 . تجارب مستقلة. غير متطابقة ذات جانبين -اختبار. البيانات هي المتوسط ± الانحراف المعياري، طيف NMR المسجل عند 310 كلفن في الميثانول- . ل و ، القيم من نوع غير متزاوج ذو جانبين -اختبار مقارنة مع المركبة. تم استخدام التركيزات التالية: h، i، Lip-1 باف-أ1 تظهر مخططات الصندوق نطاق الربع، مع خطوط مركزية تشير إلى الوسيطات وشعيرات تشير إلى القيم الدنيا والقصوى. شريط القياس، .
عن طريق التعبير العالي لبروتين امتصاص الحديد CD44، وهو بروتين سكري موجود في غشاء الخلية يتم إدخاله عن طريق البلعمة ويستخدم كعلامة على خصائص الخلايا السرطانية والانتقال. . وبالتالي، تظهر هذه الخلايا
زيادة امتصاص الحديد، مما يؤدي إلى زيادة مستويات الحديد الخلوية التي بدورها تعزز نشاط الديميثيلاز المعتمد على الحديد . هذه العملية تنشط برامج محددة على مستوى الإبيجينيتك والترجمة الجينية
التي تكمن وراء انتقالات حالة الخلية واكتساب نمط ظاهرة DTP وبالتالي، ظهر الحديد الليزوزومي كهدف قابل للعلاج لتعزيز الفيروبتوزيس بطريقة تعتمد على حالة الخلية. مع وضع ذلك في الاعتبار ومع العلم أن الحديد الليزوزومي يمكن أن يحفز أكسدة الدهون الغشائية قمنا بتصميم جزيء صغير لاستهداف الدهون في الغشاء البلازمي وتنشيط الحديد (II) في الليزوزومات عند الابتلاع الخلوي. مثل هذا المركب سيستغل الدهون التفاعلية القريبة في الغشاء كركائز للأكسدة. لهذا الغرض، قمنا بتخليق مركب ثنائي الوظيفة يتكون من المنتج الطبيعي الفلوري الليبوفيلك مارمايسين والليغاند الاصطناعي تشين-وايت، الذي أطلقنا عليه اسم فنتومايسين-1 (Fento-1) (الشكل 2أ والشكل التمديدي 4أ-هـ). يتجمع مارمايسين عند الغشاء البلازمي ويتم امتصاصه عن طريق الابتلاع الخلوي. بينما يُستخدم ligand Chen-White عادةً في التخليق الكيميائي لأكسدة الركائز العضوية عن طريق تنشيط الحديد (II) في وجود بيروكسيد الهيدروجين وتحت ظروف مائية حمضية خفيفة، مثل تلك الموجودة في الليزوزومات، يُعتقد أن محفز الحديد تشين-وايت يشكل نوعًا تفاعليًا من الحديد-أوكسي. . مثل الجذور الحرة الهيدروكسيلية والهيدروبيروكسيلية، يمكن لهذا الوسط أن يستخلص ذرة هيدروجين من الركائز العضوية، بما في ذلك المشبعة، لإنتاج جذور كربونية تفاعلية ومنتجات أكسدة لاحقة. لذلك، فإن فنتو-1 يشبه جزيئًا صغيرًا ثنائي الوظيفة قادرًا على تحفيز القرب من جديد بين محفز والأحماض النووية أو البروتينات لتعزيز التحلل. اقترحنا أنه من خلال استغلال الكمية الوفيرة من الحديد (II) التفاعلي في خلايا سرطان DTP ستشكل جزيء ثنائي الوظيفة هذا محفزًا نشطًا في الخلية لتعزيز التحلل التأكسدي للدهون الغشائية الليزوزومية وفي النهاية تحفيز الفيروبتوز.

في نظام خالٍ من الخلايا، عزز Fento-1 الأكسدة الناتجة عن الحديد للفوسفوليبيد غير المشبع الذي يشكل الحويصلات تحت ظروف تجريبية مشابهة لتلك الموجودة في الليزوزومات. أي، درجة حموضة حمضية، وجود بيروكسيد الهيدروجين وملح الحديد (II) القابل للذوبان في الماء (الشكل 2ب والجدول التكميلي 1). من الجدير بالذكر أن الحديد عزز أكسدة طبقة الفوسفوليبيد في وجود بيروكسيد الهيدروجين دون إنزيمات، مما يدعم بالتالي فكرة أن مثل هذه العملية تحدث في الخلية. كشفت الفلورية الذاتية لـ Fento-1 عن موضعه عند الغشاء البلازمي عندما تم إجراء التجارب في درجة حرارة منخفضة لتقليل تدفق الإدخال الخلوي (الشكل التمديدي 5أ)، مما يعيد تجسيد الخصائص الضوئية الفيزيائية للمنتج الطبيعي الأم. بالمقابل، عند درجة حرارة فسيولوجية، والتي تمكن حدوث الإدخال الخلوي، تم اكتشاف Fento-1 وmarmycin في الحجرة الداخلية الليزوزومية (الشكل 2ج). كشفت الوسم الكيميائي لرباط Chen-White المحتوي على الألكاين القابل للنقر (cCW) عن تلطيخ ضعيف على مستوى الخلايا (الشكل 2ج والشكل التمديدي 4ف)، مما يشير إلى أن الرباط غير المرتبط لا يتراكم بشكل محدد في الحجرة الداخلية الليزوزومية. علاوة على ذلك، لم يستهدف Fento-1 بشكل رئيسي عضيات أخرى (الشكل التمديدي 5ب). هذا الجزيء الصغير أدى إلى أكسدة الفوسفوليبيدات الغشائية وتقليل حيوية الخلايا في عدة خطوط خلايا سرطانية بشرية وفئران وخلايا أولية، بينما كانت آثار cCW وmarmycin هامشية (الشكل التمديدي 5ج-هـ). كشفت علم الدهون القائم على مطيافية الكتلة (MS) أن Fento-1 أدى إلى أكسدة الفوسفوليبيدات في عدة خطوط خلايا إلى حد أكبر من المحفزات المعروفة للفيروبتوز تحت هذه الظروف (الشكل التمديدي 5و، ز، المعلومات التكميلية والجدول التكميلي 2 و3). أكدت تحليلات الليزوزومات المعزولة من خلايا HT-1080 المعالجة بـ Fento-1 لمدة ساعة واحدة أكسدة الفوسفوليبيدات المرتبطة في هذه النقطة الزمنية المبكرة (الشكل التمديدي 5ح، المعلومات التكميلية والجدول التكميلي 4). بما يتماشى مع أكسدة الفوسفوليبيدات الغشائية، زادت الجرعات دون القاتلة من Fento-1 من مستويات مثبطات الفيروبتوز في خلايا HT-1080، بما في ذلك GPX4، بروتين مثبط الفيروبتوز 1 (FSP1) وناقل السيستين-جلوتامات (المكون من SLC7A11 وSLC3A2) (الشكل 2د والشكل التمديدي 5ط). كشفت البروتيوميات الكمية أن الخلايا المعالجة بجرعات دون القاتلة من Fento-1 لمدة 48 ساعة عززت تنظيم الفيروبتوز. وبروتينات مرتبطة بالليزوزوم، بما في ذلك مثبطات الفيروبتوز والاغشية المرتبطة بالليزوزوم
البروتينات (LAMPs)، على التوالي، وهي نتيجة تدعم دور الليزوزومات في تحفيز الفيروبتوز (الشكل 2d، e والجدولين التكميلين 5 و6). كما تم تمييز الخلايا من خلال انخفاض تنظيم البروتينات المرتبطة بتوازن الحديد، بما في ذلك بروتين امتصاص الحديد CD44 وبروتين تخزين الحديد الفيريتين. كما أظهرت هذه الخلايا مستويات مرتفعة من مستقبل ترانسفيرين 1 (TFR1) وبروتين ربط عنصر الاستجابة للحديد 2 (IRP2)، والتي تعتبر نموذجية لنقص الحديد الخلوي. جرعات تحت القاتلة من Fento-1 عززت تقليل التعبير عن علامات الميزانشيم، والتي تم ربطها باكتساب حالات خلايا السرطان المقاومة للعلاجات القياسية. . أخيرًا، أظهرت هذه الخلايا زيادة في تنظيم عوامل النسخ الأخرى المعنية في تنظيم حالات الخلايا، مثل SOX4 و SOX13، بالإضافة إلى علامات الظهارة. تشير هذه البيانات إلى أن تأثيرات علاج Fento-1 على خلايا HT-1080، التي هي من أصل ميزانشيمي، تعود إلى اكتساب حالة خلوية مميزة تشبه تلك الخاصة بالخلايا الظهارية التي تكون عادة حساسة للعلاجات المضادة للتكاثر القياسية. تشير هذه النتيجة أيضًا إلى أن خلايا السرطان يمكن أن تتكيف مع التعرض لـ Fento-1 وتطور حالة خلوية تتحمل الفيروبتوز. أي أن الخلايا المعالجة بجرعة منخفضة من Fento-1 تظهر بقاء مستدام ونمط ظاهري مميز بسبب التكيف الخلوي بدلاً من الاختيار الكلوني. تحليلات Western blot أكدت المزيد من بيانات البروتيوم (الشكل 5j من البيانات الموسعة). علاوة على ذلك، تم الكشف عن مستويات مرتفعة من GPX4 في الفractions الغنية بالليسوزوم المعزولة من خلايا HT-1080 المعالجة بـ Fento-1 (الشكل 2f).

تم تقليل أكسدة الفوسفوليبيدات الغشائية التي تسببها Fento-1 بواسطة RTA المحبة للدهون. -توكوفيرول، الخالب للحديد ديفيريبيرون وLip-1 (الشكل 2g، الشكل البياني الموسع 5k، المعلومات التكميلية والجدول التكميلية 7). علاوة على ذلك، أدى العلاج بـ Fento-1 إلى إنتاج 4-هيدروكسي نونينال (4-HNE) (الشكل البياني الموسع 51)، وهو نتيجة تشير إلى الأكسدة وانهيار الفوسفوليبيدات التي تحتوي على أحماض دهنية غير مشبعة. من الجدير بالذكر أن 4 -HNE يمكن أن يسبب تلفًا خلويًا، وإنتاجه هو علامة مميزة للفيروبتوز. أدى العلاج بـ Fento-1 أيضًا إلى زيادة مستويات الليسوفوسفوليبيدات والجليسرول، مما يشير بشكل أكبر إلى تحلل الفوسفوليبيدات المؤكسدة (الشكل 2h، الشكل الإضافي 5m، المعلومات التكميلية والجدول التكميلية 8). تشير هذه النتيجة، جنبًا إلى جنب مع زيادة تنظيم عملية الأيض الدهني بعد العلاج بـ Fento-1 (الشكل 2e)، إلى أن الدهون المؤكسدة في الأغشية تحفز استجابة تلف الأغشية. تمت معاكسة موت الخلايا الذي تم تحفيزه بواسطة Fento-1 بواسطة مثبطات الفيروبتوز المعروفة، والتي شملت خافضات الحديد وRTAs، ولكن ليس بواسطة مثبطات الاستماتة أو النخر المبرمج (الشكل 2i والشكل الإضافي 6a-f). ومن الجدير بالذكر أن Fento-1 أظهر سمية متبقية لم تتمكن مثبطات الفيروبتوز من التغلب عليها بالكامل، مما يعكس قوة Fento-1. -توكوفيرول لم يمنع استهداف الليزوزوم مع Fento-1، مما يدل على أن هذا المثبط للفيروبتوزيس يمارس نشاطه الوقائي من خلال العمل كـ RTA في الدهون الغشائية وليس من خلال التنافس على التفاعل عند الغشاء البلازمي (الشكل 6g من البيانات الموسعة). كان Fento-1 قاتلاً اصطناعياً بعد المعالجة المشتركة مع مثبطات GPX4، وتم إنقاذ حيوية الخلايا بواسطة Lip-1 (الشكل 6h من البيانات الموسعة)، وهو نتيجة تؤكد النشاط المؤيد للفيروبتوزيس لـ Fento-1. أخيرًا، أدى تقليل مثبطات الفيروبتوزيس إلى زيادة حساسية الخلايا تجاه Fento-1، في حين أن تقليل Cd44 منح تأثيرًا وقائيًا (الشكل 6i من البيانات الموسعة). وبشكل متسق، فإن تقليل Cd44 حمى الخلايا جزئيًا من أكسدة الدهون الغشائية، في حين أن التثبيط الجيني لمسار امتصاص الحديد التقليدي الذي يشمل TFR1 كان أقل فعالية (الشكل 6j من البيانات الموسعة). تؤكد هذه النتيجة دور CD44 كعامل رئيسي في امتصاص الحديد في الحالة الميزنشيمية لخلايا السرطان. .
بعد ذلك استكشفنا نشاط المتغيرات الهيكلية لـ Fento-1 (الشكل 7a من البيانات الموسعة). أظهر Fento-2، الذي يحتوي على رابط أطول بين المارمايسين و ligand تشين-وايت، فعالية أقل ضد خلايا PDAC والساركوما مقارنة بـ Fento-1. تدعم هذه النتيجة الفكرة القائلة بأن Fento-1 يمارس نشاطه من خلال تعزيز القرب بين محفز الحديد التفاعلي والدهون الغشائية (الشكل 7b,c من البيانات الموسعة).

الشكل 2 | تحفيز الفيروبتوز بواسطة مُحلل الفوسفوليبيد المعتمد على الحديد والاختيارية للليزوزوم. أ، التركيب الكيميائي لـ Fento-1 وتكوين المحفز الحديدي النشط بالأكسدة. ب، أعلى، توضيح لليبوزوم المحمّل بالحديد (II) و . القاع، علم الدهون للأغشية الدهنية المؤكسدة من DOPC مع الحديد (II) وFento-1. n = 3 تجارب مستقلة. ج-ي، البيانات تخص خلايا HT-1080. ج، تصوير الفلورسنت لـ Fento-1، مارمايسين وcCW المعلم. في الخلايا المعالجة عند لمدة ساعة واحدة. شريط القياس، تجارب مستقلة. البيانات هي المتوسط ± الانحراف المعياري، البروتيوميات الكمية للخلايا المعالجة بـ Fento-1 . الخط العمودي المتقطع يشير إلى التعديل تجارب مستقلة. FC، تغيير الطي؛ TFs، عوامل النسخ. e، تحليل إثراء KEGG للبروتينات المرتفعة في الخلايا المعالجة بـ Fento-1 تجارب مستقلة. تحليل البروتينات باستخدام تقنية الويسترن بلوت من مستخلصات إجمالية وغنية بالليزوزومات من خلايا تم معالجتها بـ Fento-1 (48 ساعة). تمثيلي لـ تجارب مستقلة. -التوبولين هو عنصر تحكم في معالجة العينة. ج، علم الدهون للأفوسفوليبيدات المؤكسدة في الخلايا المعالجة بـ Fento-1 والمثبطات (أضيفت قبل ساعتين من Fento-1). تجارب مستقلة. خريطة الحرارة الكاملة موجودة في المعلومات التكميلية. ه، دهنات
الليسوفوسفوليبيدات في الخلايا المعالجة بـ Fento-1 (24 ساعة). تجارب مستقلة. أنا، إطلاق اللاكتات ديهيدروجيناز (LDH) من الخلايا المعالجة بفينتو- لمدة 6 ساعات ومع إضافة المثبطات قبل ساعتين. تجارب مستقلة. تم مقارنة اختبار مان-ويتني ذو الجانبين مع المركبة. تُظهر الرسوم البيانية الصندوقية نطاق الربع، مع وجود خطوط المركز التي تشير إلى الوسيطات والشعيرات التي تمثل القيم الدنيا والقصوى. ديف، ديفيريبيرون؛ DFX، ديفيراسيروك؛ Fer-1، فيروستاتين-1؛ توك، -توكوفيرول. تم استخدام التركيزات التالية ما لم يُذكر خلاف ذلك: فينتو-1 توك ، تعريف وشفاه- تظهر الدهون الفوسفوليبيدية الفوسفatidylcholine (PC) في الشكل الرئيسي. يشير الحرف السفلي Oxn إلى إضافة الأكسجين. يتم عرض الفوسفatidylethanolamine (PE) والفوسفatidylinositol (PI) والفوسفatidylserine (PS) في المعلومات التكميلية. يتم عرض الدهون lysophosphatidylcholine (LPC) في الشكل الرئيسي. يتم عرض LPE و LPI و LPS في المعلومات التكميلية. بالنسبة لـ d و e، نموذج خطي، ذو جانبين. -اختبار على تغيير الطي. تم التعديل باستخدام معدل الاكتشاف الخاطئ لبيجاميني-هوشبرغ. تم إنشاء التوضيح في (ب) باستخدام BioRender (https:// biorender.com).

الشكل 3 | تنشيط الحديد الليزوزومي يستهدف CD44 خلايا السرطان وتقلل من نمو الورم. أ، ICP-MS للأنسجة البشرية السليمة والسرطانية. PDAC، قطع لكل نسيج؛ UPS والليبو ساركوما، قطع لكل نسيج. ب، ICP-MS لخلايا سرطان الورم البشري المفككة (CD45 CD31 فاب “). PDAC، ; يو بي إس، ورم دهني التكرارات لكل ورم. ج، قياس التدفق HMRhoNox-M لخلايا سرطان البنكرياس البشرية المفصولة (CD45 CD31 فاب ). مرضى. د، علم الدهون للفوسفوليبيدات المؤكسدة لخلايا الورم البشرية المفصولة المعالجة بـ Fento-1(1 ) و Toc (قبل ساعتين). e، تحليل تدفق CD44 لخلية سرطان البنكرياس البشرية المفصولة (CD45 CD31 فاب عولجت بـ Fento- ومثبطات (قبل ساعتين). المرضى. تحليل التباين الأحادي. اختبار تشكيل المستعمرات لخلايا سرطان DTP SUM159 بعد علاج الدوكسوروبيسين ( )، ثم فينتو-1 ( ) أو DMSO ( ) علاج لمدة 72 ساعة. البيانات هي المتوسط ± الانحراف المعياري، ICP-MS لخلايا الورم 4T1 المفروزة (CD45 ). نسخ. حجم الورم في حاملي ورم 4T1
فئران. فئران لكل حالة. تحليل التباين ثنائي الاتجاه. القيم (اليوم 10) مقارنةً بالمركبة. البيانات هي المتوسط ± الانحراف المعياري. CW، ligand تشين-وايت. i، الحد الأقصى لقطر الورم كنقطة نهاية البقاء للفئران الحاملة للورم. اختبار مانتل-كوكس لرتبة اللوغاريتم. j، دهنات الفوسفوليبيدات المؤكسدة في أورام الفئران 4T1 (علاج لمدة 15 يومًا). فئران لكل حالة. ك، تحليل تدفق CD44 لخلايا سرطان الورم المفصولة (CD45 ) من فئران تحمل ورم 4T1 المعالجة بـ Fento-1 لكل حيوان كل يومين). المركبة، فأران، فينتو- الفئران. تم استخدام التركيزات التالية ما لم يُذكر خلاف ذلك: ، ، “ و cLip-1 . ل و القيم مأخوذة من اختبارات مان-ويتني ذات الجانبين. لـ و كل نقطة ملونة تمثل ورمًا لمريض مختلف في اللوحة المعطاة. خرائط الحرارة الكاملة لـ و مقدمة في المعلومات التكميلية. تُظهر الرسوم البيانية الصندوقية نطاق الربع، مع خطوط مركزية تشير إلى الوسيطات والشعيرات تمثل القيم الدنيا والقصوى.

كما استبدلنا المارمايسين بالكوليسترول، وهو منتج طبيعي غير قطبي يمكنه التداخل بين الفوسفوليبيدات في الغشاء البلازمي. ولها دور في الحالة الميزانشيمية لخلايا السرطان ، ربما عند الغشاء البلازمي. أدت هذه التعديلات إلى النظير غير الفلوري Fento-3، الذي أظهر قوة مشابهة لتلك الخاصة بـ

فينتو-1. معًا، توضح هذه النظائر الطبيعة المتنوعة لهذه الاستراتيجية (الشكل البياني الموسع 7 أ-ج). كتحكم، أدى استبدال الهيكل غير القطبي بموحد أكثر قطبية، مثل المورفولين، إلى إنتاج فينتو-4، الذي كان غير نشط بيولوجيًا (الشكل البياني الموسع 7 أ-ج). أخيرًا، أدى استبدال ligand تشين-وايت بـ ligand أكثر تعقيدًا هيكليًا

الحديد الليزوزومي يحمي الخلايا من كيمياء الحديد-الأكسدة. تنشيط الحديد الليزوزومي يؤدي إلى أكسدة الدهون الغشائية والفيروبتوز. هيال، هيالورونات ب، انتقالات حالة الخلية التي تسببها أدوية الرعاية القياسية والأدوية المؤيدة للفيروبتوز. الرسوم التوضيحية في و تم إنشاؤها باستخدام BioRender (https://biorender.com).

نورلاندير-كوستاس الليغاند المنشط للحديد أنتج Fento-5، الذي أظهر خصائص سامة للخلايا وأكسدة الدهون الغشائية مشابهة لتلك الخاصة بـ Fento-1، على الرغم من استجابة موت الخلايا المتأخرة. تعكس هذه النتيجة التفاعل المميز لمحفز الحديد تجاه الركائز العضوية. (الشكل 7a-c من البيانات الموسعة). معًا، تشير هذه البيانات إلى أن التنشيط الدوائي للحديد الليزوزومي يمكن أن يحفز الفيروبتوز.

بعد ذلك، قمنا بالتحقيق في تأثير تنشيط الحديد الليزوزومي في نماذج ذات صلة بالمرض. لهذا الغرض، قمنا بتحديد محتوى الحديد في أنسجة الأورام الأولية لأنواع سرطانية مختلفة، بما في ذلك سرطان البنكرياس القنوي البشري، وأنواع مختلفة من الساركوما البشرية، ونموذج فأر لانتقال سرطان الثدي العفوي. تم اختيار هذه الأنسجة السرطانية لطبيعتها المقاومة للعلاجات القياسية وقدرتها على تشكيل النقائل، مما يساهم في نتائج سريرية سيئة. علاوة على ذلك، فقد أظهرت هذه المؤشرات أنها عرضة للفيروبتوز. .

كان محتوى الحديد الكلي أعلى في أنسجة السرطان من سرطان البنكرياس القنوي (PDAC) وساركوما غير المتمايزة (UPS) وساركوما الأوعية الدموية وساركوما الدهون وساركوما الظهارة مقارنةً بالأنسجة غير السرطانية المجاورة، كما تم قياسه بواسطة مطيافية الكتلة المتصلة بالتحريض (ICP-MS) (الشكل 3أ والشكل التمديدي 8أ). علاوة على ذلك، كان الحمل الخلوي للحديد أعلى في تحت مجموعات خلايا السرطان ذات التعبير العالي عن CD44 (الشكل 3ب والشكل التمديدي 8ب). أظهرت خلايا من أنسجة PDAC وساركوما البشرية الأولية المفرومة حديثًا مستويات أعلى من الحديد(II) الليزوزومي النشط في حالة الأكسدة في CD44. تحت مجموعات من خلايا السرطان أكثر من CD44 الخاص بهم النظائر (الشكل 3c والشكل الإضافي 8c). هذه النتيجة تتماشى مع النتائج السابقة التي تظهر أن CD44 يساهم في ابتلاع الحديد في خلايا السرطان التي اكتسبت نمط DTP. . في الخلايا المستخلصة من الأورام الأولية البشرية المفككة حديثًا، أدى تحفيز Fento-1 إلى الأكسدة وتحلل الدهون للفوسفوليبيدات الغشائية، وهو تأثير تم معاداته بواسطة مثبطات الفيروبتوز (الشكل 3d الشكل التمديدي 8d-g، المعلومات التكميلية و

الجداول التكميلية 9 و 10). كما قلل فنتو-1 من عدد CD44 الخلايا في سرطان البنكرياس الغدي البشري المنفصل وUPS، وقد تم عكس هذا التأثير بواسطة مثبطات الفيروبتوز (الشكل 3e والشكل الممتد 8h، i).

في خلايا PDAC الأولية والأورغانويدات المشتقة من PDAC البشري، قلل Fento-1 من حيوية الخلايا بشكل أقوى من الأدوية القياسية (الشكل التمديدي 9a، b) وتعاون مع هذه الأدوية في عدة خلايا سرطان أولية من PDAC البشري (الشكل التمديدي 9c، d). في اختبار تشكيل المستعمرات، قضى Fento-1 على DTP لخلايا سرطان الثدي الثلاثي السلبية SUM159 التي تعبر عن CD44 والتي نجت من العلاج بالدكسوروبسين (الشكل 3f). تماشيًا مع ذلك، كان Fento-1 أكثر فعالية ضد خلايا HT-1080 التي تم علاجها بجرعات منخفضة من الدكسوروبسين لفترة طويلة من الزمن (الشكل التمديدي 9e). في ظل هذه الظروف، اعتمدت خلايا HT-1080 شكلًا مميزًا وتميزت بزيادة مستويات CD44 والفيريتين مع زيادة علامات الميزانشيم (الشكل التمديدي 9f-h). تشير هذه البيانات إلى أن الخلايا المعرضة للدكسوروبسين تزيد من CD44 لتعزيز امتصاص الحديد وتعتمد نمطًا ميزانشيميًا أكثر للهروب من الحالة الحساسة للدكسوروبسين. تؤدي هذه التكيفات إلى زيادة القابلية للفيروبتوز والحساسية لـ Fento-1. على العكس، أظهرت خلايا HT-1080 المعرضة لجرعات منخفضة من Fento-1 مستويات منخفضة من CD44 والفيريتين مع انخفاض علامات الميزانشيم، مما يشير إلى أن هذه الخلايا تتكيف مع استهداف الحديد الليزوزومي (الشكل 2d والشكل التمديدي 9g، i).

تعتبر آفات سرطان العقد اللمفاوية الإقليمية مؤشرات على النقائل البعيدة والوفيات، وتكون الخلايا المنتشرة محمية من الفيروبتوز في اللمف. أظهرت القياسات في الفئران أن مستويات الحديد الكلية في سائل اللمف كانت أقل من تلك الموجودة في الدم والمصل (الشكل 10a من البيانات الموسعة). وبالتالي، قمنا بتقييم تأثير Fento-1 على بقاء خلايا السرطان مباشرة في الأوعية اللمفاوية. لهذا الغرض، استخدمنا نموذج الفئران Balb/c المناعي 4T1 لسرطان الثدي الثلاثي السلبي العفوي. أظهرت الكمية من الحديد في الخلايا المعزولة من أورام 4T1 داخل العقد اللمفاوية حمولة حديد أعلى في CD44. خلايا السرطان أكثر من CD44 المجموعات الفرعية (الشكل 3g). هذه

CD44 أظهرت الخلايا أيضًا نشاطًا أعلى في اختزال الحديد (II) في الجسيمات الحالّة (الشكل 10b من البيانات الموسعة). عندما تم علاج الفئران التي تحتوي على أورام 4T1 داخل العقد اللمفاوية بـ Fento-1 (إدارة داخل اللمف كل يومين)، أظهرت الفئران انخفاضًا في نمو الورم، وزيادة في نقاط البقاء المستندة إلى حجم الورم، وعدم وجود آثار سلبية على وزن الجسم (الشكل 3h,i والشكل 10c-e من البيانات الموسعة). أظهرت التحليلات الإضافية للأورام المتبقية أن Fento-1 أدى إلى أكسدة الدهون الغشائية وإنتاج الليسوفوسفوليبيدات، مما أثر بشكل تفضيلي على CD44. على CD44 تحت مجموعات خلايا السرطان (الشكل 3j، k، الشكل البياني الموسع 10f، المعلومات التكميلية والجداول التكميلية 11 و12). معًا، تُظهر هذه البيانات أن Fento-1 يحفز الموت الخلوي الحديدي في الجسم الحي من خلال استغلال الوفرة الأعلى من الحديد(II) الليزوزومي في CD44. تحت مجموعات خلايا السرطان.

الفيروبتوز هو شكل من أشكال موت الخلايا الناتج عن الأكسدة غير المنضبطة للدهون الغشائية. حيث وكيف يتم بدء ذلك في الخلية لا يزال غير واضح. يمكن أن يتفاعل الحديد مع الهيدروبيروكسيدات لبدء أو نشر تفاعل سلسلة جذرية بشكل مستقل عن الإنزيمات. تعتبر الحويصلات الليزوزومية منظمًا حاسمًا لتوازن الحديد الخلوي. وطبيعتها الحمضية، جنبًا إلى جنب مع وجود الحديد التفاعلي وبيروكسيد الهيدروجين، توفر بيئة كيميائية مثالية لتحفيز أكسدة الفوسفوليبيدات الغشائية (الشكل 4أ). تقوم مجموعات فرعية محددة من خلايا السرطان بزيادة تنظيم بروتين امتصاص الحديد CD44 لتعزيز إزالة الميثيل المؤكسدة للعلامات الكروماتينية القمعية وفتح التعبير عن الجينات التي تنظم انتقالات حالة الخلية المرتبطة بتقدم السرطان. . وبالتالي، على الرغم من أن مستويات الحديد المرتفعة تمكّن هذه الخلايا من اكتساب ملف DTP، إلا أن هذه السمة تمنح أيضًا بشكل حتمي قابلية للتعرض للفيروبتوسيس. (الشكل 4ب). إن حقيقة أن CD44 يميز أيضًا التطور، والتجديد الذاتي، وشفاء الجروح، وتنشيط خلايا المناعة تشير إلى أن الحديد الليزوزومي يساهم أيضًا في تحفيز الفيروبتوز في هذه الإعدادات البيولوجية. إن تعزيز النشاط الأكسدي للحديد الليزوزومي من خلال التدخلات الجينية للقضاء على خلايا السرطان يمثل تحديًا. هنا قمنا بتطوير مُحلل للفوسفوليبيد يستفيد من الحمل العالي للحديد في مجموعات فرعية معينة من خلايا السرطان لتحفيز الفيروبتوز عن طريق تنشيط الحديد الليزوزومي (II) (الشكل 4أ). أدت جرعات غير مميتة من هذا المحلل إلى اكتساب حالة خلوية مقاومة للفيروبتوز، والتي أعادت جزئيًا ميزات الخلايا الظهارية (الشكل 4ب). تسلط هذه النتيجة الضوء على قيمة دمج الأدوية المحددة لحالة الخلية لعلاج السرطان. يمكن أن يتسبب دواء السرطان دوكسوروبيسين في إحداث ضرر للحمض النووي الجيني في الخلايا المتكاثرة، مما يؤدي، إذا لم يتم إصلاحه، إلى تحفيز الموت الخلوي المبرمج. على العكس من ذلك، فإن حالة الخلايا المقاومة للفيروبتوز، التي تتميز بزيادة تنظيم مثبطات الفيروبتوز، والهيكليين الإيبوكسيديين، والفوسفوليباز، وزيادة في عملية الأيض الدهني (الشكل 2د)، يمكن أن تنشأ نتيجة لقدرة الخلايا على إصلاح الأغشية التالفة بكفاءة.
تظهر هذه الدراسة أن ضبط النشاط الأكسدي للحديد الليزوزومي يوفر تحكمًا في أكسدة الدهون الغشائية، مما يدعم فكرة أن الحديد الليزوزومي هو محفز للفيروبتوز. يمكن الآن استخدام هذه المعرفة في تصميم معدلات الفيروبتوز. يتمتع Fento-1 بنوع كيميائي مميز للتحقيق في الفيروبتوز ويوفر إطارًا مفاهيميًا لاستهداف خلايا سرطان DTP. .

أي طرق، مراجع إضافية، ملخصات تقارير Nature Portfolio، بيانات المصدر، بيانات موسعة، معلومات تكميلية، شكر وتقدير، معلومات مراجعة الأقران؛ تفاصيل مساهمات المؤلفين والمصالح المتنافسة؛ وبيانات توفر البيانات والرموز متاحة علىhttps://doi.org/10.1038/s41586-025-08974-4.

2. فريدمان أنجيلي، ج. ب. وآخرون. تعطيل منظم الفيروبتوز Gpx4 يؤدي إلى فشل كلوي حاد في الفئران. نات. خلية بيولوجيا. 16، 1180-1191 (2014).
3. بيرسوكير، ك. وآخرون. إن إنزيم CoQ الأكسيدوريدوكتاز FSP1 يعمل بالتوازي مع GPX4 لمنع الفيروبتوز. ناتشر 575، 688-692 (2019).
4. دول، س. وآخرون. FSP1 هو مثبط للفيروبتوز غير المعتمد على الجلوتاثيون. ناتشر 575، 693-698 (2019).
5. يانغ، و. س. و ستوكويل، ب. ر. تحديد الفحص القاتل الاصطناعي للمركبات التي تنشط موت الخلايا غير المبرمج المعتمد على الحديد في خلايا السرطان الحاملة لـ RAS المسرطنة. كيم. بيول. 15، 234-245 (2008).
6. مولر، س. وآخرون. CD44 ينظم اللدونة الجينية عن طريق التوسط في ابتلاع الحديد. نات. كيم. 12، 929-938 (2020).
7. سولير، س. وآخرون. مسار إشارة النحاس القابل للعلاج الذي يحفز الالتهاب. ناتشر 617، 386-394 (2023).
8. ماي، ت. ت. وآخرون. سالينوميسين يقتل خلايا السرطان الجذعية عن طريق احتجاز الحديد في الليزوزومات. نات. كيم. 9، 1025-1033 (2017).
9. رودريغيز، ر.، شرايبر، س. ل. وكونراد، م. خلايا السرطان المستمرة: إدمان الحديد والضعف تجاه الفيروبتوز. مول. سيل 82، 728-740 (2022).
10. فرانكا، ج. س. وآخرون. التكيف الخلوي مع علاج السرطان على طول استمرارية المقاومة. ناتشر 631، 876-883 (2024).
11. فينتون، هـ. ج. هـ. أكسدة حمض الطرطريك في وجود الحديد. مجلة الجمعية الكيميائية 65، 899-910 (1894).
12. سيلر، أ. وآخرون. إن إنزيم الجلوتاثيون بيروكسيداز 4 يستشعر ويترجم الإجهاد التأكسدي إلى موت الخلايا المعتمد على 12/15 ليبكسجيناز والمُدار بواسطة AIF. ميتابوليزم الخلايا. 8، 237-248 (2008).
13. تشين، إكس، كانغ، ر، كرويمر، ج. وتانغ، د. تنظيم محدد للعضيات للفيروبتوسيس. موت الخلايا والتمايز. 28، 2843-2856 (2021).
14. زو، ي. وآخرون. مرونة الدهون الأثيرية تعزز القابلية للإصابة بالفيروبتوز وتجنبها. الطبيعة 585، 603-608 (2020).
15. قاو، م. وآخرون. دور الميتوكوندريا في الفيروبتوز. مول. خلية 73، 354-363 (2019).
16. ديكسون، س. ج. وآخرون. التثبيط الدوائي لتبادل السيستين-جلوتامات يسبب إجهاد الشبكة الإندوبلازمية والفيروبتوز. eLife 3، eO2523 (2014).
17. توري، س. وآخرون. دور أساسي للليسوزومات الوظيفية في الفيروبتوزيس لخلايا السرطان. مجلة الكيمياء الحيوية 473، 769-777 (2016).
18. أنطوشاك، م. وآخرون. بروتينات حساسة للحديد تحفز الفيروبتوز النشط في خلايا سرطان البنكرياس المقاومة للعلاج. ج. أم. كيم. سوس. 144، 11536-11545 (2022).
19. فون كروزنشتيرن، أ. ن. وآخرون. تحديد المواقع الأساسية لعملية أكسدة الدهون في الفيروبتوز. نات. كيم. بيول. 19، 719-730 (2023).
20. جيانغ، إكس، ستوكويل، ب. ر. وكونراد، م. فيروبتوسيس: الآليات، البيولوجيا والدور في المرض. نات. ريف. مول. سيل. بيول. 22، 266-282 (2021).
21. كانيكي، ت.، مولر، س. ورودريغيز، ر. تصور الجزيئات الصغيرة النشطة بيولوجيًا في الخلايا باستخدام كيمياء النقر. نات. ريف. كيم. 2، 202-215 (2018).
22. زيلكا، أ. وآخرون. حول آلية الحماية الخلوية بواسطة فيروستاتين-1 وليبروكستاتين-1 ودور أكسدة الدهون في موت الخلايا الناتج عن الفيروبتوز. ACS Cent. Sci. 3، 232-243 (2017).
23. شاه، ر.، فارمر، ل. أ.، زيلكا، أ.، فان كيسل، أ. ت. م. و برات، د. أ. ما وراء DPPH: استخدام التثبيط المعتمد على الفلورية للتنبؤ بإنقاذ موت الخلايا التأكسدي. كيمياء الخلايا. بيولوجيا 26، 1594-1607 (2019).
24. شونبرغ، د. ل. وآخرون. تميز النقل التفضيلي للحديد خلايا الجذعية الشبيهة بالورم الدبقي. خلية السرطان 28، 441-455 (2015).
25. باسولي، د. وآخرون. إدمان الحديد: هدف علاجي جديد في سرطان المبيض. أونكوجين 36، 4089-4099 (2017).
26. Elgrishi، ن. وآخرون. دليل عملي للمبتدئين في الفولتمترية الدورية. مجلة التعليم الكيميائي 95، 197-206 (2018).
27. وي، ي.، أيدين، ز.، تشانغ، ي.، ليو، ز. وغو، م. جهاز استشعار فلوري متحول للتصوير في خلايا عصبية حية بدقة تحت خلوية. ChemBioChem 13، 1569-1573 (2012).
28. نوا، م.، هيراياما، ت.، أوكودا، ك. وناجاساوا، هـ. فئة جديدة من مجسات الفلورسنت الانتقائية لـ Fe(II) ذات التباين العالي تعتمد على هياكل حلزونية لتصور الحديد القابل للتغيير داخل الخلايا الذي يتم توصيله بواسطة الترانسفيرين. الكيمياء العضوية والجزيئية 12، 6590-6597 (2014).
29. فيسواناثان، ف. س. وآخرون. اعتماد حالة مقاومة العلاج لخلايا السرطان على مسار بيروكسيداز الدهون. ناتشر 547، 453-457 (2017).
30. هانغاور، م. ج. وآخرون. خلايا السرطان المقاومة للعقاقير عرضة لتثبيط GPX4. ناتشر 551، 247-250 (2017).
31. غونترت، يو. وآخرون. نوع جديد من الجليكوبروتين CD44 يمنح الخلايا السرطانية في الجرذان القدرة على الانتقال. خلية 65، 13-24 (1991).
32. كانيكي، ت. وآخرون. تخليق المارمايسين A والتحقيق في نشاطه الخلوي. نات. كيم. 7، 744-751 (2015).
33. تشين، م. س. ووايت، م. س. تفاعل أكسدة C-H الأليفاتي الانتقائي بشكل متوقع لتخليق الجزيئات المعقدة. ساينس 318، 783-787 (2007).
34. هيرتزبيرغ، ر. ب. وديرفان، ب. ب. انقسام الحمض النووي الحلزوني المزدوج بواسطة ميثيديم-بروبيل-EDTA-حديد(II). مجلة الجمعية الكيميائية الأمريكية 104، 313-315 (1982).
35. شرايبر، س. ل. صعود اللصقات الجزيئية. خلية 184، 3-9 (2021).
36. تشيو، ب. وآخرون. الفوسفوليبيدات ذات ذيول الأحماض الدهنية المتعددة غير المشبعة تعزز الفيروبتوز. خلية 187، 1177-1190 (2024).
37. رودريغيز، ر. وآخرون. إشارات أيونات المعادن في الطب الحيوي. مراجعة الكيمياء 125، 660-744 (2025).
38. مارين، ج. س.، داوسون، س. ج. وداوسون، م. أ. آليات المقاومة العلاجية غير الوراثية في السرطان. نات. ريف. كانسر 20، 743-756 (2020).
39. ين، هـ.، شو، ل. وبورتر، ن. أ. أكسدة الدهون بواسطة الجذور الحرة: الآليات والتحليل. مراجعة الكيمياء 111، 5944-5972 (2011).
40. داي، إ. وآخرون. دليل حول النظام البيئي الجزيئي الذي ينظم الفيروبتوسيس. نات. بيولوجيا الخلايا 26، 1447-1457 (2024).
41. بامبلونا، ر. الفوسفوليبيدات الغشائية، الضرر الناتج عن الأكسدة الدهنية والنزاهة الجزيئية: دور سببي في الشيخوخة وطول العمر. بيوكيمي. بيوفيز. أكتا 1777، 1249-1262 (2008).
42. سيزجين، إ.، ليفنتال، إ.، مايور، س. وإيغيلينغ، س. لغز تنظيم الغشاء: التركيب، التنظيم وأدوار طوفان الدهون. نات. ريف. مول. سيل. بيول. 18، 361-374 (2017).
43. عبد الله، ن.، فينسنت، س. ت. وكور، م. رؤى آلية توضح دور الكوليسترول في الانتقال الظهاري الميزانشيمي ومقاومة الأدوية في السرطان. فرونت. خلية تطوير. بيولوجيا. 9، 728325 (2021).
44. ميترا، م. وآخرون. أكسدة الإيبوكسيد عالية الانتقائية الإنزيمية للأوليفينات بواسطة تم تحفيزه بواسطة محفز غير هيمي Fe(II) من ligand رباعي الأسنان غير متماثل. دالتون ترانس. 48، 6123-6131 (2019).

ملاحظة الناشر: تظل شركة سبرينغر ناتشر محايدة فيما يتعلق بالمطالبات القضائية في الخرائط المنشورة والانتماءات المؤسسية.

الوصول المفتوح هذه المقالة مرخصة بموجب رخصة المشاع الإبداعي النسبية-غير التجارية-بدون مشتقات 4.0 الدولية، التي تسمح بأي استخدام غير تجاري، ومشاركة، وتوزيع، وإعادة إنتاج في أي وسيلة أو صيغة، طالما أنك تعطي الائتمان المناسب للمؤلفين الأصليين والمصدر، وتوفر رابطًا لرخصة المشاع الإبداعي، وتوضح إذا قمت بتعديل المادة المرخصة. ليس لديك إذن بموجب هذه الرخصة لمشاركة المواد المعدلة المشتقة من هذه المقالة أو أجزاء منها. الصور أو المواد الأخرى من طرف ثالث في هذه المقالة مشمولة في رخصة المشاع الإبداعي الخاصة بالمقالة، ما لم يُشار إلى خلاف ذلك في سطر الائتمان للمادة. إذا لم تكن المادة مشمولة في رخصة المشاع الإبداعي الخاصة بالمقالة واستخدامك المقصود غير مسموح به بموجب اللوائح القانونية أو يتجاوز الاستخدام المسموح به، ستحتاج إلى الحصول على إذن مباشرة من صاحب حقوق الطبع والنشر. لعرض نسخة من هذه الرخصة، قم بزيارة http:// creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/.
(ج) المؤلف(ون) 2025

تم الحصول على عينات جديدة من الأورام عن طريق الجراحة من مرضى في مراكز رعاية بول بروسي ومعهد كوري. قدم جميع المرضى موافقة خطية مستنيرة لاستخدام عينات الأورام. تمت الموافقة على الدراسة من قبل اللجان التنظيمية المؤسسية (رقم 587 و DATA190160). تم إجراء جميع تجارب cLip-1 في الجسم الحي وفقًا لقانون الرفق بالحيوانات الألماني وتمت الموافقة عليها من قبل اللجنة المؤسسية لتجارب الحيوانات وحكومة بافاريا العليا (رقم ROB-55.2-2532.Vet_02-18-13). امتثلت جميع تجارب حقن العقد اللمفاوية في الفئران لجميع اللوائح الأخلاقية ذات الصلة وتمت وفقًا للبروتوكولات المعتمدة من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية في مدرسة هارفارد تي. إتش. تشان للصحة العامة (البروتوكول IS00003460). بالنسبة لجمع اللمف والدم من الفئران، تم إجراء تجارب الحيوانات وفقًا لإرشادات المجتمع الأوروبي لرعاية واستخدام الحيوانات. تم إجراء تجارب الحيوانات بما يتماشى مع الإرشادات الفرنسية للتعامل مع الحيوانات وتمت الموافقة عليها من قبل اللجان الأخلاقية المحلية (رقم الاتفاقية). ).

تم شراء المواد الأولية بأعلى جودة تجارية واستخدمت دون مزيد من التنقية ما لم يُذكر خلاف ذلك. تم الحصول على المذيبات اللامائية عن طريق تمرير المذيبات المنزوعة الغاز عبر مصافي جزيئية وأعمدة الألومينا المنشطة. تم مراقبة التفاعلات بواسطة كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة (TLC) باستخدام ألواح الألمنيوم المغلفة بهلام السيليكا أو أكسيد الألمنيوم المحايد من ميرك. تمت رؤية ألواح TLC بواسطة الأشعة فوق البنفسجية أو عن طريق المعالجة بمحلول نينهدين، أو موليبدات الأمونيوم السيري، أو برمنغنات البوتاسيوم والتسخين. تم تنقية نواتج التفاعل بواسطة كروماتوغرافيا العمود السريع على هلام السيليكا 60 (230-400 شبكة، ماشيراي ناغل) أو أكسيد الألمنيوم (نشط محايد، سيغما-ألدريش) باستخدام نظام CombiFlash NextGen و HPLC التحضيري Gradient رباعي 2545 المزود بكاشف مصفوفة الفوتوديود 2998 (واترز) المجهز بعمود عكسي (XBridge BEH C18 OBD prep col). تم إجراء مطيافية الرنين المغناطيسي النووي باستخدام أجهزة Bruker 400 أو 500 ميغاهرتز. تم تشغيل الطيف في الميثانول- ثنائي ميثيل سلفوكسيد- كلوريد الميثيلين- أو كلوروفورم- عند 298 كلفن أو 310 كلفن كما هو موضح. التحولات الكيميائية يتم التعبير عنها بوحدات ppm باستخدام المذيب غير الديوتيري كمعيار داخلي، وتحدد ثوابت الاقتران J بوحدات Hz. يتم استخدام الاختصارات التالية: bs، قمة عريضة؛ s، قمة مفردة؛ d، قمة مزدوجة؛ dd، قمة مزدوجة من مزدوجات؛ ddd، قمة مزدوجة من مزدوجة من مزدوجات؛ dt، قمة مزدوجة من ثلاثيات؛ dq، قمة مزدوجة من رباعيات؛ q، قمة رباعية؛ t، قمة ثلاثية؛ td، قمة ثلاثية من مزدوجات؛ quint.، قمة خماسية؛ و m، مجموعة. التحولات الكيميائية يتم التعبير عنها بوحدات ppm باستخدام المذيب غير الديوتيري كمعيار داخلي. تم تحديد نقاء المركبات النهائية ليكون >98% بواسطة UPLC-MS. تم تسجيل طيف الكتلة منخفض الدقة باستخدام جهاز Waters Acquity H-class مزود بكاشف مصفوفة ثنائية الأبعاد وكاشف SQ (UPLC-MS) مزود بعمود عكسي الطور (Acquity UPLC BEH C18). تم تسجيل طيف الكتلة عالي الدقة على جهاز Thermo Scientific Q-Exactive Plus المزود بجهاز Robotic TriVersa NanoMate Advion. يتم تفصيل إجراءات تخليق الجزيئات الصغيرة في المعلومات التكميلية.

تم تسجيل طيف NMR على جهاز مطياف Bruker بتردد 500 ميجاهرتز عند 310 كلفن باستخدام برنامج Bruker Topspin (الإصدار 4.1.4) وتم تحليله باستخدام برنامج MestRenova (الإصدار 5.0.1-35756) أو برنامج Bruker Topspin (الإصدار 4.1.4)، والانزياحات الكيميائية يتم التعبير عنها بوحدات جزء في المليون (ppm) باستخدام إشارات المذيبات غير الديوتيرية المتبقية كمعيار داخلي. تم تحضير جميع المحاليل في الميثانول- . لتسجيلات طيف الرنين المغناطيسي النووي لـ Lip-1 المضاف إليه قبل إضافة TFA أو الصوديوم
ديتروكسيد معادلة محلول لـ (ألفا أيسر، 12357، ، 145 مليمول) أضيفت إلى محلول Lip-1 (سيغما-ألدريتش، SML1414، 1 ملغ في ). ثم، تم تحضير محلول من TFA (سيغما-ألدريتش، T6508، الدفعة STBG1988V، ) أو محلول من ديوتيريد الصوديوم (Eurisotop، D076Y، الدفعة R2621، ) تم إضافته. لتسجيلات طيف الرنين المغناطيسي النووي لـ Lip-1 والنفتالين المعاير بـ معادلة محلول لـ تمت إضافته إلى محلول Lip-1 (1 ملغ في ونفتالين (سيغما-ألدريتش، بعد كل إضافة، تم تحريك المحلول لبضع ثوان وسُجلت طيفيات الرنين المغناطيسي النووي.

الجهد الدوري تم إجراء التجارب باستخدام خلية ذات ثلاثة أقطاب. تم استخدام قطب زئبقي مشبع كمرجع، وتم اختيار قطب كربون زجاجي ثابت بقطر 3 مم كقطب عمل، وسلك من البلاتين كقطب مضاد. تم تسجيل جميع الفولتموجرامات الدورية في درجة حرارة الغرفة مع -autolab III من ميتروهيم باستخدام برنامج نوفا (الإصدار 2.1) بمعدل مسح تم استخدام الأسيتونيتريل والميثانول من درجة HPLC للتسجيلات. لجميع التجارب، في الأسيتونيتريل تم استخدام محلول مخزون. تم استخدام 10 مل من محلول مخزون تم تحضيره بـ من محلول في ماء الميلي Q و 9.5 مل من الأسيتونيتريل. ثم، تم إضافة (0.2 معادل) من محلول مخزون بتركيز 40 مللي مولار من DFO، Lip-1، metcLip-1 (محلي الصنع) أو alcLip-1 (محلي الصنع، مذاب في الأسيتونيتريل أو الميثانول) إلى 1 مل من تم الوصول إلى 1.0 مكافئ من المحلول. بعد كل إضافة، تم تحريك المحلول لبضع ثوانٍ وتم تسجيل الفولتموجرامات.

تم تحسين جميع الهياكل باستخدام مجموعة برامج Gaussian 16 (المرجع 50) على مستوى BHLYP/SVP لجميع الذرات (حالة دوران سداسية لمركبات الحديد(III)) (Gaussian 16، المراجعة C.01). تم حساب التصحيح الحراري للطاقة الحرة لجيبس عند 310.15 كلفن. تم إجراء نقاط مفردة على مستوى UMP2/SVP باستخدام نموذج الإذابة SMD (الميثانول). النتائج المقدمة هي في .

تم تخفيف محلول RPE (محلي، 10 مللي مول) في DMSO بمحلول من الأسيتونيتريل-مخزن الأسيتات للوصول إلى تركيز من في لوحة مكونة من 96 بئرًا، ثلاث حلول من RPE 10 مللي مول و 10 أو 20 أو 50 معادلة من Lip-1 (داخلي 1، 2 أو محلول مخزون بتركيز 10 مللي مولار في الميثانول، على التوالي) تم تحضيرها وتم خلط المحاليل عدة مرات. ثم، 10 معادلات. ( محلول مخزون في محلول أسيتونيتريل-أسيتات ( )) تم إضافته إلى كل حل وخلط مرة أخرى. تم تسجيل الأطياف باستخدام جهاز الفلورية (Tecan spark 10 M ) ( باستخدام برنامج SoftMax Pro 7.1 GxP. تم استخدام الأسيتونيتريل والميثانول من درجة UPLC بالإضافة إلى ماء الميلي Q.

تم شحن أنبوب الطرد المركزي المخروطي (15 مل) بحويصلات دهنية أحادية الطبقة من فوسفاتيديل كولين البيض (0.4 مل من تعليق 20 مليمول في PBS، بمتوسط قطر 100 نانومتر)، 134 مل من محلول 12 مليمول من (E)-1,2-bis((2-methyldecan-2-yl)oxy)diazene (Cayman، 32742) في الإيثانول وPBS (7.46 مل من 12 مليمول عند pH 7.4) وتم خلطه بواسطة جهاز الخلط. STY-Bodipy ( تم إضافة محلول بتركيز 1.74 مليمول في DMSO، ثم تم خلط التعليق بواسطة دوامة مرة واحدة. تم نقل خليط الليبوسوم-المبادر-الصبغة إلى خزان، واستخدام تم تحميل لوحة 96 بئر (سوداء، نونك) بالمزيج باستخدام بيبتيد متعدد القنوات لكل بئر). مركبات الاختبار ( من محلول بتركيز 0.24 مليمول في الأسيتونيتريل) تم إضافته لرفع الحجم النهائي إلى تم خلط محتويات الآبار يدويًا باستخدام ماصة متعددة القنوات ثم تم خلطها في قارئ الميكرو بلايت لمدة دقيقة واحدة عند ، بعد ذلك تم مراقبة أكسدة STY-Bodipy بواسطة الفلورية ( تم جمع البيانات باستخدام برنامج Agilent BioTek Gen5 (الإصدار 3.08.01) بين عشية وضحاها.

“تم توضيح الأجسام المضادة على النحو التالي: WB، البقعة الغربية؛ FCy، قياس التدفق الخلوي؛ FI، تصوير الفلورية؛ Hu، مستخدمة لعينات بشرية؛ Ms، مستخدمة لعينات فئران. يتم الإشارة إلى التخفيفات. أي تحقق من الأجسام المضادة من قبل الشركة المصنعة موضح ويمكن العثور عليه على مواقع الشركات المصنعة. استراتيجيات تحققنا من الأجسام المضادة من خلال تقنيات خفض التعبير (KD) و/أو حذف الجينات (KO) للأجسام المضادة ذات الصلة موضحة. تم استخدام الأجسام المضادة الأولية التالية: AIFM2/FSP1 (Merck، MABC1638، النسخة 6D8-11، الدفعة Q3745998، WB، 1:500، Hu، تم التحقق من KD داخليًا)؛ الكاتالاز (Cell Signaling، 12980T، النسخة D4P7B، الدفعة 3، FI، 1:200، Hu)؛ CD3-BV510 (BioLegend، 317332، النسخة OKT3، الدفعة B263750، FCy، 1:100، Hu)؛ CD31-PE-Cy7 (BioLegend، 303118، النسخة WM59، الدفعة B276836، FCy، 1:100، Hu)؛ CD31-BV605 (BioLegend، 303122، النسخة WM59، الدفعة 331683، FCy، 1:100، Hu)؛ CD31-BV605 (BioLegend، 102427، النسخة 390، الدفعة B375532، FCy، 1:100، Ms)؛ CD44 (Abcam، ab189524، النسخة EPR18668، الدفعة 1014086-32، WB، 1:30,000، Hu، تم التحقق من KO وKD داخليًا)؛ CD44-AF647 (Novus Biologicals، NB500-481AF488، النسخة MEM-263، الدفعة P158343، FCy، 1:100، Hu)؛ CD44-AF647 (Novus Biologicals، NB500-481AF647، النسخة MEM-263، الدفعة D145771، FCy، 1:100، Hu)؛ CD44-AF647 (BioLegend، 103018 (إشارة الخلية، 12963S، النسخة “، الدفعة 2، FI، 1:200، Hu)؛ EEA1 (Abcam، ab70521، النسخة 1G11، الدفعة GR315680-1، FI، 1:200، Hu، تم التحقق منها بواسطة المناعية الخلوية/ المناعية الفلورية من قبل الشركة المصنعة)؛ FAP-AF700 (R&D Systems، FAB3715N، النسخة 427819، الدفعة AEVI020011، FCy، 1:100، Hu)؛ FAP-AF750 (Bio-Techne، FAB3715S-100UG، النسخة 427819، الدفعة 1718688، FCy، 1:100، Hu)؛ الفيريتين (Abcam، ab75973، النسخة EPR300AY، الدفعة 10136442-29، WB، 1:1,000، Hu، تم التحقق منها بواسطة WB من قبل الشركة المصنعة)؛ الفيبرو نكتين (Abcam، ab45688، النسخة F14، الدفعة 1016266-35، WB، 1:1,000، Hu)؛ FTH1 (Santa Cruz Biotechnology، sc-376594، النسخة B-12، الدفعة G2622، WB، 1:200، Hu)؛ GPX4 (Abcam، ab125066، النسخة EPNCIR144، الدفعة GR3369574-4، WB، 1:2,000، Hu، تم التحقق من KO من قبل الشركة المصنعة، تم التحقق من KD داخلياً)؛ 4-HNE (Abcam، ab48506، النسخة HNEJ-2، الدفعة 1062274-2، FI، 1:200، Hu)؛ IRP2 (Novus Biologicals، NB100-1798، الدفعة D-4، WB، 1:1,000، Hu)؛ لامين A/C (Cell Signaling، 2032S، الدفعة 6، WB، 1:1,000، Hu)؛ LAMP1 (Cell Signaling، 9091S، النسخة D2D11، الدفعة 7، FI، 1:200، Hu)؛ LAMP1 (Santa Cruz Biotechnology، sc-20011، النسخة H4A3، FI، 1:100، Ms)؛ LAMP1 (Abcam، ab24170، الدفعة GR3235630-1، WB، 1:1,000، Hu)؛ LAMP2 (Abcam، ab25631، النسخة H4B4، الدفعة 1011336-1، FI، 1:200، Hu)؛ LAMP2 (Thermo Fisher Scientific، MA1-205، النسخة H4B4، الدفعة YG377512، WB، 1:1,000، Hu)؛ LIMPII (Proteintech، 27102-1-AP، WB، 1:1,000، Hu)؛ NCOA4 (Abcam، ab86707، الدفعة GR3244520-13، WB، 1:10,000، Hu، تم التحقق من KD داخلياً)؛ NDUFS1 (Ab -توبولين (سيغما-ألدريتش، T5326، النسخة GTU-88، الدفعة 0000140390، WB، 1:1,000، Hu، تم التحقق منها من قبل الشركة المصنعة)؛ وفيمنتين (سيل سيجنالينغ، 5741S، النسخة D21H3، الدفعة 8، WB، 1:1,000، Hu). تم استخدام الأجسام المضادة الثانوية التالية: أليكسا فلور 647 مضاد للفأر (أبكام، ab150115، وسم الأنسجة، 1:500، Ms)؛ أليكسا فلور 647 مضاد للفأر (إنفيتروجين، A21237، الدفعة 1485202، FI، 1:1,000،

Hu); أليكسا فلور 647 مضاد للأرنب (إنفيتروجين، A21246، دفعة 2714437، FI، 1:1,000، Hu); مضاد للأرنب IgG-H+L مترافق مع HRP (مختبرات بيذل، A120-108P، دفعة 13، WB، 1:10,000، Hu); مضاد للفأر IgG-H+L مترافق مع HRP (مختبرات بيذل، A90-116P، دفعة 39، WB، 1:10,000، Hu); ومضاد للفأر IgG-H+L مترافق مع HRP (إنفيتروجين، ).

تم الحصول على خلايا HT-1080، MDA-MB-231 وخلايا 4T1 من ATCC. تم زراعة خلايا الأورام البشرية والفأر المنفصلة وخلايا 4T1 في RPMI1640 معززة بـ GlutaMAX (Gibco، 61870010) و FBS (Eurobio Scientific, CVFSVF00-01). تم زراعة خلايا HT-1080 في وسط دلبوكو المعدل (DMEM)-GlutaMAX (Gibco, 61965059) معززة بـ 10% FBS (Gibco, 10270-106) والبنسلين-ستربتوميسين (BioWhittaker/Lonza, DE17-602E). تم زراعة خلايا MDA-MB-231 في DMEM-GlutaMAX معززة بالبيروفات (Thermo Fisher Scientific, 31966021) ومعززة بـ 10% FBS والبنسلين-ستربتوميسين (Gibco, 15140148). خلايا FC1242 و FC1245 من سرطان البنكرياس الفأري، وخلايا 4a وخلايا البنكرياس البشرية hMIA-2D كانت هدية من مختبر توفيسون (مختبر كولد سبرينغ هاربر) وتم زراعتها في DMEM-GlutaMAX معززة بـ 10% FBS والبنسلين-ستربتوميسين. تم زراعة خلايا PDAC024T و PDAC030T و PDAC053T و PDAC054T و PDAC084T و PDAC090T و PDAC211T البشرية الأولية في وسط قنوي خالٍ من المصل DMEM/F12 (Gibco, 10565018) معززة بـ 0.61 جرام في 500 مل من النيكوتيناميد (Sigma-Aldrich, 3376)، و2.50 جرام في 500 مل من الجلوكوز (Sigma-Aldrich, G6152)، و1:200 ITS+ (Corning, 354352)، و1:20 Nu-serum IV (Corning, 355104). سم الكوليرا ديكساميثازون (سيغما-ألدريتش، D4902)، -ثلاثي يودو-L-ثيرونين (سيغما-ألدريتش، T6397) وبنسلين-ستربتوميسين). مستخلص الغدة النخامية البقرية الطازج (جيبكو، ) و تم إضافة EGF البشري المعاد تركيبه الخالي من الحيوانات (Thermo Fisher Scientific، AF-100-15-1MG) إلى وسط جديد عند تقسيم أو زراعة الخلايا. تم زراعة خلايا SUM159 في Ham F12، GlutaMAX (Gibco، 31765035)، NEAA (Gibco، 11140050)، مضاد حيوي-مضاد للفطريات (Thermo Fisher Scientific، 15240062)، الأنسولين (Humalog، Cip: 3400934142680)، الهيدروكورتيزون (Sigma-Aldrich، H0888-10G) و5% FBS (Thermo Fisher Scientific، A5256701). تم زراعة خلايا الأورام الدائرية الأولية من الرئة (Celprogen، 36107-34CTC، الدفعة 219411، الجنس: أنثى) وخلايا الأورام الدائرية الأولية من القولون (Celprogen، 36112-39CTC، الدفعة 20188، الجنس: أنثى) باستخدام وسط الخلايا الجذعية الكامل (Celprogen، M36102-29PS) حتى المرور الثالث. تم زراعة خلايا السرطان الدائرية في قوارير T75 من ECM الخلايا الجذعية (Celprogen، E77002-07-T75). تم زراعة خلايا Pfa1 باستخدام DMEM عالي الجلوكوز و FBS، 2 مللي مول من L-glutamine و 1% من البنسلين-ستربتوميسين.

تم جمع عينات الأورام من المرضى بعد الجراحة. كانت عينات الأورام من مرضى يعانون من سرطان البنكرياس القنوي، ساركوما الأنسجة الرخوة غير المحددة، ليبوساركوما، أنجيو ساركوما، ساركوما الظهارية أو نقائل سرطان البنكرياس إلى الكبد. تم فصل الأورام باستخدام مجموعة فصل الأورام البشرية (ميلتيني، 130-095929) وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة. باختصار، تم قطع الأورام إلى قطع صغيرة ( )، وضعت في خليط الإنزيمات في RPMI وتم تفكيكها باستخدام جهاز التفكيك gentleMACS Octo مع السخانات (Miltenyi) باستخدام البرنامج المناسب gentleMACS (37C_h_TDK). لكل عينة ورم، تم استخدام 9.4 مل من وسط RPMI مع تركيز الإنزيم المناسب وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة. تم تفكيك عينات الأورام من الفئران باستخدام مجموعة تفكيك أورام الفئران (Miltenyi، 130-096-730) وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة. تم قطع الأورام إلى قطع صغيرة ( )، وضعت في خليط الإنزيمات في RPMI وتم تفكيكها باستخدام جهاز التفكيك gentleMACS Octo مع السخانات (Miltenyi) مع البرنامج المناسب gentleMACS (37C_m_TDK). بعد ذلك، تم تطبيق تعليق الورم المفكك على مصفاة MACS SmartStrainer. (ميلتيني). تم تخفيف العينات بـ تمت معالجة العينة بمحلول PBS وتم الطرد المركزي عند 300 جرام. تم إعادة تعليق راسب الخلايا في RPMI.
(مع 10% من مصل فتي وبيتا-لاكتام المضاد الحيوي)، وتم عد الخلايا باستخدام عداد خلايا آلي (Entek). يتم الإشارة إلى إجمالي عدد الخلايا المفصولة على أنه خلايا ورمية مفصولة، بينما يتم الإشارة إلى المجموعة الفرعية التي تتوافق مع خلايا السرطان من الأورام من خلال الاختيار السلبي (انظر قسم ‘تدفق الخلايا’) على أنها خلايا سرطان ورمية مفصولة.

تم اشتقاق هذه النماذج في الأصل من نماذج زراعة الأنسجة المستمدة من المرضى (PDX). تم معالجة قطع PDX المخصصة لزراعة الخلايا في غرفة أمان حيوي. بعد تقطيعها إلى قطع صغيرة، تم معالجتها بالإنزيم الكولاجيناز من النوع الخامس (Sigma-Aldrich، C9263) والتربسين EDTA (Gibco، 25200-056) وتم تعليقها في DMEM المدعوم بـ البنسلين-ستربتوميسين و FBS. بعد الطرد المركزي، تم إعادة تعليق الخلايا في وسط قنوي خالٍ من المصل تم تكييفه من بروتوكولات سابقة. في في الحاضنة. تم تخزين الخلايا المعززة في النيتروجين السائل. تم فصل الخلايا عن المضادات الحيوية لأكثر من 48 ساعة قبل الاختبار. تم استخدام هذا البروتوكول لإنشاء الخلايا المعينة باسم PDAC024T و PDAC030T و PDAC053T و PDAC054T و PDAC084T و PDAC090T و PDAC211T.

تم اشتقاق نماذج الأعضاء البنكرياسية المستمدة من زراعة الأنسجة الغريبة (XDPO) في الأصل من نماذج PDX. تم تقسيم زراعات الأنسجة إلى عدة قطع صغيرة ومعالجتها في غرفة أمان حيوي. بعد تقطيعها إلى قطع صغيرة، تم معالجتها باستخدام مجموعة تفكيك الأورام البشرية (Miltenyi، 130-095-929). تم هضم الكريات غير المهضومة باستخدام الأكتوز (Thermo Fisher Scientific، A1110501) عند لمدة 30 دقيقة. تم نقل معلق نسيج البنكرياس إلى منخل الأنسجة ثم وضع في لوحة 12 بئر مغطاة بـ ماتريجيل (كورنينج، 354230). تم زراعة العينات في وسط تغذية الأعضاء البنكرياسية، والذي يتكون من DMEM/F12 المتقدم معزز بـ 10 مللي مول من HEPES (ثيرمو فيشر ساينتيفيك، 15630056)، غلوتا ماكس (ثيرمو فيشر ساينتيفيك، 35050087)، بنسلين-ستربتوميسين، FGF10 البشري المعاد تركيبه الخالي من الحيوانات (ثيرمو فيشر ساينتيفيك، EGF البشري المعاد تركيبه الخالي من الحيوانات (ثيرمو فيشر ساينتيفيك، AF-100-15-1MG) نوجين بشري مؤتلف (بايو-تيكن، 6057-NG)، وسط مُشَشَّد بـ WNT3A وسط مشروط بـ RSPO1 ( 10 نانومتر من الجاسترين البشري 1 (سيغما-ألدريتش، SCP0152)، 10 ملليمول من النيكوتيناميد (سيغما-ألدريتش، NO636)، -أسيتيل سيستين (سيغما-ألدريتش، A9165)، (ثيرمو فيشر ساينتيفيك، 17504001)، 500 نانومتر A83-01 (توكريس، 2939/10) و Y27632 (Tocris, 1254/1). تم حضن الأطباق في في الحاضنة، وتم تغيير الوسط كل أيام. تم استخدام هذه الإجراءات لتوليد XDPOs PDAC009T و PDAC003T و PDAC117T و PDAC372T.

لتحليل حساسية الأدوية الكيميائية، تم زرع XDPOs في أطباق 96 بئرًا ثم تعرضت لتركيزات متزايدة من الأدوية. تم قياس حيوية الخلايا بعد 72 ساعة من العلاج باستخدام CellTiter-Glo 3D (بروماجا، G9683). تم حساب أوقات تضاعف حيوية XDPO في ظروف العلاج بالمركب على اليومين 0 و3. كانت نسبة اليوم 3 إلى اليوم 0 تعادل معدل التكاثر (RR) للخلايا بعد 72 ساعة. تم حساب أوقات التضاعف باستخدام الصيغة تم قياس قيم الفلورية واللمعان باستخدام جهاز قراءة الألواح Tristar LB941 (تقنيات بيرثولد). تم إجراء كل تجربة على الأقل ثلاث مرات مع ثلاثة مكررات على الأقل.

اختبار موت الخلايا باستخدام Annexin-V ويوديد البروبيديوم. تم زراعة خلايا PDAC053T في أطباق 6 آبار بكثافة خلايا لكل بئر. RSL3 (سيغما-ألدريتش، SML2234، 0.1، 0.5، 2 و ) تم إضافته مع Lip-1 ، cLip-1 الكليب-1 أو ميتكليب-1 في اليوم التالي. بعد 24 ساعة، تم استعادة الوسط.
وتمت معالجة الخلايا بالتريبسين. تم جمع الخلايا، وتكويرها مع الوسط المستعاد وغسلها بـ PBS. التالي، من تم إضافة محلول ربط الأنكسين- V الذي يحتوي على الأنكسين- V واليوديد البروبيوم وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة (مجموعة تحليل التدفق للأنكسين- V، ثيرمو فيشر ساينتيفيك، V13242). محلول PBS يحتوي على FBS و EDTA تمت إضافة ) لقياس التدفق الخلوي. تم إجراء قياس التدفق الخلوي باستخدام جهاز قياس التدفق AttuneTM NxT وتم تحليل البيانات باستخدام FlowJo.

اختبار موت الخلايا باستخدام Annexin-V و Sytox الأزرق. تم زراعة خلايا PDAC053T في أطباق 6 آبار بكثافة خلايا لكل بئر. في اليوم التالي، تم نقل الخلايا باستخدام siRNA كما هو موضح في قسم ‘تداخل RNA’. تم استبدال الوسط بعد 6 ساعات من النقل. بعد ثلاثة أيام من النقل، تم معالجة الخلايا بالتركيزات المحددة من Fento-1 لمدة 6 ساعات. تم تحليل موت الخلايا باستخدام Annexin-V AF488 (Thermo Fisher Scientific، A13201) و Sytox blue (Thermo Fisher Scientific، S34857). تم إجراء تحليل تدفق الخلايا باستخدام جهاز تحليل تدفق AttuneTM NxT وتم تحليل البيانات باستخدام FlowJo.

اختبار LDH. تم قياس إفراز LDH باستخدام مجموعة كشف السمية الخلوية (سيغما-ألدريتش، 11644793001) وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة في صفيحة 96 بئر. تم تقييم حيوية الخلايا باستخدام مجموعة CellTiterGlo 2.0 (بروماجا، G9241) أو CellTiter blue (بروماجا، G8081) وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة في صفيحة 96 بئر. باختصار، تم زراعة 4000 خلية (HT-1080، PDAC053T أو 4T1) لكل بئر في صفائح 96 بئر ذات قاع شفاف ومظلم (غرينر، 655090، دفعة E23063EG) قبل 24 ساعة من التجربة. ثم تم معالجة الخلايا مسبقًا لمدة ساعتين بـ , كليب-1 فيروستاتين-1 (SML0583، DFO (سيغما-ألدريتش، D9533، ديفرسيروك (كيميان كيميكل، ديفيريبيرون (سيغما-ألدريتش، Y0001976، ) ، -توكوفيرول ( فيتامين K3 (سيغما-ألدريتش، M5625-25G، Z-VAD-FMK (إنزو لايف ساينسز، ALX-260-020-M005، ) أو نيكروستاتين-1 (سيغما-ألدريتش، N9037، . بعد ذلك، فنتو-1 تمت الإضافة. بالنسبة لقياسات الجرعة والاستجابة، تم معالجة الخلايا بكميات متفاوتة من الجزيء المعني لمدة الوقت المحدد. تم معالجة العينات كما هو موضح في بروتوكولات الشركة المصنعة وتم تسجيل البيانات على جهاز قراءة الألواح SpectraMax ID3 (Molecular Devices). بالنسبة لقياسات بقاء الخلايا وفقًا لمعايير الرعاية، تم زراعة الخلايا بمعدل 2000 خلية لكل بئر قبل 24 ساعة من التجربة. تم حضانة الخلايا مع تخفيفات متسلسلة من Fento-1، إيرينوتيكان (Sigma-Aldrich، I1406)، 5-فلورويوراسيل (5-FU؛ Alfa Aesar، A13456-06) أو أوكساليبلاتين (Bio-Techne، 2623) لمدة 72 ساعة.

اختبار MTT. تم زرع الخلايا في صفيحة 96 بئرًا، وتم حضنها لمدة 24 ساعة ثم تم معالجتها مسبقًا بـ Lip-1. لمدة 10 دقائق قبل العلاج مع التحكم في المركبة أو Fento-1 لمدة 24 ساعة. بعد 24 ساعة، تمت إزالة الوسط بعناية و وسط خالٍ من المصل و تم إضافة محلول MTT (Cayman Chemical، 21795) لكل بئر. تم حضن اللوحة في لمدة 3 ساعات. بعد الحضانة، تمت إزالة المحلول و تم إضافة DMSO لكل بئر. تم تغطية اللوحة وهزها على هزاز مداري لمدة 15 دقيقة قبل قراءة الامتصاص على جهاز قراءة اللوحات (OD ). لعلاج RSL3، تم زراعة خلايا Pfa1 في أطباق 96 بئر (2000 خلية لكل بئر) وتم زراعتها طوال الليل. في اليوم التالي، تم معالجة الخلايا بـ RSL3 والجزيئات الصغيرة المشار إليها في التخفيف التسلسلي. بالنسبة لعلاج 4-OH-TAM، تم زراعة خلايا Pfa1 في أطباق 96 بئر (500 خلية لكل بئر) مع 4-OH-TAM ( ) وسلسلة تخفيف من المركبات المحددة. بعد 24 ساعة (لـ RSL3) أو 72 ساعة (لـ 4-OH TAM) من الحضانة، تم تقييم حيوية الخلايا باستخدام الريزازورين كمؤشر لحيوية الخلايا. تم قياس شدة الفلورية عند باستخدام جهاز قراءة الميكرو بلايت SpectraMax iD5 مع برنامج SoftMax Pro الإصدار 7 (Molecular Devices) بعد 4 ساعات من الحضانة في وسط زراعة الخلايا القياسي الذي يحتوي على ريزازورين.

اختبار ألامار الأزرق. تم تقييم تأثير الجرعات غير القاتلة من Fento-1 مع RSL3 أو ML210 على بقاء الخلايا باستخدام اختبار ألامار الأزرق. لتحديد بقاء الخلايا، تم استخدام 3,000 من خلايا HT-1080 أو MDA-MB-231.
تم زراعة الخلايا في لوحة 96 بئر باستخدام وسط قياسي (10% مصل بقري فتي). البنسلين-ستربتوميسين) حوالي 20 ساعة قبل العلاج. تم معالجة الخلايا مسبقًا بـ فينتو- 1 و/أو لمدة ساعة واحدة. بعد 48 ساعة من علاج RSL3 أو ML210 (سيغما-ألدريتش، SML0521-5MG)، تم إجراء اختبار حيوية الخلايا. تم تحضير محلول ألامار الأزرق عن طريق إذابة 0.5 جرام من ملح الصوديوم ريسازورين (سيغما-ألدريتش، 263-718-5) في 100 مل من PBS معقم وتم ترشيحه بشكل معقم من خلال فلتر. بعد ساعتين من الحضانة، تم تقييم الحيوية عن طريق قياس الفلورية باستخدام فلتر الإثارة و فلتر الانبعاث على قارئ الميكرو بلايت Spark (تيكان).

تم قياس السمية الخلوية لـ Fento-1 باستخدام جهاز IncuCyte. تم جمع حركيات موت الخلايا باستخدام منصة التصوير الحيوي IncuCyte (Essen). تم زراعة الخلايا في أطباق 96 بئرًا (3,000 خلية لكل بئر) قبل يوم واحد من العلاج. تم علاج الخلايا بـ Fento-1 بالاشتراك مع Lip-1. في وسط FluoroBrite DMEM (Thermo Fisher Scientific A1896701). تم التقاط أربع صور لكل بئر كل ساعة، وتم تحليلها ومتوسط البيانات. تم قياس موت الخلايا بناءً على دمج DRAQ7. تم جمع البيانات كعدد للخلايا الإيجابية لـ DRAQ7 لكل عدد إجمالي من الخلايا في كل حالة.

حول تم زراعة خلايا HT-1080 في قوارير T75 قبل 24 ساعة من إضافة دوكسوروبيسين (Clinisciences، HY-15142، 25 نانومول). تم غسل القوارير بـ تم استبدال محلول PBS ووسيط يحتوي على دوكسوروبيسين (25 نانومول) كل أيام. بعد 30 يومًا من العلاج بالدوكسوروبيسين، تم زراعة 4000 خلية في أطباق 96 بئرًا لكل بئر لتقييم حيوية الخلايا بعد العلاج مع Fento-1.

حول تم زراعة خلايا SUM159 في أطباق سعة 10 سم في وسط نمو كامل. تم معالجة الخلايا المزروعة بالدoxorubicin عند التركيز المثبط نصف الأقصى. ) التركيز ( 150 نانومولار ). بعد 72 ساعة ، تم غسل الخلايا ومعالجتها بـ Fento- ) أو دي إم إس أو بدون دواء. بعد 72 ساعة، تم غسل الخلايا، واستُبدل العلاج بوسط نمو كامل. بعد 10-15 يومًا، تم غسل الخلايا، وتثبيتها، وصبغها بحمض الأسيتيك والميثانول (1:7) و كوماسي الأزرق 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. عدد المستعمرات مع تم عد الخلايا باستخدام عداد المستعمرات SCAN1200 (إنترساينس).

تم زراعة الخلايا في أطباق 96 بئر (5000 خلية لكل بئر). بعد 12 ساعة، تم معالجة الخلايا بـ 5-FU (Selleckchem، S1209، جمسيتابين (سيلك كيم، S1714، أوكساليبلاتين (سيلك كيم، S1224، بكليتاكسيل (Selleckchem، S1150، ) أو SN-38 (Selleckchem، S4908، بمفرده أو بالاشتراك مع Fento-1 لمدة 72 ساعة. تم تقدير حيوية الخلايا بعد إضافة PrestoBlue (Life Technologies، A13261) لمدة ساعتين وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. لتحديد وجود تأثير تآزري على تكاثر الخلايا أو حيوية الخلايا بين أدوية الرعاية القياسية وFento-1، استخدمنا برنامج SynergyFinder. لتحليل هذا التأثير، تم استخدام درجة ZIP كنموذج لحساب التآزر. .

تم الاحتفاظ بالفئران تحت ظروف قياسية مع الماء والطعام بحرية وفي بيئة خاضعة للرقابة. الرطوبة، دورة ضوء-ظلام لمدة 12 ساعة). بالنسبة لدراسات الحيوانات، تم توزيع فئران C57BL6/J عشوائيًا في أقفاص منفصلة. تم استخدام الفئران التي تتراوح أعمارها بين 12-24 أسبوعًا والمتطابقة في الجنس لجميع التجارب. لدراسة مجموعة البقاء، Rosa26-creERT2;Gpx4 تم علاج الفئران عن طريق الحقن داخل البطن بالتاموكسيفين (سيغما-ألدريتش، T2859، 2 ملغ في اليوم مذاب في Myglyol 812) في اليومين 0 و 1 من أجل الحذف لـ في الجسم كله باستثناء الدماغ . من اليوم الثاني، cLip-1 (محلي الصنع، 10 ملغ لكل كغ يوميًا مذاب في بي بي إس
تم إعطاء 20% PEG400 و5% Solutol HS15) أو المركب كحقن داخل الصفاق للفئران يوميًا حتى انتهاء دراسة البقاء. بالنسبة لتحليلات الكيمياء النسيجية، Rosa26-creERT2;Gpx4 تم استخدام الفئران المعالجة بحقن التاموكسيفين داخل الصفاق (2 ملغ يوميًا في اليومين 0 و1). في اليوم السابع، cLip-1 (محلي الصنع، 10 و تم حقن المركب (أو المركبة) داخل الصفاق في الفئران. بعد ساعة من الحقن، تم euthanized الفئران، وتم معالجة عينات الكلى والكبد كما هو موضح في قسم ‘توسيم الجزيئات الصغيرة باستخدام كيمياء النقر’.

تم شراء فئران Balb/c (إناث بعمر 25 أسبوعًا) من شركة تشارلز ريفر وتم إيواؤها في منشأة الحيوانات الأساسية في CRCM وتم توزيعها عشوائيًا في أقفاص منفصلة. تم استخدام الفئران التي تتراوح أعمارها بين 12-24 أسبوعًا والمتطابقة في الجنس لجميع التجارب. تم إيواء الفئران في ظروف معقمة مع توفير الطعام والماء المعقمين بحرية، وتم الحفاظ عليها على دورة ضوء-ظلام مدتها 12 ساعة. الرطوبة. لم تتعرض الفئران لأي إجراءات قبل جمع اللمف والدم والمصل.

لجمع عينة اللمف، تم إعطاء البوبرينورفين (Buprecare)، وهو مسكن، عن طريق الحقن داخل الصفاق قبل 30 دقيقة من بدء التجربة. تم euthanizing الفئران عن طريق الحقن داخل البطن بمزيج من الكيتامين والزلازين (الكيتامين “إيمالجين” وزيلزين (رومبوم)؛ بعد إجراء الشقوق الجلدية والبطنية، فإن اللمف في جذع اللمف المعوي تم جمعها باستخدام شعيرة زجاجية. تم وضع عينات اللمف في أنابيب تجميد، وتم تجميدها عند وتم تخزينه في .

لجمع عينات الدم والمصل، بعد جمع اللمف، قمنا بإجراء ثقب قلبي نهائي (إبرة 23 G مع إبرة) عن طريق فتح الصدر لجمع حجم كبير من الدم دون مضادات التخثر. بعد ذلك، عينة الدم وضعت في قنينة، وتم تجميدها عند وتم تخزينه في تم ترك بقية عينة الدم لتقف في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة، ثم تم الطرد المركزي عند لمدة 15 دقيقة. تم جمع الطور العلوي (المصل) في قنينة، وتم تجميده عند وتم تخزينه في .

تحضير العينة. تم زراعة خلايا HT-1080 في أطباق دائرية في التقاء ومعالجته بـ Fento- تم جمع مستخلصات الخلايا الكاملة ثم تم الطرد المركزي عند 500 جرام لمدة 5 دقائق في مغسول مع الثلج البارد تمت معالجة PBS وتحليله باستخدام محلول التحلل (8 م يوريا، 200 مللي مولار بيكربونات الصوديوم وخلطة مثبطات البروتياز الكاملة (روش، 000000011697498001)). تم تحقيق التحلل عن طريق الحضانة على عجلة دوارة في . لمدة 45 دقيقة في تمت عملية الطرد المركزي للمستخلصات عند لمدة 20 دقيقة عند ، وتم استخدام السائل العلوي الذي يحتوي على البروتين الكلي للتحليل البروتيني الكمي العالمي. باختصار، تم تقليل إجمالي بروتين lysate الخلايا عن طريق الحضانة مع 5 مليمول من ديثيوثريتال عند لمدة 30 دقيقة ثم تم ألكلة باستخدام يودوأستاميد ) في درجة حرارة الغرفة في الظلام. تم إضافة التربسين/ليس سي (بروماجا) بنسبة 1:100 (وزن/وزن) من الإنزيم إلى الركيزة. تم إجراء الهضم طوال الليل في ثم تم تحميل العينات على StageTips C18 المصنوعة خصيصًا (AttractSPE Disk Bio C18-100.47.20، Affinisep) لإزالة الأملاح. تم استرجاع الببتيدات باستخدام نسبة 40:60 من الأسيتونيتريل و تم تركيز حمض الفورميك تحت الفراغ حتى الجفاف باستخدام جهاز SpeedVac. تم إعادة تكوين الببتيدات في 0.3% TFA قبل استخدام الكروماتوغرافيا السائلة مع مطياف الكتلة الثنائي (LC-MS/MS).

تحليلات LC-MS/MS. تم إجراء LC باستخدام نظام Vanquish Neo LC (ثيرمو ساينتيفيك) متصل بمطياف الكتلة Orbitrap Astral، مع واجهة بواسطة مصدر أيون Nanospray Flex (ثيرمو ساينتيفيك). تم حقن الببتيدات على عمود C18 ( قطر داخلي م دوبل نانو فايبر بيب ماب نيو ، ثيرمو فيشر العلمية) التي تخضع للتنظيم في ومفصولة بتدرج خطي من المخزن A ( و “حمض الفورميك” إلى مخزن أسيتونيتريل و حمض الفورميك) بمعدل تدفق قدره أكثر من 104 دقيقة. تم تشغيل الجهاز في وضع الاكتساب غير المعتمد على البيانات (DIA). تحليل الطيف الكتلي الكامل
تم تسجيل المسح على محلل الكتلة Orbitrap في وضع المركز لمدى بدقة 240,000، مع ضبط هدف التحكم التلقائي في الكسب (AGC) على ووقت حقن أقصى قدره 5 مللي ثانية. تم إجراء DIAs في محلل أسترا في وضع المركز لمدى الكتلة من بعرض نافذة يبلغ 2 دا (بدون تداخل)، ووقت حقن أقصى قدره 3 مللي ثانية وهدف ضبط تلقائي عادي يبلغ 500% بعد التفتت باستخدام التفكك بالاصطدام عالي الطاقة (25% طاقة اصطدام عادية).

معالجة البيانات. لأغراض التعريف، تم البحث عن البيانات مقابل قاعدة بيانات يوني بروت (UP000005640) الخاصة بالبشر (Homo sapiens) باستخدام برنامج سبكترو نوت (v.18.7 أو v.19؛ بيوجنوسيس) من خلال تحليل directDIA + باستخدام إعدادات البحث الافتراضية. تم تعيين خصوصية الإنزيم إلى التربسين، وتم السماح بحد أقصى من انقضاضين مفقودين. تم تعيين الكارباميدوميثيل كتعديل ثابت، وتم تعيين الأسيتيل على الطرف الأميني والأكسدة للميثيونين كتعديلات متغيرة. تم معالجة الملفات الناتجة بشكل إضافي باستخدام myProMS (v.3.10؛https://github.com/bioinfo-pf-curie/مبروك لتحديد كمية البروتين، تم السماح باستخدام XICs من الببتيدات البروتيوتيبية المشتركة بين الظروف المقارنة (مطابقة TopN) مع الانقسامات المفقودة والكارباميدوميثيليشن. تم تطبيق التطبيع الوسيط والنطاق على مستوى الببتيد على الإشارة الكلية لتصحيح XICs لكل تكرار بيولوجي مستقل. ). لتقييم أهمية التغير في وفرة البروتين، تم إجراء نموذج خطي (معدل على الببتيدات والتكرارات البيولوجية)، وتم استخدام اختبار ذو جانبين تم تطبيق اختبار على التغير النسبي المقدر بواسطة النموذج. تم تعديل القيم بعد ذلك باستخدام إجراء معدل الاكتشاف الخاطئ لبنجاميني-هوشبرغ. تم إيداع بيانات البروتيوميات الخام الخاصة بـ MS في اتحاد بروتيوم إكس من خلال مستودع شريك PRIDE. .

تم زرع خلايا سرطان الثدي من الفئران (4T1) في فئران أنثوية من نوع Balb/c تتراوح أعمارها بين 6-8 أسابيع (متجانسة مع نموذج 4T1). تم الاحتفاظ بالفئران في منشأة الحيوانات الأساسية بمدرسة هارفارد الطبية وتم توزيعها عشوائيًا في أقفاص منفصلة. تم الاحتفاظ بالفئران في ظروف معقمة مع توفير الطعام والماء المعقمين بحرية، وتم الحفاظ عليها على دورة ضوء-ظلام مدتها 12 ساعة. الرطوبة. لأداء الحقن في العقد اللمفاوية، تم تتبع الأوعية اللمفاوية أولاً عن طريق حقن صبغة إيفانز الزرقاء 2% (سيغما-ألدريتش، E2129) في دواسة القدم قبل 5 دقائق من إجراء الحقن داخل العقد. بعد حقن صبغة إيفانز الزرقاء، تم تخدير الفئران باستخدام الإيزوفلوران وقطعة صغيرة ( تم إجراء شق في منطقة العقدة اللمفاوية البقعية اليمنى. تم تحديد موقع العقدة اللمفاوية بناءً على صبغة إيفانز الزرقاء، وتم تثبيتها بالملاقط، و خلايا معلقة في تم حقن PBS بحجم إلى العقدة اللمفاوية الفخذية باستخدام حقنة هاملتون 27 ج. تم تأكيد الحقن في العقدة اللمفاوية من خلال تورم مرئي للعقدة اللمفاوية. تم إغلاق الشق باستخدام لاصق جراحي (لاصق الأنسجة 3 م فيت بوند، 1469 SB) وتم مراقبة الفئران عن كثب بحثًا عن علامات الألم أو الضيق. بمجرد أن أصبحت الأورام ملحوظة في على الأقل الفئران (حوالي أسبوع بعد الحقن)، فينتو-1 تم تسليم (لكل حيوان) أو مركبة داخل العقدة اللمفاوية الحاملة للورم كل يومين حتى نقطة النهاية التجريبية. تم قياس أقطار الأورام داخل العقدة 3 مرات في الأسبوع باستخدام الكالبر حتى وصل أي ورم في مجموعة الفئران إلى 2.0 سم في أكبر قطر له، وهو ما كان نقطة النهاية التجريبية المحددة مسبقًا لهذه التجارب. في جميع التجارب، لم يتم تجاوز هذا الحد الأقصى المسموح به لقطر الورم. في تلك المرحلة، تم euthanized جميع الفئران في المجموعة، وفقًا للبروتوكولات المعتمدة، لتحليل قطر الورم داخل العقدة، وكتلة الورم ومعلمات أخرى. عند نقطة النهاية التجريبية، تم جمع بيانات حول تكوين الورم بطريقة غير معروفة لهوية العينة أو العلاج. لتحديد منحنيات البقاء، تم تطبيق طرق معدل البقاء المعتمدة على حجم الورم، مع 1.5 سم كقيمة مقطوعة مقبولة أخلاقيًا لتحديد
الفعالية العلاجية في دراسات الفئران تم قياس أحجام الأورام بعددين، الطول ( المحور) والعرض ( المحور)، مع المحور يُعرف تقليديًا بأنه أطول محور للورم. يتم تمثيل أحجام الأورام كقطر الورم (سم) أو حجم الورم ( )، كما تم استنتاجه بواسطة الطول × العرض ، كما هو موضح لكل تجربة حية. تم تجميد عينات الورم في دي إم إس أو في FBS حتى ) لتحليلات خلوية لاحقة. لم تُستخدم تقنيات عشوائية رسمية. ومع ذلك، تم تخصيص الحيوانات عشوائيًا لمجموعات العلاج وتم معالجة العينات بترتيب عشوائي. في جميع التجارب، تم إبقاء الفئران على نظام غذائي عادي وتم إطعامها بحرية.

تم زراعة الخلايا على شرائح زجاجية وتم معالجتها كما هو موضح. بوديبي 665/676 (ثيرمو فيشر ساينتيفيك، B3932، LysoTracker Deep Red (ثيرمو فيشر ساينتيفيك، L12492، ), DND-189 ليزو سينسور (ثيرمو فيشر ساينتيفيك، L7535، ليبرفلو (دوجيندو، ) و SQSS (داخلي، ) أُضيفت إلى الخلايا الحية قبل التثبيت. لدراسات التداخل، تم معالجة الخلايا بـ Fento- ) أو مارمايسين (داخلي، ) عند درجة الحرارة المحددة بعد 16 ساعة من النقل. بعد 16 ساعة من النقل، تم معالجة الخلايا التي تم نقلها بواسطة BacMam بـ RSL3 لمدة 15 دقيقة أو لمدة 3 ساعات و15 دقيقة ثم تم معالجتها بـ Bodipy 665/676 لمدة 45 دقيقة لتحديد النقاط الزمنية النهائية وهي 1 ساعة و4 ساعات. من أجل التداخل المكاني لدهون البيروكسيد مع الليزوزومات، تم معالجة الخلايا بـ RSL3. وإما بوديبي 665/676 وDND-189 لايسوسينسور أو ليبرفلور وليسوتراكر ديب ريد لمدة ساعة واحدة. لتقييم شدة الفلورسنت لفينتو-1 في وجود تمت معالجة الخلايا مسبقًا بـ -توكوفيرول -توكوفيرول (سيغما-ألدريتش، PHR1031، ) ثم مع Fento-1 ( ). ثم تم غسل الخلايا 3 مرات بـ PBS، ثابت مع بارافورمالدهيد في PBS لمدة 12 دقيقة ثم تم غسلها 3 مرات بـ PBS. لتلوين الأجسام المضادة، تم اختراق الخلايا بـ ترايتون X-100 في PBS لمدة 5 دقائق وغسل 3 مرات بـ PBS. بعد ذلك، تم حجب الخلايا في 2% BSA (يوروميدكس، 04-100-812-E)، 0.2% توين-20 و PBS (محلول ملحي فوسفاتي) لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تم حضن الخلايا مع الأجسام المضادة المناسبة في محلول الحجب لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة، وغسلت 3 مرات مع تمت معالجة PBS وتم حضنه مع الأجسام المضادة الثانوية لمدة ساعة واحدة. أخيرًا، تم غسل الشرائح ثلاث مرات بـ تم تثبيت الخلايا المعالجة بـ Bodipy 665/676 وLiperfluo باستخدام مواد كيميائية باردة ووضعها في على الفور بعد التركيب على شرائح الزجاج وتم تصويرها. تم الحصول على صور الفلورسنت باستخدام ميكروسكوب ديلتا فيجن في الوقت الحقيقي (أبلايد بريسيجن)، أو ميكروسكوب ثاندر (لايكا) أو ميكروسكوب أبوتوم وايس مع برنامج تصوير ديلتا فيجن، أو برنامج اكتساب الصور ثاندر لايكا، أو برنامج تصوير أبوتوم زيس، على التوالي. أو تم استخدام الهدف NA للاستحواذات، وتم الحصول على جميع الصور كـ تم فك تشويش الصور باستخدام SoftWorx (نسبة محافظة، 15 تكرار، Applied Precision) ومعالجتها باستخدام Fiji تم التقاط الصور بالأبيض والأسود وتم تطبيق التلوين باستخدام فيجي. يتم عرض شدة الفلورية بوحدات عشوائية ولا يمكن مقارنتها بين الألواح المختلفة. تم حساب تقدير التداخل باستخدام فيجي 2.0.0-rc-69/1.52n. تم الكشف عن النوى باستخدام فلوروسينس DAPI أو Hoechst كما هو موضح.

تم الحصول على صور المجال الساطع باستخدام ميكروسكوب CKX41 (أوليمبوس) وبرنامج تصوير cellSens Entry (أوليمبوس).

تسمية النقر داخل الخلايا. تم معالجة الخلايا على الشرائح الزجاجية كما هو موضح باستخدام cDFO (داخلي، ), cLip-1 (داخلي، أو 2 ساعة)، ميتكليب-1 (داخلي، ), alcLip-1 (داخلي، ) أو cCW ثم تم تثبيتها وتمريرها كما هو موضح في قسم ‘تصوير الفلورسنت’. تم إضافة Lyso Tracker Deep Red إلى الخلايا الحية لـ

45 دقيقة قبل التثبيت. تم تحضير خليط تفاعل النقر باستخدام مجموعة تصوير Click-iT EdU (Invitrogen, C10337) وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة. في تجربة نموذجية، قمنا بخلط من عازل تفاعل Click-iT مع حل ألكسا-فلور-أزيد مضافات عازلة للتفاعل (أسكوربات الصوديوم) و ماء نقي للغاية للوصول إلى حجم نهائي من تم تحضين الشرائح الزجاجية مع خليط تفاعل النقر في الظلام عند درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة، ثم تم غسلها 3 مرات بـ تم إجراء تصوير المناعة الفلورية كما هو موضح في قسم ‘تصوير الفلورسنت’.

انقر على وضع العلامات في الأنسجة. تم تثبيت عينات أنسجة الكلى والكبد المجمعة من الفئران المعالجة بـ cLip-1 في بارافورمالدهيد في PBS طوال الليل في تم تحضين الأنسجة المثبتة في السكروز في PBS لمدة 30 دقيقة ثم تم حضنه في السكروز في PBS في لمدة 4 ساعات، تليها التضمين في مركب تثبيت OCT (TissueTek، ساكورا) على ثلج جاف وتخزينه في تم قطع الأنسجة المجمدة إلى -شرائح سميكة باستخدام جهاز Cryostat Microm HM 560 (ثيرمو فيشر ساينتيفيك) عند تم تثبيت مقاطع الأنسجة بعد ذلك باستخدام 1% من البارافورمالدهيد في PBS لمدة 10 دقائق ثم تم حضنه مع أسيتون لمدة 10 دقائق عند تم تحضين الأقسام في محلول الحجب ( PBS يحتوي على BSA و تريتونيك X-100) لمدة 30 دقيقة. تم وضع علامات على العينات باستخدام تفاعل النقر كما هو موضح أعلاه. للتلوين المشترك مع علامة ليفية، تم حضانة العينات المعلّمة بتفاعل النقر مع مضاد LAMP1 أو الأجسام المضادة المخففة في PBS يحتوي على مصل الماعز العادي طوال الليل في . في اليوم التالي، تم حضانة الأقسام مع الأجسام المضادة الثانوية في PBS يحتوي على 1% BSA و تم استخدام Triton X-100 لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة. تم تصور النوى باستخدام صبغة Hoechst 33342، وتم تثبيت الشرائح في Aqua/ PolyMount (Polysciences). تم التقاط الصور باستخدام ميكروسكوب فلوري (DS-Qi2، نيكون) أو ميكروسكوب ضوئي متماسك (LSM880، كارل زيس) ومجموعات الفلاتر المناسبة المقابلة للفلوروفورات.

تم معالجة الخلايا كما هو موضح ثم تم غسلها بـ PBS. تم إذابة البروتينات في محلول لايملي المحتوي على بنزونايز (VWR، 70664-3، 1:100). تم حضن المستخلصات في لمدة ساعة واحدة، تم تسخينه عند لمدة 10 دقائق وتم قياسها باستخدام مقياس الطيف الضوئي NanoDrop 2000 (ثيرمو فيشر ساينتيفيك). تم فصل مستخلصات البروتين بواسطة كهربائية الهلام SDS-PAGE (نظام إنفيتروجين شور لوك وNu-PAGE) هلامات بيس-تريس مسبقة الصنع). في تجربة نموذجية، تم تحميل إجمالي مستخلص البروتين لكل حارة في محلول لايملي يحتوي على بروموفينول أزرق. تم تشغيل علامة حجم على كل هلام: PageRuler (ثيرمو فيشر ساينتيفيك، 26616) أو PageRuler Plus (ثيرمو فيشر ساينتيفيك، 26620) و محلول لايملي. ثم تم نقل البروتينات إلى أغشية نيتروسليلوز (أميرشام بروتران باستخدام خلية نقل كهربائية شبه جافة Trans-Blot SD (بايو راد) باستخدام حافظة نقل NuPage (Invitrogen, NP00061) مع الميثانول. تم حجب الأغشية باستخدام 5% من مسحوق الحليب الخالي من الدسم (ريجيلاي) في توين-20 تمت معالجة الأنسجة بمحلول PBS لمدة 20 دقيقة. تم قطع الأغشية بحجم العلامة المناسب لتمكين اختبار عدة أجسام مضادة على نفس الغشاء. ثم تم اختبار البقع بالأجسام المضادة الأولية ذات الصلة في بسا تويين-20 PBS أو في 5% من مسحوق الحليب الخالي من الدسم في 0.1% توين-20 و PBS في بين عشية وضحاها مع حركة لطيفة في كيس بلاستيكي شفاف مختوم باليد. تم غسل الأغشية بـ توين-20 PBS ثلاث مرات وتم حضنه مع أجسام مضادة ثانوية مرتبطة بالبيروكسيداز من الفجل (مختبرات جاكسون) في 5% من مسحوق الحليب الخالي من الدسم (ريجيلاي) تويين-20 PBS لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة وغسل 3 مرات مع توين-20 تم الكشف عن المستضدات باستخدام مجموعات الكشف الكيميائي الضوئي SuperSignal West Pico PLUS (Thermo Fisher Scientific، 34580) وSuperSignal West Femto (Thermo Fisher Scientific، 34096). تم تسجيل الإشارات باستخدام نظام تصوير Fusion Solo S (Vilber) مع برنامج FusionCapt Advance. تم معالجة الصور باستخدام برنامج Fiji 2.0.0-rc-69/1.52n. تم توفير مسحات كاملة من البقع في المعلومات التكميلية.