تنظيم التغذية الراجعة الإيجابية بين التحلل السكري والأسيتيل الهستوني يقود الأورام في سرطان القناة البنكرياسية الغدي Positive feedback regulation between glycolysis and histone lactylation drives oncogenesis in pancreatic ductal adenocarcinoma

المجلة: Molecular Cancer، المجلد: 23، العدد: 1
DOI: https://doi.org/10.1186/s12943-024-02008-9
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38711083
تاريخ النشر: 2024-05-06

تنظيم التغذية الراجعة الإيجابية بين التحلل السكري والأسيتيل الهستوني يقود الأورام في سرطان القناة البنكرياسية الغدي

في وينزه سي ، ديشان يين تيانجياو وي مينغ تاو شياونا كوي جين يانغ تيانبي هونغ وروي وي

الملخص

الخلفية: إعادة برمجة الأيض والتغيرات الوراثية تلعب دورًا في عدوانية سرطان القناة البنكرياسية الغدي (PDAC). يعد تعديل الهيستون المعتمد على اللاكتات نوعًا جديدًا من علامات الهيستون، والذي يربط بين ناتج التحلل السكري وعملية اللاكتيل. ومع ذلك، لا يزال دور اللاكتيل في الهيستون في PDAC غير واضح. الطرق: تم تحديد مستوى اللاكتيل في الهيستون في PDAC من خلال التحليل الغربي والتلوين المناعي، وتم تقييم علاقته بالبقاء العام باستخدام مخطط بقاء كابلان-ماير. تم تأكيد مشاركة اللاكتيل في الهيستون في نمو وتقدم PDAC من خلال تثبيط اللاكتيل في الهيستون بواسطة مثبطات التحلل السكري أو تقليل التعبير عن إنزيم لاكتات ديهيدروجيناز A (LDHA) في كل من المختبر وفي الكائنات الحية. تم تحديد الكتاب والممحيات المحتملة للاكتيل في الهيستون في PDAC من خلال التحليل الغربي والتجارب الوظيفية. تم فحص الجينات المستهدفة المحتملة للاكتيل H3K18 (H3K18la) من خلال تحليلات CUT&Tag وRNA-seq. تم التحقق من الجينات المستهدفة المرشحة TTK كيناز البروتين (TTK) وBUB1 كيناز نقطة التفتيش الانقسامية سيرين/ثريونين B (BUB1B) من خلال تحليلات ChIP-qPCR وRT-qPCR والتحليل الغربي. بعد ذلك، تم تأكيد تأثير هذين الجينين في PDAC من خلال تقليل التعبير أو زيادة التعبير. تم تحديد التفاعل بين TTK وLDHA من خلال اختبار Co-IP. النتائج: كان مستوى اللاكتيل في الهيستون، وخاصة مستوى H3K18la، مرتفعًا في PDAC، وكان المستوى العالي من H3K18la مرتبطًا بتشخيص سيئ. ساهمت قمع النشاط التحللي بواسطة أنواع مختلفة من المثبطات أو تقليل التعبير عن LDHA في التأثيرات المضادة للورم لـ PDAC في المختبر وفي الكائنات الحية. كان بروتين ربط E1A p300 (P300) وديستاز الهيستون 2 هما الكاتب والممحاة المحتملان للاكتيل في الهيستون في خلايا PDAC، على التوالي. تم إثراء H3K18la عند المحفزات وتفعيل نسخ منظمين نقطة التفتيش الانقسامية TTK وBUB1B. ومن المثير للاهتمام، أن TTK وBUB1B يمكن أن يزيدا من تعبير P300 الذي بدوره زاد من التحلل السكري. علاوة على ذلك، TTK

الملخص

LDHA الفسفوري في التيروزين 239 (Y239) وLDHA المنشط، وبالتالي زاد من مستويات اللاكتات وH3K18la. الاستنتاجات حلقة التغذية الراجعة الإيجابية بين الجليكوليز وH3K18la وTTK/BUB1B تفاقم الخلل الوظيفي في PDAC. هذه النتائج قدمت استكشافًا جديدًا وعلاقة مهمة بين إعادة برمجة الأيض للاكتات والتنظيم الوراثي، مما قد يمهد الطريق نحو استراتيجيات علاج جديدة تعتمد على اللاكتيل في علاج PDAC.

الكلمات الرئيسية: التحلل السكري، أسيتيل الهستون، H3K18la، سرطان القناة البنكرياسية الغدي

مقدمة

سرطان البنكرياس، الذي يزيد عن سرطان القناة البنكرياسية الغدي (PDAC) هو ورم عدواني للغاية في الجهاز الهضمي وأشد الأورام الخبيثة فتكًا بالبشر، مع معدل بقاء عام ضعيف لمدة 5 سنوات [1]. على الرغم من المحاولات لتحسين علاجه على مدار العقد الماضي، لم تنخفض معدلات الوفيات بسبب PDAC بشكل ملحوظ. لذلك، من الضروري فهم آليات نمو PDAC وانتشاره بشكل أوضح، للعثور على أهداف علاجية محتملة وعلامات حيوية جديدة للتنبؤ بتوقعات PDAC [2، 3].
بالإضافة إلى الطفرات في جينات السائق في سرطان البنكرياس (PDAC) مثل KRAS المسرطن، وجينات كابحة الورم SMAD4 وTP53، أظهرت العديد من الدراسات أن البيولوجيا العدوانية للورم في PDAC مرتبطة ارتباطًا وثيقًا بالمواد الأيضية وإعادة البرمجة الوراثية [5، 6]. تستخدم خلايا PDAC “إعادة البرمجة الأيضية” لدعم السلوكيات الخبيثة مثل التكاثر السريع، والغزو، والعديد من العمليات الخلوية [7]. المواد الأيضية هي منتجات وسيطة من الأيض الخلوي التي يتم تحفيزها بواسطة إنزيمات مختلفة، من خلال التعديلات ما بعد الترجمة للبروتينات. تم الإبلاغ عن المزيد والمزيد من المواد الأيضية التي تشارك في تنظيم مسارات الإشارة المتنوعة في تكوين الأورام [8]. من بين هذه المواد، يعتبر اللاكتات، وهو مادة أيضية وفيرة، منتجًا نهائيًا من عملية التحلل السكري ويغذي دورة حمض الكربوكسيليك الثلاثي خلال تأثير واربورغ (التحلل السكري الهوائي) [9، 10]. يعتبر تعزيز التحلل السكري وتراكم اللاكتات من الميزات الشائعة في أنواع مختلفة من السرطان [11]. ومع ذلك، لا يزال غير واضح كيف تعيد إعادة البرمجة الأيضية تشكيل التغيرات الوراثية، وخاصة اللاكتيل في PDAC.
تشارك الهيستونات في تنظيم وظائف فسيولوجية متنوعة، وتلعب التعديلات ما بعد الترجمة للهيستونات (مثل الأسيتيل، والسكسينيل) أدوارًا مهمة في تطور الأمراض. تم تأكيد وجود اللاكتيل الناتج عن حمض اللاكتيك على الهيستونات الأساسية من قبل عدة مجموعات كنوع جديد من علامات الهيستون. حتى الآن، تم تحديد 28 موقعًا للاكتيل على الهيستونات، بما في ذلك ليسين 4 في الهيستون H3 وليسين 18 في الهيستون H3 (H3K18) وغيرها. تمارس الهيستونات تأثيرات بيولوجية من خلال التأثير على التعبير وتنشيط الجينات السفلية. يؤثر اللاكتيل على الهيستونات بشكل تفضيلي على الإنزيمات المشاركة في المسارات الأيضية الأساسية مثل الكربوهيدرات، والأحماض الأمينية، والدهون، والنيوكليوتيدات.
ومع ذلك، لم يتم تحقيق استراتيجيات تتضمن علاج اللاكتيل الهستوني للتغلب على وتحويل المشهد الجزيئي لسرطان البنكرياس القنوي. وبالتالي، لا يزال فهم أفضل للاكتيل الهستوني في علم الأمراض لسرطان البنكرياس القنوي يتطلب مزيدًا من البحث.
تهدف دراستنا إلى التحقيق في دور اللاكتيل في الهيستون، وبالتحديد H3K18la، في تقدم سرطان البنكرياس (PDAC) وتوضيح الآلية المحتملة. أظهرت نتائجنا أن تراكم اللاكتات في بيئة الورم في PDAC أدى إلى تحفيز اللاكتيل في الهيستون، سواء في الجسم الحي أو في المختبر، مما ارتبط بقوة مع تكوين الأورام والنتائج السريرية السيئة. من الناحية الآلية، أدى تعزيز التحلل السكري في PDAC إلى زيادة إنتاج اللاكتات وH3K18la، مما عزز نسخ بروتين كيناز TTK. ) و BUB1 كيناز السيرين/ الثريونين في نقطة التفتيش الانقسامية B (BUB1B). من الجدير بالذكر أن TTK و BUB1B زادا من مستوى P300 (كاتب اللاكتيل في الهيستون)؛ حيث قام TTK بتنشيط لاكتات ديهيدروجيناز A (LDHA)، وزاد من إنتاج اللاكتات وعزز من اللاكتيل في الهيستون، مما شكل حلقة تغذية راجعة من الجليكوليز- H3K18la- TTK/ BUB1B. تكشف نتائجنا، كدليل على المبدأ، للمرة الأولى، عن دور جديد للاكتيل في الهيستون، وخاصة H3K18la في سرطان البنكرياس القنوي (PDAC)، بينما قد يكون تعطيل حلقة التغذية الراجعة الإيجابية للجليكوليز- H3K18la- TTK/ BUB1B نهجًا علاجيًا محتملاً للعلاج التكميلي لسرطان البنكرياس القنوي.

المواد والأساليب

عينات بشرية

تم أرشفة عينات البنكرياس من سرطان البنكرياس القنوي (PDAC) وعينات التحكم المرافقة في قسم الجراحة العامة في مستشفى بكين الجامعي الثالث. تم تجميد جميع الأنسجة على الفور في النيتروجين السائل وتخزينها في للكشف عن مستوى اللاكتات واللاكتيل. تم جمع عينات المصل من مرضى سرطان البنكرياس (PDAC) والأشخاص الأصحاء من قسم الطب المخبري في مستشفى بكين الجامعي الثالث لإجراء اختبار الميتابولوميات غير المستهدفة. قدم جميع المشاركين في هذه الدراسة موافقة خطية مستنيرة وتمت الموافقة على الدراسة من قبل لجنة أخلاقيات البحث السريري في مستشفى بكين الجامعي الثالث. تم الحصول على مصفوفة الأنسجة الدقيقة (TMA، Cat. HPanA180Su03) التي تحتوي على أنسجة ورمية وأنسجة مجاورة للسرطان من 90 مريضًا بسرطان البنكرياس من شركة أوتدو بيوتيك المحدودة (شنغهاي،
الصين)، وتم منح الموافقة الأخلاقية من قبل لجنة أخلاقيات البحث السريري، شركة أوتدو للتكنولوجيا الحيوية المحدودة.

اختبار الميتابولوميات غير المستهدفة

تم إجراء تجارب اختبار الميتابولوم غير المستهدف بواسطة شركة APExBIO Technology، LLC (شنغهاي، الصين). في أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 مل، تم دمج المصل مع محلول الميثانول الذي يحتوي على المعيار الداخلي L-2-كلوروفينيل ألانين مل. تم إعداد عينة للتحكم في الجودة عن طريق الاستخراج من السائل الطافي من كل عينة، تلا ذلك خلط شامل واهتزاز. تم إجراء تحليل الكروماتوغرافيا السائلة-مطياف الكتلة باستخدام نظام Agilent 1290 Infinity II UHPLC المتصل بجهاز Agilent 6545 UHD و Accurate-Mass Q-TOF/MS. كانت العمود الكروماتوغرافي المستخدم هو Waters XSelect HSS T3. تم إجراء مطيافية الكتلة في وضعي الأيونات الموجبة والسالبة مع المعلمات المحسّنة التالية: تم ضبط جهد الكابيلاري على 4.5 كيلو فولت في الوضع الموجب و3.5 كيلو فولت في الوضع السالب. كان تدفق الغاز المجفف هو في الوضع الإيجابي و في الوضع السلبي، مع درجة حرارة الغاز تم ضبط ضغط النيبولايزر على 20 رطل لكل بوصة مربعة. كانت معايير الفحص للمواد الأيضية المختلفة تعتمد على الأهمية المتغيرة في التوقع. شخصية مهمة تغير الطي .

زراعة الخلايا والعلاج

تم استخدام خط خلايا الظهارة القنوية البنكرياسية البشرية hTERTHPNE وأربعة خطوط خلايا سرطان البنكرياس (MIA PaCa-2 وPANC-1 وAsPC-1 وPL45) في هذه الدراسة. تم الحصول على خلايا hTERT-HPNE من شركة Meisen Cell Technology Co., Ltd (تشجيانغ، الصين). تم الحصول على خلايا MIA PaCa-2 من بنك خلايا الأكاديمية الصينية للعلوم (شنغهاي، الصين). تم الحصول على خلايا PANC-1 وAsPC-1 من مركز موارد الخلايا، كلية بكين الطبية المتحدة (بكين، الصين). تم الحصول على خلايا PL45 من شركة iCell Bioscience Inc. (شنغهاي، الصين). تم زراعة الخلايا في وسط Eagle المعدل من دولبيكو (DMEM) أو وسط معهد روسويل بارك التذكاري (RPMI) 1640 المدعوم بـ ( مصل جنيني من الأبقار ( البنسلين-ستربتوميسين، (حجم/حجم) غلوتا مكس (جميعها من جيبكو، غراند آيلاند، نيويورك، الولايات المتحدة الأمريكية). تم زراعة الخلايا في جو رطب يحتوي على في تم استخدام خلايا hTERT-HPNE وأربعة خطوط خلايا PDAC للتحقيق في إنتاج اللاكتات، وتعديل الهيستون باللاكتيل، والتعبير عن TTK وBUB1B.
تم إجراء تجارب لاحقة باستخدام خلايا MIA PaCa-2 و AsPC-1، التي خضعت للتدخلات التالية: (1) تم معالجة الخلايا بعدة مثبطات للجليكوليز: ثنائي كلورو الأسيتات الصوديوم (DCA: )، الذي يمكن أن يثبط كيناز البيروفات ديهيدروجيناز [16]؛ أوكزامات ( )، مثبط لـ LDHA [17]؛ 2-ديكسي-D-جلوكوز (2-DG، )، تعمل كمقلد للجلوكوز D، مما يعطل الجلوكوز D
الأيض عن طريق تثبيط الهيكسوكيناز وإيزوميراز الجلوكوز-6-فوسفات [18] أو التحكم في المركبة (محلول فوسفات الملح، PBS). (2) تم نقل الخلايا باستخدام siRNA الخاص بـ LDHA أو siRNA عشوائي كتحكم سلبي، مع إضافة لاكتات الصوديوم (NaLa، ). (3) تم معالجة الخلايا بمثبط P300 C646 ( ) مدموج مع NaLa ( ” ). (4) تم نقل الخلايا باستخدام siRNA P300 أو siRNA عشوائي كتحكم سلبي، مع إضافة NaLa ( ). (5) تم معالجة الخلايا بمثبطات مختلفة لإنزيمات إزالة الأسيتيل من الهيستونات (HDAC)، بما في ذلك مثبطات HDAC واسعة الطيف (Trichostatin A، TSA، مُثبِّط السرتوين (نيكوتيناميد، NAM، مُثبِّط فئة I من HDAC (تايسيدالين، CI994، مُثَبِّط HDAC IIa (TMP195، مثبط HDAC من الفئة IIb (بوفكساماك، و مثبط HDAC من الفئة الرابعة (SIS17، ). (6) تم نقل الجينات إلى الخلايا باستخدام بلازميدات زيادة التعبير عن HDAC1 و 2 و 3 أو بلازميدات التحكم السلبية. (7) تم نقل الجينات إلى الخلايا باستخدام siRNA، siRNA BUB1B أو siRNA غير محدد كتحكم سلبي. (8) تم نقل الخلايا باستخدام بلازميد الإفراط في التعبير أو بلازميد التحكم السلبي.
بعد العلاج، تم جمع البروتينات للكشف عن اللاكتيل في الهيستون بواسطة تقنية الويسترن بلوت أو لاختبار نشاط LDHA. تم جمع السائل العلوي للكشف عن مستوى اللاكتات. تم مراقبة تكاثر الخلايا باستخدام جهاز IncuCyte S3 خلال فترة التدخل التي استمرت 72 ساعة أو تم الكشف عنه بواسطة اختبارات تشكيل المستعمرات بعد علاج استمر من 1-2 أسبوع. تم مراقبة هجرة الخلايا باستخدام اختبار شفاء الجروح خلال فترة التدخل التي استمرت 48 ساعة أو تم الكشف عنها بواسطة اختبارات الترانسويل بعد علاج استمر 48 ساعة. التفاعل بين H3K18la مع أو تم تحديد ذلك بواسطة ترسيب المناعة للكروماتين – PCR الكمي في الوقت الحقيقي (ChIP-qPCR). تم الكشف عن مستويات mRNA والبروتين بواسطة PCR العكسي الكمي في الوقت الحقيقي (RT-qPCR) وويسترن بلوت. تم تقييم التفاعل بين TTK و LDHA بواسطة اختبارات الترسيب المناعي المشترك (Co-IP).

تداخل RNA وزيادة التعبير

تم إذابة SiRNA إلى تركيز عمل قدره 50 نانومول/لتر. خضعت خلايا MIA PaCa-2 و AsPC-1 لتداخل RNA باستخدام Lipofectamine. ™تم استخدام RNAi MAX (Invitrogen، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة، وتم جمع الخلايا بعد 48 ساعة من التحويل. تسلسلات siRNA مدرجة في الجدول التكميلي S1.
تم إعداد البلازميدات من جين كيم (شنغهاي، الصين). تم نقل جينات خلايا MIA PaCa-2 و AsPC-1 باستخدام بلازميدات مع ليبوفكتامين (Invitrogen) لمدة 48 ساعة لتحقيق التعبير المفرط للجينات المحددة.

عدوى الفيروسات القهقرية

لتحقيق التعبير المستقر لـ إسقاط زيادة التعبير، الفيروسات اللينتية المؤتلفة
تم تحضير التعبير عن sh-LDHA و oe-TTK بواسطة Hanbio Tech (شنغهاي، الصين). كانت خلايا MIA PaCa-2 عند تداخل تمت العدوى باستخدام الفيروسات القهقرية [10 مضاعفات العدوى (MOI)، MOI=عيار الفيروس (TU/ حجم الفيروس (مل) / عدد الخلايا] لمدة 24 ساعة، وتمت مراجعتها مع بوميسين (MedChemExpress، شنغهاي، الصين) لمدة أسبوع وتم الحفاظ عليه في مل من البيروميسين. بعد تأكيد التعبير باستخدام RT-qPCR وWestern blot، تم استخدام خطوط الخلايا المستقرة sh-LDHA وoe-TTK للتجارب اللاحقة. تسلسلات sh-LDHA مدرجة في الجدول التكميلي S1.

اختبار تكاثر الخلايا

تم زراعة خلايا MIA PaCa-2 و AsPC-1 في أطباق 96 بئر بكثافة 5000 خلية لكل بئر وتم الحفاظ عليها لمدة 72 ساعة. تم مراقبة تكاثر الخلايا باستخدام نظام تحليل الخلايا الحية على المدى الطويل IncuCyte S3 (Sartorius، غوتنغن، ألمانيا). تم تقييم التكاثر من خلال قياسات التوافق وتم تطبيعها إلى 0 ساعة حسبما حسبه برنامج IncuCyte S3. تم التقاط صور الخلايا في فترات من أربع مناطق منفصلة لكل بئر. كان هناك التكرارات في كل تجربة.

اختبار تشكيل المستعمرات

تم زراعة خلايا MIA PaCa-2 و AsPC-1 في أطباق 6 آبار بتركيز 1000 خلية لكل بئر. تم تجديد الوسط كل 3 أيام خلال نمو المستعمرات، وتم زراعة الخلايا لمدة أيام بناءً على خصائص كل خط خلوي. بعد ذلك، تم تثبيت الخلايا بـ تم تثبيت العينات باستخدام بارافورمالدهيد (لياجين، بكين، الصين) لمدة 20 دقيقة وصبغها بصبغة الكريستال البنفسجي (بيوتايم للتكنولوجيا الحيوية) لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم تم تصوير المستعمرات الناتجة وعدها.

اختبار شفاء الجروح

تم زراعة خلايا MIA PaCa-2 و AsPC-1 في أطباق 96 بئرًا ونمت إلى تم إنشاء جروح خدش بواسطة أداة علامة الجروح IncuCyte. تم غسل تساقط الكتلة الخلوية باستخدام PBS. بعد تغيير الوسط الخالي من المصل، تم الحفاظ على الثقافة لمدة 48 ساعة. تم التقاط الصور على فترات 3 ساعات على منصة IncuCyte S3. تم قياس مناطق الجروح باستخدام برنامج تحليل الصور IncuCyte S3.
أحيانًا، تم زراعة الخلايا في أطباق 6 آبار ونمت إلى التقاء، تم توليد جروح خدش باستخدام طرف أنبوب بيبيتي معقم. تم غسل كتلة الخلايا المتساقطة بمحلول PBS. بعد تغيير الوسط الخالي من المصل، تم الحفاظ على الثقافة لمدة 48 ساعة. تم التقاط الصور في 0 و 24 و 48 ساعة بعد توليد الجرح باستخدام ميكروسكوب مدعوم بالكمبيوتر (لايكا للميكروسيستمز، ويتزلار، ألمانيا). بعد ذلك،
تم قياس مناطق الجروح باستخدام برنامج Image J (المعاهد الوطنية للصحة، بيثيسدا، ماريلاند، الولايات المتحدة الأمريكية).

اختبار هجرة ترانسويل

تم تقييم قدرات الهجرة لخلايا MIA PaCa-2 و AsPC-1 باستخدام غرفة أقراص ترانسويل (كورنينغ لايف ساينس، نيويورك، الولايات المتحدة الأمريكية). تم زراعة الخلايا في غرفة الترانسويل العلوية في وسط بدون مصل جنيني بقرى، بينما كانت الغرفة السفلية مملوءة بـ وسيط يحتوي على مصل الجنين البقري كعامل جذب. بعد ال بعد الحضانة، تم تثبيت الخلايا المهاجرة بـ بارافورمالدهيد وصبغت بصبغة الكريستال البنفسجي. تم تصوير الخلايا الملونة، وتم تقدير عدد الخلايا المهاجرة باستخدام برنامج Image J.

نموذج الورم المزروع في الفئران العارية

فئران عارية أنثوية، بعمر أسابيع ووزن تم تعيينهم عشوائيًا إلى مجموعات تجريبية مختلفة. (1) إجمالي تم حقن خلايا MIA PaCa-2 تحت الجلد في كل فأر. عندما وصل متوسط حجم الورم إلى حوالي 70 تم تعيين الفئران عشوائيًا إلى مجموعة الأوكزاميت ( ) ومجموعة التحكم ( )، وتم قياس أحجام الأورام. أوكسامات ( ، يوميًا) أو المركبة (PBS) تم إعطاؤها عن طريق الحقن داخل البطن لمدة 30 يومًا. (2) تم استخدام خلايا MIA PaCa-2 المستقرة الش-LDHA أو التحكم السلبي (sh-NC) ( تم حقن (خلايا لكل فأر) تحت الجلد في الفئران، مع 7 فئران في كل مجموعة. عندما وصل حجم الورم في مجموعة الش-NC إلى حوالي تم قياس أحجام الأورام كل يومين لمدة 26 يومًا. تم تقدير أحجام الأورام باستخدام الصيغة التالية: الحجم طول عرض تم التضحية بالفئران وتم تصوير الأورام ووزنها. تم الكشف عن محتوى اللاكتات في الأورام. تم الكشف عن مستوى H3K18la بواسطة تقنية الويسترن بلوت والتلوين المناعي (IHC). تم تحديد تكاثر الخلايا بواسطة التلوين المناعي لـ Ki-67. تم إجراء تلوين الهيماتوكسيليين والإيوزين (HE) للكبد لتقييم انتشار الورم. تم إجراء جميع التجارب الحيوانية في مركز العلوم الصحية بجامعة بكين وتمت الموافقة عليها من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات بجامعة بكين.

المؤسسة الدولية للحقوق

تم تثبيت الأنسجة من المرضى والفئران العارية بـ ( ) تم حفظها في الفورمالين المحايد المؤقت طوال الليل وتضمينها في الشمع، و تم إعداد مقاطع سميكة. تم إزالة البارافين من مقاطع الأنسجة، تلاها إعادة ترطيب في الزيلين وتركيزات متدرجة من الإيثانول. تم تحقيق إخماد نشاط البيروكسيداز الداخلي باستخدام تم استخدام بيروكسيد الهيدروجين، بينما تم إجراء استرجاع المستضد باستخدام محلول EDTA. ثم،
تم حضانة الأقسام طوال الليل في في غرفة رطبة مع الأجسام المضادة الأولية المحددة. تم استخدام نظام الكشف 3، 3′-ديامينوبنزيدين (ZSGB-BIO، بكين، الصين) لتصور الصبغة بعد ساعة من الحضانة مع الأجسام المضادة الثانوية في درجة حرارة الغرفة. الأجسام المضادة المستخدمة في هذه الدراسة مدرجة في الجدول التكميلي S2.
بالنسبة لمصفوفة الأنسجة الدقيقة، تم الحصول على درجات IHC لتعبير H3K18la من خلال ضرب شدة التلوين في نسبة الخلايا الإيجابية. بالنسبة لتلوين IHC الآخر، تم استخدام الكثافة الضوئية المتوسطة لحساب التعبير النسبي لـ H3K18la و Ki-67 و TTK و BUB1B باستخدام برنامج Image J.

استخراج RNA و RT-qPCR

تم استخراج RNA الكلي باستخدام Trizol (Thermo Fisher Scientific، وولثام، الولايات المتحدة الأمريكية) وتم تحويله عكسيًا إلى cDNA باستخدام مجموعة RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher Scientific). تم إخضاع cDNA لتحليل qPCR في الوقت الحقيقي باستخدام Thunderbird SYBR qPCR Mix (TOYOBO Co., Ltd، أوساكا، اليابان) على نظام QuantStudio5 Real-Time PCR (Thermo Fisher Scientific). تم تلخيص تسلسلات البرايمر التي تم تصنيعها بواسطة شركة Beijing Tsingke Biotech Co., Ltd. (بكين، الصين) في الجدول التكميلي S3. تم تطبيع التعبير الجيني النسبي إلى وتم حسابه مع طريقة.

استخراج البروتين وويسترن بلوت

تم تحلل الخلايا أو الأنسجة باستخدام محلول التحلل RIPA (بيوتايم للتكنولوجيا الحيوية، شنغهاي، الصين)، الذي يحتوي على مثبط للبروتياز ومثبط للفوسفاتاز (أبلاي جين تكنولوجيز، بكين، الصين). تم قياس محتوى البروتين الكلي باستخدام اختبار حمض البيكينكونينيك (BCA) (ثيرمو فيشر ساينتيفيك). تم فصل البروتينات المنكرة بواسطة SDS-PAGE ونقلها إلى غشاء نيتروسليلوز (ميليبور، سانت تشارلز، ميزوري، الولايات المتحدة الأمريكية). بعد حجبها بـ تمت معالجة الألبومين المصل البقري لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة، ثم تم تحضين الأغشية مع الأجسام المضادة الأولية طوال الليل في ، تليها ثلاث غسلات، ثم الحضانة مع الأجسام المضادة الثانوية لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. تم تصور حزم البروتين باستخدام نظام التصوير بالأشعة تحت الحمراء Odyssey 290 (LI-COR Biosciences، لنكولن، نبراسكا، الولايات المتحدة الأمريكية). تم تحليل شدة كل حزمة باستخدام برنامج Image J. تم تطبيع مستوى البروتين النسبي إلى -أكتين. الأجسام المضادة المستخدمة في هذه التجربة مدرجة في الجدول التكميلي S2.

قياس محتوى اللاكتات ونشاط إنزيم LDH

تم جمع السائل العلوي من نسيج الورم المهجن أو السائل العلوي من زراعة الخلايا بعد الطرد المركزي لمدة 10 دقائق. تم قياس إنتاج اللاكتات وفقًا لتعليمات حمض اللبنيك.
تم قياس قيم الامتصاص عند 570 نانومتر باستخدام مطياف الضوء. تم تطبيع محتوى اللاكتات بناءً على عدد الخلايا.
تم قياس نشاط إنزيم LDH باستخدام مجموعة اختبار إنزيم اللاكتات ديهيدروجيناز (معهد نانجينغ جيانشينغ للهندسة الحيوية، نانجينغ، الصين) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. باختصار، تم جمع الخلايا، وتعريضها للتفتيت بالموجات فوق الصوتية، ثم تم طردها مركزيًا بسرعة 4000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق. ثم تم جمع الطور العلوي الناتج لإجراء القياسات اللاحقة. تم قياس الامتصاص عند 450 نانومتر باستخدام مطياف الضوء، وتم تطبيع النتائج المستخلصة بناءً على محتوى البروتين الكلي.

Co-IP

تم جمع خلايا MIA PaCa-2 و AsPC-1 وتفتيتها في محلول تفتيت IP بوجود مثبطات البروتياز لمدة 40 دقيقة، ثم تم الطرد المركزي عند لمدة 10 دقائق. تم تقسيم المستخلصات إلى مجموعات الإدخال، IgG و LDHA. تم تحضين المستخلصات مع جسم مضاد LDHA أو IgG في بين عشية وضحاها. تم إضافة كريات مغناطيسية بروتين A/G (بيوتايم) إلى المستخلصات وتمت المعالجة لمدة 4 ساعات عند بعد ثلاث غسلات بمحلول تفكك IP، تم الحصول على البروتينات المترسبة المشتركة وخضعت للتحليل من خلال تقنية الويسترن بلوت.

اختبار CUT&Tag

تم إجراء تجربة CUT&Tag بواسطة شركة ووهان فراسيرجن للمعلوماتية الحيوية المحدودة (ووهان، الصين). باختصار، تم جمع الخلايا وغسلها. تمت إضافة كريات مغناطيسية مغطاة بـ Concanavalin A وتمت المعالجة لمدة 10 دقائق. ثم تم إعادة تعليق الخلايا المرتبطة بالكريات في محلول الغسيل مع جسم مضاد H3K18la لمدة ساعتين. بعد ذلك، تم غسل الخلايا مرتين باستخدام حامل المغناطيس مع محلول الغسيل، وتمت المعالجة مع في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة. بعد غسلتين، تم إعادة تعليق الخلايا في محلول التاجمنت واحتُفظت في الحضانة عند لمدة ساعة واحدة. لوقف التجزئة، بروتيناز ك SDS و تم إضافة EDTA إلى العينة. ثم تم حضن هذا المزيج في لمدة ساعة واحدة، تليها عملية تنقية باستخدام الفينول-كلوروفورم-كحول الإيزوأميلي، ترسيب الإيثانول، والغسل بـ الإيثانول، والتعليق النهائي في الماء. تم تضخيم الحمض النووي من خلال تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) وتنقيته. ثم تم تسلسل المكتبات على منصة إلومينا نوفا-سيك. تم استخدام DiffBind لاكتشاف القمم التفاضلية (DP) من مجموعات القمم. القمم التي تحتوي على تغير الطي ومعدل الاكتشاف الخاطئ (FDR) < 0.05 تم تعريفه على أنه DP ذو دلالة إحصائية. تم تجميع إشارة DP للعينات للتحليل. بعد ذلك، تم استخدام ChIPseeker لتوضيح DP إلى منطقة المحفز ولإيجاد الجينات المرتبطة بـ DP. علاوة على ذلك، تم استخدام فقدان DP في الجينات المرتبطة بمنطقة المحفز لـ
قم بإجراء تحليلات علم الأحياء الجزيئي (GO) و(KEGG).

تسلسل RNA

تم إجراء تجربة RNA-seq بواسطة شركة ووهان فراسيرجن للمعلوماتية الحيوية المحدودة. تم استخراج RNA الكلي باستخدام Trizol (Invitrogen). تم تقييم نقاء RNA وسلامته باستخدام مقياس الطيف NanoDrop 2000 (NanoDrop Technologies، ويلمنجتون، ديلاوير، الولايات المتحدة الأمريكية). تم استخدام هلام أغاروز بتركيز 1.5% لتقييم تلوث RNA. تم استخدام كرات مغناطيسية مرتبطة بـ Oligo (dT) لتنقية mRNA. تم تجزئة mRNA المنقى إلى قطع صغيرة باستخدام محلول التجزئة. تم تصنيع cDNA من الشريط الأول من خلال النسخ العكسي المعتمد على الهكسامير العشوائي، تلاه تصنيع الشريط الثاني من cDNA، وتم تنقيته باستخدام كرات AMPure XP. بعد ذلك، تمت إضافة محولات فهرسة RNA ومزيج A-Tailing من خلال عملية حضانة لإكمال إصلاح cDNA. خضعت قطع cDNA لتكبير PCR، وتم تنقية المنتجات الناتجة للحصول على المكتبة النهائية. بمجرد اختبار المكتبة واعتبارها ذات جودة كافية، تم إعداد كرات DNA Nano ثم تحميلها على شريحة التسلسل. ثم تم إجراء عملية التسلسل باستخدام جهاز التسلسل عالي الإنتاجية MGI. كانت معايير الفحص لتحديد الجينات المعبر عنها بشكل مختلف تشمل تغير الطي . بعد ذلك، تم إخضاع الجينات المنخفضة التنظيم لتحليلات GO و KEGG.

اختبار ChIP و ChIP-qPCR

تم جمع خلايا MIA PaCa-2 وتثبيتها باستخدام الفورمالديهايد في PBS لمدة 10 دقائق. ثم، تم إضافة الجلايسين لإيقاف عملية الربط المتقاطع. بعد خطوة الغسل، تم إعادة تعليق الخلايا المثبتة في محلول التحلل ( تريس EDTA، مثبطات البروتياز) لمدة ساعة واحدة. لإنتاج قطع الكروماتين بطول حوالي 300 قاعدة، تم تعريض الخلايا للتسونيد والطرد المركزي في لمدة 10 دقائق. تم تخفيف المستخلصات في محلول يحتوي على ترايتون-X-100 تريس-هيدروكلوريك (رقم هيدروجيني 8.1)، 150 EDTA ومثبطات البروتياز. الأرانب المضادة لـ IgG ( ) أو الأجسام المضادة للأرنب H3K18la ( تم إدخاله في الكروماتين المخفف وترك طوال الليل في مع دوران مستمر. في اليوم التالي، من دينابيدز ™تم إضافة بروتين G (إنفيتروجين) وتم الحضانة لمدة 4 ساعات في بعد خطوات الغسل، تم فك ارتباط المدخل ومجمع الكروماتين المسحوب في لمدة 12 ساعة. تم تنقية الحمض النووي المستخرج من عملية السحب باستخدام مجموعة تنقية PCR MinElute (Qiagen، هيلدن، ألمانيا). تم إجراء ChIP-qPCR باستخدام PerfectStart Green qPCR SuperMix (TransGen Biotech، بكين، الصين) على جهاز QuantStudio5.
نظام PCR في الوقت الحقيقي. تسلسلات البرايمر لـ ChIPqPCR مدرجة في الجدول التكميلي S4.

التحليل الإحصائي

تم استخدام قاعدة بيانات GEPIA وGEO لتحليل مستويات التعبير عن TTK وBUB1B في مرضى سرطان البنكرياس (PDAC) والأشخاص الأصحاء. تم استخدام قاعدة بيانات GEPIA ومخطط كابلان-ماير لتقييم العلاقة بين تعبير TTK/BUB1B ونتائج البقاء على قيد الحياة في مرضى PDAC. يتم التعبير عن البيانات كمتوسط. أو الوسيط مع نطاق الربيع بين الأرباع. تم التحقق من التوزيع الطبيعي باستخدام اختبار شابيرو-ويلك. إذا كانت البيانات موزعة بشكل طبيعي، تم إجراء الفروق بين المجموعتين باستخدام اختبار الطالب. -اختبار (ذو طرفين)؛ تم إجراء الفروق بين المجموعات المتعددة باستخدام تحليل التباين (ANOVA)، تلاه اختبار المقارنات المتعددة توكي، واختبار المقارنات المتعددة دانييت، حسب الاقتضاء. إذا لم تكن البيانات موزعة بشكل طبيعي، تم إجراء الفروق بين مجموعتين باستخدام اختبار مان-ويتني؛ وتم إجراء الفروق بين المجموعات المتعددة باستخدام اختبار كروسكال-واليس تلاه اختبار المقارنات المتعددة داني. اعتُبر ذا دلالة إحصائية. تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام برنامج GraphPad Prism 8.0 (شركة GraphPad Software Inc.، سان دييغو، كاليفورنيا).

النتائج

ترتبط مستويات اللاكتيل في الهيستونات المرتفعة بتوقعات غير مواتية لدى المرضى المصابين بسرطان البنكرياس القنوي.

في أنسجة البنكرياس من مرضى سرطان البنكرياس (PDAC)، كان محتوى اللاكتات أعلى من ذلك في الأنسجة المجاورة الطبيعية (الشكل 1A). وبالمثل، كانت إنتاجية اللاكتات في خطوط خلايا PDAC مثل MIA PaCa-2 وPANC-1 وAsPC-1 وPL45 أعلى أيضًا من تلك في خط خلايا الظهارة القنوية البنكرياسية البشرية hTERT-HPNE (الشكل 1B). تم تحليل التغيرات في المستقلبات باستخدام الميتابولوميات غير المستهدفة في عينات مصل من مرضى PDAC ومجموعات صحية (البيانات الأصلية في الملف الإضافي 2). أظهرت النتائج أن 222 مستقلبًا اختلفت بشكل كبير بين مجموعة الورم والمجموعة الصحية، مع 100 أقل و122 أعلى في مجموعة الورم (الشكل 1C). كشفت تحليل KEGG للمستقلبات المختلفة في المصل عن غنى في عملية الأيض الكربوني المركزي (الشكل 1D). خاصة، لفت انتباهنا أن اللاكتات كانت أيضًا واحدة من المستقلبات.
نظرًا لإنتاج كميات كبيرة من اللاكتات المقدمة كركائز لأسيتيل الهيستون، قمنا بفحص مستويات أسيتيل البروتين في 5 أزواج من أنسجة سرطان البنكرياس (PDAC) والأنسجة غير السرطانية المحيطة. لوحظت مستويات أعلى من أسيتيل اللايسين الشامل/العمومي (Pan Kla) في أنسجة PDAC (الشكل 1E). نظرًا لأن تعديلات الهيستون تلعب أدوارًا أساسية في معظم العمليات البيولوجية وقد تم الإبلاغ عن أن H3K18la ينظم عمليات بيولوجية متعددة مثل الأورام [12،19]، ركزنا على
الشكل 1 (انظر الشرح في الصفحة التالية.)
(انظر الشكل في الصفحة السابقة.)

الملخص

الشكل 1 مستوى اللاكتات المرتفع وتعديل الهيستون باللاكتيل مرتبطان بتوقعات غير مواتية لدى المرضى المصابين بسرطان القناة البنكرياسية (PDAC). (A) محتوى اللاكتات في سرطان القناة البنكرياسية (PDAC) والأنسجة المجاورة للسرطان. . (B) محتوى اللاكتات في خط خلايا الظهارة القنوية البنكرياسية البشرية hTERT-HPNE وأربعة خطوط خلايا مختلفة من سرطان البنكرياس (MIA PaCa-2، PANC-1، AsPC-1 و PL45). . (C-D) تم تحليل المستقلبات المصلية المميزة لدى مرضى سرطان البنكرياس (PDAC) والأفراد الأصحاء باستخدام علم الميتابولوميات غير المستهدفة. مخطط البركان ) وتحليل KEGG ( ) على الميتابوليتات المصلية المختلفة بين مرضى سرطان البنكرياس (PDAC) والأفراد الأصحاء. (E) تم قياس مستويات اللاكتيل في البان-لايسين (Pan Kla) واللاكتيل في H3K18 (H3K18la) في أنسجة PDAC المقترنة (T) والأنسجة الطبيعية المجاورة (N) بواسطة تقنية الويسترن بلوت. صور تمثيلية (اللوحة اليسرى) والتquantification (اللوحة اليمنى). تم تقييم مستويات بان كلا و H3K18la في خط خلايا الظهارة القنوية البنكرياسية وخطوط خلايا سرطان البنكرياس باستخدام تقنية الويسترن بلوت. صور تمثيلية (اللوحة اليسرى) والكمية (اللوحة اليمنى). (G-K) تم تصور مستوى H3K18la في أنسجة PDAC وأنسجة ما حول السرطان بواسطة صبغة IHC في مصفوفة الأنسجة. (G) الصورة التمثيلية لصبغة IHC. تم تكبير المجال المرئي في المربع الأسود أدناه. (H-I) الكمية لصبغة IHC في أنسجة ما حول السرطان. ) و PDAC ( ) الأنسجة. ( مستويات H3K18la لمراحل AJCC T1 إلى T4 في مرضى PDAC. هناك 5 مرضى PDAC في المرحلة T1، و33 في المرحلة T2، و25 في المرحلة T3، و11 في المرحلة T4. (K) تحليل كابلان-ماير للبقاء العام في مرضى PDAC ذوي المستويات المنخفضة ( ) و H3K18la العالي ( ) المستويات. البيانات في الشكل ب، هـ، و تُعرض كمتوسط SD؛ البيانات في الشكل A و H و J مقدمة كوسيط مع نطاق ربعي. تم إجراء التحليل الإحصائي بواسطة اختبار الطالب. -اختبار في E، أو بواسطة تحليل التباين الأحادي (ANOVA) متبوعًا باختبار المقارنات المتعددة لدونيت في B و F، أو بواسطة اختبار رانك لوغ في K، أو بواسطة اختبار مان-ويتني في A و H، أو بواسطة اختبار كروسكال-واليس متبوعًا باختبار المقارنات المتعددة لدون في J. ; غير مهم

تعبيرها ووظيفتها. بشكل متسق، كانت مستويات H3K18la مرتفعة أيضًا في أنسجة PDAC (الشكل 1E). بالإضافة إلى ذلك، كان تعبير Pan Kla وكذلك H3K18la مرتفعًا بشكل ملحوظ في أربعة خطوط خلوية من PDAC مقارنة بخط الخلايا الظهارية القنوية البنكرياسية الطبيعية (الشكل 1F). بعد ذلك، قمنا بتقييم الأهمية السريرية لـ H3K18la من خلال صبغة IHC في 74 حالة من أنسجة PDAC و72 حالة من أنسجة ما حول السرطان (90 نسيجًا مزدوجًا تم استبعادها من الشريحة المتساقطة، الأنسجة التي لا تحتوي على قناة بنكرياسية، أنسجة ما حول السرطان ذات الشكل غير الطبيعي الواضح). كما هو موضح في الشكل 1G وH، كان مستوى H3K18la مرتفعًا بشكل ملحوظ في PDAC مقارنة بالأنسجة الطبيعية. بين مرضى PDAC، أظهرت عينات عالية من مستوى H3K18la، والتي كانت أكثر انتشارًا من المجموعات الطبيعية (الشكل 1I). كانت مستويات H3K18la المرتفعة مرتبطة إيجابيًا بمراحل AJCC الأكثر تقدمًا (الشكل 1J). لتحديد القيمة التنبؤية لـ H3K18la بشكل أكبر، تم تقييم البقاء العام باستخدام مخطط بقاء كابلان-ماير بناءً على مستوى H3K18la، وكان H3K18la مرتبطًا بشكل محتمل بالتنبؤ كما تحدد بواسطة اختبار لوغ-رانك (الشكل 1K).

تثبيط التحلل السكري يقلل من لاكتيل الهستون ويعيق تكاثر خلايا سرطان البنكرياس القنوي والهجرة

لتوضيح تأثيرات التحلل السكري على لاكتيل الهيستون، استخدمنا أنواعًا مختلفة من مثبطات التحلل السكري (DCA، أوكسامات و2-DG) وواصلنا خفض في خلايا MIA PaCa-2 و AsPC-1 على التوالي. كانت مستويات Pan Kla و H3K18la تتناقص باستمرار مع زيادة جرعات المثبطات (الشكل 2A و B). علاوة على ذلك، أدى si-LDHA إلى تقليل مستوى اللاكتيل في الهيستون بشكل فعال، والذي زاد بشكل ملحوظ بعد علاج Nala (الشكل 2C و D).
بعد ذلك، قمنا بالتحقيق في الوظائف البيولوجية لأسيتيل الهيستون على تكاثر الخلايا. لاحظنا انخفاضًا كبيرًا في حيوية الخلايا وقدرة تشكيل المستعمرات عند المعالجة بـ DCA أو Oxamate أو 2-DG (الشكل 3A-F). علاوة على ذلك، أظهر كتم LDHA تثبيطًا كبيرًا لنمو الخلايا وتشكيل المستعمرات في كل من خلايا MIA PaCa-2 و AsPC-1، بينما Nala
خفف تأثير تثبيط تكاثر الخلايا لـ الصمت (الشكل 3G-L).
لاستكشاف ما إذا كان يمكن أن تؤثر اللاكتيل على هجرة خلايا PDAC، تم إجراء اختبارات شفاء الجروح واختبارات ترانسويل. أدت العلاجات باستخدام DCA وOxamate و2-DG إلى تقليل هجرة الخلايا بشكل كبير في خلايا MIA PaCa-2 وAsPC-1، وأظهر الجرعة الأعلى تأثيرات تثبيط أكثر وضوحًا على هجرة الخلايا مقارنة بالجرعة الأقل في اختبار شفاء الجروح (الشكل 4A-D). وبالمثل، أدى تقليل LDHA إلى تثبيط قدرات الهجرة مقارنة بمجموعة المتجه، وأدى إضافة Nala إلى تخفيف التأثير المثبط لـ si-LDHA (الشكل 4I-L). أظهرت اختبارات ترانسويل أيضًا أن خلايا MIA PaCa-2 أو AsPC-1 المعالجة بـ DCA وOxamate و2-DG قد قللت بشكل كبير من هجرة الخلايا (الشكل 4E-H). لوحظت نفس النتائج في تقليل LDHA، وعكست Nala تأثير التثبيط الهجري لـ si-LDHA في كلا خطي الخلايا (الشكل 4M-P). بشكل جماعي، تشير هذه النتائج إلى أن اللاكتيل الهيستوني يلعب دورًا حاسمًا في بدء وتقدم PDAC، بينما قد يظهر تثبيط اللاكتيل الهيستوني نشاطًا مضادًا للورم محتمل ضد PDAC.

تثبيط التحلل السكري يقلل من اللاكتيل الهيستوني ويثبط تقدم PDAC في نموذج الفأر الزرعي لـ PDAC

لتقييم الأهمية البيولوجية للاكتيل الهيستوني في تقدم PDAC، تم إنشاء نموذج فأر زرعي عن طريق زراعة خلايا MIA PaCa-2 تحت الجلد في الفئران العارية. تم علاج الفئران بمثبط التحلل السكري Oxamate أو المركب، وتم قياس حجم الورم كل يومين. كان حجم الورم في مجموعة Oxamate أقل بكثير من تلك في مجموعة التحكم طوال التجربة، كما أظهر وزن الورم أيضًا انخفاضًا كبيرًا في مجموعة Oxamate مقارنة بالتحكم (الشكل 5A-C). للتحقيق في تأثير تقليل على نمو الورم، تم حقن خلايا sh-LDHA المستقرة ومجموعة التحكم MIA PaCa-2 تحت الجلد في الفئران العارية. مشابهًا لنتائج مثبط التحلل السكري، كانت الأورام في
الشكل 2 تثبيط التحلل السكري يقلل من اللاكتيل الهيستوني. تم معالجة خطي خلايا PDAC MIA PaCa-2 وAsPC-1 بمثبطات التحلل السكري DCA ( )، Oxamate ( ) أو 2-DG ( ) لمدة 24 ساعة، أو تم نقلها باستخدام siRNA لـ LDHA (si-LDHA) أو siRNA للتحكم السلبي (si-NC) لمدة 48 ساعة مع أو بدون معالجة بالصوديوم لاكتات (NaLa، ) . (A-D) تم قياس مستويات اللاكتيل البان-لايسين (Pan Kla) واللاكتيل H3K18 (H3K18la) بواسطة التحليل الغربي وتم تقديرها باستخدام برنامج Image J. أو 6 . تم تقديم جميع البيانات كمتوسط SD. تم إجراء التحليل الإحصائي بواسطة ANOVA أحادي الاتجاه تلاه اختبار المقارنات المتعددة لدونيت في A-B، أو بواسطة اختبار المقارنات المتعددة توكي في C-D.
الشكل 3 تثبيط التحلل السكري يقلل من اللاكتيل الهيستوني ويثبط تكاثر خلايا PDAC. تم معالجة خطي خلايا PDAC MIA PaCa-2 وAsPC-1 بمثبطات التحلل السكري DCA ( )، Oxamate ( ) أو 2-DG ( )، أو تم نقلها باستخدام siRNA لـ LDHA (si-LDHA) أو siRNA للتحكم السلبي (si-NC) مع أو بدون معالجة بالصوديوم لاكتات (NaLa، ) . ( ) تم تصور حيوية الخلايا بواسطة IncuCyte S3 في خلايا MIA PaCa-2 ( ) وAsPC-1 ( ) . أو 3 . ( ) تم تقييم قدرة تكاثر الخلايا بواسطة اختبارات تشكيل المستعمرات في خلايا MIA PaCa-2 ( ) وAsPC-1 ( ) . . تم تقديم جميع البيانات كمتوسط SD. تم إجراء التحليل الإحصائي بواسطة ANOVA تلاه اختبار المقارنات المتعددة لدونيت في A، B، E، F، أو بواسطة اختبار المقارنات المتعددة توكي في G، H، K، L.
أظهرت مجموعة تقليل LDHA حجمًا أصغر ووزنًا أقل مقارنة بمجموعات التحكم (الشكل 5I-K).
بعد ذلك، قمنا بالكشف عن تأثيرات تثبيط التحلل السكري على إنتاج اللاكتات واللاكتيل في نموذج الفأر الزرعي. لم يكن من المفاجئ أن إنتاج اللاكتات في الورم قد انخفض بعد معالجة Oxamate أو
تقليل LDHA (الشكل 5D وL). علاوة على ذلك، لوحظت مستويات منخفضة من Pan Kla وH3K18la مع انخفاض شدة صبغة H3K18la في الأورام المعالجة بـ Oxa-mate (الشكل 5E وF). لوحظت نتائج مماثلة في مجموعات تثبيط LDHA: Pan Kla و
الشكل 4 (انظر التسمية في الصفحة التالية.)
(انظر الشكل في الصفحة السابقة.)

ملخص

الشكل 4 تثبيط التحلل السكري يقلل من اللاكتيل الهيستوني ويثبط هجرة خلايا PDAC. (A-H) تم معالجة خطي خلايا PDAC MIA PaCa-2 وAsPC-1 بمثبطات التحلل السكري DCA ( )، Oxamate ( ) أو DG ( ) لمدة 48 ساعة. تم تقييم قدرة الهجرة بواسطة اختبارات شفاء الجروح واختبارات ترانسويل. . صور تمثيلية ( ) والتقدير ( ). ( ) تم نقل خلايا MIA PaCa-2 وAsPC-1 باستخدام siRNA لـ LDHA (si-LDHA) أو siRNA للتحكم السلبي (si-NC) لمدة 48 ساعة مع أو بدون معالجة بالصوديوم لاكتات ( ) . تم تقييم قدرة الهجرة بواسطة اختبارات شفاء الجروح واختبارات ترانسويل. أو 5 . صور تمثيلية ( ) والتقدير ( J، L، O، P). تم تقديم جميع البيانات كمتوسط SD. تم إجراء التحليل الإحصائي بواسطة ANOVA تلاه اختبار المقارنات المتعددة لدونيت في B، D، G، H، أو بواسطة اختبار المقارنات المتعددة توكي في J، L، O، P.

تم تقليل مستويات H3K18la مقارنة بأنسجة الورم التحكم (الشكل 5M وN).
بالإضافة إلى ذلك، أشار صبغ علامة التكاثر Ki-67 وصبغ الكبد HE إلى أن كل من معالجة Oxamate وshLDHA قللت من تعبير Ki-67 وقللت من بؤر النقائل في الكبد (الشكل 5G-H، O-P). تشير هذه النتائج إلى أن تثبيط التحلل السكري بواسطة المثبط أو تقليل LDHA قلل بشكل ملحوظ من تكاثر الورم وتقدمه. بشكل عام، يقلل تثبيط التحلل السكري من حجم الورم ووزنه، ويثبط إنتاج اللاكتات واللاكتيل، ويثبط تكاثر الورم ونقائل الكبد، مما يشير إلى تثبيط تقدم PDAC في نموذج الفأر الزرعي لـ PDAC.

P300 وHDAC2 هما كاتبان ومزيلان محتملان للاكتيل الهيستوني في خلايا PDAC على التوالي

تم الإبلاغ عن الأسيتيل ترانسفيراز P300 ككاتبة محتملة للاكتيل الهيستوني [20]. ومع ذلك، نادرًا ما تم دراسة مشاركتها في تقدم PDAC بعمق. لتقييم تأثير P300 على اللاكتيل، استخدمنا تقليل P300 (si-P300) أو C646 (مثبط P300) مع أو بدون معالجة NaLa في خلايا MIA PaCa-2 وAsPC-1. أظهرت الشكل 6A والشكل S1A انخفاضًا كبيرًا في كل من مستويات Pan Kla وH3K18la في مجموعة si-P300 أو C646 في خلايا MIA PaCa-2 على التوالي. تحت شرط معالجة NaLa، لا يزال si-P300 أو C646 يقلل بشكل كبير من مستويات Pan Kla وH3K18la (الشكل 6A، S1A). لوحظت نتائج مماثلة أيضًا في خلايا AsPC-1 (الشكل 6B، S1B). تشير هذه النتائج إلى أن P300 قد تكون كاتبة محتملة للاكتيل الهيستوني.
بعد ذلك، بحثنا في تأثيرات P300 على تكاثر الخلايا وهجرتها. وجدنا أن صمت P300 أو معالجة C646 في خلايا MIA PaCa-2 أدى إلى تقليل كبير في تكاثر الخلايا باستخدام IncuCyte S3 واختبارات تشكيل المستعمرات (الشكل 6C وD، S1C-D). في وجود NaLa، تم أيضًا تثبيط حيوية الخلايا بواسطة تقليل P300 أو C646 (الشكل 6C وD، S1C-D). كانت فعالية تقليل P300 أو C646 في تثبيط تكاثر الخلايا وتشكيل المستعمرات واضحة بالمثل في خلايا AsPC-1 (الشكل 6E وF، S1E-F). تم تقييم معدل هجرة الخلايا باستخدام اختبارات شفاء الجروح واختبارات ترانسويل. أدى صمت P300 أو معالجة C646 إلى إعاقة كبيرة لقدرات الهجرة لكل من خلايا MIA PaCa-2 (الشكل 6G وH، S1G-H) وخلايا AsPC-1 (الشكل 6I وJ، S1I-J). بعد ذلك، بحثنا في ما إذا كان تقليل P300
أو معالجة C646 يمكن أن تعكس تأثير NaLa على هجرة PDAC. كما هو متوقع، أظهرت الخلايا التي تم نقلها باستخدام si-P300 أو المعالجة بـ C646 مع NaLa قدرة هجرة مخفضة مقارنة بتلك المعالجة فقط بـ NaLa في خلايا MIA PaCa-2 (الشكل 6G وH، S1G-H) وخلايا AsPC-1 (الشكل 6I وJ، S1I-J). تشير هذه النتائج إلى أن P300، الكاتبة المحتملة للاكتيل الهيستوني، تعزز تقدم PDAC.
لتحديد المحو المحتمل لتعديل اللاكتيل على الهيستون في PDAC، تم استخدام أنواع مختلفة من مثبطات هيستون ديستيلز (HDAC) في خلايا MIA PaCa-2 وAsPC-1. من المثير للاهتمام، أن العلاج بمثبطات HDAC واسعة الطيف TSA، بدلاً من مثبط السرتوين NAM، أدى إلى زيادة المستوى العالمي لتعديل اللاكتيل على الهيستون. بالإضافة إلى ذلك، زاد مثبط HDAC من الفئة I CI994 من تعديل اللاكتيل، بينما لم يكن لمثبط HDAC من الفئة IIa TMP195، ومثبط HDAC من الفئة IIb Bufexamac، ومثبط HDAC من الفئة IV SIS17 أي تأثير مماثل (الشكل S2A-B). للتحقق من دور كل إيزوزيم من HDAC، تم إجراء تجارب التعبير الزائد في خلايا MIA PaCa-2 وAsPC-1. أظهرت النتائج أن التعبير الزائد عن HDAC2 قلل بشكل كبير من مستوى تعديل اللاكتيل، وخاصة H3K18la، بينما لم يؤثر التعبير الزائد عن HDAC1 وHDAC3 على مستويات Pan Kla وH3K18la (الشكل S2C-H). تشير هذه النتائج إلى أن P300 قد تعمل ككاتبة محتملة بينما يعمل HDAC2 كممحاة لتعديل اللاكتيل على الهيستون في PDAC.

H3K18la ينشط نسخ TTK وBUB1B في PDAC

بعد ذلك، حاولنا تحديد كيف يؤثر H3K18la على تقدم PDAC. تم الإبلاغ عن أن تعديل اللاكتيل على الهيستون، وهو تعديل وراثي جديد، ينظم مباشرة نسخ الجينات من الكروماتين. لذلك، قمنا بإجراء اختبار CUT&Tag باستخدام جسم مضاد مضاد لـ H3K18la (البيانات الأصلية في الملف الإضافي 3). في مجموعة المعالجة بـ Oxamate، كان هناك انخفاض ملحوظ في منطقة موقع بدء النسخ (TSS) (الشكل 7A وB)، مع حوالي تم ملاحظة زيادة في مناطق المحفز (الشكل 7C). أظهر تحليل KEGG للقمم المنخفضة في مناطق المحفز المحددة لعلاج Oxamate زيادة ذات صلة في مسار نقل RNA، ودورة الخلية، ومسارات مرتبطة بالورم مثل مسار إشارة MAPK (الشكل 7D).
بالإضافة إلى ذلك، أجرينا اختبار RNA-seq لفحص الجينات المستهدفة المحتملة التي تنظمها اللاكتيل (البيانات الأصلية في الملف الإضافي 4). عند مقارنتها بمجموعة التحكم، زادت معالجة Oxamate من
1259 جينًا وانخفضت 303 جينًا في خلايا PDAC (الشكل 7E). أظهر تحليل KEGG لهذه الجينات المنخفضة أيضًا زيادة في مسار دورة الخلية في مجموعات علاج Oxamate (الشكل 7F). كما أظهر تحليل علم الجينات (GO) لكل من CUT&Tag وتحليل RNA-seq أيضًا زيادة في العمليات المتعلقة بدورة الخلية (الشكل S3A-B).
بحثنا عن جينات ذات تعبير عالٍ في PDAC في قاعدة بيانات GEPIA ووجدنا 8741 جينًا ( تغيير مضاعف , قيمة Q ). من خلال تداخل مجموعات الجينات بين CUT&Tag وRNA-seq وقاعدة بيانات GEPIA، حددنا 14 جينًا معبرًا مختلفًا أظهرت مستويات mRNA منخفضة بشكل ملحوظ وانخفاض في زيادة إشارة H3K18la في منطقة المحفز عند معالجة Oxamate ولكن تم زيادة تعبيرها في أنسجة PDAC (الشكل 7G). نظرًا لأن كل من CUT&Tag وRNAseq زادت في مسار دورة الخلية، ركزنا على الجينات المعنية في مسار دورة الخلية. كشفت النتائج أن 4 جينات (CDC6، TTK، BUB1B، PTTG1) كانت مرتبطة بمسار دورة الخلية، وشاركت بشكل أساسي في المرحلة M (TTK، BUB1B، PTTG1) (الشكل S3C). من الجدير بالذكر، من بينها، (المعروف أيضًا باسم MPS1) وBUB1B (المعروف أيضًا باسم BUBR1)، وهما منظمين لنقطة تفتيش تجميع المغزل الانقسامي ويقعان في الجزء العلوي من المرحلة M، وهما مهمان لتوزيع الكروموسومات بدقة خلال الانقسام [21]. وبالتالي، قررنا التحقيق في هذين الجينين.
حددنا انخفاضًا واضحًا في القمم عند مواضع المحفز لـ و في الخلايا المعالجة بـ Oxamate (الشكل 7H). استخدمنا اختبارات ChIP-qPCR لتأكيد أن H3K18la كان متزايدًا في المحفزات لـ و ، والتي انخفضت بواسطة مثبطات التحلل السكري DCA وOxamate أو 2-DG (الشكل 7I). بالإضافة إلى ذلك، كانت مستويات mRNA والبروتين لـ TTK وBUB1B منخفضة بشكل كبير بواسطة مثبطات مختلفة للتحلل السكري في خلايا MIA PaCa-2 (الشكل 7J وK). تشير هذه النتائج إلى أن تنشيط و قد يكون متورطًا في تعزيز PDAC بواسطة H3K18la.

ترتبط المستويات العالية من TTK وBUB1B بخباثة PDAC

للتحقيق في تأثيرات TTK وBUB1B في تقدم PDAC، قمنا أولاً بالكشف عن تعبيرهما في PDAC. كانت مستويات النسخ والبروتين لـ TTK وBUB1B أعلى بشكل ملحوظ في أربعة خطوط خلوية من PDAC (MIA PaCa-2، PANC-1، AsPC-1، وPL45) مقارنة بخلايا hTERT-HPNE (الشكل 8A وB). أظهر تحليل IHC زيادة كبيرة في تعبير TTK وBUB1B في أنسجة PDAC مقارنة بأنسجة ما حول السرطان (الشكل 8C). أكدت قاعدة بيانات GEPIA وGEO أيضًا أن تعبير TTK وBUB1B ارتفع في أنسجة PDAC مقارنة بالأنسجة الطبيعية (الشكل S4AD). بالإضافة إلى ذلك، أظهر التحليل باستخدام GEPIA وقاعدة بيانات Kaplan-Meier Plotter أن مرضى PDAC الذين لديهم
ارتفاع تعبير TTK أو BUB1B كان لديهم وقت بقاء إجمالي أقصر أو وقت بقاء خالٍ من المرض مقارنة بأولئك الذين لديهم مستويات تعبير أقل (الشكل 8D-G).

يؤدي حذف TTK وBUB1B إلى قمع خباثة PDAC بينما يمنع التعبير الزائد عن TTK جزئيًا التأثيرات المضادة للسرطان لتثبيط اللاكتيل

لتقييم وظيفة TTK وBUB1B في PDAC، استخدمنا نقل siRNA لتقليل تعبير و في خلايا MIA PaCa-2 وAsPC-1 (الشكل 9A وB، S5A-D). أدى تقليل أي من أو إلى انخفاض كبير في حيوية الخلايا لكل من خلايا MIA وAsPC-1 مقارنة بمجموعة التحكم (الشكل 9C وD). أظهرت اختبارات شفاء الجروح (الشكل 9E وF) بالإضافة إلى اختبارات transwell (الشكل 9G وH) أن كتم أو قمع هجرة الخلايا.
للتحقيق في تأثير TTK في تقدم PDAC بواسطة H3K18la، تم التعبير الزائد عن TTK في خلايا MIA PaCa-2 (الشكل 9I) وتم علاجها بمثبطات التحلل السكري. مقارنة بالتحكم السلبي، لم يعزز التعبير الزائد قدرة التكاثر أو هجرة خلايا MIA PaCa-2 (الشكل S5E-F). قد يكون ذلك بسبب أن مستوى TTK كان مرتفعًا للغاية بالفعل في PDAC [22، 23]، وأن قدرته على تعزيز تقدم الورم كانت مشبعة. مشابهة للنتائج المذكورة أعلاه، مثبطات التحلل السكري Oxamate و2-DG منعت نمو الخلايا وهجرتها في خلايا MIA PaCa-2. من المثير للاهتمام، أن التعبير الزائد مع مثبطات التحلل السكري قد أضعف التأثيرات المضادة للسرطان لمثبطات التحلل السكري على تثبيط نمو الخلايا وقمع الهجرة (الشكل 9J-L). تشير هذه النتائج إلى أن TTK وBUB1B متورطان في تقدم PDAC، وأن TTK يشارك في خباثة PDAC بواسطة H3K18la.

حلقة تغذية راجعة إيجابية بين جينات هدف H3K18la والتحلل السكري

تم الإبلاغ عن أن تعبير BUB1B مرتبط إيجابيًا بدورة الخلية والتحلل السكري في سرطان الرئة الغدي. يمكن أن يؤدي تقليل BUB1B إلى تقليل الجينات المرتبطة بالتحلل السكري، بما في ذلك عائلة الناقلات الذائبة 2 رقم 1، , كيناز البيروفات M 2، وهكسوكيناز 2، مما يشير إلى أن BUB1B يعمل كمنشط في الأيض الجلايكولي لتعزيز سرطان الرئة الغدي [24]. لذلك، كان من المعقول أن نفترض أن BUB1B قد يعمل كمنظم حاسم للتحلل السكري، داعمًا التكاثر غير المنضبط في PDAC. من المثير للاهتمام، أن مستويات البروتين لـ P300 كانت منخفضة بشكل كبير في خلايا PDAC التي تم نقلها بـ si-TTK، si-BUB1B، أو مزيج من الاثنين (الشكل 10A وB). نظرًا لأن P300 ثبت أنها كاتبة لتعديل اللاكتيل على الهيستون في النتائج المذكورة سابقًا، استنتجنا أنه خلال تقدم PDAC، لم يكن فقط مسار التحلل السكري-تعديل اللاكتيل على الهيستون-TTK/BUB1B موجودًا، ولكن
الشكل 5 (انظر التسمية في الصفحة التالية.)
(انظر الشكل في الصفحة السابقة.)
الشكل 5 تثبيط التحلل السكري يقلل من تعديل اللاكتيل على الهيستون ويقمع تقدم السرطان في PDAC المزروع في الفئران العارية. (A-H) تم حقن خلايا MIA PaCa-2 في الفئران العارية تحت الجلد وتم إعطاؤها Oxamate ( , يوميًا) أو مركب للتحكم لمدة 30 يومًا. (I-P) تم تحقيق تقليل مستقر لـ LDHA (sh-LDHA) بواسطة الفيروسات المعوية في خلايا MIA PaCa-2. تم حقن خلايا sh-LDHA والخلايا الضابطة (sh-NC) في الفئران العارية تحت الجلد. صورة الورم الإجمالية ( ) ووزن الورم ( ) بعد التضحية. تقييم حجم الورم خلال التجربة ( ). محتوى اللاكتات في أنسجة الورم ( تم قياس مستويات اللاكتيل من البان-لايسين (Pan Kla) ولاكتيل H3K18 (H3K18la) بواسطة تقنية الويسترن بلوت أو صبغة IHC، وتمت الكمية باستخدام برنامج Image J (E-F، M-N). تم تقييم تكاثر الخلايا باستخدام صبغة IHC مع Ki-67. الصور التمثيلية والكمية ( تم تقييم انتشار الورم في الكبد باستخدام صبغة HE ). تشير الأسهم إلى آفات الورم النقيلي. جميع البيانات مقدمة كمتوسط تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام اختبار ت الطالب.
كما أن TTK/BUB1B لعبت دورًا إيجابيًا في اللاكتيلation الهيستونية، مما زاد من سوء الخباثة.
علاوة على ذلك، حاولنا تحديد ما إذا كان TTK/ BUB1B يمكن أن يؤثر على التحلل السكري في سرطان البنكرياس القنوي (PDAC). يلعب LDHA دورًا محوريًا في تخليق اللاكتات، ويدفع تفضيل خلايا السرطان للتحلل السكري الهوائي في PDAC [25]. تشمل مواقع الفسفرة المحتملة لـ LDHA التيروزين 10 (Y10) والتيروزين 239 (Y239) كما تم التنبؤ به بواسطة PhosphoSitePlus.https://www.phosphosite.org/homeAction“، الشكل S6A). بالنظر إلى نشاط كيناز TTK ذو التخصص المزدوج تجاه كل من بقايا التيروزين والسيرين/الثريونين [26]، كنا مهتمين بتحديد ما إذا كان لدى TTK القدرة على فسفرة LDHA. لذلك، قمنا بالتحقيق فيما إذا كان هناك تفاعل داخل الجسم بين TTK وLDHA باستخدام اختبارات Co-IP. أكدت عملية IP باستخدام جسم مضاد لـ LDHA تليها تقنية الويسترن بلوت مع جسم مضاد لـ TTK التفاعل بين TTK وLDHA في خلايا MIA PaCa-2 وAsPC-1 (الشكل 10C وD). علاوة على ذلك، فإن تقليل التعبير عن قلل بشكل كبير من تعبير LDHA الفسفوري عند Y239 (الشكل 10E و F). كان هناك فقط انخفاض طفيف في الفسفرة عند Y10 بعد تمت الإطاحة، لكن النتائج لم تكن ذات دلالة إحصائية (الشكل 10E وF، S6BC). كما اكتشفنا نشاط LDH، ووجدنا أن تثبيط TTK يمكن أن يقلل من نشاط LDH (الشكل 10G وH). تشير هذه النتائج إلى أن TTK يتفاعل مع LDHA، ويؤثر على فسفرتها ونشاطها. بعد ذلك، قمنا بتقييم ما بعد فسفرة LDHA للتحقيق في تأثيرات TTK على التحلل السكري في PDAC. أظهرت النتائج أدى تقليل التعبير إلى تقليل إنتاج اللاكتات (الشكل 10I وJ)، وانخفاض مستويات Pan kla وH3K18la (الشكل 10K وL) في كل من خلايا MIA PaCa-2 وAsPC-1. تشير هذه النتائج إلى أن TTK يلعب دورًا في التغذية الراجعة الإيجابية بين التحلل السكري واللاكتيل. بشكل عام، نجد حلقة تغذية راجعة إيجابية بين جينات الهدف H3K18la TTK/BUB1B والتحلل السكري/اللاكتيل.

نقاش

كشفت تحقيقاتنا في سرطان البنكرياس القنوي (PDAC) عن زيادة ملحوظة في تراكم اللاكتات داخل بيئة الورم، والتي خدمت بعد ذلك كركائز لعملية اللاكتيلation للهستونات، ولا سيما H3K18la، التي ظهرت كمحرك رئيسي لتكون الورم وتقدمه في PDAC وكانت مرتبطة بشكل كبير بالنتائج السريرية السلبية. تم تحديد P300 ككاتبة وHDAC2 كـ
مزيل لكتلة الهيستون في خلايا PDAC. علاوة على ذلك، فإن H3K18la حفزت و نسخ، مما يعزز تقدم دورة الخلية وتكوّن الأورام في PDAC. ومن المثير للاهتمام، أن تقليل التعبير عن وأدى تقليل BUB1B إلى تقليل تعبير P300، كما أن تقليل TTK منع فسفرة LDHA عند Y239، مما أدى إلى انخفاض إنتاج اللاكتات ومستوى اللاكتيل الهيستوني، مما أنشأ حلقة تغذية راجعة بين هذه الجزيئات. تقدم هذه الحلقة الإيجابية من الجليكوليز- H3K18la- TTK/BUB1B طريقًا واعدًا لأساليب علاجية إضافية محتملة في علاج PDAC. باختصار، توفر دراستنا رؤى حاسمة حول دور اللاكتيل الهيستوني في مسببات PDAC، مما يبرز الأهداف العلاجية المحتملة لهذه المرض التحدي.
يُعتبر سرطان البنكرياس (PDAC) واحدًا من أكثر أنواع السرطان فتكًا وتحديًا كبيرًا في مجال الطب السرطاني. تُعتبر الاضطرابات الأيضية عوامل خطر لتقدم سرطان البنكرياس. يُعتبر إعادة برمجة الأيض الخلوي لدعم التكاثر والعمليات الخلوية المختلفة علامة رئيسية للسرطان. تلعب عملية التحلل السكري دورًا مركزيًا في إعادة برمجة الأيض لخلايا سرطان البنكرياس وتدعم السلوكيات الخبيثة. يُعرف التحلل السكري الهوائي، المعروف أيضًا بتأثير واربورغ، بأنه يتميز بتوليد الطاقة بشكل تفضيلي من خلال التحلل السكري بدلاً من الفسفرة التأكسدية، حتى في وجود مستويات كافية من الأكسجين، مما يؤدي إلى إنتاج كبير من حمض اللبنيك. تظهر هذه الظاهرة كعلامة مميزة لخلايا الورم، وخاصة في سرطان البنكرياس. لذلك، فإن استهداف تأثير واربورغ يحمل أهمية قصوى في استكشاف استراتيجيات علاجية جديدة ضد سرطان البنكرياس. كان يُعتبر حمض اللبنيك سابقًا مجرد منتج ثانوي لعملية الأيض التحللي حتى اكتشف فوبيرت وزملاؤه أنه يمكن إعادة استخدامه كمصدر الكربون الرئيسي لدورة حمض الكربوكسيليك الميتوكوندري. من جانبهم، قدم زانغ وزملاؤه أدلة على أن حمض اللبنيك لديه القدرة على العمل كمنظم وراثي من خلال تعديل بقايا الليسين في الهيستون عبر عملية اللبنيك. في السنوات الأخيرة، كشفت الدراسات عن مشاركة اللبنيك في عمليات مثل تكوين الأورام، وفشل القلب، والإنتان، وأمراض أخرى. ومع ذلك، لم يتم الإبلاغ عن دراسات حول تعديل اللبنيك في الهيستون في سرطان البنكرياس حتى الآن. في دراستنا الحالية، لاحظنا تراكم حمض اللبنيك في البيئة الدقيقة للورم في سرطان البنكرياس، والذي عمل كركائز لتعديل الهيستون باللبنيك. لقد كشفنا أن
يمكن أن تؤدي اللاكتيلation، وخاصة H3K18la، إلى حدوث الأورام وتقدمها في PDAC في المختبر وفي الجسم الحي للمرة الأولى. علاوة على ذلك، أظهرت المستويات العالية من اللاكتيلation ارتباطًا قويًا بالنتائج السريرية السيئة. تشير جميع هذه النتائج إلى أن اللاكتيلation تشارك في تطور PDAC. ومع ذلك، لم نتمكن من إثبات العلاقة المباشرة بين H3K18la وتطور PDAC، نظرًا لأن الطبيعة المعقدة والديناميكية لتعديلات الهيستون تجعلها أقل عرضة للتأثر بالطفرات النقطية في قاعدة واحدة. هذه هي قيود شائعة في الدراسات التي تهدف إلى إثبات الارتباط المباشر لتعديلات الهيستون (بما في ذلك اللاكتيلation، والأسيتيلation، والفوسفو-تعديل) مع الأمراض. بالإضافة إلى ذلك، فإن آثار اللاكتيلation في بروتينات هيستون أو غير هيستون الأخرى مثيرة للاهتمام أيضًا.
‘كاتب’ و’ممحاة’ يلعبان أدوارًا تنظيمية حاسمة في التعديلات الجينية. الكاتب هو إنزيم مسؤول عن إضافة أو إدخال تعديل محدد لجزيء الركيزة، بينما الممحاة هي إنزيم مسؤول عن إزالة أو عكس تعديل ما بعد الترجمة المحدد من جزيء الركيزة. حاليًا، تم الإشارة إلى أن الأسيتيل ترانسفيراز P300 [20] وGCN5 [33] يمكن أن يعملوا ككتّاب لكتلة الهيستون. بينما تعمل مزيلات الأسيتيل HDAC1-3 [36] جنبًا إلى جنب مع SIRT3 [37] كممحاة للكتلة. هنا، من خلال استخدام المثبطات وتجارب الوظيفة، حددنا P300 وHDAC2 ككاتب وممحاة محتملين على التوالي المعنيين في تنظيم كتلة الهيستون في خلايا PDAC. من خلال إسكاة أو تثبيط P300 لتعطيل كتلة الهيستون، تمكنا من تثبيط تكاثر الخلايا وقدرتها على الهجرة في خلايا PDAC في بيئة غنية باللاكتات. ومن الملاحظ أن تدخل اللاكتات عزز من قدرات التكاثر والهجرة في خلايا AsPC-1، ولكن ليس في خلايا MIA PaCa-2. قد تنشأ هذه الفجوة من الإنتاج الأعلى للاكتات في خلايا MIA PaCa-2 مقارنة بخلايا AsPC-1 [38]، وهو ما يكفي لتعزيز التكاثر والهجرة. سؤال آخر يجب ملاحظته هو أنه عند المقارنة مع خفض P300 وحده، بدا أن إضافة NaLa مع خفض P300 زادت من كتلة الهيستون. وذلك لأننا قمنا فقط بخفض التعبير بدلاً من الإزالة الكاملة. عند المستوى المرتفع للغاية من NaLa العلوي، حتى الكاتب (P300) كان مقيدًا بشكل كبير، قد يتم أيضًا تنظيم الكتلة (كتلة الهيستون) في الأسفل. أيضًا، قد لا يكون P300 هو الكاتب الوحيد لكتلة الهيستون، وقد يكون هناك كتّاب آخرون يشاركون في العملية. بالإضافة إلى ذلك، نظرًا لأن P300 يعمل أيضًا ككتّاب بروتين لتعديلات هيستون متنوعة بما في ذلك الأسيتيل، الكروتونيل، و -هيدروكسيبيوتيريلات [39، 40]، لا يمكننا استبعاد ما إذا كانت تعديلات الأسيتيل الأخرى التي يقودها P300 تشارك في الأنماط الخبيثة، ولا تزال هناك حاجة لمزيد من التحقيقات.
لقد تم الإبلاغ عن أن HDAC من الفئة الأولى، وخاصة HDAC1 وHDAC3، هم الممحاة الرئيسية لكتلة الهيستون في الخلايا [41]. في سرطان الكبد الخلوي، تظهر غالبية مواقع الكتلة ارتباطات إيجابية مع HDAC1-3، ويؤدي خفض HDAC3 في خلايا HepG2 إلى زيادة في شدة الكتلة [42]. بالإضافة إلى ذلك، تم الإبلاغ أيضًا عن أن عائلة السرتوين تشارك في الكتلة. تحت ظروف نقص الأكسجين، يتراكم إنزيم الألانين-tRNA في الميتوكوندريا ويقوم بكتلة البروتينات الميتوكوندرية، مما يمنع الفسفرة التأكسدية. ومع ذلك، يمكن عكس هذه العملية بواسطة SIRT3، مما يشير إلى أن SIRT3 قد يعمل كممحاة لكتلة البروتينات الميتوكوندرية [37]. هنا، أظهرت تدخلاتنا مع مثبطات مزيلات الأسيتيل الدور المحتمل لوظيفة HDAC من الفئة الأولى كمزيل للكتلة وأشارت تجارب التعبير الزائد إلى أن HDAC2 قد يعمل كممحاة في خلايا PDAC. ومع ذلك، يتطلب فهم الآلية المحددة لـ HDAC2 في تطور PDAC، بالإضافة إلى توضيح أدوار عائلات HDAC الأخرى، مزيدًا من التحقيق في المستقبل.
تم التحقق من أن زيادة كتلة الهيستون في مناطق المحفز تؤدي إلى تحفيز التعبير عن الجينات المستهدفة، بما في ذلك أرجيناز 1 (Arg1)، وبروتين قارئ N6-methyladenosine YTHDF2 في أنواع خلايا مختلفة [13، 20]. في الدراسة الحالية، كشفنا عن H3K18la الذي ينشط وBUB1B في خلايا PDAC لدفع دورة الخلية وتسريع تكوين الأورام للمرة الأولى. تعتبر مسار دورة الخلية عملية محفوظة تطوريًا ضرورية لنمو خلايا الثدييات. تتراكم خلايا الورم في تشوهات دورة الخلية التي تؤدي إلى تكاثر غير مجدول، وعدم استقرار جيني. تم اقتراح العديد من الاستراتيجيات العلاجية لاستهداف دورة الخلية في السرطان. في هذه الدراسة، أظهرنا أن منظمات نقطة تفتيش تجميع المغزل الانقسامي TTK وBUB1B كانت معبرة بشكل كبير في أنسجة سرطان البنكرياس البشري وعملت كعوامل تنبؤية في PDAC، وهو ما يتماشى مع التقارير السابقة [22،23،43]. على الرغم من أن آليات عدة نقاط تفتيش قد تم تأسيسها بشكل جيد، إلا أن الأهمية الوظيفية لـ TTK وBUB1B في خلايا PDAC لم يتم تحليلها بعمق. من خلال استخدام خفض التعبير والتعبير الزائد جنبًا إلى جنب مع مثبطات التحلل السكري، أكدنا تأثيرات TTK وBUB1B في خبيثة PDAC المعتمدة على H3K18la. قدمنا تفسيرًا جديدًا لاستهداف المنظمات الحرجة لاستقرار الجينوم ونقطة تفتيش الانقسام TTK وBUB1B في PDAC.
أكد المزيد والمزيد من الباحثين أن إعادة توصيل الأيض وإعادة تشكيل الجينات مرتبطان ارتباطًا وثيقًا وينظمان بعضهما البعض بشكل متبادل [44]. في سرطان الخلايا الكلوية الواضحة، يؤدي عدم نشاط فون هيبل-لينداو إلى H3K18la، الذي ينشط محفز مستقبل عامل النمو المشتق من الصفائح الدموية ; والإشارة الأخيرة، بدورها، تحفز H3K18la، مما يؤسس
الشكل 6 P300 هو كاتب محتمل لكتلة الهيستون في خلايا PDAC. تم نقل خطوط خلايا PDAC MIA PaCa-2 وAsPC-1 باستخدام siRNA P300 (siP300) أو siRNA التحكم السلبي (si-NC) مع أو بدون معالجة لاكتات الصوديوم (NaLa، ). (A-B) تم قياس مستويات الكتلة الكلية (Pan Kla) وكتلة H3K18 (H3K18la) في خلايا MIA PaCa-2 (A) وAsPC-1 (B). أو 4. صور تمثيلية (اللوحة اليسرى)، والتكميل (اللوحة اليمنى). (C-F) تم الكشف عن قدرة تكاثر خلايا MIA PaCa-2 (C، D) وAsPC-1 (E، F) باستخدام IncuCyte S3 (C، E) وتجارب تشكيل المستعمرات ( ). أو 6 . ( -J) تم تقييم قدرة هجرة خلايا MIA PaCa-2 ( ) وAsPC-1 ( ) باستخدام تجارب شفاء الجروح ( ) وتجارب ترانسويل ( ). أو 5 . جميع البيانات مقدمة كمتوسط SD. تم إجراء التحليل الإحصائي بواسطة ANOVA متبوعًا باختبار المقارنات المتعددة Tukey.
الشكل 7 (انظر التعليق في الصفحة التالية.)
(انظر الشكل في الصفحة السابقة.)
الشكل 7 H3K18la ينشط التعبير عن TTK وBUB1B في PDAC. (A-H) تم معالجة خلايا MIA PaCa-2 بمثبط تحلل سكري Oxamate ( ) لمدة 24 ساعة. تم جمع الخلايا لإجراء اختبار CUT&Tag لتحديد مواقع الارتباط لـ H3K18la (A-D، H) أو تم جمعها لـ RNA-seq لتحديد الجينات السفلية للكتلة (E-F). أظهر خريطة الحرارة توزيع قمم H3K18la في جوار موقع بدء الترجمة (TSS) (A-B). توزيع H3K18la على الجينوم (C). تحليل KEGG لمنطقة المحفز لتوزيع H3K18la (D). خريطة البركان للجينات المعبر عنها بشكل مختلف في RNA-seq (E). تحليل KEGG للجينات المنخفضة التعبير في مجموعة المعالجة بـ Oxamate بواسطة RNA-seq (F). دمج CUT&Tag وRNA-seq وقاعدة بيانات GEPIA لتحديد الأهداف السفلية المحتملة لـ H3K18la (G). تتبع عارض الجينوم التكاملي لـ CUT&Tag يظهر H3K18la المتزايد في المحفزات لـ TTK وBUB1B (H). (I-K) تم معالجة خلايا MIA PaCa-2 أو AsPC-1 بمثبطات تحلل سكري DCA ( )، Oxamate ( ) أو 2-DG ( ) لمدة 24 ساعة. تم ترسيب شظايا الحمض النووي باستخدام جسم مضاد لـ H3K18la وتم تحليلها بواسطة . مستويات mRNA النسبية لـ و في خلايا MIA PaCa-2 (J). . صور تمثيلية لبلات الغربية وتكميل مستويات بروتين TTK وBUB1B في خلايا MIA PaCa-2 (K). . جميع البيانات مقدمة كمتوسط SD. تم إجراء التحليل الإحصائي بواسطة ANOVA أحادي الاتجاه متبوعًا باختبار المقارنات المتعددة Dunnett في I-K. , ** , *** ; ns، غير مهم
حلقة تغذية راجعة إيجابية مسرطنة [45]. تظهر خلايا الميكروغليا تراكمًا كبيرًا لكتلة الهيستون H4 ليسين 12 في عينات الدماغ من مرضى الزهايمر، والتي تستهدف مناطق المحفز للجينات المرتبطة بالتحلل السكري، مما يؤدي إلى تحفيز التعبير عنها وزيادة إنتاج اللاكتات. هذا يؤسس حلقة تغذية راجعة إيجابية تشمل الأيض-الجينات-الأيض، مما يؤدي إلى تفاقم اختلال الأيض الميكروغلي والضعف الوظيفي [46]. ومع ذلك، لا يزال هناك نقص في الفهم الشامل لإعادة برمجة الأيض وكتلة الهيستون في PDAC. في هذه الدراسة، وجدنا أن خفض التعبير عن و BUB1B، الجينات المستهدفة لـ H3K18la، يمكن أن تقلل من تعبير P300 في خطوط خلايا PDAC المختلفة. ككاتب لأسيتيل الهيستون، يمكن أن يثبط P300 المزيد من أسيتيل الهيستون، مما يشكل حلقة تغذية راجعة. قدمت دراستنا إضافة جديدة مهمة حول تنظيم التغذية الراجعة الإيجابية بين TTK وBUB1B وP300. بالإضافة إلى ذلك، تنظم LDHA الخطوة الأخيرة من التحلل السكري التي تنتج اللاكتات، والتي يتم التعبير عنها بشكل رئيسي في الأنسجة ذات التحلل السكري العالي، مثل الأورام [47]. مستوى اللاكتات العالي والتحلل السكري يحفزان أسيتيل الهيستون، مما يمكن أن يحفز التنشيط النسخي في خلايا PDAC المختلفة. من المثير للاهتمام، أن تقليل التعبير عن الجين المستهدف لـ H3K18la، يمكن أن يثبط بشكل عكسي فسفرة LDHA عند Y239، مما زاد من قمع
نشاط LDH وإنتاج اللاكتات، مما يقلل من مستويات Pan Kla و H3K18la. وقد تم الإبلاغ عن أن فسفرة LDHA تؤثر على نشاط LDHA، الذي يتم تعديله بشكل رئيسي بواسطة Y10 [48-50]. ومع ذلك، في نظامنا، لاحظنا للمرة الأولى أن أدى تقليل التعبير إلى تثبيط تنشيط LDHA من خلال فسفرة Y239. بشكل عام، تؤسس دراستنا حلقة تغذية راجعة إيجابية من التحلل السكري، وخلط الهيستون، وجينات دورة الخلية، مما يضيف آلية جديدة لسرطان البنكرياس ويقدم دليلاً لعلاج سرطان البنكرياس.

الخاتمة

باختصار، تقدم دراستنا استكشافًا جديدًا وإضافة مهمة لإعادة برمجة الأيض والتنظيم الجيني. يمكن الاستنتاج أن اللاكتات تعزز تكاثر الخلايا وهجرتها جزئيًا على الأقل من خلال أسيتيل الهيستون، وخاصة H3K18la، وأن هذه العملية تتوسطها TTK وBUB1B، مما يعزز بدوره عملية التحلل السكري ويزيد من الأسيتيل. هناك حاجة إلى مزيد من التحقيق لتوضيح إعادة برمجة H3K18la-TTK/BUB1B الجينية المرتبطة بالتحلل السكري المتعلق بتقدم PDAC. قد تؤدي هذه النتائج إلى تصميم استراتيجيات علاجية محتملة ضرورية وعاجلة لعلاج PDAC.
الشكل 8 المستويات العالية من TTK و BUB1B مرتبطة بخباثة PDAC. (A) تم الكشف عن مستويات mRNA النسبية لـ TTK و BUB1B في خط خلايا الظهارة القنوية البنكرياسية البشرية hTERT-HPNE وأربعة خطوط خلايا PDAC مختلفة (MIA PaCa-2 و PANC-1 و AsPC-1 و PL45) بواسطة RT-qPCR. . ( صور تمثيلية لبلوت الغربي وقياس مستويات بروتين TTK و BUB1B في خطوط الخلايا المذكورة أعلاه. . ( تمت رؤية مستويات تعبير TTK و BUB1B من خلال صبغة IHC في أنسجة PDAC وأنسجة ما حول السرطان في اللوحة اليسرى. تم عرض النتائج الإحصائية في اللوحة اليمنى. . (D-G) منحنيات كابلان-ماير للبقاء العام والبقاء خالياً من المرض في مرضى سرطان البنكرياس القنوي (PDAC) الذين لديهم تعبير منخفض وعالي لـ TTK أو BUB1B في قاعدة بيانات GEPIA (D، ) وقاعدة بيانات مخطط كابلان-ماير ( ). جميع البيانات مقدمة كمتوسط تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام تحليل التباين الأحادي (ANOVA) تلاه اختبار المقارنات المتعددة لدونيت. أو بواسطة الطالب -اختبار في C، أو بواسطة اختبار لوغ-رانك في D-G. TPM، النصوص لكل مليون
الشكل 9 (انظر الشرح في الصفحة التالية.)

(انظر الشكل في الصفحة السابقة.)

الشكل 9 تقليل TTK/BUB1B يثبط خبيثة PDAC، وزيادة TTK تعاكس جزئيًا تأثيرات مضادات السرطان لتثبيط اللاكتيل. (A-H) تم نقل خلايا MIA PaCa-2 وAsPC-1 باستخدام siRNA TTK (si-TTK)، siRNA BUB1B (si-BUB1B) أو siRNA التحكم السلبي (si-NC). كفاءة TTK و تم الكشف عن الصمت بواسطة تقنية الويسترن بلوت تم تقييم التكاثر باستخدام جهاز إنكو سايت S3 (C-D). تم تقييم قدرة الهجرة من خلال اختبارات شفاء الجروح واختبارات الترانسويل (E-H). . (I-L) تم نقل خلايا MIA PaCa-2 باستخدام بلازميد زيادة التعبير TTK (oe-TTK) أو بلازميد التحكم السلبي (oe-NC)، ثم تم معالجتها بمثبطات التحلل السكري أوكزاميت ( ) أو تم تحديد كفاءة التعبير المفرط لـ TTK بواسطة التحليل الغربي (I). تم تقييم تكاثر الخلايا باستخدام جهاز IncuCyte S3 (J) واختبارات تشكيل المستعمرات (K). أو 3. تم تقييم قدرة الهجرة من خلال اختبارات شفاء الجروح ( ). جميع البيانات مقدمة كمتوسط تم إجراء التحليل الإحصائي بواسطة ANOVA تلاه اختبار المقارنات المتعددة لدونيت في C-H، أو بواسطة اختبار المقارنات المتعددة توكي في J-L.
الشكل 10 (انظر الشرح في الصفحة التالية.)
(انظر الشكل في الصفحة السابقة.)
الشكل 10 حلقة تغذية راجعة إيجابية بين جينات الهدف H3K18la (TTK و BUB1B) والجليكوليز. (A-B) تم نقل خلايا MIA PaCa-2 (A) و AsPC-1 (B) باستخدام siRNA للتحكم السلبي (si-NC) و siRNA لـ TTK (si-TTK) و/أو siRNA لـ BUB1B (si-BUB1B). تم الكشف عن مستويات البروتين بواسطة تقنية الويسترن بلوت وتم قياسها. . (C-D) تم تأكيد التفاعلات بين TTK و LDHA في خلايا MIA PaCa-2 (C) و AsPC-1 (D) بواسطة الترسيب المناعي المشترك (Co-IP). (E-L) تم نقل خلايا MIA PaCa-2 و AsPC-1 باستخدام si-TTK أو si-NC. (E-F) تم الكشف عن مستويات LDHA الفسفورية عند Y239 و Y10 في خلايا MIA PaCa-2 (E) و AsPC-1 (F) بواسطة تقنية الويسترن بلوت وتم قياسها. . ( اختبارات نشاط LDHA في MIA PaCa-2 ) و AsPC-1 ( ) خلايا. أو 6 . ( مستوى اللاكتات في سوائل زراعة الخلايا. . (K-L) تم قياس مستويات اللاكتيل من البان-لايسين (Pan Kla) ولاكتيل H3K18 (H3K18la) بواسطة تقنية الويسترن بلوت وتم تقديرها باستخدام برنامج Image J. جميع البيانات مقدمة كمتوسط تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام تحليل التباين الأحادي (ANOVA) متبوعًا باختبار المقارنات المتعددة لتوكاي في A-B، أو بواسطة اختبار المقارنات المتعددة لدونيت في E-F، أو بواسطة اختبار t لستودنت في G-L. . ( ) النتائج الرئيسية لهذه المقالة. حلقة التغذية الراجعة الإيجابية بين الجليكوليز وH3K18la وTTK/BUB1B تفاقم الخلل في سرطان البنكرياس القنوي. تم إنشاء هذه الصورة بمساعدة BioRender (https://www.biorender.com)

معلومات إضافية

تحتوي النسخة الإلكترونية على مواد إضافية متاحة علىhttps://doi. org/10.1186/s12943-024-02008-9.

المادة التكميلية 1

المادة التكميلية 2
المادة التكميلية 3
المادة التكميلية 4

شكر وتقدير

نشكر GEO و GEPIA وقاعدة بيانات Kaplan-Meier Plotter على توفير المنصات العامة، ونعبر عن تقديرنا للباحثين على تحميل بياناتهم. نشكر مركز الأبحاث الطبية الأساسية، معهد الابتكار والبحث الطبي في مستشفى بكين الثالث على مساعدتهم القيمة في الحصول على خط خلايا PDAC PANC-1.

مساهمات المؤلفين

FL، WS، LX، DY، TW: قاموا بإجراء التجارب؛ MT، XC و JY: جمعوا العينات السريرية؛ FL، WS، LX، DY، TW، MT، XC و JY: تحققوا من نتائج التجارب؛ FL، WS و LX: قاموا بإجراء التحليلات الإحصائية؛ FL و WS: كتبوا المسودة؛ RW و TH: ساهموا في الفكرة، صمموا البحث، أشرفوا على المسودة وحرروها. جميع المؤلفين راجعوا المسودة.

تمويل

تم دعم هذا العمل من قبل الصندوق الخاص لبرنامج بناء التخصصات السريرية الرئيسية الوطنية، جمهورية الصين الشعبية (2023)، ومؤسسة العلوم الطبيعية الوطنية في الصين (82270843، 82170875، 82371588)، ومؤسسة العلوم الطبيعية في بكين (7232198)، وبرنامج بكين نوفا (20220484090، 20230484442)، ومشروع المواهب لمشروع التخصصات السريرية الرئيسية في مستشفى بكين الثالث.

توفر البيانات

تتوفر مجموعات البيانات التي تم تحليلها خلال الدراسة من المؤلفين المقابلين عند الطلب المعقول.

الإعلانات

قدم جميع المشاركين في هذه الدراسة موافقة خطية مستنيرة وتمت الموافقة على الدراسة من قبل لجنة أخلاقيات البحث السريري في مستشفى بكين الجامعي الثالث. تم منح الموافقة الأخلاقية لدراسة TMA من قبل لجنة أخلاقيات البحث السريري، شركة أوتدو للتكنولوجيا الحيوية المحدودة. تم إجراء جميع تجارب الحيوانات في مركز علوم الصحة بجامعة بكين وتمت الموافقة عليها من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات بجامعة بكين.
جميع المؤلفين قد وافقوا على نشر هذه المخطوطة.

المصالح المتنافسة

يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح متنافسة.

تفاصيل المؤلف

قسم الغدد الصماء والتمثيل الغذائي، المختبر الوطني الرئيسي لتعزيز خصوبة الإناث، مستشفى بكين الثالث، بكين 100191، الصين
قسم طب المختبرات، مستشفى بكين الثالث، بكين 100191، الصين
قسم الجراحة العامة، مستشفى بكين الثالث، بكين 100191، الصين
تاريخ الاستلام: 20 ديسمبر 2023 / تاريخ القبول: 24 أبريل 2024
تم النشر على الإنترنت: 06 مايو 2024

References

  1. Siegel RL, Miller KD, Wagle NS, Jemal A. Cancer statistics, 2023. CA Cancer J Clin. 2023;73:17-48.
  2. Grossberg AJ, Chu LC, Deig CR, Fishman EK, Hwang WL, Maitra A, et al. Multidisciplinary standards of care and recent progress in pancreatic ductal adenocarcinoma. CA Cancer J Clin. 2020;70:375-403.
  3. Halbrook CJ, Lyssiotis CA, Pasca di Magliano M, Maitra A. Pancreatic cancer: advances and challenges. Cell. 2023;186:1729-54.
  4. Dreyer SB, Upstill-Goddard R, Legrini A, Biankin AV, Glasgow Precision Oncology L, Jamieson NB, et al. Genomic and molecular analyses identify molecular subtypes of pancreatic cancer recurrence. Gastroenterology. 2022;162:320-4. e4.
  5. Yang J, Ren B, Yang G, Wang H, Chen G, You L, et al. The enhancement of glycolysis regulates pancreatic cancer metastasis. Cell Mol Life Sci. 2020;77:305-21.
  6. El Kaoutari A, Fraunhoffer NA, Audebert S, Camoin L, Berthois Y, Gayet O et al. Pancreatic ductal adenocarcinoma ubiquitination profiling reveals specific prognostic and theranostic markers. EBioMedicine.2023;92:104634.
  7. Qin C, Yang G, Yang J, Ren B, Wang H, Chen G, et al. Metabolism of pancreatic cancer: paving the way to better anticancer strategies. Mol Cancer. 2020;19:50.
  8. Pan C, Li B, Simon MC. Moonlighting functions of metabolic enzymes and metabolites in cancer. Mol Cell. 2021;81:3760-74.
  9. Cao L, Wu J, Qu X, Sheng J, Cui M, Liu S, et al. Glycometabolic rearrange-ments-aerobic glycolysis in pancreatic cancer: causes, characteristics and clinical applications. J Exp Clin Cancer Res. 2020;39:267.
  10. Liu M, Quek LE, Sultani G, Turner N. Epithelial-mesenchymal transition induction is associated with augmented glucose uptake and lactate production in pancreatic ductal adenocarcinoma. Cancer Metab. 2016;4:19.
  11. Lin J, Liu G, Chen L, Kwok HF, Lin Y. Targeting lactate-related cell cycle activities for cancer therapy. Semin Cancer Biol. 2022;86:1231-43.
  12. Bannister AJ, Kouzarides T. Regulation of chromatin by histone modifications. Cell Res. 2011;21:381-95.
  13. Zhang D, Tang Z, Huang H, Zhou G, Cui C, Weng Y, et al. Metabolic regulation of gene expression by histone lactylation. Nature. 2019;574:575-80.
  14. Dai X, Lv X, Thompson EW, Ostrikov KK. Histone lactylation: epigenetic mark of glycolytic switch. Trends Genet. 2022;38:124-7.
  15. Liberti MV, Locasale JW. Histone lactylation: a new role for glucose metabolism. Trends Biochem Sci. 2020;45:179-82.
  16. Itoh Y, Esaki T, Shimoji K, Cook M, Law MJ, Kaufman E, et al. Dichloroacetate effects on glucose and lactate oxidation by neurons and astroglia in vitro and on glucose utilization by brain in vivo. Proc Natl Acad Sci U SA. 2003;100:4879-84.
  17. Zhao Z, Han F, Yang S, Wu J, Zhan W. Oxamate-mediated inhibition of lactate dehydrogenase induces protective autophagy in gastric cancer cells: involvement of the Akt-mTOR signaling pathway. Cancer Lett. 2015;358:17-26.
  18. Zhang D, Li J, Wang F, Hu J, Wang S, Sun Y. 2-Deoxy-D-glucose targeting of glucose metabolism in cancer cells as a potential therapy. Cancer Lett. 2014;355:176-83.
  19. Xie B, Lin J, Chen X, Zhou X, Zhang Y, Fan M, et al. CircXRN2 suppresses tumor progression driven by histone lactylation through activating the Hippo pathway in human bladder cancer. Mol Cancer. 2023;22:151.
  20. Yu J, Chai P, Xie M, Ge S, Ruan J, Fan X, et al. Histone lactylation drives oncogenesis by facilitating m(6)a reader protein YTHDF2 expression in ocular melanoma. Genome Biol. 2021;22:85.
  21. Dominguez-Brauer C, Thu KL, Mason JM, Blaser H, Bray MR, Mak TW. Targeting mitosis in cancer: emerging strategies. Mol Cell. 2015;60:524-36.
  22. Kaistha BP, Honstein T, Müller V, Bielak S, Sauer M, Kreider R, et al. Key role of dual specificity kinase TTK in proliferation and survival of pancreatic cancer cells. Br J Cancer. 2014;111:1780-7.
  23. Grützmann R, Pilarsky C, Ammerpohl O, Lüttges J, Böhme A, Sipos B, et al. Gene expression profiling of microdissected pancreatic ductal carcinomas using high-density DNA microarrays. Neoplasia. 2004;6:611-22.
  24. Zhou X, Yuan Y, Kuang H, Tang B, Zhang H, Zhang M. BUB1B (BUB1 mitotic checkpoint serine/threonine kinase ) promotes lung adenocarcinoma by interacting with zinc finger protein ZNF143 and regulating glycolysis. Bioengineered. 2022;13:2471-85.
  25. Comandatore A, Franczak M, Smolenski RT, Morelli L, Peters GJ, Giovannetti E. Lactate dehydrogenase and its clinical significance in pancreatic and thoracic cancers. Semin Cancer Bio. 2022;86:93-100.
  26. Musacchio A. The molecular biology of spindle assembly checkpoint signaling dynamics. Curr Biol. 2015;25:R1002-18.
  27. Pavlova NN, Zhu J, Thompson CB. The hallmarks of cancer metabolism: still emerging. Cell Metab. 2022;34:355-77.
  28. Koppenol WH, Bounds PL, Dang CV. Otto Warburg’s contributions to current concepts of cancer metabolism. Nat Rev Cancer. 2011;11:325-37.
  29. Jiang SH, Li J, Dong FY, Yang JY, Liu DJ, Yang XM et al. Increased serotonin signaling contributes to the Warburg effect in pancreatic tumor cells under metabolic stress and promotes growth of pancreatic tumors in mice. Gastroenterology. 2017;153:277-91.e19.
  30. Faubert B, Li KY, Cai L, Hensley CT, Kim J, Zacharias LG et al. Lactate metabolism in human lung tumors. Cell. 2017;171:358-71.e9.
  31. Zhang N, Zhang Y, Xu J, Wang P, Wu B, Lu S, et al. Alpha-myosin heavy chain lactylation maintains sarcomeric structure and function and alleviates the development of heart failure. Cell Res. 2023;33:679-98.
  32. Yang K, Fan M, Wang X, Xu J, Wang Y, Tu F, et al. Lactate promotes macrophage HMGB1 lactylation, acetylation, and exosomal release in polymicrobial sepsis. Cell Death Differ. 2022;29:133-46.
  33. Wang N, Wang W, Wang X, Mang G, Chen J, Yan X, et al. Histone lactylation boosts reparative gene activation post-myocardial infarction. Circul Res. 2022;131:893-908.
  34. Compton SE, Kitchen-Goosen SM, DeCamp LM, Lau KH, Mabvakure B, Vos M et al. LKB1 controls inflammatory potential through CRTC2-dependent histone acetylation. Mol Cell. 2023;83:1872-86.e5.
  35. Zhao Y, Li S, Chen Y, Wang Y, Wei Y, Zhou T, et al. Histone phosphorylation integrates the hepatic glucagon-PKA-CREB gluconeogenesis program in response to fasting. Mol Cell. 2023;83:1093-108.e8.
  36. Moreno-Yruela C, Zhang D, Wei W, Baek M, Liu W, Gao J, et al. Class I histone deacetylases (HDAC1-3) are histone lysine delactylases. Sci Adv. 2022;8:eabi6696.
  37. Mao Y, Zhang J, Zhou Q, He X, Zheng Z, Wei Y, et al. Hypoxia induces mitochondrial protein lactylation to limit oxidative phosphorylation. Cell Res. 2024;34:13-30.
  38. Daemen A, Peterson D, Sahu N, McCord R, Du XN, Liu BN, et al. Metabolite profiling stratifies pancreatic ductal adenocarcinomas into subtypes with distinct sensitivities to metabolic inhibitors. Proc Natl Acad Sci USA. 2015;112:E4410-7.
  39. Chen Q, Yang B, Liu X, Zhang XD, Zhang L, Liu T. Histone acetyltransferases CBP/p300 in tumorigenesis and CBP/p300 inhibitors as promising novel anticancer agents. Theranostics. 2022;12:4935-48.
  40. Huang H, Zhang D, Weng Y, Delaney K, Tang Z, Yan C et al. The regulatory enzymes and protein substrates for the lysine beta-hydroxybutyrylation pathway. Sci Adv. 2021;7:eabe2771.
  41. Sabari BR, Tang Z, Huang H, Yong-Gonzalez V, Molina H, Kong HE, et al. Intracellular crotonyl-CoA stimulates transcription through p300-catalyzed histone crotonylation. Mol Cell. 2015;58:203-15.
  42. Yang Z, Yan C, Ma J, Peng P, Ren X, Cai S, et al. Lactylome analysis suggests lactylation-dependent mechanisms of metabolic adaptation in hepatocellular carcinoma. Nat Metab. 2023;5:61-79.
  43. Dong S, Huang F, Zhang H, Chen Q. Overexpression of BUB1B, CCNA2, CDC20, and CDK1 in tumor tissues predicts poor survival in pancreatic ductal adenocarcinoma. Biosci Rep. 2019;39:BSR20182306.
  44. Sun L, Zhang H, Gao P. Metabolic reprogramming and epigenetic modifications on the path to cancer. Protein Cell. 2022;13:877-919.
  45. Yang J, Luo L, Zhao C, Li X, Wang Z, Zeng Z, et al. A positive feedback loop between inactive VHL-triggered histone lactylation and PDGFRbeta signaling drives clear cell renal cell carcinoma progression. Int J Biol Sci. 2022;18:3470-83.
  46. Pan RY, He L, Zhang J, Liu X, Liao Y, Gao J, et al. Positive feedback regulation of microglial glucose metabolism by histone H 4 lysine 12 lactylation in Alzheimer’s disease. Cell Metab. 2022;34:634-48.e6.
  47. Kes MMG, Van den Bossche J, Griffioen AW, Huijbers EJM. Oncometabolites lactate and succinate drive pro-angiogenic macrophage response in tumors. Biochim Biophys Acta Rev Cancer. 2020;1874:188427.
  48. Xue W, Li X, Li W, Wang Y, Jiang C, Zhou L, et al. Intracellular CYTL1, a novel tumor suppressor, stabilizes NDUFV1 to inhibit metabolic reprogramming in breast cancer. Signal Transduct Target Ther. 2022;7:35.
  49. Li J, Zhang Q, Guan Y, Liao D, Jiang D, Xiong H, et al. Circular RNA circVAMP3 promotes aerobic glycolysis and proliferation by regulating LDHA in renal cell carcinoma. Cell Death Dis. 2022;13:443.
  50. Li S, Gao J, Zhuang X, Zhao C, Hou X, Xing X, et al. Cyclin G2 inhibits the Warburg effect and tumour progression by suppressing LDHA phosphorylation in glioma. Int J Biol Sci. 2019;15:544-55.

ملاحظة الناشر

تظل Springer Nature محايدة فيما يتعلق بالمطالبات القضائية في الخرائط المنشورة والانتماءات المؤسسية.
  1. ساهم في العمل كل من في لي، وينزهي سي ولي شيا بالتساوي.
    *المراسلة:
    تيانبي هونغ
    tpho66@bjmu.edu.cn
    روي وي
    weirui@bjmu.edu.cn
    قائمة كاملة بمعلومات المؤلفين متاحة في نهاية المقال

Journal: Molecular Cancer, Volume: 23, Issue: 1
DOI: https://doi.org/10.1186/s12943-024-02008-9
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38711083
Publication Date: 2024-05-06

Positive feedback regulation between glycolysis and histone lactylation drives oncogenesis in pancreatic ductal adenocarcinoma

Fei , Wenzhe Si , , Deshan Yin , Tianjiao Wei , Ming Tao , Xiaona Cui , Jin Yang , Tianpei Hong and Rui Wei

Abstract

Background Metabolic reprogramming and epigenetic alterations contribute to the aggressiveness of pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC). Lactate-dependent histone modification is a new type of histone mark, which links glycolysis metabolite to the epigenetic process of lactylation. However, the role of histone lactylation in PDAC remains unclear. Methods The level of histone lactylation in PDAC was identified by western blot and immunohistochemistry, and its relationship with the overall survival was evaluated using a Kaplan-Meier survival plot. The participation of histone lactylation in the growth and progression of PDAC was confirmed through inhibition of histone lactylation by glycolysis inhibitors or lactate dehydrogenase A (LDHA) knockdown both in vitro and in vivo. The potential writers and erasers of histone lactylation in PDAC were identified by western blot and functional experiments. The potential target genes of H3K18 lactylation (H3K18la) were screened by CUT&Tag and RNA-seq analyses. The candidate target genes TTK protein kinase (TTK) and BUB1 mitotic checkpoint serine/threonine kinase B (BUB1B) were validated through ChIP-qPCR, RT-qPCR and western blot analyses. Next, the effects of these two genes in PDAC were confirmed by knockdown or overexpression. The interaction between TTK and LDHA was identified by Co-IP assay. Results Histone lactylation, especially H3K18la level was elevated in PDAC, and the high level of H3K18la was associated with poor prognosis. The suppression of glycolytic activity by different kinds of inhibitors or LDHA knockdown contributed to the anti-tumor effects of PDAC in vitro and in vivo. E1A binding protein p300 (P300) and histone deacetylase 2 were the potential writer and eraser of histone lactylation in PDAC cells, respectively. H3K18la was enriched at the promoters and activated the transcription of mitotic checkpoint regulators TTK and BUB1B. Interestingly, TTK and BUB1B could elevate the expression of P300 which in turn increased glycolysis. Moreover, TTK

Abstract

phosphorylated LDHA at tyrosine 239 (Y239) and activated LDHA, and subsequently upregulated lactate and H3K18la levels. Conclusions The glycolysis-H3K18la-TTK/BUB1B positive feedback loop exacerbates dysfunction in PDAC. These findings delivered a new exploration and significant inter-relationship between lactate metabolic reprogramming and epigenetic regulation, which might pave the way toward novel lactylation treatment strategies in PDAC therapy.

Keywords Glycolysis, Histone lactylation, H3K18la, Pancreatic ductal adenocarcinoma

Introduction

Pancreatic cancer, of which over is pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC), is a highly aggressive tumor of the digestive system and the most lethal human malignancy, with a poor overall 5 -year survival rate [1]. Despite attempts to improve its treatment over the past decade, the mortality rates for PDAC have not considerably declined. Therefore, it is imperative for a clearer understanding of PDAC growth and metastasis mechanisms, to find potential therapeutic targets and novel biomarkers to predict PDAC prognosis [2, 3].
Besides mutations in PDAC driver genes such as oncogenic KRAS, tumor suppressor genes SMAD4 and TP53 [4], numerous studies have shown that the aggressive tumor biology of PDAC is closely related to metabolites and epigenetic rewiring [5, 6]. PDAC cells utilize “metabolic reprogramming” to support malignant behaviors such as rapid proliferation, invasion and several cellular processes [7]. Metabolites are intermediate products of cellular metabolism which are catalyzed by various enzymes, via corresponding post-translational modifications of proteins. More and more metabolites have been reported to be involved in the regulation of diverse signaling pathways in tumorigenesis [8]. Among these, lactate, an abundant oncometabolite, is an end product of glycolysis and fuels into the tricarboxylic acid cycle during the Warburg effect (aerobic glycolysis) [9, 10]. Enhanced glycolysis and accumulation of lactate are common features in various types of cancer [11]. However, how metabolic reprogramming reshapes epigenetic alterations, in particular lactylation in PDAC, is still unclear.
Histones are involved in regulating various physiological functions, and post-translational modifications of histones (such as acetylation, succinylation) play important roles in the development of diseases [12]. Lactate-derived lactylation on core histones has been confirmed by several groups as a new type of histone mark [13, 14]. Till now, 28 histone lactylation sites have been identified, including histone H3 lysine 4 and histone H3 lysine 18 (H3K18) et al. Histones exert biological effects by affecting the expression and activation of the downstream genes. Lactylation of histones preferentially affects enzymes participating in essential metabolic pathways such as carbohydrate, amino acid, lipid, and nucleotide
metabolism [15]. However, strategies involving histone lactylation treatment to overcome and shift molecular landscape of PDAC have not been achieved. Thus, a better understanding of histone lactylation in the pathology of PDAC still requires further investigation.
Our study aims to investigate the role of histone lactylation, specifically H3K18la, in PDAC progression and to clarify the potential mechanism. Our results demonstrated that lactate accumulation in the PDAC tumor microenvironment drove histone lactylation, both in vivo and in vitro, correlating strongly with tumorigenesis and poor clinical outcomes. Mechanistically, enhanced glycolysis in PDAC led to increased lactate production and H3K18la, which promoted the transcription of TTK protein kinase ( ) and BUB1 mitotic checkpoint serine/ threonine kinase B (BUB1B). Notably, TTK and BUB1B upregulated P300 (the writer of histone lactylation); TTK activated lactate dehydrogenase A (LDHA), upregulated lactate production and promoted histone lactylation, thus forming a feedback loop of glycosis-H3K18la-TTK/ BUB1B. Our findings, as a proof of principle, for the first time, uncover a novel role of histone lactylation especially H3K18la in PDAC, while disruption of the glycoly-sis-H3K18la-TTK/BUB1B positive feedback loop may be a potential therapeutic approach for the supplementary treatment of PDAC.

Materials and methods

Human samples

The pancreatic samples of PDAC and paired para-carcinoma controls were archived in the Department of General Surgery at Peking University Third Hospital. All tissues were immediately frozen in liquid nitrogen and stored at for lactate level and lactylation detection. The serum samples of PDAC and healthy controls were collected from the Department of Laboratory Medicine at Peking University Third Hospital for non-targeted metabolomics assay. All participants in this study provided written informed consent and the study was approved by the Clinical Research Ethics Committee of Peking University Third Hospital. One tissue microarray (TMA, Cat. HPanA180Su03) containing tumor and the paired para-carcinoma tissues from 90 PDAC patients was obtained from Outdo Biotech Co., Ltd (Shanghai,
China), and ethical approval was granted by the Clinical Research Ethics Committee, Outdo Biotech Co., Ltd.

Non-targeted metabolomics assay

The non-targeted metabolomics assay experiments were performed by APExBIO Technology, Llc (Shanghai, China). In a 1.5 mL centrifuge tube, of the serum was combined with of methanol solution containing the internal standard L-2-chlorophenylalanine mL . A quanlity control sample was prepared by extracting of the supernatant from each sample, followed by thorough mixing and vortexing. Liquid chromato-graph-mass spectrometer analysis was performed using an Agilent 1290 Infinity IIUHPLC system coupled to an Agilent 6545 UHD and Accurate-Mass Q-TOF/MS. The chromatographic column utilized was Waters XSelectHSS T3. Mass spectrometry was conducted in both positive and negative ion modes with the following optimized parameters: Capillary voltage was set at 4.5 kV in positive mode and 3.5 kV in negative mode. The drying gas flow was in positive mode and in negative mode, with a gas temperature of . Nebulizer pressure was set to 20 psig . The screening criteria for differential metabolites were variable importance in projection VIP Fold Change .

Cell culture and treatment

Human pancreatic ductal epithelial cell line hTERTHPNE and four PDAC cell lines (MIA PaCa-2, PANC-1, AsPC-1 and PL45) were used in this study. hTERT-HPNE cells were obtained from Meisen Cell Technology Co., Ltd (Zhejiang, China). MIA PaCa-2 cells were obtained from the Chinese Academy of Sciences Cell Bank (Shanghai, China). PANC-1 and AsPC-1 cells were obtained from the Cell Resource Center, Peking Union Medical College (Beijing, China). PL45 cells were obtained from iCell Bioscience Inc. (Shanghai, China). The cells were cultured in Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) or Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium supplemented with ( ) fetal bovine serum, ( vol) penicillin-streptomycin, (vol/vol) GlutaMAX (all from Gibco, Grand Island, NY, USA). The cells were grown in a humidified atmosphere containing at . hTERT-HPNE and four PDAC cell lines were employed to investigate lactate production, histone lactylation, and the expression of TTK and BUB1B.
Subsequent experiments were conducted using MIA PaCa-2 and AsPC-1 cells, which underwent the following interventions: (1) Cells were treated with several glycolysis inhibitors: sodium dichloroacetate (DCA: ), which can inhibit pyruvate dehydrogenase kinase [16]; Oxamate ( ), an inhibitor of LDHA [17]; 2-deoxy-D-glucose (2-DG, ), serving as a mimic of D-glucose, disrupting D-glucose
metabolism by inhibiting hexokinase and glucose-6-phosphate isomerase [18] or the vehicle control (phosphate buffer saline, PBS). (2) Cells were transfected with LDHA siRNA or scramble siRNA as negative control, combined with sodium lactate (NaLa, ). (3) Cells were treated with P300 inhibitor C646 ( ) combined with NaLa ( ). (4) Cells were transfected with P300 siRNA or scramble siRNA as negative control, combined with NaLa ( ). (5) Cells were treated with various histone deacetylase (HDAC) inhibitors, including broad-spectrum HDAC inhibitors (Trichostatin A, TSA, ), sirtuin inhibitor (Nicotinamide, NAM, ), class I HDAC inhibitor (Tacedinaline, CI994, ), IIa HDAC inhibitor (TMP195, ), class IIb HDAC inhibitor (Bufexamac, ), and class IV HDAC inhibitor (SIS17, ). (6) Cells were transfected with HDAC1, 2, 3 overexpression plasmids or negative control plasmids. (7) Cells were transfected with siRNA, BUB1B siRNA or scramble siRNA as negative control. (8) Cells were transfected with overexpression plasmid or negative control plasmid.
After treatment, the proteins were collected for histone lactylation detection by western blot or for LDHA activity assay. Supernatant was collected for lactate level detection. Cell proliferation was monitored by using IncuCyte S3 during the 72-h intervention or detected by colony formation assays after 1-2 weeks treatment. Cell migration was monitored by using wound healing during the 48-h intervention or detected by transwell assays after 48-h treatment. The interaction between H3K18la with or was determined by chromatin immuno-precipitation-quantitative real-time PCR (ChIP-qPCR). The mRNA and protein levels were detected by reverse transcription quantitative real-time PCR (RT-qPCR) and western blot. The interaction between TTK and LDHA was assessed by co-immunoprecipitation (Co-IP) assays.

RNA interference and overexpression

SiRNA was dissolved to a working concentration of 50 nmol/L. MIA PaCa-2 and AsPC-1 cells underwent RNA interference using Lipofectamine ™ RNAi MAX (Invitrogen, CA, USA) following the manufacturer’s instructions, and cells were harvested at 48 h after transfection. The sequences of siRNA are listed in Supplementary Table S1.
Plasmids were prepared from GeneChem (Shanghai, China). MIA PaCa-2 and AsPC-1 cells were transfected with plasmids with Lipofectamine (Invitrogen) for 48 h to fulfill overexpression of the specific genes.

Lentivirus transfection

To realize the stable expression of knockdown and overexpression, recombinant lentiviruses
expressing sh-LDHA and oe-TTK were prepared by Hanbio Tech (Shanghai, China). MIA PaCa-2 cells at a confluence of were transfection with lentivirus [10 multiplicities of infection (MOI), MOI=virus titer (TU/ virus volume ( mL ) /cell number] for 24 h , and screened with puromycin (MedChemExpress, Shanghai, China) for one week and maintained in mL puromycin. After confirmation of expression with RT-qPCR and western blot, the sh-LDHA and oe-TTK stable cell lines were used for subsequent experiments. The sequences of sh-LDHA are listed in Supplementary Table S1.

Cell proliferation assay

MIA PaCa-2 and AsPC-1 cells were seeded in 96-well plates at a density of 5000 cells per well and maintained for 72 h . Cell proliferation was monitored using a longterm process live cell analysis system IncuCyte S3 (Sartorius, Göttingen, Germany). Proliferation was assessed by confluence measurements and normalized to 0 h calculated by IncuCyte S3 software. Cell images were captured at intervals from four separate regions per well. There were repetitions in each experiment.

Colony formation assay

MIA PaCa-2 and AsPC-1 cells were seeded into 6-well plates at a concentration of 1000 cells per well. The medium was refreshed every 3 days during colony growth, and cells were cultured for days based on the characteristics of each cell line. Subsequently, the cells were fixed with paraformaldehyde (Leagene, Beijing, China) for 20 min and stained with crystal violet (Beyotime Biotechnology) for 15 min at room temperature. The resulting colonies were then photographed and counted.

Wound healing assay

MIA PaCa-2 and AsPC-1 cells were seeded in 96-well plates and grown to confluence, scratching wounds were generated by the IncuCyte Wound Marker tool. The shedding of the cell mass was washed off with PBS. After changing the serum-free medium, the culture was maintained for 48 h . Photographs were captured at intervals of 3-h in the IncuCyte S3 platform. The wound areas were quantified using IncuCyte S3 image analysis software.
Sometimes, cells were seeded in 6 -well plates and grown to confluence, scratching wounds were generated using a sterile pipette tip. The shedding of the cell mass was washed off with PBS. After changing the serum-free medium, the culture was maintained for 48 h . Photographs were captured at 0,24 and 48 h after wound generation using a computer-assisted microscope (Leica Microsystems, Wetzlar, Germany). Subsequently,
the wound areas were quantified using Image J software (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA).

Transwell migration assay

The migration abilities of the MIA PaCa-2 and AsPC-1 cells were evaluated using a chamber of transwell inserts (Corning Life Science, NY, USA). Cells were plated in the upper transwell chamber in medium without fetal bovine serum, while the lower chamber was filled with medium containing fetal bovine serum as the attractant. After the incubation, the migrated cells were fixed with paraformaldehyde and stained with crystal violet. The stained cells were photographed, and the number of migrated cells was quantified using Image J software.

Transplanted tumor model in nude mice

Female nude mice, aged weeks and weighing , were randomly assigned to different experimental groups. (1) A total of MIA PaCa-2 cells were injected into each mouse subcutaneously. When the average tumor volume reached approximately 70 , the mice were randomly assigned to the Oxamate group ( ) and control group ( ), and the tumor volumes were measured. Oxamate ( , daily) or vehicle (PBS) was administered by intraperitoneal injection for 30 days. (2) The stable sh-LDHA or negative control (sh-NC) MIA PaCa- 2 cells ( cells per mouse) were injected into mice subcutaneously, with 7 mice in each group. When the tumor volume in the sh-NC group reached approximately , the tumor volumes were measured every other day for 26 days. The tumor volumes were estimated using the following formula: volume length width . Mice were sacrificed and the tumors were photographed and weighed. The lactate content in the tumors was detected. The H3K18la level was detected by western blot and immunohistochemistry (IHC). Cell proliferation was determined by IHC for Ki-67 staining. Liver hematoxylin and eosin (HE) staining was performed to evaluate the tumor metastasis. All animal experiments were conducted at Peking University Health Science Center and approved by Peking University Animal Care and Use Committee.

IHC

The tissues from patients and nude mice were fixed with ( ) neutral-buffered formalin overnight and embedded in paraffin, and -thick sections were prepared. Tissue sections were deparaffinized, followed by rehydrated in xylene and graded concentrations of ethanol. Quenching of endogenous peroxidase activity was achieved using hydrogen peroxide, while antigen retrieval was performed with an EDTA buffer. Then,
sections were incubated overnight at in a humid chamber with the indicated primary antibodies. The 3, 3′-diaminobenzidine (ZSGB-BIO, Beijing, China) detection system was employed to visualize the staining after 1-h incubation with secondary antibodies at room temperature. The antibodies used in this study are listed in Supplementary Table S2.
For the tissue microarray, IHC scores for H3K18la expression were obtained by multiplying the staining intensity with the percentage of positive cells. For other IHC staining, the mean optical density was employed to calculate the relative expression of H3K18la, Ki-67, TTK and BUB1B using Image J software.

RNA extraction and RT-qPCR

Total RNA was extracted using Trizol (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA) and reversely transcribed to cDNA with a RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher Scientific). The cDNA was subjected to real-time qPCR analysis with the Thunderbird SYBR qPCR Mix (TOYOBO Co., Ltd, Osaka, Japan) on a QuantStudio5 Real-Time PCR System (Thermo Fisher Scientific). The primer sequences synthesized by the Beijing Tsingke Biotech Co., Ltd. (Beijing, China) are summarized in Supplementary Table S3. Relative gene expression was normalized to and calculated with the method.

Protein extraction and western blot

The cells or tissues were lysed using RIPA lysis buffer (Beyotime Biotechnology, Shanghai, China), which contained protease inhibitor and phosphatase inhibitor (Applygen Technologies, Beijing, China). Total protein content was quantified using the bicinchoninic acid (BCA) assay (Thermo Fisher Scientific). The denatured proteins were separated by SDS-PAGE and transferred onto a nitrocellulose membrane (Millipore, Saint Charles, MO, USA). After blocking with bovine serum albumin for 1 h at room temperature, the membranes were then incubated with primary antibodies overnight at , followed by three washes, and subsequent incubation with secondary antibodies for 1 h at room temperature. Protein bands were visualized using the Odyssey 290 infrared imaging system (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE, USA). The intensity of each band was analyzed using Image J software. Relative protein level was normalized to -actin. The antibodies used in this experiment are listed in Supplementary Table S2.

Lactate content and LDH enzyme activity measurement

The supernatant of homogenized tumor tissue or the supernatant of cell culture was collected after centrifugation for 10 min . The production of lactate was measured according to the instructions of the lactic acid
assay kit (Solarbio, Beijing, China). The absorbance values at 570 nm were measured using a spectrophotometer. The content of lactate was normalized based on the cell number.
LDH enzyme activity was measured by a lactate dehydrogenase assay kit (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, China) as the manufacturer’s instructions. Briefly, cells were harvested, subjected to ultrasonication, and subsequently centrifuged at 4000 rpm for 10 min . The resulting supernatant was then collected for subsequent measurements. Absorbance at 450 nm was measured using a spectrophotometer, and the obtained results were normalized based on the total protein content.

Co-IP

MIA PaCa-2 and AsPC-1 cells were collected and lysed in IP lysis buffer in the presence of protease inhibitors for 40 min , and centrifuged at for 10 min . Lysates were divided into input, IgG and LDHA groups. The lysates were incubated with LDHA antibody or IgG at overnight. Protein A/G magnetic beads (Beyotime) were added to lysates and incubated for 4 h at . Following three washes with IP lysis buffer, the coprecipitated proteins were obtained and subjected to analysis through western blot.

CUT&Tag assay

The CUT&Tag experiment was performed by Wuhan Frasergen Bioinformatics Co., Ltd (Wuhan, China). Briefly, cells were harvested and washed. Concanavalin A-coated magnetic beads were added and incubated for 10 min . Cells bound to the beads were then resuspended in dig-wash buffer with the H3K18la antibody for 2 h . Then cells were washed twice using the magnet stand with dig-wash buffer, and incubated with at room temperature for 1 h . After two washes, cells were resuspended in tagmentation buffer and incubated at for 1 h . To halt tagmentation, Proteinase K, SDS and EDTA were introduced to the sample. This mixture was then incubated at for 1 h , followed by purification using phenol-chlo-roform-isoamyl alcohol, ethanol precipitation, washing with ethanol, and final suspension in water. DNA was amplified through PCR, and purified. The libraries were then sequenced on the Illumina Nova-seq platform. DiffBind was employed to detect differential peaks (DP) from peak sets. Peaks with Fold Change and false discovery rate (FDR) < 0.05 were defined as the statistically significant DP. The DP signal of samples was clustered for analysis. Subsequently, ChIPseeker was utilized to annotate the DP to the promoter region and to find the genes related with DP. Furthermore, the loss of DP in promoter region-associated genes were used to
perform Gene Ontology (GO) and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) analyses.

RNA-seq

The RNA-seq experiment was performed by Wuhan Frasergen Bioinformatics Co., Ltd. Total RNA extraction was carried out using Trizol (Invitrogen). RNA purity and integrity were assessed using a NanoDrop 2000 spectrophotometer (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, USA). 1.5% Agarose gel was used to assess the RNA contamination. Oligo (dT)-attached magnetic beads were employed to purify mRNA. The purified mRNA was subsequently fragmented into small pieces using a fragment buffer. First-strand cDNA was synthesized through random hexamer-primed reverse transcription, followed by a second-strand cDNA synthesis, and purified using AMPure XP Beads. Following that, RNA Index Adapters and A-Tailing Mix were added through an incubation process to complete cDNA repair. The cDNA fragments underwent PCR amplification, and the resulting products were purified to obtain the final library. Once the library was tested and deemed of sufficient quality, DNA Nano Ball was prepared and subsequently loaded onto the sequencing chip. The sequencing process was then carried out using the MGI high-throughput sequencer. The screening criteria for identifying differential expressed genes included Fold Change . Subsequently, the downregulated genes were subjected to GO and KEGG analyses.

ChIP assay and ChIP-qPCR

MIA PaCa-2 cells were harvested and fixed using formaldehyde in PBS for 10 min . Then, glycine was added to stop the crosslinking process. Following the washing step, the fixed cells were resuspended in lysis buffer ( Tris EDTA, protease inhibitors) for 1 h . To produce chromatin fragments approximately 300 bp in length, cells were subjected to sonication and centrifuge at for 10 min . The lysates were diluted in a buffer containing Triton-X-100, Tris-HCl ( pH 8.1 ), 150 EDTA and protease inhibitors. Rabbit anti-IgG ( ) or rabbit anti-H3K18la ( ) was introduced into the diluted chromatin and left overnight at with constant rotation. The following day, of Dynabeads ™ protein G (Invitrogen) were added, and incubated for 4 h at . Following washing steps, input and the pulled-down chromatin complex were decrosslinked at for 12 h . The DNA obtained from the pull-down was then purified using the MinElute PCR purification kit (Qiagen, Hilden, Germany). ChIP-qPCR was performed using PerfectStart Green qPCR SuperMix (TransGen Biotech, Beijing, China) on a QuantStudio5
Real-Time PCR System. The primer sequences for ChIPqPCR are listed in Supplementary Table S4.

Statistical analysis

GEPIA and GEO database were utilized to analyze the expression levels of TTK and BUB1B in PDAC patients and healthy controls. GEPIA and Kaplan-Meier plotter database were used to assess the relationship between TTK/BUB1B expression and survival outcomes in PDAC patients. Data are expressed as the mean or median with interquartile range. Normality was checked by using Shapiro-Wilk test. If data were normally distributed, the differences between two groups were performed by Student’s -test (two-tailed); the differences among multiple groups were performed by ANOVA, followed by post hoc Tukey’s multiple comparisons test, Dunnett’s multiple comparisons test, as appropriate. If data were not normally distributed, the differences between two groups were performed by Mann-Whitney test; the differences among multiple groups were performed by KruskalWallis test followed by Dunn’s multiple comparisons test between groups. was considered as statistically significant. Statistical analysis was conducted with GraphPad Prism 8.0 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA ).

Results

Elevated histone lactylation levels are associated with unfavorable prognosis in patients with PDAC

In pancreatic tissues from PDAC patients, the lactate content was higher than that in the normal adjacent tissues (Fig. 1A). Similarly, lactate production in PDAC cell lines such as MIA PaCa-2, PANC-1, AsPC-1 and PL45 was also higher than that in the human pancreatic ductal epithelial cell line hTERT-HPNE (Fig. 1B). Alterations of metabolites were analyzed using non-targeted metabolomics in serum samples from PDAC patients and healthy groups (the original data is in Additional file 2). Results showed that 222 metabolites differed significantly between the tumor and healthy groups, with 100 lower and 122 higher in the tumor groups, Fig. 1C). KEGG analysis of the different serum metabolites revealed enrichment in the central carbon metabolism (Fig. 1D). Especially, to our attention, lactate was also one of the metabolites.
Since the production of large amounts of lactate supplied as substrates for histone lactylation, we examined the protein lactylation levels in 5 pairs PDAC tissues and surrounding noncancerous tissues. Higher levels of global/pan-lysine lactylation (Pan Kla) were observed in PDAC tissues (Fig. 1E). As histone modifications play fundamental roles in most biological processes and H3K18la has been reported to regulate multiple biological processes such as oncogenesis [12,19], we focused on
Fig. 1 (See legend on next page.)
(See figure on previous page.)

Abstract

Fig. 1 Elevated lactate level and histone lactylation are associated with unfavorable prognosis in patients with PDAC. (A) Lactate content in pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) and paired para-carcinoma tissues. . (B) Lactate content in human pancreatic ductal epithelial cell line hTERT-HPNE and four different PDAC cell lines (MIA PaCa-2, PANC-1, AsPC-1 and PL45). . (C-D) Distinct serum metabolites in PDAC patients and healthy individuals were analyzed by using non-targeted metabolomics. . The volcano plot ( ) and the KEGG analysis ( ) on differential serum metabolites between PDAC patients and healthy individuals. (E) The pan-lysine lactylation (Pan Kla) and H3K18 lactylation (H3K18la) levels in paired PDAC tissue (T) and adjacent normal tissues ( N ) were measured by western blot. . Representative images (left panel) and the quantification (right panel). ( ) The levels of Pan Kla and H3K18la in pancreatic ductal epithelial cell line and PDAC cell lines were assessed using western blot. . Representative images (left panel) and the quantification (right panel). (G-K) The H3K18la level in PDAC and para-carcinoma tissues were visualized by IHC staining in tissue microarray. (G) The representative picture of IHC staining. The visual field in the black square is enlarged below. (H-I) The quantification of IHC staining in para-carcinoma ( ) and PDAC ( ) tissues. ( ) H3K18la levels of AJCC stages T1 to T4 in PDAC patients. There are 5 PDAC patients in T1 stage, 33 in T2 stage, 25 in T3 stage, and 11 in T4 stage. (K) Kaplan-Meier analysis of overall survival in PDAC patients with low ( ) and high H3K18la ( ) levels. Data in Fig. B, E, F are presented as mean SD; data in Fig. A, H and J are presented as median with interquartile range. Statistical analysis was performed by Student’s -test in E , or by one-way ANOVA followed by Dunnett’s multiple comparisons test in B and F, or by Log-rank test in K, or by Mann-Whitney test in A and H , or by Kruskal-Wallis test followed by Dunn’s multiple comparisons in J. ; ns, not significant

its expression and function. Consistently, H3K18la levels were also elevated in the PDAC tissues (Fig. 1E). In addition, the expression of Pan Kla as well as H3K18la was significantly upregulated in four PDAC cell lines compared with the normal pancreatic ductal epithelial cell line (Fig. 1F). Next, we assessed the clinical importance of H3K18la by IHC staining in 74 cases of PDAC tissues and 72 cases of para-carcinoma tissue ( 90 paired tissues excluded the shedding slice, the tissues without pancreatic duct, the para-carcinoma tissue with obvious abnormal morphology). As shown in Fig. 1G and H , the level of H3K18la was significantly upregulated in PDAC compared with the normal tissues. Among PDAC patients, of samples showed high H3K18la level, which were prevalent than the normal groups (Fig. 1I). The increased H3K18la levels were positively correlated with more advanced AJCC stages (Fig. 1J). To further identify the prognostic value of H3K18la, the overall survival was evaluated using a Kaplan-Meier survival plot based on H3K18la level, and H3K18la was potentially associated with prognosis as determined by a Log-rank test (Fig. 1K).

Glycolysis inhibition diminishes histone lactylation and inhibits PDAC cell proliferation and migration

To clarify the effects of glycolysis on histone lactylation, we used different kinds of glycolysis inhibitors (DCA, Oxamate and 2-DG) and carried on knockdown in MIA PaCa-2 and AsPC-1 cells respectively. The levels of Pan Kla and H3K18la consistently reduced with increasing dosages of inhibitors (Fig. 2A and B). Furthermore, si-LDHA effectively reduced the histone lactylation level, which was significantly increased after Nala treatment (Fig. 2C and D).
Subsequently, we investigated the biological functions of histone lactylation on cell proliferation. We observed a significant decrease in cell viability and colony formation ability upon treatment with DCA, Oxamate, or 2-DG (Fig. 3A-F). Moreover, LDHA silencing exhibited significant inhibition of cell growth and colony formation in both MIA PaCa-2 and AsPC-1 cells, while Nala
attenuated the proliferation inhibition effect of silencing (Fig. 3G-L).
To explore whether lactylation could affect PDAC cell migration, wound healing and transwell assays were performed. Treatments with DCA, Oxamate and 2-DG significantly decreased cell migration in MIA PaCa-2 and AsPC-1 cells, and the higher dose showed more pronounced inhibition effects on the cell migration than the lower dose in the wound healing assay (Fig. 4A-D). Similarly, LDHA knockdown inhibited migration capacities compared to the vector group, and Nala addition attenuated the suppressive effect of si-LDHA (Fig. 4I-L). Transwell assays also showed that DCA, Oxamate and 2-DG treated MIA PaCa-2 or AsPC-1 cells significantly decreased cell migration (Fig. 4E-H). The same outcomes were observed in LDHA knockdown, and Nala counteracted the migratory suppression effect of si-LDHA in both cell lines (Fig. 4M-P). Collectively, these findings suggest that histone lactylation plays a crucial role in the initiation and progression of PDAC, while inhibiting histone lactylation may exhibit potential antitumor activity against PDAC.

Glycolysis inhibition diminishes histone lactylation and suppresses PDAC progression in the PDAC xenograft mouse model

To further evaluate the biological significance of histone lactylation in PDAC progression, a xenograft mouse model was established by implanting MIA PaCa-2 cells subcutaneously into nude mice. Mice were treated with a glycolysis inhibitor Oxamate or vehicle, and the tumor volume was detected every two days. The tumor volume in the Oxamate group was significantly lower than that in the control group during the whole experiment, and the tumor weight also exhibited a dramatic decline in the Oxamate group compared with the control (Fig. 5A-C). To investigate the impact of knockdown on tumor growth, stable sh-LDHA and the control MIA PaCa-2 cells were subcutaneously injected into nude mice. Similar to the results of glycolysis inhibitor, tumors in the
Fig. 2 Glycolysis inhibition diminishes histone lactylation. Two PDAC cell lines MIA PaCa-2 and AsPC-1 cells were treated with glycolysis inhibitors DCA ( ), Oxamate ( ) or 2 -DG ( ) for 24 h , or transfection with LDHA siRNA (si-LDHA) or negative control siRNA (si-NC) for 48 h with or without sodium lactate (NaLa, ) treatment. (A-D) The pan-lysine lactylation (Pan Kla) and H3K18 lactylation (H3K18la) levels were measured by western blot and quantified by using Image J software. or 6 . All data are presented as mean SD. Statistical analysis was performed by one-way ANOVA followed by Dunnett’s multiple comparisons test in A-B, or by Tukey’s multiple comparisons test in C-D.
Fig. 3 Glycolysis inhibition diminishes histone lactylation and suppresses PDAC cell proliferation. Two PDAC cell lines MIA PaCa-2 and AsPC-1 cells were treated with glycolysis inhibitors DCA ( ), Oxamate ( ) or 2 -DG ( ), or transfection with LDHA siRNA (si-LDHA) or negative control siRNA (si-NC) with or without sodium lactate (NaLa, ) treatment. ( ) Cell viability was visualized by IncuCyte S3 in MIA PaCa-2 ( ) and AsPC-1 ( ) cells. or 3 . ( ) Cell proliferation ability was evaluated by colony formation assays in MIA PaCa-2 ( ) and AsPC-1 ( ) cells. . All data are presented as mean SD. Statistical analysis was performed by ANOVA followed by Dunnett’s multiple comparisons test in A, B, E, F, or by Tukey’s multiple comparisons test in G, H, K, L.
LDHA knockdown group displayed smaller size and lower weight compared to the control groups (Fig. 5I-K).
Next, we detected the effects of glycolysis inhibition on the lactate production and lactylation in the xenograft mouse model. Not surprisingly, the lactate production in the tumor was decreased after Oxamate treatment or
LDHA knockdown (Fig. 5D and L). Furthermore, diminished levels of Pan Kla and H3K18la were observed along with reduced H3K18la staining intensity in Oxa-mate-treated tumors (Fig. 5E and F). Similar findings were observed in LDHA inhibition groups: Pan Kla and
Fig. 4 (See legend on next page.)
(See figure on previous page.)

Abstract

Fig. 4 Glycolysis inhibition diminishes histone lactylation and suppresses PDAC cell migration. (A-H) Two PDAC cell lines MIA PaCa-2 and AsPC-1 cells were treated with glycolysis inhibitors DCA ( ), Oxamate ( ) or DG ( ) for 48 h . The migration ability was evaluated by wound healing and transwell assays. . Representative images ( ) and quantification ( ). ( ) MIA PaCa-2 and AsPC-1 cells were transfected with LDHA siRNA (si-LDHA) or negative control siRNA (si-NC) for 48 h with or without sodium lactate ( ) treatment. The migration ability was evaluated by wound healing and transwell assays. or 5 . Representative images ( ) and quantification ( J, L, O, P). All data are presented as mean SD. Statistical analysis was performed by ANOVA followed by Dunnett’s multiple comparisons test in B, D, G, H, or by Tukey’s multiple comparisons test in J, L, O, P.

H3K18la levels were suppressed compared to the control tumor tissues (Fig. 5M and N).
Additionally, a proliferation marker Ki-67 staining and liver HE staining indicated that both Oxamate and shLDHA treatment decreased the Ki-67 expression and reduced metastatic foci in the liver (Fig. 5G-H, O-P). These results suggested that glycolysis inhibition by the inhibitor or LDHA knockdown remarkably decreased tumor proliferation and progression. Altogether, glycolysis inhibition decreases tumor volume and weight, inhibits lactate production and lactylation, and suppresses tumor proliferation and liver metastasis, suggestive of PDAC progression inhibition in the PDAC xenograft mouse model.

P300 and HDAC2 are potential writer and eraser of histone lactylation in PDAC cells respectively

The acetyltransferase P300 has been reported as a potential writer of histone lactylation [20]. However, its involvement in PDAC progression has been rarely studied in depth. To assess the impact of P300 on lactylation, we used P300 knockdown (si-P300) or C646 (a P300 inhibitor) with or without NaLa treatment in MIA PaCa-2 and AsPC-1 cells. Figure 6A and Fig. S1A demonstrated a significant decrease in both Pan Kla and H3K18la levels in the si-P300 or C646 group in MIA PaCa-2 cells respectively. Under the condition of NaLa treatment, si-P300 or C646 still significantly decreased Pan Kla and H3K18la levels (Fig. 6A, S1A). The similar results were also observed in AsPC-1 cells (Fig. 6B, S1B). These results suggest that P300 might be a potential writer of histone lactylation.
Next, we investigated the effects of P300 on cell proliferation and migration. We found that P300 silencing or C646 treatment in MIA PaCa-2 cells resulted in a substantial reduction in cell proliferation by using IncuCyte S3 and colony formation assays (Fig. 6C and D, S1C-D). In the presence of NaLa, cell viability was also inhibited by P300 knockdown or C646 (Fig. 6C and D, S1C-D). The efficacy of P300 knockdown or C646 in suppressing cell proliferation and colony formation was similarly evident in AsPC-1 cells (Fig. 6E and F, S1E-F). Cell migration rate was evaluated by using wound healing and transwell assays. Silencing of P300 or treatment with C646 significantly impaired migration abilities for both MIA PaCa-2 (Fig. 6G and H, S1G-H) and AsPC-1 cells (Fig. 6I and J, S1I-J). Next, we investigated whether P300 knockdown
or C646 treatment could reverse the effect of NaLa on PDAC migration. As expected, cells transfected with si-P300 or treatment with C646 in combination with NaLa exhibited reduced migration ability compared to those solely treated with NaLa in MIA PaCa-2 (Fig. 6G and H, S1G-H) and AsPC-1 cells (Fig. 6I and J, S1I-J). These results suggest that P300, the potential writer of histone lactylation, promotes progression of PDAC.
To identify the potential eraser of histone lactylation in PDAC, various types of histone deacetylase (HDAC) inhibitors were employed in MIA PaCa-2 and AsPC-1 cells. Intriguingly, treatment with broad-spectrum HDAC inhibitors TSA, rather than sirtuin inhibitor NAM, resulted in an increased global level of histone lactylation. Additionally, the class I HDAC inhibitor CI994 enhanced lactylation, while class IIa HDAC inhibitor TMP195, class IIb HDAC inhibitor Bufexamac, and class IV HDAC inhibitor SIS17 had no such effect (Fig. S2A-B). To further validate the role of each HDAC isozyme, overexpression experiments were conducted in MIA PaCa-2 and AsPC-1 cells. Results demonstrated that overexpression of HDAC2 significantly decreased the lactylation level, particularly H3K18la, while HDAC1 and HDAC3 overexpression did not affect the levels of Pan Kla and H3K18la (Fig. S2C-H). These findings suggest that P300 may act as a potential writer while HDAC2 functions as an eraser for histone lactylation in PDAC.

H3K18la activates TTK and BUB1B transcription in PDAC

Next, we tried to determine how H3K18la affect PDAC progression. Histone lactylation, a novel epigenetic modification, has been reported to directly regulate gene transcription from chromatin. Therefore, we performed a CUT&Tag assay using an anti-H3K18la antibody (the original data is in Additional file 3). In the Oxamatetreated group, there was a noticeable reduction in the transcription start site (TSS) region (Fig. 7A and B), with approximately enrichment observed in the promoter regions (Fig. 7C). KEGG analysis of the downregulated peaks in promoter regions specific to Oxamate treatment revealed relevant enrichment in RNA transport pathway, cell cycle, and tumor-related pathways such as MAPK signaling pathway (Fig. 7D).
Additionally, we conducted RNA-seq assay to screen the potential target genes regulated by lactylation (the original data is in Additional file 4). When compared with the control group, Oxamate treatment upregulated
1259 genes and downregulated 303 genes in PDAC cells (Fig. 7E). The KEGG analysis of these downregulated genes also showed enrichment in the cell cycle pathway in Oxamate treatment groups (Fig. 7F). Geno ontology (GO) analysis of both CUT&Tag and RNA-seq analysis also demonstrated enrichment in cell cycle-related processes (Fig. S3A-B).
We searched for genes with high expression in PDAC in GEPIA database and found 8741 genes ( Fold Change , Q value ). By overlapping the gene sets among CUT&Tag, RNA-seq and GEPIA database, we identified 14 differential expressed genes that exhibited significantly reduced mRNA levels and reduced enrichment of the H3K18la signal at the promoter region upon Oxamate treatment but were upregulated in PDAC tissues (Fig. 7G). Given that both the CUT&Tag and RNAseq enriched in the cell cycle pathway, we focused on the genes involved in the cell cycle pathway. The results revealed that 4 genes (CDC6, TTK, BUB1B, PTTG1) were associated with the cell cycle pathway, predominantly involved in the M phase (TTK, BUB1B, PTTG1) (Fig. S3C). Notably, among them, (also known as MPS1) and BUB1B (also known as BUBR1), which are mitotic spindle assembly checkpoint regulators and locate in the upstream of the M phase, are important for accurate chromosome segregation during mitosis [21]. Consequently, we decided to investigate these two genes.
We identified an obvious reduction of peaks at the promoter positions of and in cells treated with Oxamate (Fig. 7H). We used ChIP-qPCR assays to further confirm that H3K18la was enriched at the and promoters, which were reduced by glycolysis inhibitors DCA, Oxamate, or 2-DG (Fig. 7I). Besides, the mRNA and protein levels of TTK and BUB1B were significantly downregulated by different inhibitors of glycolysis in MIA PaCa-2 cells (Fig. 7J and K). These results suggest that the activation of and might be involved in the H3K18la-mediated PDAC promotion.

The high levels of TTK and BUB1B are associated with the malignancy of PDAC

To investigate the effects of TTK and BUB1B in PDAC progression, we first detected their expression in PDAC. The transcription and protein levels of TTK and BUB1B were significantly higher in four PDAC cell lines (MIA PaCa-2, PANC-1, AsPC-1, and PL45 cells) in comparison with hTERT-HPNE cells (Fig. 8A and B). IHC analysis revealed a significant increase in TTK and BUB1B expression in PDAC tissues compared to para-carcinoma tissues (Fig. 8C). GEPIA and GEO database also confirmed that TTK and BUB1B expression were elevated in PDAC tissues compared with normal tissues (Fig. S4AD). Additionally, analysis with GEPIA and Kaplan-Meier Plotter database demonstrated that PDAC patients with
high TTK or BUB1B expression had shorter overall survival time or disease-free survival time than those with lower expression levels (Fig. 8D-G).

TTK and BUB1B deletion suppresses PDAC malignancy while TTK overexpression partially prevents the anticancer effects of lactylation inhibition

To assess the function of TTK and BUB1B in PDAC, we used siRNA transfection to knockdown and expression in MIA PaCa-2 and AsPC-1 cells (Fig. 9A and B, S5A-D). Knockdown of either or resulted in a significant reduction in cell viability for both MIA and AsPC-1 cells compared to the control group (Fig. 9C and D). Wound healing assays (Fig. 9E and F) as well as transwell assays (Fig. 9G and H) indicated that silencing or suppressed cell migration.
To investigate the effect of TTK in H3K18la-mediated PDAC progression, MIA PaCa-2 cells were overexpressed with TTK (Fig. 9I) and treated with glycolysis inhibitors. Compared with negative control, overexpression didn’t promote the ability of proliferation or migration of MIA PaCa-2 cells (Fig. S5E-F). This might be due to the fact that the level of TTK was already extremely high in PDAC [22, 23], and its ability to promote tumor progression was saturated. Similar to the results above mentioned, glycolysis inhibitors Oxamate and 2-DG inhibited cell growth and migration in MIA PaCa-2 cells. Interestingly, overexpression together with glycolysis inhibitors compromised the anticancer effects of glycolysis inhibitors on cell growth inhibition and migration suppression (Fig. 9J-L). These results suggest that TTK and BUB1B are involved in the PDAC progression, and TTK participates in the H3K18la-mediated PDAC malignancy.

A positive feedback loop between H3K18la target genes and glycolysis

It has been reported that the expression of BUB1B was positively related to the cell cycle and glycolysis in lung adenocarcinoma. BUB1B knockdown could decrease the glycolysis-related genes, including solute carrier family 2 number 1, , pyruvate kinase M 2, and hexokinase 2, suggesting that BUB1B acts as an activator in glycolytic metabolism to promote lung adenocarcinoma [24]. Therefore, it was reasonable to hypothesize that BUB1B might serve as a crucial regulator of glycolysis, supporting uncontrolled proliferation in PDAC. Interestingly, to our attention, the protein levels of P300 were significantly reduced in PDAC cells transfected with si-TTK, si-BUB1B, or a combination of both (Fig. 10A and B). Considering P300 was proved to be a writer of histone lactylation in the beforementioned results, we concluded that during PDAC progression, not only the glycolysishistone lactylation-TTK/BUB1B pathway existed, but
Fig. 5 (See legend on next page.)
(See figure on previous page.)
Fig. 5 Glycolysis inhibition diminishes histone lactylation and suppresses cancer progression in the transplanted PDAC in nude mice. (A-H) MIA PaCa-2 cells were injected into nude mice subcutaneously and were intraperitoneally administered Oxamate ( , daily) or vehicle for 30 days. (I-P) Stable knockdown of LDHA (sh-LDHA) was mediated by lentivirus in MIA PaCa-2 cells. The sh-LDHA cells and the control (sh-NC) cells were injected into nude mice subcutaneously. Tumor gross image ( ) and tumor weight ( ) after sacrifice. Tumor volume assessment during the experiment ( ). Lactate content in the tumor tissues ( ). The levels of pan-lysine lactylation (Pan Kla) and H3K18 lactylation (H3K18la) were measured by western blot or IHC staining, and quantified by using Image J software (E-F, M-N). Cell proliferation was assessed by using IHC staining with Ki-67. Representative images and quantification ( ). Tumor metastasis in the liver was evaluated by using HE staining ( ). The arrows point to the metastatic tumor lesions. All data are presented as mean SD. Statistical analysis was performed by Student’s t-test.
also TTK/BUB1B played positive feedback in histone lactylation, which further exacerbate the malignancy.
Furthermore, we tried to determine whether TTK/ BUB1B could affect glycolysis in PDAC. LDHA plays a pivotal role in the synthesis of lactate, and it drives cancer cells’ preference for aerobic glycolysis in PDAC [25]. The potential phosphorylation sites of LDHA included tyrosine 10 (Y10) and tyrosine 239 (Y239) as predicted by PhosphoSitePlus (https://www.phosphosite.org/homeAction, Fig. S6A). Considering TTK’s dual specificity kinase activity towards both tyrosine and serine/threonine residues [26], we were interested in determining whether TTK has the capability to phosphorylate LDHA. Thus, we investigated whether there is an in vivo interaction between TTK and LDHA by using Co-IP assays. IP with LDHA antibody followed by western blot with TTK antibody confirmed the interaction between TTK and LDHA in MIA PaCa-2 and AsPC-1 cells (Fig. 10C and D). Furthermore, the knockdown of significantly suppressed the expression of phosphorylated LDHA at Y239 (Fig. 10E and F). There was only a slight reduction for phosphorylation at Y10 after knockdown, but the results had no statistical significance (Fig. 10E and F, S6BC). We also detected the activity of LDH, and found inhibition of TTK could suppress the LDH activity (Fig. 10G and H), These results suggest that TTK interacts with LDHA, and affects its phosphorylation and activity. Next, we evaluated the downstream of LDHA phosphorylation to investigate the effects of TTK on glycolysis in PDAC. Results showed knockdown reduced the production of lactate (Fig. 10I and J), and decreased the levels of Pan kla and H3K18la (Fig. 10K and L) in both MIA PaCa-2 and AsPC-1 cells. These results suggest that TTK plays a role in positive feedback between glycolysis and lactylation. Altogether, we find a positive feedback loop between H3K18la target genes TTK/BUB1B and glycolysis/lactylation.

Discussion

Our investigation into PDAC revealed a notable increase in lactate accumulation within the tumor microenvironment, which subsequently served as substrates for histone lactylation, notably H3K18la, which emerged as a key driver of PDAC tumorigenesis and progression and was correlated significantly with adverse clinical outcomes. P300 was identified as a writer and HDAC2 as an
eraser of histone lactylation in PDAC cells. Furthermore, H3K18la stimulated and transcription, thereby promoting cell cycle progression and tumorigenesis in PDAC. Intriguingly, knockdown of and BUB1B resulted in reduced P300 expression, and TTK knockdown inhibited LDHA phosphorylation at Y239, leading to decreased lactate production and histone lactylation level, establishing a feedback loop among these molecules. This glycolysis-H3K18la-TTK/BUB1B positive feedback loop presents a promising avenue for potential supplementary therapeutic approaches in PDAC treatment. In summary, our study provides critical insights into the role of histone lactylation in PDAC pathogenesis, emphasizing potential therapeutic targets for this challenging disease.
PDAC is one of the most lethal types of cancer and a significant challenge in the field of cancer medicine. Metabolic disorders are risk factors for PDAC progression. Reprogramming cellular metabolism to support proliferation and various cellular processes is considered a key hallmark of cancer [27]. Glycolysis plays a central role in the metabolic reprogramming of PDAC cells and supports malignant behaviors. Aerobic glycolysis, commonly recognized as the Warburg effect, is characterized by the preferential generation of energy through glycolysis instead of oxidative phosphorylation, even in the presence of adequate oxygen levels, which results in substantial production of lactate [28]. This phenomenon emerges as a hallmark of tumor cells, particularly in PDAC. Therefore, targeting the Warburg effect holds paramount importance in exploring novel therapeutic strategies against PDAC [29]. Lactate was previously regarded solely as a byproduct of glycolytic metabolism until Faubert et al. discovered that it could be reused as the primary carbon source for the mitochondrial tricarboxylic acid cycle [30]. Zhang et al., on their part, provided evidence that lactate has the potential to act as an epigenetic regulator by modifying histone lysine residues through lactylation [13]. In recent years, studies have revealed the participation of lactylation in processes such as tumorigenesis [19, 20], heart failure [31], sepsis [32] and other diseases. However, studies on histone lactylation modification in PDAC have not been reported yet till now. In our present study, we observed lactate accumulation in the tumor microenvironment of PDAC, which served as substrates for histone lactylation. We have revealed that
histone lactylation, particularly H3K18la, could drive tumorigenesis and progression in PDAC in vitro and in vivo for the first time. Furthermore, the high level of lactylation showed a strong correlation with poor clinical outcomes. All these results suggest that lactylation participates in the development of PDAC. However, we could not prove the direct connection between H3K18la and PDAC development, owing that the complex and dynamic nature of histone modifications makes them less likely to be affected by point mutations in a single base. This is a common limitation in studies aimed at demonstrating the direct association of histone modifications (including lactylation, acetylation and phosphorylation) with diseases [19, 20, 33-35]. Besides, the effects of lactylation in other histone or non-histone proteins are also interesting.
‘Writer’ and ‘eraser’ play crucial regulatory roles in epigenetic modifications. A writer is an enzyme responsible for adding or introducing a specific modification to a substrate molecule, while an eraser is an enzyme responsible for removing or reversing a specific post-translational modification from a substrate molecule. Currently, it has been noted that acetyltransferase P300 [20] and GCN5 [33] could act as histone lactylation writers. while deacetylase HDAC1-3 [36] along with SIRT3 [37] serve as lactylation erasers. Here, by using inhibitors and function experiments, we identified P300 and HDAC2 as the potential writer and eraser respectively involved in regulating histone lactylation in PDAC cells. By silencing or inhibiting P300 to disrupt histone lactylation, we were able to inhibit cell proliferation and migration ability in PDAC cells in a high lactate environment. Notably, lactate intervention promoted proliferation and migration abilities in AsPC-1 cells, but not in MIA PaCa-2 cells. This discrepancy may arise from the higher lactate production in MIA PaCa-2 cells compared to AsPC-1 cells [38], which is sufficient to promote proliferation and migration. Another question that needs to be noted is that when compared with P300 knockdown alone, NaLa supplementation together with P300 knockdown seemed to increase histone lactylation. This is because we only did the knockdown rather than the knockout. Upon the extremely high level of the upstream NaLa, even the writer (P300) was largely limited, the downstream (histone lactylation) might also be upregulated. Also, P300 might not be the sole writer of histone lactylation, and there might be other writers participating in the process. Besides, since P300 also acts as a writer protein for diverse histone acylations including acetylation, crotonylation, and -hydroxybutyrylation [39, 40], we can’t rule out whether P300-guided other acylation modifications participate in the malignant phenotypes, and further investigations are still needed.
It has been reported that Class I HDAC, especially HDAC1 and HDAC3, are the primary erasers of histone lactylation in cells [41]. In hepatocellular carcinoma, the majority of lactylation sites exhibit positive correlations with HDAC1-3, and knockdown of HDAC3 in HepG2 cells leads to an increase in lactylation intensity [42]. In addition, the sirtuin family has also been reported to participate in the lactylation. Under hypoxic conditions, mitochondrial alanyl-tRNA synthetase accumulates and lactylates mitochondrial proteins, thereby inhibiting oxidative phosphorylation. However, this process can be reversed by SIRT3, which suggests that SIRT3 may act as an eraser of mitochondrial protein lactylation [37]. Here, our intervention with deacetylase inhibitors demonstrated the potential role of Class I HDAC function as delactylase and overexpression experiments indicated that HDAC2 might function as an eraser in PDAC cells. However, understanding the specific mechanism of HDAC2 in PDAC development, as well as elucidating the roles of other HDAC families, requires further investigation in the future.
Increased histone lactylation in the promoter regions has been verified to induce the expression of target genes, including Arginase 1 (Arg1), N6-methyladenosinereader protein YTHDF2 in different cell types [13, 20]. In the present study, we revealed H3K18la activated and BUB1B transcription in PDAC cells to drive the cell cycle and accelerate tumorigenesis for the first time. The cell cycle pathway is an evolutionarily conserved process necessary for mammalian cell growth. Tumor cells accumulate cell cycle aberrations that result in unscheduled proliferation, genomic instability. Numerous therapeutic strategies have been proposed for targeting the cell cycle in cancer. In this study, we showed that mitotic spindle assembly checkpoint regulators TTK and BUB1B were highly expressed in human pancreatic cancer tissues and worked as prognostic factors in PDAC, which are in consistent with previous reports [22,23,43]. Although the mechanisms of several checkpoints have been well established, however, the functional significance of TTK and BUB1B in PDAC cells has not been analyzed in depth. By using knockdown and overexpression together with glycolysis inhibitors, we confirmed the effects of TTK and BUB1B in the H3K18la-mediated PDAC malignancy. We provided a novelty explanation for targeting critical regulators of genomic stability and the mitotic checkpoint TTK and BUB1B in PDAC.
More and more researchers have confirmed that metabolic rewiring and epigenetic remodeling are closely linked and reciprocally regulate each other [44]. In clear cell renal cell carcinoma, inactive von Hippel-Lindau leads to H3K18la, which activates the promoter of platelet-derived growth factor receptor ; and the latter signaling, in turn, stimulates H3K18la, establishing
Fig. 6 P300 is a potential writer of histone lactylation in PDAC cells. PDAC cell lines MIA PaCa-2 and AsPC-1 cells were transfected with P300 siRNA (siP300 or negative control siRNA (si-NC) with or without sodium lactate (NaLa, ) treatment. (A-B) The pan-lysine lactylation (Pan Kla) and H3K18 lactylation (H3K18la) levels were measured in MIA PaCa-2 (A) and AsPC-1 (B) cells. or 4. Representative images (left panel), and the quantification (right panel). (C-F) The proliferation ability of MIA PaCa-2 (C, D) and AsPC-1 (E, F) cells was detected by using IncuCyte S3 (C, E) and colony formation assays ( ). or 6 . ( -J) The migration ability of MIA PaCa-2 ( ) and AsPC-1 ( ) cells were assessed by using wound healing ( ) and transwell assays ( ). or 5 . All data are presented as mean SD. Statistical analysis was performed by ANOVA followed by Tukey’s multiple comparisons test.
Fig. 7 (See legend on next page.)
(See figure on previous page.)
Fig. 7 H3K18la activates TTK and BUB1B transcription in PDAC. (A-H) MIA PaCa-2 cells were treated with a glycolysis inhibitor Oxamate ( ) for 24 h . Cells were collected for CUT&Tag assay to screen the binding sites of H3K18la (A-D, H) or collected for RNA-seq to screen the downstream genes of lactylation (E-F). The heatmap showed the distribution of H3K18la peaks in the vicinity of the translation start site (TSS) (A-B). The distribution of H3K18la on the genome (C). KEGG analysis of the promoter region of the H3K18la distribution (D). The volcano plot of the differently expressed genes in RNA-seq (E). KEGG analysis of the downregulated genes in Oxamate-treated group by RNA-seq (F). Combination of CUT&Tag, RNA-seq and GEPIA database to identify the potential downstream targets of H3K18la (G). Integrative Genomics Viewer tracks of CUT&Tag showing enriched H3K18la in the promotors of TTK and BUB1B (H). (I-K) MIA PaCa-2 or AsPC-1 cells were treated with glycolysis inhibitors DCA ( ), Oxamate ( ) or 2 -DG ( ) for 24 h . DNA fragments were immunoprecipitated with the H3K18la antibody and analyzed by . Relative mRNA levels of and in MIA PaCa-2 cells (J). . Representative western blot images and quantification of TTK and BUB1B protein levels in MIA PaCa-2 cells (K). . All data are presented as mean SD. Statistical analysis was performed by one-way ANOVA followed by Dunnett’s multiple comparisons test in I-K. , ** , *** ; ns, not significant
an oncogenic positive feedback loop [45]. Microglial cells exhibit significant enrichment of histone H4 lysine 12 lactylation in brain specimens from patients with Alzheimer’s disease, which target the promoter regions of genes associated with glycolysis, thereby inducing their transcription and promoting lactate production. This establishes a positive feedback loop involving metabo-lism-epigenetics-metabolism, which exacerbates microglial metabolic dysregulation and functional impairments [46]. However, a comprehensive understanding of metabolic reprogramming and histone lactylation in PDAC is still lacking. In this study, we found the knockdown of and BUB1B, the target genes of H3K18la, could reduce the expression of P300 in different PDAC cell lines. As a writer of histone lactylation, P300 could further inhibit histone lactylation, which formed a feedback loop. Our study delivered a new important supplement about positive feedback regulation between TTK, BUB1B and P300. Besides, LDHA regulates the last step of glycolysis which generates lactate, which is mainly expressed in tissues with high glycolysis, such as tumors [47]. The high lactate level and glycolysis induced histone lactylation, which could induce transcriptional activation in different PDAC cells. Interestingly, knockdown of , a target gene for H3K18la, could feedback inhibit the phosphorylation of LDHA at Y239, which further suppressed the
activity of LDH and the lactate production, thus decreasing the levels of Pan Kla and H3K18la. The phosphorylation of LDHA has been reported to influence LDHA activity, which is mainly modulated by Y10 [48-50]. However, in our system, we observed for the first time that knockdown inhibited the activation of LDHA through Y239 phosphorylation. Altogether, our study establishes a positive feedback loop of glycolysis, histone lactylation and the genes of cell cycle, which adds a new mechanism of PDAC and provides a clue for the treatment of PDAC.

Conclusion

In summary, our study delivers a new exploration and important supplement of metabolic reprogrammingepigenetic regulation. It can be concluded that lactate promotes cell proliferation and migration at least in part through histone lactylation, especially H3K18la, and this process is mediated by TTK and BUB1B, which in turn enhance the glycolysis, and increase lactylation. Further investigation is needed to elucidate H3K18la-TTK/BUB1B epigenetic reprogramminglinked glycolysis related to PDAC progression. These results may lead to the design of potential therapeutic strategies that are both necessary and pressing for the treatment of PDAC.
Fig. 8 The high levels of TTK and BUB1B are associated with the malignancy of PDAC. (A) Relative mRNA levels of TTK and BUB1B were detected in human pancreatic ductal epithelial cell line hTERT-HPNE and four different PDAC cell lines (MIA PaCa-2, PANC-1, AsPC-1, and PL45 cells) by RT-qPCR. . ( ) Representative western blot images and quantification of TTK and BUB1B protein levels in the above cell lines. . ( ) TTK and BUB1B expression levels were visualized by IHC staining in PDAC and para-carcinoma tissues on the left panel. Statistical results were shown on the right panel. . (D-G) Kaplan-Meier curves of overall survival and disease-free survival in PDAC patients with low and high TTK or BUB1B expression in the GEPIA database (D, ) and Kaplan-Meier plotter database ( ). All data are presented as mean SD. Statistical analysis was performed by one-way ANOVA followed by Dunnett’s multiple comparisons test in , or by Student’s -test in C , or by Log-rank test in D-G. . TPM, transcripts per million
Fig. 9 (See legend on next page.)

(See figure on previous page.)

Fig. 9 TTK/BUB1B knockdown suppresses PDAC malignancy, and TTK overexpression partially attenuates the anticancer effects of lactylation inhibition. (A-H) MIA PaCa-2 and AsPC-1 cells were transfected with TTK siRNA (si-TTK), BUB1B siRNA (si-BUB1B) or negative control siRNA (si-NC). The efficiency of TTK and silencing was detected by western blot . The proliferation was assessed using IncuCyte S3 (C-D). . The migration ability was assayed by wound healing assays and transwell assays (E-H). . (I-L) MIA PaCa-2 cells were transfected with TTK overexpression plasmid (oe-TTK), or negative control plasmid (oe-NC), and then treated with glycolysis inhibitors Oxamate ( ) or . The efficiency of TTK overexpression was determined by western blot (I). The cell proliferation was assessed using IncuCyte S3 (J) and colony formation assays (K). or 3 . The migration ability was assessed by wound healing assays ( ). . All data are presented as mean SD. Statistical analysis was performed by ANOVA followed by Dunnett’s multiple comparisons test in C-H, or by Tukey’s multiple comparisons test in J-L.
Fig. 10 (See legend on next page.)
(See figure on previous page.)
Fig. 10 A positive feedback loop between H3K18la target genes (TTK and BUB1B) and glycolysis. (A-B) MIA PaCa-2 (A) and AsPC-1 (B) cells were transfected with negative control siRNA (si-NC), TTK siRNA (si-TTK) and/or BUB1B siRNA (si-BUB1B). The protein levels were detected by western blot and quantified. . (C-D) The interactions between TTK and LDHA in MIA PaCa-2 (C) and AsPC-1 (D) cells were confirmed by co-immunoprecipitation (Co-IP). (E-L) MIA PaCa-2 and AsPC-1 cells were transfected with si-TTK or si-NC. (E-F) The levels of phosphorylated LDHA at Y239 and Y10 in MIA PaCa-2 (E) and AsPC-1 (F) cells were detected by western blot and quantified. . ( ) LDHA activity assays in MIA PaCa-2 ( ) and AsPC-1 ( ) cells. or 6 . ( ) The lactate level in cell culture supernatants. . (K-L) The pan-lysine lactylation (Pan Kla) and H3K18 lactylation (H3K18la) levels were measured by western blot and quantified using Image J software. . All data are presented as mean SD. Statistical analysis was performed by one-way ANOVA followed by Tukey’s multiple comparisons test in A-B, or by Dunnett’s multiple comparisons test in E-F, or by Student’s t-test in G-L. . ( ) The main findings of this article. The glycolysis-H3K18la-TTK/BUB1B positive feedback loop exacerbates dysfunction in PDAC. This image was created with the help of BioRender (https://www.biorender.com)

Supplementary Information

The online version contains supplementary material available at https://doi. org/10.1186/s12943-024-02008-9.

Supplementary Material 1

Supplementary Material 2
Supplementary Material 3
Supplementary Material 4

Acknowledgements

We thank the GEO, GEPIA and Kaplan-Meier Plotter database for providing public platforms, and extend our appreciation to the researchers for uploading their data. We thank the Center of Basic Medical Research, Institute of Medical Innovation and Research at Peking University Third Hospital for their invaluable assistance in obtaining the PDAC cell line PANC-1.

Author contributions

FL, WS, LX, DY, TW: performed the experiments; MT, XC and JY: collected clinical samples; FL, WS, LX, DY, TW, MT, XC and JY: validated results of the experiments; FL, WS and LX: performed statistical analyses; FL and WS: drafted manuscript; RW and TH: contributed to the conception, designed the research, supervised and edited the manuscript. All authors reviewed the manuscript.

Funding

This work was supported by the special fund of the National Clinical Key Specialty Construction Program, P. R. China (2023), the National Nature Science Foundation of China (82270843, 82170875, 82371588), the Nature Science Foundation of Beijing (7232198), Beijing Nova Program (20220484090, 20230484442), Talent Project of Clinical Key Project of Peking University Third Hospital.

Data availability

The analyzed data sets generated during the study are available from the corresponding authors on reasonable request.

Declarations

All participants in this study provided written informed consent and the study was approved by the Clinical Research Ethics Committee of Peking University Third Hospital. Ethical approval for the study of the TMA was granted by the Clinical Research Ethics Committee, Outdo Biotech Co., Ltd. All animal experiments were conducted at Peking University Health Science Center and approved by Peking University Animal Care and Use Committee.
All authors have agreed with publishing this manuscript.

Competing interests

The authors declare no competing interests.

Author details

Department of Endocrinology and Metabolism, State Key Laboratory of Female Fertility Promotion, Peking University Third Hospital, Beijing 100191, China
Department of Laboratory Medicine, Peking University Third Hospital, Beijing 100191, China
Department of General Surgery, Peking University Third Hospital, Beijing 100191, China
Received: 20 December 2023 / Accepted: 24 April 2024
Published online: 06 May 2024

References

  1. Siegel RL, Miller KD, Wagle NS, Jemal A. Cancer statistics, 2023. CA Cancer J Clin. 2023;73:17-48.
  2. Grossberg AJ, Chu LC, Deig CR, Fishman EK, Hwang WL, Maitra A, et al. Multidisciplinary standards of care and recent progress in pancreatic ductal adenocarcinoma. CA Cancer J Clin. 2020;70:375-403.
  3. Halbrook CJ, Lyssiotis CA, Pasca di Magliano M, Maitra A. Pancreatic cancer: advances and challenges. Cell. 2023;186:1729-54.
  4. Dreyer SB, Upstill-Goddard R, Legrini A, Biankin AV, Glasgow Precision Oncology L, Jamieson NB, et al. Genomic and molecular analyses identify molecular subtypes of pancreatic cancer recurrence. Gastroenterology. 2022;162:320-4. e4.
  5. Yang J, Ren B, Yang G, Wang H, Chen G, You L, et al. The enhancement of glycolysis regulates pancreatic cancer metastasis. Cell Mol Life Sci. 2020;77:305-21.
  6. El Kaoutari A, Fraunhoffer NA, Audebert S, Camoin L, Berthois Y, Gayet O et al. Pancreatic ductal adenocarcinoma ubiquitination profiling reveals specific prognostic and theranostic markers. EBioMedicine.2023;92:104634.
  7. Qin C, Yang G, Yang J, Ren B, Wang H, Chen G, et al. Metabolism of pancreatic cancer: paving the way to better anticancer strategies. Mol Cancer. 2020;19:50.
  8. Pan C, Li B, Simon MC. Moonlighting functions of metabolic enzymes and metabolites in cancer. Mol Cell. 2021;81:3760-74.
  9. Cao L, Wu J, Qu X, Sheng J, Cui M, Liu S, et al. Glycometabolic rearrange-ments-aerobic glycolysis in pancreatic cancer: causes, characteristics and clinical applications. J Exp Clin Cancer Res. 2020;39:267.
  10. Liu M, Quek LE, Sultani G, Turner N. Epithelial-mesenchymal transition induction is associated with augmented glucose uptake and lactate production in pancreatic ductal adenocarcinoma. Cancer Metab. 2016;4:19.
  11. Lin J, Liu G, Chen L, Kwok HF, Lin Y. Targeting lactate-related cell cycle activities for cancer therapy. Semin Cancer Biol. 2022;86:1231-43.
  12. Bannister AJ, Kouzarides T. Regulation of chromatin by histone modifications. Cell Res. 2011;21:381-95.
  13. Zhang D, Tang Z, Huang H, Zhou G, Cui C, Weng Y, et al. Metabolic regulation of gene expression by histone lactylation. Nature. 2019;574:575-80.
  14. Dai X, Lv X, Thompson EW, Ostrikov KK. Histone lactylation: epigenetic mark of glycolytic switch. Trends Genet. 2022;38:124-7.
  15. Liberti MV, Locasale JW. Histone lactylation: a new role for glucose metabolism. Trends Biochem Sci. 2020;45:179-82.
  16. Itoh Y, Esaki T, Shimoji K, Cook M, Law MJ, Kaufman E, et al. Dichloroacetate effects on glucose and lactate oxidation by neurons and astroglia in vitro and on glucose utilization by brain in vivo. Proc Natl Acad Sci U SA. 2003;100:4879-84.
  17. Zhao Z, Han F, Yang S, Wu J, Zhan W. Oxamate-mediated inhibition of lactate dehydrogenase induces protective autophagy in gastric cancer cells: involvement of the Akt-mTOR signaling pathway. Cancer Lett. 2015;358:17-26.
  18. Zhang D, Li J, Wang F, Hu J, Wang S, Sun Y. 2-Deoxy-D-glucose targeting of glucose metabolism in cancer cells as a potential therapy. Cancer Lett. 2014;355:176-83.
  19. Xie B, Lin J, Chen X, Zhou X, Zhang Y, Fan M, et al. CircXRN2 suppresses tumor progression driven by histone lactylation through activating the Hippo pathway in human bladder cancer. Mol Cancer. 2023;22:151.
  20. Yu J, Chai P, Xie M, Ge S, Ruan J, Fan X, et al. Histone lactylation drives oncogenesis by facilitating m(6)a reader protein YTHDF2 expression in ocular melanoma. Genome Biol. 2021;22:85.
  21. Dominguez-Brauer C, Thu KL, Mason JM, Blaser H, Bray MR, Mak TW. Targeting mitosis in cancer: emerging strategies. Mol Cell. 2015;60:524-36.
  22. Kaistha BP, Honstein T, Müller V, Bielak S, Sauer M, Kreider R, et al. Key role of dual specificity kinase TTK in proliferation and survival of pancreatic cancer cells. Br J Cancer. 2014;111:1780-7.
  23. Grützmann R, Pilarsky C, Ammerpohl O, Lüttges J, Böhme A, Sipos B, et al. Gene expression profiling of microdissected pancreatic ductal carcinomas using high-density DNA microarrays. Neoplasia. 2004;6:611-22.
  24. Zhou X, Yuan Y, Kuang H, Tang B, Zhang H, Zhang M. BUB1B (BUB1 mitotic checkpoint serine/threonine kinase ) promotes lung adenocarcinoma by interacting with zinc finger protein ZNF143 and regulating glycolysis. Bioengineered. 2022;13:2471-85.
  25. Comandatore A, Franczak M, Smolenski RT, Morelli L, Peters GJ, Giovannetti E. Lactate dehydrogenase and its clinical significance in pancreatic and thoracic cancers. Semin Cancer Bio. 2022;86:93-100.
  26. Musacchio A. The molecular biology of spindle assembly checkpoint signaling dynamics. Curr Biol. 2015;25:R1002-18.
  27. Pavlova NN, Zhu J, Thompson CB. The hallmarks of cancer metabolism: still emerging. Cell Metab. 2022;34:355-77.
  28. Koppenol WH, Bounds PL, Dang CV. Otto Warburg’s contributions to current concepts of cancer metabolism. Nat Rev Cancer. 2011;11:325-37.
  29. Jiang SH, Li J, Dong FY, Yang JY, Liu DJ, Yang XM et al. Increased serotonin signaling contributes to the Warburg effect in pancreatic tumor cells under metabolic stress and promotes growth of pancreatic tumors in mice. Gastroenterology. 2017;153:277-91.e19.
  30. Faubert B, Li KY, Cai L, Hensley CT, Kim J, Zacharias LG et al. Lactate metabolism in human lung tumors. Cell. 2017;171:358-71.e9.
  31. Zhang N, Zhang Y, Xu J, Wang P, Wu B, Lu S, et al. Alpha-myosin heavy chain lactylation maintains sarcomeric structure and function and alleviates the development of heart failure. Cell Res. 2023;33:679-98.
  32. Yang K, Fan M, Wang X, Xu J, Wang Y, Tu F, et al. Lactate promotes macrophage HMGB1 lactylation, acetylation, and exosomal release in polymicrobial sepsis. Cell Death Differ. 2022;29:133-46.
  33. Wang N, Wang W, Wang X, Mang G, Chen J, Yan X, et al. Histone lactylation boosts reparative gene activation post-myocardial infarction. Circul Res. 2022;131:893-908.
  34. Compton SE, Kitchen-Goosen SM, DeCamp LM, Lau KH, Mabvakure B, Vos M et al. LKB1 controls inflammatory potential through CRTC2-dependent histone acetylation. Mol Cell. 2023;83:1872-86.e5.
  35. Zhao Y, Li S, Chen Y, Wang Y, Wei Y, Zhou T, et al. Histone phosphorylation integrates the hepatic glucagon-PKA-CREB gluconeogenesis program in response to fasting. Mol Cell. 2023;83:1093-108.e8.
  36. Moreno-Yruela C, Zhang D, Wei W, Baek M, Liu W, Gao J, et al. Class I histone deacetylases (HDAC1-3) are histone lysine delactylases. Sci Adv. 2022;8:eabi6696.
  37. Mao Y, Zhang J, Zhou Q, He X, Zheng Z, Wei Y, et al. Hypoxia induces mitochondrial protein lactylation to limit oxidative phosphorylation. Cell Res. 2024;34:13-30.
  38. Daemen A, Peterson D, Sahu N, McCord R, Du XN, Liu BN, et al. Metabolite profiling stratifies pancreatic ductal adenocarcinomas into subtypes with distinct sensitivities to metabolic inhibitors. Proc Natl Acad Sci USA. 2015;112:E4410-7.
  39. Chen Q, Yang B, Liu X, Zhang XD, Zhang L, Liu T. Histone acetyltransferases CBP/p300 in tumorigenesis and CBP/p300 inhibitors as promising novel anticancer agents. Theranostics. 2022;12:4935-48.
  40. Huang H, Zhang D, Weng Y, Delaney K, Tang Z, Yan C et al. The regulatory enzymes and protein substrates for the lysine beta-hydroxybutyrylation pathway. Sci Adv. 2021;7:eabe2771.
  41. Sabari BR, Tang Z, Huang H, Yong-Gonzalez V, Molina H, Kong HE, et al. Intracellular crotonyl-CoA stimulates transcription through p300-catalyzed histone crotonylation. Mol Cell. 2015;58:203-15.
  42. Yang Z, Yan C, Ma J, Peng P, Ren X, Cai S, et al. Lactylome analysis suggests lactylation-dependent mechanisms of metabolic adaptation in hepatocellular carcinoma. Nat Metab. 2023;5:61-79.
  43. Dong S, Huang F, Zhang H, Chen Q. Overexpression of BUB1B, CCNA2, CDC20, and CDK1 in tumor tissues predicts poor survival in pancreatic ductal adenocarcinoma. Biosci Rep. 2019;39:BSR20182306.
  44. Sun L, Zhang H, Gao P. Metabolic reprogramming and epigenetic modifications on the path to cancer. Protein Cell. 2022;13:877-919.
  45. Yang J, Luo L, Zhao C, Li X, Wang Z, Zeng Z, et al. A positive feedback loop between inactive VHL-triggered histone lactylation and PDGFRbeta signaling drives clear cell renal cell carcinoma progression. Int J Biol Sci. 2022;18:3470-83.
  46. Pan RY, He L, Zhang J, Liu X, Liao Y, Gao J, et al. Positive feedback regulation of microglial glucose metabolism by histone H 4 lysine 12 lactylation in Alzheimer’s disease. Cell Metab. 2022;34:634-48.e6.
  47. Kes MMG, Van den Bossche J, Griffioen AW, Huijbers EJM. Oncometabolites lactate and succinate drive pro-angiogenic macrophage response in tumors. Biochim Biophys Acta Rev Cancer. 2020;1874:188427.
  48. Xue W, Li X, Li W, Wang Y, Jiang C, Zhou L, et al. Intracellular CYTL1, a novel tumor suppressor, stabilizes NDUFV1 to inhibit metabolic reprogramming in breast cancer. Signal Transduct Target Ther. 2022;7:35.
  49. Li J, Zhang Q, Guan Y, Liao D, Jiang D, Xiong H, et al. Circular RNA circVAMP3 promotes aerobic glycolysis and proliferation by regulating LDHA in renal cell carcinoma. Cell Death Dis. 2022;13:443.
  50. Li S, Gao J, Zhuang X, Zhao C, Hou X, Xing X, et al. Cyclin G2 inhibits the Warburg effect and tumour progression by suppressing LDHA phosphorylation in glioma. Int J Biol Sci. 2019;15:544-55.

Publisher’s Note

Springer Nature remains neutral with regard to jurisdictional claims in published maps and institutional affiliations.
  1. Fei Li, Wenzhe Si and Li Xia contributed equally to this work.
    *Correspondence:
    Tianpei Hong
    tpho66@bjmu.edu.cn
    Rui Wei
    weirui@bjmu.edu.cn
    Full list of author information is available at the end of the article