تاريخ الاستلام: 19 سبتمبر 2023
تم القبول: 24 أبريل 2024
نُشر على الإنترنت: 15 مايو 2024

تعتمد الكائنات الحية متعددة الخلايا على الحواجز السطحية لتقسيم نفسها عن البيئات القاسية والمتطرفة والحفاظ على التوازن الداخلي. في الفقاريات الأرضية، يتم إغلاق سطح الجسم بواسطة الظهارة الحرشفية المتعددة الطبقات للجلد المعروفة باسم البشرة. انتقال الحياة من الماء إلى اليابسة في الفقاريات تسبب في ضغوط انتقائية أثرت على تشريح البشرة، وطور الفقاريات الأرضية حاجز واجهة الهواء-السائل، المعروف باسم الطبقة القرنية (SC)، كأعلى طبقة في بشرتها (الشكل 1أ). . المحكمة العليا
يمتلك خصائص فريدة، حيث يمنع دخول الممرضات والمواد المسببة للحساسية (حاجز من الخارج إلى الداخل)، بالإضافة إلى تسرب الماء (حاجز من الداخل إلى الخارج)، على الرغم من أنه يتكون من طبقات من الكيراتينوسيتات غير الحية المنزوعة النواة (الكورنيوسيتات). كما يمكنه أيضًا الحفاظ على سمك محدد للموقع من خلال تقشير القشور (التقشير) يوميًا. علاوة على ذلك، يستضيف الطبقة القرنية ميكروبيوم الجلد الذي يلعب أدوارًا أساسية في تحفيز أنظمة المناعة الجلدية الفطرية والتكيفية. . هذه الخصائص هي نتيجة لآلية تحافظ على التوازن الداخلي في الخلايا الجذعية.

ومع ذلك، تظل الآليات الأساسية التي تحمي توازن الخلايا الجذعية غامضة.

ترتبط الخلايا القرنية معًا بواسطة الكورنيوديسموسومات، وتُغلق المسافات بين الخلايا بالدهون. تمتلئ المساحات داخل الخلايا القرنية بالبروتينات مثل خيوط الكيراتين والفيلاغرين، بالإضافة إلى منتجات تحللها. . يحتوي المجلس الأعلى
الإنزيمات المسؤولة عن تخليق الدهون وتحلل البروتين، وتُنظم الأنشطة التحفيزية لهذه الإنزيمات بواسطة بالإضافة إلى ذلك، يتم إنتاج الخلايا القرنية من خلال نمط فريد من موت الخلايا لخلايا الكيراتين في الطبقة العليا من الطبقة الحبيبية (خلايا SG1، الشكل 1أ) يسمى الكورنيوبتوز. يتطلب فترة طويلة داخل الخلايا الارتفاع (المرحلة الأولى) يليه تحمض خلوي متحكم فيه

الشكل 1 | ثلاث مناطق SC-pH متدرجة محفوظة عبر أجزاء الجسم المختلفة. أ هيكل البشرة. تتكون البشرة من الطبقة القاعدية (SB) والطبقة الشوكية (SS) والطبقة الحبيبية (SG) والطبقة القرنية (SC). تتكون SG من SG1 و SG2 و SG3. تتشكل الوصلات الضيقة (TJs، باللون الأحمر) بين خلايا SG2 المجاورة. درست الدراسة الحالية توزيع pH وقيم pH داخل SC و SG1 (باللون البرتقالي). ب صور تمثيلية مجهرية ضوئية للطبقة العليا من بشرة جلد البطن من الفئران، كما لوحظ تحت صور مقطعية معاد تشكيلها (أعلى) وصور عالية التكبير في مستوى X-Y (أسفل). قضبان القياس، 5 (أعلى)، 10 (أسفل) صورة مجهر إلكتروني تمثيلي (أعلى) ومخطط لصورة مجهرية متداخلة في مستوى X-Y (أسفل) لثلم SC. شريط القياس، صور تمثيلية تمثيلية للطبقة العليا من البشرة في جلد الظهر الفئران، كما لوحظ تحت صور معاد تكوينها مقطعية Z (الأعلى) وتكبير منخفض (الأسفل-left) وعالي (الأسفل-right، المنطقة المحددة بالخطوط الزرقاء في اليسار) في مستوى X-Y. قضبان القياس، 5 (الأعلى)، 10 (الأسفل-left)، و1 (الأسفل-right) . عالي-
صور مجهرية مركبة لمناطق SC-pH في مستوى X-Y (الأعلى) من الظهر البطني، و جلد الأذن من الفئران. قيم pH في كل منطقة SC-pH و SG1 (الأسفل) من ظهرية ، و30 موقعًا من أربعة حيوانات مستقلة بيولوجيًا، على التوالي، البطني ، و 30 نقطة من أربعة حيوانات مستقلة بيولوجيًا، على التوالي)، و أذن ، و 30 نقطة من أربعة حيوانات مستقلة بيولوجيًا، على التوالي) جلد. مقياس الرسم، ممثل منخفض و تكبير عالي صور الطائرة المترافقة من جلد الأذن في B6.Display-VmC الفئران (يسار). قيم pH في كل منطقة SC-pH و SG1 (يمين، “، و 21 نقطة من ثلاثة حيوانات مستقلة بيولوجيًا، على التوالي). شريط القياس، و تُعرض البيانات كمتوسط SEM ويتم تجميعها من أربعة ( ) أو ثلاث تجارب ( ) أو تمثل على الأقل ثلاث تجارب مستقلة ( و ). ; تحليل التباين الأحادي كروسكال-واليس يليه اختبار دان بعد الاختبار ( تم توفير بيانات المصدر كملف بيانات المصدر.
(المرحلة الثانية)، مما ينشط DNases و proteases لإزالة العضيات مثل الميتوكوندريا دون التسبب في الالتهاب استنادًا إلى هذه النتائج، افترضنا أن SC-pH يؤثر على توازن SC.

استخدمت الدراسات السابقة طريقتين رئيسيتين لقياس توزيع الرقم الهيدروجيني لطبقة الجلد البشرية: تطبيق إلكترود الرقم الهيدروجيني على سطح الجلد قبل وبعد إزالة الشريط اللاصق المتتالي أو إجراء تصوير عمر الفلورسنت للهياكل الجلدية البشرية ثلاثية الأبعاد الملطخة بمؤشر الرقم الهيدروجيني المذاب في المذيبات العضوية باستخدام مجهر المسح ثنائي الفوتون. لقد تم الإبلاغ عن أن ملف SC-pH يظهر تدرجًا أحاديًا، يتراوح من في طبقة الحبيبات (SG؛ الطبقة العليا من خلايا الكيراتين القابلة للحياة التي تقع تحت الطبقة القرنية) إلى pH 4.5-5.5 على سطح الطبقة القرنية . ومع ذلك، من المعروف أن إزالة الشريط تسبب التهاب الجلد ، وقد تذوب المذيبات العضوية الدهون المحيطة بالخلايا القرنية، مما يمكن أن يؤثر على درجة حموضة الطبقة القرنية. وبالتالي، قد لا تعكس قياسات درجة حموضة الطبقة القرنية التي تم الإبلاغ عنها سابقًا قيم درجة حموضة الطبقة القرنية في حالة التوازن في الجسم الحي وتوزيعها. في الواقع، فإن إنزيمات الكاليكرين المرتبطة (KLKs) التي تبدأ عملية التقشر تظل غير نشطة عند درجة حموضة حمضية، وهذا لا يمكن أن يفسر بوضوح لماذا تنفذ KLKs عملية التقشر في الجزء العلوي. . علاوة على ذلك، بسبب وجود الميكروبات الجلدية على سطح الطبقة القرنية من غير المحتمل أن يكون السائل المنوي حمضيًا في الجسم الحي، حيث أن هذا النطاق من الرقم الهيدروجيني أقل ملاءمة لاستعمار البكتيريا المفيدة مقارنةً بالقيم المحايدة للرقم الهيدروجيني. .

هنا، قمنا بإجراء تصوير كمي لدرجة الحموضة داخل الجسم في خلايا القرنية باستخدام فئران معدلة وراثيًا تعبر عن مؤشر درجة حموضة نسبي، مع الأخذ في الاعتبار توزيع درجة حموضة SC الدقيق. كان هدفنا توضيح توزيع درجة حموضة SC في الجسم وأهمية درجة الحموضة البيولوجية في توازن SC. الدراسات التي استخدمت قياسات سابقة لدرجة حموضة SC اقترحت أن SC تمتلك ملف تدرج محايد إلى حمضي رتيب وأن البيئة الدقيقة الحمضية تعزز الدفاع المضاد للميكروبات في الجلد. . ومع ذلك، في هذه الدراسة، وجدنا أن الخلايا القرنية تخضع للتمايز، مما يؤدي إلى تكوين مناطق حموضة ثلاثية المستويات؛ وهي: هذه العملية تولد مناطق حامضية منخفضة معتدلة (pH 6.0)، ومنطقة حامضية متوسطة (pH 5.4)، ومنطقة علوية قريبة من الحيادية (pH 6.7). تنشأ منطقة حموضة SC السفلية من الحموضة خلال المرحلة الثانية من الكورنيوبتوز. منطقة حموضة SC المتوسطة هي طبقة الحموضة التي تعمل كحاجز واقي ضد مسببات الأمراض. منطقة حموضة SC العلوية قابلة للتكيف بشكل مدهش؛ يمكنها تعديل حموضتها بناءً على الظروف الخارجية، حيث تظهر حموضة قريبة من الحيادية في حالة الاستقرار بفضل ميكروبيوتا الجلد. المناطق الثلاثية للحموضة مناسبة لتنظيم نشاط إنزيم البروتياز لتحفيز التقشر على سطح SC. تؤكد نتائجنا أن SC ليست مجرد طبقة من الكيراتينوسيت الميتة. بدلاً من ذلك، تتكون SC من ثلاث مناطق حموضة متميزة تساهم في تمايز SC، مما يحافظ على توازن SC.

لتصوير توزيع وقيم pH في الجسم الحي، قمنا بإنشاء بروتينات اندماجية باستخدام مجسات حساسة لدرجة الحموضة مختلفة. استخدمنا فينوس.
أو VenusH148G كأجهزة استشعار حساسة لدرجة الحموضة العالية وmCherry كجهاز استشعار حساس لدرجة الحموضة المنخفضة قمنا بتوليد فئران بلا شعر (HR) تعبر بشكل محدد عن هذه البروتينات المدمجة تحت موضع بروتين الأسبارتيك (SASP) في الجلد، مما يعبر عن هذه المجسات pH في طبقة خلايا SG1 (HR.SASP). و HR.SASP [VH148GmC ] الفئران، على التوالي [ الشكل التوضيحي التكميلي 1أ]). لذلك، فإن هذه الفئران متطابقة مع الفأر الناقص الجين الهجين SASP الموصوف سابقًا الذي لا يمتلك نمط ظاهري، باستثناء أن دمج Veuns-mcherry (VmC) أو فينوس إدخال كاسيت mCherry (VH 148 GmC) في موقع SASP. لتقييم ما إذا كانت فلورية فينوس-مCherry (VmC) وفيونوس -بروتينات -mCherry ( VH 148 GmC )، المعبر عنها في النخاع الشوكي الفأري، عكست تغييرات الرقم الهيدروجيني، قمنا بعزل خلايا SG1 من جلد الظهر لهذه الفئران وعرضناها لمخازن مختلفة من الرقم الهيدروجيني ( ) مع بروتونوفورات (نيجيريسين وفالينوميسين) التي قامت بتوازن الرقم الهيدروجيني داخل الخلايا مع الرقم الهيدروجيني للمحلول. تم تحليل شدة الفلورسنت لفيونوس، فيونوسH148G، وmCherry عند كل قيمة pH باستخدام المجهر الضوئي المجهري (الشكل التكميلي 1b-e). الاختلافات في ملفات فلورسنت فيونوس، فيونوسH148G، وmCherry استجابةً لتغيرات pH أنتجت منحنيات نسبية محددة لفلورسنت فيونوس/mCherry وفلورسنت فيونوسH148G/mCherry (الشكل التكميلي 1f، g). عندما تم تطبيع نسبة فلورسنت فيونوس/mCherry إلى القيمة المقابلة عند pH 8.0 (فيونوس/mCherry النسبي)، تداخلت منحنيات النسبة لفلورسنت فيونوس/mCherry المقاسة تحت قوتين ليزريتين (الشكل التكميلي 1f). بعد التطبيع، تداخلت أيضًا منحنيات النسبة لفلورسنت فيونوسH148G/mCherry المقاسة تحت قوتين ليزريتين (الشكل التكميلي 1g). تشير هذه النتائج إلى أن الرقم الهيدروجيني للخلايا القرنية وخلايا SG1 في كلا و VH148GmC يمكن حساب الفئران عن طريق استبدال نسبة فينوس/ميري و فينوس قيم المCherry، على التوالي، في المنحنيات النسبية التي تم إنشاؤها باستخدام خلايا SG1 المعزولة. علاوة على ذلك، كانت قيم pKa لـ VmC و VH148GmC حوالي 5.8 و 7.0، على التوالي (الشكل التكميلي 1f، g)، مما يشير إلى أن VmC أكثر ملاءمة لتصور تغييرات pH في الظروف الحمضية مقارنة بـ VH148GmC.

لرصد توزيع SC-pH في الفئران في الجسم الحي، قمنا بإجراء تصوير حيوي و الفئران عبر المجهر الضوئي التداخلي (الشكل 1أ). كشفت مقطع Z المعاد تشكيله أن SC من جلد الظهر يتكون من تقسيم ثلاثي الطبقات: الطبقة العليا – شبه محايدة، والطبقة الوسطى – حمضية، والطبقة السفلية – حمضية معتدلة. ومع ذلك، كان من الصعب تحديد درجة الحموضة في الخلايا القرنية الفردية (الشكل 1ب وفيلم إضافي 1). حيث أظهر الجلد تجاعيد مخططة (الشكل 1ج) وصورة المجهر الضوئي التداخلي في قدمت الصورة في المستوى X-Y دقة أعلى من القسم المعاد تكوينه المقطعي Z (الشكل 1ب)، لذا ركزنا على التجاعيد المضلعة في صورة المستوى X-Y (الشكل 1ج). هذه الطريقة مكنتنا من تصور SC-pH بدقة خلية قرنية واحدة (الشكل 1د، هـ). بالإضافة إلى جلد الظهر، أظهر جلد البطن والأذن والذيل وكف اليد في الفئران تقسيمًا ثلاثي الطبقات (الشكل 1و، ز، والشكل التكميلية 2أ-هـ).

بعد ذلك، قمنا بحساب قيمة الرقم الهيدروجيني لكل منطقة في SC من الفئران. كانت قيم pH في المناطق العليا والوسطى والسفلى من SC-pH وطبقة خلايا SG1 مختلفة بشكل ملحوظ، حيث تراوحت بين 6.58-6.77، 5.32-5.42، 5.92-6.04، و6.93-7.11، على التوالي (الشكل 1e-g). بشكل جماعي، كان لدى SC ثلاث مناطق SC-pH متدرجة، والتي تم الحفاظ عليها عبر مواقع الجسم المختلفة.

نظرًا لأن و مكنت الفئران من التصوير الحي لدرجة الحموضة بين الخلايا في الخلايا القرنية وأظهرت تقسيمًا ثلاثي المستويات، وتساءلنا عما إذا كانت درجة الحموضة خارج الخلايا في الخلايا القرنية تظهر تغييرات مماثلة في درجة الحموضة. للتحقيق في ذلك، قمنا بإنشاء فئران B6 التي تعبر بشكل محدد عن بروتين الاندماج Venus-mCherry على الجانب الخارجي من غشاء الخلية لبروتينات SG1 والخلايا القرنية (B6.SASP فئران [B6. عرض-VmC الفئران]) وأجريت تصوير pH تحت الجلد الحي. مشابه لـ و VH148GmC فئران، B6. عرض-VmC أظهرت الفئران تقسيمًا ثلاثي المستويات (الشكل 1h والفيلم التكميلي 2). كانت مناطق SC-pH العليا والوسطى والسفلى وطبقة خلايا SG1 لها قيم pH مختلفة بشكل ملحوظ [pH 6.76 ( CI 6.61-6.91)، 5.36 ( 5.30-5.41)، 5.82 (95% CI 5.76-5.88)، و 6.80 ( تشير هذه النتائج إلى أن الرقم الهيدروجيني الخارجي للخلايا القرنية يتطابق مع الرقم الهيدروجيني الداخلي للخلايا القرنية.

يمكن أن يتم إخماد الفلورية في الزهرة بواسطة درجة الحموضة وكذلك بواسطة تركيز أيون الكلوريد. بينما لا يمكن إخماد الفلورية لـ EGFP بواسطة قمنا بإجراء تصوير داخلي حي لفئران HR التي تعبر عن EGFP في خلايا SG1 الفئران). مشابه لـ فئران كانت الفئران تمتلك ثلاث مناطق متميزة من شدة EGFP في SC – العليا-عالية EGFP، الوسطى-منخفضة EGFP، والسفلى-عالية EGFP (الشكل التكميلي 3a) – مما يشير إلى أن توهين فلوريسcence فينوس لم يكن بسبب التغيرات. علاوة على ذلك، اكتشفنا تعبير بروتين EGFP في الفئران و فينوس و تعبير mCherry في الفئران من خلال تحليلات Western blot لعينات SC المأخوذة من تقشير الشريط (TS). كانت كميات EGFP وVenus وmCherry متشابهة من (الجزء العلوي من SC) إلى (الطبقة السطحية السفلية) عينات TS؛ ومع ذلك، انخفض مستوى الفيلاغرين نحو سطح الطبقة السطحية، مما يتماشى مع الملاحظات السابقة (الشكل التكميلي 3b) تشير هذه النتائج إلى أن التغيرات في فلورية Venus-mCherry داخل SC لم تكن ناتجة عن التحلل البروتيني ولكن بسبب التثبيط الناتج عن درجة الحموضة في SC.

يُعرف أن الفيلاغرين موجود في منطقة الخلايا الكيراتينية السفلية، ثم يتحلل إلى عوامل الترطيب الطبيعية، مما يلعب دورًا حيويًا في ترطيب الجلد. لفحص توزيع الفيلاغرين ضمن مناطق SC-pH، قمنا بإجراء صبغ مناعة فلورية للفيلاغرين في جلد الفأر. تم ملاحظة الفيلاغرين في غشاء الخلية للكورنيوسايت الموجود في منطقة SC-pH السفلى واختفى فوق منطقة SC-pH السفلى (الشكل 2a). تشير هذه النتيجة إلى أن منطقة SC-pH السفلى تت correspond إلى المنطقة السفلى من SC التي تم الإبلاغ عنها سابقًا، حيث يوجد الفيلاغرين. وأن الفيلاغرين يتحلل إلى عوامل الترطيب الطبيعية في منطقة الرقم الهيدروجيني المتوسطة للطبقة القرنية.

حيث تتشكل الخلايا القرنية من خلال موت خلايا SG1 (الكورنيوبتوزيس) وتصبح خلايا SG1 حمضية خلال المرحلة الثانية من الكورنيوبتوزيس. ، ثم هدفنا بعد ذلك إلى تحديد موقع وقيمة الرقم الهيدروجيني لخلايا SG1 في المرحلة الثانية من الكورنيوبتوز. للقيام بذلك، قمنا بحقن Hoechst 33242 في جلد و تمت دراسة الفئران وأُجريت تصوير pH داخل الأنسجة في طبقة الجلد. كانت خلايا SG1 ذات السيتوبلازم الأصفر وصبغة نووية Hoechst 33242 (التي تت correspond إلى المرحلة الثانية من الكورنيوبتوز) موجودة في الطبقة السفلية من منطقة SC-pH السفلية (الشكل 2b و c، والشكل التكميلي 3c، والفيلم التكميلي 3). كان pH خلايا SG1 في المرحلة الثانية من الكورنيوبتوز مشابهًا لذلك الموجود في الكورنيوسيتات في منطقة SC-pH السفلية (الشكل 2d)، مما يشير إلى أن منطقة SC-pH السفلية تنشأ من الحموضة التي تحدث خلال المرحلة الثانية من الكورنيوبتوز.

في جلد الثدييات، يحتوي البشرة على نوعين من الحواجز الفيزيائية: الوصلات الضيقة (TJs) والطبقة القرنية (SC). تتشكل الوصلات الضيقة في الجانب القمي للخلايا الكيراتينية في الطبقة الثانية من الغدة الدهنية (الشكل 1أ) وتكون في اتصال مع خلايا SG1 لتعمل كحواجز بين السوائل. الفئران التي تفتقر إلى كلودين-1 (Cldn1 )، بروتين رباعي عبر الغشاء يشكل بروتينات الوصلات الضيقة، معروف بأنه يمتلك طبقة جلدية أكثر تماسكًا وسماكة، ويعاني من فقدان أكبر للماء عبر البشرة مقارنة بالفئران من النوع البري. من المعروف أن المرضى الذين يعانون من نقص كلودين-1 يصابون بالسمكية. اضطراب قرني وراثي يتميز بضعف تمايز الخلايا القرنية وسماكة نتيجة ضعف التقشر. علاوة على ذلك، فإن المرضى الذين يعانون من التهاب الجلد التأتبي (AD)، وهو مرض جلدي التهابي مزمن يؤدي إلى ارتفاع قيم pH السطحية للخلايا القرنية. لديهم تعبير منخفض بشكل ملحوظ لبروتين كلودين-1 في بشرتهم استنادًا إلى هذه التقارير، افترضنا أن التوزيعات والقيم لـ SC-pH قد تكون غير طبيعية في فئران Cldn1/. كما أن VH148GmC الفئران لديها حساسية أعلى للقيم المحايدة لدرجة الحموضة من الفئران، وCldn1 تموت الفئران خلال يوم واحد من الولادة (بسبب فقدان الماء المفرط من البشرة) قمنا بفحص SC-pH لـ Cldn1 حديثي الولادة الفئران. لاحظنا غياب المناطق الثلاثة من مستويات الحموضة SC-pH المتدرجة، وكان مستوى الحموضة في SC بالكامل محايدًا (الشكل 2e، f)، مما يشير إلى أن حموضة المناطق السفلية والوسطى من SC-pH تتطلب وجود روابط ضيقة سليمة. بشكل جماعي، تشير هذه النتائج إلى أن منطقة SC-pH السفلية هي طبقة أساسية من ثلاث مناطق SC-pH متدرجة وأنها تتعطل بسبب تدمير الروابط الضيقة.

علاوة على ذلك، قمنا بفحص SC-pH الخاص بالجلد من نوع Cldn1. VH148GmC فئران (B6.Cldn1 K14-CreERT VH148GmC الفئران). مشابهة لـ Cldn1/ VH148GmC حديثي الولادة الفئران، كامل SC من البالغين B6.Cldn K14-CreERT VH148 أظهرت الفئران درجة حموضة محايدة وكانت أكثر سمكًا مقارنةً بـ الفئران (الشكل التكميلي 3d، e). من المدهش أن صبغة المناعة الفلورية للفيلاجرين في B6.Cldn1 K14-CreERT VH148GmC أظهر جلد الفئران أن الفيلاغرين موزع مع تراكم على طول غشاء الخلية للكورنيوسايت وكان موجودًا في جميع أنحاء الطبقة القرنية (الشكل 2g). ومع ذلك، لم يكن بالإمكان اكتشاف مونومر الفيلاغرين في B6.Cldn1. K14-CreERT VH148GmC الفئران، كما تم تأكيده من خلال تحليلات Western blot لعينات SC المأخوذة من TS (الشكل التكميلي 3f). بدلاً من ذلك، تم الكشف عن أشرطة تقريبًا بحجم الفيلاغرين الثنائي والثلاثي والرباعي. بشكل جماعي، تشير هذه النتائج إلى أن نقص Cldn1 أدى إلى فقدان ثلاث مناطق SC-pH تدريجية وتراكم الفيلاغرين المعالج مسبقًا. تعتبر هذه الظروف المتأثرة بالوصلات الضيقة نتيجة لانخفاض مونومر الفيلاغرين وكبح إنتاج عامل الترطيب الطبيعي اللاحق، مما يؤدي إلى ضعف التقشر.

نظرًا لأن منطقة SC-pH المتوسطة الحموضة تتمايز أكثر إلى منطقة SC-pH العليا شبه المحايدة، قمنا بدراسة تأثير المحفزات الخارجية على تمايز مناطق pH. استخدمنا صبغة STELLA Fluor 650 (صبغة فلورية تتميز بثبات شدة فلوروسنتها عند ; مذاب في محلول ملحي معزز بالفوسفات) يحتوي على ماء ميلي-كيو على سطح الجلد الظهري لـ الفئران. تم ملاحظة إشارات STELLA Fluor 650 فقط في الطبقة العليا من SC، والتي تت correspond إلى منطقة SCpH العليا (الشكل 3a). كانت هذه النتيجة متسقة مع الملاحظات السابقة المستندة إلى مطيافية الكتلة للأيونات الثانوية بتقنية زمن الطيران (TOF-SIMS)، والتي اقترحت وجود منطقة سطحية سمحت بوجود أيونات سلبية (أي، البوتاسيوم التدفق والدفق . علاوة على ذلك، قمنا بتطبيق محاليل عازلة بقيم pH مختلفة ( ) إلى جلد الظهر والبطن من الفئران وقاسوا درجة الحموضة لكل منها المنطقة و SG1. في كل من الجلد الظهري والبطني، تغير الرقم الهيدروجيني في المنطقة العليا من SC-pH بشكل ملحوظ بعد معالجة العازل. بالمقابل، قدمت المناطق الوسطى والسفلى من SC-pH قيم pH مشابهة لتلك الموجودة في الفئران غير المعالجة (الشكل 3b، c). لذلك، تظهر المنطقة العليا من SC-pH خصائص مشابهة للتكيف ويمكنها تعديل الرقم الهيدروجيني الخاص بها وفقًا للتغيرات في الرقم الهيدروجيني الخارجي، على عكس المناطق السفلى والوسطى من SC-pH.

الشكل 2 | منطقة SC-pH السفلية تنشأ من الحموضة خلال الكورنيوبتوز، تعبر عن الفيلاغرين، وتتعطل بسبب اضطراب الوصلات الضيقة. أ تصوير المناعة الفلورية لجلد أذن الفأر من فئران مصورة لفيتامين (د)، ميري، وفيلاغرين. شريط القياس، صور مجهرية متداخلة تمثل مقطع Z المعاد تكوينه (الأعلى) وصور مجهرية بتكبير منخفض في مستوى X-Y (أسفل اليسار وأسفل اليمين) لجلد الظهر فئران تم حقنها بـ Hoechst 33242 (أبيض). الأسهم البيضاء تمثل خلايا SG1 ذات السيتوبلازم الأصفر (خلايا SG1 في مرحلة الكورنيوبتوز). مقياس الرسم، 10 (أعلى) و 20 (أسفل اليسار وأسفل اليمين) صور تمثيلية مجهرية متناهية الدقة لمستوى X-Y من جلد الظهر فئران تم حقنها بـ Hoechst 33242 (أبيض). مقياس الرسم، قيم الخلايا القرنية و

خلايا SG1 في مرحلة الكورنيوبتوزيس الثانية في منطقة SC-pH السفلية خلايا من ثلاثة حيوانات مستقلة بيولوجيًا، على التوالي). منخفض و تكبير عالي صور تمثيلية مستوية متحدة المحاور لجلد البطن لحديثي الولادة VH148GmC و Cldn1 VH148GmC فئران. شريط القياس، (هـ) و (ف). ج المجهر المناعي الفلوري لجلد الأذن من B6.Cldn K14-CreERT VH148GmC فئران لتصوير الزهرة، mCherry، والفيلاغرين. شريط القياس، تُعرض البيانات كمتوسط SEM ومجمعة من ثلاثة تجارب ( ) أو تمثل على الأقل ثلاثة تجارب مستقلة (أ-ج، هـ-و). غير ذات دلالة، اختبار مان-ويتني ثنائي الجانب (د). تم توفير بيانات المصدر كملف بيانات مصدر.

الشكل 3 | منطقة SC-pH العليا تظهر خاصية مشابهة للتكيف. أ صور مجهرية تمثيلية بتكبير عالٍ في مستوى X-Y لجلد الظهر لـ فئران منقوعة في STELLA Fluor 650. تُظهر الصور المدمجة لكوكب الزهرة (الأخضر)، وmCherry (الأحمر)، وSTELLA Fluor 650 (الأزرق). شريط القياس، . ب صور تمثيلية مجهرية بتكبير عالٍ لمستوى X-Y لجلد الظهر والبطن من الفئران المعالجة مع أو بدون مجموعة متنوعة من العوازل الحمضية ( مقياس، . في المناطق العليا من SC-pH للجلد الظهري أو البطني الفئران المعالجة بدون عازل (بدون ماء) ومخازن pH المختلفة ، و 7.2) ، و22 نقطة من ثلاثة حيوانات مستقلة بيولوجيًا، على التوالي). في مناطق SC-pH الوسطى الظهرية أو
جلد البطن الفئران المعالجة بدون عازل (بدون ماء) ومخازن pH المختلفة ، و 7.2 ) ( ، و 25 نقطة من ثلاثة حيوانات مستقلة بيولوجيًا، على التوالي). درجة الحموضة في مناطق SC-pH السفلية من جلد الظهر أو البطن من الفئران المعالجة بدون عازل (بدون ماء) ومخازن مختلفة من الرقم الهيدروجيني ، و 7.2 ) ( ، و 25 نقطة من ثلاثة حيوانات مستقلة بيولوجيًا، على التوالي). تُعرض البيانات كمتوسط SEM ومجمعة من ثلاثة تجارب ( ) أو تمثل على الأقل ثلاث تجارب مستقلة (أ و ب). ، ; تم استخدام تحليل التباين أحادي الاتجاه كروسكال-واليس متبوعًا باختبار دان بعد الاختبار (ج-هـ). تم توفير بيانات المصدر كملف بيانات المصدر.

نظرًا لأن ميكروبات الجلد تعيش على سطح الطبقة القرنية، قمنا بتقييم ما إذا كانت وجودها ضرورية للحفاظ على درجة حموضة الطبقة العليا منطقة. لقد عالجنا فئران خالية من مسببات الأمراض المحددة (SPF) مع خليط من الأجسام المضادة تم الإبلاغ عنه سابقًا لتقليل عبء ميكروبيوم الجلد وأجرينا تصوير SC-pH داخل الكائن الحي (الشكل 4 أ، ب، والفيلم التكميلي 4). وجدنا أن معظم منطقة SC-pH العلوية من
الفئران التي تلقت المضادات الحيوية أصبحت حمضية، وانخفضت منطقة pH العلوي المحايد بشكل كبير، مما يشير إلى أن ميكروبيوتا الجلد يمكن أن تعادل pH منطقة SC-pH العلوية. لتأكيد ذلك، قمنا بإنشاء خالي من الجراثيم ( الفئران وأجرينا تصوير pH داخل الجسم باستخدام SC (الشكل 4c و d، والفيلم التكميلي 4). اكتشفنا أن درجة حموضة الجزء العلوي منطقة كانت مستويات الفئران (pH 6.05 [95% CI 5.97-6.13]) أقل بشكل ملحوظ من تلك الخاصة بسلالة B6. فئران SPF (pH 6.65 [95% CI 6.58-6.72]). ومع ذلك، B6.

الشكل 4 | يتمتع الجزء العلوي من SC-pH برقم هيدروجيني قريب من الحياد بفضل ميكروبيوتا الجلد. أ صورة تمثيلية مجهرية متماسكة في مستوى X-Y بتكبير منخفض و (ب) صور مقطعية معاد تشكيلها في مستوى Z الفئران التي لم تتلق أي علاج أو مضادات حيوية. مقياس الرسم، 10 (أ) و (ب). صور تمثيلية معاد تشكيلها بتقنية التصوير المجهري الضوئي من مستوى X-Y منخفض التكبير و (د) مقاطع Z لـ SPF و GF و B6.VmC المشتركة في السكن فئران (صديقة سابقة). شريط القياس، و درجة الحموضة في الجزء العلوي من SC لـ SPF و GF و B6 المشتركة. فئران (أعلى، ، و 25 حقلًا من ثلاثة مستقلين بيولوجيًا
الحيوانات، على التوالي) و SG1 من SPF و GF و B6 المشتركة في السكن. VmC فئران (أسفل، ، و 27 مجالًا من ثلاثة حيوانات مستقلة بيولوجيًا، على التوالي). تُعرض البيانات كمتوسط SEM ومجمعة من ثلاثة تجارب (e) أو تمثل على الأقل ثلاث تجارب مستقلة (a-d). ; NS غير دال، اختبار كروسكال-واليس ANOVA أحادي الاتجاه يليه اختبار دان بعد ذلك (e). تم توفير بيانات المصدر كملف بيانات المصدر.

فئران GF التي تعيش معًا مع B6.VmC أظهرت فئران SPF (المعروفة باسم B6.Ex-GF) مستوى SC علوي محايد مع قيم pH مشابهة (pH 6.81 [95% CI 6.71-6.90]) لفئران B6.VmC. فئران SPF (الشكل 4e). بشكل جماعي، تشير هذه النتائج إلى أن وجود ميكروبات الجلد يعادل منطقة pH SC العلوية القريبة من الحيادية.

المكورات العنقودية الذهبية، وهي مسببة بارزة للأمراض الجلدية، ترتبط عادةً بأمراض الجلد الالتهابية مثل التهاب الجلد التأتبي. يُذكر أن وفرة المكورات العنقودية الذهبية مرتفعة على جلد مرضى التهاب الجلد التأتبي، وتوزيعها يختلف عن ذلك الذي يُرى في الأصحاء. . ومع ذلك، لا يزال غير واضح كيف يتوطن S. aureus في SC في التهاب الجلد التأتبي. لمراقبة توطين S. aureus في SC، قمنا بتلقيح جلد أذن B6.VmC SPF (المشار إليه فيما بعد بـ الفئران، مع ضمان عدم وجود .
المكورات العنقودية الذهبية، مع بروتين فلوري قابل للتحفيز بالأرجواني (VFP) ملصق على المكورات العنقودية الذهبية وأجريت تصوير pH تحت الجلد الحي (الشكل 5 أ والشكل التكميلية 4 أ). على الرغم من أنه تم الإبلاغ عن أن المكورات العنقودية الذهبية تتوطن على سطح SC وجدنا أنه أيضًا تم تحديده في أسفل منطقة pH العلوي المحايد للطبقة القرنية (الشكل 5ب والفيلم التوضيحي 5). ومن الجدير بالذكر أن توزيع S. aureus كان محدودًا حتى فوق منطقة pH القرنية المتوسطة الحمضية، ولم تكن هناك أي علامات على وجود S. aureus في منطقة pH القرنية المتوسطة الحمضية لمدة ثلاثة أسابيع على الأقل (الشكل التوضيحي 4ب).

بعد ذلك، قمنا بفحص توزيع S. aureus عند حدوث الالتهاب. قمنا بتطبيق MC903 على آذان فئران لتحفيز التهاب الجلد الشبيه بمرض الزهايمر (الشكل التكميلي 4c). تم الحفاظ على المناطق الثلاثة ذات مستويات الحموضة SC-pH بشكل تدريجي؛ ومع ذلك، أصبحت جميع المناطق الثلاثة أكثر سمكًا في الفئران التي تلقت MC903 (على الأرجح بسبب التهاب الجلد) مقارنة بتلك التي تم علاجها بالمركب الوهمي (الشكل التكميلي 4d، e). لم يكن هناك فرق في مستوى الحموضة في الجزء العلوي (المركب الوهمي

مقابل ) أو مناطق pH المنخفضة SC- (المركبة [ ] مقابل MC903 [ ]) بين المجموعتين؛ ومع ذلك، كانت منطقة SC الوسطى تميل إلى أن يكون لديها pH أعلى في الفئران المعالجة بـ MC903 مقارنة بالفئران المعالجة بالمركبة (المركبة [pH 5.39 ] مقابل MC903 [ ]) (الشكل التوضيحي التكميلي 4f).

بعد ذلك، قمنا بتطبيق S. aureus المعلمة بـ VFP على آذان B6.VmC الفئران التي تلقت MC903 (الشكل 5c، d). وجدنا أن S. aureus استعمرت في أسفل منطقة pH العليا المحايدة للجلد تحت التهاب الجلد الناتج عن MC903. مشابهًا للتحكم في الحالة الثابتة، لم تكن هناك إشارات لـ S. aureus في منطقة pH الحمضية المتوسطة للجلد (الشكل 5d وفيلم إضافي 5). بالإضافة إلى ذلك، قمنا بإجراء تصوير زمني.

الشكل 5 | منطقة SC-pH متوسطة الحموضة تمنع غزو S. aureus. أ، ب B6. تم تلقيح الفئران بـ . الذهبية في اليوم الأول. تم تحليل الفئران في اليوم الرابع.
تصميم تجريبي. ب) مستوى منخفض من التكبير في مستوى X-Y (يسار) وصور تمثيلية معاد تكوينها باستخدام التصوير المجهري الفلوري في مستوى منخفض (وسط) أو مرتفع (يمين، المنطقة المحددة بالخطوط الحمراء والزرقاء في الوسط) مقطوعة في مستوى Z. الأسهم الوردية تمثل إشارات S. aureus. تم تطبيق MC903 على B6.VmC تم معالجة فئران SPF يوميًا لمدة 7 أيام (الأيام 1-7) لتحفيز التهاب الجلد (فئران معالجة بـ MC903). تم بعد ذلك تلقيح الفئران بـ S. aureus في اليوم 8 وتم تحليلها في اليوم 12. ج تصميم التجربة. د صور تمثيلية مجهرية متداخلة منخفضة التكبير في مستوى X-Y (يسار) و Z مقطعة معاد تشكيلها (وسط). صور تمثيلية مجهرية متداخلة عالية التكبير في مستوى X-Y (الزاوية العليا اليمنى، المنطقة المحددة بخطوط حمراء في اليسار) و Z مقطعة معاد تشكيلها (الزاوية السفلى اليمنى، المنطقة المحددة بخطوط زرقاء في الوسط). هـ، و تم تلقيح الفئران المعالجة بـ MC903 بـ . الذهبية في اليوم الثامن وتم تحليلها في الأيام 13 و 13.25 و 14. التصميم التجريبي. صور تمثيلية بتقنية الزمن المتقطع لـ كشف الـ . aureus في SC من B6.V-
فئران SPF. الخط الأزرق المتقطع يمثل منطقة الـ . إشارة(s) aureus. تم تلقيح الفئران المعالجة بـ MC903 بـ S. aureus في اليوم الثامن وتمت معالجة الفئران بمخازن pH مختلفة مرة واحدة يوميًا في الأيام 9-12. تم تحليل الفئران في اليوم 13. ج تصميم التجربة. سمك أذن الفئران التي تم علاجها موضعياً بمخازن مختلفة من الرقم الهيدروجيني كل) بعد تطبيق MC903 و S. aureus. صور تمثيلية مجهرية متماسكة ذات تكبير منخفض في مستوى X-Y وشرائح Z للمجسمات التي تلقتها الفئران باستخدام محاليل عازلة محايدة (pH 6.6) وقلوية (pH 10.3). تمثيل مستوى X-Y (الزاوية العليا اليسرى، تكبير منخفض: الزاوية السفلى اليمنى، منطقة محددة بخطوط زرقاء في الزاوية العليا اليسرى) و -صور تمثيلية معاد تشكيلها مقطعة باستخدام تقنية التصوير المجهري التداخلي . دخلت S. aureus طبقة الخلايا الحية (أسفل SC) في الفئران التي تلقت محلول قاعدي (pH 10.3). السهم الوردي يمثل S. aureus. البيانات تمثل على الأقل ثلاث تجارب مستقلة (b، d، f، h-j). مقياس الرسم، تُعرض البيانات كمتوسط SEM (س). *** تحليل التباين الأحادي مع اختبار مقارنة دانييت (h). يتم توفير بيانات المصدر كملف بيانات المصدر.
تصوير الحبل الشوكي من B6.VmC الفئران التي تلقت MC903 و VFPlabeled . الذهبية. وجدنا أن الملقحة تضاعف S. aureus أفقيًا في أسفل منطقة SC-pH العلوية القريبة من الحيادية (الشكل 5f). علاوة على ذلك، وجدنا أن تضاعف S. aureus كان أكثر كبحًا في الظروف الحمضية مقارنةً بالظروف المحايدة أو القلوية في المختبر (الشكل التكميلية 4g). بشكل جماعي، تشير هذه النتائج إلى أن أسفل منطقة SC-pH العلوية القريبة من الحيادية تعمل كموطن لـ استعمار المكورات العنقودية الذهبية.

نظرًا لأن منطقة SC-pH المتوسطة الحمضية لم تظهر أي إشارات لـ S. aureus، قمنا بعد ذلك بفحص تأثير الحموضة في منطقة SCpH المتوسطة. بعد أن طبقنا MC903 على آذان B6.VmC تم تطبيق بكتيريا S. aureus المعلمة بـ VFP على الفئران لمدة 7 أيام (الأيام 1-7) في اليوم الثامن، وتم استخدام محاليل ذات pH مختلف مرة واحدة يوميًا في الأيام (أربعة أيام) إلى الأذنين، وتم تحليلها في اليوم 13 (الشكل 5 ج). B6.VmC أظهرت الفئران التي تلقت محلولاً بتركيز pH 10.3 التهاباً جلدياً معززاً، مما أدى إلى ظهور جلد الأذن أكثر سمكاً بشكل ملحوظ مقارنة بالفئران التي تلقت محلول pH 6.6 (الشكل 5h). كشفت التصوير الحي لـ S. aureus وتوزيع SC-pH أنه بينما في الفئران التي تلقت محلول pH 6.6 تم استعمار S. aureus أفقيًا في أسفل منطقة SC-pH العلوية تقريبًا المحايدة، حيث قامت تطبيقات محلول pH 10.3 بتحييد المناطق الوسطى من SC-pH، مما مكن S. aureus من الدخول إلى المناطق الوسطى أو السفلية من SC-pH (الشكل 5i) وحتى إلى SG (طبقة الخلايا الحية) (الشكل 5j والشكل التكميلية 4h والفيلم التكميلية 6). وبالتالي، تشير هذه النتائج إلى أن منطقة SC-pH الحمضية الوسطى هي طبقة الحماية الحمضية التي تعمل كحاجز واقي ضد S. aureus.

يتم الحفاظ على سمك الطبقة القرنية من خلال التخلص المستمر من طبقة الخلايا القرنية الخارجية عبر عملية تُعرف بالتقشر. يتم تنفيذ التقشر من خلال تحلل الكورنيوديسموسومات (المعنية بالتلاصق بين الكورنيوسيت) بواسطة أحد أعضاء عائلة الببتيداز المرتبطة بالكاليكريين (KLK). تم اعتبار ملف تعريف الرقم الهيدروجيني للطبقة القرنية لتنظيم النشاط التحفيزي لإنزيمات KLKs وضمان حدوث التقشر في الموقع المناسب في . في الظروف العادية، يسمح الرقم الهيدروجيني المحايد في الطبقة السفلية من SC لمثبط كازال من نوع اللمفوي الظهاري (LEKTI) بتعطيل KLKs (KLK5 و KLK7 و KLK14)؛ ومع ذلك، فإن الظروف الحمضية في الطبقة العليا تمنع LEKTI، مما يسمح لـ KLKs بالعمل وتعزيز تقشير الجلد. . هنا، كشفنا عن ملف تعريف تدريجي للرقم الهيدروجيني بقيم pH تبلغ , 5.4 و 6.7 (نموذج pH7.0_6.0_5.4_6.7) في الطبقات SG1 و SC السفلي و SC الأوسط و SC العلوي، على التوالي. لتوضيح الأهمية البيولوجية لهذا الملف التدريجي للرقم الهيدروجيني، قمنا ببناء نموذج رياضي لفهم تنظيم النشاط التحفيزي الفعال لـ KLK في SCs مع ملفات تعريف pH مختلفة. قمنا بنمذجة العمليات المعتمدة على الرقم الهيدروجيني (i) التنشيط من pro-KLKs إلى KLKs النشطة، (ii) تثبيط KLKs النشطة بواسطة LEKTI، (iii) تحلل LEKTI، و (iv) التحلل البروتيني بواسطة KLKs النشطة (الشكل 6a) (انظر الطرق).

أعاد ملف تعريف SC-pH التدريجي إنتاج الزيادة في النشاط التحفيزي الفعال لـ KLK تجاه سطح SC، مما يشير إلى
ضرورة وجود منطقة SC-pH محايدة علوية على سطح SC للتقشير (الشكل 6b). مقارنةً بنموذج pH7.0_6.0_5.4_6.7 التدريجي، أظهر نموذج التدرج pH7.0_5.4 نشاط KLK التحفيزي الفعال المتناقص تجاه سطح SC (الشكل 6c). لم يتمكن هذا الملف التدريجي من إنتاج البيئة الدقيقة المطلوبة لتنفيذ التقشير على سطح SC. بالإضافة إلى ذلك، أظهر نموذج التدرج pH 7.0_5.4_6.7 زيادة مبكرة في نشاط KLK من SC الأوسط ولكن زيادة أبطأ في نشاط KLK في SC العلوي عند مقارنته بنموذج pH7.0_6.0_5.4_6.7 التدريجي. تشير هذه الملاحظة إلى أن الملف التدريجي للرقم الهيدروجيني أكثر ملاءمة لتعديل تشغيل وإيقاف نشاط KLK التحفيزي في منطقة SC-pH المحايدة العلوية (الشكل 6d).

قمنا أيضًا بمحاكاة تأثير النشاط التحفيزي الفعال لـ KLK على ملفات تعريف SC-pH المعطلة، نماذج pH 5.4 الموحد و pH 7.0 الموحد. فشل نموذج pH5.4 الموحد في زيادة النشاط التحفيزي الفعال لـ KLK في جميع أنحاء منطقة SC (الشكل التكميلي 6c) بسبب الرقم الهيدروجيني المنخفض الذي لا يمكنه استغلال النشاط المحتمل لـ KLK مقارنةً بنموذج pH7.0_6.0_5.4_6.7 التدريجي ولم يتمكن من بدء التقشير على سطح SC. على النقيض من ذلك، أدى نموذج pH 7.0 الموحد إلى زيادة مفاجئة في النشاط التحفيزي الفعال لـ KLK في النصف السفلي من SC بسبب الرقم الهيدروجيني العالي الذي يستغل بالكامل النشاط المحتمل لـ KLK في هذه المنطقة (الشكل التكميلي 6c). قد يؤدي النشاط التحفيزي الفعال العالي لـ KLK إلى بدء التقشير حتى في النصف السفلي من SC، مما يؤدي إلى نمط جلد غير طبيعي. تشير هذه النتائج إلى الضرورة البيولوجية لوجود عدة مناطق بمستويات pH مختلفة في SC، كما هو الحال في نموذج pH7.0_6.0_5.4_6.7 التدريجي.

أخيرًا، قمنا بفحص تأثير تثبيط نشاط KLK التحفيزي في منطقة SC-pH العلوية على التقشير في الجسم الحي. تم ذلك عن طريق تطبيق محلول عازل pH 3.5، الذي يثبط بشكل كبير النشاط التحفيزي لـ KLK الفأر مقارنةً بمحلول عازل pH 6.6، على أذن الفئران B6. VmC لمدة أربعة أيام متتالية (الشكل التكميلي 6d، e). الفئران التي تلقت محلول pH 3.5 حافظت على ثلاث مناطق SC-pH تدريجية؛ ومع ذلك، أظهرت سمكًا أكبر في SC مقارنة بالفئران التي تلقت محلول pH 6.6 (الشكل التكميلي 6e). تشير هذه النتائج إلى أن تثبيط نشاط KLK التحفيزي يؤدي إلى تثبيط التقشير، مما يعزز سمك SC. كانت هذه النتائج متوافقة مع نموذجنا الرياضي.

بشكل عام، تشير نتائج المحاكاة إلى أن المناطق الثلاثة التدريجية للرقم الهيدروجيني تحفز LEKTI للارتباط بـ KLKs لتثبيط نشاطها التحفيزي في منطقة SC-pH الحمضية المعتدلة السفلية. وهذا يسمح أيضًا لـ KLKs بالبقاء في حالة غير نشطة في منطقة SC-pH الحمضية المتوسطة وتنشيطها في منطقة SC-pH المحايدة تقريبًا العلوية لتنفيذ التقشير. علاوة على ذلك، تشير نتائجنا إلى أن الكيراتينوسيتات تخضع للتمايز، مما يؤدي إلى تطوير تقسيم ثلاثي للرقم الهيدروجيني، والذي يحافظ على سمك ووظيفة الحاجز لـ SC لإنتاج توازن SC (الشكل 6e).

بينما درست الدراسات السابقة SC-pH باستخدام أدوات مقيدة إلى حد كبير لقياس الرقم الهيدروجيني خارج الخلية في SC (مثل تطبيق

إلكترود pH على الجلد)، قمنا بإجراء تصوير حي عالي الدقة للرقم الهيدروجيني داخل الخلايا في SC باستخدام وفئران VH148GmC . أظهرت نتائجنا أن SC يحتوي على ثلاث مناطق pH تدريجية متميزة (حمضية منخفضة-معتدلة [pH 6.0]، حمضية متوسطة [pH 5.4]، وعالية-محايدة تقريبًا [pH 6.7]). تم العثور على المناطق الثلاثة من SC-pH بشكل شائع عبر أجزاء مختلفة من الجسم، مما يعني
أنها تلعب دورًا في توازن SC. علاوة على ذلك، أظهر الرقم الهيدروجيني خارج الخلية في SC من الكورنيوسيتات باستخدام فئران B6.Display-VmC تقسيمًا ثلاثي المستويات، وكانت قيمة الرقم الهيدروجيني تتطابق مع الرقم الهيدروجيني داخل الخلايا. قد يكون التفسير المحتمل للاختلاف بين بياناتنا والدراسات السابقة هو أن الدراسة السابقة استخدمت طرقًا تؤدي إلى التهاب الجلد أو تذويب الخلايا بين الخلايا.

الشكل 6 | توفر ثلاث مناطق pH تدريجية بيئة ملائمة لتقشير SC. أ نظرة عامة على العمليات المعتمدة على الرقم الهيدروجيني المدرجة في نموذج رياضي لنشاط KLK التحفيزي في SC. تتحرك الكورنيوسيتات من حدود SG/SC نحو سطح SC عبر تجديد البشرة. يتم إطلاق pro-KLKs غير النشطة و LEKTI في حدود SC/SG من خلايا SG1. بعد ذلك، يتم تنشيط pro-KLKs إلى KLKs (شكل نشط) بواسطة KLKs وmesotrypsin. KLKs قادرة على تحلل الكورنيوديسموسومات عبر التحلل البروتيني، مما يبدأ التقشير. LEKTI تثبط النشاط التحفيزي لـ KLKs عن طريق تشكيل معقد KLK-LEKTI بشكل عكسي، مما يعطل KLK. يقوم mesotrypsin بتحلل LEKTI في معقد KLK-LEKTI
. الأرقام في الشكل تتوافق مع معادلات النموذج. تمثل الخطوط الحمراء المتقطعة العملية المعتمدة على الرقم الهيدروجيني. ملفات تعريف النشاط التحفيزي الفعال لـ KLK , المعلمات، ومخطط لـ KLK و LEKTI في نموذج pH7.0_6.0_5.4_6.7 التدريجي، (ج) نموذج التدرج pH 7.0_5.4، و (د) نموذج التدرج pH7.0_5.4_6.7. هـ. مخطط وملخص لوظيفة ثلاث مناطق SC-pH التدريجية. تم تعديل صورة SC و SG (يمين) في الشكل 6e بإذن من مطبعة جامعة أكسفورد: المناعة الدولية “تشريح تشكيل وبنية ووظيفة الحاجز للطبقة القرنية” بواسطة ماتسوي تي وآخرون. حقوق الطبع والنشر 2015.
dهن في , كلاهما يمكن أن يؤثر على SC-pH، بينما كان تصويرنا الحي غير جراحي.

تتواجد بروتينات البروتياز المختلفة في جميع أنحاء ؛ ومع ذلك، أكدنا أن كل من بروتينات Venus-mCherry/VenusH148G-mCherry ظلت موجودة بكثرة في طبقة SC. استنادًا إلى هذه الأدلة وخصائص التكيف مثل SC العلوي، قمنا بقياس التغيرات في الفلورية في Venus و mCherry بنجاح من خلال تطبيق محاليل pH المختلفة على مناطق SC العلوية. تشير هذه النتائج إلى أن التعبير عن بروتينات مجس pH النسبية في خلايا SG1 ودمجها في الكورنيوسيتات هي طرق مفيدة لقياس وتصوير SC-pH.

يتكون SC من طبقات من الكورنيوسيتات مع مساحات بين الخلايا مختومة بهياكل دهنية لاميلارية (نموذج “الطوب والملاط”). لقد أعاقت عدم قابلية الذوبان في SC التحليل الشامل، واعتُبر SC حاجزًا متجانسًا . ومع ذلك، باستخدام المجهر الإلكتروني المناعي للفيلاجرين، يمكن تقسيم SC إلى SC السفلي مع الفيلاجرين و SC العلوي بدون فيلاجرين . علاوة على ذلك، أظهر المجهر الإلكتروني الماسح لـ SC أن SC السفلي يتورم عند نقعه في الماء، مما يشكل إدراجات مائية ضخمة بين طبقات الخلايا المجاورة. على النقيض من ذلك، يبقى SC الأوسط تقريبًا غير متأثر بالإجهاد المائي ويحافظ على سمكه. كما يتورم SC العلوي بشكل كبير، مما يؤدي إلى تفكيك تعبئة الألياف داخل الخلايا. تشير هذه النتائج إلى أنه يمكن تقسيم SC إلى ثلاث مناطق متميزة بناءً على قدرتها على اختراق الماء والارتباط. بالإضافة إلى ذلك، كشفت دراستنا السابقة التي أجريت باستخدام TOFSIMS، والتي تتيح تصور توزيع المواد الطبيعية دون استخدام طرق التلوين، أن الأرجينين، وهو مكون رئيسي من عوامل الترطيب الطبيعية المشتقة من الفيلاغرين، كان مركزًا في الطبقة الوسطى من الطبقة القرنية، مما يشير إلى أن هذه الطبقة تلعب دورًا رئيسيًا في ترطيب الجلد. أظهر اختبار النقع في الدراسة أن الطبقة العليا من البشرة تسمح بدخول وخروج أيونات المعادن المختلفة، بينما أظهرت الطبقات الوسطى والسفلى خصائص حواجز مميزة. من خلال صبغ الفيلاغرين باستخدام المناعية الفلورية وتصوير pH البشرة الحي باستخدام STELLA 650 المحتوي على ماء ميلي-كيو، لاحظنا وجود الفيلاغرين وفلورية STELLA 650 في منطقة pH السفلى من البشرة ومنطقة pH العليا من البشرة، على التوالي. تشير هذه النتائج إلى أن المناطق الثلاث التي تم ملاحظتها بواسطة TOF-SIMS تت correspond إلى ثلاث مناطق pH للبشرة. وبالتالي، فإن البشرة ليست طبقة بسيطة أحادية، بل تتمايز إلى ثلاث طبقات محددة بوضوح، حيث يعتبر pH منظمًا رئيسيًا لهذه العملية.

ليس من الواضح كيف يتم تغيير تنظيم الرقم الهيدروجيني في الخلايا الجذعية، مما يؤدي إلى تطوير ثلاث مناطق من الرقم الهيدروجيني في الخلايا الجذعية. أظهرت دراسة حديثة للبروتينات أن ببتيدات ATPase من النوع الفجوي (التي تضخ البروتونات عبر الأغشية البلازمية باستخدام طاقة تحلل ATP) تم اكتشافها من عينات الخلايا الجذعية. . ومع ذلك، لا توجد الميتوكوندريا في الخلايا القرنية، ولا يحدث تخليق ATP عن طريق الفسفرة التأكسدية في الطبقة القرنية. وبالتالي، فإنه من غير الواضح ما إذا كان ATPase من النوع الفجوي نشطًا في الطبقة القرنية ويلعب دورًا في الحفاظ على درجة حموضة الطبقة القرنية. كشفت المجهرية الإلكترونية بالتبريد (cryo-EM) أن تنظيم صفائح الدهون يتغير بشكل جذري في الفجوات بين الخلايا الأولى والخامسة من الطبقة القرنية: (1) نمط شريط واحد مع تكرارية 2.0-2.5 نانومتر، و(2) نمط شريطان مع الدورية نظرًا لأن الرقم الهيدروجيني الأمثل لإنزيمات استقلاب الدهون هو حمضي، نفترض أن إنزيمات استقلاب الدهون قد تساهم في تشكيل تنظيم صفائح الدهون وبالتالي تنظيم الرقم الهيدروجيني للطبقة القرنية.

نظرًا لأن منطقة SC-pH العليا لديها قدرة مشابهة للتكيف وتقوم بضبط درجة الحموضة الخاصة بها بشكل سلبي وفقًا للبيئة الخارجية، وأن ميكروبيوتا الجلد تتواجد على سطح SC، فقد افترضنا أن ميكروبيوتا الجلد تؤثر على درجة الحموضة في منطقة SC-pH العليا. في الواقع، وجدنا أن الفئران الخالية من الجراثيم كانت لديها منطقة SC-pH العليا أكثر حموضة قليلاً من الفئران المحمية من الجراثيم، مما يشير إلى أن ميكروبيوتا الجلد تساهم في تحييد منطقة SC-pH العليا. ومن الجدير بالذكر أن S. aureus كانت تتواجد في ظروف مستقرة واستعمرت السطح السفلي لمنطقة SC-pH العليا في ظروف التهابية. كشفت نتائج اختبار تكاثر S. aureus في المختبر أن S. aureus تفضل بيئة محايدة على الظروف الحمضية. مشابهة لـ S. aureus، تزدهر معظم البكتيريا في مستويات درجة حموضة محايدة (بشكل مثالي عند درجة حموضة 7.0)، ويمكن أن يؤدي الانحراف عن هذه القيم المثلى لدرجة الحموضة إلى تقليل معدل نموها بحوالي وبالتالي، قد تعمل السطح السفلي لمنطقة SC-pH العليا كموطن لتكاثر مسببات الأمراض. علاوة على ذلك، وجدنا أن S. aureus لا تزال قادرة على التكاثر عند pH 5.4، وهو قيمة pH لمنطقة SC-pH المتوسطة الحموضة، على الرغم من عدم وجود إشارات لـ S. aureus. استنادًا إلى هذه النتائج، نفترض أن منطقة SC-pH المتوسطة الحموضة لا يمكنها فقط قمع تكاثر S. aureus، ولكنها أيضًا تحافظ على السلامة الهيكلية و/أو إنتاج الببتيدات المضادة للميكروبات لتحقيق وظيفة الحاجز.

الطبقة القرنية فريدة من نوعها حيث يمكنها الحفاظ على التوازن الداخلي والتمايز إلى ثلاث مناطق من الطبقة القرنية حسب درجة الحموضة، على الرغم من أنها تتكون من خلايا كيراتينية ميتة. الأمراض الجلدية الالتهابية، مثل الصدفية، تؤدي إلى تطور خلايا كيراتينية نواة في الطبقة القرنية (تسمى باراكراتوز) وطبقة قرنية أكثر سمكًا (تسمى أكانتوز) مقارنة بالجلد الصحي الطبيعي، مما يشير إلى خلل في توازن الطبقة القرنية. بالإضافة إلى ذلك، يظهر المرضى الذين يعانون من الإكزيما (مجموعة من الأمراض الجلدية الوراثية المتنوعة) طبقة قرنية سميكة وقشرية بشكل غير طبيعي. بعض الأفراد يظهرون زيادة في تنظيم الجينات المرتبطة بتمايز البشرة وانخفاض في تنظيم الجينات المرتبطة بمكونات الوصلات الضيقة، مما يدل على ضعف تمايز الطبقة القرنية. وبالتالي، فإن فك رموز الآليات الكامنة وراء توليد مناطق SC-pH المتدرجة وتنظيم SC-pH قد يوفر رؤى جديدة لتطوير استراتيجيات علاجية للأمراض الجلدية الالتهابية والسمكية.

تم الحصول على فئران C57BL/6 (B6) وفئران بلا شعر (HR) من شركة Japan SLC Inc. (هاماماتسو، اليابان). B6.Cldn1 تم توفير الفئران من قبل الدكتور م. فوروستي (المعهد الوطني للعلوم الفسيولوجية، أوكازاكي، اليابان). B6.SASP (B6.EGFP تم إنتاج الفئران عن طريق دمج كاسيت EGFP-Neo في موضع جين SASP على الكروموسوم 6 في خلايا ES من خلفية B6 عبر إعادة التركيب المتماثل. لإنشاء B6.SASP (B6.VH148GmC ) الفئران، قمنا بتعديل متجه الإدخال لب6.SASP الفئران عن طريق استبدال cDNA EGFP-Neo بـ Venus -cDNA المCherry باستخدام pSK-VenusH148G-mCherry وCRISPR/Cas9. علاوة على ذلك، فينوس تم إرجاع الطفرة إلى النوع البري (G148 إلى V148) باستخدام التحوير بواسطة أوليغونيوكليوتيد عبر CRISPR/Cas9 لإنشاء B6.SASP (B6.VmC ) الفئران ( الشكل التوضيحي 1a). لإنشاء B6.SASP (B6.عرض في الفئران، تم دمج كاسيت pDisplay-Venus-mCherry في موضع جين SASP على الكروموسوم 6 في خلايا ES من خلفية B6 عبر إعادة التركيب المتجانس. تم التعبير عن بروتين الاندماج Venus-mCherry من متجه التعبير الثديي pDisplay (Invitrogen) كان
م fused في الطرف N إلى تسلسل قائد سلسلة الكلوبيولين المناعي الفأري Ig k، الذي يوجه البروتين إلى المسار الإفرازي، وفي الطرف C إلى مجال غشاء PDGFR، الذي يثبت البروتين في غشاء البلازما، معروضًا على الجانب الخارجي. B6.EGFP , B6.VH148GmC , B6.VmC ، و B6.Cldn1 تم إعادة تهجين الفئران مع فئران HR لمدة لا تقل عن 10 أجيال لإنتاج ، ، و الفئران، على التوالي. تم تزاوج الفئران مع VH148G mCherry فئران لتوليد Cldn1’/ VH148GmCherry فئران. فئران knockout الشرطي الخاص بالجلد Cldn-1 (B6.Cldn1 تم الحصول على K14-CreERT من RIKEN LARGE (رقم الوصول CDB0803K) وتداخلت مع VH148GmC فئران لإنتاج B6.Cldn1 K14-CreERT VH148GmC الفئران. من أجل تحفيز حذف جين Cldn1 المحدد للبشرة، B6.Cldn1 K14-CreERT VH148GmC تم حقن الفئران بحقنة داخل البطن بجرعة 1 ملغ من التاموكسيفين لمدة 5 أيام، وتم استخدام الفئران في التجربة بعد تسعة أيام من آخر حقنة تاموكسيفين. لتوليد فئران، إعادة إنتاج خالية من الجراثيم تم إجراء التجربة على الفئران في مرافق الحيوانات الجنوبيوتية بجامعة كيو. تم الاحتفاظ بفئران GF في عوازل جنتوبيوتيك فردية حتى التحليل مع 12 ساعة من الضوء دورة مظلمة عند درجة حرارة مضبوطة ) ورطوبة ( ) مع الوصول المجاني إلى الماء المعقم ونظام غذائي قياسي مخبري معقم. بالنسبة للإيواء المشترك، تم إيواء الفئران SPF و GF في نفس القفص تحت ظروف SPF لمدة سبعة أيام. جميع الفئران باستثناء B6.VmC تم الحفاظ على فئران GF وتربيتها في مرافق حيوانية خالية من مسببات الأمراض في فرع ريكين في يوكوهاما أو كلية الطب بجامعة كيو مع 12 ساعة من الضوء. دورة مظلمة عند درجة حرارة مضبوطة ) ورطوبة ( ) مع الوصول المجاني إلى الماء ونظام غذائي قياسي من طعام المختبر (مرباة بواسطة سلالات). لم يتم اعتبار الجنس في هذه الدراسة. الفئران التي تتراوح أعمارها بين 3-6 أشهر (باستثناء Cldn1 VH148GmCherry تم استخدام الفئران، التي تموت في غضون يوم واحد من الولادة، في جميع التجارب لأن خصائص الكورنيوبتوزيس لا تتغير في هذا النطاق. .

معلومات الفئران المستخدمة في كل شكل هي كما يلي.
الشكل 1: في الأشكال 1ب، 1 ذكر، و2 إناث تم تحليل الفئران في سن 16-27 أسبوعًا. في الأشكال 1c و d، ذكرين وأنثى واحدة. تم تحليل الفئران في سن 12-23 أسبوعًا. في الأشكال 1e-g، 3 ذكور وأنثى واحدة تم تحليل الفئران في سن 23-27 أسبوعًا. في الأشكال 1 هـ و i، تم عرض 2 ذكر و 1 أنثى من سلالة B6. تم تحليل الفئران في سن 20-27 أسبوعًا.

الشكل 2: في الأشكال 2أ، 2 ذكر و1 أنثى تم تحليل الفئران في سن 16-21 أسبوعًا. في الأشكال. ذكر واحد وأنثى واحدة تم تحليل الفئران في سن 12-15 أسبوعًا. في الأشكال 2e و f، تمثل 2 ذكر و 1 أنثى VH148GmC فئران في سن 19-22 أسبوعًا وذكرين وأنثى واحدة حديثة الولادة (عمرها يوم واحد) Cldn1 VH148GmCherry تم تحليل الفئران. في الأشكال 2g، ذكر واحد واثنتان من الإناث من B6.Cldn1 تم تحليل فئران K14-CreERT في سن 12-13 أسبوعًا.

الشكل 3: في الشكل 3أ، 3 ذكور تم تحليل الفئران في سن 13-21 أسبوعًا. في الأشكال 3ب-هـ، 2 ذكور و1 أنثى تم تحليل الفئران في سن 12-16 أسبوعًا.

الشكل 4: في الشكل 4أ، ب، ذكر واحد واثنتان من الإناث من B6. تم تحليل الفئران في سن 16-23 أسبوعًا. في الأشكال 4c-e، 3 ذكور من B6.VmC SPF، 3 ذكر B6.VmC GF، و 3 ذكور B6. تم تحليل الفئران السابقة للحبيبة في سن 20-23 أسبوعًا.

الشكل 5: في الأشكال 5ب، د، وف، 2 ذكور و1 أنثى من B6. تم تحليل الفئران في سن 12-19 أسبوعًا. في الشكل 5h، 24 ذكر من B6.VmC فئران SPF (4 ذكور B6). تم تحليل الفئران SPF في كل مجموعة) في عمر 20-23 أسبوعًا. في الأشكال 5i، 6 ذكر B6.VmC فئران SPF (3 ذكر B6.VmC تم تحليل فئران SPF في كلا المجموعتين في سن 20-23 أسبوع. في الأشكال 5j و 3 ذكر B6. VmC تم تحليل فئران SPF في سن 20-23 أسبوعًا.
الشكل التكميلي 1: في الشكل التكميلي 1ب، 1د، و1ف، تم اشتقاق خلايا SG1 من ذكرين وأنثى واحدة تم تحليل الفئران في سن 18-22 أسبوعًا. في الشكل التوضيحي 1c و1e و1g، تم اشتقاق خلايا SG1 من 3 ذكور VH148GmC. تم تحليل الفئران في سن 12-14 أسبوعًا.
الشكل التكميلي 2: في الشكل التكميلي 2a-c، ذكران وأنثى واحدة من VH148GmC تم تحليل الفئران في سن 12-22 أسبوعًا. في الأشكال 2d و e، تمثل 1 ذكر و 2 أنثى. تم تحليل الفئران في سن 14-23 أسبوعًا.
الشكل التكميلي 3: في الشكل التكميلي 3أ و 3ب، 2 ذكر و 1 أنثى في سن 12-20 أسبوعًا فأران وذكر واحد واثنتان من الإناث تم تحليل الفئران في سن 14-23 أسبوعًا. في الشكل التكميلي 3c، 3 ذكور من VH148GmC تم تحليل الفئران في سن 12-20 أسبوعًا. في الشكل التكميلية 3d و e، تم استخدام ذكر واحد واثنتين من الإناث من B6.Cldn1 فئران K14-CreERT في سن 12-13 أسبوعًا وذكرين وأنثى واحدة الفئران في سن تم تحليل الأسابيع. في الشكل التكميلي 3f، ذكر واحد واثنتان من الإناث من B6.Cldn1 تم تحليل فئران K14-CreERT في سن 12-13 أسبوعًا.
الشكل التكميلي 4: في الشكل التكميلي 4b، 2 ذكر و 1 أنثى من B6.VmC تم تحليل الفئران في سن 12-19 أسبوعًا. في الشكل التكميلية. ذكر وامرأتان فئران (ذكران و أنثى واحدة من نوع B6). تم تحليل فئران SPF في كلا المجموعتين في سن 12-19 أسبوعًا.
الشكل التوضيحي الإضافي 6: في الشكل التوضيحي الإضافي 6e و f، 2 ذكر و 1 أنثى تم تحليل الفئران في سن 20-23 أسبوعًا.

تم عزل خلايا SG1 من جلد الظهر لـ و VH148GmC الفئران، كما تم وصفها سابقًا، مع بعض التعديلات باختصار، تم تخدير الفئران عن طريق الحقن داخل البطن بمزيج من ميديتوميدين-ميدازولام-بوتورفانول (MMB) ). بعد ذلك، تم حقن السم exfoliative المأشوب-A (ETA) المذاب في محلول ملحي مخفف بالفوسفات (PBS) يحتوي على 1 مللي مول من CaCl 2 في جلد الظهر لـ و الفئران والفئران الموضوعة في لمدة 60 دقيقة. تم بعد ذلك تقشير ورقة ETA، التي تتكون من SG1/2/SC، ميكانيكياً من الجلد. بعد 5 دقائق من معالجة التربسين، تم الحصول على خلايا SG1 الإيجابية لـ Venus-mCherry وخلايا SG2 السلبية لـ Venus-mCherry المشتقة من VmC. ورقة ETA للفأر أو خلايا SG1 الإيجابية لـ VenusH148G-mCherry وخلايا SG2 السلبية لـ VenusH148G-mCherry المشتقة من VH148GmC تم وضع ورقة ETA للفأر في محاليل ذات قيم pH مختلفة )، مع النيجرسين ( ) وفالينوميسين ( ) (كلاهما FUJIFILM Wako Pure Chemical Co.، أوساكا، اليابان). كانت المحاليل العازلة تتكون من 50 مليمول من العازلة عند درجة حموضة 150 مليمول من NaCl. تم استخدام محاليل الأسيتات والفوسفات لضبط قيم درجة الحموضة إلى و 5.8-8.0، على التوالي. تم تحديد شدة الفلورية لبروتينات فينوس، فينوسH148G، وmCherry في خلايا SG1 باستخدام عدسة هدف غمر HC PL APO CS2 63x/NA 1.40 على ميكروسكوب تيس SP8 المقلوب (لايكا ميكروسستمز، ويتزلار، ألمانيا). أ تم استخدام فلتر الانبعاث للكشف عن فلوريسcence الزهرة أو VenusH148G عند التحفيز بـ ليزر OPSL، و تم استخدام فلتر الانبعاث لفلورية المCherry عند التحفيز بـ ليزر OPSL. للحصول على الصورة، تم مسح الطائرات بدقة 361 نانومتر لكل بكسل بسرعة 400 هرتز باستخدام ليزر تم ضبط قوته على (i) لزهرة و لـ mCherry أو (ii) لزهرة و لـ mCherry لخلايا SG1 من الفئران و (iii) لـ VenusH148G و لـ mCherry أو (iv) لزهرة و لـ mCherry لخلايا SG1 من VH148GmC فئران. صور في مستوى X-Y (30) مع تم إنشاء المسافات لكل طائرة.

تم تحليل الصور باستخدام فيجي [الصورة]، المعاهد الوطنية للصحة (NIH)، بيثيسدا، ماريلاند، الولايات المتحدة الأمريكية]. تم عرض صور خلايا SG1 باستخدام نص “MAX intensity”. تم تحديد ثلاثين خلية SG1 بواسطة منطقة الاهتمام (ROI)، وتم قياس متوسط كثافاتها باستخدام مدير منطقة الاهتمام. تم قياس كثافة الخلفية بطريقة مماثلة. تم حساب التغيرات في كثافة الفلورسنت كمتوسط كثافة منطقة الاهتمام ناقص كثافة الخلفية لكل صورة. فينوس/ميري تشيري وفينوس تم ملاءمة نسب فلورية mCherry والنسب النسبية عند قيم pH المختلفة إلى نموذج انحدار غير خطي على شكل سيغمويد باستخدام برنامج GraphPad Prism 9.

تصوير pH داخل الجسم باستخدام SC (تصوير الشرائح X وY وZ)
تم إجراء التصوير الحي للفئران كما هو موصوف سابقًا، مع بعض التعديلات. باختصار، تم تخدير الفئران عن طريق الحقن داخل البطن بمزيج من ميديتوميدين-ميدازولام-بوتورفانول (MMB) (0.75:4:5). تم لصق عينات من جلد الظهر والبطن والأذن والذيل وكف اليد من الفئران على زجاج ميكرو. سمك ، C4050HT؛ شركة ماتسunami للزجاج، أوساكا، اليابان) تحتوي على عينة من ماء ميلي-كيو، ماء ميلي-كيو مع STELLAFluor 650 خالي من COOH (Goryo Chemical، سابورو، اليابان)، أو محاليل عازلة بقيم pH مختلفة (4.1-8.0). ثم تم تثبيتها على منصة مسخنة (TPi-SQH26؛ توكاي هيت، فوجينوميا، اليابان) عند تم الحصول على الصور باستخدام عدسة مكبرة HC PL APO CS2 63x/NA 1.40 أو HC PL APO CS2 100x/NA 1.40 باستخدام عدسة غمر مع ميكروسكوب تداخل ضوئي مقلوب TCS SP8 (لايكا للميكروسكوبات). تم استخدام فلتر الانبعاث للكشف عن إشارات هوشت 33342 عند التحفيز باستخدام ليزر ديود. تم استخدام فلتر الانبعاث لكوكب الزهرة وكوكب الزهرة الكشف عند التحفيز باستخدام ليزر OPSL بطول موجي 488 نانومتر، و تم استخدام فلتر الانبعاث للكشف عن mCherry عند التحفيز باستخدام ليزر OPSL. للحصول على صور بتكبير منخفض، تم مسح الطائرات بدقة 91 نانومتر لكل بكسل، مع وجود تباعد Z بين الشرائح للحصول على صور عالية التكبير، تم مسح مستويات X-Y الفردية بدقة 45 نانومتر لكل بكسل. تم ضبط قوة الليزر على (i) لزهرة و لـ mCherry (البطن، الأصابع، والجلد) أو (ii) لزهرة و لـ mCherry (جلد الظهر والأذن) لالتقاط الصور لـ فئران، (iii) لـ VenusH148G و لـ mCherry لالتقاط الصور لـ VH148GmC كلد ن 1 VH148GmCherry ، و B6.Cldn K14-CreERT VmC الفئران، و (iv) لزهرة و لـ mCherry لالتقاط الصور لـ B6.Display- الفئران. في بعض التجارب، محلول ملحي يحتوي على تم حقن Hoechst 33342 في الماء المقطر تحت الجلد في جلد الظهر لـ الفئران قبل 24 ساعة من التصوير.

لكشف بكتيريا المكورات العنقودية الذهبية المعلمة بالفلوريسنت في الأذن الخارجية للفئران، تم تلقيح الفئران بالبكتيريا ثم تم تخديرها على وسادة تدفئة عبر حقن داخل البطن لمزيج MMB (0.75:4:5) أو مزيج من البنتوباربيتال داخل البطن. حقن و استنشاق الإيزوفلورين. تم وضع الفئران في صندوق مغلق مصنوع من راتنج الأكريلونيتريل-ستايرين مع صمامات تهوية (للتخدير بالاستنشاق) ونافذة مراقبة مغطاة بزجاج ميكرو (C4050HT). تم لصق جلد الأذن بزجاج الميكرو. تم تصور الفلورية لكل من البكتيريا والفئران من خلال مجهر ليزر مسح ضوئي تداخلي FV3000 (أوليمبوس) مزود بعدسة موضوع UPLSAPO 60XS2 والإعدادات التالية: (1) مامتيرين: الإثارة، 405 نانومتر؛ الجمع، ; (2) الزهرة: إثارة، 514 نانومتر؛ جمع، ; و (3) mCherry: الإثارة، 594 نانومتر؛ الجمع، للحصول على الصورة، تم مسح الطائرات بدقة لكل بكسل، وكانت المسافة بين الشرائح تمت معالجة الصور باستخدام فيجي (ImageJ، NIH) وفوتوشوب 2023 (أدوبي، ماونتن فيو، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية).

نظرًا لأن نسبة الفلورية بين فينوس/مCherry تم تطبيعها إلى قيمتها المقابلة عند pH 8.0 (فينوس/مCherry النسبية)، فقد تداخلت منحنيات النسبة للفلورية النسبية بين فينوس/مCherry المقاسة تحت قوتين ليزريتين. تم أخذ عينات من جلد الظهر والبطن والأذن من تم تثبيت الفئران على زجاجة ميكرو (C4050HT) تحتوي على عينة من ماء ميلي-كيو أو محلول عازل pH 8.0. بعد ذلك، تم قياس شدة فلورية بروتين فينوس وmCherry باستخدام عدسة مكبرة HC PL APO CS2 63x/NA 1.40 في مجهر تيسير ضوئي مقلوب TCS SP8 (شركة لايكا للميكروسكوبات). مشابهًا لتصوير خلايا SG1 المعزولة، تم مسح الطائرات بدقة 361 نانومتر لكل بكسل بسرعة 400 هرتز. تم ضبط قوة الليزر على (i) لـ

فينوس و لـ mCherry (جلد البطن) أو (ii) لزهرة و لـ mCherry (جلد الظهر والأذن) لالتقاط الصور لـ أو (iii) لزهرة و لـ mCherry لالتقاط الصور لـ B 6. العرض- فئران. فردي تم الحصول على صور للطائرات. تم تحليل الصور باستخدام Fiji وتم تمييز خلايا Cornecoytes أو SG1 بواسطة ROI، وتم قياس متوسط كثافاتها باستخدام مدير ROI. نظرًا لأن منطقة SCpH العليا قادرة على التكيف، تم تطبيع نسبة الفلورسنت Venus/mCherry إلى نسبة Venus/mCherry في منطقة SC-pH العليا عند pH 8.0 للحصول على قيم Venus/mCherry النسبية. تم حساب SCpH عن طريق استبدال القيم النسبية لـ Venus/mCherry بالمنحنيات النسبية التي تم إنشاؤها باستخدام خلايا SG1 المعزولة.

الجلود الظهرية لـ تم تثبيت الفئران في الجلوتارالدهيد في محلول ملحي مخفف بالفوسفات بتركيز 0.1 م لمدة ساعتين. تم غسل العينات طوال الليل في في نفس المخزن ومضاف إليه أكسيد الأوزميوم الرباعي في محلول فوسفات 0.1 م لمدة ساعتين عند تم تجفيف العينات في سلسلة من الإيثانول المتدرج وتضمينها في TAAB EPON 812 (نيشين-إي إم، طوكيو، اليابان)، و تم قطع الأقسام أفقيًا. تم الحصول على الصور باستخدام مجهر إلكتروني مسح ميداني من نوع SU8220 (شركة هيتاشي للتقنيات العالية، طوكيو، اليابان) مع كاشف إلكترونات مرتدة YAG (5 كيلو فولت).

تم تضمين عينات جلد الفأر مباشرة في مركب درجة الحرارة المثلى للقطع (ساكورا فينيتيك، طوكيو، اليابان) وتجميدها عند تم تطبيق فيلم كاواموتو اللاصق (نوع كريوفيلم 2 C (9)؛ شركة SECTION-LAB المحدودة، يوكوهاما، اليابان) على السطح المقطوع المكشوف، وتم قطع العينات المجمدة إلى -أقسام سميكة دون تجفيف أو تثبيت، تم حجب المقاطع بـ ألبومين مصل البقر (سيغما ألدريتش، سانت لويس، ميزوري، الولايات المتحدة الأمريكية) في PBS عند لمدة 30 دقيقة، تم حضنها مع جسم مضاد مضاد للفيلاغرين (1:1000؛ Poly19058؛ BioLegend، سان دييغو، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية) في محلول الحجب في لمدة ساعة واحدة أو عند بين عشية وضحاها. تم غسل الأقسام مرتين بمحلول PBS، وتم تحضينها مع جسم مضاد ثانوي مضاد للأرنب من نوع IgG تم امتصاصه بشكل عالٍ، أليكسا فلور (1:1000؛ ثيرمو فيشر ساينتيفيك، وولثام، ماساتشوستس، الولايات المتحدة الأمريكية) في محلول الحجب عند لمدة 30 دقيقة، وغسلت مرتين بمحلول PBS. تم تثبيت الشرائح في وسط تثبيت الفلورسنت من Dako (Agilent Technologies، سانتا كلارا، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية) وتمت ملاحظتها تحت ميكروسكوب TCS SP8 المقلوب (Leica Microsystems). تم معالجة الصور باستخدام Fiji (ImageJ، NIH) وAdobe Photoshop (Adobe).

طبقة SC من جلد الظهر ، و B6.Cldn1 K14-CreERT VH148GmC تم الحصول على الفئران من خلال تقنية إزالة الشريط (TS) باستخدام شرائط شريط D-Squame الكبيرة (Promotool, Inc.، شاتو، فرنسا). تم إجراء TS تسع مرات (لـ “ و فئران) أو سبعة (لـ B6.Cldn K14-CreERT VH148GmC الفئران) مرات، وفي كل مرة، تم الضغط على الشريط ضد الجلد لمدة 5 ثوانٍ مع ضغط موحد ( ) باستخدام جهاز ضغط D-Squame (Promotool, Inc.). تم نقع كل شريط في 1.8 مل من محلول يوريا (5 م يوريا / 2 م ثيو يوريا)، PBS، و 1 مللي مول من EDTA مضاف إليه خليط مثبطات البروتياز (Nacalai Tesque، طوكيو، اليابان) لمدة 5 دقائق. تم طرد المستخلصات في جهاز الطرد المركزي عند لمدة 10 دقائق عند ، وتم تقدير تركيزات البروتينات في السائل الطافي باستخدام مجموعة قياس البروتين SensoLyte OPA بطريقة الفلورية (AnaSpec Inc.، فريمونت، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية). تم تغيير طبيعة السائل الطافي عند لمدة 5 دقائق في محلول لايملي (بايو راد، هيركوليس، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية) وتم فصل العينات المنكرة باستخدام محلول تريس/غليسين/ SDS. بعد التحليل الكهربائي، تم نقل البروتينات إلى غشاء PVDF (بايو راد). تم تحضين الأغشية لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة ( ) في محلول حجب EveryBlot ثم مع تخفيف 1:1000 من مضاد GFP (598؛ MBL Life Science، سوني فيل، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية)، مضاد RFP (PM005؛ MBL Life Science)، 1:1000
تخفيف الأجسام المضادة المضادة للفيلاغرين (Poly19058؛ BioLegend)، أو تخفيف 1:100 من الأجسام المضادة الأولية المضادة للسايتوكيراتين 10 (LH2؛ سانتا كروز للتكنولوجيا الحيوية، دالاس، تكساس، الولايات المتحدة الأمريكية) في تم الكشف عن المجمعات المناعية باستخدام الأجسام المضادة المضادة للأرانب أو الأجسام المضادة المضادة للفئران IgG، والأجسام المضادة الثانوية المرتبطة بإنزيم البيروكسيداز من الفجل، وركيزة Clarity Western ECL (جميعها من Bio-Rad)، ونظام تصوير iBright FL1500 (Thermo Fisher Scientific).

تم إنتاج S. aureus الذي يعبر عن mAmetrine عبر استبدال الأليل باستخدام بلازميد pRN112 كما تم وصفه سابقًا. باختصار، تم إدخال pRN112 إلى S. aureus MW2 عن طريق التحفيز الكهربائي، وتم زراعة الخلايا على أجار تود هيويت (TH) المحتوي على الكلورامفينيكول. ) للتعقيم الليلي في تم اختيار المستعمرات ونقلها إلى طبق جديد وتم حضنها عند لمدة يومين لاختيار دمج البلازميد في الكروموسوم. بالنسبة لفعاليات التداخل المزدوج، تم اختيار مستعمرات فردية وتم حضنها في وسط TH بدون مضادات حيوية مع التحريك في تم تخفيف الثقافات بنسبة 1:1000 وزرعها لـ ، مما أدى إلى 7 دورات تخفيف وزراعة. تم زراعة الثقافة النهائية على أجار TH يحتوي على أنهدروتتراسيكلين وتم حضنه طوال الليل عند لاختيار الطفرات ذات التقاطع المزدوج. تم تحليل مستعمرات فردية حساسة للكلورامفينيكول عبر تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) للتأكد من التكامل الصحيح.

للتطعيم بسلالة MW2 من المكورات العنقودية الذهبية، تم زراعة العزلات البكتيرية في وسط تغذية الدماغ والقلب (بيكتون ديكنسون، فرانكلين ليكس، نيو جيرسي، الولايات المتحدة الأمريكية) طوال الليل وتم تعديلها لتكون تقريبًا في وسط. تعليقات بكتيرية ( تم تطبيقها موضعياً على آذان الفئران SPF. بالنسبة لمنحنى نمو البكتيريا، تم إضافة عزل بكتيري مزروع في مرق الصويا التربتي (TSB) (بيكتون ديكنسون) طوال الليل إلى من TSB المعدل pH وتم حضنه مع التحريك عند لتحديد معدل نمو البكتيريا، تم قياس OD (600 نانومتر) كل 15 دقيقة باستخدام جهاز Infinite 200Pro مع برنامج Tecan i-control (شركة تيكان اليابان المحدودة، كاواساكي، اليابان).

B6.VmC تلقت الفئران كوكتيلًا من المضادات الحيوية يتكون من الميترونيدازول ( سلفاميثوكسازول )، تريميثوبريم ( ) سيفاليكسين ( ) وبيتريل ( ) مذاب في مياه الشرب لمدة أسبوعين لتقليل الحمل الميكروبي على الجلد بايتريل هو إنروفلوكساسين، الذي يُعرف بشكل أفضل كمثبط لإنزيم الجيراز DNA في فئة المضادات الحيوية الفلوروكينولونية. لضمان تقليل العبء الميكروبي، تم تغيير الأقفاص ثلاث مرات أسبوعياً. .

لإحداث حالة مشابهة لالتهاب الجلد باستخدام MC903، يتم معالجة آذان الفئران من نوع B6 WT التي تبلغ من العمر 8 أسابيع أو B6. تم علاج الفئران يوميًا بـ 1 نانومول MC903 (كالسيبوتريول، توكريس بيوساينس، بريستول، المملكة المتحدة) في الإيثانول لمدة 7 أيام (الأيام 1-7). بعد يوم واحد من تطبيق MC903، تقريبًا تعليق بكتيري في تم تطبيق الوسط موضعياً على صيوان الأذن. لتطبيق العازل المعدل pH، تم تطبيق 100 ملليمول من محلول فوسفات معدل الحموضة موضعياً على صيوان الأذن مرتين يومياً لمدة أربعة أيام. تم قياس سمك الأذن باستخدام ميكرومتر رقمي (ميتوتويو، كاواساكي، اليابان) في نهاية كل تجربة.