بحث العظام (2024) 12:14 ؛https://doi.org/10.1038/s41413-024-00319-7

هشاشة العظام السكري (DOP)، هو اضطراب استقلابي عظمي نظامي، وهو السبب الرئيسي لانخفاض كتلة العظام، واضطراب الميكروهيكل العظمي، وزيادة القابلية للكسور. في عام 2021، خوسلا وآخرون أفاد أن المرضى الذين يعانون من السكري كان لديهم خطر أعلى من الكسور مقارنةً بأولئك الذين لا يعانون من السكري، مع معدل وفيات أعلى بمقدار 1.23 مرة من ذلك للأفراد الذين يعانون من السكري من النوع 2 فقط، مما يؤدي إلى عبء كبير على المرضى ونظام الرعاية الصحية. مؤخرًا، قام هوفباور وآخرون. اقترح أن الفيروبتوز قد يمثل آلية خلوية وجزيئية حاسمة تدعم التغيرات الهيكلية الناتجة عن السكري. على وجه التحديد، فإن المستويات المرتفعة من الفيروبتوز تثبط تعبير عوامل النسخ العظمية، مثل أوستريكس (OSX؛ المعروف أيضًا باسم SP7) وعامل النسخ المرتبط بـ Runt 2 (RUNX2)، مما يغير توازن الالتزام العظمي وتمايز خلايا السلالة الجذعية العظمية (BMSCs)، مما يؤثر سلبًا على توازن العظام. لذلك، فإن استهداف الفيروبتوسيس يمثل استراتيجية جديدة لعلاج DOP.

الفيروبتوز هو شكل حديث من أشكال موت الخلايا المبرمج الذي يميز نفسه عن الأنواع التقليدية لموت الخلايا المبرمج، والتي تشمل الاستماتة، والالتهام الذاتي، والفيروبتوز. ويتميز بتراكم الحديد وأكسدة الدهون. إنزيم الجلوتاثيون بيروكسيداز 4 (GPX4)، وهو إنزيم مضاد للأكسدة يتم تنظيمه سلبًا بواسطة إجهاد الشبكة الإندوبلازمية ومسؤول عن القضاء على فائض بيروكسيدات الدهون، هو المنظم الرئيسي العلوي لعملية الفيروبتوز.

علاوة على ذلك، يلعب GPX4 دور النظام الرئيسي للحماية ضد الفيروبتوز في كل من السيتوبلازم والميتوكوندريا. في البيئة الدقيقة لمرض السكري، يتم تقليل المحتوى الداخلي والنشاط لـ GPX4 بشكل كبير، مما يؤدي إلى تراكم مفرط للجذور الحرة للأكسجين (ROS) و وتعبير غير الطبيعي عن الهيدروبيروكسيد الدهني والبروتينات المرتبطة بالفيروبتوز، والتي تعتبر العناصر الرئيسية التي تبدأ الفيروبتوز. يمكن أن يقلل التطبيق المباشر لمثبط الفيروبتوزيس فيروستاتين-1 (Fer-1) في نموذج الفأر لداء هشاشة العظام من فقدان العظام، يثبت أن الفيروبتوسيس مرتبط ارتباطًا وثيقًا بمرض داء الأمعاء الالتهابي. يقوم عامل النسخ المرتبط بعامل النووي E2 (NRF2) بتثبيط الفيروبتوسيس من خلال زيادة تعبير GPX4. لذا، فإن تطوير منبه GPX4 الذي يستهدف تنشيط NRF2 يمكن أن يقضي بفعالية على ROS وينظم أكسدة الدهون. يمكن أن تمنع هذه الطريقة الموت الخلوي الحديدي، وتزيد من تكوين العظام، وتخفف من هشاشة العظام الناتجة عن السكري.

الكركمين، وهو بوليفينول مستمد من نبات الكركم الطبي، ينشط مسار بروتين KEAP1/NRF2 المرتبط بـ ECH الشبيه بالكيلش. بالإضافة إلى ذلك، تم دراسة الكركمين بشكل مكثف لخصائصه المضادة للالتهابات، ومضادات الأكسدة، وخفض الدهون، فضلاً عن قدرته على قمع تكوين الخلايا العظمية في المختبر. افترضنا أن الكركمين يستهدف الأيض الخلوي للأكسدة والاختزال لتنظيم الفيروبتوز. ومع ذلك، فإن ضعف الديناميكا الدوائية، والاستهداف، والآثار الجانبية السامة للكركمين، عند إعطائه بشكل متكرر، تعيق استخدامه على نطاق واسع كدواء. لذلك، من الضروري وجود نظام توصيل بديل لتقدم تطوير الكركمين إلى دواء.

تاريخ الاستلام: 1 نوفمبر 2023 تاريخ المراجعة: 2 يناير 2024 تاريخ القبول: 19 يناير 2024
نُشر على الإنترنت: 29 فبراير 2024

مع التطور السريع لتكنولوجيا النانو، أظهرت المواد النانوية مجموعة واسعة من التطبيقات في المجال الطبي الحيوي بفضل سلامتها الحيوية الممتازة، واستقرارها، وتصميمها متعدد الوظائف. يمكن تجميع الحمض النووي الإطاري الرباعي (tFNA) ذاتيًا باستخدام أربع جزيئات من الحمض النووي أحادي السلسلة (ssDNA) من خلال تنظيم درجة الحرارة. تتيح هذه الخاصية الفريدة لـ tFNA عبور أغشية الخلايا بحرية. إنه يتمتع بتوافق حيوي ممتاز، وأمان، وقابلية للتعديل، واستقرار، مما يجعله مادة نانوية من الحمض النووي ذات تطبيقات محتملة واسعة. أظهرت الدراسات السابقة قدرة tFNA على توصيل الأوليغونوكليوتيدات (مثل siRNA و microRNA)، البوليببتيدات (مثل OGP)، والمنتجات الطبيعية (مثل الكيرسيتين والتيفانوسيد). علاوة على ذلك، فإن tFNA يحسن مقاومة الأنسولين الكبدية، يقلل من مستويات الجلوكوز في الدم، ويخفف من مرض السكري من النوع 2 (T2DM) من خلال مسار الفوسفاتيديلينوسيتول 3-كيناز (PI3K)/أكت. لذلك، كان هدف دراستنا هو تخليق جزيئات نانوية مثبطة للفيروبتوز باستخدام tFNA التي ستقوم بتوصيل منتج طبيعي، وهو الكركم، إلى نخاع العظام، مما يؤدي لاحقًا إلى تعزيز الحماية الميتوكوندرية، وتثبيط الفيروبتوز، وتحفيز تمايز خلايا بون مارستيم (BMSC) إلى خلايا عظمية في بيئة داء السكري. نتوقع أن توفر نتائجنا معلومات حول الآليات الجزيئية المعنية في تثبيط الفيروبتوز بواسطة الجزيئات النانوية، مما يحدد استراتيجية جديدة لعلاج داء السكري.

تضمن تخليق tFNA-Cur خطوتين (الشكل 1a). في البداية، تجمعت tFNA ذاتيًا من خلال تنظيم درجة الحرارة، كما يتضح من الرحلان الكهربائي للهلام بولي أكريلاميد (PAGE) (الشكل 1b). بعد ذلك، تم استخدام تركيزات مختلفة من الكركمين (10، 20، و ) تم تعقيدها مع tFNA من خلال الاهتزاز لمدة 3 ساعات، وتم تأكيد احتواء الكركمين بنجاح في tFNA من خلال PAGE (الشكل 1c). كما أكد طيف الامتصاص لـ tFNA-Cur في الشكل 1d هذه النتيجة. تم قياس حجم tFNA عند ، وكان tFNA-Cur هو مع إمكانيات زيتا من و على التوالي (الشكل 1e، الشكل S1b، c). أظهرت تقنية المجهر الإلكتروني النافذ (TEM) والمجهر الذري (AFM) بشكل أكبر أن حجم tFNA-Cur كان مع الحفاظ على الهيكل النانوي ثلاثي الأبعاد لـ tFNA (الشكل 1f، g).

تم تحديد كفاءة الت encapsulation وإطلاق الكركمين من tFNACur من خلال تقييم نسبة الكركمين الذي تحمله tFNA. مع تركيز ثابت لـ tFNA من تركيزات مختلفة من الكركمين ( ، و تم احتواء الكركمين في tFNA، مما أدى إلى منحنى متناقص لكفاءة الاحتواء. كانت كفاءات الاحتواء للكركمين عند 10 و 20 و وُجدت أن ، و ، على التوالي (الشكل 1h). أظهر tFNA قدرة ممتازة على تحميل الأدوية ضمن علاوة على ذلك، أظهر الكركمين إطلاقًا مستدامًا من tFNA-Cur على مدى 48 ساعة، حيث ظل عند ، وهو ما يعد مهمًا للتطبيقات السريرية (الشكل 1i). تم تأكيد الذوبانية الممتازة لـ tFNA-Cur من خلال ظهور الكركمين المُصنّع و tFNA-Cur (الشكل S1a). نتيجة لذلك، قمنا بنجاح بتصنيع جزيئات نانوية مثبطة للفيروبتوز، تُعرف باسم “tFNA-Cur”، بعملية تخليق بسيطة، وسعة تحميل دوائية ممتازة، ونسبة استخدام عالية للدواء.

تتناول tFNA-Cur قضايا ضعف التوافر الحيوي وعدم الاستقرار في السوائل الفسيولوجية التي تقيد بشكل كبير التطبيق السريري للمنتجات الطبيعية. قمنا بالتحقيق في امتصاص الخلايا للكركمين وtFNA-Cur باستخدام المجهر الفلوري. أظهرت صور المناعة الفلورية (الشكل 1j، k) أن امتصاص tFNA-Cur كان متفوقًا على امتصاص الكركمين في كل من 6 ساعات و12 ساعة، مع أفضل تأثير اختراق لوحظ عند 12 ساعة، مما يوضح المزيد من وظيفة التوصيل الممتازة لـ tFNA-Cur. قمنا بالتحقق من استقرار مصل tFNA-Cur (الشكل 1I، m). تدهور الكركمين المنفصل بسرعة في محلول TM خلال ساعتين، مع
المبلغ المتبقي يصل فقط إلى عند الساعة 12، أضعف بكثير من من tFNA-Cur. علاوة على ذلك، أظهرت PAGE أن tFNA-Cur يمكن أن يوجد بشكل مستقر في المصل لمدة 12 ساعة، وهو أطول من tFNA المنفصل. النتائج عند و كانت متسقة. أخيرًا، استكشفنا استقرار tFNA و tFNA-Cur المعلّمين بـ Cy 5 في الفئران ووجدنا أن tFNA-Cur ظل في السوائل الفسيولوجية لمدة 24 ساعة، متفوقًا على استقرار tFNA التفكيكي (الشكل S2). في الختام، لقد نجح الجسيم النانوي الذي يثبط الفيروبتوسيس في معالجة عنق الزجاجة المتمثل في ضعف التوافر البيولوجي وعدم الاستقرار للمنتجات الطبيعية في السوائل الفسيولوجية، مما يجعله واعدًا للغاية لمجموعة واسعة من التطبيقات.

إنشاء نموذج DOP واستكشاف الفيروبتوزيس في الجسم الحي
قمنا بإنشاء نموذج للداء السكري من النوع الثاني باستخدام نظام غذائي عالي الدهون (HFD) وجرعة منخفضة من ستربتوزوتوسين (STZ) (الشكل 2أ). تم إجراء تقديرات أسبوعية لوزن الجسم ومستويات الجلوكوز في البلازما، وتم إجراء اختبار تحمل الجلوكوز داخل الصفاق (IPGTT) واختبار تحمل الأنسولين (ITT) في يوم القتل الرحيم. استمرت مستويات الجلوكوز في البلازما في الفئران المعالجة بـ HFD&STZ في الارتفاع، بينما انخفضت أوزانها (الشكل 2ب-د). أظهر IPGTT وITT ضعف تحمل الجلوكوز ومقاومة الأنسولين في الفئران المعالجة بـ HFD&STZ (الشكل 2هـ، و). كما دعمت مقاطع البنكرياس هذه النتيجة (الشكل S3). من المثير للاهتمام، أننا وجدنا أن مستويات المنتجات النهائية المتقدمة للجليكوزيل (AGEs) في البلازما والعظام لدى الفئران المعالجة بـ HFD&STZ قد زادت أيضًا (الشكل 2ز، ح). تُعرف AGEs بأنها علامات على مرض السكري، وتراكمها يؤدي إلى مضاعفات مختلفة. تشير هذه النتائج إلى أن تراكم AGEs هو سمة مهمة للبيئة الدقيقة لمرضى السكري.

وجدنا أن الفئران التي تتغذى على نظام غذائي عالي الدهون (HFD) وحقن ستربتوزوتوسين (STZ) أظهرت كسرًا شديدًا في التربيق، وامتصاصًا، وهشاشة العظام، مشابهة للملاحظات في هشاشة العظام. أظهر التحليل الكمي أن نسبة حجم العظام إلى الحجم الكلي (BV/TV)، وعدد التربيقات (Tb. N)، وسماكة التربيقات (Tb. Th) في فئران HFD&STZ قد انخفضت، في حين زادت المسافة بين التربيقات (Tb. SP) ومؤشر كتلة العضلات الهيكلية (SMI). ومن المثير للاهتمام أن كثافة المعادن في العظام (BMD) بين مجموعتي HFD&STZ والمجموعة الضابطة لم تظهر اختلافات كبيرة، وهو ما يتماشى مع الدراسات السابقة (الشكل 2i-k). علاوة على ذلك، قمنا بتقييم التغيرات في الميكروهيكل العظمي في الفئران النموذجية باستخدام صبغة الهيماتوكسيليين والإيوزين (H&E) وصبغة ماسون، وكانت النتائج متوافقة مع الميكرو-CT (الشكل 2l، m).

لاستكشاف العلاقة بين تكوين العظام والفيروبتوز في البيئة الدقيقة لمرض السكري، قمنا بإجراء تمييز نهاية النيك بواسطة TdTmediated dUTP (TUNEL) لعظام الساق. أظهرت نتائج صبغة TUNEL زيادة ملحوظة في الخلايا الميتة في مجموعة النمذجة (الشكل 2n، الشكل S4). لقد قمنا بنجاح بإنشاء نموذج لداء العظام السكري وأظهرنا أن الفيروبتوز مرتبط ارتباطًا وثيقًا بآلية حدوث داء العظام السكري.

الإمكانات العظمية لخلايا BMSCs، وهي خلايا سابقة حيوية مهمة للأوستيوبلasts في نسيج نخاع العظام، يتم تثبيطه داخل البيئة الدقيقة لمرضى السكري. وبالتالي، فإن تعزيز الإمكانات العظمية لخلايا BMSCs أمر حاسم لعلاج DOP. في البداية، تم عزل خلايا BMSCs وزراعتها وتحديدها (الشكل S5a-c). بعد ذلك، تم معالجة خلايا BMSCs بـ tFNA-Cur أو AGEs لتقييم حيوية الخلايا. ومن الجدير بالذكر أن tFNA-Cur أظهر تأثيرًا يعتمد على التركيز على خلايا BMSCs، مع ملاحظة النشاط الخلوي الأمثل عند tFNA. والكركمين (الشكل 3أ-ج). تم اختبار تركيزات مختلفة من AGEs، و تم اختياره للتجارب اللاحقة لأنه قمع الإمكانية العظمية لخلايا BMSCs مع الحفاظ على نسبة عالية من بقاء الخلايا (الشكل 3d، الشكل S6a، b).

قمنا بمعالجة خلايا BMSCs مع AGEs لمحاكاة بيئة ميكروية سكرية وحققنا في الوظائف البيولوجية لـ tFNACur. كما هو موضح في الشكل 3e، f، التمايز العظمي و

تكون العقد الكالسيومية انخفض بشكل ملحوظ في البيئة الدقيقة لمرض السكري. ومع ذلك، أظهرت مجموعات المعالجة المسبقة tFNA والكركمين وtFNA-Cur تحسنًا، لا سيما مجموعة tFNA-Cur (الشكل 3g، h). بالإضافة إلى ذلك، قمنا بتقييم تعبير Alp وRunx2 وOsx وOpn من خلال RT-PCR، والتي
تم تثبيطها بشكل كبير في مجموعة العلاج ولكن تم عكسها بواسطة معالجة tFNA-Cur (الشكل 3i-I). تم دعم هذه النتائج بشكل أكبر من خلال تحليلات مستوى البروتين (الشكل 3m-q، الشكل S7a-c). ALP (علامة للخلايا العظمية)، OSX (علامة محددة لخلايا سلف الخلايا العظمية) وRUNX2 (علامة للخلايا العظمية الناضجة)

تم تحديدها باستخدام تقنية الوسترن بلوت (WB) والتألق المناعي. أظهرت الأنماط المتسقة أن tFNA-Cur عزز بشكل كبير تكوين العظام في البيئة الدقيقة السكري مقارنةً بـ tFNA أو الكركمين بمفرده.

تتميز الفيروبتوزيس بأكسدة الدهون، وتراكم الحديد المعتمد، وانخفاض مستوى GPX4. من الناحية الشكلية، تعتبر الميتوكوندريا المتقلصة، والميتوكوندريا المكثفة بشكل كثيف، وانخفاض أو اختفاء الأهداب الميتوكوندريا من الميزات الفريدة للفيروبتوزيس. لتقييم التغيرات في أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) وإمكانات غشاء الميتوكوندريا (MMP)، عالجنا الخلايا بـ AGEs و tFNA-Cur، ثم قمنا بملاحظتها باستخدام المجهر الفلوري. أدى تحفيز AGEs إلى تراكم كبير في ROS وتمزق غشاء الميتوكوندريا، بينما قمع علاج tFNA والكركمين الفيروبتوزيس، حيث أظهر tFNA-Cur انخفاضًا أكثر وضوحًا في مستويات ROS وأضرار الغشاء (الشكل 4a، b، e، f). تم الحصول على نتائج مماثلة باستخدام صبغة FerroOrange، التي أشارت إلى تراكم الحديد المعتمد في BMSCs عند معالجتها بـ AGEs. ومع ذلك، أظهرت مجموعة المعالجة المسبقة بـ tFNA-Cur انخفاضًا كبيرًا في مستويات في البيئة الدقيقة لمرضى السكري (الشكل 4c، g). شكل الميتوكوندريا هو مؤشر حاسم على الفيروبتوز، يتميز بميتوكوندريا متقلصة وكثيفة مع انخفاض أو اختفاء الكريستا. باستخدام المجهر الإلكتروني النافذ، قمنا بتقييم التغيرات الميتوكوندرية في البيئة الدقيقة لمرضى السكري. بينما أدت منتجات نهاية glycation المتقدمة إلى تغييرات ميتوكوندرية، استعادة معالجة tFNA-Cur الميتوكوندريا إلى حالة طبيعية بشكل أكثر فعالية من tFNA والكركمين بمفردهما (الشكل 4d). تم استخدام التحليل الغربي والتألق المناعي للكشف عن مستويات GPX4 وACSL4. أدت معالجة tFNA-Cur إلى انخفاض كبير في تعبير GPX4، ومع ذلك، كانت الاتجاهات بالنسبة لـ ACSL4 عكس ذلك (الشكل 4k-n، الشكل S7d، e). تم دعم هذه النتائج أيضًا بمستويات التعبير الجيني (الشكل 4h، i). يمكن أن تعزز tFNA-Cur بشكل كبير الدفاع الميتوكوندري (مسار GPX4)، مما يحمي خلايا BMSCs من الفيروبتوز.

بالإضافة إلى نتائج نموذج الفأر، فإن الفيروبتوسيس لخلايا BMSCs يعيق قدرتها على التكون العظمي في البيئة الدقيقة للسكري. لذلك، قد يكون استهداف الفيروبتوسيس وسيلة فعالة لعلاج DOP. في عام 2023، أبلغ ليانغ وآخرون عن خمسة جينات معروفة مثبطة للفيروبتوسيس: Slc7a11، Nrf2، Fsp1، Gch1، وNos2. نفترض أن NRF2 يمكن أن يكون جينًا مستهدفًا لعلاج DOP، حيث إنه يزيد من تعبير GPX4، مما يؤدي إلى تثبيط الفيروبتوز. استخدمنا AlphaFold وAutoDock Vina (الإصدار 1.2.0) للتنبؤ بالهيكل البروتيني لـ NRF2 ورصده الجزيئي مع الكركمين. كشف تحليل التفاعل (الشكل 4p) عن مجموعات متعددة من قوى التفاعل (الجدول S4)، مثل رابطة الهيدروجين بين Asp408 من NRF2 والكركمين، مع طاقة ربط قدرها استنادًا إلى هذه النتائج والدراسات السابقة، نقترح أن الكركمين يمكن أن يثبط الفيروبتوسيس من خلال تنشيط مسار NRF2/GPX4.

أشارت نتائج الربط الجزيئي إلى أن NRF2 هو الهدف لـ tFNACur في تثبيط الفيروبتوز. بناءً على ذلك، قمنا بتقييم تعبير NRF2 باستخدام تقنية الويسترن بلوت والتألق المناعي (الشكل 4j-I، o، الشكل S7f)، وكما هو متوقع، تم ملاحظة تنشيط NRF2 عند معالجة tFNA-Cur، تمامًا كما حدث مع GPX4. في الختام، يقوم tFNA-Cur بتثبيط الفيروبتوز من خلال مسار NRF2/GPX4 في البيئة الدقيقة لمرض السكري.

لإظهار نتائجنا في كل من التجارب الحيوانية وفي المختبر، قمنا بحقن كميات متساوية من tFNA والكركم وtFNA-Cur عن طريق البطن في فئران DOP (الشكل 5a). أظهر tFNA-Cur تأثيرات متفوقة في تقليل سكر البلازما وAGEs مقارنةً بـ tFNA والكركم بمفردهما (الشكل S8a-c). قد يُعزى هذا التأثير المعزز إلى التأثير الوقائي لـ tFNA-Cur على جزر البنكرياس (الشكل 5b). علاوة على ذلك، توضح النتائج المعروضة في الشكل 5c-f أن علاج tFNA-Cur استعاد بشكل كبير
سلامة التربيق وتقليل فقدان العظام بشكل فعال عند مقارنتها بمجموعات العلاج الأخرى. وقد دعمت هذه النتائج المزيد من خلال صبغات H&E وماسون، مما كشف عن زيادة كبيرة في وفرة التربيقات وألياف الكولاجين (الشكل 5g، h). ومن المثير للاهتمام أن فئران DOP أظهرت زيادة في تراكم الخلايا الدهنية في نخاع العظام (BMAs)، وهو ما يتماشى مع الأبحاث السابقة (الشكل S9a-c). من المRemarkably، لم يظهر tFNA-Cur أي سمية في الفئران وعالج بفعالية المضاعفات الناجمة عن مرض السكري، كما هو موضح في الشكل S10 للرئة والكبد والكلى.

بالإضافة إلى تأثيراته الإيجابية على توازن الأنسجة التربيقية، قام tFNA-Cur بشكل كبير بتثبيط الفيروبتوز وفعّل الإمكانية العظمية لخلايا BMSCs. لتوضيح الآلية الكامنة، قمنا بفحص التعبير الجزيئي لـ ALP و GPX4 و NRF2 في مجموعات العلاج المختلفة. قام tFNA-Cur بشكل كبير بتعزيز التعبير عن NRF2، مما أدى إلى تنشيط نظام الدفاع المضاد للأكسدة (الشكل 6c، f)، وزيادة التعبير عن GPX4، مما عزز بشكل فعال الدفاع الميتوكوندري وتثبيط الفيروبتوز (الشكل 6b، e). في النهاية، قام tFNA-Cur بممارسة تأثيراته المثبطة على الفيروبتوز من خلال مسار NRF2/GPX4، مما أدى إلى تنشيط الإمكانية العظمية لخلايا BMSCs في البيئة الدقيقة السكري (الشكل 6a، d).

تم التعرف على الفيروبتوزيس لأول مرة في عام 2012 ويُوصف بأنه نوع فريد من موت الخلايا المعتمد على الحديد. تمت ملاحظة وفاة مفرطة للخلايا العظمية في العظام السكري بسبب وجود ظاهرة الفيروبتوز الواضحة. تشمل هذه الظاهرة تراكم بيروكسيد الدهون، وتغيرات شكلية في الميتوكوندريا، وزيادة الحديد، وتنشيط جين الفيريتين. تشير هذه النتائج إلى أن الفيروبتوز هو هدف لعلاج داء العظام السكري.

DOP هو نوع من هشاشة العظام الثانوية، والتي يمكن تقسيمها إلى النوع 1 والنوع مقارنة بالنوع 1، فإن النوع 2 له معدل مرضي أعلى وزيادة في تلف الميكروهيكل العظمي. في هذه الدراسة، قمنا بإنشاء نموذج فأر من النوع 2 DOP باستخدام نظام غذائي عالي الدهون وجرعة منخفضة مستمرة من STZ. يتماشى ذلك مع تقارير أخرى، لم تُلاحظ فروق ذات دلالة إحصائية في كثافة المعادن بالعظام (BMD) في فئران DOP من النوع 2؛ ومع ذلك، كانت نسبة حجم العظام/إجمالي الحجم (BV/TV) وعدد التربيق (Tb. N) وسماكة التربيق (Tb. Th) منخفضة بشكل ملحوظ مقارنةً بمجموعة التحكم. أحد التفسيرات المحتملة هو أن فترة الشهرين كانت غير كافية لإعادة تشكيل العظام القشرية. علاوة على ذلك، لاحظنا أن موت الخلايا وتراكم AGE في عظام فئران DOP من النوع 2 كانا مرتفعين مقارنةً بتلك الموجودة في مجموعة التحكم. بالإضافة إلى ذلك، في البيئة الميكروية الناتجة عن AGE، كانت مستويات ROS، واختلال وظيفة الميتوكوندريا، والتراكم المفرط لـ زاد، بينما انخفض تعبير GPX4. استنادًا إلى النتائج المذكورة أعلاه، افترضنا أن الإنتاج المفرط للـ AGEs قد يكون السبب الرئيسي لموت الخلايا في البيئة الدقيقة السكري، وقد تكون الفيروبتوزيس واحدة فقط من عدة آليات جزيئية رئيسية محتملة متورطة في هذه العملية.

في نظام الدفاع المضاد للأكسدة الخلوي، يعتبر مسار KEAP1/NRF2 الأيضي المنظم المركزي للفيروبتوز، حيث يمنع الفيروبتوز مباشرة من خلال استهداف المسار الاختزالي الأكسدي. الكركمين هو أحد المركبات الفينولية النشطة بيولوجيًا الرئيسية المعزولة من الكركم الطويل. نبات طبي قديم له خصائص مضادة للالتهابات، ومضادة للأكسدة، وخافضة للسكر في الدم. وجدنا في هذه الدراسة أن الكركمين يمكن أن يثبط الفيروبتوز ويعزز التمايز العظمي لخلايا BMSCs من خلال تقليل الإنتاج المفرط لجذور الأكسجين التفاعلية، وتقليل المستويات، وتنشيط مسار KEAP1/NRF2 لزيادة التعبير عن GPX4 في البيئة الدقيقة لمرض السكري. تشير هذه النتائج إلى أن الكركم يمكن أن يُستخدم للوقاية من وتخفيف DOP.
تم استخدام FNA، كمواد نانوية متعددة الوظائف، على نطاق واسع في مجالات العلوم الطبية الحيوية المختلفة لتوصيل الحمض النووي DNA، والحمض النووي الريبي RNA، والببتيدات، والمركبات الصغيرة. المزيد

من المهم أن هذه الجسيمات النانوية تتمتع بميزة الأمان الحيوي الجيد واستخدام الدواء العالي. في هذه الدراسة، قمنا بتطوير جسيمات نانوية tFNA مثبطة للفيروبتوز لتوصيل الكركمين إلى خلايا جذعية عظمية (BMSCs) تم علاجها بالمنتجات النهائية للجليكوزيل (AGEs) وإلى فئران نموذجية لداء السكري، لتقييم تطبيق tFNA-Cur كخيار علاجي محتمل لداء السكري. أظهرت نتائجنا أن الجسيمات النانوية المثبطة للفيروبتوز حفزت التمايز العظمي لخلايا BMSCs المعالجة بالـ AGEs من خلال تنشيط مسار NRF2/GPX4. علاوة على ذلك، أظهرت نتائجنا أن هذه الجسيمات النانوية تتمتع باستقرار عالٍ وتحسن من وقت الدورة للكركمين في السوائل الفسيولوجية، مما يعزز توافره الحيوي، ويوصل الكركمين إلى نخاع العظام ويحقق تأثيرات علاجية أفضل عند جرعات أقل.

استهداف الفيروبتوزيس لتخفيف هشاشة العظام الناتجة عن السكري هو نهج علاجي واعد. في هذه الدراسة، أظهرنا أن جزيئات tFNA-Cur يمكن أن تثبط الفيروبتوزيس، وتعزز وظيفة الميتوكوندريا من خلال تنشيط مسار NRF2/GPX4، وتحث على التمايز العظمي لخلايا BMSCs في البيئة الدقيقة للسكري، بالإضافة إلى تقليل فقدان العظام الإسفنجية وزيادة تكوين العظام في نموذج الفأر لهشاشة العظام الناتجة عن السكري (المخطط 1). تشير هذه النتائج إلى أن الجزيئات المثبطة للفيروبتوزيس المستندة إلى تقنية الهرم الرباعي من الحمض النووي تحمل إمكانات واعدة لعلاج هشاشة العظام الناتجة عن السكري وأمراض أخرى مرتبطة بالفيروبتوزيس.

ومع ذلك، تتطلب بعض القيود الانتباه والتحسين. أولاً، تحسين استقرار المصل لجزيئات النانو المثبطة للفيروبتوزيس لا يزال أولوية. بينما أظهر tFNA-Cur استقرارًا أكبر في بيئات المصل العادية، فإن تحسينات إضافية في الاستقرار ستعزز من امتصاص وفعالية الدواء. ثانيًا، تساهم الكمية الدقيقة للمنتجات الطبيعية التي تحملها الأحماض النووية الإطارية في التحول السريري. في الوقت الحالي، كميات المنتجات الطبيعية التي تحملها الأحماض النووية الإطارية غير قابلة للتحكم، على الرغم من أن تخليق النانو مركبات بسيط، إلا أنه يقيّد التطبيق السريري لمثبطات الفيروبتوزيس النانوية. وأخيرًا، والأهم من ذلك، كيف يمكن استهداف خلايا BMSCs بشكل أكثر تحديدًا في الجسم الحي؟ من أجل مزيد من البحث، ربطنا الببتيد المستهدف للعظام SDSSD بأحد ssDNA من خلال كيمياء النقر، وحققنا استهداف العظام بواسطة
تغليف غشاء خلايا جذعية من النخاع العظمي على الجسيمات النانوية المثبطة للفيروبتوز.

أولاً، تم خلط أربعة جزيئات من الحمض النووي أحادي السلسلة (ssDNAs، الجدول S1) (سانغون، شنغهاي، الصين) بكميات متساوية، وتم إذابتها في محلول TM (تريس- HCl و )، مسخن عند لمدة 10 دقائق، ثم تم تبريده عند لـ ثانيًا، ناتج الخطوة الأولى، tFNA ( )، تم مزجه مع تركيزات مختلفة من الكركمين ( ، ، و ) وتذبذبت لمدة 3 ساعات.

تم تقييم تخليق tFNA-Cur باستخدام PAGE (الرحلان الكهربائي للهلام البولي أكريلاميد). تم قياس الجهد الكهربائي وز sizes tFNA-Cur و tFNA باستخدام DLS (تشتت الضوء الديناميكي) مع جهاز Nano ZS (مالفيرن، المملكة المتحدة). تم تحديد الأشكال والأحجام لـ tFNA-Cur باستخدام TEM (المجهر الإلكتروني الناقل) مع مجهر Libra200 (زايس، أوبركوخن، ألمانيا) و AFM (المجهر القوي الذري) مع مجهر Cypher VRS (أكسفورد إنسترومنتس، المملكة المتحدة). تم تحليل الطيف الكامل لـ tFNA والكركمين و tFNA-Cur باستخدام مطياف الأشعة فوق البنفسجية الفائق (UV5 Nano، ميتلر توليدو، سويسرا).

إطلاق واستقرار tFNA-Cur
استنادًا إلى الأبحاث السابقة، قمنا بتقسيم كيس الغسيل الكلوي (30 كيلودالتون؛ سولاربيو، بكين، الصين) إلى سائل خارجي (30 مل) وسوائل داخلية (3 مل) باستخدام PBS. ) كوسيط. تركيزات متساوية من الكركمين و tFNA-Cur ( ) تم إذابتها في السائل الداخلي عند مع ت agitation مستمر تم تحديد قيمة OD للكركمين المحرر في السائل الخارجي باستخدام مطياف ضوئي فائق الدقة. لتقييم استقرار tFNA و tFNA-Cur، تم حضنهما بشكل منفصل مع أو مصل لفترات زمنية مختلفة (0 ساعة، و 12 ساعة). تم إجراء الرحلان الكهربائي لهلام الأجاروز
تم استخدامه لتحليل نتائج الاستقرار. أخيرًا، تم التقاط صور لـ tFNA و tFNA-Cur باستخدام جهاز التعرض للأشعة فوق البنفسجية (Bio-Rad، هيركوليس، الولايات المتحدة الأمريكية).

تم الحصول على ذكور فئران C57، بعمر 4 أسابيع، من شركة جيمفارماتيك (جيانغسو، الصين). تم عزل خلايا جذعية من نخاع العظام للفئران، وتم غسلها بمحلول MEM (HYCLONE، بيتسبرغ، الولايات المتحدة الأمريكية) و10% من مصل الجنين البقري، و البنسلين-ستربتوميسين (هايكلون، بيتسبرغ، الولايات المتحدة الأمريكية).

تم زراعة خلايا BMSCs في طبق مكون من عدسة مجهرية متداخلة مع 10000 خلية وتم معالجتها بالكركم و tFNA-Cur لمدة 6 و 12 ساعة. تم التقاط صور لامتصاص الخلايا للكركم و tFNA-Cur باستخدام مجهر ضوئي متداخل (أوليمبوس، طوكيو، اليابان).

الحديد الناتج عن AGEs والتمييز العظمي لخلايا BMSCs تم زراعة خلايا BMSCs من الجيل الثاني في لوحة 96 بئر (10,000 خلية لكل بئر) وتم علاجها بتركيزات مختلفة من tFNACur (مع تركيزات الكركمين من ، و ، و tFNA في ) لمدة 12 ساعة. بالإضافة إلى ذلك، تم تعريضهم لمركبات AGEs بتركيزات مختلفة ( ، و ) لمدة 24 ساعة. بعد ذلك، تم حضن خلايا BMSCs مع مادة CCK-8 (KeyGEN Biotech) لمدة 30 دقيقة عند ، وتم قياس كثافتهم الضوئية عند 450 نانومتر. استنادًا إلى النتائج من اختبار CCK-8 وصبغة ALP، كانت تركيزات AGEs (Bioss، بكين، الصين) عند كان مصمماً على محاكاة بيئة ميكروية لمرض السكري. تم معالجة خلايا BMSCs مسبقاً بـ tFNA والكركم و tFNA-Cur لمدة 12 ساعة، ثم تم معالجتها بـ من AGEs لمدة 24 ساعة للتحقيق في قمع الفيروبتوز. وبالمثل، تم إجراء نفس المعالجة المسبقة، تلتها التعرض لوسط تمايز عظمية (يحتوي على ديكساميثازون حمض الأسكوربيك، و -غليسيروفوسفات) لمدة 7 أيام، مع التعرض المستمر لـ AGEs.

بعد المعالجة المسبقة بـ tFNA-Cur لمدة 12 ساعة والعلاج اللاحق مع AGEs ) لمدة 7 أيام، تم تثبيت خلايا BMSCs بـ بارافورمالدهيد (عند لمدة 20 دقيقة) وتم صبغها باستخدام مجموعة ALP (C3250S، بييوتيم، الصين) في لمدة 10 دقائق. وبالمثل، بعد 14 يومًا، تم حضن الخلايا مع أليزارين الأحمر عند درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. تم ملاحظة نشاط ALP والعقد المعدنية وتصويرها تحت المجهر الضوئي.

بعد العلاج المذكور أعلاه، تم معالجة خلايا BMSCs أولاً بـ tFNA-Cur لمدة 12 ساعة ثم تعرضت لـ AGEs لمدة 24 ساعة. بعد ذلك، تم حضن الخلايا مع Hoechst 33342 (1X، C1028، بييوتيم، الصين) لمدة 10 دقائق و DCFH-DA ( تمت معالجة العينات بـ S0033S (Beyotime، الصين) لمدة 20 دقيقة للكشف عن مستوى ROS. بالإضافة إلى ذلك، تم تحضينها مع Rhodamine 123 (1X، C2008S، Beyotime، الصين) لمدة 20 دقيقة لتقييم مستوى MMP. بعد الغسل بمحلول PBS، تم التقاط صور لـ ROS و MMP باستخدام ميكروسكوب ضوئي متماسك.

مستوى داخل الخلية من تم تقييمه باستخدام مجس فيروأورانج ( ، MkBio، Mx4559). بعد العلاجات المحددة، مشابهة للإجراء الخاص بتقييم ROS و MMP، تم غسل خلايا BMSCs بمحلول PBS ثم تم تحضينها مع Hoechst 33342 لمدة 10 دقائق و FerroOrange لمدة 20 دقيقة. بعد ذلك، تم التقاط صور الفلورية لخلايا BMSCs باستخدام ميكروسكوب ضوئي متماسك.

تمت ملاحظة تغييرات في شكل الميتوكوندريا باستخدام المجهر الإلكتروني النافذ. بعد العلاج المذكور أعلاه، تم تثبيت خلايا BMSCs بـ
محلول الجلوتارالدهيد في لمدة 16 ساعة. بعد ذلك، تم تجفيف خلايا النخاع العظمي باستخدام الأسيتون، وتم تضمينها في Epon812، وتم تقطيعها وتم صبغها بأسيتات اليورانيوم وسترات الرصاص. أخيرًا، تم فحص شكل الميتوكوندريا لمجموعات العلاج المختلفة والتقاطها باستخدام مجهر إلكتروني نافذ JEM1400FLASH.

تم تقييم مستويات النسخ لجينات Alp وRunx2 وOsx وOpn وGpx4 وAcs/4 وNrf2 باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي (RT-PCR). يمكن العثور على تسلسلات البرايمر في الجدول S2 (Tsingke Biotech). تم استخراج RNA الكلي باستخدام كاشف TRIzol (Thermo Fisher Scientific، MA، الولايات المتحدة الأمريكية). تم إجراء تخليق cDNA باستخدام مجموعة SYBR Premix Ex Taq II (Perfect Real Time؛ تاكارا، داليان، الصين). تم قياس الجينات المستهدفة باستخدام SYBR. خليط الماستر الأخضر في Q7 (ABI QuantStudio 7، ثيرمو فيشر، الولايات المتحدة الأمريكية). تم تحليل النتائج باستخدام طريقة كمية نسبية، مع -الأكتين (الجدول S2) يعمل كجين تحكم. تم تكرار جميع التجارب ثلاث مرات.

تم تحلل خلايا BMSCs باستخدام مادة استخراج بروتين الخلايا (KEYGEN Biotech، نانجينغ، الصين)، ثم تم خلطها مع محلول التحميل بنسبة 4:1. ) قبل أن يتم غليها لمدة 5 دقائق. تم فصل البروتينات باستخدام 10% SDS-PAGE ثم تم نقلها إلى غشاء PVDF. بعد ذلك، تم حجب الغشاء باستخدام محلول الحجب (Thermo Fisher Scientific، MA، الولايات المتحدة الأمريكية) لمدة 10 دقائق وتم حضنه مع الأجسام المضادة التالية (الجدول S3) طوال الليل عند في اليوم الثاني، تم حضن الأشرطة مع جسم مضاد ثانوي مضاد للأرنب (1:3000 BEYOTIME، شنغهاي، الصين) لمدة ساعة بعد الغسل بـ TBST. تم تصور النتائج باستخدام نظام كشف كيميائي مضيء ECL (Bio-Rad، هيركوليس، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية).

تم تثبيت خلايا BMSCs باستخدام محلول بارافورمالدهيد ، 25 دقيقة)، تم اختراقه بـ ترايتون X-100 (درجة حرارة الغرفة، 20 دقيقة)، محجوز بـ مصل الأغنام )، وتم غسلها بمحلول PBS في كل خطوة، باستثناء الخطوة النهائية. ثم تم حضنها مع أجسام مضادة محددة: مضاد ALP (1:200، HUABio، تشجيانغ، الصين)، مضاد RUNX2 (1:200، HUABio، تشجيانغ، الصين)، مضاد OSX (1:200، HUABio، تشجيانغ، الصين)، مضاد GPX4 (1:200، HUABio، تشجيانغ، الصين)، مضاد ACSL4 (1:200، HUABio، تشجيانغ، الصين)، ومضاد NRF2 (1:200، HUABio، تشجيانغ، الصين) طوال الليل في . في اليوم التالي، تم حضن خلايا BMSCs مع جسم مضاد ثانوي مضاد للأرنب (1:200، إنفيتروجين، كارلسباد، الولايات المتحدة الأمريكية) في لمدة ساعة واحدة. تم صبغ الهيكل الخلوي بالفاللويدين )، وتم صبغ النواة بـ DAPI ( 10 دقائق)، تليها التنظيف بمحلول PBS في كل خطوة. تم التقاط الصور باستخدام ميكروسكوب ضوئي متماسك (أوليمبوس، طوكيو، اليابان).

تم إجراء جميع تجارب الحيوانات بموافقة لجنة أخلاقيات الحيوانات في مستشفى ويست تشاينا لطب الأسنان، جامعة سيتشوان. تم شراء ذكور الفئران C57BL/6J التي تبلغ من العمر أربعة أسابيع من GemPharmatech (نانجينغ، الصين) وتم تربيتها في ظروف خالية من مسببات الأمراض في الرطوبة و أولاً، تم تحفيز داء السكري من النوع 2 وفقًا للدراسات المنشورة سابقًا. لتحقيق تأثير السكري على الميكروهيكل العظمي، تم تقسيم الفئران عشوائيًا إلى مجموعتين: مجموعة التحكم، مجموعة النظام الغذائي عالي الدهون وSTZ. ). لتقييم التأثيرات العلاجية لـ tFNA والكركم و tFNA-Cur على DOP، تم تقسيم الفئران عشوائيًا إلى خمس مجموعات: مجموعة التحكم، DOP، DOP+tFNA، DOP + كركم، و DOP+tFNA-Cur ( ). خلال التجربة، تم إطعام فئران مجموعة التحكم نظامًا غذائيًا عاديًا ( من الدهون)، بينما تم إطعام مجموعة النموذج ومجموعة العلاج نظام غذائي عالي الدهون ( من الدهون). بعد أربعة أسابيع، جميع المجموعات باستثناء المجموعة الضابطة
تم حقن المجموعة داخل الصفاق بـ STZ ( ) لمدة سبعة أيام لتحفيز مرض السكري. تلقت الفئران في مجموعة التحكم حقن محلول سترات. بعد ذلك، كانت الفئران التي لديها مستويات عالية من الجلوكوز في البلازما ( ) مصحوبة بزيادة الشهية للطعام، وزيادة العطش، وزيادة التبول اعتُبرت فئرانًا مصابة بالسكري للتجارب اللاحقة. تم حقن مجموعات العلاج عن طريق الحقن داخل البطن بـ tFNA ( الكركمين )، أو tFNA-Cur (tFNA: الكركمين: ثلاث مرات أسبوعياً لمدة 8 أسابيع. علاوة على ذلك، تم حقن مجموعتي التحكم وDOP بمحلول ملحي ( تمت مراقبة وزن الجسم ومستويات الجلوكوز الصائم كل أسبوعين. أخيرًا، تم جمع العظام وتحليلها باستخدام التصوير المقطعي المحوسب الدقيق، وصبغة H&E، وصبغة ماسون الثلاثية، وصبغة IF لـ ALP و GPX4 و NRF2.

تم فحص الأطراف السفلية باستخدام جهاز SCANCO Medical Micro-Computerized Tomography 50 ، تم تحديد مناطق الاهتمام (ROI) للفخذ والساق في موقع 2 مم أسفل الإيبيفيس.

تم إيداع عينات الدم في لمدة 30 دقيقة ثم تم الطرد المركزي عند لمدة 10 دقائق للحصول على المصل. تم تحديد مستويات AGEs في كل من عينات المصل والعظام باستخدام مجموعة ELISA لـ AGEs من الفئران (YKW-20124، شنغهاي، الصين).

تم تقييم موت الخلايا في نسيج العظام باستخدام اختبار TUNEL (بيوتايم، شنغهاي، الصين). تم استرجاع مستضدات الأنسجة باستخدام البروتياز ثم تم حضنه مع محلول TUNEL ). بعد ذلك، تم صبغ النواة بـ DAPI ( ). أخيرًا، تم التقاط الصور باستخدام مجهر ضوئي متماسك.

تم تثبيت العينات من مجموعات العلاج المختلفة بـ الفورمالين المخفف لمدة 72 ساعة. بعد شهر من إزالة الكالسيوم، تم تجفيف العظام، وتضمينها في البارافين، وتقطيعها. سُمك). ثم تم صبغ الأقسام باستخدام صبغة H&E وصبغة ماسون الثلاثية لرؤية شكل الأنسجة والمكونات الهيكلية. بالإضافة إلى ذلك، خضعت أقسام العظام لصبغ IF باستخدام الأجسام المضادة anti-ALP وanti-GPX4 وanti-NRF2 كما هو موضح أعلاه.

تم إنشاء الهياكل المتوقعة لـ NRF2 باستخدام برنامج Alphafold. تم إنشاء مستندات شبكة التثبيت باستخدام AutoGrid من Sitemap، وتم إجراء محاكاة التثبيت باستخدام AutoDock Vina (الإصدار 1.2.0). تم اختيار الوضع الأمثل لتحليل التفاعلات. أخيرًا، تم إنشاء شكل تفاعل البروتين-المركب باستخدام PyMOL. في الشكل، يتم تصوير NRF2 كنموذج كرتوني رمادي، بينما يتم عرض الكركمين كعصي زرقاء، ومواقع ارتباطه ممثلة بهياكل عصا بنفسجية.

تم تحليل جميع البيانات التجريبية باستخدام برنامج GraphPad Prism 9.3.1 (سان دييغو، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية). تم إجراء المقارنات بين مجموعتين باستخدام اختبار ستودنت. -اختبار، بينما تم إجراء المقارنات بين أكثر من مجموعتين باستخدام تحليل التباين الأحادي أو الثنائي مع اختبار المقارنة المتعددة لسيداك. تُعرض النتائج التجريبية كمتوسط قيم SD، و اعتُبر ذا دلالة إحصائية.

تم دعم هذا البحث ماليًا من قبل البرنامج الوطني الرئيسي للبحث والتطوير في الصين (2019YFA0110600) ، ومؤسسة العلوم الطبيعية الوطنية في الصين (82370932،

81970917، 82370929، 81970916، 81800947، 82101077) ، برنامج البحث والتطوير ، مستشفى غرب الصين لطب الأسنان بجامعة سيتشوان (RD-03-202102، RD03202302) ، برنامج العلوم والتكنولوجيا في سيتشوان (2022NSFSC0002) ، فريق الابتكار العلمي والتكنولوجي للشباب في مقاطعة سيتشوان (2022JDTD0021). يود المؤلفون أن يشكروا ليينغ هاو (المختبر الوطني الرئيسي لأمراض الفم ، المركز الوطني للبحث السريري لأمراض الفم ، مستشفى غرب الصين لطب الأسنان ، جامعة سيتشوان) على مساعدتها في توصيف AFM.

ساهم Y.L. و Z.C. بالتساوي في هذا العمل. أشرف E.L و Y.L. وابتكروا الدراسة. صمم Y.L. و Z.C. وأكملوا البحث. جمع Y.L. و Z.C. البيانات وحللوها. كتب Y.L. المخطوطة. قدم W.M. و L. B. المساعدة خلال جمع البيانات وتحليلها.

المعلومات التكميلية تحتوي النسخة الإلكترونية على مواد تكميلية متاحة علىhttps://doi.org/10.1038/s41413-024-00319-7.

المصالح المتنافسة: يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح متنافسة.

Open Access This article is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License, which permits use, sharing, adaptation, distribution and reproduction in any medium or format, as long as you give appropriate credit to the original author(s) and the source, provide a link to the Creative Commons licence, and indicate if changes were made. The images or other third party material in this article are included in the article’s Creative Commons licence, unless indicated otherwise in a credit line to the material. If material is not included in the article’s Creative Commons licence and your intended use is not permitted by statutory regulation or exceeds the permitted use, you will need to obtain permission directly from the copyright holder. To view a copy of this licence, visit http:// creativecommons.org/licenses/by/4.0/.
© The Author(s) 2024

Bone Research (2024)12:14 ; https://doi.org/10.1038/s41413-024-00319-7

Diabetic osteoporosis (DOP), a systemic metabolic bone disorder, is the primary cause of reduced bone mass, disruption of bone tissue microstructure, and increased susceptibility to fractures. In 2021, Khosla et al. reported that patients with diabetes had a higher risk of fractures compared to those without diabetes, with a mortality rate 1.23 times higher than that of individuals with type 2 diabetes alone, leading to a significant burden on patients and the healthcare system. Recently, Hofbauer et al. proposed that ferroptosis could represent a crucial cellular and molecular mechanisms underpinning the diabetes-induced skeletal changes. Specifically, elevated levels of ferroptosis inhibit the expression of osteogenic transcription factors, such as osterix (OSX; also known as SP7) and Runt-related transcription factor 2 (RUNX2), altering the equilibrium of osteogenic commitment and differentiation of bone mesenchymal stem cells (BMSCs), negatively affecting bone homeostasis. Therefore, targeting ferroptosis presents a new strategy for the treatment of DOP.

Ferroptosis is a recently identified form of programmed cell death that distinguishes itself from traditional types of programmed cell death, which include apoptosis, autophagy, and pyroptosis, and is characterized by accumulation of iron and lipid peroxidation. Glutathione peroxidase 4 (GPX4), an antioxidative enzyme negatively regulated by endoplasmic reticulum stress and responsible for the elimination of excessive lipid peroxides, is the critical upstream regulator of ferroptosis.

Moreover, GPX4 plays a role of the main protection system against ferroptosis in both the cytoplasm and mitochondria. In the diabetic microenvironment, the intracellular content and activity of GPX4 are significantly reduced, leading to the excessive accumulation of reactive oxygen species (ROS) and , and the ectopic expression of lipid hydroperoxide and ferroptosisrelated proteins, which are considered to be the principal elements that initiate ferroptosis. The direct application of ferroptosis inhibitor ferrostatin-1 (Fer-1) in the mouse model of DOP could reduce bone loss, demonstrating that ferroptosis is closely associated with the pathogenesis of DOP. Nuclear factor E2-related factor 2 (NRF2) inhibits ferroptosis by upregulating the expression of GPX4. Thus, the development of an GPX4 agonist that targets NRF2 activation could effectively eliminate ROS and regulate lipid peroxidation. This approach could inhibit ferroptosis, increase bone formation, and alleviate diabetic osteoporosis.

Curcumin, a polyphenol derived from medicinal plant turmeric, activates the kelch like ECH associated protein 1(KEAP1)/NRF2 pathway. In addition, curcumin has been extensively studied for its anti-inflammatory, antioxidative, and hypolipidemic properties, as well as for its ability to suppress osteoclastogenesis in vitro. We hypothesized that curcumin targeted the cellular redox metabolism to regulate ferroptosis. However, poor pharmacokinetics, targeting, and toxic side effects of curcumin, when administered repeatedly, hinder its widespread use as a drug. Therefore, an alternative delivery system is necessary to advance the development of curcumin into a drug.

Received: 1 November 2023 Revised: 2 January 2024 Accepted: 19 January 2024
Published online: 29 February 2024

With the rapid development of nanotechnology, nanomaterials have shown a wide variety of applications in the biomedical field owing to their excellent biosafety, stability, and multifunctional design. Tetrahedral framework nucleic acid (tFNA) can be selfassembled using four single-stranded DNA (ssDNA) molecules via temperature regulation. The unique property enables tFNA to freely traverse cell membranes. It possesses excellent biocompatibility, safety, editability, and stability, making it a DNA nanomaterial with broad potential applications. Prior studies have demonstrated the ability of tFNA to deliver oligonucleotides (e.g., siRNA and microRNA), polypeptides (e.g., OGP), and natural products (e.g., quercetin and typhaneoside). Moreover, tFNA improves hepatic insulin resistance, reduces blood glucose levels, and alleviates type 2 diabetes (T2DM) through the phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)/Akt pathway. Therefore, the objective of our study was to synthesize a ferroptosis-suppressing nanoparticle using tFNA that would deliver a natural product, specifically curcumin, to the bone marrow, subsequently resulting in enhanced mitochondrial protection, inhibition of ferroptosis, and induction of BMSC osteogenic differentiation in a diabetic microenvironment. We anticipate our findings to provide information regarding the molecular mechanisms involved in the nanoparticle-mediated inhibition of ferroptosis, identifying a novel strategy for the treatment of DOP.

The synthesis of tFNA-Cur involved two steps (Fig. 1a). Initially, tFNA self-assembled through temperature regulation, as demonstrated by polyacryamide gel electrophoresis (PAGE) (Fig. 1b). Subsequently, various concentrations of curcumin (10, 20, and ) were complexed with tFNA through oscillation for 3 h , and successful encapsulation of curcumin into tFNA was confirmed through PAGE (Fig. 1c). The absorption spectrum of tFNA-Cur in Fig. 1d also confirmed this result. The size of tFNA was measured at , and tFNA-Cur was , with zeta potentials of and , respectively (Fig. 1e, Fig. S1b, c). TEM and AFM further demonstrated that the size of tFNA-Cur was , maintaining the 3D nanostructure of tFNA (Fig. 1f, g).

The encapsulation efficiency and curcumin release from tFNACur were determined by evaluating the proportion of curcumin carried by tFNA. With a fixed tFNA concentration of , various concentrations of curcumin ( , and ) were encapsulatedna into tFNA, resulting in a decreasing curve for encapsulation efficiency. The encapsulation efficiencies of curcumin at 10,20 , and were found to be , and , respectively (Fig. 1h). The tFNA exhibited excellent drug-loading capacity within . Moreover, curcumin showed sustained release from tFNA-Cur over 48 h , remaining at , which is significant for clinical applications (Fig. 1i). The excellent water solubility of tFNA-Cur was confirmed by the appearance of synthesized curcumin and tFNA-Cur (Fig. S1a). As a result, we have successfully fabricated a ferroptosis-suppressing nanoparticle, known as “tFNA-Cur,” with a simple synthesis process, excellent drug-loading capacity, and high utilization ratio of the drug.

The issues of poor bioavailability and instability in physiological fluids that significantly restrict the clinical application of natural products are addressed by tFNA-Cur. We investigated the cellular uptake of curcumin and tFNA-Cur using confocal microscopy. The immunofluorescence (IF) images (Fig. 1j, k) revealed that the uptake of tFNA-Cur was superior to that of curcumin at both 6 h and 12 h , with the best penetration effect observed at 12 h , further demonstrating the excellent delivery function of tFNA-Cur. We validated the serum stability of tFNA-Cur (Fig. 1I, m). Dissociative curcumin rapidly degraded in TM buffer within 2 h , with the
residual amount reaching only at 12 h , significantly weaker than the of tFNA-Cur. Moreover, PAGE showed that tFNA-Cur could stably exist in the serum for 12 h , which is longer than dissociative tFNA. The results at and were consistent. Finally, we explored the stability of tFNA and tFNA-Cur labeled with Cy 5 in mice and found that tFNA-Cur remained in physiological fluids for 24 h , superior to the stability of dissociative tFNA (Fig. S2). In conclusion, the synthesized ferroptosissuppressing nanoparticle has successfully addressed the bottleneck of poor bioavailability and instability of natural products in physiological fluids, making it highly promising for a wide range of applications.

Establishment of DOP model and exploration of the ferroptosis in vivo
We established a model of DOP using a high-fat diet (HFD) and low-dose streptozotocin (STZ) (Fig. 2a). Biweekly estimations of body weight and plasma glucose levels were conducted, and inraperitoneal glucose tolerance test (IPGTT) and insulin tolerance test (ITT) were performed on the day of euthanasia. The plasma glucose levels in the HFD&STZ mice continued to rise, while their weights decreased (Fig. 2b-d). IPGTT and ITT demonstrated impaired glucose tolerance and insulin resistance in the HFD&STZ mice (Fig. 2e, f). Pancreatic sections also supported this result (Fig. S3). Interestingly, we found the levels of advanced glycation end products (AGEs) in the plasma and bone of HFD&STZ mice also increased (Fig. 2g, h). AGEs are known markers of diabetes, and their accumulation leads to various complications. These findings indicate that AGEs accumulation is important characteristics of the diabetic microenvironment.

We found that HFD&STZ mice exhibited severe trabecular breakage, absorption, and osteopenia, similar to observations in osteoporosis. Quantitative analysis revealed that the bone volume/total volume ratio (BV/TV), trabecular number (Tb. N), and trabecular thickness (Tb. Th) of HFD&STZ mice decreased, whereas trabecular separation (Tb. SP) and skeletal muscle mass index (SMI) increased. Interestingly, bone mineral density (BMD) between the HFD&STZ and control groups did not show significant differences, consistent with previous studies (Fig. 2i-k). Furthermore, we evaluated the bone microstructure changes in the model mice using hematoxylin and eosin (H&E) and masson staining, and the results are consistent with the micro-CT (Fig. 2l, m).

To further explore the correlation between osteogenesis and ferroptosis in the diabetic microenvironment, we performed TdTmediated dUTP nick-end labeling (TUNEL) of tibial. The results of TUNEL staining showed a significant increase in apoptotic cells in the modeling group (Fig. 2n, Fig. S4). We successfully constructed a model of DOP and showed that ferroptosis is closely associated with the pathogenesis of DOP.

The osteogenic potential of BMSCs, crucial osteoblastic precursor cells in the bone marrow stroma, is inhibited within the diabetic microenvironment. Thus, enhancing the osteogenic potential of BMSCs is crucial for treating DOP. Initially, BMSCs were isolated, cultivated, and identified (Fig. S5a-c). Subsequently, BMSCs were treated with tFNA-Cur or AGEs to assess cell viability. Notably, tFNA-Cur exhibited a concentration-dependent effect on BMSCs, with optimal cell activity observed at tFNA and curcumin (Fig. 3a-c). Different concentrations of AGEs were tested, and was chosen for subsequent experiments since it inhibited the osteogenic potential of BMSCs while maintaining high cell viability (Fig. 3d, Fig. S6a, b).

We treated BMSCs with AGEs to simulate a diabetic microenvironment and investigated the biological functions of tFNACur. As depicted in Fig. 3e, f, osteogenic differentiation and

calcium nodule formation significantly decreased in the diabetic microenvironment. However, the tFNA, curcumin, and tFNA-Cur pretreatment groups demonstrated improvement, particularly the tFNA-Cur group (Fig. 3g, h). Additionally, we assessed the expression of Alp, Runx2, Osx, and Opn through RT-PCR, which
were substantially inhibited in the treatment group but reversed by tFNA-Cur pretreatment (Fig. 3i-I). These findings were further supported by protein level analyses (Fig. 3m-q, Fig. S7a-c). ALP (a marker for osteoblasts), OSX (a specific marker for osteoblast progenitor cells) and RUNX2 (a marker for mature osteoblasts)

were determined using western blot (WB) and immunofluorescence. Consistent patterns revealed that tFNA-Cur significantly promoted osteogenesis in the diabetic microenvironment compared to tFNA or curcumin alone.

Ferroptosis is characterized by lipid peroxidation, iron-dependent accumulation, and downregulation of GPX4. Morphologically, shrunken mitochondria, densely condensed mitochondria, and reduced or vanished mitochondrial cristae are unique features of ferroptosis. To assess changes in reactive oxygen species (ROS) and mitochondrial membrane potential (MMP), we treated cells with AGEs and tFNA-Cur, then observed them using fluorescence microscopy. AGEs stimulation resulted in significant ROS accumulation and mitochondrial membrane rupture, whereas tFNA and curcumin treatment suppressed ferroptosis, with tFNA-Cur showing a more pronounced reduction in ROS levels and membrane damage (Fig. 4a, b, e, f). Similar results were obtained using FerroOrange staining, which indicated iron-dependent accumulation in BMSCs when treated with AGEs. However, the tFNA-Cur pretreatment group exhibited significantly lower levels in the diabetic microenvironment (Fig. 4c, g). Mitochondrial morphology is a crucial indicator of ferroptosis, characterized by shrunken and densely condensed mitochondria with reduced or vanished cristae. Using TEM, we evaluated mitochondrial changes in the diabetic microenvironment. While AGEs induced mitochondrial alterations, tFNA-Cur pretreatment restored mitochondria to a normal state more effectively than tFNA and curcumin alone (Fig. 4d). Western blot and immunofluorescence were used to detect the levels of GPX4 and ACSL4. tFNA-Cur treatment significantly decreased GPX4 expression, however, the trend for ACSL4 was the opposite (Fig. 4k-n, Fig. S7d, e). These findings were also supported by gene expression levels (Fig. 4h, i). tFNA-Cur can significantly enhance mitochondrial defense (GPX4 pathway), protecting BMSCs against ferroptosis.

Combined with the results from the mouse model, ferroptosis of BMSCs inhibits their osteogenic potential in the diabetic microenvironment. Therefore, targeting ferroptosis could be an effective method for treating DOP. In 2023, Liang et al. reported five known ferroptosis suppressor genes: Slc7a11, Nrf2, Fsp1, Gch1, and Nos2. We hypothesize that NRF2 could be a target gene for DOP treatment, as it upregulates GPX4 expression, leading to ferroptosis inhibition. We employed AlphaFold and AutoDock Vina (version 1.2.0) to predict the protein structure of NRF2 and its molecular docking with Curcumin. The interaction analysis (Fig. 4p) revealed multiple groups of interaction forces (Table S4), such as a hydrogen bond between Asp408 of NRF2 and curcumin, with a binding energy of . Based on these findings and previous studies, we propose that curcumin could inhibit ferroptosis by activating the NRF2/GPX4 pathway.

Molecular docking results indicated NRF2 as the target of tFNACur for inhibiting ferroptosis. Accordingly, we assessed NRF2 expression using western blot and immunofluorescence (Fig. 4j-I, o, Fig. S7f), and as expected, similar to GPX4, NRF2 activation was observed upon tFNA-Cur treatment. In conclusion, tFNA-Cur inhibits ferroptosis through the NRF2/GPX4 pathway in the diabetic microenvironment.

To demonstrate our findings in both animal and in vitro experiments, we intraperitoneally injected equal volumes of tFNA, curcumin, and tFNA-Cur into DOP mice (Fig. 5a). tFNA-Cur exhibited superior effects in reducing plasma sugar and AGEs compared to tFNA and curcumin alone (Fig. S8a-c). This enhanced effect may be attributed to the protective impact of tFNA-Cur on pancreatic islets (Fig. 5b). Moreover, the results presented in Fig. 5c-f illustrate that tFNA-Cur treatment significantly restored
trabecular integrity and effectively reduced bone loss when compared to the other treatment groups. These findings were further supported by H&E and masson staining, revealing a substantial increase in the abundance of trabeculae and collagen fibers (Fig. 5g, h). Interestingly, DOP mice exhibited increased accumulation of bone marrow adipocytes (BMAs), consistent with prior research (Fig. S9a-c). Remarkably, tFNA-Cur exhibited no toxicity in mice and effectively treated complications arising from diabetes, as shown in Fig. S10 for the Lung, Liver, and Kidney.

In addition to its positive effects on trabecular homeostasis, tFNA-Cur significantly inhibited ferroptosis and activated the osteogenic potential of BMSCs. To elucidate the underlying mechanism, we examined the molecular expression of ALP, GPX4, and NRF2 in the different treatment groups. tFNA-Cur significantly promoted the expression of NRF2, thereby activating the antioxidant defense system (Fig. 6c, f), and upregulated the expression of GPX4, effectively enhancing mitochondrial defense and inhibiting ferroptosis (Fig. 6b, e). Ultimately, tFNA-Cur exerted its inhibitory effects on ferroptosis through the NRF2/GPX4 pathway, thereby activating the osteogenic potential of BMSCs in the diabetic microenvironment (Fig. 6a, d).

Ferroptosis was first identified in 2012 and is described as a unique iron-dependent type of cell death. Excessive osteocyte death has been observed in the diabetic bone due to the presence of apparent ferroptosis phenotype. This phenotype includes lipid peroxide accumulation, morphological alterations of the mitochondria, iron overload, and ferritin gene activation. These findings indicate that ferroptosis is a target for the treatment of DOP.

DOP is a type of secondary osteoporosis, which could be divided into type 1 and type Compared with type 1, type 2 has a higher morbidity and increased bone microstructure damage. In this study, we constructed a type 2 DOP mouse model using HFD and continuous low-dose STZ. Consistent with other reports, no significant differences were observed in bone mineral density (BMD) in type 2 DOP mice; however, their bone volume/total volume ratio (BV/TV), trabecular number (Tb. N), and trabecular thickness (Tb. Th) were significantly reduced compared to that in the control group. One possible explanation is that two-month timeline was insufficient for cortical bone remodeling. Further, we observed that cell death and AGE accumulation in the bones of type 2 DOP mice were increased compared to those in the controls. Furthermore, in the AGE-induced diabetic microenvironment, ROS levels, mitochondrial dysfunction, excessive accumulation of increased, while GPX4 expression decreased. Based on the above results, we hypothesized that the excessive production of AGEs may be the main cause of cell death in the diabetic microenvironment, and ferroptosis may be only one of several potential major molecular mechanisms involved in this process.

In the cellular antioxidant defense system, the KEAP1/NRF2 metabolic pathway is the central regulator of ferroptosis, inhibiting ferroptosis directly by targeting the reductiveoxidative pathway. Curcumin is one of the main bioactive phenolic compounds isolated from Curcuma longa , an ancient medicinal plant with anti-inflammatory, antioxidant, and hypoglycemic properties. We, in this study, found that curcumin can inhibit ferroptosis and promote the osteogenic differentiation of BMSCs by decreasing the excessive production of ROS, reducing levels, and activating the KEAP1/NRF2 pathway to upregulate the expression of GPX4 in the diabetic microenvironment. These findings suggest that curcumin could be used to prevent and alleviate DOP.
tFNA, as a multifunctional nanomaterial, has been widely applied in various fields of biomedical science to deliver DNA, RNA, peptides, and small-molecule compounds. More

importantly, these nanoparticles have the advantage of good biosafety and high drug utilization. In this study, we developed a ferroptosis-suppressing tFNA nanoparticles to deliver curcumin to BMSCs treated with AGEs and to DOP model mice, to evaluate tFNA-Cur application as a potential treatment option of DOP. Our results demonstrated that ferroptosis-suppressing nanoparticles induced the osteogenic differentiation of BMSCs treated with AGEs by activating the NRF2/GPX4 pathway. Furthermore, our findings showed that these nanoparticles possessed high stability and improved the circulation time of curcumin in physiological fluids, which enhanced its bioavailability, delivering curcumin to the bone marrow and achieving better therapeutic effects at lower doses.

Targeting ferroptosis to alleviate diabetic osteoporosis is a promising therapeutic approach. In this study, we demonstrated that tFNA-Cur nanoparticles could inhibit ferroptosis, enhance mitochondrial function by activating the NRF2/GPX4 pathway, induce the osteogenic differentiation of BMSCs in the diabetic microenvironment, as well as reduce trabecular loss and increase bone formation in a mouse model of DOP (Scheme 1). These findings suggest that the ferroptosis-suppressing nanoparticles based on DNA tetrahedron technology hold a promising potential for the treatment of DOP and other ferroptosisrelated diseases.

However, certain limitations require attention and improvement. Firstly, enhancing the serum stability of ferroptosissuppressing Nanoparticle remains a priority. While tFNA-Cur has demonstrated more stability in normal serum environments, further improvements in stability would enhance the absorption and effectiveness of drug. Secondly, accurate quantification of natural products carried by frame nucleic acids contributes to clinical transformation. At present, the amounts of natural products carried by frame nucleic acids is uncontrollable, although the synthesis of nanocomposites is simple, it restricts clinical application of nano-ferroptosis inhibitors. Lastly and most importantly, how can the BMSCs be targeted more specifically in vivo? For further research, we linked the bone targeting peptide SDSSD on one of the ssDNA through click chemistry, and achieved bone targeting by
encapsulating the BMSCs membrane on the ferroptosissuppressing nanoparticle.

Firstly, four single-stranded DNA molecules (ssDNAs, Table S1) (Sangon, Shanghai, China) were mixed in equimolar quantities, dissolved in TM buffer (Tris- HCl and ), heated at for 10 min , and then cooled at for Secondly, the product of the first step, tFNA ( ), was mixed with various concentrations of curcumin ( , , and ) and oscillated for 3 h .

The synthesis of tFNA-Cur was assessed using PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis). The Zeta potentials and sizes of tFNACur and tFNA were measured using DLS (dynamic light scattering) with the Nano ZS instrument (Malvern, UK). The shapes and sizes of tFNA-Cur were determined using TEM (transmission electron microscopy) with the Libra200 microscope (Zeiss, Oberkochen, Germany) and AFM (atomic force microscopy) with the Cypher VRS microscope (Oxford Instruments, United Kingdom). The complete spectra of tFNA, curcumin, and tFNA-Cur were analyzed using an ultramicrospectrophotometer (UV5 Nano, Mettler Toledo, Switzerland).

Release and stability of tFNA-Cur
Based on previous research, we divided the dialysis bag ( 30 kD ; Solarbio, Beijing, China) into an outer liquid ( 30 mL ) and inner fluid ( 3 mL ) using PBS ( ) as the medium. Equimolar concentrations of curcumin and tFNA-Cur ( ) were dissolved in the inner fluid at with constant agitation . The OD value of the released curcumin in the external liquid was determined using an ultra-microspectrophotometer. To assess the stabilities of tFNA and tFNA-Cur, they were separately incubated with or serum for different time intervals ( 0 h , and 12 h ). Agarose gel electrophoresis was
employed to analyze the stability results. Finally, images of tFNA and tFNA-Cur were captured using an ultraviolet exposure apparatus (Bio-Rad, Hercules, USA).

Male C57 mice, aged 4 weeks, were obtained from GemPharmatech (Jiangsu, China). BMSCs were isolated from the mice’s bone marrow, flushed with-MEM (HYCLONE, Pittsburgh, USA), 10% fetal bovine serum, and penicillin-streptomycin (HYCLONE, Pittsburgh, USA).

BMSCs were cultured in a confocal dish with 10000 cells and treated with curcumin and tFNA-Cur for 6 and 12 h . Images of the cellular uptake of curcumin and tFNA-Cur were captured using a confocal microscope (Olympus, Tokyo, Japan).

AGEs-induced ferroptosis and osteogenic differentiation of BMSCs The second-passage BMSCs were seeded in a 96-well plate (10 000 cells per well) and treated with different concentrations of tFNACur (with curcumin concentrations of , and , and tFNA at ) for 12 h . Additionally, they were exposed to AGEs at various concentrations ( , and ) for 24 h . Subsequently, the BMSCs were incubated with CCK-8 reagent (KeyGEN Biotech) for 30 min at , and their optical density was measured at 450 nm . Based on the results from the CCK-8 assay and ALP staining, the concentration of AGEs (Bioss, Beijing, China) at was determined to simulate a diabetic microenvironment. The BMSCs were pre-treated with tFNA, curcumin, and tFNA-Cur for 12 h , and then treated with of AGEs for 24 h to investigate the suppression of ferroptosis. Likewise, the same pretreatment was conducted, followed by exposure to an osteogenic differentiation medium (containing dexamethasone, ascorbic acid, and -glycerophosphate) for 7 days, with continuous exposure to AGEs.

After pretreatment with tFNA-Cur for 12 h and subsequent treatment with AGEs ( ) for 7 days, BMSCs were fixed with paraformaldehyde (at for 20 min ) and stained with the ALP Kit (C3250S, Beyotime, China) at for 10 min . Similarly, after 14 days, the cells were incubated with Alizarin Red at room temperature for 5 min . ALP activity and mineralized nodules were observed and photographed under a light microscope.

Following the aforementioned treatment, BMSCs were first pretreated with tFNA-Cur for 12 h and then exposed to AGEs for 24 h . Subsequently, the cells were incubated with Hoechst 33342 (1X, C1028, Beyotime, China) for 10 min and DCFH-DA ( , S0033S, Beyotime, China) for 20 min to detect the level of ROS. Additionally, they were incubated with Rhodamine 123 (1X, C2008S, Beyotime, China) for 20 min to assess the level of MMP. After washing with PBS, images of ROS and MMP were acquired using a confocal microscope.

The intracellular level of was assessed using the FerroOrange probe ( , MkBio, Mx4559). Following the specified treatments, similar to the procedure for ROS and MMP assessment, the BMSCs were washed with PBS and then incubated with Hoechst 33342 for 10 min and FerroOrange for 20 min . Subsequently, fluorescence images of the BMSCs were captured using a confocal microscope.

Mitochondrial morphology changes were observed using TEM. Following the aforementioned treatment, BMSCs were fixed with a
glutaraldehyde solution at for 16 h . Subsequently, the BMSCs were dehydrated using acetone, embedded in Epon812, sectioned ( ), and stained with uranium acetate and lead citrate. Finally, the mitochondrial morphology of the various treatment groups was examined and captured using a JEM1400FLASH transmission electron microscope.

The transcriptional levels of Alp, Runx2, Osx, Opn, Gpx4, Acs/4, and Nrf2 were evaluated using reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR). The primer sequences can be found in Table S2 (Tsingke Biotech). Total RNA was extracted using TRIzol reagent (Thermo Fisher Scientific, MA, USA). cDNA synthesis was performed using the SYBR Premix Ex Taq II (Perfect Real Time kit; Takara, Dalian, China). The target genes were measured using SYBR Green I master mix in Q7 (ABI QuantStudio 7, Thermo Fisher, USA). The results were analyzed using the relative quantitative method, with -Actin (Table S2) serving as the control gene. All experiments were repeated three times.

The BMSCs were lysed using a cell protein extraction reagent (KEYGEN Biotech, Nanjing, China), and then mixed with loading buffer at a ratio of 4:1 ( ) before being boiled for 5 min . The proteins were separated using 10% SDS-PAGE and subsequently transferred onto a PVDF membrane. The membrane was then blocked with blocking buffer (Thermo Fisher Scientific, MA, USA) for 10 min and incubated with the following antibodies (Table S3) overnight at . On the second day, the bands were incubated with a secondary anti-rabbit antibody (1:3 000 BEYOTIME, Shanghai, China) for 1 h after washing with TBST. The results were visualized using an ECL chemiluminescence detection system (Bio-Rad, Hercules, CA, USA).

BMSCs were fixed using a paraformaldehyde solution ( , 25 min ), permeabilized with Triton X-100 (room temperature, 20 min ), blocked with sheep serum ( ), and washed with PBS at each step, except for the final step. They were then incubated with specific antibodies: anti-ALP (1:200, HUABio, Zhejiang, China), anti-RUNX2 (1:200, HUABio, Zhejiang, China), anti-OSX (1:200, HUABio, Zhejiang, China), anti-GPX4 (1:200, HUABio, Zhejiang, China), anti-ACSL4 (1:200, HUABio, Zhejiang, China), and anti-NRF2 (1:200, HUABio, Zhejiang, China) overnight at . The next day, BMSCs were incubated with a secondary anti-rabbit antibody (1:200, Invitrogen, Carlsbad, USA) at for 1 h . The cytoskeleton was stained with phalloidin ( ), and the Nucleus was stained with DAPI ( , 10 min ), followed by cleaning with PBS at each step. Images were captured using a confocal microscope (Olympus, Tokyo, Japan).

All animal experiments were conducted with the approval of the Animal Ethics Committee of West China Hospital of Stomatology, Sichuan University. Four-week-old male C57BL/6J mice were purchased from GemPharmatech (Nanjing, China) and raised in pathogen-free conditions at humidity and . First, type 2 diabetes mellitus was induced according to previously published studies. To investigate the effect of diabetes on bone microstructure, mice were randomly divided into two groups: Control, HFD&STZ ( ). To assess the therapeutic effects of tFNA, curcumin and tFNA-Cur on DOP, mice were randomly divided into five groups: Control, DOP, DOP+tFNA, DOP + curcumin, and DOP+tFNA-Cur ( ). Throughout the experiment, the Control group mice were fed an ordinary diet ( from fat), while the model and treatment groups were fed a HFD ( from fat). After four weeks, all groups except the control
group were injected intraperitoneally with STZ ( ) for seven days to induce diabetes. Mice in the Control group received citrate buffer injections. Subsequently, mice with high plasma glucose levels ( ) accompanied by polyphagia, polydipsia, and polyuria were considered diabetic mice for subsequent experiments. The treatment groups were injected intraperitoneally with tFNA ( ), curcumin ( ), or tFNA-Cur (tFNA: , curcumin: ) three times weekly for 8 weeks. Furthermore, the Control and DOP groups were injected with saline ( ). Body weight and fasting glucose levels were monitored every 2 weeks. Finally, the bones were harvested and analyzed using micro-CT, H&E staining, masson’s trichrome staining, and IF staining for ALP, GPX4, and NRF2.

The lower extremities were examined using a SCANCO Medical Micro-Computerized Tomography 50 ( , ). The regions of interest (ROI) for the femurand tibia were identified at a location 2 mm below the epiphysis.

Blood samples were deposited at for 30 min and then centrifuged at for 10 min to obtain the serum. The levels of AGEs in both the serum and bone samples were determined using a mouse AGEs ELISA kit (YKW-20124, Shanghai, China).

Cell death in the bone tissue was assessed using the TUNEL assay (Beyotime, Shanghai, China). Tissue antigens were retrieved using proteinase and then incubated with TUNEL solution ( ). Subsequently, the Nucleus was stained with DAPI ( ). Finally, images were captured using a confocal microscope.

The specimens from various treatment groups were fixed with buffered formalin for 72 h . After one month of decalcification, the bones were dehydrated, embedded in paraffin, and sectioned ( thick). The sections were then stained with H&E and masson’s trichrome to visualize tissue morphology and structural components. Additionally, the bone sections underwent IF staining using anti-ALP, anti-GPX4, and anti-NRF2 antibodies as described above-mentioned.

The predicted structures of NRF2 were generated using the Alphafold software. Docking grid documents were created using AutoGrid of Sitemap, and the docking simulation was performed using AutoDock Vina (version 1.2.0). The optimal pose was selected for analyzing the interactions. Finally, the proteincompound interaction figure was generated using PyMOL. In the figure, NRF2 is depicted as a slate cartoon model, while curcumin is shown as cyan sticks, and its binding sites are represented by magenta stick structures.

All experimental data were analyzed using GraphPad Prism 9.3.1 software (San Diego, CA, USA). Comparisons between two groups were conducted using Student’s -test, while comparisons among more than two groups were performed using one-way or two-way ANOVA with Sidak’s multiple comparison test. The experimental results are presented as the mean SD values, and was considered statistically significant.

This research was financially supported by the National Key R&D Program of China (2019YFA0110600), the National Natural Science Foundation of China (82370932,

81970917, 82370929, 81970916, 81800947, 82101077), the Research and Develop Program, West China Hospital of Stomatology Sichuan University (RD-03-202102, RD03202302), Sichuan Science and Technology Program (2022NSFSC0002), Sichuan Province Youth Science and Technology Innovation Team (2022JDTD0021). The authors would like to thank Liying Hao (State Key Laboratory of Oral Diseases, National Clinical Research Center for Oral Diseases, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University) for her help in characterizing AFM.

Y.L. and Z.C. contributed equally to this work. E.L and Y.L. supervised and conceived of the study. Y.L. and Z.C. designed and completed the research. Y.L. and Z.C. collected and analyzed the data. Y.L. wrote the manuscript. W.M. and L. B. provided help during data collection and analysis.

Supplementary information The online version contains supplementary material available at https://doi.org/10.1038/s41413-024-00319-7.

Competing interests: The authors declare no competing interests.

Open Access This article is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License, which permits use, sharing, adaptation, distribution and reproduction in any medium or format, as long as you give appropriate credit to the original author(s) and the source, provide a link to the Creative Commons licence, and indicate if changes were made. The images or other third party material in this article are included in the article’s Creative Commons licence, unless indicated otherwise in a credit line to the material. If material is not included in the article’s Creative Commons licence and your intended use is not permitted by statutory regulation or exceeds the permitted use, you will need to obtain permission directly from the copyright holder. To view a copy of this licence, visit http:// creativecommons.org/licenses/by/4.0/.
© The Author(s) 2024