الكلمات الرئيسية: بيبيرين، جزيئات أكسيد الزنك النانوية، مضاد السرطان، مضاد الميكروبات

ضمان صحة الفم المثلى أمر بالغ الأهمية بسبب التأثير الكبير للجراثيم السنية وسرطان الفم على الرفاهية العامة. ترتبط الجراثيم السنية بمختلف الأمراض الفموية مثل تسوس الأسنان، وأمراض اللثة، والعدوى الفموية. إذا تُركت هذه الحالات دون علاج، يمكن أن تؤدي إلى الألم، والانزعاج، وفقدان الأسنان، وحتى مشاكل صحية نظامية بسبب إمكانية دخول البكتيريا إلى مجرى الدم. علاوة على ذلك، يمثل سرطان الفم، الذي يمكن أن ينشأ من عوامل متعددة بما في ذلك استخدام التبغ، واستهلاك الكحول، وعدوى فيروس الورم الحليمي البشري، مصدر قلق كبير. يرتبط المكورات العنقودية الذهبية بتسوس الأسنان، وأمراض اللثة، والخراجات الفموية، مما يشكل تحديات بسبب قدرتها على إنتاج السموم ومقاومة المضادات الحيوية. تعتبر المكورات العقدية الطافرة سببًا رئيسيًا لتسوس الأسنان، حيث تنتج أحماضًا تؤدي إلى تآكل مينا الأسنان وتشكيل أغشية حيوية تساهم في تكوين اللويحات. تُعتبر الإشريكية القولونية من العوامل المسببة للعدوى المستمرة في قنوات الجذور وفشل العلاج، وغالبًا ما تظهر مقاومة للعوامل المضادة للميكروبات التقليدية. يمكن أن تؤدي الكانديدا البيض إلى داء المبيضات الفموي، خاصةً لدى الأفراد الذين يعانون من ضعف المناعة، مع إمكانية حدوث عدوى نظامية. إن فهم آليات المرض وتفاعلات المضيف والجراثيم لهذه الجراثيم السنية أمر ضروري لتطوير علاجات مستهدفة واستراتيجيات وقائية للتخفيف من تأثيرها على صحة الفم والرفاهية العامة.

يقدم سرطان الفم تحديات كبيرة ناتجة عن التشخيص المتأخر، والقدرة العالية على الانتشار، وتعقيدات العلاج، والتكرار المتكرر. تتفاعل مسببات الأمراض السنية مع سرطان الفم من خلال آليات متعددة الأوجه. أولاً، تخلق الالتهابات المزمنة التي تسببها مسببات الأمراض بيئة ميكروية ملائمة لتطور الورم. تطلق هذه المسببات السيتوكينات المؤيدة للالتهاب وتفعّل خلايا المناعة، مما ي perpetuates الالتهاب ويسهل التسرطن. ثانياً، تنتج بعض مسببات الأمراض السنية مواد جينية سامة، مثل أنواع الأكسجين التفاعلية، مما يسبب تلف الحمض النووي وعدم استقرار الجينوم في خلايا الظهارة الفموية. يمكن أن يؤدي هذا التلف الجيني إلى بدء وتقدم الآفات السرطانية. بالإضافة إلى ذلك، قد تسهم اختلالات الميكروبيوم الفموي، التي تُرى غالبًا في أمراض اللثة، في تطوير سرطان الفم من خلال التفاعلات مع استجابات المناعة لدى المضيف ومسارات الإشارة. علاوة على ذلك، قد تؤثر مسببات الأمراض السنية بشكل مباشر على المسارات المسرطنة داخل خلايا الفم، مما يعزز تكاثر الخلايا وبقائها. بالإضافة إلى فهم مسببات سرطان الفم، من الضروري مناقشة تشخيصه وعلاجه. يتضمن التشخيص عادةً مزيجًا من الفحص السريري، وتقنيات التصوير مثل الأشعة المقطعية (CT) والتصوير بالرنين المغناطيسي (MRI)، وخزعة للتحليل النسيجي.
موقع الورم ولكن قد تشمل الجراحة، العلاج الإشعاعي، العلاج الكيميائي، العلاج المستهدف، والعلاج المناعي. غالبًا ما تكون هناك حاجة إلى نهج متعددة التخصصات تشمل أطباء الأورام، الجراحين، أطباء الأسنان، وغيرهم من المتخصصين في الرعاية الصحية لتقديم رعاية شاملة للمرضى المصابين بسرطان الفم.

بيبيرين (PIP)، وهو قلويد موجود بشكل طبيعي في الفلفل الأسود ونباتات أخرى، يمتلك تأثيرات مضادة للميكروبات قوية ضد مجموعة متنوعة من مسببات الأمراض، بما في ذلك البكتيريا والفطريات، مما يجعله مرشحًا جذابًا لتطبيقات صحة الفم. في الوقت نفسه، أظهرت جزيئات أكسيد الزنك النانوية (ZnO NPs) نشاطًا مضادًا للسرطان بشكل كبير ضد خلايا السرطان، حيث تمنع تكاثرها وتسبب موت الخلايا المبرمج. استكشفت الدراسات السابقة استخدام جزيئات ZnO NPs المغلفة بحمض القرفة والكركمين للنشاط المضاد للميكروبات ضد مسببات الأمراض السنية واستهداف مسار BCL-2/BAX/P53 لتعزيز موت الخلايا المبرمج في خلايا الفم الحرشفية. قد يؤدي تغليف جزيئات ZnO NPs بـ PIP إلى تعزيز فعاليتها وانتقائيتها ضد خلايا سرطان الفم مع تقليل التأثيرات غير المستهدفة. لم يتم الإبلاغ عن هذه التركيبة الفريدة في الأدبيات من قبل، مما يمثل نهجًا جديدًا في هذا المجال. يمكن أن يؤدي دمج PIP و ZnO NPs إلى تعزيز تأثيراتهما العلاجية الفردية ضد مسببات الأمراض السنية وسرطان الفم. قد يعزز PIP الفعالية المضادة للميكروبات لجزيئات ZnO NPs من خلال تعطيل أغشية خلايا مسببات الأمراض السنية، مما يزيد من حساسيتها للتلف الناتج عن الجزيئات النانوية. بالإضافة إلى ذلك، قد تعزز قدرة PIP على تعديل مسارات الإشارات داخل الخلايا المعنية بنمو خلايا السرطان وبقائها التأثيرات المضادة للسرطان لجزيئات ZnO NPs. في هذه الدراسة، قمنا بدمج PIP و ZnO NPs لتوصيل تركيبتها المستهدفة على سطح مستقبلات مسببات الأمراض السنية وخلايا سرطان الفم لتعزيز نشاطها وفعاليتها في الطب الفموي، مما يوفر استراتيجية واعدة لمعالجة كل من الحالات الفموية المعدية والخبيثة.

أ تم تحضير محلول مركز من PIP عن طريق إذابة 50 ملغ من مسحوق PIP في 5 مل من الإيثانول. تم تخليق جزيئات ZnO النانوية بواسطة طريقة الترسيب. خلات الزنك ثنائية الهيدرات. ( تم إذابته في محلول PIP مع التحريك المستمر في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. بعد ذلك، تم إضافة هيدروكسيد الصوديوم حل تمت الإضافة قطرة قطرة إلى محلول أسيتات الزنك حتى وصل الرقم الهيدروجيني إلى حوالي 10. تم تحريك المزيج الناتج لمدة ساعتين إضافيتين لضمان حدوث التفاعل بالكامل. سهلت طريقة التخليق الأخضر تشكيل مركب النبات-ZnO NPs، والتي تم بعد ذلك طردها مركزيًا بسرعة 8000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق، وغسلت بالماء المقطر لإزالة الشوائب، وأخيرًا تم تجفيفها في لمدة 12 ساعة
تحت الفراغ. تم مسح تعليقات الجسيمات النانوية في الماء المقطر في نطاق الطول الموجي من استخدام مطياف الأشعة فوق البنفسجية والمرئية للحصول على طيف الامتصاص، الذي قدم رؤى حول طاقة فجوة النانو. تم فحص الشكل والتوزيع الحجمي للنانو المترسب باستخدام مجهر إلكتروني مسح. تم تحميل عينات المسحوق على حامل العينات وتم مسحها عند نطاق من بحجم خطوة قدره تحليل حيود الأشعة السينية (XRD) قدم معلومات حول الأطوار البلورية وحجم البلورات للنانو جزيئات. تم التحقيق في الروابط الكيميائية والمجموعات الوظيفية الموجودة في النانو جزيئات المُصنّعة باستخدام مطيافية الأشعة تحت الحمراء بتحويل فورييه (FTIR) وتحليل الأشعة السينية المشتتة للطاقة (EDAX) [21]. الحفاظ على السيطرة الدقيقة على ظروف التفاعل مثل درجة الحرارة، ودرجة الحموضة، ووقت التفاعل أمر حاسم لإمكانية التكرار. من الضروري تحسين هذه المعلمات للدفعات الأكبر. بالإضافة إلى ذلك، فإن الحصول على مواد خام عالية الجودة وفعالة من حيث التكلفة مثل خلات الزنك ثنائية الهيدرات والبيبرين بكميات كبيرة مع ضمان الاتساق يمثل تحديات لوجستية.

يعتمد اختبار DPPH على قدرة مضادات الأكسدة على التبرع بذرات الهيدروجين أو الإلكترونات لتحييد جذر DPPH، وهو جذر حر مستقر يحتوي على إلكترون غير متزاوج. تم إجراء اختبار DPPH لتقييم النشاط المضاد للأكسدة للعينات المختبرة. باختصار، تم استخدام تركيزات مختلفة ( ، و ) من جزيئات ZnO-PIP تم تحضيرها. تم تحضير محلول من جذر DPPH (0.1 مليمول) عن طريق إذابة DPPH في الإيثانول. تم أخذ عينات ( ) من جزيئات ZnO-PIP عند تركيزات مختلفة تم خلطها مع 900 محلول DPPH وتم حضنه في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. تم قياس امتصاصية المحلول الناتج عند 517 نانومتر باستخدام مطياف الأشعة فوق البنفسجية والمرئية [22].

يقيّم اختبار ABTS قدرة مضادات الأكسدة على القضاء على الجذور الحرة، التي تتكون من أكسدة ABTS مع بيرسلفات البوتاسيوم. الـ ABTS تم توليد كاتيون جذري عن طريق خلط محلول ABTS مع البوتاسيوم بيرسولفات (2.45 مللي مول) وترك المزيج في الظلام عند درجة حرارة الغرفة لمدة 16 ساعة. الناتج هو ABTS تم تخفيف المحلول بالإيثانول للحصول على امتصاص قدره عند 734 نانومتر. تركيزات مختلفة من جزيئات ZnO-PIP النانوية ، ، و تم تحضير عينات من جزيئات Zno-PIP عند تركيزات مختلفة تم خلطها مع من ABTS المخفف تم تحضير المحلول وتخزينه في الظلام عند درجة حرارة الغرفة لمدة 6 دقائق. كانت امتصاصية المحلول الناتج
تم القياس عند 734 نانومتر باستخدام مطياف الأشعة فوق البنفسجية والمرئية [23].

تم إجراء اختبار MIC لتحديد أدنى تركيز من جزيئات ZnO-PIP النانوية المطلوبة لمنع النمو المرئي للجراثيم السنية (S. aureus، S. mutans، E. faecalis، C. albicans). كل تركيز من ( تم إضافة ZnO-PIP إلى آبار فردية من لوحة ميكروتيتر معقمة. إلى كل بئر، من اللقاح الذي يحتوي على تعليق موحد من مسببات الأمراض السنية بتركيز يقارب وحدات تشكيل المستعمرات لكل مليلتر ) تم إضافته. ثم تم تغطية لوحة الميكروتيتر وحضانتها عند درجة الحرارة المناسبة للميكروorganism المحدد (على سبيل المثال، للبكتيريا، للفطريات) لـ بعد الحضانة، تم فحص نمو الميكروبات بصريًا في كل بئر، وتم تعريف الحد الأدنى من التركيز المثبط (MIC) على أنه أقل تركيز للمركب المختبر الذي منع تمامًا النمو المرئي، كما يتضح من غياب العكارة أو المستعمرات المرئية [24].

تم استخدام طريقة انتشار الآبار لتقييم النشاط المضاد للميكروبات لجزيئات ZnO-PIP النانوية ضد مسببات الأمراض السنية. تم إعداد أطباق أجار مغذية وتم تلقيحها بتعليق موحد من الكائنات الدقيقة المختبرة عن طريق دهن سطح الأجار باستخدام مسحة معقمة لتحقيق نمو متجانس. تم إنشاء آبار على أطباق الأجار باستخدام مثقاب فلين معقم أو مثقاب آبار متاح تجارياً. تم إضافة تركيزات مختلفة من جزيئات Zn-PIP النانوية إلى آبار منفصلة على أطباق الأجار. بالإضافة إلى ذلك، تم إنشاء آبار تحتوي على العامل المضاد للميكروبات القياسي المعروف نشاطه (التحكم الإيجابي) أيضًا على أطباق الأجار. ثم تم حضن الأطباق عند درجة الحرارة المناسبة للميكروorganism المحدد (على سبيل المثال، للبكتيريا، للفطريات) بعد الحضانة، تم فحص الألواح، وتم قياس قطر المنطقة الواضحة المحيطة بكل بئر باستخدام مسطرة معايرة. تم تسجيل قطر منطقة التثبيط بالملليمترات (مم) كمؤشر على النشاط المضاد للميكروبات لجزيئات ZnO-PIP النانوية.

AutoDock هو برنامج مستخدم على نطاق واسع لدراسات الربط الجزيئي الذي يتنبأ بقيم قوة الارتباط (كيلوكالوري/مول) بين الجزيء المتفاعل والمستقبل. تم الحصول على التركيب ثنائي الأبعاد لمركب PIP من قاعدة بيانات PubChem.https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/ ) وتم تحويلها إلى تنسيق ثلاثي الأبعاد باستخدام برامج مثل PyMOL. تم الحصول على هياكل المستقبلات للجراثيم السنية من بنك بيانات البروتينات (PDB) (https:// www.rcsb.org/) وتم إعدادها لدراسات الالتحام باستخدام

أداة أوتودوك الإصدار 1.5.7. تم إضافة الهيدروجينات والشحنات والروابط المناسبة إلى كل من هياكل الجزيء المتفاعل والمستقبل. تم استيراد هياكل الجزيء المتفاعل والمستقبل المعدة إلى أدوات أوتودوك. تم تعريف المستقبل كهيكل صلب، بينما تم تعيين الجزيء المتفاعل كمرن لاستكشاف أشكال مختلفة. تم تعريف موقع الربط للمستقبل بناءً على بقايا الموقع النشط أو جيوب الربط المعروفة. تم ضبط معلمات مثل حجم صندوق الشبكة، والمسافة، ومعلمات البحث وفقًا لمواصفات أوتودوك. تم تعديل معلمات خوارزمية لامارك الجينية لضمان استكشاف فعال لمساحة الأشكال. أخيرًا، بعد التحليل، تم تصور التفاعل بين الجزيء المتفاعل والمستقبل في برنامج عرض استوديو ديسكفري [25].

تم زراعة خلايا KB (خلايا سرطان الظهارة البشرية) في وسط دلبوكو المعدل من وسط إيجل (DMEM) معززة بـ مصل الجنين البقري (FBS) و البنسلين-ستربتوميسين في حاضنة مرطبة عند مع . عند الوصول إلى تمت معالجة الخلايا بتراكيز مختلفة من جزيئات ZnO-PIP النانوية. بعد الحضانة مع جزيئات ZnO-PIP لمدة 24 ساعة، تم تقييم حيوية خلايا KB باستخدام اختبار 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT). باختصار، تمت إزالة وسط الثقافة، وتم غسل الخلايا بمحلول ملحي مخفف بالفوسفات (PBS). محلول MTT ( في PBS) تم إضافته إلى كل بئر، وتمت مواصلة حضن الخلايا لمدة 3 ساعات في بعد الحضانة، تم شفط محلول MTT، وأضيف ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) لذوبان بلورات الفورمازان. تم قياس امتصاصية المحلول الناتج عند 570 نانومتر باستخدام قارئ الميكرو بلايت [26].

يمكن قياس مستويات التعبير لجينات معينة من خلال قياس كمية منتج cDNA المضخم، مما يوفر رؤى قيمة حول تنظيم الجينات تحت ظروف تجريبية مختلفة. تم استخراج RNA الكلي من خلايا KB المعالجة بـ ZnO-PIP باستخدام مادة Trizol وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. باختصار، تم تحلل الخلايا في مادة Trizol، وتم إضافة الكلوروفورم لفصل الطور المائي المحتوي على RNA. تم ترسيب RNA باستخدام الإيزوبروبانول، وغسلها بالإيثانول، وإعادة تعليقها في محلول خالٍ من RNase.
الماء. تم تقييم جودة وكمية RNA باستخدام مقياس الطيف الضوئي. تم إجراء تخليق cDNA من الشريط الأول باستخدام مجموعة النسخ العكسية وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة. باختصار، تم حضانة عينات RNA مع خليط يحتوي على إنزيم النسخ العكسي، وبرايمرات عشوائية، وdNTPs، ومثبط RNase في لمدة ساعة واحدة لتخليق cDNA. ثم تم إنهاء التفاعل بالتسخين عند لمدة 5 دقائق، وتم تخزين cDNA في حتى يتم إجراء تحليل إضافي. تم إجراء تحليل RT-PCR الكمي (qRT-PCR) لتحليل مستويات التعبير للجينات المستهدفة في خلايا KB المعالجة بجزيئات ZnO-NPs. تم تقديم البرايمرات المحددة للجينات وقائمة الاختصارات في الجدول 1 والجدول التكميلي الإلكتروني 1. تضمنت ظروف التضخيم خطوة إنكار أولية عند لمدة 5 دقائق، تليها 40 دورة من الت denaturation عند لمدة 30 ثانية، التلدين لمدة 30 ثانية، والتمديد عند لمدة 30 ثانية. تم تطبيع مستويات تعبير mRNA إلى جين housekeeping، مثل GAPDH، وتم حسابها باستخدام طريقة [27].

تم إجراء تحليل إحصائي لتقييم دلالة الفروق بين تركيزات مختلفة من مجموعة معالجة ZnO-PIP NPs والمجموعة الضابطة (غير المعالجة) باستخدام تحليل التباين الأحادي (ANOVA)، تلاه مقارنات متعددة بعد الاختبار (اختبار توكي). اعتُبرت النتائج ذات دلالة إحصائية عند تُعرض البيانات كمتوسط الانحراف المعياري، مع إجراء كل تجربة ثلاث مرات.

تحليل طيف الامتصاص بالأشعة فوق البنفسجية والمرئية لجزيئات ZnO-PIP النانوية يكشف عن قمة امتصاص بارزة عند 279 نانومتر بقيمة امتصاص تبلغ 4.30878 (الشكل 1). تتوافق هذه القمة الامتصاصية مع الانتقالات الإلكترونية التي تحدث داخل جزيئات ZnO النانوية. على وجه التحديد، تُعزى القمة الملحوظة عند 279 نانومتر إلى امتصاص فجوة الطاقة لـ ZnO، وهو ما يميز طبيعته كموصل شبه. إن امتصاص الفوتونات عند هذه الطول الموجي يعزز الإلكترونات من نطاق التكافؤ إلى نطاق التوصيل، مما يشير إلى إثارة حوامل الشحنة داخل الجزيئات النانوية. يكشف تحليل المجهر الإلكتروني الماسح لجزيئات ZnO-PIP النانوية عن شكل معقد يتميز بوجود جزيئات نانوية متبلورة بأحجام متفاوتة تقل عن 500 نانومتر (الشكل 2). تظهر الجزيئات النانوية ميلاً للتجمع، مما يشكل تجمعات بأشكال غير منتظمة. هذا التجمع

قد يُعزى ذلك إلى التفاعلات القوية بين الجسيمات أو كيمياء السطح للجسيمات النانوية التي تتوسطها وجود PIP. على الرغم من التكتل، تظهر الجسيمات النانوية الفردية أسطحًا ناعمة نسبيًا مع بعض الشوائب السطحية العرضية. كما تشير صور SEM أيضًا إلى وجود هياكل بلورية، حيث تظهر بعض الجسيمات النانوية وجوهًا تشير إلى وجوه بلورية، على الرغم من أن التأكيد الإضافي من خلال تقنيات مثل حيود الأشعة السينية سيكون ضروريًا لتوضيح الطبيعة البلورية للجسيمات النانوية. يُظهر تحليل XRD لجسيمات ZnO-PIP النانوية
مرحلة بلورية تتكون من من العينة، إلى جانب مرحلة غير متبلورة تشكل المادة. يكشف نمط XRD عن عدة قمم مميزة عند ترددات مختلفة قيم، تشير إلى الطبيعة البلورية للجزيئات النانوية. على وجه التحديد، القمم الملحوظة عند قيم من ، و تتوافق مع مستويات مختلفة من شبكة بلورة ZnO (الشكل 3). يمكن فهرسة هذه القمم إلى الهيكل البلوري السداسي الويرتزايت لـ ZnO، مع مستويات (100)، (002)، (101)، (102)، (110)، (103)، (200)، و(112) .

على التوالي. تشير وجود القمم المحددة جيدًا إلى العلوية البلورية العالية والنقاء لجزيئات ZnO النانوية، مع وجود الحد الأدنى من الشوائب أو المراحل غير المتبلورة. تم ملاحظة القمم في FTIR عند ، و يت correspond to اهتزازات الشد لمجموعات الهيدروكسيل (OH) وروابط C-H الأليفاتية، مما يشير إلى وجود مجموعات هيدروكسيل سطحية وموحدات عضوية قد تكون ناتجة عن عامل التغطية PIP (الشكل 4). القمة عند يشير إلى وجود كربونيل ) اهتزازات التمدد، تشير إلى المجموعات الوظيفية الموجودة في PIP. القمم الملحوظة عند ، و تتوافق مع العطرية اهتزازات التمدد، مما يؤكد وجود حلقات عطرية في PIP. بالإضافة إلى ذلك، قمم عند و مرتبطة بـ اهتزازات الانحناء في الحلقة العطرية، بينما القمم عند و تشير اهتزازات تمدد C-O، ربما من رابطة في أو المجموعات الوظيفية في PIP. علاوة على ذلك، قمم عند ، و تتوافق مع اهتزازات تمدد ZnO، مما يشير إلى وجود ZnO. القمم عند أرقام الموجات الأقل، مثل ، و يمكن أن يُعزى ذلك إلى اهتزازات الشبكة أو الميزات الهيكلية لجزيئات ZnO النانوية. تكشف تحليل EDAX عن وجود إشارات الكربون، مما يتماشى مع الطبيعة العضوية لوكيل التغطية PIP المستخدم أثناء تخليق الجزيئات النانوية (الشكل 5). تؤكد القمم البارزة التي تتوافق مع الزنك والأكسجين وجود جزيئات ZnO النانوية في العينة. تشير تحليل التركيب العنصري إلى أن الجزيئات النانوية تتكون في الغالب من الزنك والأكسجين، بما يتماشى مع التركيب المتوقع لـ ZnO.

تظهر نتائج اختبار DPPH (الشكل 6A) تأثيرًا متجاوبًا مع الجرعة في تقليل الجذور الحرة DPPH بواسطة جزيئات ZnO-PIP النانوية. تزداد نسبة نشاط التقليل مع زيادة التركيزات من ، ، و ، مع عرض القيم المقابلة لـ ، و . في هذه الأثناء، عند تركيزات من تظهر القدرة المضادة للأكسدة لجزيئات ZnO-PIP النانوية فعالية مماثلة لتروكس.

تشير النتائج من اختبار ABTS (الشكل 6B) إلى تأثير scavenging يعتمد على الجرعة لجزيئات ZnO-PIP النانوية على جذور ABTS. تم ملاحظة الانخفاض في الامتصاص، مما يدل على تقليل جذور ABTS، حيث سهلت جزيئات ZnO-PIP النانوية تحويل ABTS إلى كاتيونه الجذري (ABTS•+). مع زيادة تركيزات جزيئات ZnO-PIP النانوية ( ، و )، كان هناك ارتفاع ملحوظ في نسبة تقليل الجذور الحرة ABTS، مع قيم قدرها ، و على التوالي. علاوة على ذلك، فإن امتصاص جذور ABTS بواسطة جزيئات ZnO-PIP عند تركيزات من أظهرت نشاطًا أفضل.

أظهرت جزيئات ZnO-PIP نانو فعالية مستمرة في قيم MIC ضد مسببات الأمراض السنية المختبرة، بما في ذلك . الذهبية، S. mutans، E. faecalis، و C. albicans، جميعها تظهر القابلية عند . هذا يشير إلى أن تركيزات وفعّلت بشكل أكبر تثبيط نمو هذه العوامل الممرضة (الشكل 7). بالإضافة إلى ذلك، أظهرت تجربة منطقة التثبيط النشاط المضاد للميكروبات لجزيئات ZnO-PIP النانوية ضد جميع العوامل الممرضة السنية المختبرة. عند تراوحت مناطق التثبيط من ، و 11 مم ، وعند ، زادت أكثر، حيث تراوحت بين 15 و 14 و 18 و 16 مم لـ . الذهبية، S. mutans، E. faecalis، و C. albicans، على التوالي (الجدول 2). كانت جزيئات ZnO-PIP في أظهرت مناطق تثبيط أصغر قليلاً مقارنة بالتحكم الإيجابي، الأموكسيسيلين ( ). ولكن في نفس الوقت ZnO-PIP NPs عند تحسنت نشاطها المضاد للميكروبات بشكل ملحوظ، متجاوزةً نشاط الأموكسيسيلين لجميع العوامل الممرضة المختبرة.

كشفت دراسة الربط الجزيئي عن تفاعلات واعدة بين PIP وبروتينات مستقبلات أربعة مسببات أمراض أسنان: S. aureus و S. mutans و E. faecalis و C. albicans (الشكل 8). ومن الجدير بالذكر أن PIP أظهر قيم ارتباط أعلى مع مستقبلات المسببات، مما يشير إلى إمكانيته كعامل علاجي ضد العدوى السنية (الجدول 3). على وجه التحديد، في تحليل الربط مع بروتين السطح S. aureus G (معرف PDB: 7SMH)، أظهر PIP affinity ارتباط. . كانت هذه التفاعلات تتضمن أحماض أمينية حيوية مثل ARG وASP وGLY وARG مما يشير إلى احتمال تعطيل بروتين السطح وبالتالي عرقلة مسببات الأمراض في S. aureus. وبالمثل، بالنسبة لـ S. mutans، أسفر تحليل الربط مع نهاية الكربوكسيل لمستضد I/II (معرف PDB: 3QE5) عن قوة ارتباط . أظهرت التفاعلات مع الأحماض الأمينية VAL و VAL و LYS و ILE و VAL أن PIP قد تعطل وظيفة الطرف الكربوكسي لمستضد I/II، مما يؤثر على pathogenicity S. mutans. فيما يتعلق بـ E. faecalis، كشفت تحليل الربط مع بروتين السطح المعوي (PDB ID: 6ORI) عن affinity ربط قدره ، مع تفاعلات تشمل الأحماض الأمينية إيل، ليس، ألا، وليو. وهذا يشير إلى أن PIP قد يتداخل مع هذا البروتين، مما يعيق تشكيل الأغشية الحيوية ويخفف من . pathogenicity لـ faecalis. أخيرًا، في تحليل الربط مع C. albicans ALS3 (معرف PDB: 4LEE)، أظهر PIP affinity ربط مع تفاعلات تشمل الأحماض الأمينية LYS و LYS و SER. وهذا يشير إلى أن PIP قد يتداخل مع وظيفة ALS3، وهو بروتين أساسي يشارك في الالتصاق بأسطح العائل، مما يؤثر على تشكيل الأغشية الحيوية، وهي خطوة حاسمة في مسببات الأمراض لـ C. albicans.

تظهر النتائج الموضحة في الشكل 9 تغييرات ملحوظة في حيوية خلايا KB استجابةً لزيادة تركيزات جزيئات ZnO-PIP النانوية. عند تركيز أقل من مل، كان هناك تأثير ضئيل فقط على بقاء الخلايا بعد 24 ساعة من التعرض. بالمقابل، أظهرت المجموعة المعالجة بالسيكلوفوسفاميد انخفاضًا كبيرًا.
في بقاء الخلايا، ينخفض إلى . ومع ذلك، عند تركيزات أعلى، لا سيما انخفاض ملحوظ في حيوية خلايا KB كان واضحًا، حيث يشبه حيوية الخلايا التي لوحظت في مجموعة التحكم الإيجابية. تشير هذه النتائج إلى تأثير مضاد للسرطان يعتمد على التركيز لجزيئات ZnO-PIP النانوية على خلايا KB، مما يدل على آثار محتملة لعلاج سرطان الفم.

فحص جزيئات ZnO-PIP عند تركيز أظهرت خصائص مضادة للأكسدة ومضادة للميكروبات ومضادة للاستماتة متفوقة مقارنةً بتركيزات أخرى. تم اعتبار هذا التركيز مثالياً وتم استخدامه لاحقاً في دراسات التعبير الجيني. تتضمن النشاطات المضادة للسرطان الفعالة تقليل تعبير جين BCL2 وزيادة تعبير جينات BAX وP53. متماشياً مع هذه النتائج، كشفت تحقيقاتنا أن خلايا KB المعالجة بجزيئات ZnO -PIP النانوية عند أظهر انخفاضًا ملحوظًا ( ) في تعبير BCL2 (0.4 مرة)، جنبًا إلى جنب مع زيادة متزامنة في مستويات BAX (1.8 مرة) و P53 (2.9 مرة) مقارنة بمجموعة التحكم (الشكل 10).

إن دمج جزيئات ZnO النانوية مع PIP، وهو مركب حيوي نشط مشتق من الفلفل الأسود، يمثل نهجًا واعدًا لمكافحة كل من مسببات الأمراض السنية وسرطان الفم. لقد أظهرت جزيئات ZnO النانوية خصائص مضادة للميكروبات قوية ضد مجموعة واسعة من مسببات الأمراض السنية بسبب قدرتها على تحفيز الإجهاد التأكسدي وتعطيل أغشية الخلايا الميكروبية. بالإضافة إلى ذلك، أظهرت جزيئات ZnO النانوية إمكانيات في تثبيط تكوين الأغشية الحيوية، وهو عامل حاسم في مسببات الأمراض السنية. من ناحية أخرى، يمتلك PIP خصائص مضادة للميكروبات وقد تم الإبلاغ عن أنه يعزز التوافر الحيوي وفعالية مجموعة متنوعة من الأدوية. يمكن أن تعزز الفعالية التآزرية لجزيئات ZnO النانوية وPIP النشاط المضاد للميكروبات ضد مسببات الأمراض السنية من خلال استهداف مسارات متعددة متورطة في نمو الميكروبات وتكوين الأغشية الحيوية. قد يقدم دمج هذه المركبات نهجًا علاجيًا مزدوجًا ضد سرطان الفم، حيث يثبط نمو خلايا السرطان بينما يستهدف أيضًا مسببات الأمراض الفموية التي قد تساهم في تطور السرطان أو تقدمه.
تتعرض تجويف الفم للإجهاد التأكسدي بسبب عوامل مختلفة مثل العدوى البكتيرية، الالتهاب، والتعرض للجذور الحرة للأكسجين (ROS) الناتجة عن العمليات الأيضية. تساعد مضادات الأكسدة في تحييد الجذور الحرة، مما يحمي الأنسجة الفموية من الضرر التأكسدي. يمكن دمج مضادات الأكسدة في المواد السنية مثل المركبات، الأسمنت، والمواد السدادة لتحسين استقرارها، متانتها، وتوافقها الحيوي. يمكن أن يطيل ذلك من عمر الترميمات السنية.

ويقلل من خطر المضاعفات الثانوية [33]. أظهرت الأبحاث الحديثة أن النشاط المضاد للأكسدة الذي لوحظ في مستخلص الفلفل الأسود (Piper nigrum) ينشأ بشكل أساسي من مركبه المكون، PIP. يظهر PIP
القدرة على تثبيط أو تحييد الجذور الحرة وأنواع الأكسجين التفاعلية بشكل فعال. علاوة على ذلك، فإنه يؤثر بشكل إيجابي على حالة الثيول الخلوية، وجزيئات مضادات الأكسدة، وإنزيمات مضادات الأكسدة عند دراستها في

فيترو [34]. تم تأكيد التخليق الناجح لجزيئات ZnO-PIP النانوية من خلال التوصيف الشامل، الذي قدم رؤى حول الشكل والميزات السطحية للجزيئات النانوية، كاشفًا عن توزيع حجمها وشكلها. أظهرت الدراسات السابقة أن PIP من Capsicum chinense أظهر نشاطًا مضادًا للأكسدة [34]. في الوقت نفسه، أظهرت جزيئات ZnO-PIP النانوية نشاطًا متفوقًا في القضاء على الجذور الحرة مقارنةً بالمواد الأخرى المختبرة في كل من اختباري DPPH و ABTS. وهذا يشير إلى إمكانية تطبيق جزيئات ZnO-PIP النانوية في المواد السنية. علاوة على ذلك، فإن النشاط المضاد للأكسدة لـ قد يكون لمستخلصات PIP تأثير مفيد على صحة الفم من خلال تقليل الإجهاد التأكسدي في الأنسجة الفموية المحيطة. قد يساعد ذلك في الوقاية أو إدارة تسوس الأسنان، حيث يلعب الإجهاد التأكسدي دورًا كبيرًا في نشأته.

في مشاكل الأسنان، الكائنات الحية الدقيقة مثل . الذهبية، . الميكروبات، E. faecalis، و C. albicans معروفة بقدرتها على تشكيل الأغشية الحيوية، والتي تساهم بشكل كبير في الأمراض الفموية. أنواع الكانديدا، وخاصة . الكانديدا، هي فطريات انتهازية تشكل أغشية حيوية على الأسطح المخاطية الفموية، والأجهزة التعويضية، وزرعات الأسنان، مما يؤدي إلى داء المبيضات الفموي ومضاعفات لدى الأفراد ذوي المناعة الضعيفة [35]. S. mutans، العامل المسبب الرئيسي لتسوس الأسنان، يشكل بسهولة أغشية حيوية على أسطح الأسنان، منتجًا الحمض ويسهل إزالة المعادن من المينا. S. aureus، وهو مسبب شائع مرتبط بالعدوى الفموية وأمراض اللثة، يمكن أن يشكل أغشية حيوية على زرعات الأسنان والأنسجة الفموية، مما يزيد من الاستجابات الالتهابية وتلف الأنسجة [36]. E. faecalis، الذي غالبًا ما يُشار إليه في العدوى اللبية المستمرة وفشل علاج قنوات الجذور، بارع في تشكيل الأغشية الحيوية داخل قناة الجذر
النظام، مما يجعله مقاومًا للعلاجات المضادة للميكروبات ويعزز مقاومة العلاج. قدرة هذه المسببات على تشكيل أغشية حيوية قوية ومرنة تسلط الضوء على التحديات في إدارة العدوى السنية وتبرز أهمية تطوير استراتيجيات لتعطيل تشكيل الأغشية الحيوية لعلاج فعال والوقاية من الأمراض الفموية [37]. أظهرت الدراسات الحديثة أن PIP يظهر فعالية ملحوظة ضد الأغشية الحيوية ضد . aureus من خلال آلية تتضمن تراكم ROS [38]. في الوقت نفسه، وفقًا للنتيجة السابقة، أظهرت دراستنا القيم الثابتة لـ MIC والمناطق الكبيرة من التثبيط التي أظهرتها ZnO-PIP NPs ضد مسببات الأمراض السنية، مما يبرز إمكاناتها كعوامل مضادة للميكروبات فعالة في التطبيقات السنية. تستخدم مسببات الأمراض السنية بروتينات مستقبلات كعناصر رئيسية في تشكيل الأغشية الحيوية، وهي مجتمعات ميكروبية معقدة محاطة بمصفوفة خارج خلوية. تلعب هذه البروتينات المستقبلية أدوارًا حاسمة في الالتصاق الأولي، والتجمع، ونضوج الأغشية الحيوية [39]. يمكن أن تلتصق S. aureus بأسطح الأسنان أو زرعات الأسنان، بمساعدة بروتين سطح S. aureus G (SasG)، الذي يسهل الالتصاق الأولي بالأنسجة المضيفة. بمجرد الالتصاق، تفرز S. aureus مواد بوليمرية خارج خلوية، تشكل مصفوفة أغشية حيوية تحمي البكتيريا من دفاعات المضيف وعوامل المضادة للميكروبات، مما يعزز الاستعمار المستمر والعدوى [40]. S. mutans، المساهم الرئيسي في تسوس الأسنان، يستخدم نهاية الكربوكسيل لبروتينه Antigen I/ II ( ) لتشكيل الأغشية الحيوية بفعالية وتفاقم مشاكل الأسنان. تعمل نهاية الكربوكسيل لـ كمواد لاصقة، مما يسهل الالتصاق الأولي لـ S. mutans بأسطح الأسنان من خلال الارتباط بالبروتينات اللعابية والغشاء الخارجي المكتسب [41]. بمجرد الالتصاق، تفرز S. mutans الجلوكوز باستخدام إنزيمات نقل الجلوكوز، مما يشكل مصفوفة خارج خلوية تحيط بالخلايا البكتيرية، وتعزز التماسك ونضوج الأغشية الحيوية. توفر هذه البنية الكثيفة للأغشية الحيوية حماية ضد القوى الميكانيكية، وعوامل المضادة للميكروبات، واستجابات المناعة المضيفة، مما يمكّن S. mutans من الاستعمار المستمر لأسطح الأسنان واستقلاب الكربوهيدرات القابلة للتخمر، مما يؤدي إلى إنتاج الحمض وإزالة المعادن اللاحقة من المينا، مما يؤدي في النهاية إلى تسوس الأسنان [42]. E. faecalis، وهو مسبب شائع انتهازي في العدوى اللبية، يستخدم بروتينه السطحي Enterococcal (Esp) لتسهيل تشكيل الأغشية الحيوية والمساهمة في مشاكل الأسنان. يعمل Esp كمواد لاصقة سطحية، مما يمكّن الالتصاق الأولي بالأنسجة المضيفة والأسطح السنية، وهو أمر حاسم لبدء الأغشية الحيوية. بمجرد الالتصاق، تفرز E. faecalis مواد بوليمرية خارج خلوية (EPS)، تشكل مصفوفة واقية حول الخلايا البكتيرية داخل الأغشية الحيوية. تعزز هذه المصفوفة التماسك وتوفر مقاومة لعوامل المضادة للميكروبات واستجابات المناعة المضيفة، مما يعزز الاستعمار المستمر والعدوى داخل نظام قناة الجذر [43]. C. albicans، نوع فطري شائع في
الميكروبيوم الفموي، يستخدم مادة Als3 اللاصقة لتشكيل الأغشية الحيوية وتفاقم مشاكل الأسنان. تلعب Als3 دورًا محوريًا في الالتصاق الأولي لـ C. albicans بالأسطح الفموية، بما في ذلك مينا الأسنان والأنسجة المخاطية، من خلال الارتباط بمستقبلات خلايا المضيف مثل E-cadherin وfibronectin. بمجرد الالتصاق، تفرز C. albicans مكونات المصفوفة خارج الخلوية، بما في ذلك البروتينات، والسكريات المتعددة، وDNA خارج الخلوي، مما يشكل بنية أغشية حيوية قوية. توفر هذه الأغشية الحيوية حماية ضد استجابات المناعة المضيفة وعوامل مضادة للفطريات، مما يعزز الاستعمار المستمر ويساهم في الأمراض الفموية مثل التهاب الفم الناتج عن الأطقم وداء المبيضات الفموي [44]. تم تقييم التفاعل المحتمل بين PIP والمستقبلات المعنية في تشكيل الأغشية الحيوية بين مختلف مسببات الأمراض السنية. كشفت نتائج الدراسة أن PIP أظهر ميلًا ملحوظًا تجاه جميع المستقبلات التي تم التحقيق فيها. تدعم هذه النتيجة النتائج التي تم الحصول عليها من اختبارات منطقة التثبيط واختبارات تثبيط الأغشية الحيوية. أظهرت النتائج أن PIP قام بتثبيط نمو مسببات الأمراض السنية بفعالية وقلل بشكل كبير من تشكيل الأغشية الحيوية. تشير هذه النتائج إلى أن PIP يمكن أن يكون مرشحًا واعدًا لتطوير عوامل علاجية تهدف إلى تعطيل تشكيل الأغشية الحيوية ومكافحة العدوى السنية التي تسببها مسببات الأمراض مثل S. mutans وS. aureus وE. faecalis وC. albicans. علاوة على ذلك، فإن قدرة PIP على استهداف مستقبلات متعددة مرتبطة بتشكيل الأغشية الحيوية تسلط الضوء على إمكاناته كعامل مضاد للميكروبات واسع الطيف لتطبيقات العناية بالأسنان.
يمكن أن تسهم العدوى بواسطة مسببات الأمراض السنية في تطوير سرطان الفم من خلال آليات مختلفة. يمكن أن تؤدي الالتهابات المزمنة الناتجة عن وجود هذه المسببات ومنتجاتها الثانوية إلى استجابات مناعية مستمرة، مما يعزز تلف الأنسجة وتغيرات جينية تسهل حدوث السرطان [13]. على سبيل المثال، تنتج S. mutans حمض اللبنيك كمنتج ثانوي لتمثيل السكر، مما يخلق بيئة ميكروبية حمضية يمكن أن تلحق الضرر بخلايا الظهارة الفموية وتعزز تحولها الخبيث [45]. بالإضافة إلى ذلك، يمكن لبعض المسببات مثل C. albicans إنتاج مركبات مسرطنة أو سموم، مما يسهم في العمليات المسرطنة. علاوة على ذلك، غالبًا ما توجد هذه المسببات داخل الأغشية الحيوية، التي لا تحميها فقط من استجابات المناعة المضيفة ولكن أيضًا تعزز غزو الأنسجة المحلية والنقائل، مما يسهل انتشار الخلايا الخبيثة. علاوة على ذلك، يمكن أن تؤدي العدوى المزمنة إلى تعطيل توازن الميكروبيوم الفموي، مما يؤدي إلى اختلال التوازن الميكروبي، والذي ارتبط بزيادة خطر الإصابة بسرطان الفم. بشكل جماعي، يمكن أن تبدأ التفاعلات بين مسببات الأمراض السنية وأنسجة المضيف وتستمر في خلق بيئة مؤيدة للالتهابات ومؤيدة للسرطان داخل تجويف الفم، مما يعرض الأفراد في النهاية لتطوير سرطان الفم [46]. ZnO-PIP NPs، المعروفة بنشاطها المضاد للميكروبات القوي ضد الأسنان
تمت دراسة مسببات الأمراض بشكل أعمق من أجل آثارها المحتملة المضادة للسرطان التي تستهدف بشكل خاص سرطان الفم. كشفت نتائج الدراسة عن نشاط مضاد للسرطان واعد، حيث أظهرت انخفاضًا كبيرًا في حيوية خلايا KB، وهي خط خلايا سرطان الفم البشري. تشير هذه النتيجة إلى أن ZnO-PIP NPs تمتلك وظيفة مزدوجة، حيث تظهر خصائص مضادة للميكروبات ومضادة للسرطان. تعتبر BCL2 وBAX وP53 من المنظمين الرئيسيين لعملية موت الخلايا المبرمج، وهي عملية مركزية في تطور السرطان وتقدمه. في سرطان الفم، يمكن أن تؤدي عدم تنظيم الجينات المرتبطة بموت الخلايا مثل BCL2، الذي يثبط موت الخلايا، وBAX، الذي يعزز موت الخلايا، إلى تعطيل التوازن الدقيق بين تكاثر الخلايا وموت الخلايا، مما يؤدي إلى نمو الورم غير المنضبط. بالإضافة إلى ذلك، يلعب P53، وهو جين مثبط للورم، دورًا حاسمًا في تنسيق استجابات الخلايا لتلف الحمض النووي والإجهاد الخلوي، بما في ذلك تحفيز موت الخلايا في الخلايا التالفة أو الشاذة. نظرًا لأدوارها الحاسمة في تنظيم قرارات مصير الخلايا، يمكن أن تؤثر التغيرات في التعبير أو النشاط لهذه الجينات بشكل كبير على التطور والتقدم والاستجابة للعلاج في سرطان الفم. لذلك، فإن دراسة مستويات التعبير ونشاط BCL2 وBAX وP53 استجابةً لعلاج ZnO-PIP NPs توفر رؤى قيمة حول الآليات الأساسية لآثارها المضادة للسرطان وتوضح الأهداف العلاجية المحتملة لمكافحة سرطان الفم. في الدراسة التي تحقق في النشاط المضاد للسرطان لـ ZnO-PIP NPs في خلايا KB، كشفت النتائج عن تغييرات كبيرة في مستويات التعبير للجينات الرئيسية المرتبطة بموت الخلايا، بما في ذلك BCL2 وBAX وP53. أدى العلاج بـ ZnO-PIP NPs إلى تقليل ملحوظ في BCL2، وهو بروتين مضاد لموت الخلايا معروف بأنه يثبط موت الخلايا، مما يحول التوازن نحو تحفيز موت الخلايا. في الوقت نفسه، كان هناك زيادة في BAX، وهو بروتين مؤيد لموت الخلايا يعزز موت الخلايا من خلال تسهيل نفاذية الغشاء الخارجي للميتوكوندريا وإطلاق السيتوكروم ج، مما يعزز استجابة الموت الخلوي في خلايا KB. علاوة على ذلك، أدى علاج ZnO-PIP NPs إلى زيادة P53، وهو جين مثبط للورم حاسم في تنسيق استجابات الخلايا لتلف الحمض النووي والإجهاد. من المحتمل أن تكون زيادة P53 قد ساهمت في تنشيط مسارات الموت الخلوي اللاحقة، بما في ذلك التنظيم النسخي للجينات المؤيدة لموت الخلايا وتحفيز توقف دورة الخلية، مما يؤدي في النهاية إلى تثبيط تكاثر خلايا KB وتعزيز موت الخلايا. بشكل جماعي، تشير هذه النتائج إلى أن النشاط المضاد للسرطان لـ ZnO PIP NPs في خلايا KB يتم من خلال تعديل مستويات التعبير لـ BCL2 وBAX وP53، مما يبرز إمكانياتها كعوامل علاجية واعدة لعلاج سرطان الفم من خلال استهداف مسارات الموت الخلوي الرئيسية.

تستدعي عدة اعتبارات مهمة مناقشة حول الترجمة السريرية لنتائجنا وسبل البحث المستقبلية. أولاً، فإن توضيح السلامة
ملف التعريف والتوافق الحيوي لـ ZnO-PIP NPs أمر ضروري لاستخدامها السريري. سيكون من الضروري إجراء دراسات قبل سريرية شاملة، بما في ذلك تقييمات السمية في الجسم الحي ودراسات التحلل الحيوي، لضمان سلامة وتحمل هذه الجسيمات النانوية في التطبيقات الفموية. علاوة على ذلك، فإن استكشاف طرق توصيل بديلة لـ ZnO-PIP NPs، مثل الجل الموضعي، وغسولات الفم، أو زراعة الأسنان المغلفة بـ ZnO-PIP NPs، يمكن أن يعزز من وصولها وفعاليتها في البيئات السريرية. سيكون من الضروري التحقيق في استقرار وإطلاق ZnO-PIP NPs من هذه الأنظمة التوصيلية لتحسين نتائجها العلاجية. بالإضافة إلى خصائصها المضادة للميكروبات والمضادة للسرطان، فإن النشاط المضاد للأكسدة لـ ZnO-PIP NPs يقدم فرصًا لتخفيف الأمراض الفموية المرتبطة بالإجهاد التأكسدي، بما في ذلك تسوس الأسنان وأمراض اللثة. يمكن أن تركز الأبحاث المستقبلية على تقييم إمكانيات ZnO-PIP NPs في تعزيز تجديد الأنسجة الفموية وشفاء الجروح، خاصة في سياق علاج اللثة وجراحة الفم.

في الختام، تُظهر هذه الدراسة القدرات متعددة الوظائف لـ ZnO-PIP NPs في معالجة تحديات صحة الفم، بما في ذلك العدوى الميكروبية وسرطان الفم. من خلال أنشطتها المضادة للميكروبات والمضادة للسرطان القوية، تُظهر ZnO-PIP NPs إمكانيات واعدة كعوامل علاجية متكاملة لتدخلات الرعاية الصحية الفموية. توفر النتائج القوية من هذه الدراسة أساسًا قويًا لاستكشاف وتطوير ZnO-PIP NPs، مما يفتح آفاقًا جديدة لتحسين إدارة وعلاج الأمراض الفموية. تحمل هذه الجسيمات النانوية وعدًا لتقدم ممارسات الرعاية الصحية الفموية، مما يعود بالنفع في النهاية على المرضى من خلال تحسين نتائج العلاج وجودة الحياة.

تحتوي النسخة الإلكترونية على مواد إضافية متاحة علىhttps://doi. org/10.1186/s12903-024-04399-z.

المادة الإضافية 1

يشكر المؤلفون كلية ومستشفيات سافيثا لتمكينهم من إجراء التجارب. يعترف المؤلفون بالتمويل من مشروع دعم الباحثين رقم (RSPD2024R665)، جامعة الملك سعود، الرياض، المملكة العربية السعودية.

M.R.S وK.K وH.K قاموا بالتفكير، وتنظيم البيانات، والتحقيق. تم إجراء التحليل الرسمي بواسطة J.G. تم إجراء مراجعة الكتابة والتحرير بواسطة A.G وS.M وM.A.S وJ.A. قرأ جميع المؤلفين ووافقوا على النسخة المنشورة من المخطوطة.

يعترف المؤلفون بالدعم المالي من خلال مشروع دعم الباحثين رقم (RSPD2024R665)، جامعة الملك سعود، الرياض، المملكة العربية السعودية.

البيانات متاحة من المؤلف المراسل عند الطلب المعقول.

لم تكن هناك حاجة لموافقة أخلاقية للدراسة الحالية لأنها لم تتعامل مع أي عينات بشرية أو حيوانية.

غير قابل للتطبيق.

غير قابل للتطبيق.

يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح متنافسة.

قسم الكيمياء، كلية العلوم، جامعة الملك سعود، ص.ب 2455، الرياض 11451، المملكة العربية السعودية
قسم تسوس الأسنان، معهد سافيثا للعلوم الطبية والتقنية، كلية ومستشفيات سافيثا، جامعة سافيثا، تشيناي، الهند
قسم الصيدلة، جامعة عبد الوالي خان ماردان، ماردان 23200، باكستان
قسم الهندسة الميكانيكية، كلية ييشوانتراو تشافان للهندسة، ناجبور، الهند
علوم الفسيولوجيا الجزيئية والتكاملية، قسم الصحة البيئية، مدرسة هارفارد تي. إتش. تشان للصحة العامة، بوسطن، MA 02115، الولايات المتحدة الأمريكية
قسم علم الأدوية والسموم، جامعة أريزونا، توكسون، AZ 85721، الولايات المتحدة الأمريكية
قسم الاقتصاد، جامعة كيبري ديهار، 250، كيبري ديهار، الصومال، إثيوبيا
قسم البحث والتطوير، جامعة لوفلي المهنية، فاجوارا، بنجاب 144001، الهند
مختبر علم السموم وعلم الأدوية، قسم التكنولوجيا الحيوية، كلية العلوم والإنسانية، معهد SRM للعلوم والتكنولوجيا، منطقة تشينجالبات، كاتانكولاثور، تاميل نادو 603203، الهند

تم النشر عبر الإنترنت: 21 يونيو 2024

تظل Springer Nature محايدة فيما يتعلق بالمطالبات القضائية في الخرائط المنشورة والانتماءات المؤسسية.

Keywords Piperine, Zinc oxide nanoparticle, Anticancer, Antimicrobial

Ensuring optimal oral health is paramount due to the significant impact of dental pathogens and oral cancer on overall well-being [1]. Dental pathogens are associated with various oral diseases such as tooth decay, gum disease, and oral infections. Left untreated, these conditions can lead to pain, discomfort, tooth loss, and even systemic health issues due to the potential for bacteria to enter the bloodstream [2]. Moreover, oral cancer, which can arise from multiple factors including tobacco use, alcohol consumption, and HPV infection, presents a grave concern [3]. S. aureus is associated with dental caries, periodontal disease, and oral abscesses, posing challenges due to its ability to produce toxins and antibiotic resistance [4]. S. mutans is a primary cause of dental caries, producing acids that erode tooth enamel and forming biofilms that contribute to plaque formation [5]. E. faecalis is implicated in persistent root canal infections and treatment failures, often displaying resistance to conventional antimicrobial agents [6]. C. albicans can lead to oral thrush, particularly in immunocompromised individuals, with the potential for systemic infections [7]. Understanding the mechanisms of pathogenesis and host-pathogen interactions of these dental pathogens is essential for developing targeted therapies and preventive strategies to mitigate their impact on oral health and overall well-being.

Oral cancer presents significant challenges stemming from late diagnosis, high metastatic potential, treatment complexities, and frequent recurrence. Dental pathogens interact with oral cancer through multifaceted mechanisms [8]. Firstly, chronic inflammation induced by pathogens creates a microenvironment conducive to tumor development. These pathogens release pro-inflammatory cytokines and activate immune cells, perpetuating inflammation and facilitating carcinogenesis [9-12]. Secondly, certain dental pathogens produce genotoxic substances, such as reactive oxygen species (ROS), causing DNA damage and genomic instability in oral epithelial cells [13]. This genetic damage can lead to the initiation and progression of cancerous lesions. Additionally, dysbiosis of the oral microbiome, often seen in periodontal disease, may contribute to oral cancer development through interactions with host immune responses and signaling pathways. Furthermore, dental pathogens may directly influence oncogenic pathways within oral cells, promoting cell proliferation and survival [14]. In addition to understanding the pathogenesis of oral cancer, it is crucial to discuss its diagnosis and treatment. Diagnosis typically involves a combination of clinical examination, imaging techniques such as computed tomography (CT) scans and magnetic resonance imaging (MRI), and biopsy for histopathological analysis [15]. Treatment options vary depending on the stage and
location of the tumor but may include surgery, radiation therapy, chemotherapy, targeted therapy, and immunotherapy [16]. Multidisciplinary approaches involving oncologists, surgeons, dentists, and other healthcare professionals are often necessary to provide comprehensive care to patients with oral cancer.

Piperine (PIP), a naturally occurring alkaloid found in black pepper and other plants, possesses potent antimicrobial effects against various pathogens, including bacteria and fungi, making it an attractive candidate for oral health applications [17]. Meanwhile, Zinc oxide nanoparticle (ZnO NPs) have demonstrated significant anticancer activity against cancer cells, inhibiting their proliferation and inducing apoptosis [18]. Previous studies have explored the use of ZnO NPs coated with cinnamic acid and curcumin for antimicrobial activity against dental pathogens and targeting the BCL-2/BAX/ P53 pathway to enhance apoptosis in oral squamous cells [19, 20]. Coating ZnO NPs with PIP could potentially enhance their efficacy and selectivity against oral cancer cells while minimizing off-target effects. This unique combination has not been previously reported in the literature, thus representing a novel approach in the field. Combining PIP and ZnO NPs can potentially enhance their individual therapeutic effects against dental pathogens and oral cancer. PIP may augment the antimicrobial efficacy of ZnO NPs by disrupting the cell membranes of dental pathogens, thereby increasing their susceptibility to NPs-induced damage. Additionally, PIP ability to modulate intracellular signaling pathways involved in cancer cell growth and survival may potentiate the anticancer effects of ZnO NPs. In this study, we combined PIP and ZnO NPs for their targeted delivery of formulation on the surface of dental pathogen receptors and oral cancer cells to enhance their activity and efficacy in oral medicine, thereby offering a promising strategy for addressing both infectious and malignant oral conditions.

A concentrated solution of PIP was prepared by dissolving 50 mg of PIP powder in 5 mL of ethanol. ZnO NPs were synthesized by the precipitation method. Zinc acetate dihydrate ( ) was dissolved in the PIP solution under constant stirring at room temperature for 1 h . Subsequently, sodium hydroxide solution was added dropwise to the zinc acetate solution until the pH reached approximately 10 . The resulting mixture was stirred for an additional 2 h to ensure complete reaction. The green synthesis approach facilitated the formation of plant compound-ZnO NPs, which were then centrifuged at 8000 rpm for 10 min , washed with distilled water to remove impurities, and finally dried at for 12 h
under vacuum. NPs suspensions in distilled water were scanned in the wavelength range of using a UV-Vis spectrophotometer to obtain the absorption spectrum, which provided insights into the bandgap energy of the NPs. The morphology and size distribution of the synthesized NPs were examined using a scanning electron microscope (SEM). Powder samples were loaded onto a sample holder and scanned at a range of with a step size of . X-ray Diffraction analysis (XRD) analysis provided information regarding the crystallographic phases and crystallite size of the NPs. Chemical bonding and functional groups present in the synthesized NPs were investigated using Fourier-transform infrared spectroscopy (FTIR) and Energy dispersive X-ray analysis (EDAX) [21]. Maintaining precise control over reaction conditions like temperature, pH , and reaction time is crucial for reproducibility. Optimizing these parameters for larger batches is necessary. Additionally, sourcing high-quality, cost-effective raw materials like zinc acetate dihydrate and piperine in bulk while ensuring consistency poses logistical challenges.

The DPPH assay is based on the ability of antioxidants to donate hydrogen atoms or electrons to neutralize the DPPH radical, a stable free radical with an unpaired electron. The DPPH assay was performed to evaluate the antioxidant activity of the test samples. Briefly, various concentrations ( , & ) of the ZnO-PIP NPs were prepared. A solution of DPPH radical ( 0.1 mM ) was prepared by dissolving DPPH in ethanol. Aliquots ( ) of the ZnO-PIP NPs at different concentrations were mixed with 900 of DPPH solution and incubated in the dark at room temperature for 30 min . The absorbance of the resulting solution was measured at 517 nm using a UV-Vis spectrophotometer [22].

The ABTS assay measures the ability of antioxidants to scavenge radicals, which are formed by the oxidation of ABTS with potassium persulfate. The ABTS radical cation was generated by mixing ABTS solution with potassium persulfate ( 2.45 mM ) and allowing the mixture to stand in the dark at room temperature for 16 h . The resulting ABTS solution was diluted with ethanol to obtain an absorbance of at 734 nm . Various concentrations of the ZnO-PIP NPs , , & ) were prepared. Aliquots of the Zno-PIP NPs at different concentrations were mixed with of the diluted ABTS solution and incubated in the dark at room temperature for 6 min . The absorbance of the resulting solution was
measured at 734 nm using a UV-Vis spectrophotometer [23].

The MIC assay was performed to determine the lowest concentration of the ZnO-PIP NPs required to inhibit the visible growth of the dental pathogens (S. aureus, S. mutans, E. faecalis, C. albicans). Each concentration of the ( ) was ZnO-PIP added to individual wells of a sterile microtiter plate. To each well, of inoculum containing a standardized suspension of the dental pathogens at a concentration of approximately colony-forming units per milliliter ( ) was added. The microtiter plate was then covered and incubated at the appropriate temperature for the specific microorganism (e.g., for bacteria, for fungi) for . Following incubation, the growth of the microorganism in each well was visually inspected, and the MIC was defined as the lowest concentration of the test compound that completely inhibited visible growth, indicated by the absence of turbidity or visible colonies [24].

The well diffusion method was employed to evaluate the antimicrobial activity of the ZnO-PIP NPs against a dental pathogens. Nutrient agar plates were prepared and inoculated with a standardized suspension of the test microorganism by streaking the agar surface using a sterile swab to achieve a lawn of growth. Wells were created on the agar plates using a sterile cork borer or a commercially available well puncher. The of different concentration of Zn-PIP NPs were added to separate wells on the agar plates. Additionally, wells containing the standard antimicrobial agent of known activity (positive control) were also created on the agar plates. The plates were then incubated at the appropriate temperature for the specific microorganism (e.g., for bacteria, for fungi) for . Following incubation, the plates were examined, and the diameter of the clear zone surrounding each well was measured using a calibrated ruler. The diameter of the zone of inhibition was recorded in millimeters ( mm ) as an indicator of the antimicrobial activity of the ZnO-PIP NPs.

AutoDock is a widely used software for molecular docking studies that predicts the binding affinity values (kcal/ mol ) between the ligand and receptor. The 2D structure of the PIP compound was obtained from the PubChem database (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/ ) and converted into 3D format using software such as PyMOL. The receptor structures of dental pathogens were obtained from the Protein Data Bank (PDB) (https:// www.rcsb.org/) and prepared for docking studies using

Autodock tool ver 1.5.7. Hydrogens, charges, and appropriate bonds were added to both ligand and receptor structures. The prepared ligand and receptor structures were imported into AutoDock Tools. The receptor was defined as a rigid structure, while the ligand was set as flexible to explore different conformations. The binding site of the receptor was defined based on the active site residues or known binding pockets. Parameters such as grid box size, spacing, and search parameters were set according to the specifications of AutoDock. Lamarckian genetic algorithm parameters were adjusted to ensure efficient exploration of the conformational space. Finally after the analysis, the interaction between the ligand and receptor was visulaized in the Discovery studio visualizer software [25].

KB cells (human epithelial carcinoma cells) were cultured in Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) supplemented with fetal bovine serum (FBS) and penicillin-streptomycin in a humidified incubator at with . Upon reaching confluency, the cells were treated with various concentrations of the ZnO-PIP NPs were treated to cells. After incubation with the ZnO-PIP NPs for 24 h , the viability of KB cells was assessed using the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay. Briefly, the culture medium was removed, and the cells were washed with phosphate-buffered saline (PBS). MTT solution ( in PBS) was added to each well, and the cells were further incubated for 3 h at . Following incubation, the MTT solution was aspirated, and dimethyl sulfoxide (DMSO) was added to solubilize the formazan crystals. The absorbance of the resulting solution was measured at 570 nm using a microplate reader [26].

The expression levels of specific genes can be quantified by measuring the amount of amplified cDNA product, providing valuable insights into gene regulation under different experimental conditions. Total RNA was extracted from ZnO-PIP treated KB cells using the Trizol reagent according to the manufacturer’s instructions. Briefly, cells were lysed in Trizol reagent, and chloroform was added to separate the RNA-containing aqueous phase. The RNA was precipitated with isopropanol, washed with ethanol, and resuspended in RNase-free
water. The quality and quantity of RNA were assessed using a spectrophotometer. First-strand cDNA synthesis was performed using a reverse transcription kit according to the manufacturer’s protocol. Briefly, RNA samples were incubated with a mixture containing reverse transcriptase enzyme, random primers, dNTPs, and RNase inhibitor at for 1 h to synthesize cDNA. The reaction was then terminated by heating at for 5 min , and the cDNA was stored at until further analysis. Quantitative RT-PCR (qRT-PCR) was performed to analyze the expression levels of target genes in ZnO-NPs treated KB cells. Gene-specific primers and list of abbreviation were given in Table 1 and E-supplement Table 1. The amplification conditions included an initial denaturation step at for 5 min , followed by 40 cycles of denaturation at for 30 s , annealing for 30 s , and extension at for 30 s . The mRNA expression levels were normalized to a housekeeping gene, such as GAPDH, and calculated using the method [27].

Statistical analysis was conducted to assess the significance of differences among various concentrations of ZnO-PIP NPs treatment group and the control (untreated) using a one-way analysis of variance (ANOVA), followed by post-hoc multiple comparisons (Tukey’s test). Results were deemed statistically significant at . Data are presented as mean standard deviation, with each experiment performed in triplicate.

The UV-Vis spectroscopy analysis of ZnO-PIP NPs reveals a prominent absorption peak at 279 nm with an absorbance value of 4.30878 (Fig. 1). This absorption peak corresponds to the electronic transitions occurring within the ZnO NPs. Specifically, the observed peak at 279 nm is attributed to the bandgap absorption of ZnO , which is characteristic of its semiconductor nature. The absorption of photons at this wavelength promotes electrons from the valence band to the conduction band, indicating the excitation of charge carriers within the NPs. The SEM analysis of ZnO-PIP NPs reveals a complex morphology characterized by the presence of crystallized NPs with varying sizes ranging below 500 nm (Fig. 2). The NPs exhibit a tendency to agglomerate, forming clusters of irregular shapes. This agglomeration

may be attributed to the strong interparticle interactions or the surface chemistry of the NPs mediated by the presence of PIP. Despite the agglomeration, individual NPs display relatively smooth surfaces with occasional surface irregularities. The SEM images also hint at the presence of crystalline structures, with some NPs showing facets indicative of crystal faces, although further confirmation through techniques like X-ray diffraction would be necessary to elucidate the crystallographic nature of the NPs. The XRD analysis of ZnO-PIP NPs exhibits a
crystalline phase comprising of the sample, alongside an amorphous phase constituting of the material. The XRD pattern reveals several distinct peaks at various values, indicative of the crystalline nature of the NPs. Specifically, the observed peaks at values of , and correspond to different planes of the ZnO crystal lattice (Fig. 3). These peaks can be indexed to the hexagonal wurtzite crystal structure of ZnO , with the (100), (002), (101), (102), (110), (103), (200), and (112) planes,

respectively. The presence of well-defined peaks indicates the high crystallinity and purity of the ZnO NPs, with minimal presence of impurities or amorphous phases. The FTIR observed peaks at , and correspond to stretching vibrations of hydroxyl (OH) groups and aliphatic C-H bonds, respectively, indicating the presence of surface hydroxyl groups and organic moieties possibly originating from the PIP capping agent (Fig. 4). The peak at suggests the presence of carbonyl ( ) stretching vibrations, indicative of functional groups present in PIP. Peaks observed at , and correspond to aromatic stretching vibrations, further confirming the presence of aromatic rings in PIP. Additionally, peaks at and are associated with bending vibrations in the aromatic ring, while peaks at and suggest C-O stretching vibrations, possibly from the bond in or functional groups in PIP. Furthermore, peaks at , and correspond to ZnO stretching vibrations, indicating the presence of ZnO . Peaks at lower wavenumbers, such as , and , may be attributed to lattice vibrations or structural features of ZnO NPs. The EDAX analysis detect the presence of carbon signals is consistent with the organic nature of the PIP capping agent used during NPs synthesis (Fig. 5). The prominent peaks corresponding to Zn and O confirm the presence of ZnO -NPs in the sample. The elemental composition analysis suggests that the NPs are predominantly composed of Zn and O , in accordance with the expected composition of ZnO .

The results of the DPPH assay (Fig. 6A) display a doseresponsive scavenging impact of ZnO-PIP NPs on DPPH free radicals. The scavenging activity percentage increases with concentrations of , , and , showing respective values of , and . Meanwhile, at concentrations of , the antioxidant potential of ZnO-PIP NPs demonstrates comparable effectiveness to the Trolox.

The results from the ABTS assay (Fig. 6B) indicate a dose-dependent scavenging effect of ZnO-PIP NPs on ABTS radicals. The reduction in absorbance, signifying the scavenging of ABTS radicals, was observed as ZnO-PIP NPs facilitated the conversion of ABTS to its radical cation (ABTS•+). With increasing concentrations of ZnO-PIP NPs ( , and ), there was a significant rise in the percentage of ABTS radical scavenging, with values of , and , respectively. Moreover, the scavenging of ABTS radicals by ZnO-PIP NPs at concentrations of exhibited better activity.

ZnO-PIP NPs consistently showed effective MIC values against the dental pathogens tested, including . aureus, S. mutans, E. faecalis, and C. albicans, all exhibiting susceptibility at . This suggests that concentrations of and higher effectively inhibited the growth of these pathogens (Fig. 7). Additionally, the zone of inhibition assay demonstrated the antimicrobial activity of ZnO-PIP NPs against all tested dental pathogens. At , the zones of inhibition ranged from , and 11 mm , and at , they increased further, ranging from 15, 14, 18, and 16 mm for . aureus, S. mutans, E. faecalis, and C. albicans, respectively (Table 2). The ZnO-PIP NPs at showed slightly smaller zones of inhibition compared to the positive control, amoxicillin ( ). But at the same time ZnO-PIP NPs at , their antimicrobial activity significantly improved, surpassing that of amoxicillin for all tested pathogens.

The molecular docking investigation unveiled promising interactions between PIP and the receptor proteins of four dental pathogens: S. aureus, S. mutans, E. faecalis, and C. albicans (Fig. 8). Notably, PIP exhibited higher binding affinity values with the pathogen receptors, indicating its potential as a therapeutic agent against dental infections (Table 3). Specifically, in the docking analysis with S. aureus surface protein G (PDB ID: 7SMH), PIP demonstrated a binding affinity of . This interaction involved crucial amino acids such as ARG, ASP, GLY, and ARG suggesting a potential disruption of the surface protein and consequently hindering S. aureus pathogenicity. Similarly, for S. mutans, the docking analysis with Antigen I/II carboxy-terminus (PDB ID: 3QE5) yielded a binding affinity of . Interactions with amino acids VAL, VAL, LYS, ILE, and VAL indicated that PIP might disrupt the function of Antigen I/ II carboxy-terminus, thereby affecting S. mutans pathogenicity. Regarding E. faecalis, the docking analysis with Enterococcal surface protein (PDB ID: 6ORI) revealed a binding affinity of , with interactions involving amino acids ILE, LYS, ALA, and LEU. This suggests that PIP could potentially interfere with this protein, thereby impeding biofilm formation and attenuating . faecalis pathogenicity. Lastly, in the docking analysis with C. albicans ALS3 (PDB ID: 4LEE), PIP exhibited a binding affinity of , with interactions involving amino acids LYS, LYS, and SER. This indicates that PIP might interfere with the function of ALS3, an essential protein involved in adherence to host surfaces, thereby affecting biofilm formation, a critical step in C. albicans pathogenicity.

The results depicted in Fig. 9 highlight notable changes in KB cell viability in response to increasing concentrations of ZnO-PIP NPs. At a lower concentration of mL , there was only minimal impact on cell viability following 24 h of exposure. In contrast, the group treated with Cyclophosphamide exhibited a significant reduction
in cell viability, dropping to . However, at higher concentrations, particularly , a marked decrease in KB cell viability ( ) was evident, resembling the cell viability observed in the positive control group. These findings suggest a concentration-dependent anticancer effect of ZnO-PIP NPs on KB cells, indicating potential implications for oral cancer treatment.

The examination of ZnO-PIP NPs at a concentration of showcased superior antioxidant, antimicrobial, and antiapoptotic properties in comparison to other concentrations. This concentration was deemed optimal and subsequently employed in gene expression studies. The effective anticancer activity involves the downregulation of BCL2 and the upregulation of BAX and P53 gene expression levels. Consistent with these findings, our investigation revealed that KB cells treated with ZnO -PIP NPs at displayed a notable decrease ( ) in BCL2 expression ( 0.4 fold), alongside a simultaneous upregulation of BAX (1.8 fold) and P53 (2.9 fold) levels relative to the control group (Fig. 10).

The combination of ZnO NPs with PIP, a bioactive compound derived from black pepper, presents a promising approach for combating both dental pathogens and oral cancer. ZnO NPs have demonstrated potent antimicrobial properties against a wide range of dental pathogens due to their ability to induce oxidative stress and disrupt microbial cell membranes [21]. Additionally, ZnO NPs have shown potential in inhibiting biofilm formation, a crucial factor in the pathogenesis of dental infections [30]. PIP, on the other hand, possesses antimicrobial properties and has been reported to enhance the bioavailability and efficacy of various drugs [31]. The synergistic action of ZnO NPs and PIP can enhance the antimicrobial activity against dental pathogens by targeting multiple pathways involved in microbial growth and biofilm formation. The combination of these compounds could potentially offer a dual therapeutic approach against oral cancer, inhibiting cancer cell growth while also targeting oral pathogens that may contribute to cancer development or progression.
The oral cavity is subject to oxidative stress due to various factors such as bacterial infections, inflammation, and exposure to reactive oxygen species (ROS) generated during metabolic processes. Antioxidants help neutralize ROS, thus protecting oral tissues from oxidative damage [32]. Antioxidants can be incorporated into dental materials such as composites, cements, and sealants to improve their stability, durability, and biocompatibility. This can extend the lifespan of dental restorations

and reduce the risk of secondary complications [33]. Recent research has reported that the antioxidant activity observed in Piper nigrum extract primarily originates from its constituent compound, PIP. PIP demonstrates
the ability to effectively inhibit or neutralize free radicals and reactive oxygen species. Furthermore, it exerts a positive influence on cellular thiol status, antioxidant molecules, and antioxidant enzymes when studied in

vitro [34]. The successful synthesis of ZnO-PIP NPs was confirmed through comprehensive characterization, which provided insights into the morphology and surface features of the NPs, revealing their size distribution and shape. Previous studies have shown that the PIP from Capsicum chinense showed the antioxidant acivity [34]. Meanwhile, the ZnO-PIP NPs exhibited superior free radical scavenging activity compared to other tested substances in both the DPPH and ABTS assays. This suggests a potential application of ZnO-PIP NPs in dental materials. Furthermore, the antioxidant activity of PIP NPs may also have a beneficial effect on oral health by mitigating oxidative stress in the surrounding oral tissues. This could potentially aid in the prevention or management of dental caries, where oxidative stress plays a significant role in their pathogenesis.

In dental problems, pathogens such as . aureus, . mutans, E. faecalis, and C. albicans are notorious for their ability to form biofilms, which contribute significantly to oral diseases. Candida species, particularly . albicans, are opportunistic fungi that form biofilms on oral mucosal surfaces, prosthetic devices, and dental implants, leading to oral candidiasis and complications in immunocompromised individuals [35]. S. mutans, a primary etiological agent of dental caries, readily forms biofilms on tooth surfaces, producing acid and facilitating the demineralization of enamel. S. aureus, a common pathogen associated with oral infections and periodontal diseases, can form biofilms on dental implants and oral tissues, exacerbating inflammatory responses and tissue damage [36]. E. faecalis, frequently implicated in persistent endodontic infections and root canal treatment failures, is adept at biofilm formation within the root canal
system, rendering it resistant to antimicrobial therapies and promoting treatment resistance. These pathogens’ ability to form robust and resilient biofilms underscores the challenges in managing dental infections and highlights the importance of developing strategies to disrupt biofilm formation for effective treatment and prevention of oral diseases [37]. Recent studies have showed that PIP displays notable antibiofilm efficacy against . aureus through a mechanism involving the accumulation of ROS [38]. Meanwhile, in accordance with the previous result, our study showed the consistent MIC values and substantial zones of inhibition exhibited by ZnO-PIP NPs against dental pathogens were observed, emphasizing their potential as effective antimicrobial agents in dental applications. Dental pathogens utilize receptor proteins as key components in the formation of biofilms, complex microbial communities encased in an extracellular matrix. These receptor proteins play crucial roles in initial attachment, aggregation, and biofilm maturation [39]. S. aureus can adhere to tooth surfaces or dental implants, aided by S. aureus surface protein G (SasG), which mediates initial attachment to host tissues. Once adhered, S. aureus secretes extracellular polymeric substances, forming a biofilm matrix that shields bacteria from host defenses and antimicrobial agents, thus promoting persistent colonization and infection [40]. S. mutans, a primary contributor to dental caries, employs its Antigen I/ II ( ) protein’s carboxy-terminus to effectively form biofilms and exacerbate dental problems. The carboxyterminus of acts as an adhesin, facilitating the initial attachment of S. mutans to tooth surfaces by binding to salivary proteins and the acquired enamel pellicle [41]. Once attached, S. mutans secretes glucans using glucosyltransferase enzymes, forming an extracellular matrix that encapsulates bacterial cells, promoting cohesion and biofilm maturation. This dense biofilm structure provides protection against mechanical forces, antimicrobial agents, and host immune responses, enabling S. mutans to persistently colonize dental surfaces and metabolize fermentable carbohydrates, leading to acid production and subsequent enamel demineralization, ultimately resulting in dental caries [42]. E. faecalis, a common opportunistic pathogen in endodontic infections, utilizes its Enterococcal surface protein (Esp) to facilitate biofilm formation and contribute to dental problems. Esp acts as a surface adhesin, enabling initial attachment to host tissues and dental surfaces, crucial for biofilm initiation. Once adhered, E. faecalis secretes extracellular polymeric substances (EPS), forming a protective matrix around bacterial cells within the biofilm. This matrix enhances cohesion and provides resistance to antimicrobial agents and host immune responses, promoting persistent colonization and infection within the root canal system [43]. C. albicans, a prevalent fungal species in oral
microbiota, employs its Als3 adhesin to form biofilms and exacerbate dental problems. Als3 plays a pivotal role in the initial attachment of C. albicans to oral surfaces, including tooth enamel and mucosal tissues, by binding to host cell receptors such as E-cadherin and fibronectin. Once adhered, C. albicans secretes extracellular matrix components, including proteins, polysaccharides, and extracellular DNA, forming a robust biofilm structure. This biofilm provides protection against host immune responses and antifungal agents, promoting persistent colonization and contributing to oral diseases such as denture stomatitis and oral candidiasis [44]. The potential interaction between PIP and the receptors involved in biofilm formation among various dental pathogens was evaluated. The results of the study revealed that PIP exhibited a notable affinity towards all the receptors investigated. This finding supports the results obtained from the zone of inhibition assays and biofilm inhibition assays. The outcomes demonstrated that PIP effectively inhibited the growth of dental pathogens and significantly reduced biofilm formation. These results suggest that PIP could be a promising candidate for developing therapeutic agents aimed at disrupting biofilm formation and combating dental infections caused by pathogens such as S. mutans, S. aureus, E. faecalis, and C. albicans. Moreover, the ability of PIP to target multiple receptors associated with biofilm formation underscores its potential as a broad-spectrum antimicrobial agent for dental care applications.
The infection by dental pathogens can potentially contribute to the development of oral cancer through various mechanisms. Chronic inflammation triggered by these pathogens’ presence and their byproducts can lead to sustained immune responses, promoting tissue damage and genetic alterations conducive to carcinogenesis [13]. For instance, S. mutans produces lactic acid as a byproduct of sugar metabolism, creating an acidic microenvironment that can damage oral epithelial cells and promote their malignant transformation [45]. Additionally, certain pathogens like C. albicans can produce carcinogenic compounds or toxins, contributing to oncogenic processes. Moreover, these pathogens are often found within biofilms, which not only shield them from host immune responses but also promote local tissue invasion and metastasis, facilitating the spread of malignant cells. Furthermore, chronic infections can disrupt the oral microbiota balance, leading to dysbiosis, which has been associated with an increased risk of oral cancer. Collectively, the interactions between dental pathogens and host tissues can initiate and perpetuate a pro-inflammatory and pro-carcinogenic milieu within the oral cavity, ultimately predisposing individuals to the development of oral cancer [46]. ZnO-PIP NPs, known for their potent antimicrobial activity against dental
pathogens, were further investigated for their potential anticancer effects specifically targeting oral cancer. The results of the study revealed promising anticancer activity, demonstrating a significant reduction in the viability of KB cells, a human oral cancer cell line. This finding suggests that ZnO-PIP NPs possess dual functionality, exhibiting both antimicrobial and anticancer properties. BCL2, BAX, and P53 are pivotal regulators of cellular apoptosis, a process central to cancer development and progression. In oral cancer, dysregulation of apoptosisrelated genes such as BCL2, which inhibits apoptosis, and BAX, which promotes apoptosis, can disrupt the delicate balance between cell proliferation and cell death, leading to uncontrolled tumor growth. Additionally, P53, a tumor suppressor gene, plays a crucial role in orchestrating cellular responses to DNA damage and cellular stress, including the induction of apoptosis in damaged or aberrant cells. Given their critical roles in regulating cell fate decisions, alterations in the expression or activity of these genes can significantly influence the development, progression, and response to therapy in oral cancer. Therefore, studying the expression levels and activity of BCL2, BAX, and P53 in response to ZnO-PIP NPs treatment provides valuable insights into the underlying mechanisms of their anticancer effects and elucidates potential therapeutic targets for combating oral cancer. In the study investigating the anticancer activity of ZnO-PIP NPs in KB cells, the results revealed significant alterations in the expression levels of key apoptosisrelated genes, including BCL2, BAX, and P53. Treatment with ZnO-PIP NPs resulted in a remarkable downregulation of BCL2, an anti-apoptotic protein known to inhibit cell death, thereby shifting the balance towards apoptosis induction. Concurrently, there was an upregulation of BAX, a pro-apoptotic protein that promotes apoptosis by facilitating mitochondrial outer membrane permeabilization and subsequent cytochrome c release, further enhancing the apoptotic response in KB cells. Moreover, ZnO-PIP NPs treatment led to the upregulation of P53, a tumor suppressor gene crucial for orchestrating cellular responses to DNA damage and stress. The upregulation of P53 likely contributed to the activation of downstream apoptotic pathways, including the transcriptional regulation of pro-apoptotic genes and the induction of cell cycle arrest, ultimately leading to the inhibition of KB cell proliferation and the promotion of cell death. Collectively, these results suggest that the anticancer activity of ZnO PIP NPs in KB cells is mediated through the modulation of BCL2, BAX, and P53 expression levels, highlighting their potential as promising therapeutic agents for oral cancer treatment by targeting key apoptotic pathways.

Several important considerations warrant discussion regarding the clinical translation of our findings and avenues for future research. Firstly, elucidating the safety
profile and biocompatibility of ZnO-PIP NPs is essential for their clinical use. Conducting comprehensive preclinical studies, including in vivo toxicity assessments and biodegradation studies, will be crucial to ensure the safety and tolerability of these nanoparticles in oral applications. Furthermore, exploring alternative delivery methods for ZnO-PIP NPs, such as topical gels, mouthwashes, or dental implants coated with ZnO-PIP NPs, could enhance their accessibility and efficacy in clinical settings. Investigating the stability and release kinetics of ZnO-PIP NPs from these delivery systems will be imperative to optimize their therapeutic outcomes. In addition to their antimicrobial and anticancer properties, the antioxidant activity of ZnO-PIP NPs presents opportunities for mitigating oxidative stress-related oral diseases, including dental caries and periodontal diseases. Future research could focus on evaluating the potential of ZnO-PIP NPs in promoting oral tissue regeneration and wound healing, particularly in the context of periodontal therapy and oral surgery.

In conclusion, this research demonstrates the multifunctional capabilities of ZnO-PIP NPs in addressing oral health challenges, including microbial infections and oral cancer. Through their potent antimicrobial and anticancer activities, ZnO-PIP NPs exhibit promising potential as integrated therapeutic agents for oral healthcare interventions. The robust findings from this study provide a solid foundation for the continued exploration and development of ZnO-PIP NPs, offering new avenues for improved management and treatment of oral diseases. These NPs hold promise for advancing oral healthcare practices, ultimately benefiting patients by enhancing treatment outcomes and quality of life.

The online version contains supplementary material available at https://doi. org/10.1186/s12903-024-04399-z.

Supplementary Material 1

The authors thank the Saveetha Dental College and Hospitals for providing the space to conduct the experiments. The authors acknowledge the funding from Researchers Supporting Project number (RSPD2024R665), King Saud University, Riyadh, Saudi Arabia.

M.R.S, K.K, H.K. did the Conceptualization, Data curation, Investigation. Formal analysis was performed by J.G. Writing-review and editing were conducted by A.G, S.M, M.A.S, J.A. All authors have read and agreed to the published version of the manuscript.

The authors acknowledges the financial support through the Researchers Supporting Project number (RSPD2024R665), King Saud University, Riyadh, Saudi Arabia.

The data are available from the corresponding author upon reasonable request.

No ethical approval was required for the current study as it did not deal with any human or animal samples.

Not applicable.

Not applicable.

The authors declare no competing interests.

Department of Chemistry, College of Science, King Saud University, P.O. Box 2455, Riyadh 11451, Saudi Arabia
Department of Cariology, Saveetha Institute of Medical and Technical Sciences, Saveetha Dental College and Hospitals, Saveetha University, Chennai, India
Department of Pharmacy, Abdul wali Khan University Mardan, Mardan 23200, Pakistan
Department of Mechanical Engineering, Yeshwantrao Chavan College of Engineering, Nagpur, India
Molecular and Integrative Physiological Sciences, Department of Environmental Health, Harvard T. H. Chan School of Public Health, Boston, MA 02115, USA
Department of Pharmacology and Toxicology, University of Arizona, Tucson, AZ 85721, USA
Department of Economics, Kebri Dehar University, 250, Kebri Dehar, Somali, Ethiopia
Division of Research and Development, Lovely Professional University, Phagwara, Punjab 144001, India
Toxicology and Pharmacology Laboratory, Department of Biotechnology, Faculty of Science and Humanities, SRM Institute of Science and Technology, Chengalpattu District, Kattankulathur, Tamil Nadu 603203, India

Published online: 21 June 2024

Springer Nature remains neutral with regard to jurisdictional claims in published maps and institutional affiliations.