DOI: https://doi.org/10.3389/fchem.2025.1549927
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/40242657
تاريخ النشر: 2025-04-02
المؤلف: Changfeng Zhu وآخرون
الموضوع الرئيسي: تقنيات الاستشعار الحيوي والتحليل الحيوي المتقدمة
نظرة عامة
تقدم هذه البحث تطوير جهاز استشعار مناعي كهربائي حساس للغاية للكشف عن الإنترلوكين-6 (IL-6)، مستفيدًا من نانو مركب أكسيد الجرافين المخفض (rGO) المزخرف بالأزرق الميثيلين (MB). يبرز الدراسة أهمية IL-6 كسايتوكين التهابي في التهاب اللثة، مما يستدعي طرق مراقبة كمية فعالة في سائل اللثة. يتم تصنيع نانو مركب rGO-MB من خلال تكديس π-π والتفاعلات الكهروستاتيكية، مما يعزز الإشارة الكهربائية بسبب الموصلية العالية ومساحة السطح لـ rGO. بالإضافة إلى ذلك، يتم استخدام بوليدوبامين (PDA) كعامل ربط بيولوجي للتثبيت التساهمي للأجسام المضادة المضادة لـ IL-6، بينما يعمل أيضًا كطبقة واقية لتثبيت rGO-MB على القطب الكربوني الزجاجي (GCE).
يظهر جهاز الاستشعار المناعي القائم على PDA/rGO-MB/GCE نطاق كشف خطي لـ IL-6 من 1 pg/mL إلى 100 ng/mL، مع حد كشف منخفض يصل إلى 0.48 pg/mL. يقوم هذا الجهاز بفعالية بالتقاط IL-6، مما يؤدي إلى انخفاض قابل للقياس في الإشارة الكهربائية لـ MB، مما يمكّن من الكمية الدقيقة. تختتم الدراسة بأن جهاز الاستشعار المقترح يظهر انتقائية ممتازة، وقابلية للتكرار، واستقرار، مما يجعله أداة واعدة لمراقبة مستويات IL-6 في العينات السريرية وقابلة للتطبيق المحتمل على علامات حيوية مهمة أخرى.
مقدمة
تسلط مقدمة هذه الورقة البحثية الضوء على الانتشار الكبير لمرض التهاب اللثة في الصين، حيث يؤثر على 70%-85% من السكان ويؤدي إلى فقدان الأسنان لدى البالغين في منتصف العمر وكبار السن. تقتصر طرق التشخيص التقليدية، مثل مؤشرات الفحص اللثوي والأشعة الرقمية، على التأخيرات التي تعيق التقييم المبكر للمخاطر والتقييم الفوري لنشاط المرض. لقد حولت التقدمات الحديثة في علم الأحياء الجزيئي التركيز نحو تحديد علامات حيوية في سائل اللثة، مع ظهور الإنترلوكين-6 (IL-6) كسايتوكين التهابي رئيسي مرتبط بشدة التهاب اللثة.
لمعالجة قيود تقنيات التشخيص التقليدية، تقترح الدراسة جهاز استشعار مناعي كهربائي جديد يستخدم نانو مركب أكسيد الجرافين المخفض-الأزرق الميثيلين (rGO-MB) للكشف الحساس عن IL-6. يدمج هذا الجهاز استشعارًا كهربائيًا، ومسرع نقل إلكتروني، وعنصر تعرف بيولوجي، مما يسهل قياس IL-6 بدون كواشف. يتم تصنيع نانو مركب rGO-MB من خلال تكديس π-π والتفاعلات الكهروستاتيكية، ويتم استخدام بوليدوبامين لتعزيز الاستقرار وتفعيل سطح القطب. يظهر جهاز الاستشعار المطور إمكانيات للتطبيقات العملية في اختبارات النقاط، مما يوفر طريقة سريعة وفعالة من حيث التكلفة ودقيقة لمراقبة مستويات IL-6 في سائل اللثة، وبالتالي يساهم في المجال الأوسع للكشف عن العلامات الحيوية في مرض التهاب اللثة.
طرق
في القسم التجريبي من الدراسة، تم الحصول على تعليق أكسيد الجرافين أحادي الطبقة (GO) من شركة هانغتشو جاوكسي للتكنولوجيا المحدودة بتركيز 1 ملغ/غ. تم الحصول على عوامل التهابية مختلفة، بما في ذلك الإنترلوكين-1β (IL-1β)، وعامل نخر الورم-α (TNF-α)، وبروتين ميتالوبروتيناز-9 (MMP-9)، وإنترفيرون-γ (IFN-γ)، وبروتين سي التفاعلي (CRP)، والإنترلوكين-6 (IL-6)، بالإضافة إلى الأجسام المضادة المحددة لـ IL، من شركة بكين KEY-BIO للتكنولوجيا الحيوية المحدودة. بالإضافة إلى ذلك، تم الحصول على مجموعة من المواد الكيميائية مثل الأزرق الميثيلين ثلاثي الهيدرات (MB)، والجلوكوز (Glu)، وحمض اليوريك (UA)، وحمض الأسكوربيك (AA)، وغيرها من شركة شنغهاي ألالدين للتكنولوجيا الحيوية.
استخدمت الدراسة هيدرازين هيدرات ومحلول الأمونيا من الموردين المعنيين، بينما تم تحضير محلول ملحي مخفف بالفوسفات (PBS) عن طريق خلط فوسفات الصوديوم ثنائي الهيدروجين ثنائي الهيدرات (NaH₂PO₄·2H₂O) وفوسفات الصوديوم ثنائي الهيدروجين دوديهايدرات (Na₂HPO₄·12H₂O). تم جمع عينات من سائل اللثة من فرد صحي في مستشفى بكين للطب التقليدي الصيني والطب الغربي المتكامل. تم تحضير جميع المحاليل المائية المستخدمة في التجارب باستخدام مياه فائقة النقاء من ميلبورو، مما يضمن نقاء عالي طوال الدراسة.
نتائج
تتناول قسم النتائج تفاصيل تصنيع وآلية تشغيل جهاز استشعار BSA/Ab/PDA/rGO-MB/GCE المصمم للكشف الكهربائي عن الإنترلوكين-6 (IL-6). يتم بناء جهاز الاستشعار من خلال دمج أكسيد الجرافين المخفض (rGO) والأزرق الميثيلين (MB) من خلال تكديس π-π والتفاعلات الكهروستاتيكية، مما يؤدي إلى نانو مركب يعزز إشارات الأكسدة والاختزال لـ MB بسبب الموصلية العالية ومساحة السطح لـ rGO. ثم يتم بوليمرة طبقة بوليدوبامين (PDA) ذاتيًا على المركب rGO-MB، مما يوفر حاجزًا واقيًا ومواقع وظيفية لارتباط الأجسام المضادة المضادة لـ IL-6.
تزداد خصوصية جهاز الاستشعار بشكل أكبر من خلال استخدام ألبومين مصل البقر (BSA) لتقليل الامتصاص غير المحدد. عند إدخال IL-6، يرتبط المحلل المستهدف بالأجسام المضادة المثبتة، مما يمنع نقل الإلكترون لـ MB، مما يؤدي إلى انخفاض قابل للقياس في الإشارات الكهربائية. يرتبط هذا الانخفاض في شدة الإشارة كميًا بتركيز IL-6، مما يسهل المراقبة الدقيقة لمستويات IL-6 في العينات البيولوجية.
مناقشة
في هذه الدراسة، تم تطوير جهاز استشعار مناعي كهربائي جديد للكشف الحساس عن الإنترلوكين-6 (IL-6) باستخدام نانو مركب أكسيد الجرافين المخفض-الأزرق الميثيلين (rGO-MB). تم تصنيع صفائح نانو rGO ودمجها مع MB لتشكيل الهجين rGO-MB، الذي تم تثبيته بعد ذلك على القطب الكربوني الزجاجي (GCE). تم تعزيز أداء المستشعر من خلال تغطيته بطبقة بوليدوبامين (PDA)، التي لم تستقر فقط الإشارة الكهربائية ولكن أيضًا وفرت مواقع لارتباط الأجسام المضادة المضادة لـ IL-6. تم توصيف السلوك الكهربائي للمستشعر باستخدام الفولتمتر الدوري (CV)، والفولتمتر النبضي التفاضلي (DPV)، وطيف الامتصاص الكهربائي (EIS)، مما يظهر انخفاضًا كبيرًا في الإشارات الكهربائية عند ارتباط IL-6، مما يدل على نجاح وظيفة الاختبار المناعي.
أظهر جهاز الاستشعار استجابة خطية لتركيزات IL-6 تتراوح من 1 pg/mL إلى 100 ng/mL، مع حد كشف (LOD) يبلغ 0.48 pg/mL. أظهرت اختبارات الانتقائية تدخلًا ضئيلًا من المواد الشائعة الموجودة في سائل اللثة، بينما أكدت تقييمات القابلية للتكرار والاستقرار موثوقية المستشعر على مر الزمن. تم تطبيق جهاز الاستشعار المطور بنجاح للكشف عن IL-6 في عينات حقيقية من سائل اللثة، محققًا معدلات استرداد عالية (97.3-99.3%) وانحرافات معيارية نسبية منخفضة (<1.3%). بشكل عام، يمثل جهاز الاستشعار rGO-MB/GCE منصة واعدة للكشف عن IL-6 وربما علامات حيوية أخرى، مما يجمع بين سهولة التصنيع مع حساسية وخصوصية عالية.
DOI: https://doi.org/10.3389/fchem.2025.1549927
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/40242657
Publication Date: 2025-04-02
Author(s): Changfeng Zhu et al.
Primary Topic: Advanced biosensing and bioanalysis techniques
Overview
This research presents the development of a highly sensitive electrochemical immunosensor for interleukin-6 (IL-6) detection, leveraging a methylene blue (MB)-decorated reduced graphene oxide (rGO) nanocomposite. The study highlights the significance of IL-6 as an inflammatory cytokine in periodontitis, necessitating effective quantitative monitoring methods in gingival crevicular fluid. The rGO-MB nanocomposite is synthesized through π-π stacking and electrostatic interactions, enhancing the electrochemical signal due to rGO’s high conductivity and surface area. Additionally, polydopamine (PDA) is utilized as a biological crosslinking agent for the covalent immobilization of anti-IL-6 antibodies, while also serving as a protective layer to stabilize the rGO-MB on the glassy carbon electrode (GCE).
The resulting PDA/rGO-MB/GCE-based immunosensor demonstrates a linear detection range for IL-6 from 1 pg/mL to 100 ng/mL, with a limit of detection as low as 0.48 pg/mL. This immunosensor effectively captures IL-6, leading to a measurable decrease in the electrochemical signal of MB, thus enabling precise quantification. The study concludes that the proposed immunosensor exhibits excellent selectivity, repeatability, and stability, making it a promising tool for monitoring IL-6 levels in clinical samples and potentially applicable to other important biomarkers.
Introduction
The introduction of this research paper highlights the significant prevalence of periodontal disease in China, affecting 70%-85% of the population and leading to tooth loss in middle-aged and older adults. Traditional diagnostic methods, such as periodontal examination indices and digital subtraction radiography, are limited by delays that hinder early risk assessment and timely evaluation of disease activity. Recent advancements in molecular biology have shifted focus towards identifying biomarkers in gingival crevicular fluid, with interleukin-6 (IL-6) emerging as a key inflammatory cytokine linked to the severity of periodontitis.
To address the limitations of conventional diagnostic techniques, the study proposes a novel electrochemical immunosensor utilizing a reduced graphene oxide-methylene blue (rGO-MB) nanocomposite for the sensitive detection of IL-6. This immunosensor integrates an electrochemical probe, an electron transfer accelerator, and a biological recognition element, facilitating reagentless measurement of IL-6. The rGO-MB nanocomposite is synthesized through π-π stacking and electrostatic interactions, and polydopamine is employed to enhance stability and functionalize the electrode surface. The developed immunosensor demonstrates potential for practical applications in point-of-care testing, offering a rapid, cost-effective, and accurate method for monitoring IL-6 levels in gingival crevicular fluid, thereby contributing to the broader field of biomarker detection in periodontal disease.
Methods
In the experimental section of the study, monolayered graphene oxide (GO) aqueous dispersion was sourced from Hangzhou Gaoxi Technology Co., Ltd. at a concentration of 1 mg/g. Various inflammatory factors, including interleukin-1β (IL-1β), tumor necrosis factor-α (TNF-α), matrix metalloproteinase-9 (MMP-9), interferon-γ (IFN-γ), C-reactive protein (CRP), and interleukin-6 (IL-6), along with IL-specific antibodies, were procured from Beijing KEY-BIO Biotech Co., Ltd. Additionally, a range of chemicals such as methylene blue trihydrate (MB), glucose (Glu), uric acid (UA), ascorbic acid (AA), and others were obtained from Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co., Ltd.
The study utilized hydrazine hydrate and ammonia solution from respective suppliers, while phosphate-buffered saline (PBS) was prepared by mixing sodium dihydrogen phosphate dihydrate (NaH₂PO₄·2H₂O) and disodium hydrogen phosphate dodecahydrate (Na₂HPO₄·12H₂O). Gingival crevicular fluid samples were collected from a healthy individual at the Beijing Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine. All aqueous solutions used in the experiments were prepared using ultrapure water from Millipore, ensuring high purity throughout the study.
Results
The results section details the fabrication and operational mechanism of a BSA/Ab/PDA/rGO-MB/GCE immunosensor designed for the electrochemical detection of interleukin-6 (IL-6). The immunosensor is constructed by combining reduced graphene oxide (rGO) and methylene blue (MB) through π-π stacking and electrostatic interactions, resulting in a nanocomposite that enhances the redox signals of MB due to rGO’s high conductivity and surface area. A polydopamine (PDA) layer is then self-polymerized on the rGO-MB composite, providing a protective barrier and functional sites for the attachment of anti-IL-6 antibodies.
The immunosensor’s specificity is further enhanced by the use of bovine serum albumin (BSA) to minimize non-specific adsorption. Upon introduction of IL-6, the target analyte binds to the immobilized antibodies, which inhibits the electron transfer of MB, leading to a measurable decrease in electrochemical signals. This decline in signal intensity correlates quantitatively with IL-6 concentration, thereby facilitating accurate monitoring of IL-6 levels in biological samples.
Discussion
In this study, a novel electrochemical immunosensor for the sensitive detection of interleukin-6 (IL-6) was developed using a reduced graphene oxide-methylene blue (rGO-MB) nanocomposite. The rGO nanosheets were synthesized and combined with MB to form the rGO-MB hybrid, which was then immobilized on a glassy carbon electrode (GCE). The sensor’s performance was enhanced by coating it with a polydopamine (PDA) layer, which not only stabilized the electrochemical signal but also provided sites for the attachment of anti-IL-6 antibodies. The electrochemical behavior of the sensor was characterized using cyclic voltammetry (CV), differential pulse voltammetry (DPV), and electrochemical impedance spectroscopy (EIS), demonstrating a significant reduction in electrochemical signals upon IL-6 binding, indicative of successful immunoassay functionality.
The immunosensor exhibited a linear response to IL-6 concentrations ranging from 1 pg/mL to 100 ng/mL, with a limit of detection (LOD) of 0.48 pg/mL. Selectivity tests showed minimal interference from common substances found in gingival crevicular fluid, while repeatability and stability assessments confirmed the sensor’s reliability over time. The developed immunosensor was successfully applied to detect IL-6 in real gingival crevicular fluid samples, achieving high recovery rates (97.3-99.3%) and low relative standard deviations (<1.3%). Overall, the rGO-MB/GCE immunosensor represents a promising platform for the detection of IL-6 and potentially other biomarkers, combining ease of fabrication with high sensitivity and specificity.