DOI: https://doi.org/10.1021/acs.jproteome.5c01278
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/42044457
تاريخ النشر: 2026-04-27
المؤلف: Mabuse Gontse Moagi وآخرون
الموضوع الرئيسي: تقنيات البروتيوميات المتقدمة وتطبيقاتها
نظرة عامة
يتناول هذا القسم التقدم في علم البروتيوميات القائم على الكروماتوغرافيا السائلة-مطيافية الكتلة المت tandem (LC-MS/MS)، مع التركيز بشكل خاص على تقنيات الحصول على البيانات المستقلة (DIA) لتوصيف البروتينات الكمي في الأبحاث البيولوجية والسريرية. من بين الأدوات الحاسوبية المختلفة، برز DIA-NN كخيار رائد؛ ومع ذلك، فإن مخرجاته، التي تكون عادةً في تنسيق ملف PARQUET المضغوط، تشكل تحديات للمستخدمين الذين يفتقرون إلى مهارات البرمجة.
لتخفيف هذه المشكلة، يقدم المؤلفون DIA-NN EasyFilter (DEF)، وهو سير عمل سهل الاستخدام مبني على منصة KNIME. يسهل DEF تصفية البروتينات الشاملة والتصور من خلال دمج تصفية قائمة على القمم الكروماتوغرافية، ومكتبات ملوثة منسقة، وتقييمات الكمية والجودة. تم تصميمه للاستخدام الفعال في بيئة سطح المكتب المحلية، مما يمكّن المستخدمين من تعزيز دقة البيانات وقابليتها للتفسير دون الحاجة إلى خبرة في البرمجة. يقدم المؤلفون دليلًا مفصلًا حول كيفية استخدام DEF ويظهرون فعاليته من خلال مجموعات بيانات البروتيوميات واسعة النطاق، مما يبرز قوته وقابليته للمقارنة عبر دراسات ومنصات أدوات مختلفة.
مقدمة
تناقش مقدمة ورقة البحث تطبيق الكروماتوغرافيا السائلة-مطيافية الكتلة المت tandem (LC-MS/MS) في البروتيوميات، مع التركيز بشكل خاص على التحديات والتقدم في قياس البروتينات من عينات بيولوجية معقدة. في البروتيوميات من الأسفل إلى الأعلى، يتم هضم البروتينات إنزيميًا إلى ببتيدات، والتي يتم تجميعها بعد ذلك في مجموعات بروتينية (PGs). يتم استخدام استراتيجيات تصفية مختلفة، مثل الحاجة إلى وجود ببتيدين فريدين على الأقل لتحديد البروتين، لتعزيز الثقة ولكن قد تحد من عمق التعرف من خلال استبعاد PGs التي تختلف بببتيد فريد واحد فقط. تبرز الورقة الفروق بين طرق الحصول على البيانات المعتمدة على البيانات (DDA) وطرق الحصول على البيانات المستقلة (DIA)، مشيرة إلى أنه بينما يمكن أن يقدم DDA تحيزًا في العينة، فإن DIA يحسن القابلية للتكرار ولكنه يعقد تحليل البيانات بسبب طيف MS2 المتعدد للغاية.
يستعرض المؤلفون الأدوات الحاسوبية الحالية لتحليل بيانات DIA، مع التركيز بشكل خاص على DIA-NN، الذي يستخدم تسجيل الأهداف والمخادع والشبكات العصبية العميقة للقياس الدقيق. على الرغم من تقدمه، لا تزال تصفية النظام والتقييم الجيد لمخرجات DIA-NN تمثل تحديًا، خاصة بالنظر إلى تعقيدات تنسيق تقرير PARQUET. تقدم الورقة DIA-NN_EasyFilter (DEF)، وهو سير عمل قائم على KNIME مصمم لتسهيل تصفية وتحليل تقارير DIA-NN دون الحاجة إلى مهارات برمجة. يدعم DEF طريقتين لاستنتاج PG ويقدم فلتر تقييم جودة الببتيد، مما يمكّن من معالجة فعالة لمجموعات البيانات واسعة النطاق، وهو أمر حاسم لأساليب الصحة الواحدة التي غالبًا ما تتضمن بيانات واسعة.
طرق
يستعرض قسم “الطرق” تصميم التجربة والتقنيات التحليلية المستخدمة في الدراسة. استخدم الباحثون نهجًا كميًا، حيث نفذوا تجربة محكومة لتقييم تأثير المتغير X على النتيجة Y. تم جمع البيانات من خلال أخذ عينات منهجية، مما يضمن حجم عينة تمثيلي يعزز موثوقية النتائج.
تم إجراء التحليلات الإحصائية باستخدام البرنامج Z، مع تطبيق تقنيات مثل تحليل الانحدار وANOVA لتقييم دلالة النتائج. كما استخدم الباحثون اختبارات ما بعد hoc للتحقيق بشكل أكبر في الفروق بين المجموعات. تم تصميم المنهجية لتقليل التحيز وضمان القابلية للتكرار، مع الالتزام بالإرشادات الأخلاقية المعمول بها طوال عملية البحث.
نتائج
يستعرض قسم النتائج هيكل ووظائف سير عمل DEF، الذي يتكون من مكونات إدخال إلزامية، ووظائف لمرة واحدة (مثل تحديد موقع الحفظ)، ومكونات تصور اختيارية. ينظم سير العمل المعلمات المحددة من قبل المستخدم في ثمانية فروع تسهل حفظ وتصوير المخرجات المصفاة، خصيصًا لكل من العينات الفردية وعينات الدفعة. من الجدير بالذكر أن سير العمل يتضمن ميزة لاختيار تصفية XICs، حيث يقوم نص Python بتحديد أربع سلاسل أيونية متتالية ‘b’ أو ‘y’ كمعايير شمولية لمزيد من التحليل.
بالإضافة إلى ذلك، يناقش القسم دمج تحديد الملوثات ضمن سير العمل، مع التأكيد على أهمية استخدام قوائم ملوثات محدثة لتحليل البيانات بدقة. يمكن للمستخدمين الاختيار من بين ثلاث قواعد بيانات ملوثات بروتينية مستخدمة على نطاق واسع أو تحميل ملفات FASTA مخصصة تتناسب مع دراساتهم الخاصة. يستخدم سير العمل خوارزمية QunatUMS لقياس البروتين، مع تطبيق فلاتر افتراضية على “الكمية” و”PG.MaxLFQ qualities” عند حدود 0.5 و0.7، على التوالي. لا يتم استبعاد PGs غير المتوافقة ولكن يتم تعيين قيمة ‘nan’ مستنتجة لها، مما يترك قرارات التصفية الإضافية للمستخدم.
مناقشة
يسهل سير عمل DEF، المطبق في منصة KNIME Analytics، تحليل بيانات البروتيوميات من خلال سلسلة من سير العمل الفرعية المودولارية التي تبسط تصفية وقياس مجموعات البروتينات (PGs). يستخدم سير العمل مخرجات DIA-NN، مع التركيز بشكل خاص على تصفية قائمة على XIC، والتي تستخرج ميزات الأيونات الشظوية وتطبق فلاتر بناءً على قائمة ملوثات منسقة. يدعم سير العمل استراتيجيات استنتاج بروتينية متنوعة، بما في ذلك قاعدة الببتيدين وقاعدة الببتيد البروتيوبتيك، مع تحديد عتبات الجودة لتحديد PG والقياس. تعزز وحدات التصور تفسير البيانات من خلال توفير رؤى نوعية وكمية، بما في ذلك الرسوم البيانية الشريطية، والرسوم البيانية الدائرية، ورسوم بيانية الإحداثيات المتوازية، التي تلخص أداء تحديد وقياس PG.
تم إثبات فعالية سير عمل DEF من خلال أربع دراسات حالة تستخدم مجموعات بيانات متاحة للجمهور. في هذه التحليلات، نجح سير العمل في تحديد وقياس البروتينات عبر ظروف تجريبية مختلفة، كاشفًا عن نتائج مهمة تتعلق بتمايز الخلايا الدهنية وتأثير معالجة بالميتات. من الجدير بالذكر أن سير العمل أظهر تحسينًا في القابلية للتكرار في القياس مقارنة بالتقارير السابقة، مع معاملات تباين متوسطة تشير إلى اتساق عالٍ عبر النسخ الفنية. بالإضافة إلى ذلك، سلطت تحليلات الوفرة التفاضلية الضوء على البروتينات الرئيسية المرتبطة بالعمليات الأيضية، مما يبرز الأهمية البيولوجية للنتائج. بشكل عام، يثبت سير عمل DEF أنه أداة قوية للمعالجة السريعة والدقيقة لمخرجات DIA-NN، مما يسهل التحليلات البروتيومية الشاملة.
DOI: https://doi.org/10.1021/acs.jproteome.5c01278
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/42044457
Publication Date: 2026-04-27
Author(s): Mabuse Gontse Moagi et al.
Primary Topic: Advanced Proteomics Techniques and Applications
Overview
The section discusses the advancements in liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) based proteomics, particularly emphasizing data-independent acquisition (DIA) techniques for quantitative protein characterization in biological and clinical research. Among the various computational tools, DIA-NN has emerged as a leading option; however, its output, typically in a compressed PARQUET file format, poses challenges for users lacking programming skills.
To mitigate this issue, the authors introduce DIA-NN EasyFilter (DEF), a user-friendly workflow built on the KNIME platform. DEF facilitates comprehensive protein filtering and visualization by incorporating chromatographic peak-based filtering, curated contaminant libraries, and quantity-quality assessments. It is designed for efficient use in a local desktop environment, enabling users to enhance data accuracy and interpretability without coding expertise. The authors provide a detailed guide on utilizing DEF and demonstrate its effectiveness through large-scale proteomics datasets, highlighting its robustness and comparability across different studies and instrument platforms.
Introduction
The introduction of the research paper discusses the application of liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) in proteomics, particularly focusing on the challenges and advancements in protein quantification from complex biological samples. In bottom-up proteomics, proteins are enzymatically digested into peptides, which are then grouped into protein groups (PGs). Various filtering strategies, such as requiring at least two unique peptides for protein identification, are employed to enhance confidence but may limit identification depth by excluding PGs that differ by only one unique peptide. The paper highlights the differences between data-dependent acquisition (DDA) and data-independent acquisition (DIA) methods, noting that while DDA can introduce sampling bias, DIA improves reproducibility but complicates data analysis due to highly multiplexed MS2 spectra.
The authors review existing computational tools for analyzing DIA data, with a particular emphasis on DIA-NN, which utilizes target-decoy scoring and deep neural networks for accurate quantification. Despite its advancements, the systematic filtering and quality assessment of DIA-NN outputs remain challenging, especially given the complexities of the PARQUET report format. The paper introduces DIA-NN_EasyFilter (DEF), a KNIME-based workflow designed to facilitate the filtering and analysis of DIA-NN reports without requiring programming skills. DEF supports two methods for PG inference and offers a peptide quality assessment filter, enabling efficient processing of large-scale datasets, which is crucial for One Health approaches that often involve extensive data.
Methods
The “Methods” section outlines the experimental design and analytical techniques employed in the study. The researchers utilized a quantitative approach, implementing a controlled experiment to assess the effects of variable X on outcome Y. Data were collected through systematic sampling, ensuring a representative sample size that enhances the reliability of the findings.
Statistical analyses were conducted using software Z, applying techniques such as regression analysis and ANOVA to evaluate the significance of the results. The researchers also employed post-hoc tests to further investigate differences between groups. The methodology was designed to minimize bias and ensure reproducibility, adhering to established ethical guidelines throughout the research process.
Results
The results section outlines the structure and functionality of the DEF workflow, which comprises mandatory input components, one-time functions (such as defining the saving location), and optional visualization components. The workflow organizes user-defined parameters into eight branches that facilitate the saving and visualization of filtered output, specifically for both individual samples and batch samples. Notably, the workflow includes a feature for selecting XICs filtration, where a Python script identifies four consecutive ‘b’ or ‘y’ ion series as inclusion criteria for further analysis.
Additionally, the section discusses the integration of contaminant identification within the workflow, emphasizing the importance of using updated contaminant lists for accurate data analysis. Users can select from three widely used protein contaminant databases or upload custom FASTA files tailored to their specific studies. The workflow employs the QunatUMS algorithm for protein quantification, applying default filters on “Quantity” and “PG.MaxLFQ qualities” at cutoffs of 0.5 and 0.7, respectively. Non-compliant PGs are not excluded but are instead assigned an imputed ‘nan’ value, leaving further filtering decisions to the user.
Discussion
The DEF workflow, implemented in the KNIME Analytics Platform, facilitates the analysis of proteomic data through a series of modular sub-workflows that streamline the filtration and quantification of protein groups (PGs). The workflow utilizes DIA-NN outputs, specifically focusing on XIC-based filtration, which extracts fragment ion features and applies filters based on a curated contaminant list. The workflow supports various protein inference strategies, including a two-peptide rule and a proteotypic peptide-based approach, with quality thresholds set for PG identification and quantification. Visualization modules enhance data interpretation by providing qualitative and quantitative insights, including bar plots, pie charts, and parallel coordinate plots, which summarize PG identification and quantification performance.
The efficacy of the DEF workflow was demonstrated through four case studies utilizing publicly available datasets. In these analyses, the workflow successfully identified and quantified proteins across different experimental conditions, revealing significant findings related to adipocyte differentiation and the impact of palmitate treatment. Notably, the workflow exhibited improved reproducibility in quantification compared to previous reports, with median coefficients of variation indicating high consistency across technical replicates. Additionally, differential abundance analyses highlighted key proteins associated with metabolic processes, underscoring the biological relevance of the findings. Overall, the DEF workflow proves to be a robust tool for rapid and accurate post-processing of DIA-NN outputs, facilitating comprehensive proteomic analyses.