DOI: https://doi.org/10.3389/fimmu.2025.1719056
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/41607802
تاريخ النشر: 2026-01-13
المؤلف: Bernd Kuebler وآخرون
الموضوع الرئيسي: أبحاث خلايا الجذع متعددة القدرات
نظرة عامة
لقد تقدم إدخال خلايا الجذع متعددة القدرات المستحثة (iPSCs) بشكل كبير في الطب التحويلي من خلال السماح بتحويل خلايا الجسم البالغة إلى حالة متعددة القدرات، مما يسهل نماذج الأمراض الشخصية والعلاجات الخلوية الجديدة. توفر خلايا iPSCs، التي يمكن أن تتجدد ذاتيًا إلى ما لا نهاية وتتفرد إلى أي نوع من خلايا الجسم، حلولًا محددة للمرضى دون المعضلات الأخلاقية المرتبطة بخلايا الجذع الجنينية (ESCs). يتضمن توليد خلايا iPSCs إعادة برمجة الخلايا المتمايزة من خلال إدخال عوامل محددة، مما يغير ملفاتها الجينية والتعبيرية لإعادة تنشيط القدرة على التعدد. ومع ذلك، لا تزال الآليات الدقيقة لهذه العملية غير مفهومة بشكل كافٍ.
في هذه الدراسة، أجرينا تحليلًا إحصائيًا لكفاءات إعادة البرمجة لـ 150 خطًا من خلايا iPSC المستمدة في مختبرنا، مع تقييم عوامل مختلفة مثل نوع خلايا الجسم البدائية، عدد التمريرات، حالة صحة المتبرع، العمر، الجنس، تقنيات إعادة البرمجة، وظروف النمو. تشير نتائجنا إلى أن الحالة التطورية للخلايا البدائية هي المحدد الأكثر أهمية لكفاءة إعادة البرمجة. على الرغم من أن العوامل الأخرى قد تؤثر بشكل طفيف، إلا أن الخصائص البيولوجية الجوهرية للمتبرع هي الأهم في تشكيل نتائج عملية إعادة البرمجة.
مقدمة
ت outlines إدخال هذه الورقة البحثية العمل الأساسي في إعادة برمجة الخلايا الذي بدأه كازوتوشي تاكاهاشي وشينيا ياماناكا في عام 2006، والذي حدد أربعة عوامل نسخ—Oct4 وSox2 وKlf4 وc-Myc (المشار إليها مجتمعة باسم OSKM)—كعوامل حاسمة لتحفيز القدرة على التعدد في خلايا الجسم. تمثل الجيل اللاحق من خلايا الجذع متعددة القدرات المستحثة (iPSCs) من الألياف البشرية تقدمًا كبيرًا، حيث تم استخدام ناقلات فيروسية عكسية وفيروسات لنتيفيرال للتكامل المستقر لهذه العوامل. ومع ذلك، أثارت المخاوف بشأن الطفرات الناتجة عن الإدخال وعدم الاستقرار الجيني تطوير تقنيات إعادة برمجة غير متكاملة، بما في ذلك استخدام الفيروسات الغدية، وفيروسات سنداي، وطرق قائمة على RNA، من بين أمور أخرى.
تؤكد الورقة على تعقيد عملية إعادة البرمجة، التي تتضمن تغييرات جينية وتعبيرية واسعة النطاق لإعادة خلايا الجسم إلى حالة متعددة القدرات. كما تسلط الضوء على دور OSKM في إعادة تشكيل الكروماتين والتحولات الأيضية خلال إعادة البرمجة. بالإضافة إلى ذلك، تتناول الدراسة التباين في كفاءة إعادة البرمجة المتأثرة بالعوامل المناعية، وخصائص المتبرع، والمتغيرات التقنية. باستخدام مجموعة بيانات شاملة من بنك خلايا الجذع في برشلونة، تهدف المؤلفون إلى تقييم هذه العوامل إحصائيًا لتعزيز فهم توليد خلايا iPSC وتحسين البروتوكولات لتحقيق عوائد أفضل وسلامة جينية. يتم وضع هذا البحث لتطوير استراتيجيات اشتقاق خلايا iPSC، مما يسهم في التقدم في الطب التجديدي.
طرق
في هذه الدراسة، تم توليد ما مجموعه 150 خطًا من خلايا الجذع متعددة القدرات المستحثة (iPSC) باستخدام تقنيات إعادة برمجة متنوعة، بما في ذلك الطرق المتكاملة وغير المتكاملة. كانت المصدر الرئيسي لإعادة البرمجة هو الألياف البشرية، التي تم علاجها باستخدام توصيل الفيروسات العكسية لعوامل ياماناكا، والنقل النووي باستخدام بلازميدات إيبسومال، ونقل فيروس سنداي، والتحويل باستخدام RNAs غير المعدلة. كانت الطريقة الأكثر شيوعًا المستخدمة هي فيروس سنداي، الذي تم استخدامه لـ 56.7% من الخطوط، تليه بلازميدات إيبسومال (33.3%). شملت المجموعة أنواع خلايا متنوعة، حيث كانت الألياف (52%) وخلايا الدم المحيطية الوحيدة النواة (PBMCs، 38%) هي الأكثر شيوعًا. ومن الجدير بالذكر أن 77% من خطوط iPSC تم اشتقاقها من مرضى يعانون من أمراض مختلفة، بينما كانت النسبة المتبقية 23% من متبرعين أصحاء، مما يخدم كضوابط لنمذجة الأمراض.
شمل سير العمل لتوليد وتوصيف خلايا iPSCs عدة خطوات رئيسية. بعد ظهور المستعمرات الأولية، تم اختيار 10 إلى 14 مستنسخات فردية يدويًا وتوسيعها، تلاها اختبار الميكوبلازما. خضعت المستنسخات المختارة لتقييم مورفولوجي وتوسيع إضافي، مع إجراء تحليلات كاريولوجية على مستنسختين خاليتين من الجينات المنقولة. شمل التوصيف الشامل الكيمياء المناعية لعلامات الحالة غير المتمايزة، وصبغ الفوسفاتاز القلوي، واختبارات التمايز عبر تشكيل الأجسام الجنينية، وفقًا لإرشادات ISSCR. تم إجراء اختبار ثانٍ للميكوبلازما قبل التخزين، وتم تكرار تحديد الكاريوتيب بعد التخزين، لضمان سلامة وجودة خطوط iPSC المولدة.
النتائج
في هذا القسم، تحقق الدراسة من تأثير معلمات مختلفة على كفاءة إعادة البرمجة لأنواع خلايا مختلفة. تشير النتائج إلى أن خلايا CD34+ المعزولة من دم الحبل السري تظهر أعلى متوسط كفاءة إعادة برمجة عند 1.199% ± 0.529، متفوقة بشكل كبير على الألياف (0.040% ± 0.103)، وPBMCs (0.015% ± 0.013)، وخلايا الشوانوما (0.121% ± 0.158)، مع تأكيد الأهمية الإحصائية (p < 0.0001). ومن الجدير بالذكر أنه عند تحليل الفئات العمرية، أظهر كبار السن كفاءة إعادة برمجة متوسطة أعلى (0.019%) مقارنة بالبالغين (0.006%) والأفراد الشباب (0.009%)، مع وجود فرق كبير بين فئات كبار السن والبالغين (p < 0.05). كشفت المقارنات المنهجية أن تقنية إعادة البرمجة القائمة على mRNA حققت كفاءة متوسطة قدرها 0.221% ± 0.235، أعلى بكثير من الطرق الأخرى مثل البلازميدات الإيبسومالية (0.017% ± 0.027) والفيروسات العكسية (0.030% ± 0.030) (p < 0.05). ومع ذلك، عند النظر في جميع أنواع الخلايا، لم يتم العثور على اختلافات كبيرة بين المنهجيات. بالإضافة إلى ذلك، لم تظهر الجنس، عدد التمريرات، وحالة الصحة تأثيرات كبيرة على كفاءة إعادة البرمجة، على الرغم من أن خطوط المتبرعين الأصحاء كانت لديها كفاءة متوسطة أعلى قليلاً (0.066% ± 0.116) مقارنة بتلك المأخوذة من المتبرعين المرضى (0.024% ± 0.071). أكدت التحليلات التكميلية باستخدام نماذج خطية عامة هذه النتائج، مما يعزز قوة استنتاجات الدراسة.
المناقشة
في هذه الدراسة، تم تحليل كفاءات إعادة البرمجة لـ 150 خطًا من خلايا الجذع متعددة القدرات المستحثة (iPSC)، مع التركيز على عوامل مختلفة مثل نوع خلايا الجسم البدائية، وطريقة إعادة البرمجة، وخصائص المتبرع. كشفت النتائج أن خلايا CD34+ أظهرت كفاءات إعادة برمجة أعلى بشكل ملحوظ (1.199% ± 0.529) مقارنة بالألياف (0.040% ± 0.103)، وPBMCs (0.015% ± 0.013)، وخلايا الشوانوما (0.121% ± 0.158). يُعزى هذا التحسن في الكفاءة في خلايا CD34+ إلى طبيعتها كخلايا سلف، مما يسهل الانتقال إلى حالة متعددة القدرات. من بين طرق إعادة البرمجة، كانت الطريقة القائمة على فيروس سنداي باستخدام مجموعة CTS CytoTune™ -iPS 2.1 هي الأكثر كفاءة، على الرغم من أن هذا تأثر بشكل أساسي باختيار نوع الخلية بدلاً من الطريقة نفسها. ومن الجدير بالذكر أن طريقة إعادة البرمجة القائمة على mRNA أظهرت كفاءة متفوقة مقارنة باستراتيجيات البلازميد الإيبسومالي عندما كانت الألياف هي نوع الخلية البدائية.
كما أبرزت الدراسة أن كفاءة إعادة البرمجة تتأثر بالعوامل المتعلقة بالمتبرع، حيث لوحظت كفاءات أعلى في خطوط الخلايا المشتقة من المتبرعين الأصحاء مقارنة بتلك المأخوذة من المرضى. ومن المثير للاهتمام، على عكس الاعتقاد الشائع بأن كفاءة إعادة البرمجة تنخفض مع تقدم العمر، أشارت البيانات إلى كفاءات أعلى في المتبرعين كبار السن، مما يشير إلى علاقة أكثر تعقيدًا بين العمر والمرونة الخلوية. تضمنت قيود الدراسة عدم التوازن في عدد خطوط الخلايا عبر المجموعات، مما قد يؤثر على القوة الإحصائية، وتأثيرات محتملة مربكة بسبب الارتباط بين نوع الخلية وطريقة إعادة البرمجة. بشكل عام، تؤكد النتائج على أهمية الخصائص الخلوية الجوهرية والعوامل المحددة للمتبرع في تحديد كفاءة إعادة البرمجة، بينما تشير أيضًا إلى أن الطرق غير المتكاملة مثل فيروس سنداي والأساليب القائمة على mRNA هي المفضلة لتوليد خلايا iPSCs في التطبيقات السريرية.
DOI: https://doi.org/10.3389/fimmu.2025.1719056
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/41607802
Publication Date: 2026-01-13
Author(s): Bernd Kuebler et al.
Primary Topic: Pluripotent Stem Cells Research
Overview
The introduction of induced pluripotent stem cells (iPSCs) has significantly advanced translational medicine by allowing the conversion of adult somatic cells into a pluripotent state, thus facilitating personalized disease models and novel cell therapies. iPSCs, which can self-renew indefinitely and differentiate into any somatic cell type, provide patient-specific solutions without the ethical dilemmas associated with embryonic stem cells (ESCs). The generation of iPSCs involves reprogramming differentiated cells through the introduction of specific factors, which alters their epigenetic and transcriptional profiles to reactivate pluripotency. However, the precise mechanisms of this reprogramming process remain inadequately understood.
In this study, we conducted a statistical analysis of the reprogramming efficiencies of 150 iPSC lines derived in our laboratory, assessing various factors such as the type of starting somatic cells, passage number, donor health status, age, sex, reprogramming techniques, and growth conditions. Our findings indicate that the developmental status of the starting cells is the most significant determinant of reprogramming efficiency. Although other factors may have minor influences, the inherent biological characteristics of the donor are paramount in shaping the outcomes of the reprogramming process.
Introduction
The introduction of this research paper outlines the foundational work in cellular reprogramming initiated by Kazutoshi Takahashi and Shinya Yamanaka in 2006, which identified four transcription factors—Oct4, Sox2, Klf4, and c-Myc (collectively referred to as OSKM)—as crucial for inducing pluripotency in somatic cells. The subsequent generation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from human fibroblasts marked a significant advancement, utilizing retroviral and lentiviral vectors for stable integration of these factors. However, concerns regarding insertional mutagenesis and genomic instability prompted the development of non-integrating reprogramming techniques, including the use of adenoviruses, Sendai viruses, and RNA-based methods, among others.
The paper emphasizes the complexity of the reprogramming process, which involves extensive epigenetic and transcriptional changes to revert somatic cells to a pluripotent state. It highlights the role of OSKM in chromatin remodeling and metabolic shifts during reprogramming. Additionally, the study addresses the variability in reprogramming efficiency influenced by immunological factors, donor characteristics, and technical variables. Utilizing a comprehensive dataset from the Barcelona Stem Cell Bank, the authors aim to statistically evaluate these factors to enhance the understanding of iPSC generation and improve protocols for better yield and genomic integrity. This research is positioned to refine strategies for iPSC derivation, ultimately contributing to advancements in regenerative medicine.
Methods
In this study, a total of 150 induced pluripotent stem cell (iPSC) lines were generated using various reprogramming technologies, including integrating and non-integrating methods. The primary source of reprogramming was human fibroblasts, which were treated using retroviral delivery of Yamanaka factors, nucleofection with episomal plasmids, Sendai virus transduction, and transfection with non-modified RNAs. The most prevalent method employed was Sendai virus, utilized for 56.7% of the lines, followed by episomal plasmids (33.3%). The collection included diverse cell types, with fibroblasts (52%) and peripheral blood mononuclear cells (PBMCs, 38%) being the most common. Notably, 77% of the iPSC lines were derived from patients with various diseases, while the remaining 23% were from healthy donors, serving as controls for disease modeling.
The workflow for generating and characterizing iPSCs involved several key steps. After the emergence of initial colonies, 10 to 14 single clones were manually selected and expanded, followed by a mycoplasma test. Selected clones underwent morphological assessment and further expansion, with karyotypic analyses performed on two transgene-free clones. Comprehensive characterization included immunocytochemistry for undifferentiated state markers, alkaline phosphatase staining, and differentiation assays via embryoid body formation, adhering to ISSCR guidelines. A second mycoplasma test was conducted prior to banking, and karyotype determination was repeated post-banking, ensuring the integrity and quality of the iPSC lines generated.
Results
In this section, the study investigates the influence of various parameters on the reprogramming efficiency of different cell types. The results indicate that CD34+ cells isolated from cord blood exhibit the highest mean reprogramming efficiency at 1.199% ± 0.529, significantly outperforming fibroblasts (0.040% ± 0.103), PBMCs (0.015% ± 0.013), and schwannoma cells (0.121% ± 0.158), with statistical significance confirmed (p < 0.0001). Notably, when analyzing age groups, the elderly exhibited a higher median reprogramming efficiency (0.019%) compared to adults (0.006%) and young individuals (0.009%), with a significant difference between the elderly and adult groups (p < 0.05). Methodological comparisons revealed that mRNA-based reprogramming technology yielded a mean efficiency of 0.221% ± 0.235, significantly higher than other methods such as episomal plasmids (0.017% ± 0.027) and retrovirus (0.030% ± 0.030) (p < 0.05). However, when considering all cell types, no significant differences were found among methodologies. Additionally, sex, passage number, and health status did not show significant effects on reprogramming efficiency, although healthy donor-derived lines had a slightly higher mean efficiency (0.066% ± 0.116) compared to those from disease donors (0.024% ± 0.071). Complementary analyses using generalized linear models corroborated these findings, reinforcing the robustness of the study's conclusions.
Discussion
In this study, the reprogramming efficiencies of 150 induced pluripotent stem cell (iPSC) lines were analyzed, focusing on various factors such as the type of starting somatic cell, reprogramming method, and donor characteristics. The results revealed that CD34+ cells exhibited significantly higher reprogramming efficiencies (1.199% ± 0.529) compared to fibroblasts (0.040% ± 0.103), PBMCs (0.015% ± 0.013), and schwannoma cells (0.121% ± 0.158). This enhanced efficiency in CD34+ cells is attributed to their progenitor nature, which facilitates the transition to pluripotency. Among the reprogramming methods, the Sendai virus-based approach using the CTS CytoTune™ -iPS 2.1 kit yielded the highest efficiency, although this was primarily influenced by the choice of cell type rather than the method itself. Notably, the mRNA-based reprogramming method demonstrated superior efficiency compared to episomal plasmid strategies when fibroblasts were the starting cell type.
The study also highlighted that reprogramming efficiency is influenced by donor-related factors, with higher efficiencies observed in cell lines derived from healthy donors compared to those from patients. Interestingly, contrary to the common belief that reprogramming efficiency declines with age, the data indicated higher efficiencies in elderly donors, suggesting a more complex relationship between age and cellular plasticity. Limitations of the study included an imbalance in the number of cell lines across groups, which may affect statistical power, and potential confounding effects due to the association between cell type and reprogramming method. Overall, the findings underscore the importance of intrinsic cellular characteristics and donor-specific factors in determining reprogramming efficiency, while also suggesting that non-integrating methods like Sendai virus and mRNA-based approaches are preferable for generating iPSCs in clinical applications.