DOI: https://doi.org/10.1038/s41597-025-04504-z
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39890826
تاريخ النشر: 2025-01-31
المؤلف: Peter Lasch وآخرون
الموضوع الرئيسي: تحديد البكتيريا واختبار الحساسية
نظرة عامة
تستعرض هذه القسم التقدمات في مطيافية الكتلة بالليزر المدعوم بالمصفوفة / التأين بالوقت (MALDI-ToF MS) كطريقة موثوقة لتوصيف وتحديد البكتيريا المسببة للأمراض، لا سيما في بيئات الميكروبيولوجيا السريرية. على الرغم من توفر قواعد بيانات طيفية شاملة للبكتيريا ذات الأهمية السريرية، لا يزال هناك فجوة في الموارد التي تتناول بشكل خاص البكتيريا شديدة pathogenic (HPB). لمعالجة ذلك، بدأ المؤلفون برنامجًا يركز على تطوير بروتوكولات لتعطيل الميكروبات متوافقة مع MALDI وتجميع طيف الكتلة لـ HPB.
نتيجة لهذه المبادرة، تم إنشاء قاعدة بيانات جديدة، أصبحت الآن متاحة للجمهور على منصات مثل ZENODO، والتي تشمل 11,055 طيفًا من 1,601 سلالة ميكروبية عبر 264 نوعًا. تهدف هذه القاعدة إلى تعزيز القدرات التشخيصية لـ HPB وتعتبر أيضًا موردًا محتملاً لتطوير خوارزميات التعلم الآلي لتحديد وتصنيف البكتيريا. توضح النشر أحدث إصدار من هذه القاعدة، مع التأكيد على أهميتها في تعزيز منهجيات التشخيص في الميكروبيولوجيا السريرية.
مقدمة
تناقش مقدمة هذه الورقة البحثية أهمية مطيافية الكتلة بالليزر المدعوم بالمصفوفة / التأين بالوقت (MALDI-ToF MS) في الميكروبيولوجيا السريرية، لا سيما لتحديد البكتيريا المسببة للأمراض بسرعة. يبدأ سير العمل في MALDI-ToF MS بنمو مستعمرات البكتيريا، تليها التطبيق المباشر لمادة المستعمرة على لوحة الهدف، والتي يتم تحليلها بعد ذلك للحصول على أطياف الكتلة. تعكس هذه الأطياف، التي تعكس بشكل أساسي بروتينات الوحدة الفرعية الريبوسومية الصغيرة، مقارنة مع قاعدة بيانات مرجعية موثقة لتحديد الكائنات الحية الدقيقة بناءً على بصمات الكتلة الفريدة. تؤكد الورقة على الدور الحاسم لقواعد البيانات الديناميكية للأطياف الكتلية في ضمان تحديد دقيق وفي الوقت المناسب، وهو أمر ضروري لعلاج المرضى بشكل فعال.
علاوة على ذلك، يبرز المؤلفون إنشاء برنامج شامل في معهد روبرت كوخ (RKI) يهدف إلى توصيف البكتيريا شديدة pathogenic ذات الصلة بالإرهاب البيولوجي (HPB) باستخدام MALDI-ToF MS. أدت هذه المبادرة إلى تطوير بروتوكول آمن لتعطيل HPB وتجميع قواعد بيانات طيفية تشمل سلالات وأنواع مختلفة. تفيد الورقة بتوسع هذه القواعد بشكل مستمر، والتي تم إتاحتها للجمهور لتعزيز دقة التشخيص ومعالجة قضايا التعرف الخاطئ في قواعد البيانات التجارية. يقدم المؤلفون الإصدار 4.2 من قاعدة بيانات RKI، والتي تتكون من 11,055 طيفًا للكتلة من 73 جنسًا بكتيريًا، تغطي 264 نوعًا و1,601 سلالة، بهدف تعزيز استخدام هذه الموارد في كل من التشخيصات السريرية والبحث الأكاديمي.
طرق
في هذا القسم، يصف المؤلفون المنهجية التي استخدمتها مجموعة RKI للحصول على أطياف الكتلة MALDI-ToF من العزلات البكتيرية، باستخدام الأطياف الميكروبية المتاحة في قاعدة بيانات ZENODO الطيفية. نظرًا للحجم الكبير من البيانات التي تم جمعها على مدى عقدين تقريبًا، فإن الوصف التفصيلي لزراعة العينات، وتحضير العينات، واكتساب البيانات لكل طيف غير عملي. بدلاً من ذلك، يوفر ملف PDF المرافق لمستودع طيف MALDI-ToF في ZENODO إدخالات بيانات وصفية للأطياف الفردية، بما في ذلك أوصاف تصنيفية ومعلمات مختارة تتعلق بتحضير العينات واكتساب البيانات.
يبدأ سير العمل النموذجي بزراعة عينات بكتيرية على وسائط أجار صلبة مناسبة للأنواع المحددة. تنمو الخلايا كثقافات نقية لمدة تمريرتين تحت ظروف هوائية، وبعد ذلك يتم حصادها بإضافة ما يعادل ثلاث حلقات بلاستيكية كاملة بحجم 1 ميكرولتر (حوالي 4 ملغ) إلى 20 ميكرولتر من الماء المعقم. يمكن الوصول إلى تفاصيل زراعة إضافية، مثل درجة الحرارة، والمدة، وتركيب الوسط، بالإضافة إلى بيانات وصفية أخرى ذات صلة، لكل سجل طيف كتلة MALDI-ToF على موقع ZENODO.
مناقشة
في هذا القسم، يوضح المؤلفون المنهجيات المستخدمة لتحضير عينات الميكروبات وقياسات مطيافية الكتلة MALDI-ToF في معهد روبرت كوخ (RKI). تم استخدام بروتوكول TFA لتحضير العينات، مما يضمن تعطيلًا كاملاً للبكتيريا، بما في ذلك الأبواغ، تليها التخفيف والخلط مع محلول مركز من حمض α-سيانو-4-هيدروكسي سيناميك (HCCA). تم الحصول على ملفات الأطياف الكتلية باستخدام مطياف الكتلة Bruker Daltonics autofleX I، مع إعدادات محددة لوقت استخراج الأيونات وجهد التسريع. تم إجراء المعايرة باستخدام معيار المعايرة البروتيني Bruker I أو سلالة المرجع Escherichia coli DSM 3871، مع التركيز على الحفاظ على جودة طيفية عالية من خلال تقنيات القياس اليدوية.
يؤكد المؤلفون على أهمية جودة البيانات وإمكانية إعادة الإنتاج في MALDI-ToF MS. قاموا بتنفيذ بروتوكول اختبار جودة صارم للأطياف الكتلية، حيث تم تقييم معلمات مثل عدد القمم، ونسبة الإشارة إلى الضوضاء، وشكل الخط الأساسي. أظهرت النتائج أن أكثر من 85% من الأطياف حققت درجة اختبار جودة فوق 45، مما يؤكد موثوقية قاعدة البيانات. بالإضافة إلى ذلك، يناقش المؤلفون دقة المعايرة والتحقق التصنيفي لإدخالات قاعدة البيانات، والتي تم التحقق منها بدقة باستخدام تقنيات توصيف مختلفة. تهدف مجموعة البيانات الناتجة، المتاحة من خلال مستودع ZENODO، إلى دعم مجتمع الميكروبيولوجيا السريرية وتسهيل التقدم في خوارزميات التعرف وتوصيف مسببات الأمراض.
DOI: https://doi.org/10.1038/s41597-025-04504-z
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39890826
Publication Date: 2025-01-31
Author(s): Peter Lasch et al.
Primary Topic: Bacterial Identification and Susceptibility Testing
Overview
The section outlines the advancements in Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry (MALDI-ToF MS) as a reliable method for characterizing and identifying pathogenic bacteria, particularly in clinical microbiology settings. Despite the availability of comprehensive spectra databases for clinically relevant bacteria, there remains a gap in resources specifically addressing highly pathogenic bacteria (HPB). To address this, the authors initiated a program focused on developing protocols for microbial inactivation compatible with MALDI and compiling mass spectra for HPB.
As a result of this initiative, a new database has been created, now publicly accessible on platforms like ZENODO, which includes 11,055 spectra from 1,601 microbial strains across 264 species. This database aims to enhance the diagnostic capabilities for HPB and is also positioned as a potential resource for the development of machine learning algorithms for bacterial identification and classification. The publication details the latest version of this database, emphasizing its significance in advancing diagnostic methodologies in clinical microbiology.
Introduction
The introduction of this research paper discusses the significance of matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-ToF MS) in clinical microbiology, particularly for the rapid identification of pathogenic bacteria. The MALDI-ToF MS workflow begins with the growth of bacterial colonies, followed by the direct application of colony material onto a target plate, which is then analyzed to obtain mass spectra. These spectra, primarily reflecting small ribosomal subunit proteins, are compared against a validated reference database to identify microorganisms based on unique mass fingerprints. The paper emphasizes the critical role of dynamic mass spectral databases in ensuring accurate and timely identification, which is essential for effective patient treatment.
Furthermore, the authors highlight the establishment of a comprehensive program at the Robert Koch Institute (RKI) aimed at characterizing bioterror-relevant highly pathogenic bacteria (HPB) using MALDI-ToF MS. This initiative has led to the development of a secure inactivation protocol for HPB and the compilation of spectral databases that include various strains and species. The paper reports on the continuous expansion of these databases, which have been made publicly available to enhance diagnostic accuracy and address issues of misidentification in commercial databases. The authors present version 4.2 of the RKI database, comprising 11,055 mass spectra from 73 bacterial genera, covering 264 species and 1,601 strains, with the goal of promoting the use of these resources in both clinical diagnostics and academic research.
Methods
In this section, the authors describe the methodology employed by the RKI group for acquiring MALDI-ToF mass spectra from bacterial isolates, utilizing the extensive microbial mass spectra available in the ZENODO spectral database. Due to the large volume of data collected over nearly two decades, detailed descriptions of cultivation, sample preparation, and data acquisition for each spectrum are impractical. Instead, a PDF file accompanying the ZENODO MALDI-ToF spectrum repository provides metadata entries for individual spectra, including taxonomic descriptors and selected parameters related to sample preparation and data acquisition.
The typical workflow begins with the cultivation of bacterial samples on solid agar media suitable for the specific species. Cells are grown as pure cultures for two passages under aerobic conditions, after which they are harvested by adding the equivalent of three full 1 µL plastic loops (approximately 4 mg) to 20 µL of sterile water. Additional cultivation details, such as temperature, duration, and medium composition, along with other relevant metadata, can be accessed for each MALDI-ToF mass spectrum record on the ZENODO website.
Discussion
In this section, the authors detail the methodologies employed for microbial sample preparation and MALDI-ToF mass spectrometry (MS) measurements at the Robert Koch Institute (RKI). The TFA protocol was utilized for sample preparation, ensuring complete inactivation of bacteria, including endospores, followed by dilution and mixing with a concentrated α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (HCCA) solution. The mass spectral profiles were acquired using a Bruker Daltonics autofleX I mass spectrometer, with specific settings for ion extraction time and acceleration voltage. Calibration was performed using Bruker’s Protein Calibration Standard I or the Escherichia coli DSM 3871 reference strain, with a focus on maintaining high spectral quality through manual measurement techniques.
The authors emphasize the importance of data quality and reproducibility in MALDI-ToF MS. They implemented a rigorous quality testing protocol for the mass spectra, assessing parameters such as peak count, signal-to-noise ratio, and baseline shape. The results indicated that over 85% of the spectra achieved a quality test score above 45, affirming the reliability of the database. Additionally, the authors discuss the calibration accuracy and taxonomic validation of the database entries, which were meticulously verified using various characterization techniques. The resulting dataset, available through the ZENODO repository, aims to support the clinical microbiology community and facilitate advancements in identification algorithms and pathogen characterization.