الكلمات الرئيسية: نظام CRISPR، تحرير الجينوم، علاج السرطان، الطفرات الجينية، نمو الورم، الاستجابة المناعية، الدراسات ما قبل السريرية، التجارب السريرية، السلامة، التوصيل، التأثيرات غير المستهدفة، الجزيئات القاتلة للسرطان

نادي الباحثين الشباب والنخبة، فرع نجف آباد، جامعة آزاد الإسلامية، نجف آباد، إيران
قسم البيولوجيا، معهد نوردانش للتعليم العالي، ميمه، أصفهان، إيران

إن استخدام CRISPR (التكرارات المتناظرة القصيرة المتباعدة بانتظام) في علاج السرطان لديه القدرة على إحداث ثورة في طريقة علاج الأمراض المختلفة [1]. تتيح تقنية CRISPR التلاعب الدقيق والفعال للجينوم، وتطبيقها في أبحاث السرطان لديه القدرة على استهداف الطفرات الجينية المحددة التي تدفع نمو وانتشار الأورام [2]. في السنوات الأخيرة، كان هناك تزايد في الأبحاث التي تستكشف استخدام تحرير الجينات المعتمد على CRISPR في علاج السرطان، مع العديد من الدراسات ما قبل السريرية والتجارب السريرية التي تظهر نتائج واعدة [3]. كانت اكتشاف تقنية CRISPR في عام 2012 علامة فارقة مهمة في
مجال تحرير الجينوم [4]. توضح الشكل 1 تطور أدوات CRISPR المستخدمة لاستكشاف بيولوجيا السرطان. يمكن برمجة الإنزيمات المرتبطة بـ CRISPR، مثل Cas9، لاستهداف تسلسلات DNA محددة، وعند دمجها مع RNAs الموجهة، يمكن استخدامها لقص أو تعديل أو حذف الجينات بطريقة دقيقة [4]. لقد تم استخدام هذه التقنية في مجموعة واسعة من التطبيقات، بما في ذلك الأبحاث الأساسية، وعلاج الجينات، والزراعة [1]. ومع ذلك، فإن تطبيقها المحتمل في أبحاث السرطان قد جذب اهتمامًا خاصًا بسبب القدرة على استهداف الطفرات الجينية التي تدفع نمو وانتشار الأورام [3]. هناك العديد من الاستراتيجيات المعتمدة على CRISPR التي تم اقتراحها لعلاج السرطان [4]. إحدى الطرق هي

لإلغاء تنشيط الجينات التي تحفز نمو الأورام. على سبيل المثال، تم اقتراح استخدام تقنية كريسبر لإلغاء تنشيط الجين المسرطن MYC كوسيلة لإيقاف نمو الورم. من المعروف أن جين MYC نشط بشكل مفرط في العديد من أنواع السرطان، وقد يؤدي إلغاء تنشيطه إلى إبطاء أو إيقاف تقدم المرض [5]. نهج آخر هو تعزيز الاستجابة المناعية تجاه خلايا السرطان. على سبيل المثال، استخدم الباحثون تحرير الجينات المعتمد على كريسبر لإلغاء أو تقليل تعبير بروتين PD-1 على خلايا T، مما يساعد على تحسين قدرتها على استهداف وقتل خلايا السرطان [6]. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام تحرير الجينات المعتمد على كريسبر لإصلاح الطفرات الجينية التي تسبب السرطان، مثل حالة الأشكال الوراثية للسرطان الناتجة عن طفرات BRCA1 وBRCA2 [7]. على سبيل المثال، أظهرت الدراسات أن كريسبر-كاس9 يمكن أن يُستخدم لتصحيح طفرات BRCA1 في خلايا بشرية، مما يُظهر الإمكانية لهذه التقنية في علاج السرطان [8]. علاوة على ذلك، يمكن أيضًا استخدام تحرير الجينات المعتمد على كريسبر في استراتيجيات العلاج المناعي لعلاج السرطان. على سبيل المثال، يمكن هندسة خلايا T باستخدام كريسبر للتعبير عن مستقبلات تستهدف خلايا الورم بشكل محدد، مما يعزز الاستجابة المناعية للجسم ضد السرطان [9]. تم إجراء دراسات قبل السريرية وتجارب سريرية باستخدام هذه الاستراتيجيات، وقد أظهرت نتائج واعدة [3]. على سبيل المثال، أظهر إلغاء تنشيط الجين المسرطن MYC في نماذج حيوانية من اللمفوما أنه يقلل من نمو الورم. وبالمثل، أظهر زيادة تعبير PD-1 على خلايا T أنه يعزز قدرة هذه الخلايا على استهداف وقتل خلايا السرطان في نماذج حيوانية [1]. ومع ذلك، على الرغم من النتائج الواعدة التي تم الحصول عليها في الدراسات قبل السريرية، لا تزال هناك العديد من التحديات التي يجب التغلب عليها لكي تصبح تقنية كريسبر لعلاج السرطان خيارًا سريريًا قابلاً للتطبيق [4]. واحدة من التحديات الرئيسية هي خطر الآثار الجانبية غير المحددة، والتي يمكن أن تحدث عندما تستهدف إنزيمات كريسبر مناطق غير مقصودة من الجينوم. السلامة والتوصيل هما أيضًا تحديات حاسمة تحتاج إلى معالجة [10].
في هذه المقالة الاستعراضية، سنقدم لمحة عامة عن الحالة الحالية لمجال تحرير الجينات المعتمد على كريسبر في علاج السرطان، مع تسليط الضوء على النتائج الأكثر وعدًا والتحديات التي لا تزال بحاجة إلى التغلب عليها. سنصف الاستراتيجيات المختلفة المعتمدة على كريسبر التي تم اقتراحها لعلاج السرطان، ونلخص الحالة الحالية للدراسات قبل السريرية والتجارب السريرية، ونناقش التحديات والقيود التي يجب التغلب عليها لكي تصبح تقنية كريسبر لعلاج السرطان خيارًا سريريًا قابلاً للتطبيق. سنقدم أيضًا لمحة عامة عن الاتجاهات المستقبلية للبحث والتطوير ونناقش الآثار المحتملة لتقنية كريسبر لعلاج السرطان على مستقبل علاج السرطان والرعاية الصحية.

تتمتع تقنية تحرير الجينات المعتمدة على كريسبر بإمكانية إحداث ثورة في طريقة علاج السرطان من خلال السماح بالتلاعب الدقيق والفعال للجينوم لاستهداف طفرات جينية محددة تحفز نمو وانتشار الأورام [12]. يبرز الشكل 2 عملية فحص كريسبر خطوة بخطوة، بدءًا من تحديد أهداف الجينات المحددة. بعد ذلك، يوضح تصميم وبناء مكتبات RNA الدليل لكريسبر، الضرورية لاستهداف الجينوم بدقة. بعد ذلك، يتم تصوير توصيل مكونات كريسبر إلى الخلايا المستهدفة، مما يوضح الطرق المستخدمة في تحرير الجينات في مجموعة واسعة من أنواع الخلايا. المرحلة التالية توضح تطبيق الضغوط الانتقائية لتحديد الخلايا ذات التغيرات الجينية المرغوبة، وفي النهاية، تقييم نتائج الفحص. يوضح الشكل 3 الآليات المختلفة لتحرير الجينات. تم اقتراح عدة استراتيجيات مختلفة تعتمد على كريسبر لعلاج السرطان، كل منها له مزاياه وقيوده الخاصة [13]. يوضح الجدول 1 عدة استراتيجيات تعتمد على كريسبر لعلاج السرطان.

تبدأ آلية استراتيجيات كريسبر في إلغاء تنشيط الجينات المسرطنة بتحديد الجينات المسرطنة المحددة التي تلعب أدوارًا حاسمة في تطور السرطان [19]. غالبًا ما ترتبط الجينات المسرطنة بطفرات أو تضخيمات جينية غير طبيعية تؤدي إلى الإفراط في التعبير عن بروتيناتها المعنية، مما يؤدي إلى نمو الخلايا وتكاثرها بشكل غير منضبط [20]. بمجرد تحديد الجين المسرطن المستهدف، يقوم الباحثون بتصميم RNA الدليل الذي يتعرف ويرتبط بشكل محدد بالمنطقة المتحورة أو المضخمة من الجين المسرطن [19]. إحدى الطرق هي إلغاء تنشيط الجينات التي تحفز نمو الورم. على سبيل المثال، أظهر إلغاء تنشيط الجين المسرطن MYC أنه يقلل من نمو الورم في نماذج حيوانية من اللمفوما [21]. تستند هذه الاستراتيجية إلى المبدأ القائل بأن خلايا السرطان تحتوي على طفرات جينية تؤدي إلى الإفراط في التعبير عن الجينات المسرطنة، مما يعزز نمو الخلايا وتكاثرها. يمكن أن يؤدي إلغاء تنشيط هذه الجينات المسرطنة إلى إيقاف نمو خلايا السرطان [22]. يمكن دمج الأساليب المعتمدة على كريسبر بسلاسة مع علاجات السرطان الأخرى لتعظيم الفعالية وتحسين نتائج العلاج [23]. على سبيل المثال، يسمح دمج كريسبر مع العلاج الكيميائي بتحرير دقيق للجينات المعنية بمقاومة الأدوية، مما يجعل خلايا السرطان أكثر حساسية للعوامل الكيميائية [24]. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام كريسبر لهندسة خلايا المناعة المأخوذة من المرضى، مثل خلايا T، للتعبير عن CARs التي تعزز قدراتها في استهداف الأورام بالتزامن مع علاج CAR-T [22]. علاوة على ذلك، من خلال تعطيل جينات نقاط التفتيش المناعية في خلايا السرطان، يعزز كريسبر فعالية

العلاجات المناعية مثل مثبطات نقاط التفتيش المناعية [25]. مثال آخر هو دمج كريسبر مع العلاجات المستهدفة، حيث يمكن أن يتغلب استهداف مسارات حيوية متعددة باستخدام تحرير الجينات على المقاومة ويعزز تأثيرات الأدوية المستهدفة [26]. من خلال استخدام كريسبر لتعزيز توصيل الأدوية، يمكن للباحثين تعديل خلايا الورم أو البيئة الدقيقة للورم لتحسين اختراق العلاجات، مما يعزز تأثيرات مختلف علاجات السرطان. توضح هذه الأمثلة مرونة كريسبر في التآزر مع علاجات السرطان الأخرى.
تمهيد الطريق لأساليب علاجية أكثر فعالية وتخصيصًا في مكافحة السرطان [27].

تدور الآلية حول استغلال إمكانيات نظام CRISPR-Cas، وهو آلية دفاع طبيعية موجودة في البكتيريا والعتائق، والتي تم تكييفها لتحرير الجينات المستهدف في كائنات حية مختلفة [28]. لتعزيز الاستجابة المناعية، يستخدم العلماء CRISPR-Cas لتحرير جينات معينة تشارك في تنظيم الاستجابة المناعية ومساراتها [29]. تحرير الجينات

يمكن استخدامها لتعطيل الجينات التي تنظم سلبًا الجهاز المناعي، مما يعزز نشاطه [28]. بالإضافة إلى ذلك، تمكّن تقنيات CRISPR من الإدخال الدقيق لجينات مفيدة، مثل السيتوكينات أو وسطاء المناعة الآخرين، لتعزيز الاستجابة المناعية ضد مستضدات معينة [23]. علاوة على ذلك، يمكن استخدام CRISPR-Cas لتصميم خلايا مناعية مثل خلايا T وخلايا NK، مما يحسن من وظيفتها وخصوصيتها تجاه خلايا السرطان أو الأهداف المصابة [30]. علاوة على ذلك، يمكّن CRISPR-Cas تطوير لقاحات جينية، حيث يتم توصيل جينات ترميز مستضدات معينة إلى خلايا المضيف لإثارة استجابة مناعية قوية وموجهة. تحمل هذه الاختراقات في تعزيز المناعة المعتمدة على CRISPR وعدًا كبيرًا في مكافحة الأمراض المعدية والسرطان وغيرها من الحالات التي يكون فيها تعزيز الجهاز المناعي أمرًا حاسمًا للعلاج الفعال [31]. استخدم الباحثون تحرير الجينات المعتمد على CRISPR لزيادة تعبير بروتين PD-1 على خلايا T، مما يساعد على تحسين قدرتها على استهداف وقتل خلايا السرطان [32]. يعزز CRISPRCas الاستجابة المناعية من خلال تمكين تحرير الجينات بدقة [33]. يمكن للعلماء استهداف جينات معينة تشارك في تنظيم الاستجابة المناعية ومساراتها. من خلال تعطيل الجينات التي تنظم سلبًا الجهاز المناعي، يزيد CRISPR-Cas من النشاط العام
لنظام المناعة [23]. بالإضافة إلى ذلك، يمكن إدخال جينات مفيدة، مثل السيتوكينات أو وسطاء المناعة الآخرين، باستخدام CRISPR-Cas لتعزيز الاستجابة المناعية ضد مستضدات معينة [34]. يمكن أن يؤدي تحرير الجينات المعتمد على CRISPR أحيانًا إلى آثار غير محددة في المواقع، حيث تحدث تغييرات غير مقصودة في أجزاء أخرى من الجينوم. قد تؤدي هذه الآثار غير الانتقائية إلى تغييرات غير مرغوب فيها في وظيفة الجين وقد تشكل مخاوف تتعلق بالسلامة في سياق تعزيز المناعة [35، 36]. من الضروري تقييم هذه الآثار غير المرغوب فيها بدقة وتقليلها لضمان سلامة وفعالية استراتيجيات CRISPR المعتمدة [28]. يمكن استخدام CRISPR-Cas لتعديل خلايا المناعة، مثل خلايا T وخلايا NK، لتحسين وظيفتها وخصوصيتها في استهداف خلايا السرطان أو الخلايا المصابة. من خلال تحرير الجينات المسؤولة عن مستقبلات الخلايا ومسارات الإشارة، يمكن للباحثين تعزيز قدرة خلايا المناعة على التعرف على الأهداف المحددة وتدميرها [33]. فهم الآليات وتحسين البروتوكولات لهذه العملية في تحرير الجينات أمر حاسم لتطوير علاجات ناجحة تعتمد على خلايا المناعة [28]. بينما تظهر استراتيجيات CRISPR المعتمدة وعدًا كبيرًا في تعزيز الاستجابة المناعية، من الضروري التحقيق في آثارها طويلة المدى على جهاز المناعة لدى المضيف [30].

يمكن أن تؤدي المسارات إلى عدم تنظيم الجهاز المناعي، أو المناعة الذاتية، أو استنفاد المناعة [37]. فهم تأثير تعزيز المناعة المعتمد على كريسبر على الوظيفة المناعية العامة والتوازن أمر بالغ الأهمية للتطبيقات السريرية الآمنة والمستدامة. ستكون الدراسات طويلة الأمد في نماذج حيوانية والتجارب السريرية ضرورية لمعالجة هذه المخاوف [23]. توضح الشكل 4 تطبيقات متنوعة لتقنية كريسبر في أبحاث السرطان.

يمكن أيضًا استخدام تعديل الجينات المعتمد على كريسبر لإصلاح الطفرات الجينية التي تسبب السرطان، مثل حالة الأشكال الوراثية للسرطان الناتجة عن طفرات BRCA1 وBRCA2 [37]. نظام كريسبر-كاس9 محدد للغاية في استهداف الطفرات الجينية بسبب قدرة RNA الموجه على التعرف والارتباط بتسلسل DNA معين [38]. ومع ذلك، يمكن أن تحدث آثار غير مرغوب فيها، حيث قد يقوم إنزيم كاس9 بشكل غير مقصود بقطع تسلسلات مشابهة في أماكن أخرى من الجينوم [39]. التحسينات المستمرة في المعلوماتية الحيوية والتقنيات التجريبية تعمل على تحسين الدقة وتقليل الآثار غير الانتقائية، مما يجعل من الضروري تقييم دقة النظام في إصلاح الطفرات الجينية [37]. تقييم الكفاءة والدقة
لطرق الإصلاح المعتمدة على كريسبر، مثل HDR وNHEJ، أمر حيوي. يمكن أن يقدم HDR التغييرات الجينية المرغوبة بدقة من خلال استخدام قالب مانح، ولكن كفاءته غالبًا ما تكون أقل مقارنة بـ NHEJ، الذي يمكن أن يؤدي إلى إدخالات أو حذف دون قالب [40]. سيساعد فهم التوازن بين الكفاءة والدقة في تحسين اختيار آلية الإصلاح للطفرات الجينية المحددة [41]. بينما أظهر كريسبر وعدًا كبيرًا، قد تكون هناك عواقب غير متوقعة من التلاعب بالجينيوم. قد تشمل هذه الطفرات غير الانتقائية أو إعادة ترتيب الجينوم على نطاق واسع، مما قد يقدم شذوذات جينية جديدة أو يسبب آثارًا غير مقصودة على تنظيم الجينات [42]. التقييم الدقيق والتقييم الشامل للنتائج غير المقصودة المحتملة أمر ضروري لضمان سلامة وموثوقية استراتيجيات كريسبر المعتمدة [37]. فهم استقرار الإصلاحات الجينية الناتجة عن كريسبر أمر حاسم لتقييم الجدوى طويلة الأمد للعلاجات المحتملة [40]. يجب أن تكون التعديلات الجينية مستقرة وتنتقل بدقة خلال انقسامات الخلايا لتوفير فوائد علاجية دائمة. سيوفر التحقيق في وراثة واستقرار الطفرات الجينية المصلحة الضوء على طول العمر وفعالية استراتيجيات كريسبر المعتمدة [41]. عند استخدام كريسبر-كاس9 للتطبيقات الحية، من الضروري تقييم الاستجابات المناعية المحتملة.

بروتين كاس9 وRNA الموجه [37]. قد يتعرف الجهاز المناعي على هذه المكونات ككيانات غريبة، مما يؤدي إلى ردود فعل مناعية غير مرغوب فيها أو تطهير خلايا معدلة بواسطة كريسبر. سيساعد فهم المناعية لمكونات كريسبر في تطوير استراتيجيات لتقليل الاستجابات المناعية وتعزيز سلامة ونجاح العلاجات الجينية [41].

لقد أحدثت الاستراتيجيات المعتمدة على كريسبر ثورة في علاج السرطان من خلال تمكين التوصيل الدقيق للجزيئات القاتلة للسرطان إلى الخلايا المستهدفة [43]. الآلية وراء هذا النهج المبتكر تتضمن استخدام نظام كريسبر-كاس، وهو أداة قوية لتعديل الجينات، لتحديد وتدمير الخلايا السرطانية بفعالية مع الحفاظ على الخلايا السليمة [44]. أولاً، يقوم الباحثون بتصميم جزيئات RNA الموجهة التي تستهدف وتربط بشكل محدد بـ DNA خلايا السرطان، مما يعمل كأجهزة توجيه جزيئية. ثانيًا، يتم تحميل هذه الـ RNA الموجهة على مركب بروتين مرتبط بكريسبر (كاس)، مما يشكل مركب ريبونوكليوبروتين (RNP) المرتبط بكريسبر-كاس. يمكن اعتبار هذا المركب RNP كنظام توصيل للجزيئات القاتلة للسرطان، وهو جزء حيوي من العلاج الجيني للسرطان المعتمد على كريسبر/كاس9، حيث يتم الاستفادة من تقنية تعديل الجينات لعلاج السرطان من خلال تعديل المادة الجينية داخل خلايا السرطان [45]. ثالثًا، يتم إدخال المركب RNP، جنبًا إلى جنب مع الجزيئات القاتلة للسرطان، إلى جسم المريض، إما من خلال الحقن المباشر أو كجزء من خلايا مناعية معدلة، مثل خلايا T. تم استكشاف أنظمة توصيل متنوعة، مثل أنظمة التوصيل المعتمدة على تكنولوجيا النانو، لضمان التوصيل الفعال لنظام كريسبر-كاس والجزيئات القاتلة للسرطان إلى الخلايا المستهدفة [46]. رابعًا، بمجرد دخولها إلى خلايا السرطان، يقوم مركب RNP المرتبط بكريسبر-كاس بقطع وتعطيل الجينات المسرطنة المسؤولة عن الخباثة، بينما تبدأ الجزيئات القاتلة للسرطان في تحفيز الموت الخلوي (موت الخلايا) أو تجعل خلايا السرطان عرضة لاستجابة الجهاز المناعي للجسم [47]. الهدف النهائي هو تحسين توصيل وتطبيق نظام كريسبر-كاس للعلاج السرطاني السريري، متجاوزًا التحديات المرتبطة بالتوصيل الحي، لضمان سلامة وفعالية هذا النهج العلاجي [48]. أخيرًا، يحدث التدمير المستهدف لخلايا السرطان، مما يؤدي إلى تراجع الورم مع تقليل الضرر على الأنسجة السليمة. تحمل هذه الآلية الرائدة وعدًا هائلًا في تطوير علاجات سرطانية محددة وفعالة للغاية، مما قد يحدث ثورة في مشهد علاجات الأورام في المستقبل [49]. تم تصميم جزيئات RNA الموجهة لتكون لها تسلسلات مكملة ترتبط بشكل محدد بـ DNA خلايا السرطان. يتم تحقيق هذه الدقة من خلال تحديد علامات جينية أو طفرات فريدة موجودة في خلايا السرطان ولكن ليست في الخلايا السليمة. من خلال استهداف هذه التسلسلات المحددة،
يمكن أن تميز جزيئات RNA الدليل بشكل فعال بين الخلايا السرطانية والخلايا السليمة [50]. يعمل مركب Cas كحامل لجزيئات RNA الدليل. يشكل مركبًا مع RNA الدليل، مما ينشئ مركب CRISPR-Cas RNP [51]. يوفر بروتين Cas الآلات اللازمة للتعرف على RNA الدليل ويسهل ارتباطه بالحمض النووي المستهدف داخل الخلايا السرطانية. يعمل هذا المركب كقاطع جزيئي قوي، حيث يقطع ويعطل الجينات المسرطنة المسؤولة عن نمو السرطان [50]. يمكن إدخال مركب CRISPR-Cas RNP إلى جسم المريض من خلال طرق مختلفة. تتضمن إحدى الطرق الحقن المباشر في الأنسجة المستهدفة أو موقع الورم [49]. تتضمن طريقة أخرى هندسة خلايا المناعة، مثل خلايا T، للتعبير عن مركب CRISPR-Cas RNP. يمكن بعد ذلك إعادة إدخال هذه الخلايا المناعية المهندسة إلى مجرى دم المريض، حيث يمكنها استهداف الخلايا السرطانية ومهاجمتها بشكل محدد [51]. بمجرد دخولها إلى الخلايا السرطانية، يقوم مركب CRISPR-Cas RNP بتحديد تسلسلات الحمض النووي المستهدفة ويقطعها بدقة، مما يعطل الجينات المسرطنة المسؤولة عن الخباثة. يؤدي هذا التعطيل إلى إما بدء عملية الموت الخلوي (الموت الخلوي) في الخلايا السرطانية أو يجعلها أكثر عرضة للاستجابة المناعية للجسم، مما يؤدي إلى تدميرها [49]. تم تصميم جزيئات RNA الدليل لاستهداف الخلايا السرطانية بشكل محدد من خلال الارتباط بعلامات جينية فريدة أو طفرات موجودة في تلك الخلايا. من خلال استهداف الخلايا السرطانية بشكل انتقائي، ينجح مركب CRISPR-Cas RNP في تجنيب الخلايا السليمة من الضرر، مما يقلل من الآثار الجانبية المحتملة [52]. بالإضافة إلى ذلك، يسمح استخدام خلايا المناعة المهندسة بمزيد من التحديد في استهداف الخلايا السرطانية، مما يقلل من التأثير على الأنسجة السليمة [52، 53].

على الرغم من وجود تقدم كبير في تقنية تحرير الجينات CRISPR، مع وجود أكثر من 800 برنامج لعلاج الخلايا والجينات، إلا أن عددًا محدودًا فقط من أدوات CRISPR قد تقدمت بنجاح إلى ما بعد التجارب ما قبل السريرية [51]. تم استكشاف طرق تحرير الجينات الأخرى، مثل TALENs و ZFNs، بشكل مكثف في البيئات السريرية وتمت مراجعتها في أماكن أخرى. توضح الشكل 5 استراتيجيات مختلفة لتحرير الخلايا باستخدام تقنية CRISPR في المرضى. إن تطوير علاج السرطان القائم على CRISPR هو مجال يتطور بسرعة ينتقل من الدراسات ما قبل السريرية إلى التجارب السريرية [54]. تعتبر الدراسات ما قبل السريرية ضرورية لتقييم سلامة وفعالية علاج السرطان القائم على CRISPR قبل أن يمكن اختباره على البشر [55]. التجارب السريرية هي الخطوة النهائية في عملية التطوير وتستخدم لتحديد سلامة وفعالية العلاج لدى البشر.

تعتبر الدراسات ما قبل السريرية خطوة حاسمة في تطوير أي علاج جديد للسرطان، بما في ذلك تلك القائمة على تقنية CRISPR [56]. يتم إجراء العديد من الدراسات على الحيوانات المختبرية، مثل الفئران والجرذان، وتستخدم لتقييم السلامة والفعالية والآثار الجانبية المحتملة لعلاج جديد. يوضح الشكل 6 تطبيق CRISPR في نمذجة السرطان للخلايا والفئران. قدم مارتينيز لاج وآخرون نهجًا ما قبل سريري ذكي يستهدف اندماجات الجينات المسرطنة، مستهدفًا كل من انتقائية خلايا الورم وتعطيل آفة جينية تعزز الورم. استفادت هذه الاستراتيجية من الخصائص الفريدة للاندماج وأظهرت فعالية محتملة [57]. مثال آخر ما قبل سريري قدمه قاو وآخرون ركز على استغلال عامل النسخ NF-кB، الذي يتم تنشيطه بشكل انتقائي في الخلايا السرطانية، لدفع نسخ مكونات CRISPR-Cas13a. أدى ذلك إلى كتم الجينات المسرطنة المقيدة للخلايا السرطانية، مما يوفر طريقًا واعدًا لعلاج السرطان [58]. يقدم الجدول 2 ملخصًا للدراسات ما قبل السريرية التي تستكشف إمكانيات علاج السرطان القائم على CRISPR عبر أنواع خلايا مختلفة.
P53 هو بروتين مثبط للورم حاسم مسؤول عن تنظيم تقدم دورة الخلية ومنع تكوين خلايا سرطانية [94]. في سياق تحرير الجينوم باستخدام CRISPR/Cas9، تصبح نشاط P53 مصدر قلق حاسم حيث أن استخدام هذه التقنية قد يؤدي إلى آثار جانبية غير مستهدفة، مما يسبب ضررًا غير مقصود للحمض النووي [95]. لذلك، من الضروري تقييم
أثر CRISPR/Cas9 على تعبير ووظيفة P53 لضمان سلامة وفعالية عملية التحرير [96]. يلعب P53 دورًا حاسمًا في مراقبة سلامة الحمض النووي للخلايا وتحفيز توقف دورة الخلية أو الموت الخلوي في حالة حدوث ضرر للحمض النووي [97]. للأسف، P53 عرضة للطفرات، مما يؤدي إلى تعطيله أو عدم وظيفته. هذه الطفرات شائعة في العديد من أنواع السرطان، بما في ذلك سرطان الرئة، وتساهم في نمو الخلايا غير المنضبط وتطور الورم [98]. يمكن أن يؤدي تعديل جين P53 إلى استعادة وظيفته، مما يؤدي إلى كبح نمو الخلايا السرطانية [94]. عندما يتم تنشيط جين P53 المعدل، فإنه يعزز إنتاج بروتين P21، وهو مثبط ورم معروف ينظم دورة الخلية. يؤدي زيادة تعبير P21 إلى توقف دورة الخلية، مما يمنع الخلايا السرطانية من التكاثر بشكل غير منضبط [96]. علاوة على ذلك، فإن تنشيط P21 يجعل الخلايا السرطانية أكثر عرضة للعلاج الكيميائي، حيث أن الخلايا التي تحتوي على بروتينات P21 نشطة تكون أكثر عرضة للموت الخلوي عند تعرضها لأدوية العلاج الكيميائي. يُعرف P21 أيضًا باسم مثبط كيناز المعتمد على السايلين 1A (CDKN1A)، وهو مثبط كيناز معتمد على السايلين يلعب دورًا محوريًا في تنظيم دورة الخلية وتعزيز توقف دورة الخلية. في سياق تحرير الجينوم باستخدام CRISPR/Cas9، قد يعمل P21 كسلاح ذو حدين [99]. من ناحية، قد يؤدي ارتفاع مستوياته استجابةً لضرر الحمض النووي الناجم عن CRISPR/Cas9 إلى توقف دورة الخلية، مما يمنع الخلايا من التكاثر وقد يهدد فعالية

عملية التحرير [100]. من ناحية أخرى، يمكن أن يعزز P21 إصلاح الحمض النووي، مما قد يكون مفيدًا لإصلاح آثار المواقع غير المحددة [101]. لذلك، فإن فهم التفاعل بين P21 وCRISPR/Cas9 أمر ضروري لتحسين نتائج التحرير [100]. يلعب بروتين P21 دورًا حاسمًا في التحكم في دورة الخلية من خلال تثبيط CDKs، التي تعتبر ضرورية لانقسام الخلايا. من خلال تثبيط CDKs، يوقف P21 تقدم دورة الخلية، مما يؤدي إلى توقف دورة الخلية. هذه الوقفة في انقسام الخلايا تمنح الخلية الوقت لإصلاح تلف الحمض النووي قبل الاستمرار في تكرار الخلايا [94]. وبالتالي، عندما يتم تنشيط P21، تصبح خلايا السرطان غير قادرة على النمو والانقسام بسرعة، مما يقلل من نمو الورم وتقدمه [97]. خلايا السرطان التي تحتوي على بروتينات P21 نشطة تكون أكثر استجابة للعلاج الكيميائي بسبب زيادة قابليتها للاستماتة [100]. تستهدف أدوية العلاج الكيميائي الخلايا التي تنقسم بسرعة، ومن خلال إيقاف دورة الخلية من خلال تنشيط P21، تصبح خلايا السرطان أكثر عرضة للتأثيرات السامة لهذه الأدوية [99]. بالإضافة إلى ذلك، قد يسهل تنشيط P21 أيضًا آليات إصلاح الحمض النووي، مما يعزز قدرة الخلية على اكتشاف وإصلاح تلف الحمض النووي الناتج عن العلاج الكيميائي، وبالتالي تقليل فرصة مقاومة الأدوية. عدم تنظيم P53 أو P21 في

يمكن أن يؤدي تحرير الجينوم باستخدام CRISPR/Cas9 إلى عدة نتائج [101]. قد يؤدي التنشيط المفرط لبروتين P53 إلى تحفيز مسارات موت الخلايا، مما يؤدي إلى زيادة السمية والآثار السلبية [100]. من ناحية أخرى، قد يؤدي ضعف نشاط P53 إلى تعزيز بقاء الخلايا التي تحتوي على طفرات غير مقصودة، مما قد يؤدي إلى تكوين الأورام [97]. وبالمثل، يمكن أن يؤثر التعبير المتغير لبروتين P21 على كفاءة التحرير، وحيوية الخلايا، والآثار الجانبية غير المرغوب فيها المحتملة [100]. إن تقييم عواقب اختلال تنظيم P53 وP21 أمر حيوي لفهم سلامة وموثوقية العلاجات المعتمدة على CRISPR/Cas9 [99]. لتقليل المضاعفات المتعلقة بـ P53 وP21 أثناء تحرير الجينوم باستخدام CRISPR/Cas9، فإن تحسين طرق توصيل مكونات CRISPR/Cas9 أمر بالغ الأهمية [100]. يمكن للباحثين استكشاف استخدام أنظمة توصيل متقدمة، مثل الحوامل المعتمدة على الجسيمات النانوية أو الناقلات الفيروسية، لتحسين كفاءة واستهداف الدقة [97]. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يقلل استخدام المحفزات الخاصة بنوع الخلايا لتعبير Cas9 من الآثار الجانبية غير المستهدفة ويحد من التأثيرات المحتملة على مستويات تعبير P53 وP21 [94]. علاوة على ذلك، يمكن أن يساعد الفحص المسبق لمواقع الهدف المحتملة والتحقق الدقيق من تسلسلات RNA الموجهة في اختيار الأهداف الأكثر فعالية ودقة.

تقليل الآثار غير المقصودة على مسارات P53 و P21 [100]. ركز هارتمان وآخرون (2021) على تنفيذ تحرير الجينوم باستخدام CRISPR/Cas9 لإنشاء نماذج سرطان الرئة الفأري التي تمثل بدقة المشهد الطفري للمرض البشري. لا يزال سرطان الرئة قضية صحية عالمية هامة بمعدلات بقاء منخفضة، مما يبرز الحاجة إلى علاجات مبتكرة. كان هدف الباحثين هو تطوير نماذج بديلة تحاكي الطفرات الجسدية التي لوحظت في مرضى سرطان الرئة، حيث تؤثر هذه الطفرات بشكل كبير على استجابات العلاج. من خلال استخدام تحرير الجينوم بواسطة CRISPR، استهدفت الفريق بنجاح جينات Trp53 و KRas، مما أعاد إنشاء نموذج سرطان الرئة الفأري غير صغير الخلايا (NSCLC) الكلاسيكي Trp53fl/fl:lslKRasG12D/wt. أظهرت الأورام الناتجة مورفولوجيا مشابهة، وتعبير عن العلامات، وملفات نسخ مقارنة بالأورام المشتقة من نموذج Trp53fl/fl:lsl-KRasG12D/wt. أظهرت الدراسة قابلية تطبيق CRISPR/Cas9 لنمذجة الأورام في الجسم الحي، مما يوفر بديلاً لنماذج الفئران المعدلة وراثيًا التقليدية. من المثير للاهتمام أن بدء الورم تحقق ليس فقط من خلال التعبير المستمر عن Cas9 ولكن أيضًا عن طريق إصابة خلايا الظهارة الرئوية للحيوانات من النوع البري بفيروسات مرتبطة بالأدينوس (AAVs) مختلفة تشفر مكونات مختلفة من آلية CRISPR. سهلت هذه الطريقة العملية من خلال القضاء على الحاجة إلى تربية مكثفة لإدخال ميزات جينية جديدة في نماذج الفئران التقليدية. بشكل عام، فإن استخدام مجموعة أدوات CRISPR في أبحاث السرطان والنمذجة يتقدم بسرعة، مما يمكّن الباحثين
من تطوير نماذج بديلة جديدة وذات صلة سريرية للدراسات الانتقالية [102].

جين BRCA1 يشفر بروتين مثبط للورم يلعب دورًا حاسمًا في إصلاح الحمض النووي والحفاظ على استقرار الجينوم [103]. عندما تتعرض الخلايا لضرر في الحمض النووي، يشارك BRCA1 في مسارات الإشارة التي تنشط P21، وهو مثبط كيناز معتمد على السايلين [104]. يمنع P21 تقدم دورة الخلية، مما يسمح بوقت لآليات إصلاح الحمض النووي لإصلاح الحمض النووي التالف. تساعد هذه التنشيط لـ P21 في منع انتشار الخلايا التي تحتوي على طفرات قد تكون ضارة، مما يقلل من خطر تكوين الأورام [105]. يمكن أن تؤدي الطفرات في جين BRCA1 إلى تعطيل وظيفته الطبيعية، مما يعيق عمليات إصلاح الحمض النووي ويؤدي إلى عدم استقرار الجينوم [106]. وبالتالي، قد يتعرض تنشيط P21 للخطر، مما يسمح للخلايا التالفة بالتهرب من توقف دورة الخلية ونقاط تفتيش الإصلاح [107]. يزيد هذا من احتمال اكتساب هذه الخلايا لطفرات إضافية، مما قد يؤدي إلى تطور السرطان [108]. فهم التفاعل المعقد بين BRCA1 و P21 أمر حاسم لتطوير العلاجات المستهدفة والتدخلات للأفراد الذين لديهم طفرات في BRCA1 أو سرطانات ذات صلة [109]. كشفت الأبحاث أن تعديل جين BRCA1 أدى إلى قمع نمو خلايا السرطان وزيادة استجابة هذه الخلايا للعلاج الكيميائي [110]. على وجه التحديد، أدى تغيير جين BRCA1 إلى تنشيط بروتين P21، وهو بروتين مثبط للورم معروف يساهم في إيقاف دورة الخلية [107]. أدى هذا التنشيط، بدوره، إلى تقليل نمو الخلايا وجعل
خلايا السرطان أكثر عرضة للعلاج الكيميائي، حيث تميل الخلايا التي تم تنشيط P21 فيها إلى أن تكون أكثر استجابة لعلاج الكيميائي [106، 111]. يبرز بعض الباحثين إمكانية تحرير القاعدة المعتمد على CRISPR كمورد قيم للتقييم الوظيفي وإعادة تصنيف المتغيرات ذات الأهمية غير المؤكدة (VUSs) في جين BRCA1. علاوة على ذلك، تناولت هذه التحقيقات العقبات المرتبطة بتقييم الوظائف وتحديد pathogenicity للمتغيرات الجديدة في BRCA1، والتي من المعروف أنها تزيد بشكل كبير من خطر الإصابة بسرطان الثدي والمبيض وعادة ما يتم تحديدها من خلال الاختبارات الجينية السريرية. لتجاوز هذه العقبات، استخدم العلماء محرر قاعدة السايتوسين BE3 المعتمد على CRISPR للتحليل الوظيفي. قاموا بإجراء فحص شامل لتحرير القاعدة المعتمد على CRISPR باستخدام 745 RNA مرشد يستهدف جميع الإكسونات في BRCA1، مما أدى إلى تحديد عدة متغيرات غير معروفة سابقًا، بما في ذلك c.-97C > T، c.154C > T، c.3847C > T، c.5056C > T، و c.4986+5G>A. عرضت الدراسة بفعالية فائدة تحرير القاعدة المعتمد على CRISPR كأداة قوية لإعادة تقييم المتغيرات ذات الأهمية غير المؤكدة (VUSs) في BRCA1، مما يوفر رؤى قيمة للإدارة السريرية. يمكن أن يكون لهذا إعادة تصنيف VUSs في BRCA1 آثار كبيرة على المرضى ومقدمي الرعاية الصحية. يمكن للمرضى الذين تم توضيح تصنيفات المتغيرات أن يتلقوا تقييمات مخاطر أكثر دقة وخطط علاج فردية، قد تشمل زيادة المراقبة أو تدابير وقائية. بالنسبة لمقدمي الرعاية الصحية، تضمن تصنيف المتغيرات بدقة تقديم المشورة المناسبة والتواصل حول المخاطر للمرضى وعائلاتهم [112].

KRAS هو جين بروتو-أونكوجين، وعندما يتعرض للطفرات، يلعب دورًا حاسمًا في تطوير أنواع مختلفة من السرطانات، بما في ذلك سرطان القولون. يعزز KRAS المتحور نمو الخلايا غير المنضبط، مما يؤدي إلى تكوين الأورام [113]. يمكن أن يؤدي تحرير جين KRAS باستخدام تقنية CRISPR-Cas9 إلى تنشيط بروتين P21، وهو مثبط ورم معروف. يعزز P21 إيقاف دورة الخلية عن طريق تثبيط كينازات معتمدة على السايلين، مما يوقف نمو خلايا السرطان بفعالية [114]. تستخدم CRISPR-Cas9 RNA مرشد مصمم ليكمل تسلسل DNA محدد في جين KRAS. يقوم إنزيم Cas9، الموجه بواسطة RNA المرشد، بإدخال كسر مزدوج في الحمض النووي، مما يدفع آلية إصلاح الخلية لإدخال أخطاء تعطل وظيفة جين KRAS [115]. يوجه RNA المرشد إنزيم Cas9 إلى الموقع المستهدف، حيث يقوم بإدخال كسر مزدوج في الحمض النووي. ثم تقوم آلية إصلاح الخلية بإصلاح الكسر، وغالبًا ما تقوم بإدخال أخطاء تعطل وظيفة جين KRAS [116]. تشير الآثار الجانبية غير المرغوب فيها إلى التعديلات غير المقصودة للحمض النووي في مواقع أخرى غير الهدف المقصود [117]. على الرغم من أن CRISPR-Cas9 قد تم تحسينه بشكل كبير لتقليل الآثار الجانبية غير المحددة، لا يزال هناك احتمال لـ
تعديلات غير مستهدفة. يمكن أن يقلل التصميم الدقيق لـ RNA المرشد، باستخدام خوارزميات متقدمة، والتحقق من المواقع غير المحددة المحتملة من خلال التسلسل من هذه الآثار [118]. لا يزال تسليم مكونات CRISPR-Cas9 إلى الخلايا المستهدفة يمثل تحديًا [119]. تم استكشاف طرق مثل الناقلات الفيروسية، والجسيمات النانوية الدهنية، والكهربة. لكل نهج مزايا وقيود من حيث الكفاءة، والسمية، والخصوصية [120]. يعزز تنشيط بروتين P21، وهو مثبط ورم معروف، إيقاف دورة الخلية عن طريق تثبيط كينازات معتمدة على السايلين التي تنظم انقسام الخلايا. من خلال إيقاف دورة الخلية، يتم تثبيط نمو خلايا السرطان [121]. يمكن أن يؤدي تنشيط بروتين P21 من خلال تحرير جين KRAS إلى زيادة حساسية خلايا السرطان للعلاج الكيميائي [122]. يؤدي زيادة تعبير P21 إلى إيقاف دورة الخلية، مما يسمح للأدوية الكيميائية باستهداف وقتل خلايا السرطان بشكل أكثر فعالية [123]. يؤدي تنشيط بروتين P21 من خلال تحرير جين KRAS إلى زيادة حساسية خلايا السرطان للعلاج الكيميائي. يسمح إيقاف دورة الخلية الناتج عن تنشيط P21 للأدوية الكيميائية باستهداف والقضاء على خلايا السرطان بشكل أكثر فعالية [115].

يلعب جين مستقبل عامل النمو البشرة (EGFR) دورًا حاسمًا في نمو الخلايا وتكاثرها وتمايزها [124]. ترتبط الطفرات في جين EGFR بأنواع مختلفة من السرطان، وخاصة في سرطان الرئة غير صغير الخلايا (NSCLC). تعتبر تقنية كريسبر-كاس9 (CRISPR-Cas9) تقنية لتحرير الجينات تستخدم RNA موجه لاستهداف تسلسلات DNA محددة وإنزيم كاس9 لإنشاء كسور مزدوجة في الموقع المستهدف. يمكن بعد ذلك إصلاح هذه الكسور، إما من خلال NHEJ أو HDR، مما يؤدي إلى طفرات جينية أو تعديلات دقيقة، على التوالي [125]. في سياق EGFR، يمكن برمجة كريسبر-كاس9 لاستهداف وتعديل التسلسلات المتحورة المسؤولة عن نمو السرطان، مما قد يعيق تقدم الورم ويحسن نتائج المرضى [126]. يمكن أن يكون لتحرير جين EGFR باستخدام كريسبر-كاس9 عواقب إيجابية وسلبية [124]. من الجانب الإيجابي، يمكن أن يساعد في تصحيح الطفرات أو الحذف في الجين المرتبطة بأمراض معينة، مثل سرطان الرئة [127]. ومع ذلك، من الضروري مراعاة الآثار المحتملة في المواقع غير المستهدفة، حيث يمكن أن تؤدي التغييرات غير المقصودة في أجزاء أخرى من الجينوم إلى عواقب غير متوقعة أو اضطرابات في وظيفة الجين [128]. يمكن أن تختلف كفاءة كريسبر-كاس9 في تحرير جين EGFR اعتمادًا على عوامل مختلفة، بما في ذلك تصميم gRNA المحدد، وطريقة التسليم، ونوع الخلية [125]. أظهرت الدراسات أن كريسبر-كاس9 يمكن أن تحقق كفاءة تحرير عالية، ولكن من المهم تحسين الظروف التجريبية لتعظيم النتائج المرغوبة [124]. تتمتع كريسبر-كاس9 بخصوصية عالية، بفضل الارتباط الدقيق لـ RNA الموجه بتسلسل DNA المستهدف [127]. ومع ذلك، لا يزال هناك قلق بشأن آثار المواقع غير المحددة، حيث قد يقوم كاس9 بتحرير مناطق جينومية أخرى بشكل غير مقصود.
مع تشابه جزئي مع الموقع المستهدف [124]. لقد أدت الأبحاث المكثفة وتحسين تصميم RNA الموجه إلى تقليل الآثار الجانبية غير المرغوب فيها بشكل كبير [127]. لقد حسنت متغيرات Cas9 المتطورة، مثل Cas9 عالي الدقة ومحررات القواعد، من التخصص بشكل أكبر، مما يقلل من خطر التعديلات الجينية غير المقصودة [124]. تشمل التحديات المرتبطة بتحرير جين EGFR باستخدام CRISPR-Cas9 الآثار الجانبية غير المرغوب فيها، وكفاءة التسليم، والآثار المحتملة على المدى الطويل. تشمل الاعتبارات الأخلاقية الحاجة إلى الحصول على موافقة مستنيرة، وضمان الوصول العادل إلى التكنولوجيا، والاستخدام المسؤول لتجنب العواقب غير المقصودة أو إنشاء “أطفال مصممين”. التقييم الدقيق، والتنظيم، والإرشادات الأخلاقية ضرورية للتعامل مع هذه التحديات وضمان التطبيق المسؤول لتقنية CRISPR-Cas9 في تحرير جين EGFR أو أي جين آخر [128].
يمكن أن يلعب تحرير جين VEGF (عامل نمو الأوعية الدموية) باستخدام تقنية كريسبر-كاس9 دورًا حاسمًا في أنواع مختلفة من السرطان. VEGF هو بروتين يعزز نمو الأوعية الدموية الجديدة، وهي عملية تعرف باسم تكوين الأوعية، والتي تعتبر ضرورية لتطور الورم وانتشاره. من خلال استهداف وتعطيل جين VEGF باستخدام كريسبر-كاس9، يمكن للباحثين أن يعيقوا إنتاج VEGF وبالتالي يثبطوا تكوين الأوعية الدموية في الورم. قد يؤدي ذلك إلى تقليل نمو الورم وزيادة حساسية العلاجات الأخرى للسرطان. على الرغم من أن كريسبر-كاس9 محدد للغاية، إلا أن هناك احتمال حدوث آثار غير مستهدفة حيث تحدث تعديلات جينية غير مقصودة. في حالة تحرير جين VEGF، يجب على الباحثين تقييم المواقع المحتملة غير المستهدفة بعناية لضمان عدم تعديل أي جينات حيوية بشكل غير مقصود. لتقليل الآثار غير المرغوب فيها، يتم استخدام تحليلات المعلوماتية الحيوية الصارمة وطرق الفحص المتقدمة لاختيار RNA الموجه بأقل احتمال لنشاط المواقع غير المحددة. قد لا يكون تحرير جين VEGF القائم على كريسبر-كاس9 كافيًا بمفرده لعلاج السرطان بشكل كامل. على الرغم من أنه يمكن أن يعيق تكوين الأوعية الدموية في الورم، فإن استراتيجية علاج السرطان الشاملة عادة ما تتضمن دمج كريسبر-كاس9 مع علاجات أخرى مثل العلاج الكيميائي أو الإشعاعي أو المناعي. يمكن أن يؤدي دمج العلاجات إلى تأثير تآزري، يستهدف خلايا السرطان من خلال مسارات متعددة ويزيد من الفعالية العلاجية العامة. إن توصيل مكونات كريسبر-كاس9 إلى خلايا السرطان يمثل تحديًا كبيرًا. قد يحد الحجم الكبير لبروتين كاس9 ومجمع RNA الموجه من طرق التوصيل. يتم استكشاف طرق مختلفة، بما في ذلك الناقلات الفيروسية والجزيئات النانوية والليبوبومات، لضمان توصيل فعال وآمن إلى خلايا السرطان المستهدفة مع تجنب الإضرار بالأنسجة السليمة. إن ضمان كبت جين VEGF على المدى الطويل والثابت أمر ضروري لتحقيق تأثيرات علاجية مستدامة. يقوم الباحثون بالتحقيق في طرق لتحسين توصيل كريسبر-كاس9.
واستقرار داخل خلايا السرطان [129]. استراتيجيات مثل استخدام متغيرات كاس9 المعدلة أو دمج مكونات كريسبر في جينوم خلايا الهدف يمكن أن تعزز بشكل محتمل متانة تحرير جين VEGF وتأثيراته المضادة للسرطان [131].

تحرير جين BCL-2 باستخدام تقنية كريسبر-كاس9 في علاج السرطان يحمل إمكانيات كبيرة بسبب دور بروتين BCL-2 في تعزيز بقاء خلايا السرطان [132]. من خلال استهداف وتعديل جين BCL-2، يهدف الباحثون إلى تعطيل الإفراط في التعبير أو عدم تنظيم هذا البروتين، مما يمكن أن يؤدي إلى مقاومة الموت الخلوي ونمو الورم. توفر تقنية كريسبر-كاس9 طريقة دقيقة وفعالة لتحرير جين BCL-2 واستعادة آليات موت الخلايا الطبيعية [133]. تستخدم كريسبر-كاس9 RNAs إرشادية مصممة لتتناسب مع تسلسلات محددة داخل جين BCL-2 [130]. عندما تجد RNA الإرشادية تطابقًا مكملًا، فإنها توجه إنزيم كاس9 إلى ذلك الموقع، مما يبدأ كسرًا مزدوج الشريط في موقع الهدف [134]. تشير آثار المواقع غير المستهدفة إلى التغيرات غير المقصودة في الحمض النووي في مواقع مشابهة لتسلسل الهدف [132]. لتقليل الآثار غير المرغوب فيها، يستخدم الباحثون أدوات المعلوماتية الحيوية لتصميم RNAs إرشادية بدقة عالية [134]. بالإضافة إلى ذلك، يتم إجراء تجارب تحقق شاملة لتحديد وتخفيف أي مواقع محتملة غير مستهدفة [133]. يُعتبر BCL-2 جينًا مضادًا للموت الخلوي يساعد خلايا السرطان على التهرب من آليات موت الخلايا [134]. من خلال تحرير جين BCL-2، يمكن لتقنية كريسبر-كاس9 تعطيل وظيفته، مما يعزز الموت الخلوي في خلايا السرطان ويعيق نمو الورم [133]. توصيل مكونات كريسبر-كاس9 إلى خلايا السرطان المحددة في جسم المريض يمثل تحديات كبيرة [132]. يستكشف الباحثون طرق توصيل متنوعة، بما في ذلك الناقلات الفيروسية والجزيئات النانوية، لضمان توصيل فعال ومستهدف مع تقليل الآثار الجانبية المحتملة [132]. أظهرت الدراسات ما قبل السريرية على نماذج حيوانية وتجارب في المختبر نتائج واعدة في استهداف جين BCL-2 باستخدام كريسبر-كاس9. ومع ذلك، فإن التجارب السريرية ضرورية لتقييم سلامة وفعالية هذا النهج في المرضى البشر [134]. فهم العواقب المحتملة على المدى الطويل لتحرير جين BCL-2 أمر بالغ الأهمية. يحتاج الباحثون إلى التحقيق فيما إذا كانت الخلايا المعدلة تحتفظ بوظيفتها الطبيعية وما إذا كانت هناك أي آثار غير مقصودة على عمليات خلوية أخرى [133]. يثير استخدام كريسبر-كاس9 في علاج السرطان أسئلة أخلاقية حول التلاعب الجيني، والموافقة المستنيرة، والوصول العادل إلى العلاجات المتقدمة [132]. يجب على الباحثين وصانعي السياسات معالجة هذه المخاوف لضمان تطبيق مسؤول وعادل لهذه التكنولوجيا [134].

يمكن أن يكون لتعديل جين PTEN باستخدام تقنية كريسبر-كاس9 تأثيرات كبيرة على تقدم السرطان [135]. PTEN هو جين مثبط للأورام ينظم نمو الخلايا وانقسامها [136]. عندما يحدث طفرات أو حذف في PTEN، يؤدي ذلك
إلى نمو الخلايا غير المنضبط، وهو سمة من سمات السرطان [137]. من خلال استخدام CRISPR-Cas9 لاستهداف وتحرير جين PTEN بدقة، يمكن للباحثين استعادة وظيفته كمثبط للأورام، مما يعيق نمو خلايا السرطان ويقلل من تطور الأورام [138]. يختلف احتمال استخدام تحرير جين PTEN بواسطة CRISPR-Cas9 كخيار علاجي بين أنواع السرطان المختلفة [136]. تظهر بعض أنواع السرطان طفرات في جين PTEN كمحرك رئيسي لتكوين الأورام، مما يجعلها أكثر قابلية لهذا النهج [135]. ومع ذلك، قد تعتمد فعالية هذه الاستراتيجية على السياق الجيني للسرطان، حيث قد تمتلك بعض الأورام آليات بديلة لتجاوز وظيفة PTEN [138]. هناك حاجة إلى دراسات قبل السريرية واسعة النطاق وتجارب سريرية لتحديد قابليتها وفعاليتها عبر أنواع السرطان المتنوعة [135]. تتعلق مخاوف السلامة في تحرير جين PTEN بواسطة CRISPR-Cas9 في علاج السرطان بالتأثيرات الجانبية غير المرغوب فيها المحتملة، حيث يمكن أن تحدث تغييرات جينية غير مقصودة في الخلايا غير السرطانية، مما يؤدي إلى عواقب سلبية [136]. بالإضافة إلى ذلك، يجب تقييم خطر إدخال طفرات جديدة أو تغيير جينات أساسية أخرى بعناية لتجنب الآثار الجانبية غير المرغوب فيها [138]. يعد الاختبار الدقيق في النماذج قبل السريرية والمراقبة الدقيقة خلال التجارب السريرية أمرًا حيويًا لضمان سلامة وقابلية هذا النهج العلاجي [135]. يستكشف الباحثون باستمرار استراتيجيات متنوعة لتحسين كفاءة تحرير جين CRISPR-Cas9 [136]. تتضمن إحدى الطرق تحسين نظام التسليم لضمان استهداف دقيق لخلايا السرطان. بالإضافة إلى ذلك، تقدم التطورات في تكنولوجيا CRISPR-Cas9، مثل استخدام محررات القواعد أو المحررات الرئيسية، تعديلات أكثر دقة وتقليل التأثيرات الجانبية غير المستهدفة [138]. علاوة على ذلك، قد يؤدي دمج CRISPR-Cas9 مع علاجات أخرى، مثل العلاجات المناعية أو العلاجات المستهدفة، إلى تعزيز الاستجابة العلاجية العامة، مما يسمح باستراتيجية علاجية أكثر شمولاً وفعالية. هناك العديد من التحديات التي يجب معالجتها عند استخدام CRISPR-Cas9 لتحرير جين PTEN في خلايا السرطان [135]. أولاً، يعد التسليم الفعال لمكونات CRISPR إلى خلايا السرطان المحددة أمرًا حيويًا لتجنب التأثيرات الجانبية غير المستهدفة [138]. ثانيًا، يعد ضمان التحرير الصحيح والدقيق لجين PTEN دون إدخال طفرات غير مقصودة أمرًا حيويًا لنجاح العلاج [135]. بالإضافة إلى ذلك، يجب تقييم الاستجابة المناعية لمكونات CRISPR وخطر الرفض المناعي المحتمل للخلايا المعدلة لتقييم قابليتها وسلامتها على المدى الطويل [138].

يلعب جين TERT، الذي يشفر إنزيم النسخ العكسي للتيلوميراز، دورًا حاسمًا في الحفاظ على التيلوميرات، الأغطية الواقية في أطراف الكروموسومات [139]. في العديد من أنواع السرطان، يتم تنظيم جين TERT بشكل مفرط، مما يؤدي إلى زيادة نشاط التيلوميراز. وهذا يسمح لخلايا السرطان بتجاوز القيود الطبيعية على انقسام الخلايا وتحقيق الخلود، مما يساهم
في نمو الأورام وتقدمها. يمكن استخدام CRISPR-Cas9 كأداة لتحرير الجينات لاستهداف وتعديل جين TERT في خلايا السرطان [140]. يتكون نظام CRISPR-Cas9 من RNA دليلي يوجه إنزيم Cas9 إلى الموقع الجيني المطلوب [141]. من خلال تصميم RNA دليلي محدد لتسلسل جين TERT، يمكن للباحثين توجيه Cas9 إلى جين TERT وإحداث كسر مزدوج في الموقع المستهدف [142]. ثم تقوم آلية إصلاح الحمض النووي في الخلية بإصلاح الكسر، غالبًا من خلال مسار NHEJ المعرض للأخطاء، والذي يقدم إدخالات أو حذف صغير (indels) تعطل وظيفة جين TERT [139]. بدلاً من ذلك، يمكن للباحثين استخدام CRISPR-Cas9 بالاشتراك مع قالب إصلاح لإدخال تعديلات محددة على تسلسل جين TERT، مثل حذف الجينات أو الطفرات النقطية [141]. يمكن أن يؤدي تحرير جين TERT باستخدام CRISPR-Cas9 إلى عدة نتائج. إحدى الاحتمالات هي تعطيل وظيفة جين TERT، مما يؤدي إلى انخفاض نشاط التيلوميراز في خلايا السرطان. يمكن أن يؤدي ذلك إلى تقصير التيلوميرات وشيخوخة الخلايا أو موتها، مما يعيق الإمكانية التكرارية غير المحدودة لخلايا السرطان [139]. نتيجة محتملة أخرى هي تعديل تعبير جين TERT، مثل تقليل مستوى تعبيره، مما يمكن أن يعيق نمو الورم [142]. بالإضافة إلى ذلك، قد يجعل تحرير جين TERT بواسطة CRISPR-Cas9 خلايا السرطان أكثر حساسية للعلاجات الأخرى، حيث يمكن أن يعزز تثبيط التيلوميراز فعالية العلاجات التقليدية مثل العلاج الكيميائي أو العلاج الإشعاعي [139].

NF-kB هو بروتين يشارك في تنظيم الالتهاب وغالبًا ما يكون نشطًا بشكل مفرط في أنواع السرطان المختلفة، بما في ذلك سرطان البنكرياس [143]. اكتشف الباحثون أن تعديل جين NF-kB أدى إلى إعاقة نمو خلايا السرطان وجعل خلايا السرطان أكثر تقبلاً للعلاج الكيميائي [144]. كشفت الدراسة بشكل خاص أن تحرير جين NF-kB قمع بروتين NF-kB، المسؤول عن تعزيز الالتهاب وتحفيز نمو الخلايا [145]. وبالتالي، فإن هذا التثبيط لنمو الخلايا زاد من حساسية خلايا السرطان للعلاج الكيميائي، حيث تظهر الخلايا التي تحتوي على بروتين NF-kB منخفض النشاط استجابة متزايدة لعلاجات العلاج الكيميائي [146]. يمكن أن يكون لتحرير جين NF-kB باستخدام CRISPR-Cas9 آثار كبيرة على تقدم السرطان [143]. NF-kB هو عامل نسخ يلعب دورًا حاسمًا في تنظيم عمليات خلوية متنوعة، بما في ذلك الالتهاب، وبقاء الخلايا، والتكاثر [145]. من خلال تحرير جين NF-kB، يمكن أن يؤدي CRISPR-Cas9 إلى تعطيل نشاطه، مما يؤدي إلى تثبيط مسارات الإشارة التي تعزز السرطان وقمع نمو الورم [146]. يمكن أن يؤدي تحرير جين NF-kB باستخدام CRISPR-Cas9 إلى تعزيز حساسية خلايا السرطان للعلاجات التقليدية [143]. غالبًا ما يرتبط تنشيط NF-kB
المقاومة للعلاج الكيميائي والإشعاعي. من خلال تعطيل إشارة NF-kB من خلال تحرير CRISPR-Cas9، قد تصبح خلايا السرطان أكثر عرضة للعلاجات القياسية للسرطان، مما يحسن النتائج العلاجية العامة [145]. بينما يظهر تحرير جين NF-kB بواسطة CRISPR-Cas9 وعدًا، من المهم تقييم الآثار الجانبية المحتملة أو العواقب غير المقصودة [143]. التأثيرات الجانبية غير المرغوب فيها، حيث يقوم CRISPR-Cas9 بتحرير مواقع جينية غير مقصودة، يمكن أن تؤدي إلى عدم استقرار جيني أو تتداخل مع الوظائف الخلوية الطبيعية [145]. بالإضافة إلى ذلك، يجب تقييم الآثار طويلة المدى لتعطيل جين NF-kB على الاستجابة المناعية العامة والعمليات الالتهابية بشكل شامل [144]. يتطلب تحسين الإمكانات العلاجية لتحرير جين NF-kB بواسطة CRISPR-Cas9 مزيدًا من البحث والتطوير. يعد فهم الخصائص الجزيئية المحددة لأنواع السرطان المختلفة ومسارات إشارة NF-kB الخاصة بها أمرًا أساسيًا لتصميم استراتيجيات CRISPR-Cas9 دقيقة [145]. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تعزز التطورات في أنظمة التسليم، مثل الناقلات الفيروسية أو الحوامل القائمة على الجسيمات النانوية، كفاءة وخصوصية تحرير جين NF-kB في خلايا السرطان [143].

جين CDK4 يشفر كيناز معتمد على السيكلين 4، وهو بروتين حاسم يشارك في تنظيم دورة الخلية [147]. يشكل CDK4 مجمعات مع السيكلين D، مما يؤدي إلى تقدم دورة الخلية من المرحلة G1 إلى المرحلة S [148]. في أنواع مختلفة من السرطان، تم ملاحظة التعبير المفرط أو تضخيم CDK4، مما يعزز التكاثر غير المنضبط للخلايا وتكون الأورام [149]. تستخدم تقنية كريسبر-كاس9 جزيئات RNA الدليل التي ترتبط بشكل تكاملي بتسلسل DNA المستهدف داخل جين CDK4 [148]. ثم يقوم بروتين كاس9، الذي يعمل كقواطع جزيئية، بقطع DNA في الموقع الدقيق الذي تحدده RNA الدليل. هذا يؤدي إلى حدوث كسور مزدوجة في جين CDK4، مما يحفز آلية إصلاح DNA في الخلية، والتي قد تؤدي إلى حذف الجين أو طفرات مستهدفة [149]. أظهرت الدراسات ما قبل السريرية التي تستخدم كريسبر-كاس9 نتائج واعدة في تثبيط تعبير CDK4 وتقليل نمو الأورام في نماذج سرطانية مختلفة، مثل الميلانوما وسرطان الثدي والورم الدبقي. قدمت هذه الدراسات رؤى قيمة حول الفعالية العلاجية المحتملة لاستهداف CDK4 باستخدام كريسبر [150]. اعتبارًا من تاريخ المعرفة الحالي، من المحتمل أن تكون هناك عدة تجارب سريرية جارية أو مخطط لها لتقييم سلامة وفعالية كريسبر-كاس9 في تعديل جين CDK4 لدى مرضى السرطان. ستساعد هذه التجارب في تحديد جدوى وفوائد استراتيجيات كريسبر في البيئات السريرية الواقعية [151]. واحدة من التحديات هي التوصيل الفعال لمكونات كريسبر-كاس9 إلى خلايا السرطان. من الضروري ضمان معدلات توصيل عالية وتقليل الآثار الجانبية غير المستهدفة لتحقيق العلاج الناجح [148]. بالإضافة إلى ذلك، قد يكون لـ CDK4
وظائف مهمة في الخلايا الطبيعية، لذا فإن استهدافها قد يسبب عواقب غير مقصودة في الأنسجة غير السرطانية [149].

تجارب سريرية تستكشف إمكانيات العلاج بالسرطان القائم على كريسبر في مراحل تطويرها المبكرة حاليًا. ومع ذلك، تم إطلاق العديد من التجارب السريرية لتقييم مدى أمان وفعالية علاج السرطان القائم على كريسبر للبشر. يركز بحث فرانغول وآخرون على استخدام تحرير الجينات كريسبر-كاس9 لمعالجة مرضين أحادي الجين شديدين [152]: المعتمد على نقل الدم. -الثلاسيميا (TDT) ومرض الخلايا المنجلية (SCD) هما حالتان شديدتان وقابلتان للتهديد للحياة. ركز الباحثون على استهداف عامل نسخ محدد يسمى BCL11A، المعروف بأنه يثبط إنتاج الهيموغلوبين الجنيني و -غلوبي في الخلايا الحمراء. لتحقيق ذلك، استخدموا نظام CRISPR-Cas9 لتعديل معزز BCL11A الخاص بالخلايا الحمراء في خلايا الجذع والسلائف المكونة للدم CD34+ المأخوذة من متبرعين أصحاء. ومن المRemarkably، أن هذه الطريقة في التحرير نجحت في تغيير حوالي الأليلات في هذا الموقع الجيني دون أي آثار جانبية غير مرغوب فيها. بعد تحرير الجينات، خضع مريضان، أحدهما يعاني من الثلاسيميا الكبرى والآخر من مرض الخلايا المنجلية، لزراعة خلايا CD34+ المعدلة بعد إزالة نخاع العظام الموجود لديهم. بعد أكثر من عام، أظهر كلا المريضين تحريرًا أليليًا كبيرًا في نخاع العظام والدم، مصحوبًا بزيادة كبيرة في مستويات الهيموغلوبين الجنيني، مما أدى إلى استقلالهما عن عمليات نقل الدم. ومن الجدير بالذكر أن المريض الذي يعاني من مرض الخلايا المنجلية لم يعد يعاني من نوبات انسداد الأوعية الدموية، وهي أحداث مؤلمة وم damaging caused by sickle-shaped red blood cells. تم تسجيل التجارب السريرية لهذه العلاجات علىClinicalTrials.govمع المعرفات NCT03655678 لـ CLIMB THAL-111 (لـ -الثلاسيميا) وNCT03745287 لدراسة CLIMB SCD121 (لمرض الخلايا المنجلية). ومن الجدير بالذكر أن هذا البحث تلقى دعمًا ماليًا من CRISPR Therapeutics وVertex Pharmaceuticals (الشكل 7).

تتضمن استراتيجية شائعة لوحظت في عدة تجارب إلغاء جين PD1، الذي يشفر لبروتين موت الخلايا المبرمج 1. من المعروف أن PD1 يشارك في تثبيط نشاط خلايا T، ومن خلال إزالته، يمكن أن تصبح خلايا T المعدلة، المعروفة باسم TILs الذاتية و CTLs الذاتية المحددة لـ EBV، أكثر قوة في التعرف على خلايا السرطان ومهاجمتها. تركز التجارب السريرية من المرحلة الأولى NCT03081715 [153] و NCT02793856 على TILs الذاتية المعطلة لـ PD1، بينما تحقق NCT03044743 [154] في CTLs الذاتية المحددة لـ EBV المعطلة لـ PD1. بالإضافة إلى ذلك، تستكشف دراسة أخرى (NCT04417764) نفس استراتيجية TILs الذاتية المعطلة لـ PD1 [155]. تتضمن نهجًا آخر إلغاء PD1 في نفس الوقت.

وجين TCR (مستقبل الخلايا التائية) في خلايا CAR T المستهدفة لميسوتيلين المأخوذة من متبرعين. يتم اختبار هذه الاستراتيجية في التجربة السريرية المرحلة الأولى NCT03545815 [156]. من خلال القضاء على TCR، يمكن لخلايا CAR T تجنب الآثار الجانبية المحتملة مثل مرض الطعم ضد المضيف (GVHD) أثناء استهداف خلايا السرطان التي تعبر عن الميسوتيلين. علاوة على ذلك، تركز بعض التجارب
استهداف جينات أخرى لتحسين علاج خلايا CAR T. على سبيل المثال، تهدف التجربة السريرية NCT04037566 إلى تعزيز فعالية خلايا CAR T المستهدفة لـ CD19 من خلال تعديل الجين الداخلي HPK1 [157]. وبالمثل، تستخدم NCT04767308 حذف CD5 الداخلي في خلايا CAR T المستهدفة لـ CD5 خلال المرحلة الأولى من التجربة لتعزيز فعاليتها المحتملة
[158]. علاوة على ذلك، تستخدم NCT03166878 حذف كل من TCR و (بيتا-2 ميكروغلوبيولين) في خلايا CAR T المستهدفة لـ CD19 [158]. يمنع إزالة TCR GVHD، وغياب يؤدي إلى تقليل تعبير MHC-I، الذي يمكن أن يقمع نشاط خلايا CAR T. تتضمن التجارب الأخرى في الجدول 2 إدخال CAR في خلايا T بعد حذف جينات معينة. على سبيل المثال، تستخدم NCT04502446 تقنية CRISPR لإدخال جين CAR بينما تقوم في الوقت نفسه بحذف TCR وMHC-I الداخليين في خلايا CAR T المستهدفة لـ CD70 [159]. وبالمثل، تستهدف NCT04244656 BCMA (بروتين نضوج الخلايا البائية) في خلايا CAR T الألوغينية بينما تحذف TCR وMHC-I الداخليين لتعزيز قدرتها على استهداف السرطان [159]. علاوة على ذلك، تستكشف NCT04637763 حذف PD1 وTCR الداخلي في خلايا CAR T المستهدفة لـ CD19 [159]. تهدف هذه الطريقة إلى تحسين بقاء ونشاط خلايا CAR T في مهاجمة خلايا السرطان التي تعبر عن CD19. يقدم الجدول 3 التجارب السريرية لعلاجات السرطان المعتمدة على CRISPR التي تستهدف أنواعًا مختلفة من السرطان.

تكنولوجيا CRISPR-Cas9، وهي تقنية ثورية لتحرير الجينات، تحمل وعدًا هائلًا لعلاج مختلف الاضطرابات والأمراض الوراثية [203]. ومع ذلك، فإن اعتمادها على نطاق واسع يواجه تحديات كبيرة تتعلق بالسلامة والتوصيل [204]. واحدة من المخاوف الرئيسية بشأن CRISPR-Cas9 هي قدرتها المحتملة على إدخال تغييرات جينية غير مقصودة، والمعروفة باسم آثار المواقع غير المرغوب فيها، والتي قد تؤدي إلى عواقب غير متوقعة وتثير مشاكل صحية جديدة [205]. يجب على العلماء والباحثين تطوير طرق أكثر دقة وموثوقية لتقليل هذه الآثار غير المستهدفة لضمان سلامة وفعالية العلاج [206، 207]. بالإضافة إلى ذلك، فإن توصيل مكونات CRISPR-Cas9 إلى خلايا وأنسجة معينة يمثل عقبة كبيرة [208، 209]. من الضروري إيجاد طرق توصيل فعالة يمكن أن تستهدف الخلايا المقصودة بشكل فعال مع تجنب ردود الفعل السلبية في الأنسجة المحيطة [203]. التغلب على هذه التحديات المتعلقة بالسلامة والتوصيل هو أمر أساسي لإطلاق الإمكانات الكاملة لـ CRISPR-Cas9 كنهج علاجي تحويلي، مما يوفر الأمل للمرضى الذين يعانون من الأمراض الوراثية. سيكون البحث القوي والاختبارات الدقيقة ضرورية لضمان أن فوائد هذه التكنولوجيا الرائدة تفوق أي مخاطر محتملة [205]. يقدم الجدول 4 التحديات المتعلقة بالسلامة والتوصيل المرتبطة بعلاج السرطان المعتمد على CRISPR.

تقييم آثار المواقع غير المستهدفة في تحرير الجينات أمر حاسم لضمان سلامة ودقة التعديلات الجينية [214]. تهدف التطورات في المحررات الأساسية و
المحررات الرئيسية إلى تقليل آثار المواقع غير الانتقائية، ولكن لا تزال الأبحاث الجارية والاعتبارات الأخلاقية ضرورية لاستغلال هذه التقنيات بشكل مسؤول للتطبيقات العلاجية وغيرها من التدخلات الجينية [215]. تشير آثار المواقع غير المستهدفة إلى التغييرات أو التعديلات غير المقصودة في الحمض النووي التي تحدث عند استخدام تقنيات تحرير الجينات مثل أنظمة CRISPR-Cas. يمكن أن تحدث هذه التعديلات غير المقصودة في مواقع أخرى غير الموقع المستهدف، مما قد يؤدي إلى تغييرات جينية غير متوقعة وغير مرغوب فيها [214]. المحررات الأساسية هي تقدم حديث في تكنولوجيا CRISPR يمكنها إجراء تعديلات كيميائية مستهدفة على قواعد الحمض النووي المحددة دون إنشاء كسور مزدوجة السلسلة مثل أنظمة CRISPR-Cas التقليدية. تقلل هذه الطريقة المستهدفة من خطر آثار المواقع غير المرغوب فيها من خلال تقليل الإمكانية للتعديلات العشوائية في الحمض النووي [215]. تقدم المحررات الرئيسية دقة محسنة في تحرير الجينات مقارنة بالمحررات الأساسية أو أنظمة CRISPR-Cas التقليدية. تجمع بين قدرات المحررات الأساسية والنكاسات، مما يسمح بالإدخال الدقيق والحذف والاستبدال لقاعدتين جينيتين معينتين داخل الجينوم. تزيد هذه الدقة من تقليل احتمال آثار المواقع غير المستهدفة [216]. يستخدم العلماء تقنيات متنوعة لتقييم آثار المواقع غير الانتقائية، مثل تسلسل الجينوم الكامل، والتسلسل عالي الإنتاجية، والتحليل الحسابي. تساعد هذه الطرق في تحديد التغييرات الجينية غير المقصودة وتحديد كفاءة وخصوصية تقنية تحرير الجينات المستخدمة [217]. على الرغم من التقدم في المحررات الأساسية والمحررات الرئيسية، تظل آثار المواقع غير المستهدفة مصدر قلق [217]. التحدي يكمن في تحقيق دقة مطلقة في استهداف مواقع جينومية معينة دون التأثير على المناطق المجاورة [215]. يعد التحسين المستمر لأدوات تحرير الجينات، جنبًا إلى جنب مع طرق التقييم والتحقق الدقيقة، أمرًا حاسمًا للتغلب على هذه التحديات [216]. لضمان سلامة استخدام المحررات الأساسية والمحررات الرئيسية في البيئات العلاجية، من الضروري إجراء دراسات قبل السريرية شاملة. تتضمن هذه الدراسات اختبارًا دقيقًا لأدوات تحرير الجينات على خطوط الخلايا والنماذج الحيوانية ذات الصلة لتقييم الآثار المحتملة للمواقع غير المستهدفة وضمان دقة التعديلات الجينية قبل التقدم إلى التجارب البشرية [215].

استراتيجية واحدة هي استخدام متغيرات Cas9 عالية الدقة، التي تم تصميمها لتقليل النشاط غير المستهدف [215]. استراتيجية أخرى هي استخدام أنظمة CRISPR بديلة، مثل Cpf1 أو Cas12a، التي لديها آليات فريدة للتعرف على الهدف وقد أظهرت نشاطًا غير مستهدف أقل مقارنة بـ Cas9 [218]. استراتيجية أخرى هي استخدام مجموعة من gRNA ومتغيرات Cas9 ذات الدقة العالية، أو استخدام عدة gRNAs لاستهداف نفس الجين. يزيد هذا من خصوصية تحرير الجينات المعتمد على CRISPR ويقلل من خطر آثار المواقع غير المستهدفة [219]. طريقة أخرى

لتقليل التأثيرات غير المستهدفة، يتم استخدام أدوات حسابية للتنبؤ بالمواقع غير المرغوب فيها والتحقق تجريبيًا من هذه التنبؤات. وهذا يسمح للباحثين بتحديد وتجنب المواقع غير الانتقائية قبل أن تسبب طفرات غير مقصودة. أخيرًا، من المهم ملاحظة أن التأثيرات غير المستهدفة يمكن أن تنشأ أيضًا من طريقة التسليم المستخدمة لتوصيل آلية CRISPR إلى الخلايا. يقوم الباحثون بتطوير مجموعة متنوعة من الطرق لتوصيل CRISPR إلى موقع الورم، بما في ذلك الناقلات الفيروسية، والجزيئات النانوية، والإكسوزومات. تركز أبحاث شيانغ وآخرون على تحسين كفاءة التنبؤ بـ gRNAs الخاصة بـ CRISPR-Cas9 باستخدام دمج البيانات والتعلم العميق. الهدف الأساسي هو تعزيز دقة تحديد gRNAs التي ستكون أكثر فعالية في استهداف تسلسلات DNA محددة. تعتبر CRISPR-Cas9 أداة قوية لتحرير الجينات تعتمد على gRNAs لتوجيه إنزيم Cas9 إلى موقع DNA المستهدف للتحرير. تصميم gRNA الفعال أمر حاسم لنجاح تحرير الجينوم، ويتطلب ذلك موثوقية.
تنبؤات كفاءة الاستهداف. لتحقيق ذلك، جمع الباحثون بيانات نشاط gRNA عالية الجودة لـ 10,592 gRNA تستهدف إنزيم SpCas9. لتحسين توقعاتهم، دمج الباحثون هذه البيانات الجديدة مع البيانات التكميلية الموجودة من مصادر أخرى. ثم استخدموا نموذج تعلم عميق يسمى “CRISPR on”، الذي تم تدريبه على مجموعة بيانات مجمعة من 23,902 gRNA، بما في ذلك البيانات التي تم إنشاؤها حديثًا والبيانات المتاحة سابقًا. أظهرت نتائج دراستهم أن CRISPR on تفوق على الأدوات الحالية المستخدمة في توقع كفاءة gRNA. لوحظت الأداء المحسن عبر أربعة مجموعات بيانات اختبار لم تكن جزءًا من بيانات التدريب المستخدمة لتطوير أدوات التوقع الأخرى. وهذا يشير إلى أن توقعات CRISPR on كانت أكثر دقة وموثوقية مما هو متاح حاليًا. لجعل نتائجهم متاحة للمجتمع العلمي، طور الباحثون خادم ويب تفاعلي لتصميم gRNA بناءً على CRISPR on

برنامج مستقل. يتيح هذا الخادم للويب للباحثين الوصول بسهولة واستخدام أداة CRISPR on لتصميم gRNAs بكفاءة أعلى [223]. ومع ذلك، لا تزال هذه الطرق في مراحل مبكرة من التطوير وهناك حاجة إلى مزيد من البحث لتحسين فعاليتها وسلامتها [224]. تعتبر الآثار الجانبية غير المرغوب فيها مصدر قلق كبير في تحرير الجينات المعتمد على CRISPR، وهي ذات صلة خاصة في سياق علاج السرطان [224]. يقوم الباحثون بتطوير استراتيجيات جديدة لتقليل خطر الآثار الجانبية غير الانتقائية، بما في ذلك استخدام متغيرات Cas9 عالية الدقة، وأنظمة CRISPR بديلة، وأدوات حسابية، وطرق توصيل محسّنة [224، 225]. بينما أظهرت هذه الاستراتيجيات وعدًا، لا يزال هناك الكثير من العمل الذي يتعين القيام به لضمان أن تحرير الجينات المعتمد على CRISPR آمن وفعال لعلاج السرطان [226]. تشير الآثار الجانبية غير المستهدفة إلى التغيرات غير المقصودة في DNA الخلايا الناتجة عن نظام CRISPR-Cas9. يمكن أن تحدث هذه التغيرات في الجينات التي لم يكن من المقصود استهدافها بواسطة نظام CRISPR-Cas9. يمكن أن تؤثر هذه التغيرات غير المقصودة على التأثير العلاجي لتحرير الجينات وقد تؤدي إلى عواقب ضارة [227]. استخدم الباحثون CRISPR-Cas9 لاستهداف جين PIK3CA في خلايا السرطان البشرية. PIK3CA هو جين معروف بأنه يسبب السرطان، أو جين يعزز تطور السرطان. وجد الباحثون أن نظام CRISPR-Cas9 تسبب في طفرات غير مقصودة في عدة جينات غير مستهدفة، بما في ذلك جين AKT1. يمكن أن تكون هذه الآثار الجانبية غير المرغوب فيها قد أضعفت التأثير العلاجي لاستهداف PIK3CA، حيث يمكن أن تنشط هذه الطفرات AKT1 وبالتالي تعزز نمو السرطان [228]. وبالمثل، استخدم باحثون آخرون CRISPR-Cas9 لاستهداف جين KRAS في خلايا السرطان البشرية. KRAS هو أيضًا جين معروف بأنه يسبب السرطان. وجد المحققون أن نظام CRISPR-Cas9 تسبب في طفرات غير مقصودة في عدة جينات غير مستهدفة، بما في ذلك جين NF1. يمكن أن تكون هذه الآثار الجانبية غير الانتقائية قد أضعفت التأثير العلاجي لاستهداف KRAS، حيث يمكن أن تعطل هذه الطفرات NF1 وبالتالي تعزز نمو السرطان [229]. استخدم الباحثون CRISPR-Cas9 لاستهداف جين MYC في خلايا السرطان البشرية. MYC هو جين معروف بأنه يسبب السرطان. وجدوا أن نظام CRISPR-Cas9 تسبب في طفرات غير مقصودة في عدة جينات غير مستهدفة، بما في ذلك جين BCL2L11. يمكن أن تكون هذه الآثار الجانبية غير المرغوب فيها قد أضعفت التأثير العلاجي لاستهداف MYC، حيث يمكن أن تنشط هذه الطفرات BCL2L11 وبالتالي تعزز نمو السرطان [230]. استخدم باحثون آخرون CRISPR-Cas9 لاستهداف جين TERT في خلايا السرطان البشرية. TERT هو جين يعزز نمو السرطان. وجدوا أن نظام CRISPR-Cas9 تسبب في طفرات غير مقصودة في عدة جينات غير مستهدفة، بما في ذلك جين NFE2L2. يمكن أن تكون هذه الآثار الجانبية غير المستهدفة قد أضعفت التأثير العلاجي لاستهداف TERT، حيث أن هذه
الطفرات يمكن أن تعطل NFE2L2 وبالتالي تعزز نمو السرطان [139]. كان الغرض من استخدام CRISPR-Cas9 هو التحقيق في التأثير العلاجي المحتمل لاستهداف جين BRCA1/TP53/RAS، الذي يتعرض عادة للطفرات في سرطان الثدي والمبيض [231]. كانت العواقب غير المقصودة لاستخدام CRISPR-Cas9 على جين BRCA1/TP53/RAS هي طفرات غير مقصودة في عدة جينات غير مستهدفة، بما في ذلك RAD51D/MDM2/MAPK، على التوالي [232]. يمكن أن تكون الطفرات غير المقصودة في جينات RAD51D/MDM2/MAPK قد أضعفت التأثير العلاجي لاستهداف BRCA1/TP53/RAS حيث يمكن أن تنشط RAD51D/تعطل MDM2/تنشط MAPK، مما يؤدي إلى تعزيز نمو السرطان [233]. تسلط النتائج المتكررة للطفرات غير المقصودة في جينات غير مرغوب فيها في هذه الدراسات الضوء على الخطر الكبير للآثار الجانبية غير الانتقائية المرتبطة بتحرير الجينات باستخدام CRISPR-Cas9 [234]. يجب على البحث تحليل ومقارنة الآثار الجانبية غير المستهدفة التي لوحظت عند استهداف جينات مختلفة، مما قد يوفر رؤى حول التأثيرات الخاصة بالجنس من CRISPR-Cas9 [235، 236]. فهم الآثار الجانبية غير المستهدفة وتأثيرها المحتمل على نمو السرطان أمر بالغ الأهمية في تقييم سلامة وفعالية CRISPR-Cas9 كنهج علاجي لعلاج السرطان [232، 237].

السلامة هي مصدر قلق حاسم في تطوير علاج السرطان القائم على كريسبر [238]. يمتلك تحرير الجينات القائم على كريسبر القدرة على التسبب في طفرات غير مقصودة في الجينوم، مما قد يؤدي إلى آثار جانبية خطيرة. هذا الأمر يثير القلق بشكل خاص في علاج السرطان، حيث الهدف هو استهداف طفرات جينية محددة تدفع نمو الورم [239]. واحدة من المخاوف الرئيسية المتعلقة بالسلامة في علاج السرطان القائم على كريسبر هي إمكانية حدوث آثار جانبية غير مستهدفة. يحدث هذا عندما تستهدف آلية كريسبر جينات غير مقصودة، مما يؤدي إلى طفرات غير مقصودة [240]. يعمل الباحثون على تطوير طرق توصيل كريسبر أكثر دقة وتحسين خصوصية RNAs الدليل المستخدمة لاستهداف جينات محددة [241]. النسخ الأحدث من كريسبر-كاس12a وكاس13 على سبيل المثال، لديها خصوصية أعلى من كاس9 الأصلي، مما يساعد في تقليل الآثار الجانبية غير المرغوب فيها [242]. قلق آخر يتعلق بالسلامة هو إمكانية إنشاء طفرات جديدة تسبب السرطان [241]. يعتمد علاج السرطان القائم على كريسبر على القدرة على استهداف طفرات جينية محددة بدقة تدفع نمو الورم [238]. ومع ذلك، إذا استهدفت آلية كريسبر عن غير قصد جينات أخرى، فقد تخلق طفرات جديدة تسبب السرطان [243]. للتخفيف من هذه المخاطر، يعمل الباحثون على تطوير استراتيجيات جديدة لتقليل خطر الآثار الجانبية غير المحددة ولتحسين فهم الآثار طويلة المدى لعلاج السرطان القائم على كريسبر [238]. القلق الثالث بشأن السلامة هو خطر
تحول الخلايا المعدلة إلى خلايا سرطانية [240]. يعتمد علاج السرطان القائم على كريسبر على القدرة على تحرير طفرات جينية محددة تدفع نمو الورم. ومع ذلك، إذا اكتسبت الخلايا المعدلة طفرات إضافية، فقد تصبح سرطانية [238]. يعمل الباحثون على فهم الآثار طويلة المدى لعلاج السرطان القائم على كريسبر وتطوير استراتيجيات لتقليل خطر تحول الخلايا المعدلة إلى خلايا سرطانية [241]. بالإضافة إلى هذه المخاوف، يثير علاج السرطان القائم على كريسبر عددًا من المخاوف الأخرى المتعلقة بالسلامة، بما في ذلك إمكانية حدوث تفاعلات مناعية تجاه الناقلات الفيروسية المستخدمة لتوصيل كريسبر، وخطر إنشاء طفرات جديدة تسبب السرطان. للتخفيف من هذه المخاوف، يعمل الباحثون على تطوير طرق توصيل أكثر أمانًا وتطوير استراتيجيات جديدة لتقليل خطر الآثار الجانبية غير المستهدفة [240]. يتم إجراء دراسات قبل السريرية والسريرية لتقييم سلامة وفعالية علاج السرطان القائم على كريسبر [238]. بالإضافة إلى ذلك، يعمل الباحثون على إيجاد طرق فعالة من حيث التكلفة وكفاءة لإنتاج أعداد كبيرة من الخلايا المعدلة بواسطة كريسبر، والتغلب على مشكلات القابلية للتوسع [240]. يمتلك تحرير الجينات القائم على كريسبر القدرة على إحداث ثورة في علاج السرطان، ولكن لا تزال هناك تحديات كبيرة تتعلق بالسلامة يجب معالجتها قبل أن يمكن استخدام هذا النهج بأمان وفعالية في العيادة [241]. البحث المستمر ضروري لفهم الآثار طويلة المدى لعلاج السرطان القائم على كريسبر بشكل أفضل، ولتطوير طرق توصيل أكثر أمانًا، وتقليل خطر الآثار الجانبية غير المستهدفة وغيرها من المخاوف المتعلقة بالسلامة [240]. جانب آخر من جوانب السلامة في علاج السرطان القائم على كريسبر هو طريقة التوصيل المستخدمة لتوصيل آلية كريسبر إلى خلايا الورم. واحدة من أكثر الطرق شيوعًا المستخدمة هي استخدام الناقلات الفيروسية، مثل الفيروسات الغدية أو الفيروسات القهقرية [241]. ومع ذلك، فإن هذه الناقلات لديها القدرة على التسبب في تفاعلات مناعية وآثار سلبية أخرى [238]. يعمل الباحثون على تطوير طرق توصيل غير فيروسية، مثل الجسيمات النانوية والإكسوزومات، كبديل للناقلات الفيروسية. هذه الطرق لديها القدرة على أن تكون أكثر أمانًا وفعالية، لكنها لا تزال في مراحل مبكرة من التطوير وتحتاج إلى مزيد من البحث لتحسين فعاليتها وسلامتها [241, 244]. بالإضافة إلى ذلك، فإن التصنيع والقابلية للتوسع لعلاج السرطان القائم على كريسبر هو مصدر قلق كبير آخر يتعلق بالسلامة. إنتاج كميات كبيرة من الخلايا المعدلة بواسطة كريسبر للاستخدام السريري يمثل تحديًا ومكلفًا [241]. يعمل الباحثون على إيجاد طرق فعالة من حيث التكلفة وكفاءة لإنتاج أعداد كبيرة من الخلايا المعدلة بواسطة كريسبر، والتغلب على مشكلات القابلية للتوسع. يشمل ذلك البحث عن طرق بديلة لإنتاج آلية كريسبر واستكشاف طرق لتحسين كفاءة عملية تحرير كريسبر [241]. السلامة هي مصدر قلق حاسم في تطوير علاج السرطان القائم على كريسبر [240]. يعمل الباحثون على معالجة هذه المخاوف من خلال تطوير
طرق توصيل أكثر أمانًا، وتطوير استراتيجيات جديدة لتقليل خطر الآثار الجانبية غير المستهدفة وغيرها من المخاوف المتعلقة بالسلامة، وإيجاد طرق فعالة من حيث التكلفة وكفاءة لإنتاج أعداد كبيرة من الخلايا المعدلة بواسطة كريسبر [238]. البحث المستمر ضروري لفهم الآثار طويلة المدى لعلاج السرطان القائم على كريسبر بشكل أفضل، ولضمان أن هذا النهج الجديد الواعد يمكن استخدامه بأمان وفعالية في العيادة. من المهم أن نلاحظ أنه بينما يعد علاج السرطان القائم على كريسبر نهجًا جديدًا واعدًا، إلا أنه لا يزال في مراحل مبكرة من التطوير. لا تزال العديد من المخاوف والتحديات المتعلقة بالسلامة التي تم مناقشتها أعلاه قيد الدراسة والتقييم في التجارب قبل السريرية والسريرية. لذلك، من المهم الاستمرار في مراقبة تقدم البحث في هذا المجال وتقييم سلامة وفعالية علاج السرطان القائم على كريسبر مع توفر المزيد من البيانات [240]. من الجدير بالذكر أيضًا أن المشهد التنظيمي لعلاج السرطان القائم على كريسبر لا يزال يتطور. لدى الدول والمناطق المختلفة لوائح وإرشادات مختلفة بشأن استخدام العلاجات القائمة على كريسبر في البشر [241]. سيحتاج الباحثون والشركات التي تطور علاجات السرطان القائمة على كريسبر إلى التنقل في هذه اللوائح والإرشادات من أجل طرح علاجاتهم في السوق [238]. يمتلك علاج السرطان القائم على كريسبر القدرة على إحداث ثورة في علاج السرطان، ولكن لا تزال هناك تحديات كبيرة تتعلق بالسلامة ومشكلات التوصيل التي يجب معالجتها. يعمل الباحثون على معالجة هذه المخاوف من خلال البحث والتطوير المستمر، ولكن سيستغرق الأمر وقتًا لفهم الآثار طويلة المدى وسلامة هذا النهج الجديد بشكل كامل. من المهم مراقبة تقدم البحث في هذا المجال وتقييم سلامة وفعالية علاج السرطان القائم على كريسبر مع توفر المزيد من البيانات [241].

توصيل تحرير الجينات القائم على كريسبر إلى موقع الورم هو تحدٍ كبير في تطوير علاج السرطان القائم على كريسبر [245]. يستخدم العلاج القائم على كريسبر ناقلًا فيروسيًا، أو جسيمات نانوية، أو إكسوزومات لتوصيل آلية كريسبر إلى خلايا الورم [245]. تعتبر طريقة التوصيل المستخدمة حاسمة لفعالية العلاج، فضلاً عن سلامة المريض [246]. واحدة من أكثر الطرق شيوعًا لتوصيل كريسبر إلى موقع الورم هي من خلال استخدام الناقلات الفيروسية [247]. الناقلات الفيروسية هي نسخ معدلة من الفيروسات يمكن استخدامها لإدخال جينات أو مواد جينية أخرى إلى الخلايا [248]. أكثر الناقلات الفيروسية شيوعًا لتوصيل كريسبر هي الفيروسات المرتبطة بالغدة (AAVs) والفيروسات القهقرية. لقد أظهرت هذه الناقلات أنها توصل كريسبر بكفاءة إلى مجموعة متنوعة من الخلايا، بما في ذلك خلايا السرطان [249]. ومع ذلك، فإن استخدام الناقلات الفيروسية يثير مخاوف تتعلق بالسلامة، حيث قد يتعرف الجهاز المناعي على الفيروس كشيء غريب
وتفعيل استجابة مناعية. يمكن أن يؤدي ذلك إلى التهاب وآثار سلبية أخرى، ويمكن أن يحد أيضًا من فعالية العلاج [250]. طريقة أخرى لتوصيل كريسبر إلى موقع الورم هي من خلال استخدام الجسيمات النانوية. هذه الجسيمات صغيرة بما يكفي لاختراق نسيج الورم بسهولة، ويمكن تصميمها لحمل معدات كريسبر [251]. يمكن أيضًا تصميم الجسيمات النانوية لاستهداف أنواع خلايا معينة، مثل خلايا السرطان، لزيادة كفاءة العلاج [252]. ومع ذلك، لا تزال فعالية الجسيمات النانوية في توصيل كريسبر إلى موقع الورم قيد التقييم، وهناك حاجة إلى مزيد من البحث لفهم سلامتها وفعاليتها [253]. تعتبر الإكسوزومات أيضًا وسيلة توصيل واعدة لكريسبر [254]. الإكسوزومات هي حويصلات صغيرة يتم إفرازها بشكل طبيعي بواسطة الخلايا ويمكن تصميمها لحمل معدات كريسبر [255]. تمتلك الإكسوزومات القدرة على عبور الحاجز الدموي الدماغي وتوصيل معدات كريسبر إلى موقع الورم. لكن هناك حاجة إلى مزيد من البحث لفهم سلامة وفعالية الإكسوزومات كوسيلة توصيل لكريسبر [256]. يقوم الباحثون بتطوير طرق توصيل كريسبر التي يمكن أن تستهدف خلايا السرطان بناءً على العلامات السطحية، مثل تعبير بروتينات معينة [257]. نهج آخر هو استهداف الطفرات الجينية التي تكون محددة لخلايا السرطان. يمكن القيام بذلك عن طريق تصميم معدات كريسبر للتعرف على واستهداف تسلسلات جينية معينة مرتبطة بالسرطان [255]. على سبيل المثال، قام الباحثون بتطوير علاجات قائمة على كريسبر تستهدف طفرات معينة في جينات مثل KRAS، والتي تتعرض للطفرات بشكل شائع في العديد من أنواع السرطان [256]. يمكن أيضًا استخدام مجموعة من هذه الاستراتيجيات لاستهداف أنواع خلايا معينة لتوصيل كريسبر إلى موقع الورم [248]. على سبيل المثال، يستكشف الباحثون استخدام الجسيمات النانوية المصممة لاستهداف علامات سطحية معينة على خلايا السرطان وتحمل أيضًا معدات كريسبر [245]. يعد توصيل كريسبر إلى موقع الورم خطوة حاسمة في تطوير علاج السرطان القائم على كريسبر [248]. يعمل الباحثون على تطوير طرق جديدة وفعالة لتوصيل كريسبر إلى موقع الورم، بما في ذلك الناقلات الفيروسية، والجسيمات النانوية، والإكسوزومات [251]. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يزيد استهداف أنواع خلايا معينة، مثل خلايا السرطان، من كفاءة العلاج. بينما لا تزال هناك تحديات كبيرة يجب معالجتها، فإن إمكانيات علاج السرطان القائم على كريسبر في إحداث ثورة في علاج السرطان واضحة، وستساعد الأبحاث المستمرة في التغلب على هذه التحديات [255].

لدى تحرير الجينات القائم على كريسبر القدرة على إحداث ثورة في علاج السرطان من خلال استهداف الطفرات الجينية بدقة التي تحفز نمو الورم [258]. ومع ذلك، لا تزال هناك تحديات كبيرة يجب معالجتها قبل أن يمكن استخدام هذا
النهج بأمان وفعالية في العيادة [200]. واحدة من التحديات الرئيسية هي التصنيع وقابلية التوسع للخلايا المعدلة بواسطة كريسبر للاستخدام السريري [259]. يعد تصنيع الخلايا المعدلة بواسطة كريسبر للاستخدام في علاج السرطان عملية معقدة ومكلفة. الخطوة الأولى هي الحصول على الخلايا التي سيتم تعديلها، والتي يمكن الحصول عليها من المريض أو من خط خلايا. بمجرد الحصول على الخلايا، يجب تعديلها باستخدام معدات كريسبر. يتضمن ذلك عادةً توصيل معدات كريسبر، بما في ذلك RNAs الموجهة وإنزيمات كاس، إلى الخلايا باستخدام ناقل فيروسي أو جسيم نانوي [260]. ومع ذلك، لم يتم تحسين هذه العملية بالكامل بعد وهناك حاجة إلى مزيد من البحث للعثور على طرق فعالة من حيث التكلفة لإنتاج أعداد كبيرة من الخلايا المعدلة بواسطة كريسبر [261]. تعتبر قابلية التوسع أيضًا تحديًا رئيسيًا في تصنيع الخلايا المعدلة بواسطة كريسبر لعلاج السرطان [262]. الطرق الحالية لإنتاج الخلايا المعدلة بواسطة كريسبر لا تزال غير قادرة على إنتاج الأعداد الكبيرة من الخلايا المطلوبة للاستخدام السريري [258]. على سبيل المثال، إذا تم إنتاج الخلايا باستخدام ناقل فيروسي، فإن العملية محدودة بعدد الخلايا التي يمكن أن تصاب في وقت واحد [263]. بالإضافة إلى ذلك، فإن الطرق الحالية لإنتاج الخلايا المعدلة بواسطة كريسبر لا تزال غير قادرة على إنتاج خلايا بكفاءة عالية بما يكفي لتكون ذات صلة سريرية [264]. هناك عدد من الحلول المحتملة لهذه التحديات. يعمل الباحثون على تطوير طرق أكثر كفاءة وفعالية من حيث التكلفة لإنتاج الخلايا المعدلة بواسطة كريسبر، مثل استخدام الإكسوزومات كوسيلة توصيل، وتحسين قابلية التوسع للعملية [265]. بالإضافة إلى ذلك، يعمل الباحثون على تحسين كفاءة عملية تحرير كريسبر وتقليل مخاطر الآثار الجانبية غير المستهدفة [200]. حل محتمل آخر لتحدي قابلية التوسع هو استخدام خطوط خلايا تم تعديلها جينيًا لإنتاج أعداد كبيرة من الخلايا المعدلة بواسطة كريسبر [259]. على سبيل المثال، قام الباحثون بتطوير خطوط خلايا تعبر بشكل مستقر عن إنزيمات كاس، والتي يمكن استخدامها لإنتاج أعداد كبيرة من الخلايا المعدلة بواسطة كريسبر [260]. بالإضافة إلى ذلك، يستكشف الباحثون استخدام خلايا جذعية كمصدر للخلايا المعدلة بواسطة كريسبر [264]. تمتلك الخلايا الجذعية القدرة على التجدد الذاتي والتمايز إلى مجموعة واسعة من أنواع الخلايا، مما يجعلها خيارًا جذابًا لإنتاج أعداد كبيرة من الخلايا المعدلة بواسطة كريسبر لعلاج السرطان. منطقة أخرى من البحث النشط هي تطوير منصات آلية لإنتاج الخلايا المعدلة بواسطة كريسبر. يمكن أن تقوم هذه المنصات بأتمتة العديد من الخطوات اليدوية المتضمنة في إنتاج الخلايا المعدلة بواسطة كريسبر، مما يجعل العملية أكثر كفاءة وفعالية من حيث التكلفة [200]. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام هذه المنصات لتحسين الظروف لإنتاج الخلايا المعدلة بواسطة كريسبر، مثل كمية إنزيمات كاس وRNAs الموجهة المستخدمة [259]. أخيرًا، يستكشف الباحثون استخدام توصيل كريسبر في الموقع.
الآلات، التي تسمح بتحرير الخلايا مباشرة في بيئة الورم الدقيقة [261]. تتجنب هذه الطريقة الحاجة إلى إنتاج وتوصيل أعداد كبيرة من الخلايا المعدلة باستخدام كريسبر، وقد تتغلب على تحديات القابلية للتوسع [264]. ومع ذلك، لا تزال هذه الطريقة في مراحلها الأولى من التطوير وتحتاج إلى مزيد من البحث لتحسين فعاليتها وسلامتها [260]. مثال واحد هو استخدام الإكسوزومات كطريقة توصيل لآلات كريسبر [264]. الإكسوزومات هي حويصلات صغيرة يتم إفرازها بشكل طبيعي بواسطة الخلايا ويمكن استخدامها لتوصيل مجموعة متنوعة من الجزيئات، بما في ذلك آلات كريسبر، إلى الخلايا المستهدفة [261]. أظهر الباحثون أن الإكسوزومات يمكن استخدامها لتوصيل آلات كريسبر إلى خلايا السرطان بكفاءة عالية وسمية منخفضة. يتم تطوير هذه الطريقة بشكل أكبر كحل محتمل لتحدي القابلية للتوسع. مثال آخر هو استخدام خطوط الخلايا التي تم تعديلها وراثيًا لإنتاج أعداد كبيرة من الخلايا المعدلة باستخدام كريسبر [264]. طور الباحثون خطوط خلايا تعبر بشكل مستقر عن إنزيمات كاس ويمكن استخدامها لإنتاج أعداد كبيرة من الخلايا المعدلة باستخدام كريسبر. يتم تطوير هذه الطريقة بشكل أكبر كحل محتمل لتحدي القابلية للتوسع. مثال آخر هو تطوير منصات آلية لإنتاج خلايا معدلة باستخدام كريسبر. تقوم هذه المنصات بأتمتة العديد من الخطوات اليدوية المتضمنة في إنتاج خلايا معدلة باستخدام كريسبر، مما يجعل العملية أكثر كفاءة وفعالية من حيث التكلفة. يتم تطوير هذه الطريقة بشكل أكبر كحل محتمل لتحدي القابلية للتوسع [200]. أخيرًا، هناك أمثلة على الأبحاث حول توصيل آلات كريسبر في الموقع [260]. طور الباحثون طرقًا لتوصيل آلات كريسبر مباشرة إلى خلايا السرطان في بيئة الورم الدقيقة [261]. تتجنب هذه الطريقة الحاجة إلى إنتاج وتوصيل أعداد كبيرة من الخلايا المعدلة باستخدام كريسبر، وقد تتغلب على تحديات القابلية للتوسع [264]. لا تزال هذه الطريقة في مراحلها الأولى من التطوير وتحتاج إلى مزيد من البحث لتحسين فعاليتها وسلامتها [259]. إن تصنيع وتوسيع نطاق الخلايا المعدلة باستخدام كريسبر للاستخدام السريري هو تحدٍ رئيسي يجب التغلب عليه لكي تصبح العلاجات القائمة على كريسبر خيارًا سريريًا قابلاً للتطبيق [261]. يعمل الباحثون على تطوير طرق أكثر كفاءة وفعالية من حيث التكلفة لإنتاج خلايا معدلة باستخدام كريسبر، مثل استخدام الإكسوزومات كطريقة توصيل، وتحسين القابلية للتوسع باستخدام خطوط خلايا معدلة وراثيًا أو خلايا جذعية، وتطوير منصات آلية وطرق توصيل في الموقع [200].

تشير التحقيقات في تحرير الجينات القائم على كريسبر لعلاج السرطان، كما تم توضيحه في هذا التحليل الشامل، إلى تحول كبير في استراتيجياتنا لمكافحة السرطان. إن قدرات كريسبر في
التعامل مع الخصائص المعقدة للسرطان من خلال التعديلات الجينية المستهدفة كبيرة. تشير الأساليب بما في ذلك تعطيل الجينات التي تعزز نمو الورم، وزيادة استجابة الجسم المناعية لخلايا السرطان، وتصحيح الشذوذات الجينية التي تؤدي إلى السرطان، ومهاجمة الأورام مباشرة باستخدام عوامل سامة، إلى مسارات واعدة في مجال العلاجات السرطانية. بدأت الأبحاث في مراحلها المبكرة والتجارب السريرية تكشف عن فعالية وإمكانات كريسبر التحويلية في سياق علاج السرطان. لم تسفر هذه التحقيقات عن نتائج واعدة فحسب، بل أوضحت أيضًا المسار الذي أمامنا. ومع ذلك، هناك عقبات ملحوظة يجب التغلب عليها. دقة كريسبر، وهي أكبر ميزة له، تثير القلق بشأن التأثيرات الجينية غير المقصودة، المعروفة باسم التأثيرات غير المستهدفة. تكمن الأهمية القصوى في ضمان أمان ودقة تدخلات كريسبر، مما يتطلب بحثًا مستمرًا لمعالجة هذه المخاوف. إن توصيل مكونات كريسبر إلى خلايا الورم يمثل تحديًا كبيرًا آخر. من الضروري تطوير طرق فعالة وآمنة لتوصيل هذه المكونات للاستخدام العملي لكريسبر في علاج السرطان. يتعزز هذا التحدي بسبب تنوع أنواع الأورام والتعقيد الكامن في البيولوجيا البشرية. ومع ذلك، فإن المستقبل المحتمل لكريسبر في علاج السرطان واعد بشكل استثنائي. مع التقدم المستمر في الأبحاث التي تتجاوز الحواجز الحالية، هناك إمكانية ملموسة لإنشاء علاجات أكثر كفاءة، مخصصة، وأقل تدخلاً لعلاج السرطان. يمكن أن تحول هذه التقدمات بشكل جذري النهج تجاه رعاية السرطان، من العلاج الكيميائي التقليدي والإشعاع إلى علاجات جينية محددة. تقدم منهجية كريسبر استراتيجية مبتكرة وقد تكون مغيرة لقواعد اللعبة في علاج السرطان. الرحلة المقبلة مليئة بالعقبات، مثل ضمان سلامة ودقة وكفاءة توصيل العلاجات. على الرغم من هذه التحديات، فإن التقدم المحرز حتى الآن واعد. إن التحقيق والتطوير المستمر في هذا المجال أمران حاسمان لاستغلال قدرات العلاجات القائمة على كريسبر بالكامل في مكافحة السرطان. من المهم مواجهة هذه التحديات مباشرة، مع التركيز على تحسين الأساليب، وتحسين أنظمة التوصيل، وإعطاء الأولوية لسلامة المرضى، من أجل استغلال الإمكانات الثورية لهذه التكنولوجيا في رعاية السرطان.

مستقبل العلاج بالسرطان القائم على كريسبر واعد، مع إمكانيات هائلة لعلاجات مخصصة وفعالة، لكنه يتطلب جهودًا متعددة التخصصات، واعتبارات أخلاقية، وتعاون دولي لضمان ترجمته الناجحة إلى الممارسة السريرية [266]. تقدم الجدول 5 الاتجاهات المستقبلية للعلاج بالسرطان القائم على كريسبر. علاوة على ذلك، استكشاف المناطق غير المشفرة من الجينوم وتطبيق شاشات كريسبر على

تحديد أهداف علاجية جديدة تقدم طرقًا واعدة لتقدم العلاج. يوضح الشكل 9 الجوانب الوظيفية المختلفة لمؤثرات كريسبر المتنوعة وتطبيقاتها في الفحوصات على نطاق الجينوم. يمكن أن يعزز دمج تقنية كريسبر مع تقنيات التصوير والاستشعار الناشئة من مراقبة وتتبع نتائج العلاج [267]. ستسرع الجهود التعاونية بين الأكاديميا والصناعة
تطوير الأدوية وتعزيز فرص الترجمة الأكثر كفاءة [266]. علاوة على ذلك، فإن دمج التدخلات المعتمدة على كريسبر مع علاجات أخرى في نهج تآزري يستحق الاستكشاف، بينما ستساعد أدوات التشخيص المعتمدة على كريسبر في الكشف المبكر عن السرطان وتشخيصه [268]. يمكن الاستفادة من تقنية تحرير الجينات لتطوير لقاحات سرطان شخصية وتحسين استجابة العلاج المناعي. من حيث التأثير الاجتماعي
هناك حاجة إلى الوصول العادل إلى العلاج المعتمد على كريسبر للسرطان لضمان استفادة جميع المرضى من هذه التقدمات، بغض النظر عن خلفياتهم أو مواقعهم. يتطلب ذلك التعاون الدولي في إنشاء أطر تنظيمية لتقنية تحرير الجينات وتعزيز الفهم العام وقبول هذه العلاجات من خلال التعليم والتوعية [269]. تشمل أولويات البحث الأخرى دراسة آثار تحرير الجينات باستخدام كريسبر على الميكروبيئة الورمية والجهاز المناعي، ومعالجة التمييز الجيني ومخاوف الخصوصية المتعلقة بتحرير الجينات، وتقييم السلامة والفعالية على المدى الطويل للعلاج المعتمد على كريسبر للسرطان [18]. أخيرًا، فإن تطوير أنظمة تحرير الجينات باستخدام كريسبر للأورام النادرة أو الصعبة العلاج، واستغلال تقنية النانو لتوصيل كريسبر المستهدف، وإنشاء قواعد بيانات لتبادل البيانات أمر حاسم لدفع حدود العلاج المعتمد على كريسبر للسرطان [270]. تعتبر الشراكات بين القطاعين العام والخاص والتعاون بين الأطباء والباحثين أساسية في تحسين تصميم العلاج وتوصيله لتحقيق نتائج أفضل للمرضى [267].

يواصل الباحثون استكشاف وتحسين أنظمة التوصيل المختلفة، مما يقربنا من تحقيق الإمكانات الكاملة لتقنية كريسبر في علم الأورام [275]. تشمل التحديات الرئيسية في العلاج المعتمد على كريسبر للسرطان باستخدام الفيروسات المرتبطة بالأدينوفيروس (AAVs) كناقلات فيروسية تحقيق توصيل محدد وفعال لمكونات كريسبر إلى خلايا الورم. لمعالجة هذه التحديات، يستكشف الباحثون تعديلات مختلفة على AAVs لتعزيز قدرات استهداف الورم، وزيادة امتصاص الخلايا، والتغلب على استجابة الجهاز المناعي للجسم [276]. بالإضافة إلى ذلك، فإن تطوير استراتيجيات للحد من آثار المواقع غير المستهدفة وتحسين الجرعة وطريقة الإدارة أمر ضروري. توفر الحويصلات الدهنية نهجًا واعدًا لتوصيل مكونات كريسبر، حيث يمكنها احتواء الآلات الخاصة بكريسبر، مما يحميها من التحلل ويحسن الاستقرار [277]. علاوة على ذلك، يمكن تعديل الحويصلات الدهنية مع جزيئات استهداف للارتباط بشكل محدد مع خلايا السرطان، مما يعزز من خصوصيتها [278]. لتحسين الفعالية، يقوم الباحثون بتحسين حجم الحويصلات الدهنية، والشحنة، والتعديلات السطحية لتحسين امتصاص الخلايا والهروب من الحويصلات، مما يضمن الإفراج الفعال عن مكونات كريسبر داخل خلايا الورم [279]. السلامة أمر بالغ الأهمية في العلاجات المعتمدة على كريسبر باستخدام ناقلات فيروسية مثل AAVs. يجب على الباحثين التأكد من أن AAVs المعدلة لا تسبب استجابات مناعية غير مقصودة أو تندمج في الجينوم المضيف في مواقع غير مرغوب فيها [280]. يمكن أن يحد استخدام المحفزات المحددة للأنسجة والمعززات المحددة للخلايا المستهدفة من آثار المواقع غير المحددة [281]. علاوة على ذلك، فإن الدراسات السريرية الصارمة والتجارب السريرية ضرورية لتقييم
سلامة وفعالية العلاجات المعتمدة على كريسبر باستخدام AAV [277]. توفر الجسيمات النانوية المصنوعة من البوليمرات أو المواد غير العضوية طرقًا بديلة لتوصيل مكونات كريسبر. يمكن تصميم هذه الجسيمات النانوية بخصائص فيزيائية كيميائية مختلفة، والتي قد تؤثر على امتصاص الخلايا وسرعة الإفراج [244]. بينما تتمتع الحويصلات الدهنية بمزايا في الاحتواء والتعديل، قد توفر الجسيمات النانوية الأخرى استقرارًا أفضل أو لديها قدرات فريدة للتوصيل المستهدف [282]. تمتلك الببتيدات المخترقة للخلايا والإكسوسومات القدرة على تحسين توصيل كريسبر [254]. يمكن للباحثين استكشاف التعديلات السطحية لهذه الأنظمة التوصيلية لزيادة ارتباطها المحدد للورم وامتصاصها [279]. بالإضافة إلى ذلك، فإن تحسين تحميل الحمولة وآليات الإفراج يمكن أن يعزز التحرير الدقيق للجينات المستهدفة مع تقليل الآثار غير المرغوب فيها [283].

يتضمن نهج مشجع دمج تحرير الجينات المعتمد على كريسبر مع علاجات السرطان الأخرى مثل العلاج المناعي أو العلاج الكيميائي [284]. أظهرت التحقيقات ما قبل السريرية نتائج واعدة من خلال دمج تحرير الجينات المعتمد على كريسبر مع العلاج المناعي أو العلاج الكيميائي في علاج السرطان. توضح الشكل 10 تطبيق كريسبر في علم الأورام المناعي. على سبيل المثال، أدى تعطيل جين PD-1 باستخدام كريسبر-كاس9 داخل خلايا السرطان إلى زيادة كبيرة في عدد خلايا المناعة القاتلة للسرطان [285]. بالإضافة إلى ذلك، أظهر تطبيق كريسبر-كاس9 جنبًا إلى جنب مع العلاج الكيميائي إمكانيات في استهداف خلايا السرطان المقاومة للعلاج الكيميائي [285]. يوفر دمج تحرير الجينات المعتمد على كريسبر مع العلاج المناعي أو العلاج الكيميائي العديد من الفوائد المحتملة. أولاً، قد يؤدي ذلك إلى تحسين فعالية العلاج حيث يمكن لكريسبر استهداف طفرات جينية محددة مرتبطة بالسرطان، مما يعزز دقة علاج السرطان [286]. ثانيًا، يمكن أن يعزز دمج كريسبر مع العلاج المناعي استجابة الجسم المناعية ضد خلايا السرطان، مما يزيد من فرص انكماش الورم [287]. ثالثًا، يمكن أن يساعد استخدام كريسبر جنبًا إلى جنب مع العلاج الكيميائي في التغلب على مقاومة الأدوية، مما يحسن فعالية العلاج الكيميائي في مكافحة خلايا السرطان [288]. حاليًا، تظل العلاجات المركبة المعتمدة على كريسبر في المراحل ما قبل السريرية، ولا يزال يتعين إثبات فعاليتها في البشر بشكل كامل [284]. في المستقبل، قد تعالج التقدم في آليات التسليم وتقنيات تحرير الجينات الدقيقة بعض هذه القيود، مما يجعل العلاجات المركبة المعتمدة على كريسبر خيارًا أكثر قابلية للتطبيق لعلاج السرطان [286]. تعتبر التجارب السريرية الدقيقة ضرورية للتحقق من سلامة وفعالية هذه الأساليب قبل أن يمكن تنفيذها في رعاية السرطان القياسية [287].

استهداف عدة جينات باستخدام تحرير الجينات القائم على تقنية كريسبر يظهر وعدًا هائلًا في علاجات السرطان المعقدة، مما يقدم فوائد محتملة في تراجع الأورام ومكافحة مقاومة الأدوية [289]. ومع ذلك، فإنه يثير أيضًا مخاوف تتعلق بالسلامة ويواجه تحديات في الترجمة السريرية. يجب أن تستمر جهود البحث في تحسين وتنقيح هذه التقنية لفائدة مرضى السرطان في جميع أنحاء العالم [290]. لقد أظهرت تقنية تحرير الجينات القائمة على كريسبر قدرات واعدة في استهداف عدة جينات في وقت واحد لعلاج السرطان [289]. وقد أظهر الباحثون فعاليتها في التجارب السريرية السابقة لسرطان الرئة، حيث استهدفت عدة جينات متحورة بشكل شائع باستخدام كريسبر-كاس9، مما أدى إلى تراجع الورم. وهذا يشير إلى أن تقنية كريسبر لديها القدرة على معالجة الطفرات الجينية المعقدة التي تسهم في تطور السرطان [290]. لقد تم استخدام كريسبر-كاس9 بنجاح لمكافحة مقاومة الأدوية في خلايا السرطان من خلال استهداف عدة جينات في وقت واحد. من خلال تحرير الجينات المسؤولة عن مقاومة الأدوية، قام الباحثون بزيادة حساسية خلايا السرطان للعلاج الكيميائي، مما يوفر حلاً محتملاً للسرطانات المقاومة للأدوية [291]. بينما تظهر تقنية تحرير الجينات القائمة على كريسبر وعدًا، هناك بعض المخاوف المتعلقة بالسلامة
يجب النظر في آثار المواقع غير الانتقائية، حيث يقوم CRISPR-Cas9 بتحرير جينات غير مقصودة، مما قد يؤدي إلى عواقب غير متوقعة. هناك حاجة إلى أبحاث واسعة وإجراءات أمان صارمة لتقليل هذه المخاطر وضمان التطبيق الآمن لتقنية CRISPR في علاجات السرطان. قد تختلف فعالية تحرير الجينات المعتمد على CRISPR في استهداف جينات متعددة بين أنواع السرطان المختلفة. يتميز كل نوع من أنواع السرطان بطفرات جينية فريدة، مما يتطلب نهجًا مخصصًا.

يقدم تحرير الجينات القائم على تقنية كريسبر (CRISPR) طريقًا واعدًا للعلاجات الشخصية للسرطان. ومع ذلك، فإن التقييم الشامل لجوانبه التقنية والأخلاقية وإمكانية الوصول إليه أمر بالغ الأهمية لاستغلال إمكاناته بأمان وفعالية لصالح المرضى. يعد تحرير الجينات القائم على كريسبر أداة ثورية تتيح للعلماء تعديل جينات معينة بدقة في الحمض النووي لكائن حي. يستخدم نظام كريسبر-كاس9، الأكثر شهرة، RNA دليلاً لاستهداف جين معين، ويعمل إنزيم كاس9 كالمقصات الجزيئية لقطع الحمض النووي في ذلك الموقع. يمكن بعد ذلك إصلاح هذا الانقطاع، مما يؤدي إما إلى تعطيل الجين أو تحرير الجين بدقة.

في العلاجات الشخصية للسرطان، يمكن استخدام CRISPR-Cas9 لاستهداف وتصحيح الطفرات الجينية المسؤولة عن تطور السرطان. من خلال تحديد الطفرات الجينية المحددة التي تسبب السرطان، يمكن للعلماء تصميم نهج مخصص لتصحيح أو تعطيل هذه الطفرات، مما يوقف فعليًا نمو السرطان. بينما يحمل تحرير الجينات القائم على CRISPR وعدًا هائلًا للطب الشخصي، يجب تقييم العديد من التحديات والمخاطر بعناية. تعتبر التأثيرات غير المستهدفة مصدر قلق كبير، حيث قد يقوم CRISPR بتحرير أجزاء أخرى من الجينوم بشكل غير مقصود، مما قد يؤدي إلى مشاكل صحية جديدة أو تعزيز تطور السرطان. ضمان خصوصية ودقة استهداف CRISPR هو جانب حاسم من تطبيقه الآمن. بالإضافة إلى ذلك، يجب تحسين طريقة توصيل مكونات CRISPR إلى الجسم لضمان استهداف فعال لخلايا السرطان دون التسبب في أضرار غير ضرورية للأنسجة السليمة. يجب أيضًا مناقشة وتنظيم الاعتبارات الأخلاقية، مثل تحرير السلالة الجرثومية، بشكل شامل لتجنب العواقب غير المقصودة. اعتبارًا من التاريخ الحالي، توجد عدة علاجات شخصية للسرطان تعتمد على CRISPR في مراحل مختلفة من التجارب السريرية وما قبل السريرية. بينما تعتبر الدراسات ما قبل السريرية الناجحة في الورم الأرومي الشبكي واللوكيميا واعدة، من الضروري فهم أن الانتقال من الإعدادات ما قبل السريرية إلى السريرية يمكن أن يقدم تحديات جديدة. تعتبر التجارب السريرية الصارمة ضرورية لتقييم سلامة وفعالية هذه العلاجات في المرضى البشر. لجعل العلاجات الشخصية للسرطان المعتمدة على CRISPR متاحة على نطاق واسع، يجب أخذ عدة عوامل بعين الاعتبار. أولاً، يجب أن تركز جهود البحث والتطوير على تحسين كفاءة ودقة وسلامة نظام CRISPR. يمكن أن يؤدي تبسيط عمليات تصنيع وتوصيل مكونات CRISPR أيضًا إلى تقليل التكاليف وزيادة الوصول. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تسهل التعاونات بين الأوساط الأكاديمية والصناعة والسلطات التنظيمية ترجمة نتائج البحث إلى علاجات معتمدة. لضمان الوصول العادل، يحتاج صانعو السياسات ومقدمو الرعاية الصحية إلى العمل معًا لتطوير استراتيجيات لدمج الطب الشخصي، بما في ذلك العلاجات المعتمدة على CRISPR، في أنظمة الرعاية الصحية الحالية.

تعتبر القابلية الاصطناعية المستندة إلى كريسبر واعدة كاستراتيجية مبتكرة لعلاج السرطان، حيث تقدم نهجًا أكثر استهدافًا وفعالية محتملة لمكافحة السرطان. ومع ذلك، هناك حاجة إلى مزيد من البحث والتجارب السريرية لتقييم سلامتها وفعاليتها بشكل كامل قبل أن يمكن تنفيذها على نطاق واسع في علاجات السرطان. تشير القابلية الاصطناعية إلى ظاهرة حيث يؤدي التعطيل المتزامن لاثنين أو أكثر من الجينات المحددة إلى وفاة السرطان المستهدف.
الخلايا، مع الحفاظ على الخلايا الطبيعية [304]. في سياق تحرير الجينات المعتمد على كريسبر، تتضمن هذه الطريقة استخدام كريسبر-كاس9 لاستهداف جينين يتم تحويرهما بشكل متكرر في السرطان، مستغلين نقاط الضعف الجينية للسرطان [305]. تتمتع العلاجات السرطانية المعتمدة على القتل الاصطناعي بميزة استهداف خلايا السرطان بشكل انتقائي مع طفرات جينية محددة، مما يقلل من خطر إلحاق الضرر بالخلايا السليمة. يمكن أن تؤدي هذه الطريقة إلى علاجات أكثر فعالية ودقة مع آثار جانبية أقل من العلاجات التقليدية مثل العلاج الكيميائي والإشعاعي [304]. استهدف الباحثون تركيبات جينية مثل BRCA1 وBRCA2، التي توجد غالبًا في حالة تحور في سرطان الثدي والمبيض، وPARP1 وBRCA1، التي تتكرر فيها الطفرات في سرطان الثدي [303]. من خلال تعطيل هذه الأزواج الجينية في وقت واحد، فإنهم يحفزون القتل الاصطناعي في خلايا السرطان [302]. أظهرت الدراسات التجريبية إمكانيات القتل الاصطناعي المعتمد على كريسبر كاستراتيجية لعلاج السرطان [304]. من خلال استهداف تركيبات جينية محددة في خلايا السرطان، لاحظ الباحثون انخفاضات كبيرة في نمو الورم وحيوية الخلايا في النماذج قبل السريرية، مما يشير إلى إمكانيته كنهج علاجي واعد [303]. أحد التحديات الرئيسية هو توصيل مكونات كريسبر إلى موقع الورم بكفاءة [302]. كما أن ضمان الاستهداف الدقيق وآثار المواقع غير الانتقائية هي أيضًا مخاوف مهمة. بالإضافة إلى ذلك، فإن تحديد تركيبات جينية مناسبة لأنواع السرطان المحددة وضمان السلامة أثناء الترجمة السريرية هي اعتبارات حيوية [303].

تشمل علاج خلايا CAR-T تعديل خلايا T الخاصة بالمريض باستخدام تقنيات الهندسة الوراثية للتعبير عن مستقبلات المستضدات الهجينة (CARs) على سطحها. تمكن هذه المستقبلات خلايا T من التعرف على البروتينات المحددة، أو المستضدات، الموجودة على خلايا السرطان، مما يؤدي إلى تدميرها. يوفر تحرير الجينات المعتمد على CRISPR إمكانية تعديل خلايا T بدقة، مما يعزز قدراتها على الاستهداف. من خلال استخدام CRISPRCas9، يمكن تغيير أو إدخال جينات محددة في خلايا T، مما يمكنها من التعرف على بروتين معين معبر عنه على أنواع مختلفة من خلايا السرطان. تزيد هذه الطريقة من كفاءة وفعالية علاج خلايا CAR-T. تواجه علاج خلايا CAR-T تحديات مثل متلازمة إطلاق السيتوكينات (CRS) والسمية العصبية، وهي آثار جانبية ناتجة عن تفعيل خلايا T. إدارة هذه الأحداث السلبية أمر حاسم للتنفيذ الآمن والناجح لعلاج خلايا CAR-T. بالإضافة إلى ذلك، لا يزال تصنيع خلايا CAR-T على نطاق واسع وبسعر معقول يمثل تحديًا. لقد أظهر علاج خلايا CAR-T نجاحًا ملحوظًا في بعض أنواع سرطانات الدم، مثل اللوكيميا اللمفاوية الحادة.
وورم ليمفوما غير هودجكين [310]. وقد أفادت التجارب السريرية بمعدلات استجابة عالية وحتى شفاء دائم في بعض المرضى [308]. ومع ذلك، فإن فعاليته في الأورام الصلبة لا تزال منطقة بحث وتطوير مهمة [307]. الآثار الجانبية طويلة الأمد لعلاج خلايا CAR-T لم تُفهم بالكامل بعد، حيث إن العلاج جديد نسبيًا [311]. ومع ذلك، تشمل بعض المخاوف المحتملة استمرار خلايا CAR-T في الجسم، والآثار الجانبية غير الانتقائية للتعديلات الجينية، وتأثيرها على وظيفة المناعة الطبيعية [312]. لمعالجة تحديات التصنيع، تُبذل جهود لتحسين وتبسيط عملية الإنتاج، بما في ذلك الأتمتة وتقليل الوقت والتكلفة المعنية [308]. علاوة على ذلك، يمكن أن يساعد إنشاء مراكز متخصصة مزودة بالخبرة والبنية التحتية في معالجة التحديات اللوجستية المرتبطة بعلاج خلايا CAR-T [307]. تشمل القيود الحالية التكلفة العالية للعلاج، والوصول المحدود بسبب المتطلبات المتخصصة، والحاجة إلى العلاج المخصص.
تصنيع لكل مريض [310]. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تتأثر فعالية علاج خلايا CAR-T بعوامل مثل هروب المستضد، وتنوع الورم، والبيئة الدقيقة المثبطة للمناعة للورم [313]. توضح الشكل 11 التلاعب خارج الجسم باستخدام CRISPR لخلايا T البشرية لعلاج خلايا T بالتبني.

لقد أظهرت مجموعة من تحرير الجينات المعتمدة على كريسبر مع علاج الخلايا الجذعية نتائج واعدة في علاج الأمراض الوراثية، مثل فقر الدم المنجلي. من خلال استخدام كريسبر-كاس9 لتصحيح الطفرة الجينية المحددة المسؤولة عن المرض في خلايا الدم الجذعية، تمكن الباحثون من إنتاج خلايا دم مصححة. لقد أظهر زرع هذه الخلايا الجذعية المصححة في جسم المريض إمكانية في استعادة خلايا دم صحية، مما يخفف من أعراض فقر الدم المنجلي.

تثير العلاجات بالخلايا الجذعية مخاوف بشأن الآثار الجانبية غير الانتقائية، حيث قد تحدث تعديلات جينية غير مقصودة. إن ضمان دقة تحرير CRISPR-Cas9 أمر بالغ الأهمية لمنع العواقب السلبية المحتملة. يحتاج الباحثون إلى تقييم والتحقق بدقة من خصوصية عملية تحرير الجينات قبل المضي قدمًا في زراعة الأنسجة. بالإضافة إلى ذلك، هناك حاجة إلى دراسات طويلة الأمد لمراقبة استقرار الخلايا الجذعية المصححة وأي آثار غير مقصودة محتملة على صحة المريض. تعتمد قابلية توسيع هذا النهج على عدة عوامل، بما في ذلك سهولة تحرير الجينات، وتوافر خلايا جذعية محددة للمرضى، والقدرة على إنتاج كميات كافية من الخلايا المصححة للزراعة. تساهم التقدمات في تكنولوجيا CRISPR وبحوث الخلايا الجذعية في تحسين قابلية التوسع باستمرار. ومع ذلك، قد تحد التحديات مثل توصيل مكونات CRISPR بكفاءة إلى الخلايا الجذعية وتكلفة العلاجات الشخصية من تنفيذها على نطاق واسع. يثير استخدام تحرير الجينات القائم على CRISPR في علاج الخلايا الجذعية اعتبارات أخلاقية. تشمل المخاوف إمكانية حدوث تغييرات جينية غير مقصودة قد تؤثر على الأجيال المستقبلية إذا تم تحرير خلايا الجرثومة. يجب على الباحثين الالتزام بإرشادات وقوانين أخلاقية صارمة لضمان إجراء تحرير الجينات بشكل مسؤول، مع الشفافية الكاملة والموافقة المستنيرة من المرضى المشاركين في التجارب السريرية. يحمل الجمع بين تحرير الجينات القائم على CRISPR وعلاج الخلايا الجذعية وعدًا لعلاج مجموعة واسعة من الأمراض الجينية بخلاف فقر الدم المنجلي. يمكن أن تكون الاضطرابات الناتجة عن طفرات جينية فردية، مثل التليف الكيسي وأنواع معينة من ضمور العضلات، أهدافًا محتملة لهذا النهج. ومع ذلك، يقدم كل مرض تحديات فريدة ويتطلب تقييمًا دقيقًا لتحديد ملاءمته لتحرير الجينات القائم على CRISPR وعلاج الخلايا الجذعية.

يجمع الجمع بين تحرير الجينات المعتمد على كريسبر والعلاج الجيني الإيبيجينيتيكي بين نهج علاج أكثر استهدافًا ودقة [320]. بينما يمكن لكريسبر تعديل تسلسلات الحمض النووي المحددة مباشرة، يمكن للعلاج الإيبيجينيتيكي تغيير أنماط التعبير الجيني دون تغيير تسلسل الحمض النووي الأساسي. من خلال استخدام كلا التقنيتين معًا، يمكن للباحثين تعزيز التأثيرات العلاجية، حيث يوفر كريسبر استهدافًا دقيقًا للجينات، ويضمن العلاج الإيبيجينيتيكي تعديلات مستدامة ومتحكم بها على نشاط الجينات [321]. أحد التحديات الكبيرة هو ضمان التسليم الآمن والفعال لمكونات كريسبر والأدوية الإيبيجينيتيكية إلى الخلايا المستهدفة. يجب على العلماء تطوير أنظمة تسليم موثوقة يمكنها اختراق الخلايا بفعالية دون التسبب في مواقع غير انتقائية.
تأثيرات [322]. بالإضافة إلى ذلك، قد يكون من الصعب الحفاظ على تنظيم طويل الأمد لنشاط الجينات عبر العلاج الجيني بسبب العمليات الخلوية التي قد تعيد هذه التغييرات مع مرور الوقت. يحتاج الباحثون إلى تطوير استراتيجيات للحفاظ على التعديلات الجينية المستقرة والقابلة للتوريث [323]. التباين الجيني، حيث تظهر خلايا مختلفة داخل ورم أو مرض طفرات جينية مميزة، يشكل تحديًا للعلاجات المستهدفة [256]. يسمح الجمع بين تقنية كريسبر والعلاج الجيني للباحثين باستهداف طفرات معينة مع تجاوز أخرى [324]. يمكن برمجة كريسبر للتعرف على وتحرير طفرات معينة، بينما يمكن للعلاج الجيني كبح نشاط جينات معينة متحورة، مما يؤدي إلى علاج أكثر شمولاً وفعالية [325]. يثير الجمع بين هذه التقنيات القوية أسئلة أخلاقية حول الآثار الجانبية المحتملة غير الانتقائية، والعواقب غير المقصودة، وتحرير الخط الجرثومي [325]. يجب على الباحثين وصانعي السياسات ضمان الالتزام الصارم ببروتوكولات السلامة والاستخدام المسؤول لمنع التغيرات الجينية غير المقصودة [326]. بالإضافة إلى ذلك، يجب معالجة الوصول العادل إلى مثل هذه العلاجات والفجوات المحتملة في الرعاية الصحية لتجنب تفاقم الفوارق الاجتماعية [327]. كما هو الحال مع أي تقنية ناشئة، هناك قيود يجب أخذها في الاعتبار. يمكن أن يكون توصيل مكونات كريسبر والأدوية الجينية إلى أنسجة أو أعضاء معينة تحديًا [328]. تركز الأبحاث الجارية على تحسين طرق التوصيل وزيادة كفاءة الاستهداف [325]. علاوة على ذلك، يبقى فهم العواقب طويلة الأمد للتعديلات الجينية والآثار الجانبية المحتملة أولوية لمزيد من التحقيق لضمان سلامة وفعالية هذه العلاج المركب [327].

يقدم تحرير الجينات القائم على تقنية كريسبر نهجًا قيمًا لاكتشاف أهداف دوائية جديدة [329-331]. من خلال حذف أو تعديل الجينات داخل خلايا السرطان عمدًا، يمكن للعلماء ملاحظة أي الجينات حيوية لنمو هذه الخلايا وبقائها [332]. تم استهداف مجموعة متنوعة من الجينات باستخدام كريسبر-كاس9 في خلايا السرطان لتحديد أهداف دوائية محتملة. تشمل الأمثلة الجينات المسرطنة مثل MYC وKRAS وEGFR، بالإضافة إلى جينات مثبطة للورم مثل TP53 وPTEN [333]. يتم عادةً تقييم آثار حذف أو تعديل الجينات في خلايا السرطان باستخدام كريسبر-كاس9 من خلال مراقبة قدرة الخلايا على النمو والبقاء [48]. قد يقارن الباحثون معدلات نمو الخلايا التي تم حذف أو تعديل جينات معينة فيها بمعدلات نمو خلايا التحكم غير المعدلة [333]. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن توفر اختبارات بقاء الخلايا والتحليلات الجزيئية رؤى حول تأثير التغيرات الجينية على الوظائف الخلوية ومسارات الإشارات [329]. يتم عادةً تحديد أهمية الجين لنمو خلايا السرطان وبقائها من خلال تقييم تأثير حذفه أو
تعديل على بقاء الخلايا وتكاثرها [330، 333-336]. إذا كان فقدان أو تغيير جين ما يؤثر بشكل كبير على قدرة الخلايا على النمو والبقاء، فإن ذلك يشير إلى أن الجين يلعب دورًا حيويًا في دعم وظائف خلايا السرطان [332]. يوفر تحديد الجينات الحاسمة باستخدام تقنية كريسبر-كاس9 رؤى قيمة حول نقاط الضعف والاعتماديات في خلايا السرطان [48، 333، 335]. يمكن أن تُدرس الجينات التي وُجدت أنها ضرورية لنمو خلايا السرطان وبقائها كأهداف محتملة للأدوية [333]. قد يؤدي استهداف هذه الجينات بالأدوية إلى تعطيل العمليات الخلوية الحيوية، مما يؤدي إلى قتل أو قمع خلايا السرطان بشكل انتقائي مع تقليل الضرر على الخلايا الطبيعية [329، 331، 337، 338]. على الرغم من إمكانياتها، تواجه تقنية تحرير الجينات المعتمدة على كريسبر لتحديد أهداف الأدوية عدة تحديات [333]. يمكن أن تؤدي التأثيرات غير المستهدفة، وعدم اكتمال إلغاء الجين، والتكرار الوظيفي داخل المسارات الخلوية إلى تعقيد تفسير البيانات [333]. بالإضافة إلى ذلك، يتطلب تحويل النتائج المستندة إلى كريسبر إلى أهداف دوائية فعالة مزيدًا من التحقق من خلال الدراسات ما قبل السريرية والسريرية [48]. إن ضمان الخصوصية والفعالية والسلامة للأدوية التي تستهدف الجينات التي تم تحديدها حديثًا أمر حاسم للتنفيذ السريري الناجح [331، 333، 339].

نود أن نشكر مختبر نوفين جينوم (NG) فرع شاهركرد، مركز البحث والتطوير للتكنولوجيا الحيوية في جنوب غرب إيران على تعاونهم الكريم.

MCH، MK، MS، EM، FE، MR، AA، AM وMACH، البحث، التحليل، كتابة المسودة الأصلية، MCH: الكتابة، المراجعة. MCH وMACH: المراجعة، التحرير، MCH: المراجعة، التحرير والإشراف. جميع المؤلفين وافقوا على النسخة النهائية من المخطوطة.

يعلن المؤلفون أنه لم يتم تلقي أي تمويل للبحث.

غير قابل للتطبيق.

غير قابل للتطبيق.

غير قابل للتطبيق.

يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح متنافسة.

تاريخ الاستلام: 8 سبتمبر 2023 تاريخ القبول: 20 ديسمبر 2023
نُشر على الإنترنت: 09 يناير 2024

CRISPR/Cas9-mediated knock-in method in pancreatic cancer cell lines. Ann Oncol. 2021;32:S1356.
108. Annunziato S, de Ruiter JR, Henneman L, Brambillasca CS, Lutz C, Vaillant F, et al. Comparative oncogenomics identifies combinations of driver genes and drug targets in BRCA1-mutated breast cancer. Nat Commun. 2019;10(1). https://doi.org/10.1038/s41467-019-08301-2.
109. Weber J, Öllinger R, Friedrich M, Ehmer U, Barenboim M, Steiger K, et al. CRISPR/Cas9 somatic multiplex-mutagenesis for high-Throughput functional cancer genomics in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 2015;112(45):13982-7.
110. Yoshimatsu S, Nakajima M, Qian E, Sanosaka T, Sato T, Okano H. Homologous Recombination-Enhancing Factors Identified by Comparative Transcriptomic Analyses of Pluripotent Stem Cell of Human and Common Marmoset. Cells. 2022;11 (3). https://doi.org/10.3390/cells 11030360.
111. Choudhury SR, Cui Y, Lubecka K, Stefanska B, Irudayaraj J. CRISPR-dCas9 mediated TET1 targeting for selective DNA demethylation at BRCA1 promoter. Oncotarget. 2016;7(29):46545-56.
112. Kweon J, Jang AH, Shin HR, See JE, Lee W, Lee JW, et al. A CRISPR-based base-editing screen for the functional assessment of BRCA1 variants. Oncogene. 2020;39(1):30-5.
113. Lee W, Lee JH, Jun S, Lee JH, Bang D. Selective targeting of KRAS oncogenic alleles by CRISPR/Cas9 inhibits proliferation of cancer cells. Sci Rep. 2018;8(1). https://doi.org/10.1038/s41598-018-30205-2.
114. Bender G, Fahrioglu Yamaci R, Taneri B. CRISPR and KRAS: a match yet to be made. J Biomed Sci. 2021;28(1). https://doi.org/10.1186/ s12929-021-00772-0.
115. Zhao X, Liu L, Lang J, Cheng K, Wang Y, Li X, et al. A CRISPR-Cas13a system for efficient and specific therapeutic targeting of mutant KRAS for pancreatic cancer treatment. Cancer Lett. 2018;431:171-81.
116. Burgess MR, Hwang E, Mroue R, Bielski CM, Wandler AM, Huang BJ, et al. KRAS Allelic Imbalance Enhances Fitness and Modulates MAP Kinase Dependence in Cancer. Cell. 2017;168(5):817-829.e15.
117. Wang B, Krall EB, Aguirre AJ, Kim M, Widlund HR, Doshi MB, et al. ATXN1L, CIC, and ETS Transcription Factors Modulate Sensitivity to MAPK Pathway Inhibition. Cell Rep. 2017;18(6):1543-57.
118. Sayed S, Sidorova OA, Hennig A, Augsburg M, Cortés Vesga CP, Abohawya M, et al. Efficient Correction of Oncogenic KRAS and TP53 Mutations through CRISPR Base Editing. Cancer Res. 2022;82(17):3002-15.
119. Lentsch E, Li L, Pfeffer S, Ekici AB, Taher L, Pilarsky C, et al. CRISPR/Cas9mediated knock-out of krasG12D mutated pancreatic cancer cell lines. Int J Mol Sci. 2019;20(22). https://doi.org/10.3390/ijms20225706.
120. Wang Z, Kang B, Gao Q, Huang L, Di J, Fan Y, et al. Quadrupleediting of the MAPK and PI3K pathways effectively blocks the progression of KRAS-mutated colorectal cancer cells. Cancer Sci. 2021;112(9):3895-910.
121. Yamada T, Amann JM, Tanimoto A, Taniguchi H, Shukuya T, Timmers C, et al. Histone deacetylase inhibition enhances the antitumor activity of a MEK inhibitor in lung cancer cells harboring RAS mutations. Mol Cancer Ther. 2018;17(1):17-25.
122. Thompson KN, Whipple RA, Yoon JR, Lipsky M, Charpentier MS, Boggs AE, et al. The combinatorial activation of the PI3K and Ras/ MAPK pathways is sufficient for aggressive tumor formation, while individual pathway activation supports cell persistence. Oncotarget. 2015;6(34):35231-46.
123. Maitra R, Seetharam R, Tesfa L, Augustine TA, Klampfer L, Coffey MC, et al. Oncolytic reovirus preferentially induces apoptosis in KRAS mutant colorectal cancer cells, and synergizes with irinotecan. Oncotarget. 2014;5(9):2807-19.
124. Yang YP, Ma H, Starchenko A, Huh WJ, Li W, Hickman FE, et al. A Chimeric Egfr Protein Reporter Mouse Reveals Egfr Localization and Trafficking In Vivo. Cell Rep. 2017;19(6):1257-67.
125. Koo T, Yoon AR, Cho HY, Bae S, Yun CO, Kim JS. Selective disruption of an oncogenic mutant allele by CRISPR/Cas9 induces efficient tumor regression. Nucleic Acids Res. 2017;45(13):7897-908.
126. Kiessling MK, Schuierer S, Stertz S, Beibel M, Bergling S, Knehr J, et al. Identification of oncogenic driver mutations by genome-wide CRISPRCas9 dropout screening. BMC Genomics. 2016;17(1). https://doi.org/10. 1186/s12864-016-3042-2.
127. Park JJ, Kim JE, Jeon Y, Lee MR, Choi JY, Song BR, et al. Deletion of NKX3.1 via CRISPR/Cas9 Induces Prostatic Intraepithelial Neoplasia in

C57BL/6 Mice. Technol Cancer Res Treat. 2020;19. https://doi.org/10. 1177/1533033820964425.
128. Zhang BC, Luo BY, Zou JJ, Wu PY, Jiang JL, Le JQ, et al. Co-delivery of Sorafenib and CRISPR/Cas9 Based on Targeted Core-Shell Hollow Mesoporous Organosilica Nanoparticles for Synergistic HCC Therapy. ACS Appl Mater Interfaces. 2020;12(51):57362-72.
129. Chung SH, Frick SL, Yiu G. Targeting vascular endothelial growth factor using retinal gene therapy. Ann Transl Med. 2021;9(15):1277-1277.
130. Ameri H, Murat C, Arbabi A, Jiang W, Janga SR, Qin PZ, et al. Reduced expression of vegf-a in human retinal pigment epithelial cells and human muller cells following crispr-cas9 ribonucleoprotein-mediated gene disruption. Transl Vis Sci Technol. 2020;9(8). https://doi.org/10. 1167/TVST.9.8.23.
131. Hariprabu KNG, Sathya M, Vimalraj S. CRISPR/Cas9 in cancer therapy: A review with a special focus on tumor angiogenesis. Int J Biol Macromol. 2021;192:913-930.
132. Li XL, Li GH, Fu J, Fu YW, Zhang L, Chen W, et al. Highly efficient genome editing via CRISPR-Cas9 in human pluripotent stem cells is achieved by transient BCL-XL overexpression. Nucleic Acids Res. 2018;46(19):10195-215.
133. Abdul Rahman SF, Mohana-Kumaran N, Mohd Azzam MG, Mohd Norudin NA, Muniandy K. CRISPR/Cas9 Mediated BFL-1 Knock-out in Nasopharyngeal Carcinoma (NPC) Cell Lines. Front Pharmacol. 2018;9. https://doi.org/10.3389/conf.fphar.2018.63.00029.
134. Zhao W, Liu J, Wang D, Wang Y, Zhang F, Jin G, et al. Effect of silencing HIF-1 a gene on testicle spermatogenesis function in varicocele rats. Cell Tissue Res. 2019;378(3):543-54.
135. Fang N, Gu T, Wang Y, Wang S, Wang F, An Y, et al. Expression of PTENlong mediated by CRISPR/Cas9 can repress U87 cell proliferation. J Cell Mol Med. 2017;21(12):3337-46.
136. de Almeida Monteiro Melo Ferraz M, Nagashima JB, Venzac B, Le Gac S, Songsasen N. A dog oviduct-on-a-chip model of serous tubal intraepithelial carcinoma. Sci Rep. 2020;10(1). https://doi.org/10.1038/ s41598-020-58507-4.
137. Callif BL, Maunze B, Krueger NL, Simpson MT, Blackmore MG. The application of CRISPR technology to high content screening in primary neurons. Mol Cell Neurosci. 2017;80:170-9.
138. Heitink L, Whittle JR, Vaillant F, Capaldo BD, Dekkers JF, Dawson CA, et al. In vivo genome-editing screen identifies tumor suppressor genes that cooperate with Trp53 loss during mammary tumorigenesis. Mol Oncol. 2022;16(5):1119-31.
139. Xi L, Schmidt JC, Zaug AJ, Ascarrunz DR, Cech TR. A novel two-step genome editing strategy with CRISPR-Cas9 provides new insights into telomerase action and TERT gene expression. Genome Biol. 2015;16(1). https://doi.org/10.1186/s13059-015-0791-1.
140. James CD, Prabhakar AT, Otoa R, Evans MR, Wang X, Bristol ML, et al. SAMHD1 Regulates Human Papillomavirus 16-Induced Cell Proliferation and Viral Replication during Differentiation of Keratinocytes. mSphere. 2019;4(4). https://doi.org/10.1128/msphere.00448-19.
141. Zagorski JW, Maser TP, Liby KT, Rockwell CE. Nrf2-Dependent and -Independent Effects of tert-Butylhydroquinone, CDDO-Im, and H2O2 in Human Jurkat T Cells as Determined by CRISPR/Cas9 Gene Editing. J Pharmacol Exp Ther. 2017;361(2):259-67.
142. Cordeiro A, Deveau AP, Dhanraj S, Dror Y, Berman J. Characterizing Dyskeratosis Congenita Caused By Parn Mutations in the Zebrafish. Blood. 2019;134(Supplement_1):3744-3744.
143. Liu N, Xu S, Yao Q, Zhu Q, Kai Y, Hsu JY, et al. Transcription factor competition at the -globin promoters controls hemoglobin switching. Nat Genet. 2021;53(4):511-20.
144. Rui L. Abstract 3436: PRMT5 upregulation and its oncogenic cooperation with PI3K/AKT signaling in diffuse large B cell lymphoma. Cancer Res. 2019;79(13_Supplement):3436-3436.
145. Bonato A, Bomben R, Chakraborty S, Felician G, Martines C, Zucchetto A, et al. Chronic Lymphocytic Leukemia Cells with Mutated Nfkbie Are Positively Selected By Microenvironmental Signals and Display Reduced Sensitivity to Ibrutinib Treatment. Blood. 2021;138(Supplement 1):248-248.
146. Tagde A, Markert T, Rajabi H, Hiraki M, Alam M, Bouillez A, et al. Targeting MUC1-C suppresses polycomb repressive complex 1 in multiple myeloma. Oncotarget. 2017;8(41):69237-49.
147. Navarro-Guerrero E, Tay C, Whalley JP, Cowley SA, Davies B, Knight JC, et al. Genome-wide CRISPR/Cas9-knockout in human induced Pluripotent Stem Cell (iPSC)-derived macrophages. Sci Rep. 2021;11(1). https:// doi.org/10.1038/s41598-021-82137-z.
148. Hamada T, Akahane T, Yokoyama S, Higa N, Kirishima M, Matsuo K, et al. An oncogenic splice variant of PDGFRa in adult glioblastoma as a therapeutic target for selective CDK4/6 inhibitors. Sci Rep. 2022;12(1). https://doi.org/10.1038/s41598-022-05391-9.
149. Iacono D, Cinausero M, Gerratana L, Vitale MG, Basile D, Angione V, et al. Primary cutaneous melanoma in elderly patients: potential prognostic markers. Pigment Cell Melanoma Res. 2017;30(1):76-156.
150. Farrell J, Pietruska J, McRee S, Tsichlis P, Hinds P. Abstract PR14: Defining isoform-specific roles for AKTs in BRAFV600E-driven melanoma. Cancer Res. 2020;80(19_Supplement):PR14-PR14.
151. Kaulich M, Dowdy S. Abstract A10: A Cdk4-dependent phosphorylation threshold regulates the cell cycle entry decision. Mol Cancer Res. 2016;14(11_Supplement):A10-A10.
152. Frangoul H, Altshuler D, Cappellini MD, Chen Y-S, Domm J, Eustace BK, et al. CRISPR-Cas9 Gene Editing for Sickle Cell Disease and -Thalassemia. N Engl J Med. 2021;384(3):252-60.
153. PD-1 Knockout Engineered T Cells for Advanced Esophageal Cancer – ClinicalTrials.gov. https://classic.clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03 081715. Accessed 22 Jul 2023.
154. PD-1 Knockout EBV-CTLs for Advanced Stage Epstein-Barr Virus (EBV) Associated Malignancies – ClinicalTrials.gov. https://classic.clinicaltrials. gov/ct2/show/NCT03044743. Accessed 22 Jul 2023.
155. TACE Combined With PD-1 Knockout Engineered T Cell in Advanced Hepatocellular Carcinoma – ClinicalTrials.gov. 2020. http://www.clini caltrials.gov/ct2/show/NCT04417764.
156. Study of CRISPR-Cas9 Mediated PD-1 and TCR Gene-knocked Out Mesothelin-directed CAR-T Cells in Patients With Mesothelin Positive Multiple Solid Tumors- ClinicalTrials.gov. 2020. http://www.clinicaltrials. gov/ct2/show/NCT03545815.
157. CRISPR (HPK1) Edited CD19-specific CAR-T Cells (XYF19 CAR-T Cells) for CD19+ Leukemia or Lymphoma- ClinicalTrials.gov. 2019. https://classic. clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT04037566.
158. Safety and Efficacy of CT125A Cells for Treatment of Relapsed/Refractory CD5 + Hematopoietic Malignancies- ClinicalTrials.gov. 2021. http:// www.clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT04767308.
159. A Safety and Efficacy Study Evaluating CTX130 in Subjects With Relapsed or Refractory T or B Cell Malignancies (COBALT-LYM). 2021. http://www.clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT04502446.
160. Ishihara M, Nishida Y, Kitano S, Kawai A, Muraoka D, Momose F, et al. A phase 1 trial of NY-ESO-1-specific TCR-engineered T-cell therapy combined with a lymph node-targeting nanoparticulate peptide vaccine for the treatment of advanced soft tissue sarcoma. Int J Cancer. 2023;152(12):2554-66.
161. Kanwal B. Relapsed/Refractory Non-Hodgkin Lymphoma: Engineering T-Cells to Express Chimeric Antigen Receptors (CARs), a Salvage? Cureus. 2021. https://doi.org/10.7759/cureus.16307.
162. Fang C, Xiao G, Wang T, Song L, Peng B, Xu B, et al. Emerging Nano-/ Biotechnology Drives Oncolytic Virus-Activated and Combined Cancer Immunotherapy. Research. 2023;6. https://doi.org/10.34133/research. 0108.
163. Hölting TLB, Cidre-Aranaz F, Matzek D, Popper B, Jacobi SJ, Funk CM, et al. Neomorphic DNA-binding enables tumor-specific therapeutic gene expression in fusion-addicted childhood sarcoma. Mol Cancer. 2022;21(1). https://doi.org/10.1186/s12943-022-01641-6.
164. Malviya M, Aretz ZEH, Molvi Z, Lee J, Pierre S, Wallisch P, et al. Challenges and solutions for therapeutic TCR-based agents. Immunol Rev. 2023. https://doi.org/10.1111/imr.13233.
165. Chira S, Nutu A, Isacescu E, Bica C, Pop L, Ciocan C, et al. Genome Editing Approaches with CRISPR/Cas9 for Cancer Treatment: Critical Appraisal of Preclinical and Clinical Utility, Challenges, and Future Research. Cells. 2022;11(18). https://doi.org/10.3390/cells11182781.
166. Xu J, Chen LJ, Yang SS, Sun Y, Wu W, Liu YF, et al. Exploratory trial of a biepitopic CAR T-targeting B cell maturation antigen in relapsed/refractory multiple myeloma. Proc Natl Acad Sci U S A. 2019. https://doi.org/ 10.1073/pnas. 1819745116.
167. Feldman L, Brown C, Badie B. Chimeric Antigen Receptor T-Cell Therapy: Updates in Glioblastoma Treatment. Neurosurgery. 2021;88(6):1056-64.
168. Lin Y, Ying H, Shao L, Liu Q, Song M, Chen S. Safety and Efficacy of CRISPR/CAS9-Edited PD-1 Deficient CAR-T Cells in MUC1 Positive Advanced Esophageal Cancer. SSRN Electron J. 2023. https://doi.org/10. 2139/ssrn. 4316844.
169. Choi SYC, Ribeiro CF, Wang Y, Loda M, Plymate SR, Uo T. Druggable Metabolic Vulnerabilities Are Exposed and Masked during Progression to Castration Resistant Prostate Cancer. Biomolecules. 2022;12(11). https://doi.org/10.3390/biom12111590.
170. Acharya UH, Walter RB. Chimeric antigen receptor (Car)-modified immune effector cell therapy for acute myeloid leukemia (aml). Cancers. 2020;12(12):1-28.
171. Zhen S, Li X. Oncogenic Human Papillomavirus: Application of CRISPR/ Cas9 Therapeutic Strategies for Cervical Cancer. Cell Physiol Biochem. 2018;44(6):2455-66.
172. Uras IZ, Moll HP, Casanova E. Targeting KRAS mutant non-small-cell lung cancer: Past, present and future. Int J Mol Sci. 2020;21(12):1-30.
173. Trigg RM, Turner SD. ALK in neuroblastoma: Biological and therapeutic implications. Cancers. 2018;10(4). https://doi.org/10.3390/cancers100 40113.
174. Anagnostou T, Riaz IB, Hashmi SK, Murad MH, Kenderian SS. AntiCD19 chimeric antigen receptor T-cell therapy in acute lymphocytic leukaemia: a systematic review and meta-analysis. Lancet Haematol. 2020;7(11):e816-26.
175. Andrea AE, Chiron A, Mallah S, Bessoles S, Sarrabayrouse G, Hacein-Bey-Abina S. Advances in CAR-T Cell Genetic Engineering Strategies to Overcome Hurdles in Solid Tumors Treatment. Front Immunol. 2022;13. https://doi.org/10.3389/fimmu.2022.830292.
176. Li M, Sun J, Shi G. Application of CRISPR screen in mechanistic studies of tumor development, tumor drug resistance, and tumor immunotherapy. Front Cell Dev Biol. 2023;11. https://doi.org/10.3389/fcell.2023. 1220376.
177. Crispo F, Pietrafesa M, Condelli V, Maddalena F, Bruno G, Piscazzi A, et al. IDH1 Targeting as a New Potential Option for Intrahepatic Cholangiocarcinoma Treatment-Current State and Future Perspectives. Molecules. 2020;25(16). https://doi.org/10.3390/molecules25163754.
178. Mirgayazova R, Khadiullina R, Chasov V, Mingaleeva R, Miftakhova R, Rizvanov A, et al. Therapeutic editing of the TP53 gene: Is crispr/CAS9 an option? Genes. 2020;11(6):1-17.
179. Gagelmann N, Riecken K, Wolschke C, Berger C, Ayuk FA, Fehse B, et al. Development of CAR-T cell therapies for multiple myeloma. Leukemia. 2020;34(9):2317-32.
180. Wang Z, Li N, Feng K, Chen M, Zhang Y, Liu Y, et al. Phase I study of CAR-T cells with PD-1 and TCR disruption in mesothelin-positive solid tumors. Cell Mol Immunol. 2021;18(9):2188-98.
181. Bamdad CC, Yuan Y, Specht JM, Stewart AK, Smagghe BJ, Lin SC-M, et al. Phase I/II first-in-human CAR T-targeting MUC1 transmembrane cleavage product (MUC1*) in patients with metastatic breast cancer. J Clin Oncol. 2022;40(16_suppl):TPS1130-TPS1130.
182. Pennesi E, Michels N, Brivio E, van der Velden VHJ, Jiang Y, Thano A, et al. Inotuzumab ozogamicin as single agent in pediatric patients with relapsed and refractory acute lymphoblastic leukemia: results from a phase II trial. Leukemia. 2022;36(6):1516-24.
183. Swain SM, Shastry M, Hamilton E. Targeting HER2-positive breast cancer: advances and future directions. Nat Rev Drug Discovery. 2023;22(2):101-26.
184. Ren J, Liu X, Fang C, Jiang S, June CH, Zhao Y. Multiplex genome editing to generate universal CART cells resistant to PD1 inhibition. Clin Cancer Res. 2017;23(9):2255-66.
185. Liu J, Zhang Y, Guo R, Zhao Y, Sun R, Guo S, et al. Targeted CD7 CAR T-cells for treatment of T-Lymphocyte leukemia and lymphoma and acute myeloid leukemia: recent advances. Front Immunol. 2023;14. https://doi.org/10.3389/fimmu.2023.1170968.
186. Furqan F, Shah NN. Multispecific CART Cells Deprive Lymphomas of Escape via Antigen Loss. Annu Rev Med. 2023;74:279-91.
187. Li Q, Ni Y, Zhang L, Jiang R, Xu J, Yang H, et al. HIF-1 a-induced expression of m6A reader YTHDF1 drives hypoxia-induced autophagy and malignancy of hepatocellular carcinoma by promoting ATG2A and ATG14 translation. Signal Transduct Target Ther. 2021;6(1). https://doi. org/10.1038/s41392-020-00453-8.
188. Kumar R, Yu F, Zhen YH, Li B, Wang J, Yang Y, et al. PD-1 blockade restores impaired function of ex vivo expanded CD8+T cells and
enhances apoptosis in mismatch repair deficient EpCAM+PD-L1+ cancer cells. Onco Targets Ther. 2017;10:3453-65.
189. Haso W, Qin H, Zhang L, Orentas RJ, Fry TJ. CD22-Targeted Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells Containing The 4-1BB Costimulatory Domain Demonstrate Enhanced Persistence and Superior Efficacy Against B-Cell Precursor Acute Lymphoblastic Leukemia (ALL) Compared To Those Containing CD28. Blood. 2013;122(21):1431-1431.
190. Dimitri A, Herbst F, Fraietta JA. Engineering the next-generation of CAR T-cells with CRISPR-Cas9 gene editing. Molecular Cancer. 2022;21(1). https://doi.org/10.1186/s12943-022-01559-z.
191. Chen X, Kozhaya L, Tastan C, Placek L, Dogan M, Horne M, et al. Functional Interrogation of Primary Human T Cells via CRISPR Genetic Editing. J Immunol. 2018;201(5):1586-98.
192. Hedrich V, Breitenecker K, Ortmayr G, Pupp F, Huber H, Chen D, et al. PRAME Is a Novel Target of Tumor-Intrinsic Gas6/AxI Activation and Promotes Cancer Cell Invasion in Hepatocellular Carcinoma. Cancers (Basel). 2023;15(9). https://doi.org/10.3390/cancers15092415.
193. Kaligotla VSA, Jasti T, Kandra P. CRISPR/Cas9 in cancer: An attempt to the present trends and future prospects. Biotechnol Appl Biochem. 2022;69(3):1238-51.
194. Mehravar M, Roshandel E, Salimi M, Chegeni R, Gholizadeh M, Mohammadi MH, et al. Utilization of CRISPR/Cas9 gene editing in cellular therapies for lymphoid malignancies. Immunol Lett. 2020;226:71-82.
195. Zhang S, Zhang F, Chen Q, Wan C, Xiong J, Xu J. CRISPR/Cas9-mediated knockout of NSD1 suppresses the hepatocellular carcinoma development via the NSD1/H3/Wnt10b signaling pathway. J Exp Clin Cancer Res. 2019;38(1). https://doi.org/10.1186/s13046-019-1462-y.
196. Sürün D, von Melchner H, Schnütgen F. CRISPR/Cas9 genome engineering in hematopoietic cells. Drug Discov Today Technol. 2018;28:33-9.
197. Koh S, Kah J, Tham CYL, Yang N, Ceccarello E, Chia A, et al. Nonlytic Lymphocytes Engineered to Express Virus-Specific T-Cell Receptors Limit HBV Infection by Activating APOBEC3. Gastroenterology. 2018;155(1):180-193.e6.
198. Adigbli G, Ménoret S, Cross AR, Hester J, Issa F, Anegon I. Humanization of Immunodeficient Animals for the Modeling of Transplantation, Graft Versus Host Disease, and Regenerative Medicine. Transplantation. 2020;104(11):2290-306.
199. Stewart JR, Baxter J, Zatreanu D, Brough R, Song F, Konde A, et al. 3P Identification of novel biomarkers of response to ATR inhibitors in ARID1A mutant ovarian clear cell carcinoma. Ann Oncol. 2022;33:S383-4.
200. Kamali E, Rahbarizadeh F, Hojati Z, Frödin M. CRISPR/Cas9-mediated knockout of clinically relevant alloantigenes in human primary T cells. BMC Biotechnol. 2021;21(1). https://doi.org/10.1186/ s12896-020-00665-4.
201. Khan A, Zhang X. Function of the Long Noncoding RNAs in HepatocelIular Carcinoma: Classification, Molecular Mechanisms, and Significant Therapeutic Potentials. Bioengineering. 2022;9(8). https://doi.org/10. 3390/bioengineering9080406.
202. Kath J, Du W, Pruene A, Braun T, Thommandru B, Turk R, et al. Pharmacological interventions enhance virus-free generation of TRAC-replaced CART cells. Mol Ther – Methods Clin Dev. 2022;25:311-30.
203. Gao Q, Dong X, Xu Q, Zhu L, Wang F, Hou Y, et al. Therapeutic potential of CRISPR/Cas9 gene editing in engineered T-cell therapy. Cancer Med. 2019;8(9):4254-64.
204. Aghamiri S, Talaei S, Ghavidel AA, Zandsalimi F, Masoumi S, Hafshejani NH, et al. Nanoparticles-mediated CRISPR/Cas9 delivery: Recent advances in cancer treatment. J Drug Deliv Sci Technol. 2020;56. https://doi.org/10.1016/j.jddst.2020.101533.
205. Tong S, Moyo B, Lee CM, Leong K, Bao G. Engineered materials for in vivo delivery of genome-editing machinery. Nat Rev Mater. 2019;4(11):726-37.
206. Mali P, Yang L, Esvelt KM, Aach J, Guell M, DiCarlo JE, et al. RNAGuided Human Genome Engineering via Cas9_Sup. Science. 2013;339(February):823-6.
207. Brouns SJJ, Jore MM, Lundgren M, Westra ER, Slijkhuis RJH, Snijders APL, et al. Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes. Science. 2008;321(5891):960-964.
208. Yin H, Kauffman KJ, Anderson DG. Delivery technologies for genome editing. Nat Rev Drug Discovery. 2017;16(6):387-99.
209. Chow MYT, Chang RYK, Chan HK. Inhalation delivery technology for genome-editing of respiratory diseases. Adv Drug Deliv Rev. 2021;168:217-28.
210. Sandhya D, Jogam P, Allini VR, Abbagani S, Alok A. The present and potential future methods for delivering CRISPR/Cas9 components in plants. J Genet Eng Biotechnol. 2020;18(1). https://doi.org/10.1186/ s43141-020-00036-8.
211. Taha EA, Lee J, Hotta A. Delivery of CRISPR-Cas tools for in vivo genome editing therapy: Trends and challenges. J Control Release. 2022;342:345-61.
212. Liu P, Liang SQ, Zheng C, Mintzer E, Zhao YG, Ponnienselvan K, et al. Improved prime editors enable pathogenic allele correction and cancer modelling in adult mice. Nat Commun. 2021;12(1). https://doi.org/10. 1038/s41467-021-22295-w.
213. Platt RJ, Chen S, Zhou Y, Yim MJ, Swiech L, Kempton HR, et al. CRISPRCas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 2014;159(2):440-55.
214. Han HA, Pang JK, Soh BS. Mitigating off-target effects in CRISPR/Cas9mediated in vivo gene editing. J Mol Med. 2020;98(5):615-32.
215. Doench JG, Fusi N, Sullender M, Hegde M, Vaimberg EW, Donovan KF, et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize offtarget effects of CRISPR-Cas9. Nat Biotechnol. 2016;34(2):184-91.
216. Burgess DJ. Characterizing CRISPR off-target effects. Nat Rev Genet. 2014;15(1):5-5.
217. Shen CC, Hsu MN, Chang CW, Lin MW, Hwu JR, Tu Y, et al. Synthetic switch to minimize CRISPR off-target effects by self-restricting Cas9 transcription and translation. Nucleic Acids Res. 2019;47(3). https://doi. org/10.1093/nar/gky1165.
218. Zhang S, Shen J, Li D, Cheng Y. Strategies in the delivery of Cas9 ribonucleoprotein for CRISPR/Cas9 genome editing. Theranostics. 2020. https://doi.org/10.7150/thno.47007.
219. Zhang D, Zhang Z, Unver T, Zhang B. CRISPR/Cas: A powerful tool for gene function study and crop improvement. J Adv Res. 2021;29:207-21.
220. Yin Y, Wang Q, Xiao L, Wang F, Song Z, Zhou C, et al. Advances in the engineering of the gene editing enzymes and the genomes: Understanding and handling the off-target effects of CRISPR/Cas9. J Biomed Nanotechnol. 2018. https://doi.org/10.1166/jbn.2018.2537.
221. Zhang X-H, Tee LY, Wang X-G, Huang Q-S, Yang S-H. Off-target Effects in CRISPR/Cas9-mediated Genome Engineering. Mol Ther Nucleic Acids. 2015;4: e264.
222. Li A, Lee CM, Hurley AE, Jarrett KE, De Giorgi M, Lu W, et al. A Self-Deleting AAV-CRISPR System for In Vivo Genome Editing. Mol Ther Methods Clin Dev. 2019. https://doi.org/10.1016/j.omtm.2018.11.009.
223. Xiang X, Corsi GI, Anthon C, Qu K, Pan X, Liang X, et al. Enhancing CRISPR-Cas9 gRNA efficiency prediction by data integration and deep learning. Nat Commun. 2021;12(1). https://doi.org/10.1038/ s41467-021-23576-0.
224. Kleinstiver BP, Prew MS, Tsai SQ, Topkar VV, Nguyen NT, Zheng Z, et al. Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities. Nature. 2015. https://doi.org/10.1038/nature14592.
225. Shen B, Zhang W, Zhang J, Zhou J, Wang J, Chen L, et al. Efficient genome modification by CRISPR-Cas9 nickase with minimal off-target effects. Nat Methods. 2014. https://doi.org/10.1038/nmeth.2857.
226. Ran FA, Hsu PD, Wright J, Agarwala V, Scott DA, Zhang F. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 2013. https:// doi.org/10.1038/nprot.2013.143.
227. Xie K, Yang Y. RNA-Guided Genome Editing in Plants Using a CRISPRCas System. Mol Plant. 2013;6(6):1975-83.
228. Izumi H, Wang Z, Goto Y, Ando T, Wu X, Zhang X, et al. Pathway-specific genome editing of PI3K/mTOR tumor suppressor genes reveals that PTEN loss contributes to cetuximab resistance in head and neck cancer. Mol Cancer Ther. 2020;19(7):1562-71.
229. Engstrom LD, Waters L, Gatto S, Fernandez-Banet J, Aranda R, Pavlicek A, et al. Abstract 5684: Drug-anchored in vitro and in vivo CRISPR screens to identify targetable vulnerabilities and modifiers of response to MRTX849 in KRASG12C-mutant models . Cancer Res. 2020;80(16_Supplement):5684-5684.
230. Li Y, Deutzmann A, Bell J, Ji H, Felsher D. Abstract PR02: Synthetic lethality screen identifies novel druggable targets in the MYC pathway. Mol Cancer Ther. 2017;16(10_Supplement):PR02-PR02.
231. Kolasa IK, Rembiszewska A, Janiec-Jankowska A, Dansonka-Mieszkowska A, Lewandowska AM, Konopka B, et al. PTEN mutation, expression and LOH at its locus in ovarian carcinomas. Relation to TP53, K-RAS and BRCA1 mutations. Gynecol Oncol. 2006;103(2):692-697.
232. Alenezi WM, Milano L, Fierheller CT, Serruya C, Revil T, Oros KK, et al. The Genetic and Molecular Analyses of RAD51C and RAD51D Identifies Rare Variants Implicated in Hereditary Ovarian Cancer from a Genetically Unique Population. Cancers (Basel). 2022;14(9). https://doi.org/10.3390/ cancers14092251.
233. Osher DJ, De Leeneer K, Michils G, Hamel N, Tomiak E, Poppe B, et al. Mutation analysis of RAD51D in non-BRCA1/2 ovarian and breast cancer families. Br J Cancer. 2012;106(8):1460-3.
234. Soukupová J, Lhotová K, Janatová M, Kleiblová P, Vočka M, Foretová L , et al. Germline mutations in RAD51C and RAD51D and hereditary predisposition to ovarian cancer. Klin Onkol. 2021;34(1):26-32.
235. Cummings S, Roman SS, Saam J, Bernhisel R, Brown K, Lancaster JM, et al. Age of ovarian cancer diagnosis among BRIP1, RAD51C, and RAD51D mutation carriers identified through multi-gene panel testing. J Ovarian Res. 2021;14(1). https://doi.org/10.1186/s13048-021-00809-w.
236. Loveday C, Turnbull C, Ramsay E, Hughes D, Ruark E, Frankum JR, et al. Germline mutations in RAD51D confer susceptibility to ovarian cancer. Nat Genet. 2011;43(9):879-82.
237. Chen X, Li Y, Ouyang T, Li J, Wang T, Fan Z, et al. Associations between RAD51D germline mutations and breast cancer risk and survival in BRCA1/2-negative breast cancers. Ann Oncol. 2018;29(10):2046-51.
238. Tao J, Bauer DE, Chiarle R. Assessing and advancing the safety of CRISPR-Cas tools: from DNA to RNA editing. Nat Commun. 2023;14(1). https://doi.org/10.1038/s41467-023-35886-6.
239. Bier E, Nizet V. Driving to Safety: CRISPR-Based Genetic Approaches to Reducing Antibiotic Resistance. Trends Genet. 2021;37(8):745-57.
240. Cromer MK, Barsan VV., Jaeger E, Wang M, Hampton JP, Chen F, et al. Ultra-deep sequencing validates safety of CRISPR/Cas9 genome editing in human hematopoietic stem and progenitor cells. Nat Commun. 2022;13(1). https://doi.org/10.1038/s41467-022-32233-z.
241. Sun D. Design of time-delayed safety switches for CRISPR gene therapy. Sci Rep. 2021;11(1). https://doi.org/10.1038/s41598-021-96510-5.
242. Xu CF, Chen GJ, Luo YL, Zhang Y, Zhao G, Lu ZD, et al. Rational designs of in vivo CRISPR-Cas delivery systems. Adv Drug Deliv Rev. 2021;168:3-29.
243. Stadtmauer EA, Fraietta JA, Davis MM, Cohen AD, Weber KL, Lancaster E, et al. CRISPR-engineered T cells in patients with refractory cancer. Science (80- ). 2020;367(6481). https://doi.org/10.1126/science.aba7365.
244. Wan F, Draz MS, Gu M, Yu W, Ruan Z, Luo Q. Novel strategy to combat antibiotic resistance: a sight into the combination of crispr/cas9 and nanoparticles. Pharmaceutics. 2021;13(3). https://doi.org/10.3390/ pharmaceutics13030352.
245. Tang N, Ning Q, Wang Z, Tao Y, Zhao X, Tang S. Tumor microenvironment based stimuli-responsive CRISPR/Cas delivery systems: A viable platform for interventional approaches. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 2022;210. https://doi.org/10.1016/j.colsurfb.2021.112257.
246. Wang G, Chow RD, Bai Z, Zhu L, Errami Y, Dai X, et al. Multiplexed activation of endogenous genes by CRISPRa elicits potent antitumor immunity. Nat Immunol. 2019;20(11):1494-505.
247. Xu L, Lau YS, Gao Y, Li H, Han R. Life-Long AAV-Mediated CRISPR Genome Editing in Dystrophic Heart Improves Cardiomyopathy without Causing Serious Lesions in mdx Mice. Mol Ther. 2019;27(8):1407-14.
248. Wei S, Shao X, Liu Y, Xiong B, Cui P, Liu Z, et al. Genome editing of PD-L1 mediated by nucleobase-modified polyamidoamine for cancer immunotherapy. J Mater Chem B. 2022;10(8):1291-300.
249. Wu Y, Zheng J, Zeng Q, Zhang T, Xing D. Light-responsive charge-reversal nanovector for high-efficiency in vivo CRISPR/Cas9 gene editing with controllable location and time. Nano Res. 2020;13(9):2399-406.
250. Li C, Ding L, Sun CW, Wu LC, Zhou D, Pawlik KM, et al. Novel HDAd/EBV Reprogramming Vector and Highly Efficient Ad/CRISPR-Cas Sickle Cell Disease Gene Correction. Sci Rep. 2016;6. https://doi.org/10.1038/srep3 0422.
251. Preece R, Pavesi A, Gkazi SA, Stegmann KA, Georgiadis C, Tan ZM, et al. CRISPR-Mediated Base Conversion Allows Discriminatory Depletion of Endogenous T Cell Receptors for Enhanced Synthetic Immunity. Mol Ther Methods Clin Dev. 2020;19:149-61.
252. Liu J, Li G, Guo H, Ni C, Gao Y, Cao X, et al. Dual-Responsive Core-Shell Tecto Dendrimers Enable Efficient Gene Editing of Cancer Cells to Boost Immune Checkpoint Blockade Therapy. ACS Appl Mater Interfaces. 2023;15(10):12809-21.
253. Chen X, Chen Y, Xin H, Wan T, Ping Y. Near-infrared optogenetic engineering of photothermal nanoCRISPR for programmable genome editing. Proc Natl Acad Sci U S A. 2020;117(5):2395-405.
254. Villamizar O, Waters SA, Scott T, Saayman S, Grepo N, Urak R, et al. Targeted Activation of Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator. Mol Ther. 2019;27(10):1737-48.
255. Pofali P, Mondal A, Londhe V. Exosome as a Natural Gene Delivery Vector for Cancer Treatment. Curr Cancer Drug Targets. 2020;20(11):821-30.
256. Ma SC, Zhang JQ, Yan TH, Miao MX, Cao YM, Cao YB, et al. Novel strategies to reverse chemoresistance in colorectal cancer. Cancer Med. 2023;12(10):11073-96.
257. Gong Z, Zhang X, Dai Z. Progress of nanoparticles inhibiting tumor metastasis. Kexue Tongbao/Chinese Sci Bull. 2018;63(15):1482-92.
258. Fix SM, Jazaeri AA, Hwu P. Applications of crispr genome editing to advance the next generation of adoptive cell therapies for cancer. Cancer Discov. 2021;11(3):560-74.
259. Choi E, Chang J-W, Krueger J, Lahr WS, Pomeroy E, Walsh M, et al. Engineering CD70-Directed CAR-NK Cells for the Treatment of Hematological and Solid Malignancies. Blood. 2021;138(Supplement 1):1691-1691.
260. Eyquem J, Mansilla-Soto J, Odak A, Sadelain M. 274. One-Step Generation of Universal CART Cells. Mol Ther. 2016;24:S109.
261. Kavanagh EW, Green JJ. Toward Gene Transfer Nanoparticles as Therapeutics. Advanced Healthcare Materials. 2022;11(7). https://doi.org/10. 1002/adhm. 202102145.
262. Wang X, Zabierowski S, Wu M, Del Casale C, Eyquem J, Mansilla-Soto J, et al. Establishing cGMP manufacturing of CRISPR/Cas9-edited human CART cells. Cytotherapy. 2020;22(5):S138-9.
263. Getahun YA, Ali DA, Taye BW, Alemayehu YA. Multidrug-Resistant Microbial Therapy Using Antimicrobial Peptides and the CRISPR/Cas9 System. Vet Med Res Reports. 2022;13:173-90.
264. Tay LS, Palmer N, Panwala R, Chew WL, Mali P. Translating CRISPR-Cas Therapeutics: Approaches and Challenges. CRISPR J. 2020;3(4):253-75.
265. Barrangou R, Horvath P. CRISPR: New horizons in phage resistance and strain identification. Annu Rev Food Sci Technol. 2012;3(1):143-62.
266. Xiu K, Saunders L, Wen L, Ruan J, Dong R, Song J, et al. Delivery of CRISPR/Cas9 Plasmid DNA by Hyperbranched Polymeric Nanoparticles Enables Efficient Gene Editing. Cells. 2023;12(1). https://doi.org/10. 3390/cells12010156.
267. Lau CH, Suh Y. In vivo genome editing in animals using AAV-CRISPR system: Applications to translational research of human disease. F1000Research. 2017;6. https://doi.org/10.12688/f1000research.11243.1.
268. Jiang C, Lin X, Zhao Z. Applications of CRISPR/Cas9 Technology in the Treatment of Lung Cancer. Trends Mol Med. 2019;25(11):1039-49.
269. Wang Z, Chen M, Zhang Y, Liu Y, Yang Q, Nie J, et al. Phase I study of CRISPR-engineered CAR-T cells with PD-1 inactivation in treating meso-thelin-positive solid tumors. J Clin Oncol. 2020;38(15_suppl):3038-3038.
270. Tratar UL, Horvat S, Cemazar M. Transgenic mouse models in cancer research. Front Oncol. 2018;8(JUL). https://doi.org/10.3389/fonc.2018. 00268.
271. Zhan T, Rindtorff N, Betge J, Ebert MP, Boutros M. CRISPR/Cas9 for cancer research and therapy. Semin Cancer Biol. 2019;55:106-19.
272. Ahmed , Daoud GH, Mohamed A, Harati R. New insights into the therapeutic applications of crispr/cas9 genome editing in breast cancer. Genes. 2021;12(5). https://doi.org/10.3390/genes12050723.
273. Zhao Z, Li C, Tong F, Deng J, Huang G, Sang Y. Review of applications of CRISPR-Cas9 gene-editing technology in cancer research. Biol Proced Online. 2021;23(1). https://doi.org/10.1186/s12575-021-00151-x.
274. Wang SW, Gao C, Zheng YM, Yi L, Lu JC, Huang XY, et al. Current applications and future perspective of CRISPR/Cas9 gene editing in cancer. Mol Cancer. 2022;21(1). https://doi.org/10.1186/s12943-022-01518-8.
275. Jo DH, Song DW, Cho CS, Kim UG, Lee KJ, Lee K, et al. CRISPR-Cas9mediated therapeutic editing of Rpe65 ameliorates the disease phenotypes in a mouse model of Leber congenital amaurosis. Sci Adv. 2019;5(10). https://doi.org/10.1126/sciadv.aax1210.
276. Liang SQ, Walkey CJ, Martinez AE, Su Q, Dickinson ME, Wang D, et al. AAV5 delivery of CRISPR-Cas9 supports effective genome editing in mouse lung airway. Mol Ther. 2022;30(1):238-43.
277. Yu W, Mookherjee S, Chaitankar V, Hiriyanna S, Kim JW, Brooks M, et al. Nrl knockdown by AAV-delivered CRISPR/Cas9 prevents retinal degeneration in mice. Nat Commun. 2017;8. https://doi.org/10.1038/ncomm s14716.
278. Zhen S, Liu Y, Lu J, Tuo X, Yang X, Chen H, et al. Human Papillomavirus Oncogene Manipulation Using Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeats/Cas9 Delivered by pH-Sensitive Cationic Liposomes. Hum Gene Ther. 2020;31(5-6):309-24.
279. Aksoy YA, Yang B, Chen W, Hung T, Kuchel RP, Zammit NW, et al. Spatial and Temporal Control of CRISPR-Cas9-Mediated Gene Editing Delivered via a Light-Triggered Liposome System. ACS Appl Mater Interfaces. 2020;12(47):52433-44.
280. Naeimi Kararoudi M, Likhite S, Elmas E, Yamamoto K, Schwartz M, Sorathia K, et al. Optimization and validation of CAR transduction into human primary NK cells using CRISPR and AAV. Cell Reports Methods. 2022;2(6). https://doi.org/10.1016/j.crmeth.2022.100236.
281. Fine EJ, Appleton CM, White DE, Brown MT, Deshmukh H, Kemp ML, et al. Trans-spliced Cas9 allows cleavage of HBB and CCR5 genes in human cells using compact expression cassettes. Sci Rep. 2015;5. https://doi.org/10.1038/srep10777.
282. Kazemian P, Yu SY, Thomson SB, Birkenshaw A, Leavitt BR, Ross CJD. Lipid-Nanoparticle-Based Delivery of CRISPR/Cas9 Genome-Editing Components. Mol Pharm. 2022;19(6):1669-86.
283. Osteikoetxea X, Silva A, Lázaro-Ibáñez E, Salmond N, Shatnyeva O, Stein J, et al. Engineered Cas9 extracellular vesicles as a novel gene editing tool. J Extracell Vesicles. 2022;11(5). https://doi.org/10.1002/jev2.12225.
284. Yang Z, Liang SQ, Yang H, Xu D, Bruggmann R, Gao Y, et al. CRISPRmediated kinome editing prioritizes a synergistic combination therapy for FGFR1-amplified lung cancer. Cancer Res. 2021;81(11):3121-33.
285. Chamberlain CA, Bennett EP, Kverneland AH, Svane IM, Donia M, Met Ö. Highly efficient PD-1-targeted CRISPR-Cas9 for tumor-infiltrating lymphocyte-based adoptive T cell therapy. Mol Ther Oncolytics. 2022;24:417-28.
286. Sajib AM, Agarwal P, Patton DJ, Nance RL, Stahr NA, Kretzschmar WP, et al. In vitro functional genetic modification of canine adenovirus type 2 genome by CRISPR/Cas9. Lab Investig. 2021;101(12):1627-36.
287. Sarkar E, Khan A. Erratic journey of CRISPR/Cas9 in oncology from bench-work to successful-clinical therapy. Cancer Treatment and Research Communications. 2021;27. https://doi.org/10.1016/j.ctarc. 2020.100289.
288. Michaels YS, Barnkob MB, Barbosa H, Baeumler TA, Thompson MK, Andre V , et al. Precise tuning of gene expression levels in mammalian cells. Nat Commun. 2019;10(1). https://doi.org/10.1038/ s41467-019-08777-y.
289. Lopez-Obando M, Hoffmann B, Géry C, Guyon-Debast A, Téoulé E, Rameau C, et al. Simple and efficient targeting of multiple genes through CRISPR-Cas9 in Physcomitrella patens. G3 Genes Genomes Genet. 2016;6(11):3647-3653.
290. Cao J, Wu L, Zhang SM, Lu M, Cheung WKC, Cai W, et al. An easy and efficient inducible CRISPR/Cas9 platform with improved specificity for multiple gene targeting. Nucleic Acids Res. 2016;44(19). https://doi.org/ 10.1093/nar/gkw660.
291. Ma X, Zhang Q, Zhu Q, Liu W, Chen Y, Qiu R, et al. A Robust CRISPR/Cas9 System for Convenient, High-Efficiency Multiplex Genome Editing in Monocot and Dicot Plants. Mol Plant. 2015;8(8):1274-84.
292. Wessels HH, Méndez-Mancilla A, Hao Y, Papalexi E, Mauck WM, Lu L, et al. Efficient combinatorial targeting of RNA transcripts in single cells with Cas13 RNA Perturb-seq. Nat Methods. 2023;20(1):86-94.
293. Hirata M, Wittayarat M, Namula Z, Le QA, Lin Q, Nguyen NT, et al. Evaluation of multiple gene targeting in porcine embryos by the CRISPR/Cas9 system using electroporation. Mol Biol Rep. 2020;47(7):5073-9.
294. Pan C, Wu X, Markel K, Malzahn AA, Kundagrami N, Sretenovic S, et al. CRISPR-Act3.0 for highly efficient multiplexed gene activation in plants. Nat Plants. 2021;7(7):942-953.
295. Selvakumar SC, Preethi KA, Ross K, Tusubira D, Khan MWA, Mani P, et al. CRISPR/Cas9 and next generation sequencing in the personalized treatment of Cancer. Mol Cancer. 2022;21(1). https://doi.org/10.1186/ s12943-022-01565-1.
296. Sioson VA, Kim M, Joo J. Challenges in delivery systems for CRISPRbased genome editing and opportunities of nanomedicine. Biomed Eng Lett. 2021;11(3):217-33.
297. Chandrasekaran AP, Karapurkar JK, Chung HY, Ramakrishna S. The role of the CRISPR-Cas system in cancer drug development: Mechanisms of action and therapy. Biotechnol J. 2022;17(7). https://doi.org/10.1002/ biot. 202100468.
298. Ma D, Liu F. Genome Editing and Its Applications in Model Organisms. Genomics Proteomics Bioinformatics. 2015;13(6):336-44.
299. Moses C, Kaur P. Applications of CRISPR systems in respiratory health: Entering a new’red pen’ era in genome editing. Respirology. 2019;24(7):628-37.
300. Kick L, Kirchner M, Schneider S. CRISPR-Cas9: From a bacterial immune system to genome-edited human cells in clinical trials. Bioengineered. 2017;8(3):280-6.
301. Leonova El, Reshetnikov VV, Sopova JV. CRISPR/Cas-edited pigs for personalized medicine: more than preclinical test-system. Res Results Pharmacol. 2022;8(3):87-98.
302. Castells-Roca L, Tejero E, Rodríguez-Santiago B, Surrallés J. Crispr screens in synthetic lethality and combinatorial therapies for cancer. Cancers. 2021;13(7). https://doi.org/10.3390/cancers13071591.
303. Huang A, Garraway LA, Ashworth A, Weber B. Synthetic lethality as an engine for cancer drug target discovery. Nat Rev Drug Discovery. 2020;19(1):23-38.
304. Dhanjal JK, Radhakrishnan N, Sundar D. Identifying synthetic lethal targets using CRISPR/Cas9 system. Methods. 2017;131:66-73.
305. Vit G, Duro J, Rajendraprasad G, Hertz EPT, Holland LKK, Weisser MB, et al. Chemogenetic profiling reveals PP2A-independent cytotoxicity of proposed PP2A activators iHAP1 and DT-061. EMBO J. 2022;41(14). https://doi.org/10.15252/embj.2022110611.
306. Li C, Mei H, Hu Y. Applications and explorations of CRISPR/Cas9 in CAR T-cell therapy. Brief Funct Genomics. 2020;19(3):175-82.
307. Hu Kjia, Yin ETS, Hu Y xian, Huang H. Combination of CRISPR/Cas9 System and CAR-T Cell Therapy: A New Era for Refractory and Relapsed Hematological Malignancies. Curr Med Sci. 2021;41(3):420-430.
308. Ajavavarakula T. CRISPR-edited CAR-T cells: Using CRISPR-Cas9 to Improve CAR-T Therapy. Highlights Sci Eng Technol. 2022;14:355-9.
309. Ye L, Park JJ, Peng L, Yang Q, Chow RD, Dong MB, et al. A genome-scale gain-of-function CRISPR screen in CD8 T cells identifies proline metabolism as a means to enhance CAR-T therapy. Cell Metab. 2022;34(4):595614.e14.
310. Zhou Z, Tao C, Li J, Tang JC on, Chan AS chi, Zhou Y. Chimeric antigen receptor T cells applied to solid tumors. Front Immunol. 2022;13. https://doi.org/10.3389/fimmu.2022.984864.
311. Cortese MJ, Sauter C. A ‘CRISPR’ non-viral manufacturing approach for CART cell therapies. Mol Ther. 2022;30(11):3338-40.
312. Yan X, Chen D, Ma X, Wang Y, Guo Y, Wei J, et al. CD58 loss in tumor cells confers functional impairment of CART cells. Blood Adv. 2022;6(22):5844-56.
313. Mollanoori H, Shahraki H, Rahmati Y, Teimourian S. CRISPR/Cas9 and CAR-T cell, collaboration of two revolutionary technologies in cancer immunotherapy, an instruction for successful cancer treatment. Hum Immunol. 2018;79(12):876-82.
314. Liu J, Wang X, Chen AT, Gao X, Himes BT, Zhang H, et al. ZNF117 regulates glioblastoma stem cell differentiation towards oligodendroglial lineage. Nat Commun. 2022;13(1). https://doi.org/10.1038/ s41467-022-29884-3.
315. Wilkinson AC, Dever DP, Baik R, Camarena J, Hsu I, Charlesworth CT, et al. Cas9-AAV6 gene correction of beta-globin in autologous HSCs improves sickle cell disease erythropoiesis in mice. Nat Commun. 2021;12(1). https://doi.org/10.1038/s41467-021-20909-x.
316. Smirnikhina SA, Kondrateva E V., Adilgereeva EP, Anuchina AA, Zaynitdinova MI, Slesarenko YS, et al. P.F508del editing in cells from cystic fibrosis patients. PLoS One. 2020;15(11 November). https://doi.org/10. 1371/journal.pone. 0242094.
317. Bonafont J, Mencía A, Chacón-Solano E, Srifa W, Vaidyanathan S, Romano R, et al. Correction of recessive dystrophic epidermolysis bullosa by homology-directed repair-mediated genome editing. Mol Ther. 2021;29(6):2008-18.
318. Valetdinova KR, Malankhanova TB, Zakian SM, Medvedev SP. The Cutting Edge of Disease Modeling: Synergy of Induced Pluripotent Stem Cell Technology and Genetically Encoded Biosensors. Biomedicines. 2021;9(8). https://doi.org/10.3390/biomedicines9080960.
319. Dessy-Rodriguez , Fañanas-Baquero , Venturi V, Payán-Pernía , Tornador C, Hernandez G, et al. Modelling Congenital Dyserythropoietic Anemia Type II through Gene Editing in Hematopoietic Stem and Progenitor Cells. Blood. 2020;136(Supplement 1):27-27.
320. Garcia-Bloj B, Moses C, Sgro A, Plani-Lam J, Arooj M, Duffy C, et al. Waking up dormant tumor suppressor genes with zinc fingers, TALEs and the CRISPR/dCas9 system. Oncotarget. 2016;7(37):60535-54.
321. Mazur PK, Herner A, Mello SS, Wirth M, Hausmann S, Sánchez-Rivera FJ, et al. Combined inhibition of BET family proteins and histone deacetylases as a potential epigenetics-based therapy for pancreatic ductal adenocarcinoma. Nat Med. 2015;21(10):1163-71.
322. Ousterout DG, Gersbach CA. Genome Editing for Neuromuscular Diseases. Genome Editing: The Next Step in Gene Therapy. 2016:51-79.
323. Ansari I, Chaturvedi A, Chitkara D, Singh S. CRISPR/Cas mediated epigenome editing for cancer therapy. Semin Cancer Biol. 2022;83:570-83.
324. Zhang C, Quan R, Wang J. Development and application of CRISPR/Cas9 technologies in genomic editing. Hum Mol Genet. 2018;27(R2):R79-88.
325. Pickar-Oliver A, Gersbach CA. The next generation of CRISPR-Cas technologies and applications. Nat Rev Mol Cell Biol. 2019;20(8):490-507.
326. Rafii S, Tashkandi E, Bukhari N, Al-Shamsi HO. Current Status of CRISPR/ Cas9 Application in Clinical Cancer Research: Opportunities and Challenges. Cancers. 2022;14(4). https://doi.org/10.3390/cancers14040947.
327. Yang Y, Xu J, Ge S, Lai L. CRISPR/Cas: Advances, Limitations, and Applications for Precision Cancer Research. Front Med. 2021;8. https://doi.org/ 10.3389/fmed.2021.649896.
328. Moses C, Garcia-Bloj B, Harvey AR, Blancafort P. Hallmarks of cancer: The CRISPR generation. Eur J Cancer. 2018;93:10-8.
329. Behan FM, lorio F, Picco G, Gonçalves E, Beaver CM, Migliardi G, et al. Prioritization of cancer therapeutic targets using CRISPR-Cas9 screens. Nature. 2019;568(7753):511-6.
330. Kim D, Kim J, Hur JK, Been KW, Yoon SH, Kim JS. Genome-wide analysis reveals specificities of Cpf1 endonucleases in human cells. Nat Biotechnol. 2016;34(8):863-8.
331. Manghwar H, Lindsey K, Zhang X, Jin S. CRISPR/Cas System: Recent Advances and Future Prospects for Genome Editing. Trends Plant Sci. 2019. https://doi.org/10.1016/j.tplants.2019.09.006.
332. Doerflinger M, Forsyth W, Ebert G, Pellegrini M, Herold MJ. CRISPR/ Cas9-The ultimate weapon to battle infectious diseases? Cell Microbiol. 2017;19(2). https://doi.org/10.1111/cmi.12693.
333. Boos SL, Loevenich LP, Vosberg S, Engleitner T, Öllinger R, Kumbrink J, et al. Disease Modeling on Tumor Organoids Implicates AURKA as a Therapeutic Target in Liver Metastatic Colorectal Cancer. CMGH. 2022;13(2):517-40.
334. Manghwar H, Li B, Ding X, Hussain A, Lindsey K, Zhang X, et al. CRISPR/ Cas Systems in Genome Editing: Methodologies and Tools for sgRNA Design, Off-Target Evaluation, and Strategies to Mitigate Off-Target Effects. Adv Sci. 2020. https://doi.org/10.1002/advs.201902312.
335. Rayner E, Durin M-A, Thomas R, Moralli D, O’Cathail SM, Tomlinson I, et al. CRISPR-Cas9 Causes Chromosomal Instability and Rearrangements in Cancer Cell Lines, Detectable by Cytogenetic Methods. Cris J. 2019;2(6):406-16.
336. Chen hang , Yin H. Recent advances in chemical modifications of guide RNA, mRNA and donor template for CRISPR-mediated genome editing. Adv Drug Deliv Rev. 2021;168:246-58.
337. Teng F, Li J, Cui T, Xu K, Guo L, Gao Q, et al. Enhanced mammalian genome editing by new Cas12a orthologs with optimized crRNA scaffolds. Genome Biol. 2019;20(1). https://doi.org/10.1186/ s13059-019-1620-8.
338. Bikard D, Euler C, Jiang W, Nussenzweig PM, Goldberg GW, Duportet X , et al. Development of sequence-specific antimicrobials based on programmable CRISPR-Cas nucleases. Nat Biotechnol. 2014;32(11):1146.
339. Deltcheva E, Chylinski K, Sharma CM, Gonzales K. CRISPR RNA maturation by trans -encoded small RNA and host factor RNase III. Nature. 2011;471(7340):602-7.

تظل شركة سبرينجر ناتشر محايدة فيما يتعلق بالمطالبات القضائية في الخرائط المنشورة والانتماءات المؤسسية.

في BMC، البحث دائمًا في تقدم.
تعرف على المزيد biomedcentral.com/submissions

Keywords CRISPR system, Genome editing, Cancer therapy, Genetic mutations, Tumor growth, Immune response, Preclinical studies, Clinical trials, Safety, Delivery, Off-target effects, Cancer-killing molecules

Young Researchers and Elite Club, Najafabad Branch, Islamic Azad University, Najafabad, Iran
Department of Biology, Nourdanesh Institute of Higher Education, Meymeh, Isfahan, Iran

The use of CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) in cancer therapy has the potential to revolutionize the way for treating different diseases [1]. CRISPR technology allows for precise and efficient manipulation of the genome, and its application in cancer research has the potential to target specific genetic mutations that drive the growth and spread of tumors [2]. In recent years, there has been a growing body of research exploring the use of CRISPR-based gene editing in cancer therapy, with several preclinical studies and clinical trials demonstrating promising results [3]. The discovery of CRISPR technology in 2012 marked a significant milestone in
the field of genome editing [4]. Figure 1 illustrates the evolution of CRISPR tools used for exploring cancer biology. CRISPR-associated enzymes, such as Cas9, can be programmed to target specific DNA sequences, and when combined with guide RNAs, can be used to cut, modify or delete genes in a precise manner [4]. This technology has been used in a wide range of applications, including basic research, gene therapy, and agriculture [1]. However, its potential application in cancer research has attracted particular interest due to the ability to target the genetic mutations that drive the growth and spread of tumors [3]. There are several different CRISPR-based strategies that have been proposed for cancer therapy [4]. One approach is

to inactivate genes that drive tumor growth. For example, using CRISPR to inactivate the oncogene MYC has been proposed as a way to halt tumor growth. The MYC gene is known to be overactive in many types of cancer, and its inactivation could potentially slow down or stop the progression of the disease [5]. Another approach is to enhance the immune response to cancer cells. For example, researchers have used CRISPR-based gene editing to knockout or decrease the expression of the PD-1 protein on T cells, which helps to improve their ability to target and kill cancer cells [6]. Additionally, CRISPR-based gene editing can be used to repair genetic mutations that cause cancer, such as in the case of inherited forms of cancer caused by BRCA1 and BRCA2 mutations [7]. For example, studies have shown that CRISPR-Cas9 can be utilized to correct BRCA1 mutations in human cells, demonstrating the potential for this technology in cancer therapy [8]. Furthermore, CRISPR-based gene editing can also be employed in immunotherapeutic strategies for cancer treatment. For instance, T cells can be engineered using CRISPR to express receptors that specifically target tumor cells, enhancing the body’s immune response against cancer [9]. Preclinical studies and clinical trials have been conducted using these strategies, and they have demonstrated promising results [3]. For example, inactivating the MYC oncogene in animal models of lymphoma has been shown to reduce tumor growth. Similarly, increasing the expression of PD- 1 on T cells has been shown to enhance the ability of these cells to target and kill cancer cells in animal models [1]. However, despite the promising results obtained in preclinical studies, there are still many challenges that need to be overcome for CRISPR-based cancer therapy to become a viable clinical option [4]. One of the main challenges is the risk of non-specific site effects, which can occur when CRISPR enzymes target unintended regions of the genome. Safety and delivery are also critical challenges that need to be addressed [10].
In this review article, we will provide an overview of the current state of the field of CRISPR-based gene editing in cancer therapy, highlighting the most promising results and the challenges that still need to be overcome. We will describe the different CRISPR-based strategies that have been proposed for cancer therapy, summarize the current state of preclinical studies and clinical trials, and discuss the challenges and limitations that need to be overcome for CRISPR-based cancer therapy to become a viable clinical option. We will also provide an overview of future directions for research, development and discuss the potential implications of CRISPR-based cancer therapy for the future of cancer treatment and healthcare.

CRISPR-based gene editing technology has the potential to revolutionize the way for treating cancer by allowing for precise and efficient manipulation of the genome to target specific genetic mutations that drive the growth and spread of tumors [12]. Figure 2 highlights the step-by-step process of CRISPR screening, starting with the identification of specific gene targets. Subsequently, it illustrates the design and construction of CRISPR guide RNA libraries, essential for precise genomic targeting. Following this, the delivery of CRISPR components into the target cells is depicted, demonstrating the methods employed for gene editing in a wide range of cell types. The next stage outlines the application of selective pressures to identify cells with desired genetic alterations, and ultimately, the evaluation of the screening results. Figure 3 illustrates the various mechanisms of gene editing. Several different CRISPR-based strategies have been proposed for cancer therapy, each with their own advantages and limitations [13]. Table 1 outlines several CRISPR-based strategies for cancer therapy.

The mechanism of CRISPR-based strategies in inactivating oncogenes begins with the identification of specific oncogenes that play critical roles in cancer development [19]. Oncogenes are often associated with mutations or abnormal gene amplifications that result in the overexpression of their respective proteins, leading to uncontrolled cell growth and proliferation [20]. Once the target oncogene has been identified, researchers design a gRNA that specifically recognizes and binds to the mutated or amplified region of the oncogene [19]. One approach is to inactivate genes that drive tumor growth. For example, inactivating the MYC oncogene has been shown to reduce tumor growth in animal models of lymphoma [21]. This strategy is based on the principle that cancer cells have genetic mutations that lead to the over-expression of oncogenes, which promote cell growth and proliferation. Inactivating these oncogenes can stop the growth of cancer cells [22]. CRISPR-based approaches can be seamlessly integrated with other cancer therapies to maximize efficacy and improve treatment outcomes [23]. For instance, combining CRISPR with chemotherapy allows for the precise editing of genes involved in drug resistance, sensitizing cancer cells to chemotherapeutic agents [24]. Additionally, CRISPR can be used to engineer patient-derived immune cells, such as T cells, to express CARs that enhance their tumor-targeting capabilities in combination with CAR-T cell therapy [22]. Furthermore, by disrupting immune checkpoint genes in cancer cells, CRISPR augments the effectiveness of

immunotherapies like immune checkpoint inhibitors [25]. Another example is integrating CRISPR with targeted therapies, where simultaneous targeting of multiple critical pathways using gene editing can overcome resistance and potentiate the effects of targeted drugs [26]. By employing CRISPR to enhance drug delivery, researchers can modify tumor cells or the tumor microenvironment to improve the penetration of therapeutics, thereby augmenting the impact of various cancer treatments. These examples demonstrate the versatility of CRISPR in synergizing with other cancer therapies
and pave the way for more effective and personalized treatment approaches in the fight against cancer [27].

The mechanism revolves around harnessing the potential of the CRISPR-Cas system, a natural defense mechanism found in bacteria and archaea, which has been adapted for targeted gene editing in various organisms [28]. To enhance the immune response, scientists utilize CRISPR-Cas to edit specific genes involved in immune regulation and response pathways [29]. Gene editing

can be employed to knockout genes that negatively regulate the immune system, thus bolstering its activity [28]. Additionally, CRISPR-based techniques enable the precise insertion of beneficial genes, such as cytokines or other immune mediators, to enhance the immune response against particular antigens [23]. Furthermore, CRISPR-Cas can be utilized to engineer immune cells like T-cells and NK cells, improving their functionality and specificity towards cancer cells or infected targets [30]. Moreover, CRISPR-Cas enables the development of genetic vaccines, where specific antigen-encoding genes are delivered into host cells to elicit a robust and targeted immune response. These breakthroughs in CRISPR-based immune enhancement hold great promise for combating infectious diseases, cancer, and other conditions where bolstering the immune system is critical for effective treatment [31]. Researchers have used CRISPR-based gene editing to increase the expression of the PD-1 protein on T cells, which helps to improve their ability to target and kill cancer cells [32]. CRISPRCas enhances the immune response by enabling precise gene editing [33]. Scientists can target specific genes involved in immune regulation and response pathways. By knocking out genes that negatively regulate the immune system, CRISPR-Cas increases the overall
activity of the immune system [23]. Additionally, beneficial genes, such as cytokines or other immune mediators, can be inserted using CRISPR-Cas to further enhance the immune response against specific antigens [34]. CRISPRbased gene editing can sometimes result in non-specific site effects, where unintended changes occur in other parts of the genome. These non-selective site effects may lead to unwanted alterations in gene function and could pose safety concerns in the context of immune enhancement [35, 36]. It is essential to thoroughly evaluate and minimize these undesirable site effects to ensure the safety and effectiveness of CRISPR-based strategies [28]. CRISPR-Cas can be utilized to modify immune cells, such as T-cells and NK cells, to improve their functionality and specificity in targeting cancer cells or infected cells. By editing the genes responsible for cell receptors and signaling pathways, researchers can enhance the ability of immune cells to recognize and destroy specific targets [33]. Understanding the mechanisms and optimizing the protocols for this gene editing process is crucial for developing successful immune cell-based therapies [28]. While CRISPR-based strategies show great promise in enhancing the immune response, it is essential to investigate their long-term effects on the host’s immune system [30]. Prolonged activation or manipulation of immune

pathways could potentially lead to immune system dysregulation, autoimmunity, or immune exhaustion [37]. Understanding the impact of CRISPR-based immune enhancement on the overall immune function and homeostasis is crucial for safe and sustainable clinical applications. Long-term follow-up studies in animal models and clinical trials will be necessary to address these concerns [23]. Figure 4 illustrates various applications of CRISPR in cancer research.

CRISPR-based gene editing can also be used to repair genetic mutations that cause cancer, such as in the case of inherited forms of cancer caused by BRCA1 and BRCA2 mutations [37]. The CRISPR-Cas9 system is highly specific in targeting genetic mutations due to the guide RNA’s ability to recognize and bind to a particular DNA sequence [38]. However, undesirable site effects can occur, where the Cas9 enzyme might inadvertently cleave similar sequences elsewhere in the genome [39]. Continuous advancements in bioinformatics and experimental techniques are improving the specificity and reducing non-selective site effects, making it crucial to evaluate the system’s precision in repairing genetic mutations [37]. Assessing the efficiency and accuracy
of CRISPR-mediated repair methods, such as HDR and NHEJ, is vital. HDR can accurately introduce the desired genetic changes by utilizing a donor template, but its efficiency is often lower compared to NHEJ, which can result in insertions or deletions without a template [40]. Understanding the balance between efficiency and accuracy will help optimize the choice of repair mechanism for specific genetic mutations [41]. While CRISPR has shown great promise, there might be unforeseen consequences of manipulating the genome. These could include nonselective site mutations or large-scale genomic rearrangements, which may introduce new genetic abnormalities or cause unintended effects on gene regulation [42]. Careful evaluation and thorough assessment of potential unintended outcomes are essential to ensure the safety and reliability of CRISPR-based strategies [37]. Understanding the stability of CRISPR-induced genetic repairs is critical for assessing the long-term viability of potential treatments [40]. Genetic modifications must be stable and faithfully passed on during cell divisions to provide lasting therapeutic benefits. Investigating the heritability and stability of repaired genetic mutations will shed light on the longevity and efficacy of CRISPR-based strategies [41]. When using CRISPR-Cas9 for in vivo applications, it is crucial to evaluate potential immune responses to

the Cas9 protein and guide RNA [37]. The immune system might recognize these components as foreign entities, leading to unwanted immune reactions or clearance of CRISPR-modified cells. Understanding the immunogenicity of CRISPR components will aid in developing strategies to minimize immune responses and enhance the safety and success of gene therapies [41].

CRISPR-based strategies have revolutionized cancer treatment by enabling the precise delivery of cancerkilling molecules to targeted cells [43]. The mechanism behind this innovative approach involves utilizing the CRISPR-Cas system, a powerful gene-editing tool, to effectively locate and destroy cancerous cells while sparing healthy ones [44]. Firstly, researchers design guide RNA molecules that specifically target and bind to cancer cell DNA, serving as molecular homing devices. Secondly, these guide RNAs are loaded onto a CRISPR-associated protein (Cas) complex, forming the CRISPR-Cas ribonucleoprotein (RNP) complex. This RNP complex can be seen as a delivery system for cancer-killing molecules, which is a crucial part of CRISPR/Cas9-based cancer gene therapy, where gene-editing technology is leveraged to treat cancer by editing the genetic material within cancer cells [45]. Thirdly, the RNP complex, along with can-cer-killing molecules, is then introduced into the patient’s body, either through direct injection or as part of engineered immune cells, such as T-cells. Various delivery systems, such as nanotechnology-based delivery systems, have been explored to ensure the efficient delivery of the CRISPR-Cas system and cancer-killing molecules to target cells [46]. Fourthly, once inside the cancer cells, the CRISPR-Cas RNP complex precisely cuts and deactivates the oncogenes responsible for the malignancy, while the delivered cancer-killing molecules initiate apoptosis (cell death) or render the cancer cells susceptible to the body’s immune response [47]. The ultimate goal is to optimize the delivery and application of the CRISPR-Cas system for clinical cancer therapy, overcoming challenges associated with in vivo delivery, to ensure the safety and effectiveness of this therapeutic approach [48]. Finally, the targeted destruction of cancer cells occurs, leading to tumor regression while minimizing damage to healthy tissues. This breakthrough mechanism holds immense promise in the development of highly specific and efficient cancer therapies, potentially revolutionizing the landscape of oncology treatments in the future [49]. Guide RNA molecules are designed to have complementary sequences that specifically bind to the DNA of cancer cells. This specificity is achieved by identifying unique genetic markers or mutations present in cancer cells but not in healthy cells. By targeting these specific sequences,
guide RNAs can effectively distinguish cancerous cells from healthy ones [50]. The Cas complex serves as a carrier for the guide RNA molecules. It forms a complex with the guide RNA, creating the CRISPR-Cas RNP complex [51]. The Cas protein provides the necessary machinery to recognize the guide RNA and facilitates its binding to the target DNA within cancer cells. This complex acts as a powerful molecular scissor, cutting and deactivating the oncogenes responsible for cancer growth [50]. The CRISPR-Cas RNP complex can be introduced into the patient’s body through different methods. One approach involves direct injection into the target tissue or tumor site [49]. Another method involves engineering immune cells, such as T-cells, to express the CRISPR-Cas RNP complex. These engineered immune cells can then be reintroduced into the patient’s bloodstream, where they can specifically target and attack cancer cells [51]. Once inside the cancer cells, the CRISPR-Cas RNP complex locates the targeted DNA sequences and precisely cuts them, deactivating the oncogenes responsible for the malignancy. This deactivation leads to either the initiation of apoptosis (cell death) in cancer cells or renders them more susceptible to the body’s immune response, resulting in their destruction [49]. The guide RNA molecules are designed to specifically target cancer cells by binding to unique genetic markers or mutations found in those cells. By selectively targeting cancerous cells, the CRISPR-Cas RNP complex effectively spares healthy cells from damage, minimizing potential side effects [52]. Additionally, the use of engineered immune cells allows for even greater specificity in targeting cancer cells, further reducing the impact on healthy tissues [52, 53].

Although there have been significant advancements in the CRISPR gene-editing technology, with over 800 cell and gene therapy programs in existence, only a limited number of CRISPR-based tools have successfully advanced beyond preclinical trials [51]. Other gene editing methods, such as TALENs and ZFNs, have been explored extensively in clinical settings and have been reviewed elsewhere. Figure 5 illustrates different strategies for editing cells using CRISPR technology in patients. The development of CRISPR-based cancer therapy is a rapidly evolving field that is moving from preclinical studies to clinical trials [54]. Preclinical studies are essential for evaluating the safety and efficacy of CRISPRbased cancer therapy before it can be tested in humans [55]. Clinical trials are the final step in the development process and are used to determine the safety and efficacy of a therapy in humans.

Preclinical studies are a critical step in the development of any new cancer therapy, including those based on CRISPR technology [56]. Several studies are conducted in laboratory animals, such as mice and rats, and are used to evaluate the safety, efficacy, and potential side effects of a new therapy. Figure 6 illustrates the application of CRISPR in cancer modeling for cells and mice. MartinezLage et al. presented a clever preclinical approach targeting oncogenic gene fusions, aiming for both tumor cell selectivity and disruption of a tumor-promoting genetic lesion. This strategy took advantage of the unique fusion characteristic and demonstrated potential effectiveness [57]. Another preclinical example by Gao et al. focused on exploiting nuclear factor-кB (NF-кB), which is selectively activated in cancer cells, to drive the transcription of CRISPR-Cas13a components. This resulted in cancer cell-restricted oncogene silencing, offering a promising avenue for cancer therapy [58]. Table 2 presents a summary of preclinical studies exploring the potential of CRISPR-based cancer therapy across various cell types.
P53 is a critical tumor suppressor protein responsible for regulating cell cycle progression and preventing the formation of cancerous cells [94]. In the context of CRISPR/Cas9 genome editing, the activity of P53 becomes a crucial concern as the use of this technology may lead to non-targeted site effects, causing unintended DNA damage [95]. Therefore, it is essential to evaluate
the impact of CRISPR/Cas9 on P53 expression and function to ensure the safety and efficacy of the editing process [96]. P53 plays a crucial role in monitoring the integrity of the cell’s DNA and inducing cell cycle arrest or apoptosis in case of DNA damage [97]. Unfortunately, P53 is susceptible to mutations, leading to its inactivation or dysfunction. These mutations are common in many cancer types, including lung cancer, and contribute to uncontrolled cell growth and tumor development [98]. Modifying the P53 gene can restore its function, leading to the suppression of cancer cell growth [94]. When the modified P53 gene is activated, it enhances the production of the P21 protein, a well-known tumor suppressor that regulates the cell cycle. Increased P21 expression induces cell cycle arrest, preventing cancer cells from proliferating uncontrollably [96]. Moreover, the activation of P21 also makes cancer cells more susceptible to chemotherapy, as cells with active P21 proteins are more prone to apoptosis when exposed to chemotherapy drugs. P21, also known as cyclin-dependent kinase inhibitor 1A (CDKN1A), is a cyclin-dependent kinase inhibitor that plays a pivotal role in regulating the cell cycle and promoting cell cycle arrest. In the context of CRISPR/Cas9 genome editing, P21 may act as a dou-ble-edged sword [99]. On one hand, its upregulation in response to DNA damage caused by CRISPR/Cas9 may induce cell cycle arrest, preventing cells from proliferating and potentially compromising the effectiveness of the

editing process [100]. On the other hand, P21 can promote DNA repair, which might be beneficial for repairing non-specific site effects [101]. Hence, understanding the interplay between P21 and CRISPR/Cas9 is essential for optimizing the editing outcomes [100]. The P21 protein plays a crucial role in controlling the cell cycle by inhibiting CDKs, which are essential for cell division. By inhibiting CDKs, P21 halts the progression of the cell cycle, leading to cell cycle arrest. This pause in cell division allows the cell time to repair DNA damage before continuing with cell replication [94]. Consequently, when P21 is activated, cancer cells are unable to grow and divide rapidly, reducing tumor growth and progression [97]. Cancer cells with active P21 proteins are more responsive to chemotherapy due to their increased susceptibility to apoptosis [100]. Chemotherapy drugs target rapidly dividing cells, and by arresting the cell cycle through P21 activation, the cancer cells become more vulnerable to the cytotoxic effects of these drugs [99]. Additionally, the activation of P21 may also facilitate DNA repair mechanisms, enhancing the cell’s ability to detect and repair chemotherapy-induced DNA damage, thus reducing the chance of drug resistance. Dysregulation of P53 or P21 in

CRISPR/Cas9 genome editing could lead to several outcomes [101]. Excessive activation of P53 might trigger cell death pathways, resulting in increased toxicity and adverse effects [100]. On the other hand, impaired P53 activity could promote the survival of cells with unintended mutations, potentially leading to tumorigenesis [97]. Similarly, altered expression of P21 could impact the editing efficiency, cell viability, and potential undesirable site effects [100]. Evaluating the consequences of P53 and P21 dysregulation is vital for understanding the safety and reliability of CRISPR/Cas9-based therapies [99]. To minimize P53 and P21-related complications during CRISPR/Cas9 genome editing, optimizing the delivery methods of CRISPR/Cas9 components is crucial [100]. Researchers can explore using advanced delivery systems, such as nanoparticle-based carriers or viral vectors, to improve the efficiency and specificity of targeting [97]. Additionally, employing cell-type-specific promoters for Cas9 expression could reduce non-targeted site effects and limit potential impacts on P53 and P21 expression levels [94]. Moreover, pre-screening potential target sites and rigorously validating guide RNA sequences can aid in selecting the most effective and specific targets,

minimizing unintended effects on P53 and P21 pathways [100]. Hartmann et al. (2021) focused on the implementation of CRISPR/Cas9 genome editing to generate murine lung cancer models that accurately represent the mutational landscape of human disease. Lung cancer remains a significant global health issue with low survival rates, highlighting the need for innovative treatments. The researchers aimed to develop surrogate models that mimic the somatic mutations observed in lung cancer patients, as these mutations significantly impact treatment responses. By employing CRISPR-mediated genome editing, the team successfully targeted Trp53 and KRas genes, effectively recreating the classic murine non-small cell lung cancer (NSCLC) model Trp53fl/fl:lslKRasG12D/wt. The resulting tumors displayed similar morphology, marker expression, and transcriptional profiles compared to tumors derived from the Trp53fl/ fl:lsl-KRasG12D/wt model. The study demonstrated the applicability of CRISPR/Cas9 for in vivo tumor modeling, providing an alternative to conventional genetically engineered mouse models. Interestingly, tumor onset was achieved not only through constitutive Cas9 expression but also by infecting lung epithelial cells of wild-type animals with two distinct adeno-associated viruses (AAVs) encoding different components of the CRISPR machinery. This approach simplified the process by eliminating the need for extensive husbandry to incorporate new genetic features in conventional mouse models. Overall, the utilization of the CRISPR toolbox in cancer research and modeling is rapidly advancing, enabling researchers
to efficiently develop new and clinically relevant surrogate models for translational studies [102].

The BRCA1 gene encodes a tumor suppressor protein that plays a crucial role in DNA repair and maintaining genomic stability [103]. When cells experience DNA damage, BRCA1 is involved in signaling pathways that activate P21, a cyclin-dependent kinase inhibitor [104]. P21 inhibits cell cycle progression, allowing time for DNA repair mechanisms to fix the damaged DNA. This activation of P21 helps prevent the propagation of cells with potentially harmful mutations, reducing the risk of tumorigenesis [105]. Mutations in the BRCA1 gene can disrupt its normal function, impairing DNA repair processes and leading to genomic instability [106]. Consequently, the activation of P21 may be compromised, allowing damaged cells to evade cell cycle arrest and repair checkpoints [107]. This increases the likelihood of these cells acquiring additional mutations, potentially leading to the development of cancer [108]. Understanding the intricate interplay between BRCA1 and P21 is crucial for developing targeted therapies and interventions for individuals with BRCA1 mutations or related cancers [109]. The research revealed that modifying the BRCA1 gene resulted in the suppression of cancer cell growth and heightened responsiveness of these cancer cells to chemotherapy [110]. Specifically, the alteration of the BRCA1 gene triggered the activation of the P21 protein, a well-known tumor suppressor protein that contributes to halting the cell cycle [107]. This activation, in turn, caused a reduction in cell growth and made
the cancer cells more susceptible to chemotherapy, as P21-activated cells tend to be more responsive to chemotherapy treatment [106, 111]. Some researchers highlight the potential of CRISPR-based base editing as a valuable resource for the functional evaluation and reclassification of variants of uncertain significance (VUSs) in the BRCA1 gene. Furthermore, this investigation tackled the obstacles associated with assessing functionality and determining the pathogenicity of new BRCA1 variants, which are known to substantially elevate the risk of breast and ovarian cancers and are typically identified through clinical genetic testing. To surmount these hurdles, the scientists employed CRISPR-mediated cytosine base editor BE3 for functional analysis. They carried out a comprehensive screening of CRISPR-mediated base editing using 745 guide RNAs targeting all exons in BRCA1, identifying several previously unidentified variants, including c.-97C > T, c.154C > T, c.3847C > T, c.5056C > T, and c.4986+5G>A. The study effectively showcased the utility of CRISPR-mediated base editing as a potent instrument for reevaluating variants of uncertain significance (VUSs) in BRCA1, offering valuable insights for clinical management. This reclassification of VUSs in BRCA1 can have substantial implications for patients and healthcare providers. Patients with clarified variant classifications can receive more precise risk assessments and individualized treatment plans, potentially involving heightened surveillance or preventative measures. For healthcare providers, accurate variant classification guarantees appropriate counseling and risk communication for patients and their families [112].

KRAS is a proto-oncogene that, when mutated, plays a crucial role in the development of various cancers, including colon cancer. Mutated KRAS promotes uncontrolled cell growth, leading to tumor formation [113]. Editing the KRAS gene using CRISPR-Cas9 technology can lead to the activation of the P21 protein, a wellknown tumor suppressor. P21 promotes cell cycle arrest by inhibiting cyclin-dependent kinases, effectively halting cancer cell growth [114]. CRISPR-Cas9 utilizes a gRNA designed to complement a specific DNA sequence in the KRAS gene. The Cas9 enzyme, guided by the gRNA, introduces a double-strand break in the DNA, prompting the cell’s repair machinery to introduce errors that disrupt KRAS gene function [115]. The gRNA guides the Cas9 enzyme to the target site, where it introduces a dou-ble-strand break in the DNA. The cell’s repair machinery then repairs the break, often introducing errors that disrupt the function of the KRAS gene [116]. undesirable site effects refer to unintended modifications of DNA at sites other than the intended target [117]. Although CRISPR-Cas9 has been significantly improved to reduce non-specific site effects, there is still a possibility of
off-target edits. Careful gRNA design, utilizing advanced algorithms, and validation of potential non-specific sites through sequencing can minimize these effects [118]. Efficient delivery of CRISPR-Cas9 components to target cells remains a challenge [119]. Methods such as viral vectors, lipid nanoparticles, and electroporation have been explored. Each approach has advantages and limitations in terms of efficiency, toxicity, and specificity [120]. The activation of the P21 protein, a well-known tumor suppressor, promotes cell cycle arrest by inhibiting cyc-lin-dependent kinases that regulate cell division. By halting the cell cycle, the growth of cancer cells is inhibited [121]. Activating the P21 protein through editing the KRAS gene can sensitize cancer cells to chemotherapy [122]. The increased expression of P21 leads to cell cycle arrest, which allows the chemotherapy drugs to target and kill the cancer cells more effectively [123]. Activating the P21 protein through KRAS gene editing sensitizes cancer cells to chemotherapy. Cell cycle arrest caused by P21 activation allows chemotherapy drugs to more effectively target and eliminate cancer cells [115].

The EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor) gene plays a crucial role in cell growth, proliferation, and differentiation [124]. Mutations in the EGFR gene are associated with various cancers, particularly in NSCLC. CRISPR-Cas9 is a gene-editing technology that utilizes a guide RNA to target specific DNA sequences and the Cas9 enzyme to create double-strand breaks at the targeted location. These breaks can then be repaired, either through NHEJ or HDR, resulting in gene mutations or precise edits, respectively [125]. In the context of EGFR, CRISPR-Cas9 can be programmed to target and modify the mutated sequences responsible for cancer growth, potentially inhibiting tumor progression and improving patient outcomes [126]. Editing the EGFR gene using CRISPR-Cas9 can have both positive and negative consequences [124]. On the positive side, it can help correct mutations or deletions in the gene that are associated with certain diseases, such as lung cancer [127]. However, it is crucial to consider potential non-targeted site effects, as unintended changes in other parts of the genome could lead to unexpected consequences or disruptions in gene function [128]. The efficiency of CRISPR-Cas9 in editing the EGFR gene can vary depending on various factors, including the specific gRNA design, delivery method, and cell type [125]. Studies have shown that CRISPR-Cas9 can achieve high editing efficiency, but it is important to optimize the experimental conditions to maximize the desired outcomes [124]. CRISPR-Cas9 has high specificity, thanks to the precise binding of the guide RNA to the target DNA sequence [127]. However, there remains a concern of non-specific site effects, where Cas9 may unintentionally edit other genomic regions
with partial similarity to the target site [124]. Extensive research and optimization of guide RNA design have significantly reduced undesirable site effects [127]. State-of-the-art Cas9 variants, such as high-fidelity Cas9 and base editors, have further improved specificity, minimizing the risk of unintended genetic modifications [124]. Challenges associated with CRISPR-Cas9 editing of the EGFR gene include undesirable site effects, delivery efficiency, and potential long-term effects. Ethical considerations include the need for informed consent, ensuring equitable access to the technology, and responsible use to avoid unintended consequences or the creation of “designer babies.” Rigorous evaluation, regulation, and ethical guidelines are essential to navigate these challenges and ensure the responsible application of CRISPR-Cas9 in editing the EGFR gene or any other gene [128].
CRISPR-Cas9 editing of the VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) gene can play a crucial role in various cancers. VEGF is a protein that promotes the growth of new blood vessels, a process known as angiogenesis, which is essential for tumor development and metastasis [129]. By targeting and disrupting the VEGF gene using CRISPR-Cas9, researchers can potentially hinder the production of VEGF and, consequently, inhibit tumor angiogenesis. This could lead to reduced tumor growth and increased sensitivity to other cancer treatments [130]. While CRISPR-Cas9 is highly specific, there is a possibility of off-target effects where unintended gene edits occur. In the case of VEGF gene editing, researchers must carefully assess potential off-target sites to ensure that no critical genes are unintentionally modified [131]. To minimize undesirable site effects, rigorous bioinformatics analyses and advanced screening methods are employed to select guide RNAs with the least likelihood of non-specific site activity. CRISPR-Cas9-based VEGF gene editing, on its own, may not be sufficient for complete cancer treatment [129]. While it can impede tumor angiogenesis, a comprehensive cancer treatment strategy usually involves combining CRISPR-Cas9 with other therapies like chemotherapy, radiation, or immunotherapy [130]. Combining treatments can lead to a synergistic effect, targeting cancer cells through multiple pathways and increasing the overall therapeutic efficacy [129]. Delivering CRISPR-Cas9 components to cancer cells poses a significant challenge [131]. The large size of the Cas9 protein and guide RNA complex may limit delivery methods [131]. Various approaches are being explored, including viral vectors, nanoparticles, and liposomes, to ensure efficient and safe delivery to target cancer cells while avoiding harm to healthy tissues [129]. Ensuring long-term and stable VEGF gene suppression is essential for sustained therapeutic effects [131]. Researchers are investigating methods to improve CRISPR-Cas9 delivery
and stability within cancer cells [129]. Strategies like utilizing modified Cas9 variants or integrating the CRISPR components into the genome of the target cells could potentially enhance the durability of VEGF gene editing and its anticancer effects [131].

Editing the BCL-2 gene using CRISPR-Cas9 in cancer treatment holds significant potential due to the role of the BCL-2 protein in promoting cancer cell survival [132]. By targeting and modifying the BCL-2 gene, researchers aim to disrupt the overexpression or dysregulation of this protein, which can lead to apoptosis resistance and tumor growth. CRISPR-Cas9 offers a precise and efficient method to edit the BCL-2 gene and potentially restore normal cell death mechanisms [133]. CRISPR-Cas9 utilizes guide RNAs designed to match specific sequences within the BCL-2 gene [130]. When the guide RNA finds a complementary match, it guides the Cas9 enzyme to that location, initiating a double-stranded DNA break at the target site [134]. Non-targeted site effects refer to unintended changes in DNA at sites similar to the target sequence [132]. To minimize undesirable site effects, researchers employ bioinformatic tools to carefully design guide RNAs with high specificity [134]. Additionally, thorough validation experiments are conducted to identify and mitigate any potential off-target sites [133]. BCL-2 is an anti-apoptotic gene that helps cancer cells evade cell death mechanisms [134]. By editing the BCL-2 gene, CRISPR-Cas9 can disrupt its function, promoting apoptosis in cancer cells and potentially hindering tumor growth [133]. Delivering CRISPR-Cas9 components to specific cancer cells in a patient’s body poses significant challenges [132]. Researchers are exploring various delivery methods, including viral vectors and nanoparticles, to ensure efficient and targeted delivery while minimizing potential side effects [132]. Preclinical studies on animal models and in vitro experiments have shown promising results in targeting the BCL-2 gene with CRISPR-Cas9. However, clinical trials are essential to assess the safety and effectiveness of this approach in human patients [134]. Understanding the potential long-term consequences of BCL-2 gene editing is crucial. Researchers need to investigate whether edited cells retain their normal functionality and whether any unintended effects on other cellular processes occur [133]. The use of CRISPRCas9 in cancer treatment raises ethical questions about genetic manipulation, informed consent, and equitable access to advanced therapies [132]. Researchers and policymakers must address these concerns to ensure responsible and equitable application of this technology [134].

CRISPR-Cas9 editing of the PTEN gene can have significant effects on cancer progression [135]. PTEN is a tumor suppressor gene that regulates cell growth and division [136]. When PTEN is mutated or deleted, it leads
to uncontrolled cell growth, a hallmark of cancer [137]. By using CRISPR-Cas9 to precisely target and edit the PTEN gene, researchers can potentially restore its function as a tumor suppressor, thereby inhibiting cancer cell growth and reducing tumor development [138]. The potential of CRISPR-Cas9-mediated PTEN gene editing as a treatment option varies among different cancer types [136]. Some cancers exhibit PTEN mutations as a dominant driver of tumorigenesis, making them more amenable to this approach [135]. However, the efficacy of this strategy may depend on the cancer’s genetic context, as some tumors may possess alternative mechanisms to bypass PTEN function [138]. Extensive preclinical studies and clinical trials are required to determine its applicability and effectiveness across diverse cancer types [135]. Safety concerns in CRISPR-Cas9 gene editing for PTEN in cancer therapy involve potential undesirable site effects, where unintended genetic changes could occur in noncancerous cells, leading to adverse consequences [136]. Additionally, the risk of introducing new mutations or altering other essential genes must be carefully evaluated to avoid unwanted side effects [138]. Rigorous testing in preclinical models and careful monitoring during clinical trials are crucial to ensure the safety and feasibility of this therapeutic approach [135]. Researchers are continuously exploring various strategies to improve CRISPR-Cas9 gene editing efficiency [136]. One approach involves optimizing the delivery system to ensure precise targeting of cancer cells. Additionally, advancements in CRISPR-Cas9 technology, such as using base editors or prime editors, offer more precise modifications and reduced non-targeted site effects [138]. Moreover, combining CRISPRCas9 with other therapies, such as immunotherapies or targeted therapies, may enhance the overall therapeutic response, allowing for a more comprehensive and effective treatment strategy. Several challenges need to be addressed when using CRISPR-Cas9 to edit the PTEN gene in cancer cells [135]. Firstly, efficient delivery of CRISPR components to specific cancer cells is crucial to avoid non-targeted site effects [138]. Secondly, ensuring the correct and precise editing of the PTEN gene without introducing unintended mutations is vital for therapeutic success [135]. Additionally, the immune response to the CRISPR components and potential immune rejection of edited cells must be evaluated to assess their long-term viability and safety [138].

The TERT gene, which encodes the telomerase reverse transcriptase enzyme, plays a critical role in maintaining telomeres, the protective caps at the ends of chromosomes [139]. In many cancer types, the TERT gene is upregulated, leading to increased telomerase activity. This allows cancer cells to bypass the natural limitations on cell division and achieve immortality, contributing
to tumor growth and progression. CRISPR-Cas9 can be employed as a gene-editing tool to target and modify the TERT gene in cancer cells [140]. The CRISPR-Cas9 system consists of a guide RNA that directs the Cas9 nuclease to the desired genomic location [141]. By designing a guide RNA specific to the TERT gene sequence, researchers can guide Cas9 to the TERT gene and induce a DSB at the targeted site [142]. The cell’s DNA repair machinery then repairs the break, often through the error-prone NHEJ pathway, which introduces small insertions or deletions (indels) that disrupt the TERT gene’s function [139]. Alternatively, researchers can use CRISPR-Cas9 in combination with a repair template to introduce specific modifications to the TERT gene sequence, such as gene knockouts or point mutations [141]. Editing the TERT gene using CRISPR-Cas9 can lead to several outcomes. One possibility is the disruption of TERT gene function, resulting in decreased telomerase activity in cancer cells. This can lead to telomere shortening and cellular senescence or apoptosis, inhibiting the unlimited replicative potential of cancer cells [139]. Another potential outcome is the modification of TERT gene expression, such as reducing its expression level, which can hinder tumor growth [142]. Additionally, CRISPR-Cas9-mediated TERT gene editing may sensitize cancer cells to other therapies, as telomerase inhibition can enhance the effectiveness of conventional treatments like chemotherapy or radiation therapy [139].

NF-kB is a protein involved in regulating inflammation and is often overly active in various cancer types, including pancreatic cancer [143]. Researchers discovered that modifying the NF-kB gene resulted in hindering cancer cell growth and rendering the cancer cells more receptive to chemotherapy [144]. The study specifically revealed that editing the NF-kB gene suppressed the NF-kB protein, which is responsible for promoting inflammation and stimulating cell growth [145]. Consequently, this inhibition of cell growth heightened the cancer cells’ sensitivity to chemotherapy since cells with subdued NF-kB protein display increased responsiveness to chemotherapy treatments [146]. Editing the NF-kB gene using CRISPR-Cas9 can have significant implications for cancer progression [143]. NF-kB is a transcription factor that plays a crucial role in regulating various cellular processes, including inflammation, cell survival, and proliferation [145]. By editing the NF-kB gene, CRISPR-Cas9 can potentially disrupt its activity, leading to the inhibition of cancer-promoting signaling pathways and the suppression of tumor growth [146]. Editing the NF-kB gene using CRISPR-Cas9 has the potential to enhance the sensitivity of cancer cells to conventional therapies [143]. NF-kB activation is often associated with
resistance to chemotherapy and radiation. By disrupting NF-kB signaling through CRISPR-Cas9 editing, cancer cells may become more vulnerable to standard cancer treatments, improving overall treatment outcomes [145]. While CRISPR-Cas9 editing of the NF-kB gene shows promise, it is important to evaluate potential side effects or unintended consequences [143]. undesirable site effects, where CRISPR-Cas9 edits unintended genomic sites, could lead to genetic instability or interfere with normal cellular functions [145]. Additionally, the long-term effects of NF-kB gene disruption on overall immune response and inflammatory processes need to be thoroughly assessed [144]. Optimizing the therapeutic potential of CRISPR-Cas9 editing of the NF-kB gene requires further research and development. Understanding the specific molecular characteristics of different cancer types and their NF-kB signaling pathways is essential for designing precise CRISPR-Cas9 strategies [145]. Additionally, advancements in delivery systems, such as viral vectors or nanoparticle-based carriers, can enhance the efficiency and specificity of NF-kB gene editing in cancer cells [143].

The CDK4 gene encodes Cyclin-Dependent Kinase 4, a crucial protein involved in cell cycle regulation [147]. CDK4 forms complexes with cyclin D, leading to cell cycle progression from G1 to S phase [148]. In various cancers, the overexpression or amplification of CDK4 has been observed, promoting uncontrolled cell proliferation and tumorigenesis [149]. CRISPR-Cas9 uses guide RNA molecules that complementarily bind to the target DNA sequence within the CDK4 gene [148]. The Cas9 protein, acting as a molecular scissors, then cleaves the DNA at the precise location indicated by the guide RNA. This induces double-strand breaks in the CDK4 gene, triggering the cell’s DNA repair machinery, which may lead to gene knockout or targeted mutations [149]. Preclinical studies using CRISPR-Cas9 have shown promising results in inhibiting CDK4 expression and reducing tumor growth in various cancer models, such as melanoma, breast cancer, and glioblastoma. These studies have provided valuable insights into the potential therapeutic efficacy of CRISPR-based CDK4 targeting [150]. As of the current knowledge cutoff, several clinical trials are likely underway or being planned to evaluate the safety and efficacy of CRISPR-Cas9 in editing the CDK4 gene in cancer patients. These trials will help determine the feasibility and potential benefits of CRISPR-based strategies in real-world clinical settings [151]. One challenge is the efficient delivery of CRISPR-Cas9 components to the cancer cells. Ensuring high delivery rates and minimizing non-targeted site effects is essential for successful therapy [148]. Additionally, CDK4 may have
important functions in normal cells, so targeting it may cause unintended consequences in non-cancerous tissues [149].

Clinical trials exploring the potential of CRISPR-based cancer therapy are currently in their early development stages. Nevertheless, multiple clinical trials have been launched to assess how safe and effective CRISPR-based cancer treatment is for humans. Frangoul et al.’s research is focused on the utilization of CRISPR-Cas9 gene editing to address two severe monogenic diseases [152]: Transfusion-dependent -thalassemia (TDT) and sickle cell disease (SCD) are both severe and potentially lifethreatening conditions. Researchers focused on targeting a specific transcription factor called BCL11A, which is known to inhibit the production of fetal hemoglobin and -globin in erythroid cells. To achieve this, they utilized the CRISPR-Cas9 system to modify the BCL11A erythroid-specific enhancer in CD34+hematopoietic stem and progenitor cells derived from healthy donors. Remarkably, this editing approach successfully altered about of the alleles at this genetic locus without any unintended undesirable site effects. After the gene editing, two patients, one with TDT and the other with SCD, underwent transplants of the edited CD34+ cells following myeloablation to remove their existing bone marrow. More than a year later, both patients exhibited significant allelic editing in their bone marrow and blood, accompanied by a substantial increase in fetal hemoglobin levels, leading to their independence from transfusions. Notably, the patient with SCD no longer experienced vasoocclusive episodes, painful and damaging events caused by sickle-shaped red blood cells. The clinical trials for these treatments were registered on ClinicalTrials.gov with the identifiers NCT03655678 for CLIMB THAL-111 (for -thalassemia) and NCT03745287 for CLIMB SCD121 (for sickle cell disease). It’s worth mentioning that this research received financial support from CRISPR Therapeutics and Vertex Pharmaceuticals (Fig. 7).

One common strategy observed in several trials involves knocking out the PD1 gene, which encodes for the programmed cell death protein 1. PD1 is known to be involved in inhibiting T cell activity, and by removing it, the modified T cells, known as autologous TILs and autologous EBV-specific CTLs, can become more potent at recognizing and attacking cancer cells. The Phase I clinical trials NCT03081715 [153] and NCT02793856 focus on PD1 KO Autologous TILs, while NCT03044743 [154] investigates PD1 KO Autologous EBV CTLs. Additionally, another study (NCT04417764) explores the same PD1 KO Autologous TILs strategy [155]. Another approach involves the simultaneous knockout of PD1

and the TCR gene ( T cell receptor) in allogeneic meso-thelin-targeting Chimeric Antigen Receptor (CAR) T cells. This strategy is being tested in the Phase I clinical trial NCT03545815 [156]. By eliminating TCR, the CAR T cells can avoid potential adverse effects like graft-ver-sus-host disease (GVHD) while targeting mesothelinexpressing cancer cells. Furthermore, some trials focus
on targeting other genes to improve CAR T cell therapy. For instance, the clinical trial NCT04037566 aims to enhance the effectiveness of CD19-targeting CAR T cells by editing the endogenous HPK1 gene [157]. Similarly, NCT04767308 utilizes endogenous CD5 knockout in allogeneic CD5-targeting CAR T cells during the early phase I trial to potentially enhance their efficacy
[158]. Moreover, NCT03166878 uses the knockout of both TCR and (beta- 2 microglobulin) in allogeneic CD19-targeting CAR T cells [158]. The removal of TCR prevents GVHD, and the absence of results in reduced expression of MHC-I, which can otherwise suppress CAR T cell activity. Other trials in Table 2 involve the insertion of CAR into T cells after knocking out specific genes. For example, NCT04502446 uses CRISPR to insert the CAR gene while simultaneously knocking out endogenous TCR and MHC-I in allogeneic CD70-targeting CAR T cells [159]. Similarly, NCT04244656 targets BCMA (B cell maturation protein) in allogeneic CAR T cells while knocking out endogenous TCR and MHC-I to boost their cancer-targeting ability [159]. Furthermore, NCT04637763 explores the knockout of PD1 and endogenous TCR in allogeneic CD19-targeting CAR T cells [159]. This approach aims to improve the persistence and activity of CAR T cells in attacking CD19-expressing cancer cells. Table 3 presents clinical trials of CRISPR-based cancer therapies targeting different cancer types.

CRISPR-Cas9, a revolutionary gene-editing technology, holds immense promise for the treatment of various genetic disorders and diseases [203]. However, its widespread adoption faces significant safety and delivery challenges [204]. One of the primary concerns with CRISPR-Cas9 is its potential to introduce unintended genetic changes, known as undesirable site effects, which could lead to unforeseen consequences and trigger new health problems [205]. Scientists and researchers must develop more precise and reliable methods to minimize these non-targeted site effects to ensure the safety and efficacy of the treatment [206, 207]. Additionally, delivering the CRISPR-Cas9 components into specific cells and tissues poses a significant hurdle [208, 209]. Finding efficient delivery methods that can effectively target the intended cells while avoiding adverse reactions in surrounding tissues is crucial [203]. Overcoming these safety and delivery challenges is fundamental to unlocking the full potential of CRISPR-Cas9 as a transformative therapeutic approach, offering hope for patients suffering from genetic ailments. Robust research and rigorous testing will be essential to ensure that the benefits of this groundbreaking technology outweigh any potential risks [205]. Table 4 presents the safety and delivery challenges associated with CRISPR-based cancer therapy.

The evaluation of off-target effects in gene editing is crucial to ensuring the safety and precision of genetic modifications [214]. Advancements in base editors and
prime editors aim to minimize non-selective site effects, but ongoing research and ethical considerations are necessary to harness these technologies responsibly for therapeutic applications and other genetic interventions [215]. Off-target effects refer to unintended changes or alterations in the DNA that occur when using gene editing technologies like CRISPR-Cas systems. These unintended modifications can happen at sites other than the targeted location, potentially leading to unpredictable and unwanted genetic changes [214]. Base editors are a recent advancement in CRISPR technology that can perform targeted chemical modifications to specific DNA bases without creating double-stranded breaks like traditional CRISPR-Cas systems. This targeted approach reduces the risk of undesirable site effects by minimizing the potential for random DNA alterations [215]. Prime editors offer enhanced precision in gene editing compared to base editors or traditional CRISPR-Cas systems. They combine the capabilities of base editors and nickases, allowing for accurate insertion, deletion, and substitution of particular genetic bases within the genome. This increased precision further reduces the likelihood of non-targeted site effects [216]. Scientists use various techniques to assess non-selective site effects, such as whole-genome sequencing, high-throughput sequencing, and computational analysis. These methods help identify unintended genetic changes and determine the efficiency and specificity of the gene-editing technology being used [217]. Despite the advancements in base editors and prime editors, off-target effects remain a concern [217]. The challenge lies in achieving absolute precision in targeting specific genomic sites without affecting nearby regions [215]. Continuous refinement of gene-editing tools, along with rigorous evaluation and validation methods, are crucial to overcoming these challenges [216]. To ensure the safety of using base editors and prime editors in therapeutic settings, comprehensive preclinical studies are necessary. These studies involve rigorous testing of the gene-editing tools on relevant cell lines and animal models to assess potential non-targeted site effects and ensure the accuracy of genetic modifications before progressing to human trials [215].

One strategy is to use high-fidelity Cas9 variants, which have been engineered to have reduced off-target activity [215]. Another strategy is to use alternative CRISPR systems, such as Cpf1 or Cas12a, which have unique mechanisms of target recognition and have shown to have lower off-target activity compared to Cas9 [218]. Another strategy is to use a combination of gRNA and Cas9 variants with high specificity, or to use multiple gRNAs to target the same gene. This increases the specificity of the CRISPR-based gene editing and reduces the risk of non-targeted site effects [219]. Another way

to minimize off-target effects is to use computational tools to predict potential undesirable site sites and to experimentally validate these predictions. This allows researchers to identify and avoid non-selective site sites before they cause unintended mutations [220]. Finally, it is important to note that off-target effects can also arise from the delivery method used to deliver the CRISPR machinery to the cells [221]. Researchers are developing a variety of methods to deliver CRISPR to the tumor site, including viral vectors, nanoparticles, and exosomes [222]. Research by Xiang et al. focuses on improving the efficiency prediction of CRISPR-Cas9 gRNAs using data integration and deep learning (Fig. 8). The primary aim is to enhance the accuracy of identifying gRNAs that will be more effective in targeting specific DNA sequences. CRISPR-Cas9 is a powerful gene-editing tool that relies on gRNAs to guide the Cas9 enzyme to the target DNA site for editing. Efficient gRNA design is crucial for successful genome editing, and this requires reliable
predictions of on-target efficiency. To achieve this, the researchers gathered high-quality gRNA activity data for 10,592 gRNAs that target the SpCas9 enzyme. To further improve their predictions, the researchers integrated this new data with existing complementary data from other sources. They then employed a deep learning model called “CRISPR on,” which was trained on a combined dataset of 23,902 gRNAs, including both the newly generated data and the previously available data. The results of their study showed that CRISPR on outperformed existing tools used for gRNA efficiency prediction. The improved performance was observed across four test datasets that were not part of the training data used for developing other prediction tools. This suggests that CRISPR on’s predictions were more accurate and reliable than what was currently available. To make their findings accessible to the scientific community, the researchers developed an interactive webserver for gRNA design based on the CRISPR on

standalone software. This webserver allows researchers to easily access and use the CRISPR on tool for designing gRNAs with higher efficiency [223]. However, these delivery methods are still in early stages of development and more research is needed to optimize their effectiveness and safety [224]. Undesirable site effects are a major concern in CRISPR-based gene editing, and they are particularly relevant in the context of cancer therapy [224]. Researchers are developing new strategies to minimize the risk of non-selective site effects, including using highfidelity Cas9 variants, alternative CRISPR systems, computational tools, and optimized delivery methods [224, 225]. While these strategies have shown promise, much work remains to be done to ensure that CRISPR-based gene editing is safe and effective for cancer therapy [226]. Non-targeted site effects refer to unintended changes in the DNA of cells caused by the CRISPR-Cas9 system. These changes can occur in genes that were not intended to be targeted by the CRISPR-Cas9 system. These unintended changes can compromise the therapeutic effect of gene editing and potentially lead to harmful consequences [227]. Researchers used CRISPR-Cas9 to target the PIK3CA gene in human cancer cells. PIK3CA is a well-established oncogene, or a gene that promotes the development of cancer. The researchers found that the CRISPR-Cas9 system caused unintended mutations in several non-targeted site genes, including the AKT1 gene. These undesirable site effects could have compromised the therapeutic effect of targeting PIK3CA, as these mutations could activate AKT1 and thus promote cancer growth [228]. Similarly, other researchers used CRISPR-Cas9 to target the KRAS gene in human cancer cells. KRAS is also a well-established oncogene. Investigators found that the CRISPR-Cas9 system caused unintended mutations in several off-target genes, including the NF1 gene. These non-selective site effects could have compromised the therapeutic effect of targeting KRAS, as these mutations could inactivate NF1 and thus promote cancer growth [229]. Researchers used CRISPRCas9 to target the MYC gene in human cancer cells. MYC is a well-established oncogene. They found that the CRISPR-Cas9 system caused unintended mutations in several off-target genes, including the BCL2L11 gene. These undesirable site effects could have compromised the therapeutic effect of targeting MYC, as these mutations could activate BCL2L11 and thus promote cancer growth [230]. Other researchers used CRISPR-Cas9 to target the TERT gene in human cancer cells. TERT is a gene that promotes the growth of cancer. They found that the CRISPR-Cas9 system caused unintended mutations in several off-target genes, including the NFE2L2 gene. These non-targeted site effects could have compromised the therapeutic effect of targeting TERT, as these
mutations could inactivate NFE2L2 and thus promote cancer growth [139]. The purpose of using CRISPR-Cas9 was to investigate the potential therapeutic effect of targeting the BRCA1/TP53/RAS gene, which is commonly mutated in breast and ovarian cancer/cancer [231]. The unintended consequences of using CRISPR-Cas9 on the BRCA1/TP53/RAS gene were unintended mutations in several off-target genes, including RAD51D/MDM2/ MAPK, respectively [232]. The unintended mutations in RAD51D/MDM2/MAPK genes could have compromised the therapeutic effect of targeting BRCA1/TP53/RAS as they could activate RAD51D/ inactivate MDM2/activate MAPK, leading to the promotion of cancer growth [233]. The frequent findings of unintended mutations in undesirable site genes in these studies highlight the significant risk of non-selective site effects associated with CRISPRCas9 gene editing [234]. The research should analyze and compare the off-target effects observed when targeting different genes, which could provide insights into the gene-specific effects of CRISPR-Cas9 [235, 236]. Understanding the off-target effects and their potential impact on cancer growth is crucial in assessing the safety and efficacy of CRISPR-Cas9 as a therapeutic approach for cancer treatment [232, 237].

Safety is a critical concern in the development of CRISPR-based cancer therapy [238]. CRISPR-based gene editing has the potential to cause unintended mutations in the genome, which can lead to serious side effects. This is particularly concerning in cancer therapy, where the goal is to target specific genetic mutations that drive tumor growth [239]. One of the main safety concerns with CRISPR-based cancer therapy is the potential for non-targeted site effects. This occurs when the CRISPR machinery targets unintended genes, leading to unintended mutations [240]. Researchers are working to develop more precise CRISPR delivery methods and to improve the specificity of the guide RNAs used to target specific genes [241]. Newer versions of CRISPR- Cas12a and Cas13 for example, have a higher specificity than the original Cas9, which helps in reducing undesirable site effects [242]. Another safety concern is the possibility of creating new cancer-causing mutations [241]. CRISPR-based cancer therapy relies on the ability to precisely target specific genetic mutations that drive tumor growth [238]. However, if the CRISPR machinery inadvertently targets other genes, it could create new cancer-causing mutations [243]. To mitigate this risk, researchers are developing new strategies to minimize the risk of non-specific site effects and to better understand the long-term effects of CRISPR-based cancer therapy [238]. A third safety concern is the risk
of the edited cells becoming cancerous [240]. CRISPRbased cancer therapy relies on the ability to edit specific genetic mutations that drive tumor growth. However, if the edited cells acquire additional mutations, they could become cancerous [238]. Researchers are working to understand the long-term effects of CRISPR-based cancer therapy and to develop strategies to minimize the risk of the edited cells becoming cancerous [241]. In addition to these concerns, CRISPR-based cancer therapy raises a number of other safety concerns, including the potential for immune reactions to the viral vectors used to deliver CRISPR, and the risk of creating new cancer-causing mutations. To mitigate these concerns, researchers are developing safer delivery methods and developing new strategies to minimize the risk of non-targeted site effects [240]. Preclinical and clinical studies are being conducted to evaluate the safety and efficacy of CRISPR-based cancer therapy [238]. Additionally, researchers are working to find cost-effective and efficient methods for producing large numbers of CRISPR-edited cells, and to overcome scalability issues [240]. CRISPR-based gene editing has the potential to revolutionize cancer therapy, but significant safety challenges remain to be addressed before this approach can be safely and effectively used in the clinic [241]. Ongoing research is essential to better understand the long-term effects of CRISPR-based cancer therapy, to develop safer delivery methods, and to minimize the risk of non-targeted site effects and other safety concerns [240]. Another aspect of safety in CRISPR-based cancer therapy is the delivery method used to deliver the CRISPR machinery to the tumor cells. One of the most commonly used methods is the use of viral vectors, such as adenoviruses or lentiviruses [241]. However, these vectors have the potential to cause immune reactions and other adverse effects [238]. Researchers are working on developing non-viral delivery methods, such as nanoparticles and exosomes, as an alternative to viral vectors. These methods have the potential to be safer and more effective, but they are still in early stages of development and more research is needed to optimize their effectiveness and safety [241, 244]. Additionally, the manufacturing and scalability of CRISPR-based cancer therapy is another important safety concern. Producing large quantities of CRISPR-modified cells for clinical use is challenging and costly [241]. Researchers are working to find cost-effective and efficient methods for producing large numbers of CRISPR-edited cells, and to overcome scalability issues. This includes researching alternative methods of producing the CRISPR machinery and exploring ways to improve the efficiency of the CRISPR editing process [241]. Safety is a critical concern in the development of CRISPR-based cancer therapy [240]. Researchers are working to address these concerns by developing
safer delivery methods, developing new strategies to minimize the risk of non-targeted site effects and other safety concerns, and finding cost-effective and efficient methods for producing large numbers of CRISPR-edited cells [238]. Ongoing research is essential to better understand the long-term effects of CRISPR-based cancer therapy, and to ensure that this promising new approach can be safely and effectively used in the clinic. It’s important to note that while CRISPR-based cancer therapy is a promising new approach, it is still in the early stages of development. Many of the safety concerns and challenges discussed above are still being studied and evaluated in preclinical and clinical trials. Therefore, it is important to continue monitoring the progress of research in this field and to evaluate the safety and efficacy of CRISPRbased cancer therapy as more data becomes available [240]. It is also worth noting that the regulatory landscape for CRISPR-based cancer therapy is still evolving. Different countries and regions have different regulations and guidelines regarding the use of CRISPR-based therapies in humans [241]. Researchers and companies developing CRISPR-based cancer therapies will need to navigate these regulations and guidelines in order to bring their therapies to market [238]. The CRISPR-based cancer therapy has the potential to revolutionize cancer treatment, but significant safety challenges and delivery issues still need to be addressed. Researchers are working to address these concerns through ongoing research and development, but it will take time to fully understand the long-term effects and safety of this new approach. It is important to monitor the progress of research in this field and to evaluate the safety and efficacy of CRISPRbased cancer therapy as more data becomes available [241].

Delivery of CRISPR-based gene editing to the tumor site is a major challenge in the development of CRISPRbased cancer therapy [245]. CRISPR-based therapy uses a viral vector, nanoparticles, or exosomes to deliver the CRISPR machinery to the tumor cells [245]. The delivery method used is crucial for the efficiency of the therapy, as well as the safety of the patient [246]. One of the most commonly used methods to deliver CRISPR to the tumor site is through the use of viral vectors [247]. Viral vectors are modified versions of viruses that can be used to introduce genes or other genetic material into cells [248]. The most commonly used viral vectors for CRISPR delivery are adeno-associated viruses (AAVs) and lentiviruses. These vectors have been shown to efficiently deliver CRISPR to a variety of cells, including cancer cells [249]. However, the use of viral vectors raises safety concerns, as the immune system may recognize the virus as foreign
and mount an immune response. This can lead to inflammation and other adverse effects, and can also limit the effectiveness of the therapy [250]. Another method to deliver CRISPR to the tumor site is through the use of nanoparticles. These particles are small enough to easily penetrate the tumor tissue, and can be engineered to carry the CRISPR machinery [251]. Nanoparticles can also be designed to target specific cell types, such as cancer cells, to increase the efficiency of the therapy [252]. However, the efficacy of nanoparticles in delivering CRISPR to the tumor site is still being evaluated, and more research is needed to understand their safety and effectiveness [253]. Exosomes are also considered as a promising delivery method for CRISPR [254]. Exosomes are small vesicles that are naturally released by cells and can be engineered to carry CRISPR machinery [255]. Exosomes have the ability to cross the blood-brain barrier and deliver the CRISPR machinery to the tumor site. But more research is needed to understand the safety and efficacy of exosomes as a delivery method for CRISPR [256]. Researchers are developing CRISPR delivery methods that can target cancer cells based on surface markers, such as the expression of specific proteins [257]. Another approach is to target genetic mutations that are specific to cancer cells. This can be done by engineering the CRISPR machinery to recognize and target specific genetic sequences associated with cancer [255]. For example, researchers have developed CRISPRbased therapies that target specific mutations in genes such as KRAS, which is commonly mutated in many types of cancer [256]. A combination of these strategies to target specific cell types can also be used to deliver CRISPR to the tumor site [248]. For example, researchers are exploring the use of nanoparticles that are designed to target specific surface markers on cancer cells and also carry the CRISPR machinery [245]. Delivery of CRISPR to the tumor site is a critical step in the development of CRISPR-based cancer therapy [248]. Researchers are working to develop new and efficient methods for delivering CRISPR to the tumor site, including viral vectors, nanoparticles, and exosomes [251]. Additionally, targeting specific cell types, such as cancer cells, can increase the efficiency of the therapy. While significant challenges remain to be addressed, the potential of CRISPR-based cancer therapy to revolutionize cancer treatment is clear, and ongoing research will help to overcome these challenges [255].

CRISPR-based gene editing has the potential to revolutionize cancer therapy by precisely targeting genetic mutations that drive tumor growth [258]. However, significant challenges remain to be addressed before this
approach can be safely and effectively used in the clinic [200]. One of the major challenges is the manufacturing and scalability of CRISPR-modified cells for clinical use [259]. Manufacturing CRISPR-edited cells for use in cancer therapy is a complex and costly process. The first step is to obtain the cells that will be edited, which can be obtained from the patient or from a cell line. Once the cells are obtained, they must be modified using the CRISPR machinery. This typically involves delivering the CRISPR machinery, including the guide RNAs and Cas enzymes, to the cells using a viral vector or nanoparticle [260]. However, this process is not yet fully optimized and more research is needed to find efficient and cost-effective methods for producing large numbers of CRISPR-edited cells [261]. Scalability is also a major challenge in the manufacture of CRISPR-edited cells for cancer therapy [262]. The current methods for producing CRISPR-edited cells are not yet able to produce the large numbers of cells required for clinical use [258]. For example, if the cells are produced using a viral vector, the process is limited by the number of cells that can be infected at one time [263]. Additionally, the current methods for producing CRISPR-edited cells are not yet able to produce cells with a high enough efficiency to be clinically relevant [264]. There are a number of potential solutions to these challenges. Researchers are working to develop more efficient and cost-effective methods for producing CRISPR-edited cells, such as using exosomes as a delivery method, and to improve the scalability of the process [265]. Additionally, researchers are working to improve the efficiency of the CRISPR-editing process and to minimize the risk of non-targeted site effects [200]. Another potential solution to the scalability challenge is the use of cell lines that have been genetically engineered to produce high numbers of CRISPR-edited cells [259]. For example, researchers have developed cell lines that stably express Cas enzymes, which can be used to produce large numbers of CRISPR-edited cells [260]. Additionally, researchers are exploring the use of stem cells as a source for CRISPR-edited cells [264]. Stem cells have the ability to self-renew and differentiate into a wide range of cell types, making them an attractive option for producing large numbers of CRISPR-edited cells for cancer therapy. Another area of active research is the development of automated platforms for producing CRISPR-edited cells. These platforms can automate many of the manual steps involved in the production of CRISPR-edited cells, making the process more efficient and cost-effective [200]. Additionally, these platforms can be used to optimize the conditions for producing CRISPR-edited cells, such as the amount of Cas enzymes and guide RNAs used [259]. Finally, researchers are exploring the use of in situ delivery of CRISPR
machinery, which allows the cells to be edited directly in the tumor microenvironment [261]. This approach avoids the need to produce and deliver large numbers of CRISPR-edited cells, and could potentially overcome the scalability challenges [264]. However, this approach is still in the early stages of development and more research is needed to optimize its effectiveness and safety [260]. One example is the use of exosomes as a delivery method for CRISPR machinery [264]. Exosomes are small vesicles that are naturally released by cells and can be used to deliver a variety of molecules, including CRISPR machinery, to target cells [261]. Researchers have shown that exosomes can be used to deliver CRISPR machinery to cancer cells with high efficiency and minimal toxicity. This approach is being further developed as a potential solution to the scalability challenge. Another example is the use of cell lines that have been genetically engineered to produce high numbers of CRISPR-edited cells [264]. Researchers have developed cell lines that stably express Cas enzymes and can be used to produce large numbers of CRISPR-edited cells. This approach is being further developed as a potential solution to the scalability challenge. Another example is the development of automated platforms for producing CRISPR-edited cells. These platforms automate many of the manual steps involved in the production of CRISPR-edited cells, making the process more efficient and cost-effective. This approach is being further developed as a potential solution to the scalability challenge [200]. Finally, there are examples of research on in situ delivery of CRISPR machinery [260]. Researchers have developed methods for delivering CRISPR machinery directly to cancer cells in the tumor microenvironment [261]. This approach avoids the need to produce and deliver large numbers of CRISPR-edited cells, and could potentially overcome the scalability challenges [264]. This approach is still in the early stages of development and more research is needed to optimize its effectiveness and safety [259]. The manufacturing and scalability of CRISPR-modified cells for clinical use is a major challenge that needs to be overcome for CRISPRbased cancer therapy to become a viable clinical option [261]. Researchers are working to develop more efficient and cost-effective methods for producing CRISPR-edited cells, such as using exosomes as a delivery method, and improving scalability by using genetically engineered cell lines or stem cells, and by developing automated platforms and in situ delivery method [200].

The investigation into CRISPR-based gene editing for cancer treatment, as elaborated in this thorough analysis, marks a significant paradigm shift in our strategies for fighting cancer. The capabilities of CRISPR in
tackling the intricate characteristics of cancer via targeted genomic alterations are substantial. Approaches including deactivating genes that promote tumor growth, boosting the body’s immune reaction to cancer cells, correcting genetic anomalies that lead to cancer, and attacking tumors directly with toxic agents, have all indicated promising pathways in the realm of cancer therapeutics. Early-stage research and clinical experiments have started to reveal the effectiveness and transformative potential of CRISPR in the context of cancer treatment. These investigations have not only yielded hopeful outcomes but have also clarified the trajectory ahead. Yet, there are notable obstacles to overcome. The accuracy of CRISPR, its greatest advantage, raises concerns about unintended genetic impacts, known as off-target effects. The paramount importance lies in ensuring the security and precision of CRISPR interventions, necessitating continuous research to address these concerns. The delivery of CRISPR components to tumor cells presents another significant challenge. Developing methods that are both effective and safe for delivering these components is vital for the practical use of CRISPR in treating cancer. This challenge is heightened by the variability of tumor types and the complexity inherent in human biology. Nonetheless, the prospective future of CRISPR in cancer treatment is exceptionally promising. With ongoing advancements in research surmounting existing barriers, there is a tangible possibility for the creation of more efficient, individualized, and minimally invasive treatments for cancer. Such advancements could fundamentally transform the approach to cancer care, moving from traditional chemotherapy and radiation to specific genetic treatments. The CRISPR methodology presents an innovative and potentially game-changing strategy in cancer therapy. The journey ahead is laden with hurdles, such as ensuring the safety, accuracy, and efficient delivery of treatments. Despite these challenges, the progress achieved to date is promising. Continuous investigation and development in this area are crucial to fully harness the capabilities of CRISPR-based therapies in combating cancer. Looking forward, it is vital to confront these challenges directly, concentrating on refining methods, improving delivery systems, and prioritizing patient safety, in order to fully exploit the revolutionary potential of this technology in cancer care.

The future of CRISPR-based cancer therapy is promising, with vast potential for personalized and effective treatments, but it requires multidisciplinary efforts, ethical considerations, and international collaboration to ensure its successful translation into clinical practice [266]. Table 5 presents the future directions for CRISPRbased cancer therapy. Moreover, exploring non-coding regions of the genome and applying CRISPR screens to

identify new therapeutic targets offer promising avenues for treatment advancements. Figure 9 illustrates the different functional aspects of various CRISPR effectors and their applications in genome-scale screens. The integration of CRISPR technology with emerging imaging and sensing technologies can enhance the monitoring and tracking of treatment outcomes [267]. Collaborative efforts between academia and industry will accelerate
drug development and foster more efficient translational opportunities [266]. Furthermore, combining CRISPRbased interventions with other therapies in a synergistic approach warrants exploration, while CRISPR-based diagnostic tools will aid in early cancer detection and diagnosis [268]. Gene editing technology can be leveraged to develop personalized cancer vaccines and improve immunotherapy response. In terms of societal
impact, there is a need for equitable access to CRISPRbased cancer therapy to ensure all patients benefit from these advancements, regardless of their background or location. This calls for international cooperation in establishing regulatory frameworks for gene editing technology and promoting public understanding and acceptance of these therapies through education and outreach [269]. Other research priorities involve studying the effects of CRISPR gene editing on the tumor microenvironment and immune system, addressing genetic discrimination and privacy concerns related to gene editing, and evaluating the long-term safety and efficacy of CRISPR-based cancer therapy [18]. Lastly, developing CRISPR gene editing systems for rare or difficult-to-treat cancers, harnessing nanotechnology for targeted delivery of CRISPR, and establishing databases for data sharing are critical for pushing the boundaries of CRISPR-based cancer therapy [270]. Public-private partnerships and collaboration between clinicians and researchers are instrumental in optimizing therapy design and delivery for better patient outcomes [267].

Researchers continue to explore and optimize various delivery systems, bringing us closer to realizing the full potential of CRISPR technology in oncology [275]. The main challenges in CRISPR-based cancer therapy using adeno-associated viruses (AAVs) as viral vectors include achieving specific and efficient delivery of CRISPR components to tumor cells. To address these challenges, researchers are exploring various modifications to the AAVs to enhance tumor-targeting capabilities, increase cellular uptake, and evade the body’s immune response [276]. Additionally, developing strategies to limit nontargeted site effects and optimize the dose and administration route are essential. Liposomes offer a promising approach to deliver CRISPR components, as they can encapsulate the CRISPR machinery, protecting it from degradation and improving stability [277]. Furthermore, liposomes can be modified with targeting molecules to specifically bind to cancer cells, enhancing their specificity [278]. To enhance efficacy, researchers are optimizing liposome size, charge, and surface modifications to improve cellular uptake and endosomal escape, ensuring efficient release of CRISPR components within the tumor cells [279]. Safety is paramount in CRISPR-based therapies using viral vectors like AAVs. Researchers must ensure that the modified AAVs do not cause unintended immune responses or integrate into the host genome at undesirable locations [280]. The use of tissue-specific promoters and target-cell-specific enhancers can limit non-specific site effects [281]. Furthermore, rigorous preclinical studies and clinical trials are necessary to assess
the safety and efficacy of AAV-based CRISPR therapies [277]. Nanoparticles made of polymers or inorganic materials offer alternative approaches to deliver CRISPR components. These nanoparticles can be designed with different physicochemical properties, which may influence cellular uptake and release kinetics [244]. While liposomes have advantages in encapsulation and modification, other nanoparticles may provide better stability or have unique capabilities for targeted delivery [282]. Cell-penetrating peptides and exosomes have the potential to improve CRISPR delivery [254]. Researchers can explore surface modifications of these delivery systems to increase their tumor-specific binding and uptake [279]. Additionally, optimizing cargo loading and release mechanisms could enhance the precise editing of target genes while minimizing unwanted effects [283].

An encouraging approach involves merging CRISPRbased gene editing with other cancer treatments like immunotherapy or chemotherapy [284]. Preclinical investigations have demonstrated promising outcomes by combining CRISPR-based gene editing with immunotherapy or chemotherapy in cancer treatment. Figure 10 illustrates the application of CRISPR in immuno-oncology. For example, deactivating the PD-1 gene using CRISPR-Cas9 within cancer cells has led to a significant increase in the population of cancer-killing immune cells [285]. Additionally, the application of CRISPR-Cas9 alongside chemotherapy has shown potential in targeting chemotherapy-resistant cancer cells [285]. The combination of CRISPR-based gene editing with immunotherapy or chemotherapy offers several potential benefits. Firstly, it may lead to improved treatment efficacy as CRISPR can target specific genetic mutations associated with cancer, enhancing the precision of cancer treatment [286]. Secondly, combining CRISPR with immunotherapy can boost the body’s immune response against cancer cells, potentially increasing the chances of tumor regression [287]. Thirdly, using CRISPR alongside chemotherapy can overcome drug resistance, improving the effectiveness of chemotherapy in combating cancer cells [288]. Currently, CRISPR-based combination therapies are primarily in preclinical stages, and their effectiveness in humans remains to be fully demonstrated [284]. In the future, advancements in delivery mechanisms and precision gene editing techniques may address some of these limitations, making CRISPR-based combination therapies a more viable option for cancer treatment [286]. Rigorous clinical trials are essential to validate the safety and efficacy of these approaches before they can be implemented in standard cancer care [287].

Targeting multiple genes using CRISPR-based gene editing shows immense promise in complex cancer treatments, offering potential benefits in tumor regression and combating drug resistance [289]. However, it also raises safety concerns and faces challenges in clinical translation. Research efforts should continue to optimize and refine this technology for the potential benefit of cancer patients worldwide [290]. CRISPR-based gene editing has shown promising capabilities in targeting multiple genes simultaneously for cancer treatment [289]. Researchers have demonstrated its effectiveness in preclinical trials for lung cancer, where it targeted multiple commonly mutated genes using CRISPR-Cas9, resulting in tumor regression. This suggests that CRISPR technology has the potential to address complex genetic mutations that contribute to cancer development [290]. CRISPR-Cas9 has been successfully employed to combat drug resistance in cancer cells by simultaneously targeting multiple genes. By editing the genes responsible for drug resistance, researchers have enhanced cancer cells’ sensitivity to chemotherapy, providing a potential solution to drug-resistant cancers [291]. While CRISPR-based gene editing shows promise, there are some safety concerns to
consider. non-selective site effects, where CRISPR-Cas9 inadvertently edits unintended genes, could result in unforeseen consequences [292]. Extensive research and stringent safety measures are necessary to minimize such risks and ensure the safe application of CRISPR technology in cancer treatments [293]. The CRISPR-based gene editing’s effectiveness in targeting multiple genes may vary between different types of cancer. Each cancer type is characterized by unique genetic mutations, necessitating tailored approaches [294].

CRISPR-based gene editing presents a promising avenue for personalized cancer therapies [295]. However, thorough evaluation of its technical, ethical, and accessibility aspects is crucial to harness its potential safely and effectively for the benefit of patients [295]. CRISPR-based gene editing is a revolutionary tool that allows scientists to precisely modify specific genes in an organism’s DNA [296]. CRISPR-Cas9, the most well-known system, uses a guide RNA to target a specific gene, and the Cas9 enzyme acts as molecular scissors to cut the DNA at that location. This break can then be repaired, leading to either gene knockout or precise gene editing [297].

In personalized cancer therapies, CRISPR-Cas9 can be utilized to target and correct genetic mutations responsible for cancer development. By identifying the specific genetic mutations causing cancer, scientists can design a customized approach to correct or disable these mutations, effectively halting cancer growth [298]. While CRISPR-based gene editing holds immense promise for personalized medicine, several challenges and risks must be carefully evaluated [295]. Off-target effects are a major concern, where CRISPR may unintentionally edit other parts of the genome, potentially leading to new health issues or promoting cancer development [299]. Ensuring the specificity and accuracy of CRISPR targeting is a critical aspect of its safe application [300]. Additionally, the delivery method of CRISPR components into the body needs to be optimized to ensure efficient targeting of cancer cells without causing unnecessary damage to healthy tissues [301]. Ethical considerations, such as germline editing, should also be thoroughly debated and regulated to avoid unintended consequences [297]. As of the current date, several CRISPR-based personalized cancer therapies are in various stages of preclinical and clinical trials [298]. While the successful preclinical studies in retinoblastoma and leukemia are promising, it’s essential to understand that the transition from preclinical to clinical settings can present new challenges [299]. Rigorous clinical trials are necessary to assess the safety and efficacy of these therapies in human patients [295]. To make CRISPR-based personalized cancer therapies widely accessible, several factors need consideration [301]. First, research and development efforts should focus on optimizing the efficiency, accuracy, and safety of the CRISPR system [300]. Streamlining the manufacturing and delivery processes of CRISPR components could also reduce costs and increase accessibility [298]. Additionally, collaborations between academia, industry, and regulatory authorities can facilitate the translation of research findings into approved therapies [295]. To ensure equitable access, policymakers and healthcare providers need to work together to develop strategies for integrating personalized medicine, including CRISPRbased therapies, into existing healthcare systems [300].

CRISPR-based synthetic lethality holds promise as an innovative cancer treatment strategy, offering a more targeted and potentially effective approach to combatting cancer [302]. However, further research and clinical trials are necessary to fully evaluate its safety and efficacy before it can be widely implemented in cancer treatments [303]. Synthetic lethality refers to a phenomenon where the simultaneous disruption of two or more specific genes leads to the death of targeted cancer
cells, while sparing normal cells [304]. In the context of CRISPR-based gene editing, this approach involves using CRISPR-Cas9 to simultaneously target two genes that are frequently mutated in cancer, exploiting the cancer’s genetic vulnerabilities [305]. Synthetic lethality-based cancer treatments have the advantage of selectively targeting cancer cells with specific gene mutations, reducing the risk of harming healthy cells. This approach can potentially lead to more effective and precise therapies with fewer side effects than conventional treatments like chemotherapy and radiation [304]. Researchers have targeted gene combinations such as BRCA1 and BRCA2, frequently found mutated in breast and ovarian cancer, and PARP1 and BRCA1, commonly mutated in breast cancer [303]. By disrupting these gene pairs simultaneously, they trigger synthetic lethality in cancer cells [302]. Experimental studies have demonstrated the potential of CRISPR-based synthetic lethality as a cancer treatment strategy [304]. By targeting specific gene combinations in cancer cells, researchers have observed significant reductions in tumor growth and cell viability in preclinical models, indicating its potential as a promising therapeutic approach [303]. One major challenge is the delivery of CRISPR components to the tumor site efficiently [302]. Ensuring precise targeting and non-selective site effects are also important concerns. Additionally, identifying suitable gene combinations for specific cancer types and ensuring safety during clinical translation are vital considerations [303].

CAR-T cell therapy involves modifying a patient’s T cells using genetic engineering techniques to express chimeric antigen receptors (CARs) on their surface. These CARs enable T cells to recognize and bind to specific proteins, or antigens, present on cancer cells, leading to their destruction [306]. CRISPR-based gene editing offers the possibility to precisely modify T cells, enhancing their targeting capabilities [307]. By using CRISPRCas9, specific genes can be altered or inserted into T cells, enabling them to recognize and attack a particular protein expressed on various cancer cell types. This approach increases the efficiency and effectiveness of CAR-T cell therapy [308]. CAR-T cell therapy faces challenges such as cytokine release syndrome (CRS) and neurotoxicity, which are immune-mediated side effects resulting from the activation of T cells [309]. Managing these adverse events is crucial for the safe and successful implementation of CAR-T cell therapy [310]. Additionally, manufacturing CAR-T cells on a large scale and at a reasonable cost remains a challenge [307]. CAR-T cell therapy has shown remarkable success in certain types of blood cancers, such as acute lymphoblastic leukemia
and non-Hodgkin lymphoma [310]. Clinical trials have reported high response rates and even durable remissions in some patients [308]. However, its effectiveness in solid tumors is still a significant area of research and development [307]. Long-term side effects of CAR-T cell therapy are not yet fully understood, as the therapy is relatively new [311]. However, some potential concerns include the persistence of CAR-T cells in the body, potential non-selective site effects of genetic modifications, and the impact on normal immune function [312]. To address manufacturing challenges, efforts are underway to optimize and streamline the production process, including automation and reducing the time and cost involved [308]. Furthermore, establishing specialized centers equipped with expertise and infrastructure can help address logistical challenges associated with CAR-T cell therapy [307]. Current limitations include the high cost of treatment, limited accessibility due to specialized requirements, and the need for personalized
manufacturing for each patient [310]. Additionally, the effectiveness of CAR-T cell therapy can be influenced by factors such as antigen escape, tumor heterogeneity, and the immunosuppressive tumor microenvironment [313]. Figure 11 illustrates the ex vivo CRISPR manipulation of human T cells for adoptive T cell therapy.

The combination of CRISPR-based gene editing with stem cell therapy has shown promising results in treating genetic diseases, such as sickle cell anemia [314]. By using CRISPR-Cas9 to correct the specific genetic mutation responsible for the disease in hematopoietic stem cells, researchers have been able to produce corrected blood cells [315]. The transplantation of these corrected stem cells into the patient’s body has demonstrated potential in restoring healthy blood cells, alleviating the symptoms of sickle cell anemia [316]. The use of CRISPR-Cas9

in stem cell therapy raises concerns about non-selective site effects, where unintended genetic modifications may occur [314]. Ensuring the accuracy of CRISPR-Cas9 editing is crucial to prevent potential adverse consequences [316]. Researchers need to thoroughly evaluate and validate the specificity of the gene-editing process before proceeding with transplantation [317]. Additionally, long-term studies are necessary to monitor the stability of corrected stem cells and any potential unintended effects on the patient’s health [316]. The scalability of this approach depends on several factors, including the ease of gene editing, the availability of patient-specific stem cells, and the ability to produce sufficient quantities of corrected cells for transplantation [314]. Advances in CRISPR technology and stem cell research are continuously improving scalability [318]. However, challenges such as efficient delivery of CRISPR components into stem cells and the cost of personalized treatments may limit its widespread implementation [314]. The use of CRISPR-based gene editing in stem cell therapy raises ethical considerations. Concerns include the potential for unintended genetic changes that could affect future generations if germ cells are edited [315]. Researchers must adhere to strict ethical guidelines and regulations to ensure that gene editing is conducted responsibly, with full transparency and informed consent from patients participating in clinical trials [317]. The combination of CRISPR-based gene editing with stem cell therapy holds promise for treating a wide range of genetic diseases beyond sickle cell anemia [319]. Disorders caused by single-gene mutations, such as cystic fibrosis and certain types of muscular dystrophy, could be potential targets for this approach [317]. However, each disease presents unique challenges and requires careful evaluation to determine its suitability for CRISPR-based gene editing and stem cell therapy [315].

The combination of CRISPR-based gene editing with epigenetic therapy allows for a more targeted and precise treatment approach [320]. While CRISPR can directly modify specific DNA sequences, epigenetic therapy can alter gene expression patterns without changing the underlying DNA sequence. By using both techniques in tandem, researchers can enhance the therapeutic effects, as CRISPR provides accurate gene targeting, and epigenetic therapy ensures sustained and controlled gene activity modifications [321]. One significant challenge is ensuring the safe and efficient delivery of CRISPR components and epigenetic drugs to target cells. Scientists must develop reliable delivery systems that can effectively penetrate the cells without causing non-selective site
effects [322]. Additionally, maintaining long-term regulation of gene activity via epigenetic therapy might be challenging due to cellular processes that could revert these changes over time. Researchers need to develop strategies to maintain stable and heritable epigenetic modifications [323]. Genetic heterogeneity, where different cells within a tumor or disease exhibit distinct genetic mutations, poses a challenge for targeted therapies [256]. The combination of CRISPR and epigenetic therapy allows researchers to target specific mutations while bypassing others [324]. CRISPR can be programmed to recognize and edit particular mutations, while epigenetic therapy can suppress the activity of specific mutated genes, leading to a more comprehensive and effective treatment [325]. The combination of these powerful technologies raises ethical questions about potential non-selective site effects, unintended consequences, and germline editing [325]. Researchers and policymakers must ensure strict adherence to safety protocols and responsible use to prevent unintended genetic alterations [326]. Additionally, equitable access to such therapies and potential disparities in healthcare must be addressed to avoid exacerbating social inequalities [327]. As with any emerging technology, there are limitations to consider. The delivery of CRISPR components and epigenetic drugs to specific tissues or organs can be challenging [328]. Ongoing research focuses on refining delivery methods and increasing targeting efficiency [325]. Moreover, understanding the long-term consequences of epigenetic modifications and potential off-target effects remains a priority for further investigation to ensure the safety and efficacy of this combination therapy [327].

CRISPR-based gene editing presents a valuable approach for discovering novel drug targets [329-331]. By deliberately deleting or modifying genes within cancer cells, scientists can observe which genes are vital for the growth and survival of these cells [332]. Various genes have been targeted using CRISPR-Cas9 in cancer cells to identify potential drug targets. Examples include oncogenes such as MYC, KRAS, and EGFR, as well as tumor suppressor genes like TP53 and PTEN [333]. The effects of gene deletion or modification in cancer cells using CRISPRCas9 are typically assessed by monitoring the cells’ ability to grow and survive [48]. Researchers may compare the growth rates of cells with specific genes deleted or modified to those of unaltered control cells [333]. Additionally, cell viability assays and molecular analyses can provide insights into the impact of gene alterations on cellular functions and signaling pathways [329]. The importance of a gene for cancer cell growth and survival is typically determined by evaluating the impact of its deletion or
modification on cell viability and proliferation [330, 333-336]. If the loss or alteration of a gene significantly impairs the cells’ ability to grow and survive, it suggests that the gene plays a vital role in supporting cancer cell functions [332]. The identification of crucial genes using CRISPR-Cas9 provides valuable insights into the vulnerabilities and dependencies of cancer cells [48, 333, 335]. Genes found to be essential for cancer cell growth and survival can be further investigated as potential drug targets [333]. Targeting these genes with drugs may disrupt critical cellular processes, leading to the selective killing or suppression of cancer cells while minimizing harm to normal cells [329, 331, 337, 338]. Despite its potential, CRISPR-based gene editing for drug target discovery faces several challenges [333]. Off-target effects, incomplete gene knockout, and functional redundancy within cellular pathways can complicate data interpretation [333]. Additionally, the translation of CRISPR-based findings into effective drug targets requires further validation through preclinical and clinical studies [48]. Ensuring the specificity, efficacy, and safety of drugs targeting newly identified genes is crucial for successful clinical implementation [331, 333, 339].

We would like to thank from the Novin Genome (NG) Lab, Shahrekord branch, Research and Development Center for Biotechnology in southwest Iran for their kindly cooperation.

MCH, MK, MS, EM, FE, MR, AA, AM and MACH, searching, analyzing, writingoriginal draft preparation, MCH: writing, reviewing. MCH and MACH: reviewing, editing, MCH: reviewing, editing and supervision. All authors approved the final version of the manuscript.

The authors declare that no funding was received for the research.

Not applicable.

Not applicable.

Not applicable.

The authors declare no competing interests.

Received: 8 September 2023 Accepted: 20 December 2023
Published online: 09 January 2024

CRISPR/Cas9-mediated knock-in method in pancreatic cancer cell lines. Ann Oncol. 2021;32:S1356.
108. Annunziato S, de Ruiter JR, Henneman L, Brambillasca CS, Lutz C, Vaillant F, et al. Comparative oncogenomics identifies combinations of driver genes and drug targets in BRCA1-mutated breast cancer. Nat Commun. 2019;10(1). https://doi.org/10.1038/s41467-019-08301-2.
109. Weber J, Öllinger R, Friedrich M, Ehmer U, Barenboim M, Steiger K, et al. CRISPR/Cas9 somatic multiplex-mutagenesis for high-Throughput functional cancer genomics in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 2015;112(45):13982-7.
110. Yoshimatsu S, Nakajima M, Qian E, Sanosaka T, Sato T, Okano H. Homologous Recombination-Enhancing Factors Identified by Comparative Transcriptomic Analyses of Pluripotent Stem Cell of Human and Common Marmoset. Cells. 2022;11 (3). https://doi.org/10.3390/cells 11030360.
111. Choudhury SR, Cui Y, Lubecka K, Stefanska B, Irudayaraj J. CRISPR-dCas9 mediated TET1 targeting for selective DNA demethylation at BRCA1 promoter. Oncotarget. 2016;7(29):46545-56.
112. Kweon J, Jang AH, Shin HR, See JE, Lee W, Lee JW, et al. A CRISPR-based base-editing screen for the functional assessment of BRCA1 variants. Oncogene. 2020;39(1):30-5.
113. Lee W, Lee JH, Jun S, Lee JH, Bang D. Selective targeting of KRAS oncogenic alleles by CRISPR/Cas9 inhibits proliferation of cancer cells. Sci Rep. 2018;8(1). https://doi.org/10.1038/s41598-018-30205-2.
114. Bender G, Fahrioglu Yamaci R, Taneri B. CRISPR and KRAS: a match yet to be made. J Biomed Sci. 2021;28(1). https://doi.org/10.1186/ s12929-021-00772-0.
115. Zhao X, Liu L, Lang J, Cheng K, Wang Y, Li X, et al. A CRISPR-Cas13a system for efficient and specific therapeutic targeting of mutant KRAS for pancreatic cancer treatment. Cancer Lett. 2018;431:171-81.
116. Burgess MR, Hwang E, Mroue R, Bielski CM, Wandler AM, Huang BJ, et al. KRAS Allelic Imbalance Enhances Fitness and Modulates MAP Kinase Dependence in Cancer. Cell. 2017;168(5):817-829.e15.
117. Wang B, Krall EB, Aguirre AJ, Kim M, Widlund HR, Doshi MB, et al. ATXN1L, CIC, and ETS Transcription Factors Modulate Sensitivity to MAPK Pathway Inhibition. Cell Rep. 2017;18(6):1543-57.
118. Sayed S, Sidorova OA, Hennig A, Augsburg M, Cortés Vesga CP, Abohawya M, et al. Efficient Correction of Oncogenic KRAS and TP53 Mutations through CRISPR Base Editing. Cancer Res. 2022;82(17):3002-15.
119. Lentsch E, Li L, Pfeffer S, Ekici AB, Taher L, Pilarsky C, et al. CRISPR/Cas9mediated knock-out of krasG12D mutated pancreatic cancer cell lines. Int J Mol Sci. 2019;20(22). https://doi.org/10.3390/ijms20225706.
120. Wang Z, Kang B, Gao Q, Huang L, Di J, Fan Y, et al. Quadrupleediting of the MAPK and PI3K pathways effectively blocks the progression of KRAS-mutated colorectal cancer cells. Cancer Sci. 2021;112(9):3895-910.
121. Yamada T, Amann JM, Tanimoto A, Taniguchi H, Shukuya T, Timmers C, et al. Histone deacetylase inhibition enhances the antitumor activity of a MEK inhibitor in lung cancer cells harboring RAS mutations. Mol Cancer Ther. 2018;17(1):17-25.
122. Thompson KN, Whipple RA, Yoon JR, Lipsky M, Charpentier MS, Boggs AE, et al. The combinatorial activation of the PI3K and Ras/ MAPK pathways is sufficient for aggressive tumor formation, while individual pathway activation supports cell persistence. Oncotarget. 2015;6(34):35231-46.
123. Maitra R, Seetharam R, Tesfa L, Augustine TA, Klampfer L, Coffey MC, et al. Oncolytic reovirus preferentially induces apoptosis in KRAS mutant colorectal cancer cells, and synergizes with irinotecan. Oncotarget. 2014;5(9):2807-19.
124. Yang YP, Ma H, Starchenko A, Huh WJ, Li W, Hickman FE, et al. A Chimeric Egfr Protein Reporter Mouse Reveals Egfr Localization and Trafficking In Vivo. Cell Rep. 2017;19(6):1257-67.
125. Koo T, Yoon AR, Cho HY, Bae S, Yun CO, Kim JS. Selective disruption of an oncogenic mutant allele by CRISPR/Cas9 induces efficient tumor regression. Nucleic Acids Res. 2017;45(13):7897-908.
126. Kiessling MK, Schuierer S, Stertz S, Beibel M, Bergling S, Knehr J, et al. Identification of oncogenic driver mutations by genome-wide CRISPRCas9 dropout screening. BMC Genomics. 2016;17(1). https://doi.org/10. 1186/s12864-016-3042-2.
127. Park JJ, Kim JE, Jeon Y, Lee MR, Choi JY, Song BR, et al. Deletion of NKX3.1 via CRISPR/Cas9 Induces Prostatic Intraepithelial Neoplasia in

C57BL/6 Mice. Technol Cancer Res Treat. 2020;19. https://doi.org/10. 1177/1533033820964425.
128. Zhang BC, Luo BY, Zou JJ, Wu PY, Jiang JL, Le JQ, et al. Co-delivery of Sorafenib and CRISPR/Cas9 Based on Targeted Core-Shell Hollow Mesoporous Organosilica Nanoparticles for Synergistic HCC Therapy. ACS Appl Mater Interfaces. 2020;12(51):57362-72.
129. Chung SH, Frick SL, Yiu G. Targeting vascular endothelial growth factor using retinal gene therapy. Ann Transl Med. 2021;9(15):1277-1277.
130. Ameri H, Murat C, Arbabi A, Jiang W, Janga SR, Qin PZ, et al. Reduced expression of vegf-a in human retinal pigment epithelial cells and human muller cells following crispr-cas9 ribonucleoprotein-mediated gene disruption. Transl Vis Sci Technol. 2020;9(8). https://doi.org/10. 1167/TVST.9.8.23.
131. Hariprabu KNG, Sathya M, Vimalraj S. CRISPR/Cas9 in cancer therapy: A review with a special focus on tumor angiogenesis. Int J Biol Macromol. 2021;192:913-930.
132. Li XL, Li GH, Fu J, Fu YW, Zhang L, Chen W, et al. Highly efficient genome editing via CRISPR-Cas9 in human pluripotent stem cells is achieved by transient BCL-XL overexpression. Nucleic Acids Res. 2018;46(19):10195-215.
133. Abdul Rahman SF, Mohana-Kumaran N, Mohd Azzam MG, Mohd Norudin NA, Muniandy K. CRISPR/Cas9 Mediated BFL-1 Knock-out in Nasopharyngeal Carcinoma (NPC) Cell Lines. Front Pharmacol. 2018;9. https://doi.org/10.3389/conf.fphar.2018.63.00029.
134. Zhao W, Liu J, Wang D, Wang Y, Zhang F, Jin G, et al. Effect of silencing HIF-1 a gene on testicle spermatogenesis function in varicocele rats. Cell Tissue Res. 2019;378(3):543-54.
135. Fang N, Gu T, Wang Y, Wang S, Wang F, An Y, et al. Expression of PTENlong mediated by CRISPR/Cas9 can repress U87 cell proliferation. J Cell Mol Med. 2017;21(12):3337-46.
136. de Almeida Monteiro Melo Ferraz M, Nagashima JB, Venzac B, Le Gac S, Songsasen N. A dog oviduct-on-a-chip model of serous tubal intraepithelial carcinoma. Sci Rep. 2020;10(1). https://doi.org/10.1038/ s41598-020-58507-4.
137. Callif BL, Maunze B, Krueger NL, Simpson MT, Blackmore MG. The application of CRISPR technology to high content screening in primary neurons. Mol Cell Neurosci. 2017;80:170-9.
138. Heitink L, Whittle JR, Vaillant F, Capaldo BD, Dekkers JF, Dawson CA, et al. In vivo genome-editing screen identifies tumor suppressor genes that cooperate with Trp53 loss during mammary tumorigenesis. Mol Oncol. 2022;16(5):1119-31.
139. Xi L, Schmidt JC, Zaug AJ, Ascarrunz DR, Cech TR. A novel two-step genome editing strategy with CRISPR-Cas9 provides new insights into telomerase action and TERT gene expression. Genome Biol. 2015;16(1). https://doi.org/10.1186/s13059-015-0791-1.
140. James CD, Prabhakar AT, Otoa R, Evans MR, Wang X, Bristol ML, et al. SAMHD1 Regulates Human Papillomavirus 16-Induced Cell Proliferation and Viral Replication during Differentiation of Keratinocytes. mSphere. 2019;4(4). https://doi.org/10.1128/msphere.00448-19.
141. Zagorski JW, Maser TP, Liby KT, Rockwell CE. Nrf2-Dependent and -Independent Effects of tert-Butylhydroquinone, CDDO-Im, and H2O2 in Human Jurkat T Cells as Determined by CRISPR/Cas9 Gene Editing. J Pharmacol Exp Ther. 2017;361(2):259-67.
142. Cordeiro A, Deveau AP, Dhanraj S, Dror Y, Berman J. Characterizing Dyskeratosis Congenita Caused By Parn Mutations in the Zebrafish. Blood. 2019;134(Supplement_1):3744-3744.
143. Liu N, Xu S, Yao Q, Zhu Q, Kai Y, Hsu JY, et al. Transcription factor competition at the -globin promoters controls hemoglobin switching. Nat Genet. 2021;53(4):511-20.
144. Rui L. Abstract 3436: PRMT5 upregulation and its oncogenic cooperation with PI3K/AKT signaling in diffuse large B cell lymphoma. Cancer Res. 2019;79(13_Supplement):3436-3436.
145. Bonato A, Bomben R, Chakraborty S, Felician G, Martines C, Zucchetto A, et al. Chronic Lymphocytic Leukemia Cells with Mutated Nfkbie Are Positively Selected By Microenvironmental Signals and Display Reduced Sensitivity to Ibrutinib Treatment. Blood. 2021;138(Supplement 1):248-248.
146. Tagde A, Markert T, Rajabi H, Hiraki M, Alam M, Bouillez A, et al. Targeting MUC1-C suppresses polycomb repressive complex 1 in multiple myeloma. Oncotarget. 2017;8(41):69237-49.
147. Navarro-Guerrero E, Tay C, Whalley JP, Cowley SA, Davies B, Knight JC, et al. Genome-wide CRISPR/Cas9-knockout in human induced Pluripotent Stem Cell (iPSC)-derived macrophages. Sci Rep. 2021;11(1). https:// doi.org/10.1038/s41598-021-82137-z.
148. Hamada T, Akahane T, Yokoyama S, Higa N, Kirishima M, Matsuo K, et al. An oncogenic splice variant of PDGFRa in adult glioblastoma as a therapeutic target for selective CDK4/6 inhibitors. Sci Rep. 2022;12(1). https://doi.org/10.1038/s41598-022-05391-9.
149. Iacono D, Cinausero M, Gerratana L, Vitale MG, Basile D, Angione V, et al. Primary cutaneous melanoma in elderly patients: potential prognostic markers. Pigment Cell Melanoma Res. 2017;30(1):76-156.
150. Farrell J, Pietruska J, McRee S, Tsichlis P, Hinds P. Abstract PR14: Defining isoform-specific roles for AKTs in BRAFV600E-driven melanoma. Cancer Res. 2020;80(19_Supplement):PR14-PR14.
151. Kaulich M, Dowdy S. Abstract A10: A Cdk4-dependent phosphorylation threshold regulates the cell cycle entry decision. Mol Cancer Res. 2016;14(11_Supplement):A10-A10.
152. Frangoul H, Altshuler D, Cappellini MD, Chen Y-S, Domm J, Eustace BK, et al. CRISPR-Cas9 Gene Editing for Sickle Cell Disease and -Thalassemia. N Engl J Med. 2021;384(3):252-60.
153. PD-1 Knockout Engineered T Cells for Advanced Esophageal Cancer – ClinicalTrials.gov. https://classic.clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03 081715. Accessed 22 Jul 2023.
154. PD-1 Knockout EBV-CTLs for Advanced Stage Epstein-Barr Virus (EBV) Associated Malignancies – ClinicalTrials.gov. https://classic.clinicaltrials. gov/ct2/show/NCT03044743. Accessed 22 Jul 2023.
155. TACE Combined With PD-1 Knockout Engineered T Cell in Advanced Hepatocellular Carcinoma – ClinicalTrials.gov. 2020. http://www.clini caltrials.gov/ct2/show/NCT04417764.
156. Study of CRISPR-Cas9 Mediated PD-1 and TCR Gene-knocked Out Mesothelin-directed CAR-T Cells in Patients With Mesothelin Positive Multiple Solid Tumors- ClinicalTrials.gov. 2020. http://www.clinicaltrials. gov/ct2/show/NCT03545815.
157. CRISPR (HPK1) Edited CD19-specific CAR-T Cells (XYF19 CAR-T Cells) for CD19+ Leukemia or Lymphoma- ClinicalTrials.gov. 2019. https://classic. clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT04037566.
158. Safety and Efficacy of CT125A Cells for Treatment of Relapsed/Refractory CD5 + Hematopoietic Malignancies- ClinicalTrials.gov. 2021. http:// www.clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT04767308.
159. A Safety and Efficacy Study Evaluating CTX130 in Subjects With Relapsed or Refractory T or B Cell Malignancies (COBALT-LYM). 2021. http://www.clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT04502446.
160. Ishihara M, Nishida Y, Kitano S, Kawai A, Muraoka D, Momose F, et al. A phase 1 trial of NY-ESO-1-specific TCR-engineered T-cell therapy combined with a lymph node-targeting nanoparticulate peptide vaccine for the treatment of advanced soft tissue sarcoma. Int J Cancer. 2023;152(12):2554-66.
161. Kanwal B. Relapsed/Refractory Non-Hodgkin Lymphoma: Engineering T-Cells to Express Chimeric Antigen Receptors (CARs), a Salvage? Cureus. 2021. https://doi.org/10.7759/cureus.16307.
162. Fang C, Xiao G, Wang T, Song L, Peng B, Xu B, et al. Emerging Nano-/ Biotechnology Drives Oncolytic Virus-Activated and Combined Cancer Immunotherapy. Research. 2023;6. https://doi.org/10.34133/research. 0108.
163. Hölting TLB, Cidre-Aranaz F, Matzek D, Popper B, Jacobi SJ, Funk CM, et al. Neomorphic DNA-binding enables tumor-specific therapeutic gene expression in fusion-addicted childhood sarcoma. Mol Cancer. 2022;21(1). https://doi.org/10.1186/s12943-022-01641-6.
164. Malviya M, Aretz ZEH, Molvi Z, Lee J, Pierre S, Wallisch P, et al. Challenges and solutions for therapeutic TCR-based agents. Immunol Rev. 2023. https://doi.org/10.1111/imr.13233.
165. Chira S, Nutu A, Isacescu E, Bica C, Pop L, Ciocan C, et al. Genome Editing Approaches with CRISPR/Cas9 for Cancer Treatment: Critical Appraisal of Preclinical and Clinical Utility, Challenges, and Future Research. Cells. 2022;11(18). https://doi.org/10.3390/cells11182781.
166. Xu J, Chen LJ, Yang SS, Sun Y, Wu W, Liu YF, et al. Exploratory trial of a biepitopic CAR T-targeting B cell maturation antigen in relapsed/refractory multiple myeloma. Proc Natl Acad Sci U S A. 2019. https://doi.org/ 10.1073/pnas. 1819745116.
167. Feldman L, Brown C, Badie B. Chimeric Antigen Receptor T-Cell Therapy: Updates in Glioblastoma Treatment. Neurosurgery. 2021;88(6):1056-64.
168. Lin Y, Ying H, Shao L, Liu Q, Song M, Chen S. Safety and Efficacy of CRISPR/CAS9-Edited PD-1 Deficient CAR-T Cells in MUC1 Positive Advanced Esophageal Cancer. SSRN Electron J. 2023. https://doi.org/10. 2139/ssrn. 4316844.
169. Choi SYC, Ribeiro CF, Wang Y, Loda M, Plymate SR, Uo T. Druggable Metabolic Vulnerabilities Are Exposed and Masked during Progression to Castration Resistant Prostate Cancer. Biomolecules. 2022;12(11). https://doi.org/10.3390/biom12111590.
170. Acharya UH, Walter RB. Chimeric antigen receptor (Car)-modified immune effector cell therapy for acute myeloid leukemia (aml). Cancers. 2020;12(12):1-28.
171. Zhen S, Li X. Oncogenic Human Papillomavirus: Application of CRISPR/ Cas9 Therapeutic Strategies for Cervical Cancer. Cell Physiol Biochem. 2018;44(6):2455-66.
172. Uras IZ, Moll HP, Casanova E. Targeting KRAS mutant non-small-cell lung cancer: Past, present and future. Int J Mol Sci. 2020;21(12):1-30.
173. Trigg RM, Turner SD. ALK in neuroblastoma: Biological and therapeutic implications. Cancers. 2018;10(4). https://doi.org/10.3390/cancers100 40113.
174. Anagnostou T, Riaz IB, Hashmi SK, Murad MH, Kenderian SS. AntiCD19 chimeric antigen receptor T-cell therapy in acute lymphocytic leukaemia: a systematic review and meta-analysis. Lancet Haematol. 2020;7(11):e816-26.
175. Andrea AE, Chiron A, Mallah S, Bessoles S, Sarrabayrouse G, Hacein-Bey-Abina S. Advances in CAR-T Cell Genetic Engineering Strategies to Overcome Hurdles in Solid Tumors Treatment. Front Immunol. 2022;13. https://doi.org/10.3389/fimmu.2022.830292.
176. Li M, Sun J, Shi G. Application of CRISPR screen in mechanistic studies of tumor development, tumor drug resistance, and tumor immunotherapy. Front Cell Dev Biol. 2023;11. https://doi.org/10.3389/fcell.2023. 1220376.
177. Crispo F, Pietrafesa M, Condelli V, Maddalena F, Bruno G, Piscazzi A, et al. IDH1 Targeting as a New Potential Option for Intrahepatic Cholangiocarcinoma Treatment-Current State and Future Perspectives. Molecules. 2020;25(16). https://doi.org/10.3390/molecules25163754.
178. Mirgayazova R, Khadiullina R, Chasov V, Mingaleeva R, Miftakhova R, Rizvanov A, et al. Therapeutic editing of the TP53 gene: Is crispr/CAS9 an option? Genes. 2020;11(6):1-17.
179. Gagelmann N, Riecken K, Wolschke C, Berger C, Ayuk FA, Fehse B, et al. Development of CAR-T cell therapies for multiple myeloma. Leukemia. 2020;34(9):2317-32.
180. Wang Z, Li N, Feng K, Chen M, Zhang Y, Liu Y, et al. Phase I study of CAR-T cells with PD-1 and TCR disruption in mesothelin-positive solid tumors. Cell Mol Immunol. 2021;18(9):2188-98.
181. Bamdad CC, Yuan Y, Specht JM, Stewart AK, Smagghe BJ, Lin SC-M, et al. Phase I/II first-in-human CAR T-targeting MUC1 transmembrane cleavage product (MUC1*) in patients with metastatic breast cancer. J Clin Oncol. 2022;40(16_suppl):TPS1130-TPS1130.
182. Pennesi E, Michels N, Brivio E, van der Velden VHJ, Jiang Y, Thano A, et al. Inotuzumab ozogamicin as single agent in pediatric patients with relapsed and refractory acute lymphoblastic leukemia: results from a phase II trial. Leukemia. 2022;36(6):1516-24.
183. Swain SM, Shastry M, Hamilton E. Targeting HER2-positive breast cancer: advances and future directions. Nat Rev Drug Discovery. 2023;22(2):101-26.
184. Ren J, Liu X, Fang C, Jiang S, June CH, Zhao Y. Multiplex genome editing to generate universal CART cells resistant to PD1 inhibition. Clin Cancer Res. 2017;23(9):2255-66.
185. Liu J, Zhang Y, Guo R, Zhao Y, Sun R, Guo S, et al. Targeted CD7 CAR T-cells for treatment of T-Lymphocyte leukemia and lymphoma and acute myeloid leukemia: recent advances. Front Immunol. 2023;14. https://doi.org/10.3389/fimmu.2023.1170968.
186. Furqan F, Shah NN. Multispecific CART Cells Deprive Lymphomas of Escape via Antigen Loss. Annu Rev Med. 2023;74:279-91.
187. Li Q, Ni Y, Zhang L, Jiang R, Xu J, Yang H, et al. HIF-1 a-induced expression of m6A reader YTHDF1 drives hypoxia-induced autophagy and malignancy of hepatocellular carcinoma by promoting ATG2A and ATG14 translation. Signal Transduct Target Ther. 2021;6(1). https://doi. org/10.1038/s41392-020-00453-8.
188. Kumar R, Yu F, Zhen YH, Li B, Wang J, Yang Y, et al. PD-1 blockade restores impaired function of ex vivo expanded CD8+T cells and
enhances apoptosis in mismatch repair deficient EpCAM+PD-L1+ cancer cells. Onco Targets Ther. 2017;10:3453-65.
189. Haso W, Qin H, Zhang L, Orentas RJ, Fry TJ. CD22-Targeted Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells Containing The 4-1BB Costimulatory Domain Demonstrate Enhanced Persistence and Superior Efficacy Against B-Cell Precursor Acute Lymphoblastic Leukemia (ALL) Compared To Those Containing CD28. Blood. 2013;122(21):1431-1431.
190. Dimitri A, Herbst F, Fraietta JA. Engineering the next-generation of CAR T-cells with CRISPR-Cas9 gene editing. Molecular Cancer. 2022;21(1). https://doi.org/10.1186/s12943-022-01559-z.
191. Chen X, Kozhaya L, Tastan C, Placek L, Dogan M, Horne M, et al. Functional Interrogation of Primary Human T Cells via CRISPR Genetic Editing. J Immunol. 2018;201(5):1586-98.
192. Hedrich V, Breitenecker K, Ortmayr G, Pupp F, Huber H, Chen D, et al. PRAME Is a Novel Target of Tumor-Intrinsic Gas6/AxI Activation and Promotes Cancer Cell Invasion in Hepatocellular Carcinoma. Cancers (Basel). 2023;15(9). https://doi.org/10.3390/cancers15092415.
193. Kaligotla VSA, Jasti T, Kandra P. CRISPR/Cas9 in cancer: An attempt to the present trends and future prospects. Biotechnol Appl Biochem. 2022;69(3):1238-51.
194. Mehravar M, Roshandel E, Salimi M, Chegeni R, Gholizadeh M, Mohammadi MH, et al. Utilization of CRISPR/Cas9 gene editing in cellular therapies for lymphoid malignancies. Immunol Lett. 2020;226:71-82.
195. Zhang S, Zhang F, Chen Q, Wan C, Xiong J, Xu J. CRISPR/Cas9-mediated knockout of NSD1 suppresses the hepatocellular carcinoma development via the NSD1/H3/Wnt10b signaling pathway. J Exp Clin Cancer Res. 2019;38(1). https://doi.org/10.1186/s13046-019-1462-y.
196. Sürün D, von Melchner H, Schnütgen F. CRISPR/Cas9 genome engineering in hematopoietic cells. Drug Discov Today Technol. 2018;28:33-9.
197. Koh S, Kah J, Tham CYL, Yang N, Ceccarello E, Chia A, et al. Nonlytic Lymphocytes Engineered to Express Virus-Specific T-Cell Receptors Limit HBV Infection by Activating APOBEC3. Gastroenterology. 2018;155(1):180-193.e6.
198. Adigbli G, Ménoret S, Cross AR, Hester J, Issa F, Anegon I. Humanization of Immunodeficient Animals for the Modeling of Transplantation, Graft Versus Host Disease, and Regenerative Medicine. Transplantation. 2020;104(11):2290-306.
199. Stewart JR, Baxter J, Zatreanu D, Brough R, Song F, Konde A, et al. 3P Identification of novel biomarkers of response to ATR inhibitors in ARID1A mutant ovarian clear cell carcinoma. Ann Oncol. 2022;33:S383-4.
200. Kamali E, Rahbarizadeh F, Hojati Z, Frödin M. CRISPR/Cas9-mediated knockout of clinically relevant alloantigenes in human primary T cells. BMC Biotechnol. 2021;21(1). https://doi.org/10.1186/ s12896-020-00665-4.
201. Khan A, Zhang X. Function of the Long Noncoding RNAs in HepatocelIular Carcinoma: Classification, Molecular Mechanisms, and Significant Therapeutic Potentials. Bioengineering. 2022;9(8). https://doi.org/10. 3390/bioengineering9080406.
202. Kath J, Du W, Pruene A, Braun T, Thommandru B, Turk R, et al. Pharmacological interventions enhance virus-free generation of TRAC-replaced CART cells. Mol Ther – Methods Clin Dev. 2022;25:311-30.
203. Gao Q, Dong X, Xu Q, Zhu L, Wang F, Hou Y, et al. Therapeutic potential of CRISPR/Cas9 gene editing in engineered T-cell therapy. Cancer Med. 2019;8(9):4254-64.
204. Aghamiri S, Talaei S, Ghavidel AA, Zandsalimi F, Masoumi S, Hafshejani NH, et al. Nanoparticles-mediated CRISPR/Cas9 delivery: Recent advances in cancer treatment. J Drug Deliv Sci Technol. 2020;56. https://doi.org/10.1016/j.jddst.2020.101533.
205. Tong S, Moyo B, Lee CM, Leong K, Bao G. Engineered materials for in vivo delivery of genome-editing machinery. Nat Rev Mater. 2019;4(11):726-37.
206. Mali P, Yang L, Esvelt KM, Aach J, Guell M, DiCarlo JE, et al. RNAGuided Human Genome Engineering via Cas9_Sup. Science. 2013;339(February):823-6.
207. Brouns SJJ, Jore MM, Lundgren M, Westra ER, Slijkhuis RJH, Snijders APL, et al. Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes. Science. 2008;321(5891):960-964.
208. Yin H, Kauffman KJ, Anderson DG. Delivery technologies for genome editing. Nat Rev Drug Discovery. 2017;16(6):387-99.
209. Chow MYT, Chang RYK, Chan HK. Inhalation delivery technology for genome-editing of respiratory diseases. Adv Drug Deliv Rev. 2021;168:217-28.
210. Sandhya D, Jogam P, Allini VR, Abbagani S, Alok A. The present and potential future methods for delivering CRISPR/Cas9 components in plants. J Genet Eng Biotechnol. 2020;18(1). https://doi.org/10.1186/ s43141-020-00036-8.
211. Taha EA, Lee J, Hotta A. Delivery of CRISPR-Cas tools for in vivo genome editing therapy: Trends and challenges. J Control Release. 2022;342:345-61.
212. Liu P, Liang SQ, Zheng C, Mintzer E, Zhao YG, Ponnienselvan K, et al. Improved prime editors enable pathogenic allele correction and cancer modelling in adult mice. Nat Commun. 2021;12(1). https://doi.org/10. 1038/s41467-021-22295-w.
213. Platt RJ, Chen S, Zhou Y, Yim MJ, Swiech L, Kempton HR, et al. CRISPRCas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 2014;159(2):440-55.
214. Han HA, Pang JK, Soh BS. Mitigating off-target effects in CRISPR/Cas9mediated in vivo gene editing. J Mol Med. 2020;98(5):615-32.
215. Doench JG, Fusi N, Sullender M, Hegde M, Vaimberg EW, Donovan KF, et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize offtarget effects of CRISPR-Cas9. Nat Biotechnol. 2016;34(2):184-91.
216. Burgess DJ. Characterizing CRISPR off-target effects. Nat Rev Genet. 2014;15(1):5-5.
217. Shen CC, Hsu MN, Chang CW, Lin MW, Hwu JR, Tu Y, et al. Synthetic switch to minimize CRISPR off-target effects by self-restricting Cas9 transcription and translation. Nucleic Acids Res. 2019;47(3). https://doi. org/10.1093/nar/gky1165.
218. Zhang S, Shen J, Li D, Cheng Y. Strategies in the delivery of Cas9 ribonucleoprotein for CRISPR/Cas9 genome editing. Theranostics. 2020. https://doi.org/10.7150/thno.47007.
219. Zhang D, Zhang Z, Unver T, Zhang B. CRISPR/Cas: A powerful tool for gene function study and crop improvement. J Adv Res. 2021;29:207-21.
220. Yin Y, Wang Q, Xiao L, Wang F, Song Z, Zhou C, et al. Advances in the engineering of the gene editing enzymes and the genomes: Understanding and handling the off-target effects of CRISPR/Cas9. J Biomed Nanotechnol. 2018. https://doi.org/10.1166/jbn.2018.2537.
221. Zhang X-H, Tee LY, Wang X-G, Huang Q-S, Yang S-H. Off-target Effects in CRISPR/Cas9-mediated Genome Engineering. Mol Ther Nucleic Acids. 2015;4: e264.
222. Li A, Lee CM, Hurley AE, Jarrett KE, De Giorgi M, Lu W, et al. A Self-Deleting AAV-CRISPR System for In Vivo Genome Editing. Mol Ther Methods Clin Dev. 2019. https://doi.org/10.1016/j.omtm.2018.11.009.
223. Xiang X, Corsi GI, Anthon C, Qu K, Pan X, Liang X, et al. Enhancing CRISPR-Cas9 gRNA efficiency prediction by data integration and deep learning. Nat Commun. 2021;12(1). https://doi.org/10.1038/ s41467-021-23576-0.
224. Kleinstiver BP, Prew MS, Tsai SQ, Topkar VV, Nguyen NT, Zheng Z, et al. Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities. Nature. 2015. https://doi.org/10.1038/nature14592.
225. Shen B, Zhang W, Zhang J, Zhou J, Wang J, Chen L, et al. Efficient genome modification by CRISPR-Cas9 nickase with minimal off-target effects. Nat Methods. 2014. https://doi.org/10.1038/nmeth.2857.
226. Ran FA, Hsu PD, Wright J, Agarwala V, Scott DA, Zhang F. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 2013. https:// doi.org/10.1038/nprot.2013.143.
227. Xie K, Yang Y. RNA-Guided Genome Editing in Plants Using a CRISPRCas System. Mol Plant. 2013;6(6):1975-83.
228. Izumi H, Wang Z, Goto Y, Ando T, Wu X, Zhang X, et al. Pathway-specific genome editing of PI3K/mTOR tumor suppressor genes reveals that PTEN loss contributes to cetuximab resistance in head and neck cancer. Mol Cancer Ther. 2020;19(7):1562-71.
229. Engstrom LD, Waters L, Gatto S, Fernandez-Banet J, Aranda R, Pavlicek A, et al. Abstract 5684: Drug-anchored in vitro and in vivo CRISPR screens to identify targetable vulnerabilities and modifiers of response to MRTX849 in KRASG12C-mutant models . Cancer Res. 2020;80(16_Supplement):5684-5684.
230. Li Y, Deutzmann A, Bell J, Ji H, Felsher D. Abstract PR02: Synthetic lethality screen identifies novel druggable targets in the MYC pathway. Mol Cancer Ther. 2017;16(10_Supplement):PR02-PR02.
231. Kolasa IK, Rembiszewska A, Janiec-Jankowska A, Dansonka-Mieszkowska A, Lewandowska AM, Konopka B, et al. PTEN mutation, expression and LOH at its locus in ovarian carcinomas. Relation to TP53, K-RAS and BRCA1 mutations. Gynecol Oncol. 2006;103(2):692-697.
232. Alenezi WM, Milano L, Fierheller CT, Serruya C, Revil T, Oros KK, et al. The Genetic and Molecular Analyses of RAD51C and RAD51D Identifies Rare Variants Implicated in Hereditary Ovarian Cancer from a Genetically Unique Population. Cancers (Basel). 2022;14(9). https://doi.org/10.3390/ cancers14092251.
233. Osher DJ, De Leeneer K, Michils G, Hamel N, Tomiak E, Poppe B, et al. Mutation analysis of RAD51D in non-BRCA1/2 ovarian and breast cancer families. Br J Cancer. 2012;106(8):1460-3.
234. Soukupová J, Lhotová K, Janatová M, Kleiblová P, Vočka M, Foretová L , et al. Germline mutations in RAD51C and RAD51D and hereditary predisposition to ovarian cancer. Klin Onkol. 2021;34(1):26-32.
235. Cummings S, Roman SS, Saam J, Bernhisel R, Brown K, Lancaster JM, et al. Age of ovarian cancer diagnosis among BRIP1, RAD51C, and RAD51D mutation carriers identified through multi-gene panel testing. J Ovarian Res. 2021;14(1). https://doi.org/10.1186/s13048-021-00809-w.
236. Loveday C, Turnbull C, Ramsay E, Hughes D, Ruark E, Frankum JR, et al. Germline mutations in RAD51D confer susceptibility to ovarian cancer. Nat Genet. 2011;43(9):879-82.
237. Chen X, Li Y, Ouyang T, Li J, Wang T, Fan Z, et al. Associations between RAD51D germline mutations and breast cancer risk and survival in BRCA1/2-negative breast cancers. Ann Oncol. 2018;29(10):2046-51.
238. Tao J, Bauer DE, Chiarle R. Assessing and advancing the safety of CRISPR-Cas tools: from DNA to RNA editing. Nat Commun. 2023;14(1). https://doi.org/10.1038/s41467-023-35886-6.
239. Bier E, Nizet V. Driving to Safety: CRISPR-Based Genetic Approaches to Reducing Antibiotic Resistance. Trends Genet. 2021;37(8):745-57.
240. Cromer MK, Barsan VV., Jaeger E, Wang M, Hampton JP, Chen F, et al. Ultra-deep sequencing validates safety of CRISPR/Cas9 genome editing in human hematopoietic stem and progenitor cells. Nat Commun. 2022;13(1). https://doi.org/10.1038/s41467-022-32233-z.
241. Sun D. Design of time-delayed safety switches for CRISPR gene therapy. Sci Rep. 2021;11(1). https://doi.org/10.1038/s41598-021-96510-5.
242. Xu CF, Chen GJ, Luo YL, Zhang Y, Zhao G, Lu ZD, et al. Rational designs of in vivo CRISPR-Cas delivery systems. Adv Drug Deliv Rev. 2021;168:3-29.
243. Stadtmauer EA, Fraietta JA, Davis MM, Cohen AD, Weber KL, Lancaster E, et al. CRISPR-engineered T cells in patients with refractory cancer. Science (80- ). 2020;367(6481). https://doi.org/10.1126/science.aba7365.
244. Wan F, Draz MS, Gu M, Yu W, Ruan Z, Luo Q. Novel strategy to combat antibiotic resistance: a sight into the combination of crispr/cas9 and nanoparticles. Pharmaceutics. 2021;13(3). https://doi.org/10.3390/ pharmaceutics13030352.
245. Tang N, Ning Q, Wang Z, Tao Y, Zhao X, Tang S. Tumor microenvironment based stimuli-responsive CRISPR/Cas delivery systems: A viable platform for interventional approaches. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 2022;210. https://doi.org/10.1016/j.colsurfb.2021.112257.
246. Wang G, Chow RD, Bai Z, Zhu L, Errami Y, Dai X, et al. Multiplexed activation of endogenous genes by CRISPRa elicits potent antitumor immunity. Nat Immunol. 2019;20(11):1494-505.
247. Xu L, Lau YS, Gao Y, Li H, Han R. Life-Long AAV-Mediated CRISPR Genome Editing in Dystrophic Heart Improves Cardiomyopathy without Causing Serious Lesions in mdx Mice. Mol Ther. 2019;27(8):1407-14.
248. Wei S, Shao X, Liu Y, Xiong B, Cui P, Liu Z, et al. Genome editing of PD-L1 mediated by nucleobase-modified polyamidoamine for cancer immunotherapy. J Mater Chem B. 2022;10(8):1291-300.
249. Wu Y, Zheng J, Zeng Q, Zhang T, Xing D. Light-responsive charge-reversal nanovector for high-efficiency in vivo CRISPR/Cas9 gene editing with controllable location and time. Nano Res. 2020;13(9):2399-406.
250. Li C, Ding L, Sun CW, Wu LC, Zhou D, Pawlik KM, et al. Novel HDAd/EBV Reprogramming Vector and Highly Efficient Ad/CRISPR-Cas Sickle Cell Disease Gene Correction. Sci Rep. 2016;6. https://doi.org/10.1038/srep3 0422.
251. Preece R, Pavesi A, Gkazi SA, Stegmann KA, Georgiadis C, Tan ZM, et al. CRISPR-Mediated Base Conversion Allows Discriminatory Depletion of Endogenous T Cell Receptors for Enhanced Synthetic Immunity. Mol Ther Methods Clin Dev. 2020;19:149-61.
252. Liu J, Li G, Guo H, Ni C, Gao Y, Cao X, et al. Dual-Responsive Core-Shell Tecto Dendrimers Enable Efficient Gene Editing of Cancer Cells to Boost Immune Checkpoint Blockade Therapy. ACS Appl Mater Interfaces. 2023;15(10):12809-21.
253. Chen X, Chen Y, Xin H, Wan T, Ping Y. Near-infrared optogenetic engineering of photothermal nanoCRISPR for programmable genome editing. Proc Natl Acad Sci U S A. 2020;117(5):2395-405.
254. Villamizar O, Waters SA, Scott T, Saayman S, Grepo N, Urak R, et al. Targeted Activation of Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator. Mol Ther. 2019;27(10):1737-48.
255. Pofali P, Mondal A, Londhe V. Exosome as a Natural Gene Delivery Vector for Cancer Treatment. Curr Cancer Drug Targets. 2020;20(11):821-30.
256. Ma SC, Zhang JQ, Yan TH, Miao MX, Cao YM, Cao YB, et al. Novel strategies to reverse chemoresistance in colorectal cancer. Cancer Med. 2023;12(10):11073-96.
257. Gong Z, Zhang X, Dai Z. Progress of nanoparticles inhibiting tumor metastasis. Kexue Tongbao/Chinese Sci Bull. 2018;63(15):1482-92.
258. Fix SM, Jazaeri AA, Hwu P. Applications of crispr genome editing to advance the next generation of adoptive cell therapies for cancer. Cancer Discov. 2021;11(3):560-74.
259. Choi E, Chang J-W, Krueger J, Lahr WS, Pomeroy E, Walsh M, et al. Engineering CD70-Directed CAR-NK Cells for the Treatment of Hematological and Solid Malignancies. Blood. 2021;138(Supplement 1):1691-1691.
260. Eyquem J, Mansilla-Soto J, Odak A, Sadelain M. 274. One-Step Generation of Universal CART Cells. Mol Ther. 2016;24:S109.
261. Kavanagh EW, Green JJ. Toward Gene Transfer Nanoparticles as Therapeutics. Advanced Healthcare Materials. 2022;11(7). https://doi.org/10. 1002/adhm. 202102145.
262. Wang X, Zabierowski S, Wu M, Del Casale C, Eyquem J, Mansilla-Soto J, et al. Establishing cGMP manufacturing of CRISPR/Cas9-edited human CART cells. Cytotherapy. 2020;22(5):S138-9.
263. Getahun YA, Ali DA, Taye BW, Alemayehu YA. Multidrug-Resistant Microbial Therapy Using Antimicrobial Peptides and the CRISPR/Cas9 System. Vet Med Res Reports. 2022;13:173-90.
264. Tay LS, Palmer N, Panwala R, Chew WL, Mali P. Translating CRISPR-Cas Therapeutics: Approaches and Challenges. CRISPR J. 2020;3(4):253-75.
265. Barrangou R, Horvath P. CRISPR: New horizons in phage resistance and strain identification. Annu Rev Food Sci Technol. 2012;3(1):143-62.
266. Xiu K, Saunders L, Wen L, Ruan J, Dong R, Song J, et al. Delivery of CRISPR/Cas9 Plasmid DNA by Hyperbranched Polymeric Nanoparticles Enables Efficient Gene Editing. Cells. 2023;12(1). https://doi.org/10. 3390/cells12010156.
267. Lau CH, Suh Y. In vivo genome editing in animals using AAV-CRISPR system: Applications to translational research of human disease. F1000Research. 2017;6. https://doi.org/10.12688/f1000research.11243.1.
268. Jiang C, Lin X, Zhao Z. Applications of CRISPR/Cas9 Technology in the Treatment of Lung Cancer. Trends Mol Med. 2019;25(11):1039-49.
269. Wang Z, Chen M, Zhang Y, Liu Y, Yang Q, Nie J, et al. Phase I study of CRISPR-engineered CAR-T cells with PD-1 inactivation in treating meso-thelin-positive solid tumors. J Clin Oncol. 2020;38(15_suppl):3038-3038.
270. Tratar UL, Horvat S, Cemazar M. Transgenic mouse models in cancer research. Front Oncol. 2018;8(JUL). https://doi.org/10.3389/fonc.2018. 00268.
271. Zhan T, Rindtorff N, Betge J, Ebert MP, Boutros M. CRISPR/Cas9 for cancer research and therapy. Semin Cancer Biol. 2019;55:106-19.
272. Ahmed , Daoud GH, Mohamed A, Harati R. New insights into the therapeutic applications of crispr/cas9 genome editing in breast cancer. Genes. 2021;12(5). https://doi.org/10.3390/genes12050723.
273. Zhao Z, Li C, Tong F, Deng J, Huang G, Sang Y. Review of applications of CRISPR-Cas9 gene-editing technology in cancer research. Biol Proced Online. 2021;23(1). https://doi.org/10.1186/s12575-021-00151-x.
274. Wang SW, Gao C, Zheng YM, Yi L, Lu JC, Huang XY, et al. Current applications and future perspective of CRISPR/Cas9 gene editing in cancer. Mol Cancer. 2022;21(1). https://doi.org/10.1186/s12943-022-01518-8.
275. Jo DH, Song DW, Cho CS, Kim UG, Lee KJ, Lee K, et al. CRISPR-Cas9mediated therapeutic editing of Rpe65 ameliorates the disease phenotypes in a mouse model of Leber congenital amaurosis. Sci Adv. 2019;5(10). https://doi.org/10.1126/sciadv.aax1210.
276. Liang SQ, Walkey CJ, Martinez AE, Su Q, Dickinson ME, Wang D, et al. AAV5 delivery of CRISPR-Cas9 supports effective genome editing in mouse lung airway. Mol Ther. 2022;30(1):238-43.
277. Yu W, Mookherjee S, Chaitankar V, Hiriyanna S, Kim JW, Brooks M, et al. Nrl knockdown by AAV-delivered CRISPR/Cas9 prevents retinal degeneration in mice. Nat Commun. 2017;8. https://doi.org/10.1038/ncomm s14716.
278. Zhen S, Liu Y, Lu J, Tuo X, Yang X, Chen H, et al. Human Papillomavirus Oncogene Manipulation Using Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeats/Cas9 Delivered by pH-Sensitive Cationic Liposomes. Hum Gene Ther. 2020;31(5-6):309-24.
279. Aksoy YA, Yang B, Chen W, Hung T, Kuchel RP, Zammit NW, et al. Spatial and Temporal Control of CRISPR-Cas9-Mediated Gene Editing Delivered via a Light-Triggered Liposome System. ACS Appl Mater Interfaces. 2020;12(47):52433-44.
280. Naeimi Kararoudi M, Likhite S, Elmas E, Yamamoto K, Schwartz M, Sorathia K, et al. Optimization and validation of CAR transduction into human primary NK cells using CRISPR and AAV. Cell Reports Methods. 2022;2(6). https://doi.org/10.1016/j.crmeth.2022.100236.
281. Fine EJ, Appleton CM, White DE, Brown MT, Deshmukh H, Kemp ML, et al. Trans-spliced Cas9 allows cleavage of HBB and CCR5 genes in human cells using compact expression cassettes. Sci Rep. 2015;5. https://doi.org/10.1038/srep10777.
282. Kazemian P, Yu SY, Thomson SB, Birkenshaw A, Leavitt BR, Ross CJD. Lipid-Nanoparticle-Based Delivery of CRISPR/Cas9 Genome-Editing Components. Mol Pharm. 2022;19(6):1669-86.
283. Osteikoetxea X, Silva A, Lázaro-Ibáñez E, Salmond N, Shatnyeva O, Stein J, et al. Engineered Cas9 extracellular vesicles as a novel gene editing tool. J Extracell Vesicles. 2022;11(5). https://doi.org/10.1002/jev2.12225.
284. Yang Z, Liang SQ, Yang H, Xu D, Bruggmann R, Gao Y, et al. CRISPRmediated kinome editing prioritizes a synergistic combination therapy for FGFR1-amplified lung cancer. Cancer Res. 2021;81(11):3121-33.
285. Chamberlain CA, Bennett EP, Kverneland AH, Svane IM, Donia M, Met Ö. Highly efficient PD-1-targeted CRISPR-Cas9 for tumor-infiltrating lymphocyte-based adoptive T cell therapy. Mol Ther Oncolytics. 2022;24:417-28.
286. Sajib AM, Agarwal P, Patton DJ, Nance RL, Stahr NA, Kretzschmar WP, et al. In vitro functional genetic modification of canine adenovirus type 2 genome by CRISPR/Cas9. Lab Investig. 2021;101(12):1627-36.
287. Sarkar E, Khan A. Erratic journey of CRISPR/Cas9 in oncology from bench-work to successful-clinical therapy. Cancer Treatment and Research Communications. 2021;27. https://doi.org/10.1016/j.ctarc. 2020.100289.
288. Michaels YS, Barnkob MB, Barbosa H, Baeumler TA, Thompson MK, Andre V , et al. Precise tuning of gene expression levels in mammalian cells. Nat Commun. 2019;10(1). https://doi.org/10.1038/ s41467-019-08777-y.
289. Lopez-Obando M, Hoffmann B, Géry C, Guyon-Debast A, Téoulé E, Rameau C, et al. Simple and efficient targeting of multiple genes through CRISPR-Cas9 in Physcomitrella patens. G3 Genes Genomes Genet. 2016;6(11):3647-3653.
290. Cao J, Wu L, Zhang SM, Lu M, Cheung WKC, Cai W, et al. An easy and efficient inducible CRISPR/Cas9 platform with improved specificity for multiple gene targeting. Nucleic Acids Res. 2016;44(19). https://doi.org/ 10.1093/nar/gkw660.
291. Ma X, Zhang Q, Zhu Q, Liu W, Chen Y, Qiu R, et al. A Robust CRISPR/Cas9 System for Convenient, High-Efficiency Multiplex Genome Editing in Monocot and Dicot Plants. Mol Plant. 2015;8(8):1274-84.
292. Wessels HH, Méndez-Mancilla A, Hao Y, Papalexi E, Mauck WM, Lu L, et al. Efficient combinatorial targeting of RNA transcripts in single cells with Cas13 RNA Perturb-seq. Nat Methods. 2023;20(1):86-94.
293. Hirata M, Wittayarat M, Namula Z, Le QA, Lin Q, Nguyen NT, et al. Evaluation of multiple gene targeting in porcine embryos by the CRISPR/Cas9 system using electroporation. Mol Biol Rep. 2020;47(7):5073-9.
294. Pan C, Wu X, Markel K, Malzahn AA, Kundagrami N, Sretenovic S, et al. CRISPR-Act3.0 for highly efficient multiplexed gene activation in plants. Nat Plants. 2021;7(7):942-953.
295. Selvakumar SC, Preethi KA, Ross K, Tusubira D, Khan MWA, Mani P, et al. CRISPR/Cas9 and next generation sequencing in the personalized treatment of Cancer. Mol Cancer. 2022;21(1). https://doi.org/10.1186/ s12943-022-01565-1.
296. Sioson VA, Kim M, Joo J. Challenges in delivery systems for CRISPRbased genome editing and opportunities of nanomedicine. Biomed Eng Lett. 2021;11(3):217-33.
297. Chandrasekaran AP, Karapurkar JK, Chung HY, Ramakrishna S. The role of the CRISPR-Cas system in cancer drug development: Mechanisms of action and therapy. Biotechnol J. 2022;17(7). https://doi.org/10.1002/ biot. 202100468.
298. Ma D, Liu F. Genome Editing and Its Applications in Model Organisms. Genomics Proteomics Bioinformatics. 2015;13(6):336-44.
299. Moses C, Kaur P. Applications of CRISPR systems in respiratory health: Entering a new’red pen’ era in genome editing. Respirology. 2019;24(7):628-37.
300. Kick L, Kirchner M, Schneider S. CRISPR-Cas9: From a bacterial immune system to genome-edited human cells in clinical trials. Bioengineered. 2017;8(3):280-6.
301. Leonova El, Reshetnikov VV, Sopova JV. CRISPR/Cas-edited pigs for personalized medicine: more than preclinical test-system. Res Results Pharmacol. 2022;8(3):87-98.
302. Castells-Roca L, Tejero E, Rodríguez-Santiago B, Surrallés J. Crispr screens in synthetic lethality and combinatorial therapies for cancer. Cancers. 2021;13(7). https://doi.org/10.3390/cancers13071591.
303. Huang A, Garraway LA, Ashworth A, Weber B. Synthetic lethality as an engine for cancer drug target discovery. Nat Rev Drug Discovery. 2020;19(1):23-38.
304. Dhanjal JK, Radhakrishnan N, Sundar D. Identifying synthetic lethal targets using CRISPR/Cas9 system. Methods. 2017;131:66-73.
305. Vit G, Duro J, Rajendraprasad G, Hertz EPT, Holland LKK, Weisser MB, et al. Chemogenetic profiling reveals PP2A-independent cytotoxicity of proposed PP2A activators iHAP1 and DT-061. EMBO J. 2022;41(14). https://doi.org/10.15252/embj.2022110611.
306. Li C, Mei H, Hu Y. Applications and explorations of CRISPR/Cas9 in CAR T-cell therapy. Brief Funct Genomics. 2020;19(3):175-82.
307. Hu Kjia, Yin ETS, Hu Y xian, Huang H. Combination of CRISPR/Cas9 System and CAR-T Cell Therapy: A New Era for Refractory and Relapsed Hematological Malignancies. Curr Med Sci. 2021;41(3):420-430.
308. Ajavavarakula T. CRISPR-edited CAR-T cells: Using CRISPR-Cas9 to Improve CAR-T Therapy. Highlights Sci Eng Technol. 2022;14:355-9.
309. Ye L, Park JJ, Peng L, Yang Q, Chow RD, Dong MB, et al. A genome-scale gain-of-function CRISPR screen in CD8 T cells identifies proline metabolism as a means to enhance CAR-T therapy. Cell Metab. 2022;34(4):595614.e14.
310. Zhou Z, Tao C, Li J, Tang JC on, Chan AS chi, Zhou Y. Chimeric antigen receptor T cells applied to solid tumors. Front Immunol. 2022;13. https://doi.org/10.3389/fimmu.2022.984864.
311. Cortese MJ, Sauter C. A ‘CRISPR’ non-viral manufacturing approach for CART cell therapies. Mol Ther. 2022;30(11):3338-40.
312. Yan X, Chen D, Ma X, Wang Y, Guo Y, Wei J, et al. CD58 loss in tumor cells confers functional impairment of CART cells. Blood Adv. 2022;6(22):5844-56.
313. Mollanoori H, Shahraki H, Rahmati Y, Teimourian S. CRISPR/Cas9 and CAR-T cell, collaboration of two revolutionary technologies in cancer immunotherapy, an instruction for successful cancer treatment. Hum Immunol. 2018;79(12):876-82.
314. Liu J, Wang X, Chen AT, Gao X, Himes BT, Zhang H, et al. ZNF117 regulates glioblastoma stem cell differentiation towards oligodendroglial lineage. Nat Commun. 2022;13(1). https://doi.org/10.1038/ s41467-022-29884-3.
315. Wilkinson AC, Dever DP, Baik R, Camarena J, Hsu I, Charlesworth CT, et al. Cas9-AAV6 gene correction of beta-globin in autologous HSCs improves sickle cell disease erythropoiesis in mice. Nat Commun. 2021;12(1). https://doi.org/10.1038/s41467-021-20909-x.
316. Smirnikhina SA, Kondrateva E V., Adilgereeva EP, Anuchina AA, Zaynitdinova MI, Slesarenko YS, et al. P.F508del editing in cells from cystic fibrosis patients. PLoS One. 2020;15(11 November). https://doi.org/10. 1371/journal.pone. 0242094.
317. Bonafont J, Mencía A, Chacón-Solano E, Srifa W, Vaidyanathan S, Romano R, et al. Correction of recessive dystrophic epidermolysis bullosa by homology-directed repair-mediated genome editing. Mol Ther. 2021;29(6):2008-18.
318. Valetdinova KR, Malankhanova TB, Zakian SM, Medvedev SP. The Cutting Edge of Disease Modeling: Synergy of Induced Pluripotent Stem Cell Technology and Genetically Encoded Biosensors. Biomedicines. 2021;9(8). https://doi.org/10.3390/biomedicines9080960.
319. Dessy-Rodriguez , Fañanas-Baquero , Venturi V, Payán-Pernía , Tornador C, Hernandez G, et al. Modelling Congenital Dyserythropoietic Anemia Type II through Gene Editing in Hematopoietic Stem and Progenitor Cells. Blood. 2020;136(Supplement 1):27-27.
320. Garcia-Bloj B, Moses C, Sgro A, Plani-Lam J, Arooj M, Duffy C, et al. Waking up dormant tumor suppressor genes with zinc fingers, TALEs and the CRISPR/dCas9 system. Oncotarget. 2016;7(37):60535-54.
321. Mazur PK, Herner A, Mello SS, Wirth M, Hausmann S, Sánchez-Rivera FJ, et al. Combined inhibition of BET family proteins and histone deacetylases as a potential epigenetics-based therapy for pancreatic ductal adenocarcinoma. Nat Med. 2015;21(10):1163-71.
322. Ousterout DG, Gersbach CA. Genome Editing for Neuromuscular Diseases. Genome Editing: The Next Step in Gene Therapy. 2016:51-79.
323. Ansari I, Chaturvedi A, Chitkara D, Singh S. CRISPR/Cas mediated epigenome editing for cancer therapy. Semin Cancer Biol. 2022;83:570-83.
324. Zhang C, Quan R, Wang J. Development and application of CRISPR/Cas9 technologies in genomic editing. Hum Mol Genet. 2018;27(R2):R79-88.
325. Pickar-Oliver A, Gersbach CA. The next generation of CRISPR-Cas technologies and applications. Nat Rev Mol Cell Biol. 2019;20(8):490-507.
326. Rafii S, Tashkandi E, Bukhari N, Al-Shamsi HO. Current Status of CRISPR/ Cas9 Application in Clinical Cancer Research: Opportunities and Challenges. Cancers. 2022;14(4). https://doi.org/10.3390/cancers14040947.
327. Yang Y, Xu J, Ge S, Lai L. CRISPR/Cas: Advances, Limitations, and Applications for Precision Cancer Research. Front Med. 2021;8. https://doi.org/ 10.3389/fmed.2021.649896.
328. Moses C, Garcia-Bloj B, Harvey AR, Blancafort P. Hallmarks of cancer: The CRISPR generation. Eur J Cancer. 2018;93:10-8.
329. Behan FM, lorio F, Picco G, Gonçalves E, Beaver CM, Migliardi G, et al. Prioritization of cancer therapeutic targets using CRISPR-Cas9 screens. Nature. 2019;568(7753):511-6.
330. Kim D, Kim J, Hur JK, Been KW, Yoon SH, Kim JS. Genome-wide analysis reveals specificities of Cpf1 endonucleases in human cells. Nat Biotechnol. 2016;34(8):863-8.
331. Manghwar H, Lindsey K, Zhang X, Jin S. CRISPR/Cas System: Recent Advances and Future Prospects for Genome Editing. Trends Plant Sci. 2019. https://doi.org/10.1016/j.tplants.2019.09.006.
332. Doerflinger M, Forsyth W, Ebert G, Pellegrini M, Herold MJ. CRISPR/ Cas9-The ultimate weapon to battle infectious diseases? Cell Microbiol. 2017;19(2). https://doi.org/10.1111/cmi.12693.
333. Boos SL, Loevenich LP, Vosberg S, Engleitner T, Öllinger R, Kumbrink J, et al. Disease Modeling on Tumor Organoids Implicates AURKA as a Therapeutic Target in Liver Metastatic Colorectal Cancer. CMGH. 2022;13(2):517-40.
334. Manghwar H, Li B, Ding X, Hussain A, Lindsey K, Zhang X, et al. CRISPR/ Cas Systems in Genome Editing: Methodologies and Tools for sgRNA Design, Off-Target Evaluation, and Strategies to Mitigate Off-Target Effects. Adv Sci. 2020. https://doi.org/10.1002/advs.201902312.
335. Rayner E, Durin M-A, Thomas R, Moralli D, O’Cathail SM, Tomlinson I, et al. CRISPR-Cas9 Causes Chromosomal Instability and Rearrangements in Cancer Cell Lines, Detectable by Cytogenetic Methods. Cris J. 2019;2(6):406-16.
336. Chen hang , Yin H. Recent advances in chemical modifications of guide RNA, mRNA and donor template for CRISPR-mediated genome editing. Adv Drug Deliv Rev. 2021;168:246-58.
337. Teng F, Li J, Cui T, Xu K, Guo L, Gao Q, et al. Enhanced mammalian genome editing by new Cas12a orthologs with optimized crRNA scaffolds. Genome Biol. 2019;20(1). https://doi.org/10.1186/ s13059-019-1620-8.
338. Bikard D, Euler C, Jiang W, Nussenzweig PM, Goldberg GW, Duportet X , et al. Development of sequence-specific antimicrobials based on programmable CRISPR-Cas nucleases. Nat Biotechnol. 2014;32(11):1146.
339. Deltcheva E, Chylinski K, Sharma CM, Gonzales K. CRISPR RNA maturation by trans -encoded small RNA and host factor RNase III. Nature. 2011;471(7340):602-7.

Springer Nature remains neutral with regard to jurisdictional claims in published maps and institutional affiliations.

At BMC, research is always in progress.
Learn more biomedcentral.com/submissions