DOI: https://doi.org/10.1038/s41564-025-02124-2
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/41073665
تاريخ النشر: 2025-10-10
المؤلف: Kuan‐Yi Lu وآخرون
الموضوع الرئيسي: علم الوراثة البكتيرية والتكنولوجيا الحيوية
نظرة عامة
تقدم هذه القسم دراسة تركزت على معالجة تحدي تحمل المضادات الحيوية في البكتيريا المستمرة داخل الخلايا، مع استهداف المكورات العنقودية الذهبية. طور الباحثون طريقة فحص عالية الإنتاجية لتحديد المركبات التي تعزز النشاط الأيضي لهذه البكتيريا. تم تحديد المركب KL1 كعامل مساعد واعد موجه نحو المضيف، لا يزيد فقط من النشاط الأيضي للمكورات العنقودية الذهبية داخل الخلايا، بل يجعل أيضًا الخلايا المستمرة أكثر حساسية لعلاج المضادات الحيوية دون التسبب في آثار سامة للخلايا أو تعزيز نمو البكتيريا.
كشفت التحقيقات الإضافية أن KL1 يظهر خصائص مساعدة ضد مسببات الأمراض الأخرى، بما في ذلك السالمونيلا وMycobacterium tuberculosis، في كل من نماذج العدوى في المختبر والفئران. أشارت التحليلات النسخية إلى أن KL1 يعدل جينات استجابة المناعة لدى المضيف ويقلل من إنتاج الأنواع التفاعلية في البلعميات، والتي من المعروف أنها تسبب تحمل المضادات الحيوية. تؤكد هذه الدراسة على إمكانية استهداف المستمرين داخل الخلايا من خلال تحفيز الأيض لديهم، مما يعالج فجوة حاسمة في مكافحة تحمل المضادات الحيوية والمقاومة.
طرق
في هذا القسم، يوضح المؤلفون المواد والأساليب المستخدمة في بحثهم. تم الحصول على مضادات حيوية متنوعة، بما في ذلك الرفامبيسين، هيدروكلوريد موكسيفلوكساسين، سلفات جنتاميسين، والكلورامفينيكول، من فيشر ساينتيفيك، بينما تم الحصول على هيدروكلوريد فانكومايسين من ألفا أيسر. تم الحصول على المركب KL1 من ChemBridge وEnamine، بالإضافة إلى تصنيعه داخليًا لضمان الدقة، مع شراء النظائر KL2-6 من ChemDiv وChemBridge وVitas M Chemical. بالإضافة إلى ذلك، تم تصنيع KL7 داخليًا. تم الحصول على مثبط EHMT2/G9a BIX-01294 من MedChemExpress.
تضمنت تقنيات زراعة الخلايا استخدام بليعات RAW 264.7 وTHP-1، التي تم الحصول عليها من ATCC وتم الحفاظ عليها تحت ظروف محددة في وسط دلبوكو المعدل (DMEM) ووسط RPMI 1640، على التوالي. تم عزل بليعات مشتقة من نخاع العظام (BMDMs) من فئران C57BL/6J وزراعتها في DMEM كامل. تم إنتاج BMDMs الخالدة من خلال طريقة عدوى فيروسية retroviral CRE-J2، والتي تتضمن الحضانة في وسط مشروط L929 ثم النقل باستخدام الفيروس. تضمنت ظروف الزراعة لـ BMDMs الخالدة RPMI 1640 مدعومًا بمغذيات متنوعة ووسط مشروط، مما يضمن نموًا وصيانة مثالية.
نتائج
تسلط نتائج هذه الدراسة الضوء على الدور الكبير للبيئة الداخلية في تعزيز تحمل المضادات الحيوية في المكورات العنقودية الذهبية. بينما أشارت اختبارات الأنابيب التقليدية إلى فرق كبير يبلغ 200 ضعف في تكوين المستمرين بين عزلات سريرية اثنتين، أظهرت كلا العزلتين مستويات عالية مماثلة من تحمل المضادات الحيوية عند دخولها إلى بليعات مشتقة من نخاع العظام (BMDMs). على وجه التحديد، زادت معدلات التحمل إلى 26-51% داخل البليعات، مما يتناقض بشكل حاد مع 0.05-9% التي لوحظت في الثقافات العائمة. من الجدير بالذكر أن كلا العزلتين حافظتا على تركيزات مثبطة دنيا متطابقة (MICs) للرفامبيسين ومضادات حيوية أخرى، مما يشير إلى أن التفاعلات مع المضيف حاسمة في تعزيز تحمل المضادات الحيوية.
للمزيد من التحقيق في خلايا المستمرين داخل الخلايا، طور الباحثون سلالات تقارير فلورية قابلة للتحفيز من المكورات العنقودية الذهبية، مما يتيح تصور البكتيريا الحية داخل البليعات عبر المجهر الضوئي المتماسك. كشفت هذه الطريقة عن خلايا المكورات العنقودية الذهبية الحية التي تعبر عن GFP والتي نجت من علاج الرفامبيسين، مما يوضح أن البيئة الداخلية لا تعمل فقط كحاجز مادي ولكن أيضًا تعزز تحمل المضادات الحيوية بنشاط. تؤكد هذه النتائج على ضرورة وجود استراتيجيات مبتكرة تهدف إلى القضاء على المستمرين داخل الخلايا، خاصة في ضوء الخيارات المحدودة من المضادات الحيوية المتاحة لعلاج العدوى داخل الخلايا.
مناقشة
تسلط الأبحاث الضوء على تطوير منصة فحص عالية الإنتاجية تهدف إلى تحديد المركبات التي يمكن أن تعيد تنشيط المكورات العنقودية الذهبية (S. aureus) داخل الخلايا وتعزز حساسيتها للمضادات الحيوية. استخدمت الدراسة سلالة مضيئة حيوية من المكورات العنقودية الذهبية المقاومة للميثيسيلين (MRSA) لمراقبة النشاط الأيضي داخل البليعات المصابة. تشير النتائج الرئيسية إلى أن المركب KL1 زاد بشكل كبير من الإضاءة الحيوية، مما يشير إلى زيادة في الأيض البكتيري، وعند دمجه مع الرفامبيسين أو موكسيفلوكساسين، حسّن فعالية القتل ضد MRSA داخل الخلايا حتى عشرة أضعاف. من المهم أن KL1 لم يحفز نمو البكتيريا، مما يشير إلى إمكانيته كعامل مساعد علاجي آمن.
أظهرت التجارب الحية أن KL1، عند إعطائه مع الرفامبيسين في نموذج الفئران لعدوى المكورات العنقودية الذهبية، أدى إلى تقليل ملحوظ في الحمل البكتيري وتحسين معدلات البقاء. كما أظهر المركب نشاطًا مساعدًا ضد مسببات الأمراض الداخلية الأخرى، مثل السالمونيلا وMycobacterium tuberculosis، مما يشير إلى تطبيق أوسع. من الناحية الآلية، يبدو أن KL1 يعدل استجابات المضيف من خلال تقليل الأنواع التفاعلية من الأكسجين والنيتروجين (ROS/RNS)، والتي تشارك في تحمل المضادات الحيوية. تؤكد الدراسة على إمكانية العلاجات المستهدفة للمضيف لتعزيز فعالية المضادات الحيوية ضد العدوى المستمرة، مما يمهد الطريق لمزيد من التحقيقات في آلية KL1 وتطبيقه في البيئات السريرية.
DOI: https://doi.org/10.1038/s41564-025-02124-2
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/41073665
Publication Date: 2025-10-10
Author(s): Kuan‐Yi Lu et al.
Primary Topic: Bacterial Genetics and Biotechnology
Overview
This section presents a study focused on addressing the challenge of antibiotic tolerance in intracellular bacterial persisters, specifically targeting Staphylococcus aureus. The researchers developed a high-throughput screening method to identify compounds that enhance the metabolic activity of these bacteria. The compound KL1 was identified as a promising host-directed adjuvant that not only increases the metabolic activity of intracellular S. aureus but also sensitizes persister cells to antibiotic treatment without causing cytotoxic effects or promoting bacterial outgrowth.
Further investigations revealed that KL1 exhibits adjuvant properties against other pathogens, including Salmonella enterica Typhimurium and Mycobacterium tuberculosis, in both in vitro and murine infection models. Transcriptomic analyses indicated that KL1 modulates host immune response genes and reduces the production of reactive species in macrophages, which are known to induce antibiotic tolerance. This study underscores the potential of targeting intracellular persisters by stimulating their metabolism, addressing a critical gap in the fight against antibiotic tolerance and resistance.
Methods
In this section, the authors detail the materials and methods employed in their research. Various antibiotics, including rifampicin, moxifloxacin hydrochloride, gentamicin sulfate, and chloramphenicol, were sourced from Fisher Scientific, while vancomycin hydrochloride was obtained from Alfa Aesar. The compound KL1 was acquired from ChemBridge and Enamine, as well as synthesized in-house to ensure fidelity, with analogues KL2-6 purchased from ChemDiv, ChemBridge, and Vitas M Chemical. Additionally, KL7 was synthesized in-house. The EHMT2/G9a inhibitor BIX-01294 was sourced from MedChemExpress.
Cell culture techniques involved the use of RAW 264.7 macrophages and THP-1 monocytes, obtained from ATCC and maintained under specific conditions in complete Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) and RPMI 1640 medium, respectively. Bone marrow-derived macrophages (BMDMs) were isolated from C57BL/6J mice and cultured in complete DMEM. Immortalized BMDMs were generated through a CRE-J2 retroviral infection method, involving incubation in L929-conditioned medium and subsequent transduction with the retrovirus. The culture conditions for immortalized BMDMs included RPMI 1640 supplemented with various nutrients and conditioned medium, ensuring optimal growth and maintenance.
Results
The results of this study highlight the significant role of the intracellular environment in promoting antibiotic tolerance in Staphylococcus aureus. While traditional tube assays indicated a substantial 200-fold difference in persister formation between two clinical isolates, both isolates exhibited comparable high levels of antibiotic tolerance when internalized by bone marrow-derived macrophages (BMDMs). Specifically, the tolerance rates increased to 26-51% within macrophages, contrasting sharply with the 0.05-9% observed in planktonic cultures. Notably, both isolates maintained identical minimum inhibitory concentrations (MICs) for rifampicin and other antibiotics, suggesting that host interactions are crucial in enhancing antibiotic tolerance.
To further investigate intracellular persister cells, the researchers developed inducible fluorescent reporter strains of S. aureus, enabling visualization of viable bacteria within macrophages via confocal microscopy. This approach revealed live, GFP-expressing S. aureus cells that survived rifampicin treatment, illustrating that the intracellular environment not only serves as a physical barrier but also actively fosters antibiotic tolerance. These findings emphasize the necessity for innovative strategies aimed at eradicating intracellular persisters, particularly in light of the limited antibiotic options available for treating intracellular infections.
Discussion
The research highlights the development of a high-throughput screening platform aimed at identifying compounds that can resuscitate intracellular *Staphylococcus aureus* (S. aureus) and enhance its susceptibility to antibiotics. The study utilized a bioluminescent strain of methicillin-resistant *S. aureus* (MRSA) to monitor metabolic activity within infected macrophages. Key findings indicate that the compound KL1 significantly increased bioluminescence, suggesting enhanced bacterial metabolism, and when combined with rifampicin or moxifloxacin, it improved the killing efficacy against intracellular MRSA by up to tenfold. Importantly, KL1 did not induce bacterial outgrowth, indicating its potential as a safe therapeutic adjuvant.
In vivo experiments demonstrated that KL1, when administered alongside rifampicin in a mouse model of *S. aureus* sepsis, resulted in a notable reduction in bacterial burden and improved survival rates. The compound also exhibited adjuvant activity against other intracellular pathogens, such as *Salmonella* and *Mycobacterium tuberculosis*, suggesting a broader application. Mechanistically, KL1 appears to modulate host responses by reducing reactive oxygen and nitrogen species (ROS/RNS), which are implicated in antibiotic tolerance. The study underscores the potential of host-targeted therapeutics to enhance antibiotic efficacy against persistent infections, paving the way for future investigations into KL1’s mechanism and its application in clinical settings.