DOI: https://doi.org/10.1038/s44328-025-00067-6
تاريخ النشر: 2026-01-13
المؤلف: Fei Deng وآخرون
الموضوع الرئيسي: تنظيم RNA والأمراض
نظرة عامة
تقدم البحث نظام استشعار حيوي جديد يعتمد على Cas13a مصمم للكشف الفائق الحساسية عن أهداف RNA دون الحاجة إلى تضخيم مسبق. أنظمة Cas13a التقليدية، على الرغم من فعاليتها في الكشف عن RNA، غالبًا ما تتطلب تقنيات تضخيم مثل تضخيم البوليميراز المعتمد على إعادة التركيب (RPA) أو تضخيم الحرارة المتوسطة بواسطة الحلقة (LAMP) لتحقيق الحساسية على مستوى الأتومولار (aM). ومع ذلك، فإن هذه الطرق محدودة بسبب الحاجة إلى معدات متخصصة وتكون عرضة للنتائج الإيجابية الكاذبة والتلوث. اكتشف المؤلفون أن RNA مزدوج الشريطة (dsRNA) يمكن أن ينشط نشاط القطع العابر لبروتين Cas13a النووي (RNP)، وإن كان بمعدلات قطع منخفضة. قاموا بتطوير نظام استشعار حيوي مبتكر ذاتي التحفيز يستخدم دوائر RNA النانوية، والتي، عند القطع، تعزز تنشيط عدة RNPs من Cas13a بواسطة RNA هدف واحد.
تسمح هذه الطريقة الجديدة بالكشف عن أهداف RNA الاصطناعية بتركيزات منخفضة تصل إلى 1 aM في غضون 15 دقيقة، مما يظهر تحسينات كبيرة في الحساسية والسرعة مقارنة بالطرق الحالية. تم التحقق من القابلية السريرية لهذا المستشعر الحيوي من خلال مراقبة مستويات miRNA-21 في عينات البلازما من مرضى سرطان القولون والمستقيم. بشكل عام، يبرز هذا البحث إمكانيات مستشعر Cas13a الحيوي في علم الأورام الدقيق، حيث يوفر طريقة سريعة وغير جراحية وحساسة للغاية للكشف عن العلامات الحيوية لـ RNA في الخزعات السائلة، مما يلبي الحاجة الملحة لطرق الكشف عن RNA تكون متاحة وفعالة في البيئات السريرية.
طرق
في هذه الدراسة، استخدم المؤلفون نظام استشعار حيوي قياسي يعتمد على CRISPR/Cas13a للتحقيق في معلمات مختلفة تؤثر على أدائه. كانت مزيج التفاعل يتكون من 40 نانومتر من بروتين Cas13a، 20 نانومتر من gRNA، و120 نانومتر من 5U-reporters، تم تحضيرها في محلول rCutSmart. تم إجراء تجارب تحسين لتحديد التركيزات المثالية لـ RNA أحادي الشريطة المحفز (ssRNA)، gRNA، والمراسلين، بالإضافة إلى تأثيرات المحاليل المختلفة ودرجات حرارة الحضانة على إشارات الفلورسنت، التي تم قياسها باستخدام قارئ لوحات ID5 عند أطوال موجية الإثارة والانبعاث 480 نانومتر و520 نانومتر، على التوالي.
تم تقييم حد الكشف لنظام الاستشعار الحيوي من خلال إدخال تركيزات متغيرة من ssRNA المحفز (تتراوح من 0 إلى 100 نانومتر) في مزيج التفاعل. بالإضافة إلى ذلك، استكشفت الدراسة الخصائص الأساسية لكل من المحفزات أحادية الشريطة ومزدوجة الشريطة، بما في ذلك ssRNA، cRNA، dsRNA، وcDNA، لتقييم فعاليتها في تنشيط Cas13a. تم التحقيق في آلية التنشيط بواسطة RNA مزدوج الشريطة (dsRNA) باستخدام نقل الطاقة الرنانة فورستر (FRET) لتوضيح عملية تنشيط المحفز. بشكل عام، قدمت هذه الطرق تحليلًا شاملاً لقدرات نظام CRISPR/Cas13a وقيوده في تطبيقات الاستشعار الحيوي.
النتائج
في هذه الدراسة، تم التحقيق في تنشيط بروتين Cas13a النووي (RNP) بواسطة محفزات مختلفة من الأحماض النووية، مما كشف أن RNA مزدوج الشريطة (dsRNA) يعمل كمحفز فعال للغاية، حيث حقق مستوى تنشيط يبلغ 53%. بالمقابل، فشلت الحمض النووي أحادي الشريطة (ssDNA) في تنشيط Cas13a، بينما أدى RNA أحادي الشريطة المعدل بالفوسفورثيوات (ps-ssRNA) إلى تنشيط طفيف فقط (7.5%). أظهرت الأحماض النووية مزدوجة الشريطة الأخرى التي تم اختبارها، بما في ذلك الهجائن RNA-DNA والحمض النووي مزدوج الشريطة، تنشيطًا محدودًا أو عدم تنشيط. تم توضيح آلية تنشيط dsRNA بشكل أكبر باستخدام نقل الطاقة الرنانة فورستر (FRET)، الذي أظهر أن التفاعل بين dsRNA وRNP Cas13a يتضمن ارتباط t-RNA بـ gRNA لـ Cas13a، مما يؤدي إلى إطلاق RNA المكمل (cRNA) وزيادة في إشارة الفلورسنت.
على الرغم من التنشيط الفعال لـ Cas13a بواسطة dsRNA، وجدت الدراسة أن RNP Cas13a المنشطة غير قادرة على قطع ركائز dsRNA. أكدت الرحلان الكهربائي في هلام الأجاروز ونظام الاستشعار الحيوي CRISPR/Cas13a أنه لم يحدث قطع لـ dsRNA، كما يتضح من عدم وجود زيادة كبيرة في الفلورسنت في اختبارات المراسلين. تسلط هذه النتائج الضوء على إمكانيات dsRNA كمحفز لـ Cas13a بينما تشير أيضًا إلى قيود في خصوصيتها للركائز لأنشطة القطع العابر.
المناقشة
في هذه الدراسة، طور المؤلفون هيكل RNA-Nanocircle جديد يدمج RNA مزدوج الشريطة (dsRNA) وRNA أحادي الشريطة (ssRNA) لتعزيز وظيفة نظام RNP Cas13a. تم تخليق RNA-Nanocircle باستخدام طريقة كيمياء النقر وتمت ملاحظته من خلال الرحلان الكهربائي في هلام الأجاروز، مما كشف أن تكوينه الدائري أدى إلى تقليل تنشيط Cas13a مقارنة بـ ssRNA الخطي. أظهرت الدراسة أنه عند القطع العابر لمنطقة ssRNA، يمكن أن يتم تسطيح الهيكل الدائري، مما يستعيد قدرته على تنشيط Cas13a ويمكّن آلية استشعار حيوي ذاتي التحفيز. تسمح هذه الآلية لـ RNA هدف واحد بتحفيز سلسلة من تنشيطات Cas13a، مما يحقق حد كشف يبلغ 1 aM في غضون 15 دقيقة، وبالتالي توفير منصة كشف سريعة وحساسة لأهداف RNA.
لزيادة مرونة المستشعر الحيوي، تم تقديم نظام RNP Cas13a مزدوج، مما يسمح بالكشف عن أهداف RNA متعددة ببساطة عن طريق تغيير gRNA لـ RNP Cas13a الأول. أظهر هذا النظام خصوصية استثنائية ضد التسلسلات غير المتطابقة وتم تطبيقه بنجاح للكشف عن miRNA-21 في عينات بلازما سرطان القولون والمستقيم (CRC) البشرية، مما أظهر اختلافات كبيرة في تركيزات miRNA-21 عبر مراحل الورم المختلفة. تشير النتائج إلى أن المستشعر الذاتي لـ Cas13a هو أداة واعدة للتشخيص السريري، خاصة في مراقبة تقدم CRC. ومع ذلك، أشار المؤلفون إلى التحديات المتعلقة بتعقيد تخليق RNA-Nanocircle واستقراره في العينات البيولوجية، مما يشير إلى الحاجة إلى مزيد من التحسين لتسهيل التطبيقات العملية في البيئات التشخيصية.
DOI: https://doi.org/10.1038/s44328-025-00067-6
Publication Date: 2026-01-13
Author(s): Fei Deng et al.
Primary Topic: RNA regulation and disease
Overview
The research presents a novel Cas13a-based biosensing system designed for the ultrasensitive detection of RNA targets without the need for preamplification. Traditional Cas13a systems, while effective for RNA detection, often require amplification techniques like recombinase polymerase amplification (RPA) or Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) to achieve sensitivity at the attomolar (aM) level. These methods, however, are limited by the need for specialized equipment and are prone to false positives and contamination. The authors discovered that double-stranded RNA (dsRNA) can activate the trans-cleavage activity of Cas13a ribonucleoprotein (RNP), albeit at low cleavage rates. They developed an innovative autocatalytic biosensing system utilizing RNA-Nanocircles, which, upon cleavage, enhance the activation of multiple Cas13a RNPs by a single target RNA.
This new approach allows for the detection of synthetic RNA targets at concentrations as low as 1 aM within 15 minutes, demonstrating significant improvements in sensitivity and speed compared to existing methods. The clinical applicability of this biosensor was validated through the monitoring of miRNA-21 levels in plasma samples from colorectal cancer patients. Overall, this research highlights the potential of the Cas13a-based biosensor in precision oncology, providing a rapid, non-invasive, and highly sensitive method for RNA biomarker detection in liquid biopsies, thus addressing the critical need for accessible and efficient RNA detection methods in clinical settings.
Methods
In this study, the authors employed a standard CRISPR/Cas13a biosensing system to investigate various parameters affecting its performance. The reaction mixture consisted of 40 nM Cas13a protein, 20 nM gRNA, and 120 nM 5U-reporters, prepared in rCutSmart buffer. Optimization experiments were conducted to determine the ideal concentrations of trigger single-stranded RNA (ssRNA), gRNA, and reporters, as well as the effects of different buffers and incubation temperatures on fluorescence signals, measured using an ID5 plate reader at excitation and emission wavelengths of 480 nm and 520 nm, respectively.
The limit of detection for the biosensing system was assessed by introducing varying concentrations of trigger ssRNA (ranging from 0 to 100 nM) into the reaction mixture. Additionally, the study explored the basic properties of both single-strand and double-strand triggers, including ssRNA, cRNA, dsRNA, and cDNA, to evaluate their effectiveness in activating Cas13a. The mechanism of activation by double-stranded RNA (dsRNA) was further investigated using Förster resonance energy transfer (FRET) to elucidate the trigger activation process. Overall, these methods provided a comprehensive analysis of the CRISPR/Cas13a system’s capabilities and limitations in biosensing applications.
Results
In this study, the activation of Cas13a ribonucleoprotein (RNP) by various nucleic acid triggers was investigated, revealing that double-stranded RNA (dsRNA) serves as a highly effective activator, achieving a 53% activation level. In contrast, single-stranded DNA (ssDNA) failed to activate Cas13a, while phosphorothioate-modified single-stranded RNA (ps-ssRNA) resulted in only a slight activation (7.5%). Other tested double-stranded nucleic acids, including RNA-DNA hybrids and double-stranded DNA, exhibited limited or no activation. The mechanism of dsRNA activation was further elucidated using Förster Resonance Energy Transfer (FRET), which demonstrated that the interaction between dsRNA and Cas13a RNP involves the binding of the t-RNA to the guide RNA (gRNA) of Cas13a, leading to the release of the complementary RNA (cRNA) and an increase in fluorescence signal.
Despite the effective activation of Cas13a by dsRNA, the study found that activated Cas13a RNP is incapable of trans-cleaving dsRNA substrates. Agarose gel electrophoresis and a CRISPR/Cas13a biosensing system confirmed that no cleavage of dsRNA occurred, as evidenced by the lack of significant fluorescence increase in the reporter assays. These findings highlight the potential of dsRNA as an activator for Cas13a while also indicating limitations in its substrate specificity for trans-cleavage activities.
Discussion
In this study, the authors developed a novel RNA-Nanocircle structure that integrates double-stranded RNA (dsRNA) and single-stranded RNA (ssRNA) to enhance the functionality of the Cas13a RNP system. The RNA-Nanocircle was synthesized using a click chemistry method and characterized through agarose gel electrophoresis, revealing that its circular conformation resulted in reduced activation of Cas13a compared to linear ssRNA. The study demonstrated that upon trans-cleavage of the ssRNA region, the circular structure could be linearized, restoring its ability to activate Cas13a and enabling an autocatalytic biosensing mechanism. This mechanism allows a single target RNA to trigger a cascade of Cas13a activations, achieving a detection limit of 1 aM within 15 minutes, thus providing a rapid and sensitive detection platform for RNA targets.
To enhance the versatility of the biosensor, a two-Cas13a RNP system was introduced, allowing for the detection of multiple RNA targets by simply altering the guide RNA (gRNA) of the first Cas13a RNP. This system demonstrated exceptional specificity against mismatched sequences and was successfully applied to detect miRNA-21 in human colorectal cancer (CRC) plasma samples, showing significant differences in miRNA-21 concentrations across various tumor stages. The findings suggest that the Cas13a-autosensor is a promising tool for clinical diagnostics, particularly in monitoring CRC progression. However, the authors noted challenges related to the complexity of RNA-Nanocircle synthesis and its stability in biological samples, indicating the need for further optimization to facilitate practical applications in diagnostic settings.