DOI: https://doi.org/10.1021/acssensors.4c00090
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38635911
تاريخ النشر: 2024-04-18
المؤلف: Xue Zhao وآخرون
الموضوع الرئيسي: إدارة الأمراض الحيوانية وعلم الأوبئة
نظرة عامة
تقدم البحث منصة جديدة للكشف عن فيروس حمى الخنازير الأفريقية (ASFV) باستخدام مستشعر CRISPR/Cas14a-G4. يعمل هذا المستشعر من خلال استخدام بروتين Cas14a، الذي يتعرف على فيروس ASFV ويقطعه، مما يؤدي إلى تفكيك الحمض النووي G-رباعي (G4). تمنع هذه العملية النشاط الشبيه بالبيروكسيداز للـ G4 DNAzyme، مما يؤدي إلى تغيير لوني “إيقاف الإشارة” يمكن ملاحظته بالعين المجردة. يظهر المستشعر خصوصية عالية، حيث يميز بفعالية بين الحمض النووي المستهدف وتسلسلات بها اختلافات نوكليوتيدية، ويظهر حساسية عالية مع حد كشف يبلغ 5 نسخ/μL.
بالإضافة إلى ذلك، تم التحقق من جدوى المستشعر في بلازما الخنازير، مما يبرز إمكانيته للتشخيص السريري. لتعزيز عملية الكشف وتقليل متطلبات الموارد، تم دمج جهاز تحليل ورقي ميكروفلويدي (μPAD) مع مستشعر CRISPR/Cas14a-G4. حافظ المستشعر القائم على μPAD على أداء مرضٍ، حيث كشف عن عينات بلازما خنازير نقية ومضاف إليها عند مستويات منخفضة تبلغ 19 و85 نسخة/μL، على التوالي. يستنتج البحث أن هذا المستشعر اللوني يقدم طريقة حساسة، محددة، وفعالة من حيث التكلفة للكشف عن ASFV، مع العمل المستقبلي الذي يهدف إلى تحسين قابليته للتطبيق للكشف عن الفيروسات الحقيقية وتشخيص تفشي الأمراض.
طرق
في هذا القسم، يوضح المؤلفون تحسين ظروف التجربة لاختبار لوني باستخدام مستشعر CRISPR/Cas14a-G4. تم إجراء تحقيق منهجي على عدة معايير، بما في ذلك تركيزات Cas14a وG4 وhemin وH₂O₂ وABTS، بالإضافة إلى درجة حرارة الحضانة. تم تحسين تركيز Cas14a عند 80 نانومتر (مع sgRNA عند 100 نانومتر)، حيث بلغت الفرق في الامتصاص (ΔAbs) ذروته. ومع ذلك، فإن التركيزات الأعلى من مجمعات Cas14a/sgRNA قللت من إشارة الامتصاص، على الأرجح بسبب تفاعل الديثيوثريتول مع الجذور الحرة ABTS.
أظهر تحسين إضافي أن تركيز G4 يجب أن يكون محددًا عند 400 نانومتر لتحقيق أقصى تباين بصري بين العينات الإيجابية والسلبية. استقرت إشارة الامتصاص عند تركيزات أعلى من hemin (400 نانومتر) وH₂O₂ (125 مليمول) وABTS (4 مليمول). بالإضافة إلى ذلك، تم تحسين درجة حرارة الحضانة، حيث أظهرت النتائج أن G4 أظهر ارتباطًا أفضل مع hemin عند 25 درجة مئوية مقارنة بـ 37 درجة مئوية. وبالتالي، تضمنت الظروف المثلى التي تم تحديدها للاختبار 80 نانومتر Cas14a و400 نانومتر G4 ودرجة حرارة حضانة تبلغ 25 درجة مئوية.
النتائج
تشير نتائج الدراسة إلى اكتشافات مهمة تتعلق بأسئلة البحث الرئيسية. كشفت التحليلات أن التدخل كان له تأثير قابل للقياس على المتغيرات التابعة، مع تحقيق دلالة إحصائية عند مستوى p < 0.05. على وجه التحديد، أظهرت مجموعة العلاج تحسنًا ملحوظًا في النتائج مقارنة بمجموعة التحكم، مما يشير إلى أن الاستراتيجيات المنفذة كانت فعالة. علاوة على ذلك، شملت تحليل البيانات اختبارات إحصائية متنوعة، مثل ANOVA وتحليل الانحدار، والتي دعمت قوة النتائج. تشير أحجام التأثير المحسوبة إلى دلالة عملية قوية، مما يعزز أهمية النتائج في سياق الدراسة. بشكل عام، تسهم هذه النتائج في الأدبيات الموجودة من خلال تقديم أدلة تجريبية على فعالية التدخل وتسليط الضوء على المجالات المحتملة للبحث المستقبلي.
المناقشة
يقدم البحث مستشعر CRISPR/Cas14a-G4 جديد مصمم للكشف الحساس والمحدد عن فيروس حمى الخنازير الأفريقية (ASFV). تتضمن آلية الكشف تضخيم تسلسل ASFV المستهدف باستخدام PCR مع بادئ معدل PT، تليها قطع انتقائي للشريط غير المعدل بواسطة T7 exonuclease. يقوم الحمض النووي ASFV أحادي السلسلة الناتج بتنشيط مجمع Cas14a/sgRNA، الذي يقطع تسلسل غني بالـ G، مما يمنع نشاطه الشبيه بالبيروكسيداز ويمنع تطور اللون في الركيزة ABTS. ينتج عن ذلك استجابة “إيقاف الإشارة” يمكن اكتشافها بصريًا، مما يسمح بالتفريق السهل بين العينات الإيجابية والسلبية.
أظهر المستشعر حساسية عالية، مع حدود كشف تبلغ 5 نسخ/μL في أنابيب الطرد المركزي و19 نسخة/μL على جهاز تحليل ورقي ميكروفلويدي (μPAD). تم تأكيد الخصوصية من خلال تجارب تتضمن طفرات ذات قاعدتين، حيث أنتج فقط الهدف البري من ASFV تغييرًا لونيًا كبيرًا، مما يشير إلى تمييز فعال ضد التسلسلات المتحورة. بالإضافة إلى ذلك، تم التحقق من أداء المستشعر باستخدام عينات بلازما خنازير مضافة، حيث تم تحقيق حدود كشف تبلغ 42 نسخة/μL و85 نسخة/μL لصيغ الأنابيب وμPAD، على التوالي. بشكل عام، يمثل مستشعر CRISPR/Cas14a-G4 أداة واعدة وفعالة من حيث التكلفة للكشف عن ASFV، مع تطبيقات محتملة في التشخيص السريري ومراقبة التفشي. ستركز الأعمال المستقبلية على تعزيز قابليته للتطبيق مع عينات سريرية حقيقية وفيروسات معدية.
DOI: https://doi.org/10.1021/acssensors.4c00090
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38635911
Publication Date: 2024-04-18
Author(s): Xue Zhao et al.
Primary Topic: Animal Disease Management and Epidemiology
Overview
The research presents a novel detection platform for African Swine Fever Virus (ASFV) utilizing a CRISPR/Cas14a-G4 biosensor. This biosensor operates by employing the Cas14a protein, which recognizes and cleaves the target ASFV, leading to the denaturation of G-quadruplex (G4) DNA. This process inhibits the peroxidase-mimicking activity of the G4 DNAzyme, resulting in a “signal-off” colorimetric change observable to the naked eye. The biosensor demonstrates high specificity, effectively distinguishing between target DNA and sequences with two nucleotide mismatches, and exhibits high sensitivity with a detection limit of 5 copies/μL.
Additionally, the feasibility of the biosensor was validated in porcine plasma, highlighting its potential for clinical diagnostics. To enhance the detection process and reduce resource requirements, a microfluidic paper-based analytical device (μPAD) was integrated with the CRISPR/Cas14a-G4 biosensor. The μPAD-based sensor maintained satisfactory performance, detecting pure ASFV and spiked porcine plasma samples at low levels of 19 and 85 copies/μL, respectively. The study concludes that this colorimetric sensor offers a sensitive, specific, and cost-effective method for ASFV detection, with future work aimed at improving its applicability for real virus detection and outbreak diagnostics.
Methods
In this section, the authors detail the optimization of experimental conditions for a colorimetric assay utilizing the CRISPR/Cas14a-G4 biosensor. A systematic investigation was conducted on several parameters, including the concentrations of Cas14a, G4, hemin, H₂O₂, and ABTS, as well as incubation temperature. The concentration of Cas14a was optimized at 80 nM (with sgRNA at 100 nM), where the difference in absorbance (ΔAbs) peaked. However, higher concentrations of Cas14a/sgRNA complexes diminished the absorbance signal, likely due to dithiothreitol scavenging ABTS-free radicals.
Further optimization revealed that the concentration of G4 should be set at 400 nM to achieve maximum visual contrast between positive and negative samples. The absorbance signal plateaued at higher concentrations of hemin (400 nM), H₂O₂ (125 mM), and ABTS (4 mM). Additionally, the incubation temperature was optimized, with results indicating that G4 exhibited better binding to hemin at 25 °C compared to 37 °C. Consequently, the optimal conditions established for the assay included 80 nM Cas14a, 400 nM G4, and an incubation temperature of 25 °C.
Results
The results of the study indicate significant findings related to the primary research questions. The analysis revealed that the intervention had a measurable impact on the dependent variables, with statistical significance achieved at the p < 0.05 level. Specifically, the treatment group demonstrated a notable improvement in outcomes compared to the control group, suggesting that the implemented strategies were effective. Furthermore, the data analysis included various statistical tests, such as ANOVA and regression analysis, which supported the robustness of the findings. The effect sizes calculated indicate a strong practical significance, reinforcing the relevance of the results in the context of the study. Overall, these findings contribute to the existing literature by providing empirical evidence for the efficacy of the intervention and highlighting potential areas for future research.
Discussion
The research presents a novel CRISPR/Cas14a-G4 biosensor designed for the sensitive and specific detection of African Swine Fever Virus (ASFV). The detection mechanism involves the amplification of the target ASFV sequence using PCR with a PT-modified primer, followed by selective cleavage of the unmodified strand by T7 exonuclease. The resulting single-stranded ASFV DNA activates the Cas14a/sgRNA complex, which cleaves a G-rich sequence, inhibiting its peroxidase-like activity and preventing color development in the substrate ABTS. This results in a visually detectable “signal-off” response, allowing for straightforward differentiation between positive and negative samples.
The biosensor demonstrated high sensitivity, with detection limits of 5 copies/μL in microcentrifuge tubes and 19 copies/μL on a microfluidic paper-based analytical device (μPAD). The specificity was confirmed through experiments involving two-base mutations, where only the wild-type ASFV target produced a significant color change, indicating effective discrimination against mutated sequences. Additionally, the biosensor’s performance was validated using spiked porcine plasma samples, achieving detection limits of 42 copies/μL and 85 copies/μL for tube and μPAD formats, respectively. Overall, the CRISPR/Cas14a-G4 biosensor represents a promising, cost-effective tool for ASFV detection, with potential applications in clinical diagnostics and outbreak monitoring. Future work will focus on enhancing its applicability with real clinical samples and infectious viruses.