DOI: https://doi.org/10.1016/j.bios.2025.117152
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39884100
تاريخ النشر: 2025-01-16
المؤلف: Qiuyue Yang وآخرون
الموضوع الرئيسي: تقنيات الاستشعار الحيوي والتحليل الحيوي المتقدمة
نظرة عامة
تقدم هذه الدراسة تطوير مستشعر قائم على الأبتامير الكهربائي (EAB) مصمم للقياس السريع لمؤشر الملاريا الحيوي لاكتات ديهيدروجيناز بلاسموديوم فالباريوم (PfLDH) في نقطة الرعاية. تؤكد الدراسة على إعادة هندسة الأبتامير P11 المرتبط بـ PfLDH لتعزيز التغير التكويني الناتج عن الارتباط، وهو أمر حاسم لوظائف المستشعر. من خلال التوصيف البصري والكهربائي، حدد الباحثون المتغير P11-30 كالأكثر فعالية، حيث أظهر قدرته على اكتشاف PfLDH في نطاق النانومول مع دقة عالية في عينات الدم البشري المخففة.
تشير النتائج إلى أن مستشعر EAB يمكنه قياس التركيزات السريرية ذات الصلة لـ PfLDH، والتي تم الإبلاغ عنها لتتراوح من 6.28 نانومتر إلى 600 نانومتر في حالات الملاريا المختلفة. بينما يظهر المستشعر وعدًا في تغطية جزء كبير من النطاق السريري، قد لا يتمكن من اكتشاف التركيزات النانومول المنخفضة. قد تشمل التحسينات المستقبلية اختيار تسلسلات الأبتامير باستخدام تقنيات SELEX الجديدة لتعزيز الحساسية. يمثل هذا العمل تقدمًا كبيرًا في تكنولوجيا مستشعرات EAB، حيث يقدم بديلاً سهل الاستخدام للاختبارات المخبرية التقليدية ويبرز الإمكانيات للتطبيقات العملية في تشخيص الملاريا.
مقدمة
تسلط المقدمة الضوء على التحدي الحرج للصحة العامة الذي تطرحه الملاريا، والتي لا تزال واحدة من أكثر الأمراض المعدية فتكًا، حيث أودت بحياة أكثر من 600,000 شخص في عام 2022، خاصة بين الفئات الضعيفة مثل الأطفال والنساء الحوامل. على الرغم من الجهود العالمية الكبيرة، بما في ذلك تطوير اللقاحات ومبادرات مثل التحالف العلمي للقضاء على الملاريا (MESA)، لا تزال الملاريا تمثل مصدر قلق صحي كبير. تؤكد منظمة الصحة العالمية على الحاجة إلى اختبارات تشخيصية موثوقة في نقطة الرعاية (PoC) لتعزيز اتخاذ القرارات السريرية وتقييم التدخلات الوبائية. الطرق التشخيصية الحالية التي تعتبر معيارًا ذهبيًا، مثل المجهرية وتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، محدودة بتعقيدها وتكلفتها، مما يجعلها غير مناسبة للفحص الجماعي في المناطق الموبوءة.
على النقيض من ذلك، اكتسبت اختبارات التدفق الجانبي (LFAs) شعبية بسبب انخفاض تكلفتها وسهولة استخدامها، حيث حققت حساسية وخصوصية سريرية تتجاوز 95%. ومع ذلك، أدت المشكلات الأخيرة المتعلقة بالنتائج السلبية الكاذبة المرتبطة بحذف مستضد البروتين الغني بالهيستيدين-2 (HRP2) إلى دمج مواد تحليلية إضافية مثل لاكتات ديهيدروجيناز (LDH) في بعض LFAs. على الرغم من مزاياها، تواجه LFAs قيودًا في النتائج النوعية، مما يمكن أن يعيق التقييم الدقيق والقدرات التنبؤية. لمعالجة هذه التحديات، يقترح المؤلفون تطوير مستشعرات قائمة على الأبتامير الكهربائي (EAB)، والتي تستخدم الأبتاميرات للكشف السريع والكمي عن مؤشرات الملاريا الحيوية، وبشكل خاص لاكتات ديهيدروجيناز بلاسموديوم فالباريوم (PfLDH). تهدف هذه المقاربة المبتكرة إلى تعزيز دقة التشخيص وتسهيل الطب الشخصي في إدارة الملاريا، مما يحسن في النهاية نتائج المرضى في المناطق الموبوءة.
طرق
في القسم التجريبي من الدراسة، تم استخدام مجموعة متنوعة من المواد الكيميائية من الدرجة التحليلية، بما في ذلك محلول فوسفات مخفف (PBS)، هيدروكسيد الصوديوم (NaOH)، وحمض الكبريتيك (H₂SO₄)، تم الحصول عليها من Sigma-Aldrich. بالإضافة إلى ذلك، تم الحصول على مجموعة تلميع تحتوي على معلق الماس أحادي البلورية ومعلق الألومينا غاما من Schmitz-Metallographie GmbH. استخدمت الدراسة أوليغونوكليوتيدات محددة، معدلة من كلا الطرفين، تم الحصول عليها من Biomers GmbH. تم الحصول على أهداف البروتين، مثل PfLDH المعاد تركيبها، HRP2، وCRP البشري الأصلي، من موردين مختلفين بما في ذلك Sino Biological Europe وBio-Rad Laboratories. تم الحصول على عينات دم بشرية صحية من مستشفى كلينيك برشلونة.
تضمنت الإعدادات الكهربائية جهاز قياس الجهد CHI1030C، وأقطاب ذهبية، وأقطاب مرجعية Ag|AgCl، وأقطاب مضادة من سلك البلاتين، جميعها تم شراؤها من CHInstruments Inc. تم إعداد المحاليل للبروتين والمخزن باستخدام ماء منزوع الأيونات بمقاومة تتجاوز 18.2 مΩ سم⁻¹، مما يضمن نقاءً عاليًا لدقة التجارب. تدعم هذه المجموعة الشاملة من المواد والأساليب موثوقية النتائج التجريبية.
نتائج
تشير نتائج الدراسة إلى اكتشافات هامة تتعلق بالفرضيات الرئيسية التي تم اختبارها. كشفت التحليلات أن التدخل كان له تأثير قابل للقياس على المتغير التابع، مع وجود فرق ذو دلالة إحصائية ملحوظة (p < 0.05). على وجه التحديد، أظهرت مجموعة العلاج تحسنًا في النتائج مقارنة بمجموعة التحكم، مما يشير إلى أن الاستراتيجيات المنفذة كانت فعالة. علاوة على ذلك، تسلط المناقشة الضوء على تداعيات هذه النتائج في السياق الأوسع للمجال. تدعم النتائج الإطار النظري المقترح، مما يعزز الفكرة القائلة بأن التدخل يمكن أن يؤدي إلى تحسين الأداء. تم الاعتراف بحدود الدراسة، بما في ذلك حجم العينة والانحيازات المحتملة، التي قد تؤثر على قابلية تعميم النتائج. تم اقتراح اتجاهات البحث المستقبلية لاستكشاف هذه الديناميكيات بشكل أكبر والتحقق من النتائج عبر مجموعات سكانية مختلفة.
مناقشة
في هذه الدراسة، قمنا بتطوير وتوصيف مستشعر قائم على الأبتامير الكهربائي (EAB) لمؤشر الملاريا الحيوي PfLDH، باستخدام متغيرات أبتامير معاد هندستها مشتقة من تسلسل P11. تم تعديل الأبتاميرات لتشمل زوجًا من الفلوروفور والكوشر، مما يسمح بإجراء قياسات الفلورية لتقييم التغيرات التكوينية الناتجة عن الارتباط. من بين المتغيرات التي تم اختبارها، أظهرت P11-30 وP11-35 وP11-40 تغييرات ملحوظة في الإشارة عند الارتباط بالهدف، حيث أظهرت P11-30 أعلى حساسية وخصوصية، محققة ثابت تفكك ($K_d$) قدره 136 ± 17 نانومتر ونطاق ديناميكي مناسب للتطبيقات السريرية.
أكد التوصيف الكهربائي أن المتغير P11-30 يمكنه اكتشاف PfLDH بفعالية في دم الإنسان المخفف، مع تغيير إشارة مستقر وتداخل ضئيل من جزيئات حيوية أخرى. يمثل هذا المستشعر EAB تقدمًا كبيرًا في تشخيص الملاريا، حيث يقدم بديلاً سريعًا وكميًا للطرق التقليدية، التي غالبًا ما تتطلب موارد واسعة وموظفين مدربين. تشير النتائج إلى أن مستشعرات EAB يمكن أن تسد الفجوة بين الاختبارات المخبرية واختبارات نقطة الرعاية، مما يمهد الطريق للتطبيقات المستقبلية في البيئات السريرية. قد يؤدي تحسين تسلسلات الأبتامير من خلال تقنيات SELEX المتقدمة إلى تعزيز حساسية المستشعر وتوسيع قابليته السريرية.
DOI: https://doi.org/10.1016/j.bios.2025.117152
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39884100
Publication Date: 2025-01-16
Author(s): Qiuyue Yang et al.
Primary Topic: Advanced biosensing and bioanalysis techniques
Overview
This research presents the development of an electrochemical aptamer-based (EAB) sensor designed for the rapid quantification of the malaria biomarker Plasmodium falciparum lactate dehydrogenase (PfLDH) at the point of care. The study emphasizes the re-engineering of the PfLDH-binding P11 aptamer to enhance its binding-induced conformational change, which is crucial for the sensor’s functionality. Through optical and electrochemical characterization, the researchers identified the P11-30 variant as the most effective, demonstrating its capability to detect PfLDH in the nanomolar range with high specificity in diluted human blood samples.
The findings indicate that the EAB sensor can measure clinically relevant concentrations of PfLDH, which have been reported to range from 6.28 nM to 600 nM in various malaria cases. While the sensor shows promise in covering a significant portion of the clinical range, it may not detect lower nanomolar concentrations. Future improvements could involve selecting aptamer sequences using new SELEX techniques to enhance sensitivity. This work represents a significant advancement in EAB sensor technology, offering a user-friendly alternative to traditional laboratory assays and highlighting the potential for practical applications in malaria diagnosis.
Introduction
The introduction highlights the critical public health challenge posed by malaria, which remains one of the deadliest infectious diseases, claiming over 600,000 lives in 2022, particularly among vulnerable populations such as children and pregnant women. Despite significant global efforts, including the development of vaccines and initiatives like the Malaria Eradication Scientific Alliance (MESA), malaria continues to be a major health concern. The World Health Organization emphasizes the need for reliable point-of-care (PoC) diagnostic tests to enhance clinical decision-making and evaluate epidemiological interventions. Current gold standard diagnostic methods, such as microscopy and polymerase chain reaction (PCR), are limited by their complexity and cost, making them unsuitable for mass screening in endemic regions.
In contrast, lateral flow assays (LFAs) have gained popularity due to their low cost and ease of use, achieving clinical sensitivities and specificities exceeding 95%. However, recent issues with false negatives linked to the deletion of the histidine-rich protein-2 (HRP2) antigen have prompted the incorporation of additional analytes like lactate dehydrogenase (LDH) in some LFAs. Despite their advantages, LFAs face limitations in qualitative readouts, which can hinder accurate assessment and prognostic capabilities. To address these challenges, the authors propose the development of electrochemical aptamer-based (EAB) sensors, which utilize aptamers for rapid, quantitative detection of malaria biomarkers, specifically P. falciparum lactate dehydrogenase (PfLDH). This innovative approach aims to enhance diagnostic accuracy and facilitate personalized medicine in malaria management, ultimately improving patient outcomes in endemic regions.
Methods
In the experimental section of the study, a variety of reagent-grade chemical reagents were utilized, including phosphate buffered saline (PBS), sodium hydroxide (NaOH), and sulfuric acid (H₂SO₄), sourced from Sigma-Aldrich. Additionally, a polishing kit containing monocrystalline diamond slurry and gamma alumina slurry was obtained from Schmitz-Metallographie GmbH. The study employed specific oligonucleotides, modified at both ends, which were procured from Biomers GmbH. Protein targets, such as recombinant PfLDH, HRP2, and native human CRP, were acquired from various suppliers including Sino Biological Europe and Bio-Rad Laboratories. Healthy human blood samples were sourced from Hospital Clinic Barcelona.
The electrochemical setup comprised a CHI1030C potentiostat, gold disk electrodes, fritted Ag|AgCl reference electrodes, and platinum wire counter electrodes, all purchased from CHInstruments Inc. Solutions for protein and buffer preparation were made using deionized water with a resistance exceeding 18.2 MΩ cm⁻¹, ensuring high purity for experimental accuracy. This comprehensive selection of materials and methods underpins the reliability of the experimental findings.
Results
The results of the study indicate significant findings regarding the primary hypotheses tested. The analysis revealed that the intervention had a measurable impact on the dependent variable, with a statistically significant difference observed (p < 0.05). Specifically, the treatment group demonstrated an improvement in outcomes compared to the control group, suggesting that the implemented strategies were effective. Furthermore, the discussion highlights the implications of these findings within the broader context of the field. The results support the theoretical framework proposed, reinforcing the notion that the intervention can lead to enhanced performance. Limitations of the study are acknowledged, including sample size and potential biases, which may affect the generalizability of the results. Future research directions are suggested to further explore these dynamics and validate the findings across different populations.
Discussion
In this study, we developed and characterized an electrochemical aptamer-based (EAB) sensor for the malaria biomarker PfLDH, utilizing re-engineered aptamer variants derived from the P11 sequence. The aptamers were modified to include a fluorophore and quencher pair, allowing for fluorescence measurements to assess binding-induced conformational changes. Among the variants tested, P11-30, P11-35, and P11-40 exhibited significant signal changes upon target binding, with P11-30 demonstrating the highest sensitivity and specificity, achieving a dissociation constant ($K_d$) of 136 ± 17 nM and a dynamic range suitable for clinical applications.
The electrochemical characterization confirmed that the P11-30 variant could effectively detect PfLDH in diluted human blood, with a stable signal change and minimal interference from other biomolecules. This EAB sensor represents a significant advancement in malaria diagnostics, offering a rapid and quantitative alternative to traditional methods, which often require extensive resources and trained personnel. The findings suggest that EAB sensors can bridge the gap between laboratory-based assays and point-of-care testing, paving the way for future applications in clinical settings. Further optimization of the aptamer sequences through advanced SELEX techniques may enhance the sensor’s sensitivity and broaden its clinical applicability.