DOI: https://doi.org/10.1007/s00216-026-06312-9
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/41553404
تاريخ النشر: 2026-01-19
المؤلف: Giusy Finocchiaro وآخرون
الموضوع الرئيسي: تقنيات الاستشعار الحيوي المتقدمة وتطبيقاتها
نظرة عامة
تتناول هذه الدراسة التحديات التي تطرحها تأثيرات المصفوفة في بلازما الدم البشري، والتي تعقد الكشف الدقيق عن المؤشرات الحيوية ذات التركيزات المنخفضة بسبب الامتصاص غير المحدد على أسطح المستشعرات والتفاعلات مع الأجسام المضادة الذاتية (IAbs). باستخدام مستشعر الرنين السطحي (SPR)، طور الباحثون استراتيجية تجمع بين حقن بلازما الدم/المخزن المؤقت المتسلسل، والمرجعية ذات السطح الواحد، وإدخال جسم مضاد ضد IAbs. هذه الطريقة تقلل بشكل فعال من تأثيرات المصفوفة، مما يعزز قدرات الكشف عن علامة السرطان الحيوية المستضد السرطاني الجنيني (CEA).
تظهر النتائج أن هذه المنهجية تسمح بالكشف المباشر عن CEA في بلازما الدم غير المخففة عند حد الكشف (LOD) يبلغ 12 نانوغرام/مل، وهو أكثر النتائج حساسية المبلغ عنها للكشف المباشر عن CEA في مثل هذه العينات باستخدام مستشعر SPR. علاوة على ذلك، عند استخدام اختبار السندويتش مع جزيئات الذهب النانوية الوظيفية، يتحسن LOD إلى 225 بيكوغرام/مل، وهو أقل بكثير من العتبة الفسيولوجية. وهذا يشير إلى أن الاستراتيجية المقترحة لا تسهل فقط الكشف القوي عن مستويات CEA ذات الصلة سريرياً في بلازما الدم غير المعالجة، ولكن لديها أيضاً القدرة على التكيف مع مختلف المؤشرات الحيوية البروتينية عبر مصفوفات بيولوجية مختلفة، مع تحسينات في الأداء من المحتمل أن ترتبط بتركيز IAbs الموجود.
مقدمة
تسلط مقدمة هذه الورقة البحثية الضوء على التحديات التي تطرحها تأثيرات المصفوفة في بلازما الدم البشري، والتي تعقد القياس التحليلي للمؤشرات الحيوية الضرورية للتشخيص السريري. تنشأ هذه التأثيرات المصفوفية بشكل أساسي من مكونات البلازما الوفيرة التي تتداخل مع كل من الطرق التحليلية التقليدية وتقنيات الاستشعار الحيوي المتقدمة، مثل مستشعرات الرنين السطحي (SPR). على وجه التحديد، يتم تحديد مشكلتين رئيسيتين: الامتصاص غير المحدد (NSA) لمكونات البلازما على أسطح المستشعرات والتداخل من الأجسام المضادة الذاتية (IAbs) التي تعطل التفاعلات المستقبلية.
لمعالجة هذه التحديات، تستعرض الورقة استراتيجيات متنوعة تهدف إلى تقليل NSA، بما في ذلك تقنيات معالجة العينات، وتفعيل المستشعر، ومنهجيات الكشف المتقدمة مثل المرجعية ذات السطح الواحد (SSR) وطرق غسل الميكروفلويديك. ومع ذلك، تشير إلى أن الأساليب الحالية غالباً ما تتجاهل تأثير IAbs، والتي يتم تصنيفها بشكل خاطئ في كثير من الأحيان على أنها NSA في دراسات المستشعر. يقترح المؤلفون استراتيجية جديدة تجمع بين SSR وطرق الحقن المتسلسل لتقليل NSA مع استخدام جسم مضاد ضد الغلوبولين المناعي G (Ab IgG) لمواجهة تداخل IAb. تتيح هذه الطريقة المتكاملة بنجاح الكشف عن المستضد السرطاني الجنيني (CEA)، وهو علامة حيوية مهمة للسرطان، في عينات بلازما الدم غير المعالجة، مما يعزز الإمكانية لتحليل دقيق للمؤشرات الحيوية في مصفوفات بيولوجية معقدة.
طرق
في هذه الدراسة، أنشأ المؤلفون منحنيات المعايرة للكشف عن المستضد السرطاني الجنيني (CEA) في بلازما الدم باستخدام مستشعر مع تعويض مرجعي. اختبروا تركيزات مختلفة من CEA (50، 100، 200، 300، 500، و1000 نانوغرام/مل) المضافة إلى بلازما الدم. شملت طرق الكشف نهجاً مباشراً واختبار سندويتش باستخدام جسم مضاد ثانوي موجه ضد CEA (b-Ab 2,CEA) وجزيئات الذهب النانوية المطلية بالستربتافيدين (AuNPs). تم تحضير b-Ab 2,CEA بتركيز 10 ميكروغرام/مل في مخزن مؤقت فوسفات مع 0.01% توين 20 (PBS Tween) وتم حقنه في المستشعر لمدة 15 دقيقة، تلاه إدخال AuNPs بتركيز 25 بيكو مولار لمدة 60 دقيقة.
تم إنشاء منحنيات المعايرة لكل من الكشف المباشر والكشف المعزز بواسطة AuNP عن CEA من خلال رسم استجابة المستشعر مقابل تركيزات CEA، التي تم قياسها في فترات زمنية مختلفة بعد الحقن. على وجه التحديد، تم تسجيل استجابة الكشف المباشر بعد 10 دقائق من آخر حقن للمخزن المؤقت، بينما تم أخذ استجابة الكشف المعزز بواسطة AuNP بعد 5 دقائق من حقن المخزن المؤقت. بالإضافة إلى ذلك، شملت الدراسة مقارنة أداء المستشعر مع قياس مستويات CEA الطبيعية في بلازما الدم باستخدام مجموعة ELISA تجارية من Abbott Diagnostics، الولايات المتحدة الأمريكية.
نتائج
تظهر نتائج الدراسة فعالية النهج المقترح للكشف عن المستضد السرطاني الجنيني (CEA) باستخدام مستشعر الرنين السطحي (SPR). تم تقييم استجابة المستشعر في بلازما الدم غير المخففة مع وبدون إضافة IgG المضاد لـ CEA (Ab IgG). تشير النتائج إلى أن إضافة Ab IgG قللت بشكل كبير من التداخل من الغلوبولينات المناعية الذاتية (IAbs)، كما يتضح من الفرق الكبير في استجابات المستشعر بين القنوات مع وبدون Ab IgG. على وجه التحديد، تم تقليل الفرق في استجابة المستشعر بين القناة المرجعية والقناة مع بلازما الدم، مما يؤكد أن استجابة المستشعر لبلازما الدم غير المعالجة تأثرت بشكل أساسي بالبروتينات الوفيرة بدلاً من CEA الطبيعي.
كشفت التحليلات الكمية أن حد الكشف (LOD) لـ CEA تحسن بحوالي ثلاثة أضعاف مع إضافة Ab IgG، محققاً LOD يبلغ 12 نانوغرام/مل، وهو تحسين ملحوظ مقارنة بالتقارير السابقة. علاوة على ذلك، تم استخدام اختبار السندويتش مع تعزيز جزيئات الذهب النانوية (AuNPs) للكشف عن CEA عند تركيزات فسيولوجية، مما أسفر عن LOD مثير للإعجاب يبلغ 225 بيكوغرام/مل. هذا LOD أقل بكثير من العتبة الفسيولوجية ويظهر إمكانيات المنهجية المطورة للكشف عن CEA عبر نطاق ديناميكي من ثلاثة أوامر من حيث الحجم، من 0.3 نانوغرام/مل إلى 500 نانوغرام/مل، مما يسهل الكشف عن CEA في البيئات السريرية.
مناقشة
في هذه الدراسة، طور المؤلفون مستشعر الرنين السطحي (SPR) للكشف عن المستضد السرطاني الجنيني (CEA) في بلازما الدم البشري غير المخففة، مع معالجة التحديات التي تطرحها الامتصاص غير المحدد والأجسام المضادة الذاتية (IAbs). تم جمع عينات بلازما الدم بشكل أخلاقي ومعالجتها لضمان عينة تمثيلية. استخدم مستشعر SPR تكويناً بست قنوات مع تثبيت درجة الحرارة، حيث تم معايرة استجابة المستشعر لربط تحولات الطول الموجي بكثافة سطح البروتين. تم تفعيل شريحة المستشعر بمزيج من الألكانثيولات والأجسام المضادة، تلاها بروتوكول غسل لتقليل التفاعلات غير المحددة.
جمعت الطريقة المبتكرة بين حقن بلازما الدم المتسلسل مع طريقة المرجعية ذات السطح الواحد (SSR)، مما سمح بالتفريق بين الإشارات المحددة وغير المحددة. قللت هذه الطريقة بشكل كبير من تأثير IAbs، محققة حد الكشف (LOD) لـ CEA يصل إلى 12 نانوغرام/مل في بلازما غير مخففة، وهو الأفضل المبلغ عنه للكشف عن CEA باستخدام SPR في مثل هذه العينات. بالإضافة إلى ذلك، عند استخدام اختبار السندويتش مع تعزيز جزيئات الذهب النانوية (AuNP)، تحسن LOD إلى 225 بيكوغرام/مل، وهو أقل بكثير من العتبات الفسيولوجية. تشير النتائج إلى أن هذه المنهجية لا تعزز فقط الكشف عن CEA ولكن يمكن أيضاً تكييفها لمؤشرات حيوية بروتينية أخرى في مصفوفات بيولوجية متنوعة، مع توقع تحسينات في الأداء في العينات التي تحتوي على تركيزات أعلى من IAbs.
DOI: https://doi.org/10.1007/s00216-026-06312-9
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/41553404
Publication Date: 2026-01-19
Author(s): Giusy Finocchiaro et al.
Primary Topic: Advanced Biosensing Techniques and Applications
Overview
This study addresses the challenges posed by matrix effects in human blood plasma, which complicate the accurate detection of low-concentration biomarkers due to nonspecific adsorption to sensor surfaces and interactions with endogenous antibodies (IAbs). Utilizing a surface plasmon resonance (SPR) biosensor, the researchers developed a strategy that combines sequential blood plasma/buffer injections, single-surface referencing, and the introduction of an antibody against IAbs. This approach effectively mitigates the matrix effects, enhancing the detection capabilities for the cancer biomarker carcinoembryonic antigen (CEA).
The findings demonstrate that this methodology allows for the direct detection of CEA in undiluted blood plasma at a limit of detection (LOD) of 12 ng/mL, which is the most sensitive result reported for direct detection of CEA in such samples using an SPR biosensor. Furthermore, when employing a sandwich assay with functional gold nanoparticles, the LOD improves to 225 pg/mL, significantly below the physiological threshold. This suggests that the proposed strategy not only facilitates the robust detection of clinically relevant CEA levels in untreated blood plasma but also has the potential for adaptation to various protein biomarkers across different biological matrices, with performance improvements likely correlating with the concentration of IAbs present.
Introduction
The introduction of this research paper highlights the challenges posed by matrix effects in human blood plasma, which complicate the analytical measurement of biomarkers crucial for clinical diagnostics. These matrix effects arise primarily from the abundant plasma components that interfere with both conventional analytical methods and advanced biosensing technologies, such as surface plasmon resonance (SPR) biosensors. Specifically, two main issues are identified: nonspecific adsorption (NSA) of plasma components to sensor surfaces and interference from endogenous antibodies (IAbs) that disrupt receptor interactions.
To address these challenges, the paper reviews various strategies aimed at mitigating NSA, including sample treatment techniques, biosensor functionalization, and advanced detection methodologies like single-surface referencing (SSR) and microfluidic washing methods. However, it notes that existing approaches often overlook the impact of IAbs, which are frequently misclassified as NSA in biosensor studies. The authors propose a novel strategy that combines SSR and sequential injection methods to reduce NSA while employing an antibody against immunoglobulin G (Ab IgG) to counteract IAb interference. This integrated approach successfully enables the detection of carcinoembryonic antigen (CEA), a significant cancer biomarker, in untreated blood plasma samples, thereby advancing the potential for accurate biomarker analysis in complex biological matrices.
Methods
In this study, the authors established calibration curves for the detection of carcinoembryonic antigen (CEA) in blood plasma using a reference-compensated sensor. They tested various concentrations of CEA (50, 100, 200, 300, 500, and 1000 ng/mL) spiked into blood plasma. The detection methods included a direct approach and a sandwich assay utilizing a biotinylated secondary antibody against CEA (b-Ab 2,CEA) and streptavidin-coated gold nanoparticles (AuNPs). The b-Ab 2,CEA was prepared at a concentration of 10 µg/mL in phosphate buffer with 0.01% Tween 20 (PBS Tween) and injected into the sensor for 15 minutes, followed by the introduction of AuNPs at a concentration of 25 pM for 60 minutes.
Calibration curves for both direct detection and AuNP-enhanced detection of CEA were generated by plotting the sensor response against CEA concentrations, measured at different time intervals post-injection. Specifically, the response for direct detection was recorded 10 minutes after the last buffer injection, while the response for AuNP-enhanced detection was taken 5 minutes after the buffer injection. Additionally, the study included a comparison of the sensor’s performance with the measurement of naturally occurring CEA levels in blood plasma using a commercial ELISA kit from Abbott Diagnostics, USA.
Results
The results of the study demonstrate the effectiveness of the proposed approach for carcinoembryonic antigen (CEA) detection using a surface plasmon resonance (SPR) biosensor. The sensor response was evaluated in undiluted blood plasma with and without the addition of anti-CEA IgG (Ab IgG). The findings indicate that the addition of Ab IgG significantly mitigated the interference from endogenous immunoglobulins (IAbs), as evidenced by the substantial difference in sensor responses between channels with and without Ab IgG. Specifically, the sensor response difference between the reference channel and the channel with blood plasma was reduced, confirming that the sensor’s response to untreated plasma was primarily influenced by abundant proteins rather than naturally occurring CEA.
Quantitative analysis revealed that the limit of detection (LOD) for CEA was improved by approximately threefold with the addition of Ab IgG, achieving an LOD of 12 ng/mL, which is a notable enhancement compared to previous reports. Furthermore, a sandwich assay utilizing gold nanoparticles (AuNPs) was employed to detect CEA at physiological concentrations, yielding an impressive LOD of 225 pg/mL. This LOD is significantly below the physiological threshold and demonstrates the potential of the developed methodology for detecting CEA across a dynamic range of three orders of magnitude, from 0.3 ng/mL to 500 ng/mL, thereby facilitating the detection of CEA in clinical settings.
Discussion
In this study, the authors developed a surface plasmon resonance (SPR) biosensor to detect carcinoembryonic antigen (CEA) in undiluted human blood plasma, addressing challenges posed by nonspecific adsorption and endogenous antibodies (IAbs). Blood plasma samples were collected ethically and processed to ensure a representative sample. The SPR biosensor utilized a six-channel configuration with temperature stabilization, where the sensor response was calibrated to correlate wavelength shifts with protein surface density. The sensor chip was functionalized with a mixture of alkanethiols and antibodies, followed by a washing protocol to minimize nonspecific interactions.
The innovative approach combined sequential blood plasma injections with a single-surface referencing (SSR) method, allowing for the differentiation between specific and nonspecific signals. This method significantly reduced the impact of IAbs, achieving a limit of detection (LOD) for CEA as low as 12 ng/mL in undiluted plasma, which is the best reported for SPR detection of CEA in such samples. Additionally, when employing a sandwich assay with gold nanoparticle (AuNP) enhancement, the LOD improved to 225 pg/mL, well below physiological thresholds. The findings indicate that this methodology not only enhances the detection of CEA but could also be adapted for other protein biomarkers in various biological matrices, with performance improvements expected in samples with higher concentrations of IAbs.