الغرض: العلاج الضوئي، المعروف بانتقائيته العالية، وقلة آثاره الجانبية، وقوة تحكمه، وتعزيز التآزر للعلاجات المجمعة، يُستخدم على نطاق واسع في علاج الأمراض مثل سرطان عنق الرحم.
الطرق: في هذه الدراسة، تم استخدام ثاني أكسيد المنغنيز المسامي المجوف كحامل لبناء جزيئات نانوية مشحونة إيجابياً معدلة بواسطة بولي (هيدروكلوريد الأليل أمين). تم تحميل NP بكفاءة مع المحسس الضوئي إندوسيانين الأخضر (ICG) من خلال إضافة أيونات هيدروجين فوسفات لإنتاج تأثير تجميع الأيونات المضادة. تم تنفيذ تغليف غشاء خلايا هيلا لتحقيق M-HMnO النهائية @ICG NP. في هذه البنية، يتحلل الحامل استجابةً لإطلاق ICG في البيئة الدقيقة للورم، ويولد ذاتياً للتحسس للعلاج الضوئي المعتمد على ICG (PDT)، ويستهلك GSH لتوسيع تأثير العلاج الناتج عن الإجهاد التأكسدي [العلاج الكيميائي (CDT) + PDT]. يتسبب ICG المتراكم في أنسجة الورم في تأثير تآزري للعلاج الضوئي / العلاج الحراري (PTT) من خلال إشعاع ليزر واحد، مما يحسن الكفاءة ويقلل من الآثار الجانبية. يزيد تغليف غشاء الخلية من تراكم النانودواء في أنسجة الورم ويمنح قدرة على التهرب المناعي. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تعزز درجات الحرارة المحلية العالية الناتجة عن PTT من CDT. تمكّن هذه الخصائص من تحقيق كامل لتأثيرات PTT/PDT/CDT المستهدفة.
النتائج: يمكن أن تعمل كعامل تصوير بالرنين المغناطيسي لتوجيه العلاج، ويمكن استخدام ICG للتصوير الحراري والفلوري. بعد حقنه في الوريد، تراكم بشكل فعال في مواقع الأورام لدى الفئران؛ يمكن التحقق من التوقيت الأمثل لعلاج الليزر داخل الجسم بواسطة الفلورية القريبة من الأشعة تحت الحمراء، والرنين المغناطيسي، والتصوير الحراري. كانت M- ICG NPs لديها أفضل تأثيرات مضادة للورم بين مجموعات العلاج تحت ظروف الضوء القريب من الأشعة تحت الحمراء، وأظهرت توافقًا حيويًا جيدًا.
الاستنتاج: في هذه الدراسة، صممنا نظام توصيل نانوي حيوي يحسن نقص الأكسجين، ويستجيب للبيئة الدقيقة للورم، ويحمّل ICG بكفاءة. يوفر استراتيجية جديدة اقتصادية ومريحة للعلاج الضوئي التآزري وCDT لسرطان عنق الرحم.
الكلمات الرئيسية: العلاج الضوئي، أنواع الأكسجين التفاعلية، تخفيف نقص الأكسجين، العلاج التعاوني

سرطان عنق الرحم هو رابع أكثر الأورام الخبيثة النسائية شيوعًا في العالم، مما يتسبب في أكثر من 300,000 حالة وفاة سنويًا. حاليًا، يعتمد علاجه السريري على الجراحة. بالنسبة للمرضى الشباب الذين يحتاجون إلى الإنجاب، فإن هذا النهج غير مرضٍ، حيث يزيد استئصال عنق الرحم من خطر الإجهاض بسبب عدم كفاية عنق الرحم، وتؤدي الجراحة الجذرية إلى عقم النساء. العلاج الكيميائي هو علاج مساعد ضروري لسرطان عنق الرحم، لكنه ذو فعالية ضعيفة بسبب تحمل العلاج وآثاره الجانبية السامة الشديدة. لذلك، فإن تطوير استراتيجيات علاجية جديدة لسرطان عنق الرحم له أهمية سريرية كبيرة.

نظرًا لأن التركيب التشريحي لعنق الرحم مرتبط بتركيب المهبل، فقد جذبت استخدام العلاجات الضوئية لسرطان عنق الرحم اهتمامًا بحثيًا واسعًا. العلاج الضوئي، أو إدارة العلاج الحراري (PTT) والعلاج الضوئي (PDT) من خلال التعرض للأشعة تحت الحمراء القريبة (NIR) باستخدام المحسسات الضوئية (PSs) والعوامل الحرارية، قد تم استخدامه على نطاق واسع في أبحاث مكافحة الأورام. كطريقة علاج محلية، لها مزايا عدم التوغل المباشر، ومقاومة منخفضة للأدوية، وتشخيص في الوقت الحقيقي، وانتقائية جيدة للأنسجة؛ فهي تمكّن من تراكم المواد الحساسة للضوء والحرارة في مواقع الإشعاع دون إلحاق الضرر بالأنسجة الطبيعية المحيطة. في PTT، يحول عامل حراري ضوئي الطاقة الضوئية الممتصة من NIR إلى طاقة حرارية فعالة لقتل خلايا الورم من خلال التبخر الحراري. في PDT، تحول PSs الجزيئات المحيطة إلى أنواع الأكسجين التفاعلية السامة (ROS) تحت إشعاع الليزر عند أطوال موجية محددة لدفع موت الخلايا. تمتلك PTT وPDT تأثيرات تآزرية. من ناحية، يزيد نقص الأكسجين وتحمض البيئة الدقيقة للورم بعد PDT من حساسية خلايا الورم لـ PTT، ويقلل تدفق الدم إلى الورم من تأثير “مصدر الحرارة”، مما يساعد على تحقيق درجة حرارة التخثر الضوئي. من ناحية أخرى، يزيد الحرارة الناتجة عن PTT من تدفق الدم، ويحسن الإمداد، ويعزز بشكل كبير الإصابة الناتجة عن PDT. تمامًا كما يمكن أن يسهل إشعاع الليزر بمصدر ضوء واحد العمليات السريرية، فإن الاستخدام التآزري لـ PDT وPTT ضد سرطان عنق الرحم بمصدر ضوء واحد يمكن أن يكون قابلاً للتحويل إلى الإعداد السريري.

مع التقدم في مجال العلاج الضوئي، تم اعتماد عوامل مثل بروتوبورفيرين IX، وديهيدروكلورين e6، وميثيلين الأزرق (MB) للعلاج السريري للأورام الجلدية، والمريئية، والرئوية. ومع ذلك، تقع أطياف امتصاص هذه PSs بشكل أساسي ضمن نطاق الضوء المرئي ( )، وتقلل درجات عالية من امتصاص الضوء وتشتت الأنسجة البيولوجية بشكل كبير من فعاليتها في علاج الأنسجة العميقة. الضوء القريب من الأشعة تحت الحمراء، الذي يقع ضمن نافذة الشفافية البيولوجية لـ ، يظهر اختراقًا أعمق للأنسجة ومعدلات امتصاص أقل. لذلك، فإن استخدام PSs ذات خصائص امتصاص أطوال موجية أطول لتعزيز التأثيرات العلاجية الضوئية يستحق النظر.

إندوسيانين الأخضر (ICG) لديه قمة امتصاص قوية بين 780 و800 نانومتر، وبالتالي قدرة امتصاص جيدة في NIR. بسبب سميته المنخفضة، و affinity العالية، وخصائصه البصرية الفريدة، تم اعتماد ICG من قبل إدارة الغذاء والدواء الأمريكية للاستخدام السريري كصبغة عضوية NIR ذات قدرات حرارية وضوئية تحت إشعاع مصدر ضوء واحد. ومع ذلك، فإن التطبيق العملي لـ ICG ينطوي على عدة تحديات تتعلق بميله للتفتيح الضوئي، وكفاءة تحويل الحرارة الضوئية المنخفضة، وعدم استقراره الضوئي. على سبيل المثال، تحت تعرض الليزر NIR، يكون العائد الكمي للأكسجين الأحادي ( ) الناتج عن مونومرات ICG هو فقط علاوة على ذلك، يرتبط ICG المحقون في الوريد بسهولة ببروتينات البلازما، مثل الألبومين والدهون البروتينية عالية الكثافة (مثل، )، مما يؤدي إلى تطهيره السريع من الجسم ونصف عمره حوالي كما أن ICG يفتقر إلى التخصص، مما يحد من تراكمه في أنسجة الورم وبالتالي تطبيقه في العلاج الضوئي للورم. لذلك، فإن تطوير أدوية نانوية جديدة لمعالجة هذه القضايا، وتعزيز استقرار ICG، ومدة احتباسه في الجسم، وتأثيراته العلاجية ضد الأورام، أمر ضروري بشكل عاجل.

لقد جعلت التقدمات الحديثة في تكنولوجيا النانو الاستخدام المشترك للمواد النانوية وتقنيات العلاج الضوئي نهجًا قابلاً للتطبيق لعلاج الأورام. لتحسين المزايا العلاجية لـ ICG وتأثير العلاج الحراري الضوئي / العلاج الضوئي المشترك، قام الباحثون بإنشاء مواد مركبة جديدة. شيوه وآخرون تم تطعيم ICG على الناقلات النانوية المغناطيسية نوى الجسيمات النانوية وقشور الأزرق البروسي (المشكلة في الموقع) باستخدام تعديل بولي إيثيلين إيمين وامتصاص كهربائي لتحسين كفاءة نقل الأدوية واستقرارها، مما يسهل تراكم ICG في الأورام. هذه الطريقة حلت بشكل فعال مشاكل الاستقرار البصري الضعيف والتوافر البيولوجي المنخفض لجزيئات ICG الحرة. تشين وآخرون طور هيكل نواة-غلاف مع نشاط إنزيمي مزدوج، وأفاد بأن المحمّل بـ ICG أظهرت أنشطة شبيهة بالبيروكسيداز والكاتالاز (CAT) وفعالية مضادة للأورام بالتآزر بين الحرارة الضوئية/الحركة الضوئية/الحركة الكيميائية. أدت نشاطها الشبيه بالكاتالاز إلى في الموقع الجيل، الذي خفف من نقص الأكسجين في الورم وحسن من كفاءة العلاج الضوئي الديناميكي المرتبط بـ ICG. تشينغ وآخرون أعدت على مقياس نانوي إطار عضوي معدني (MOF) من خلال إدخال “الأيونات إلى سلف ZIF-90 واستكشاف تشكيل الحالة المختلطة من الشحنات ( ) مجوف
الهياكل المسامية عند التسخين والمعادن المختلطة، ذات القيم المختلطة الهياكل عند التسخين مع إضافة أسيتيل أسيتونات المنغنيز لقد قاموا بتحميل الهيكل المجوف بمادة ICG (ICG@Mn/Cu/Zn-MOF@MnO2) من أجل التصوير متعدد الأوضاع الموجه للعلاج الحراري الضوئي / العلاج الضوئي الديناميكي / العلاج الكيميائي الديناميكي. وقد أظهرت هذه الدراسات أن الاستقرار البصري لمادة ICG يمكن تحسينه بشكل فعال من خلال الت encapsulation في الناقلات النانوية، مما يتيح الاستفادة الكاملة من المزايا العلاجية المزدوجة لهذه الصبغة وتحسين فعاليتها المضادة للأورام. ومع ذلك، فإن التعقيد الهيكلي لهذه الأدوية النانوية متعددة الوظائف يزيد من صعوبة ترجمتها سريرياً. وبالتالي، فإن تبسيط هياكل ناقلات الأدوية، وتعزيز كفاءة توصيل الأدوية، والاستفادة الكاملة من التأثيرات العلاجية المجمعة لا تزال تمثل تحديات.

في هذه الدراسة، استخدمنا ثاني أكسيد المنغنيز المسامي المجوف )، الذي يتمتع بسطح محدد عالي واستجابة جيدة لبيئة الورم الدقيقة، كحامل. تم تعديله باستخدام بولي (هيدروكلوريد الأليل أمين) (PAH) لاستغلال خصائصه الكاتيونية لعكس شحنة ثاني أكسيد المنغنيز، وبالتالي التغلب على التنافر الكهروستاتيكي مع جزيئات ICG المشحونة سلبًا. بالإضافة إلى ذلك، تم إضافة أيونات فوسفات الهيدروجين لإنشاء تأثير تماسك الأيونات المضادة، مما يثبت حالة الشحنة السطحية للمادة، ويعزز مواقع الامتزاز، ويعزز بشكل كبير امتصاص وتغليف جزيئات ICG. مع هذا التصميم، تم بذل الجهود لتعزيز استقرار ICG واستخدام النشاط الشبيه بالقطط للحامل لتفكيك التركيزات العالية من في الأورام إلى ، مما يحسس تأثير العلاج الضوئي الديناميكي لمادة ICG تحت إشعاع الليزر. بالإضافة إلى ذلك، مع دمج العلاج الحراري، تم تعزيز الخصائص الكيميائية الديناميكية للحامل لزيادة الإجهاد التأكسدي. تم تمكين تغليف أسطح الجسيمات النانوية بأغشية خلايا هيلا لتحقيق التهرب المناعي واستهداف الأورام المتماثلة. تم بناء منصة متكاملة للجسيمات النانوية لتوحيد تأثيرات العلاج الضوئي الديناميكي/العلاج الحراري/العلاج الكيميائي الديناميكي وممارسة وظائف التصوير متعددة الأبعاد (المخطط 1).

أكد نموذج الفأر الحي أن يمارس تأثيرات علاجية مضادة للأورام مثالية تحت إشعاع NIR. توفر هذه المنصة النانوية المتكاملة المبسطة والفعالة من حيث التكلفة، والتي تستجيب لبيئة الورم، أساسًا للترجمة السريرية.

تيترايثيل أورثوسيليكات (TEOS)، PAH (الوزن الجزيئي ) برمنغنات البوتاسيوم، كربونات الصوديوم، والأمونيا تم شراء المواد من Innochem. تم شراء ICG من ARK Pharmaceuticals. تم شراء Hoechst 33,342، فلوريد الفينيل ميثيل سلفونيل (PMSF)، مجموعة عد الخلايا 8 (CCK8)، ومجموعات اختبار بروتين حمض البيكينكونينيك (BCA) من Biosharp. تم شراء مجموعات استخراج البروتين السيتوبلازمي وصبغات التلوين الحي من Beyotime Biotechnology. تم شراء جميع مواد زراعة الخلايا من Procell. تم تحضير الماء المزيل للأيونات باستخدام نظام Milli-Q (Millipore، الولايات المتحدة الأمريكية).

أولاً، صلب تم تخليق الجسيمات النانوية باستخدام طريقة تم الإبلاغ عنها سابقًا. تم غسلها ثلاث مرات بالماء والإيثانول ثم تم تخزينها في الماء حتى الاستخدام. لتخليق تم إضافة 10 مل من الماء الموزع بالتنقيط إلى الجسيمات النانوية، تلا ذلك معالجة بالموجات فوق الصوتية لمدة ساعة ثم التحريك طوال الليل في درجة حرارة الغرفة. الناتج تم غسلها ثلاث مرات بالماء منزوع الأيونات وتم الطرد المركزي عند ثم تم إذابته في حل في لمدة 12 ساعة للحصول على . لتحميل ICG، هذه الجسيمات النانوية تمت إضافتها إلى محلول يحتوي على 10 مل من PAH ، تليها التحريك لمدة ساعتين، ثم الطرد المركزي عند ، وغسل بالماء. محلول فوسفات ( ) تم إضافته إلى ما تم الحصول عليه الحل، يليه إضافة ICG في PB )، الخلط، والتحريك في الظلام لمدة ساعتين. ثم تم تحميل ICG في المحلول بواسطة الطرد المركزي في لمدة 10 دقائق. الناتج تم غسل الخليط ثلاث مرات بالماء منزوع الأيونات. للتحقيق بشكل أعمق في تأثيرات حالة التحميل على احتواء الدواء ومعدلات التحميل، استخدمنا ، و محاليل كحاملات. أضفنا محلول ICG مائي بنفس المحتوى مع التحريك تحت نفس الظروف بنسبة تغذية ثم تم جمع الطور العلوي وتدويره بالطرد المركزي. وفقًا لطريقة منحنى المعايرة المبلغ عنها، تم قياس محتوى ICG في السائل الطافي باستخدام مطياف الأشعة فوق البنفسجية/المرئية-الأشعة تحت الحمراء القريبة (UV/Vis-NIR) (UV-2600؛ شركة شيمادزو، اليابان) تحت ، و تم حساب سعة تحميل ICG (LC) وكفاءة الت encapsulation (EE) للجزيئات النانوية باستخدام المعادلات التالية:

للحصول على حويصلات غشاء خلايا هيلا، تم طرد خلايا سرطان عنق الرحم البشرية. تم جمع الرواسب النقية وإعادة تعليقها في محلول انحلال مفرط التخفيف يحتوي على مادة استخراج البروتينات الغشائية وPMSF. بعد ساعة من الحضانة في حمام ثلجي، تم نقل خلايا هيلا إلى جهاز خلط زجاجي لإجراء 40 تكسيرًا ميكانيكيًا، وتمت عملية الطرد المركزي للمزيج الناتج. تمت عملية الطرد المركزي للمستخلص الناتج مرة أخرى عند لمدة 30 دقيقة. تم جمع شظايا غشاء خلايا هيلا، وتجفيفها بالتجميد، وقياس كميتها، وتخزينها في تم إعادة تشتت هذه الشظايا (1 ملغ) في محلول ملحي معزز بالفوسفات (PBS)، تم صوته لمدة 10 ثوان، ثم تم ضغطه من خلال و غشاء بولي كربونات مسامي على الأقل 11 مرة باستخدام جهاز ضغط ليبوسوفاست (أفستين) للحصول على حويصلات غشاء خلايا هيلا. خليط ) أُضيفت إلى هذه الحويصلات ( )، تليها الخلط في حمام ثلجي، والتسونك لمدة 20 ثانية، والبثق من خلال
غشاء البولي كربونات خمس مرات على الأقل. ثم تم طرد الخليط مركزيًا ( ) وتم التخلص من السائل العلوي للحصول على M النهائية – صياغة @ICG.

تمت ملاحظة مورفولوجيا الجسيمات النانوية (NP) وحجمها وتوزيع العناصر تحت مجهر إلكتروني نافذ (TEM؛ Tecnai G2 F20؛ FEI، الولايات المتحدة الأمريكية). تم تحديد مساحة السطح وحجم المسام للمواد باستخدام جهاز ASAP2460 3.01 لقياس إيزوثرم امتصاص-إزالة النيتروجين (Micromeritics، الولايات المتحدة الأمريكية). تم تحديد تشتت الضوء الديناميكي (DLS) والجهود الزاوية للجسيمات باستخدام جهاز Zetasizer Nano ZS90 (Malvern). تم استخدام طيف الأشعة السينية للالكترونات (XPS) الذي تم جمعه باستخدام مجهر ESCALAB 250Xi (Thermo Scientific) لتحليل التركيب العنصري للجسيمات النانوية وتوزيعات التكافؤ. تم استخدام مطيافية الانبعاث الضوئي بالبلازما المقترنة بالحث (ICP-OES) لتحديد محتوى المنغنيز. تم الحصول على أطياف الفلورية باستخدام مطياف F-2700 (Hitachi، اليابان). تم قياس أطياف الامتصاص UV/Vis-NIR باستخدام مطياف UV-2600 (Shimadzu، اليابان).

أنواع ومحتويات بروتينات الغشاء في NPs، أغشية خلايا هيلا، وM-HMnO تمت دراسة الجسيمات النانوية بواسطة تقنية الفصل الكهربائي للهلام بولي أكريلاميد مع دودي سلفات الصوديوم (SDS-PAGE). تم استخراج البروتينات الكلية من أغشية الخلايا باستخدام محلول التحلل RIPA، وتم تحليلها بواسطة الفصل الكهربائي، وصبغها بصبغة كومانز الزرقاء. تم استخدام تقنية النقل الغربي لتحديد البروتينات السطحية في أغشية خلايا هيلا. خلايا هيلا، أغشية خلايا هيلا، وM-HMnO. تم تحلل جزيئات ICG باستخدام محلول RIPA المحتوي على PMSF في حمام ثلجي لمدة 30 دقيقة وتم قياس كميتها باستخدام مجموعة BCA. تم خلط هذه البروتينات المجمعة مع محلول زيادة العينة، وتم نزع طبيعتها عن طريق الغليان في الماء لمدة 10 دقائق، ثم تم إخضاعها لـ SDS-PAGE (Mini-Protean؛ Bio-Rad، الولايات المتحدة الأمريكية). ثم تم نقل الجل إلى غشاء فلوريد البولي فينيليدين، وتم إغلاقه بـ الحليب في حمام ثلجي لمدة حوالي ساعة، وتم حضنه طوال الليل عند مع جسم مضاد وحيد يحتوي على CD47 وCD44 وE-cadherin وgalactin-3، تلاه حضانة مع الجسم المضاد الثانوي المقابل. أخيرًا، تم ملاحظة إشارات البروتين باستخدام نظام تصوير الهلام (ChemiDoc XRS؛ Bio-Rad).

مائي م- حلول ( ، و ) أُضيفت إلى أنابيب الطرد المركزي وتم تعريضها للإشعاع لمدة 6 دقائق باستخدام كثافة الطاقة بالليزر، مع المراقبة في الوقت الحقيقي لتغيرات درجة الحرارة باستخدام كاميرا حرارية بالأشعة تحت الحمراء (FLIR Systems AB). تم تسجيل درجات الحرارة بواسطة التصوير المباشر باستخدام كاميرا حرارية بالأشعة تحت الحمراء في ، وبعد 5 دقائق من الإشعاع. بالإضافة إلى ذلك، تغييرات درجة الحرارة لـ محلول مائي ) مشعة بكثافات طاقة ليزر مختلفة ( ، و تمت دراسة ( ) باستخدام نفس الطريقة. للتحقيق في الاستقرار الضوئي الحراري لـ تم إجراء أربع دورات متتالية من التسخين والتبريد. المحلول المائي حل تم إشعاعه لمدة ، ) ثم سمح له بالتبريد بشكل طبيعي لمدة 11 دقيقة. وفقًا للتغيرات في درجة الحرارة التي حدثت خلال مرحلة التبريد، فإن كفاءته في تحويل الطاقة الضوئية الحرارية تم حسابه على النحو التالي:

أين هو معامل نقل الحرارة، هو المساحة السطحية للوعاء، هي أقصى درجة حرارة لـ M تعليق مائي هي درجة حرارة البيئة المحيطة، هو الطاقة الممتصة بواسطة المذيب، هو قوة الليزر للحادثة ( ) و هو امتصاص الـ M- تشتت مائي @ICG عند 808 نانومتر.

لاختبار السائل خارج الخلية قدرة الإنتاج على إشارة الفلورسنت المتناسبة [ ] (RDPP) ينفجر بواسطة تم فحصه. RDPP ( تم إضافة محلول الإيثانول إلى PBS الذي يحتوي على M-
، و تمت إضافتها إلى الأنظمة المعنية. في “، وبعد 12 دقيقة من التفاعل، تم نقل كل خليط إلى طبق فلوري للكشف عن شدة الفلورسنت لـ RDPP ( ).

لتحقيق الخصائص الضوئية الديناميكية لـ ، الـ تم الكشف عن المنتج في كل نظام تفاعل تحت إشعاع ليزر بطول موجي 808 نانومتر باستخدام حمض 9,10-أنثراسيندييل-بيس(ميثيلين)ديمالونيك (ABDA). تم توزيع العينات في 1 مل من PBS يحتوي على أبدًا. تحت ظروف ، و تم تطبيق إشعاع الليزر لـ ثم تم جمع السائل العلوي وتم الكشف عن التغيرات في قمم امتصاص ABDA باستخدام مطيافية الامتصاص UV/Vis-NIR.

لتقييم الانحلال والاستجابة للتوليد في بيئة الورم الدقيقة بواسطة NPs ( ) ، GSH ( ، و 10 مللي مول محلول عازل (25 مللي مولار)، و تم التفاعل تحت درجة حرارة ثابتة من لمدة 30 دقيقة. تم مراقبة التغيرات في امتصاصية MB عند 664 نانومتر لرصد المعدلات لـ الجيل تحت ظروف مختلفة. ثم، تم وضعه في محلول عازل (pH 6.0 أو 7.4) يحتوي على و لمدة 30 دقيقة، وتم تقييم تحلل MB لتحديد الإنتاج لـ من خلال تفاعل شبيه بفنتون بوساطة.

تشتت م- في بيئات بيولوجية محاكاة مختلفة مثل ، وحضانة في لمدد زمنية مختلفة. ثم، قم بتدوير المحلول في جهاز الطرد المركزي، واجمع 1 مل من السائل العلوي للتحليل بواسطة امتصاص UV/Vis-NIR عند 800 نانومتر، واستبدله بمخزن جديد.

تم شراء خلايا هيلا وخلايا اللوكيميا أحادية النواة الماوس (RAW264.7) من مركز شيانغيا للخلايا (تشانغشا، الصين). تم زراعة الخلايا في وسط إيجل المعدل (MEM) ووسط معهد روسويل بارك التذكاري 1640، على التوالي، مع إضافة مصل الجنين البقري و إضافة البنسلين-ستربتوميسين تحت في .

تم تلقيح خلايا HeLa أو RAW264.7 في أطباق كونفوكال الخلايا/طبق) وتم حضنها طوال الليل، تلاها إضافة أو لمدة 6 ساعات. قبل التجربة، تم غسل الجسيمات النانوية غير الممتصة ثلاث مرات بمحلول PBS، تم إضافة البارافورمالدهيد، وتم تخزين الخلطات في لمدة ساعة واحدة. تم شفط الفائض من البارافورمالدهيد ووضعه في صبغة هوكست لمدة 10 دقائق، تليها ثلاث غسلات وملاحظة تحت مجهر ليزر متداخل (LSM780NLO؛ زايس، أوبيركوخن، ألمانيا). تم إجراء قياس الفلورية باستخدام مقياس تدفق (LSRFortessa؛ BD، الولايات المتحدة الأمريكية) والطريقة الموضحة أعلاه.

تم اختبار السمية الخلوية والآثار العلاجية للمواد النانوية بواسطة اختبار CCK8. تم حضن خلايا هيلا في أطباق 96 بئرًا في لمدة 24 ساعة. ثم، وسط جديد يحتوي على نفس تدرجات التركيز لـ @ICG و تم إضافة @ICG إلى كل بئر تجريبي. بعد 6 ساعات من الحضانة، تم غسل الخلايا بلطف واستمرت الحضانة لمدة 12 ساعة. ثم، تم إدخال CCK 8 في كل بئر واستمرت الحضانة لمدة ساعة واحدة. تم تحديد حيوية الخلايا عن طريق قياس امتصاص الأشعة فوق البنفسجية والمرئية عند 450 نانومتر باستخدام قارئ الألواح الدقيقة (Unlimited M200 pro؛ تيكان، النمسا). للتحقق من التأثيرات العلاجية للمواد، تم زراعة الخلايا كما هو موضح أعلاه. ثم تم تزامنها مع M-HMnO2 @ ICG تحت ظروف المعالجة المسبقة لمدة 6 ساعات، تلتها إشعاع بالليزر.
) وحضانة لمدة 12 ساعة أخرى. أخيرًا، تم تقييم حيوية الخلايا باستخدام طريقة CCK8 وتم تقييم تأثيرات العلاج التآزري. استخدم تفاعل البوليميراز المتسلسل للكشف عن تأثيرات التأثير الضوئي الحراري للمواد النانوية على الالتهاب في البيئة الدقيقة. قم بزراعة خلايا هيلا وخلايا البلعمة RAW 264.7 بشكل منفصل في طبق 24 بئرًا بكثافات من و خلايا لكل بئر، على التوالي، وزرعها لمدة 24 ساعة. بعد ذلك، أضف تركيبات مختلفة إلى خلايا هيلا واحتفظ بها في الحضانة لمدة 6 ساعات، اغسل ثلاث مرات بمحلول PBS، ثم عالج خلايا هيلا باستخدام ليزر NIR بطول موجي 808 نانومتر عند كثافة لمدة 10 دقائق. اجمع السائل الطافي من خلايا HeLa واستخدمه لزراعة ماكروفاج RAW 264.7 لمدة 24 ساعة. ثم، اجمع خلايا RAW 264.7 الناتجة لاستخراج RNA الكلي، وقم بإجراء كشف RT-PCR باستخدام مجموعة qRT-PCR. تم تصميم تسلسلات البرايمر وفقًا للجدول S1.

تم تقييم السمية الخلوية في المجموعة الضابطة، NIR، ، و M-HMnO + مجموعات NIR باستخدام صبغة الكالسيفين-أسيتوكسي ميثيل إستر (AM)/يوديد البروبيديوم (PI). كل بئر من لوحة زراعة تحتوي على 24 بئرًا تم تلقيح الوسط بـ الخلايا. عندما وصلت كثافة الخلايا إلى حوالي ثم تم إضافة وسط جديد يحتوي على جزيئات نانوية مختلفة وتمت زراعة الخلايا معًا لمدة 6 ساعات. بعد ذلك، تم تعريض الخلايا للإشعاع. ثم تم الحضانة لمدة 12 ساعة. بعد ذلك، تم صبغها لمدة 30 دقيقة باستخدام مجموعة صبغ مزدوجة من الكالسيفين-AM / PI وتم تصويرها تحت ميكروسكوب فلوري. لت quantification الموت الخلوي، تم زراعة الخلايا ومعالجتها كما هو موضح أعلاه، ثم تم صبغها باستخدام مجموعة كشف الموت الخلوي من الأنكسين V-Alexa Fluor 647/PI وتم تحليلها بواسطة قياس التدفق الخلوي.

للتحقق من داخل الخلايا تم تلقيح خلايا هيلا أولاً في أطباق 24 بئرًا لمدة 24 ساعة، ثم تم تعايشها مع تمت معالجة RDPP لمدة 4 ساعات. بعد غسلها ثلاث مرات بمحلول PBS، تم تحضينها بوسط جديد يحتوي على م- أو لمدة 8 ساعات. داخل الخلايا تم تحديد المستويات بناءً على الفلورية استنادًا إلى إشارات RDPP ( ).

لتحديد تأثير المواد النانوية الناتجة على عامل الاستجابة لنقص الأكسجين – (HIF-1 تم تلقيح خلايا HeLa في أطباق 6 آبار بكثافة خلايا/بئر مع 2 مل من MEM لمدة 24 ساعة، ثم تم حضنها مع MEM intact يحتوي على M- ICG أو ICG لمدة 8 ساعات. بعد غسلتين بمحلول PBS، تم تحلل الخلايا وHIF-1 داخل الخلايا تم تحديد المستويات في الخلايا المعالجة بـ PBS واثنين من الجسيمات النانوية بواسطة تقنية الويسترن بلوت كما هو موضح في عملنا السابق.

لتحديد محتوى GSH داخل الخلايا، تم تلقيح خلايا HeLa في أطباق 6 آبار بكثافة الخلايا/بئر وتم حضنها لمدة 24 ساعة. بعد الحضانة مع PBS و M- أو بعد 6 ساعات، تمت إزالة الوسط وتم غسل الخلايا ثلاث مرات بمحلول PBS. ثم، محلول تحليل Triton-X-100 ) تم إضافة إلى الخلايا الم lysed. تم طرد المستحلب في جهاز الطرد المركزي بسرعة 6000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق، و تم خلط السائل العلوي مع حمض 5.5′-ثنائي (2-نيتروبنزوئيك) (0.5 مللي مولار)؛ تم قياس الامتصاص عند 410 نانومتر باستخدام قارئ الميكرو بلايت.

لتحليل ROS، تم تلقيح خلايا هيلا في أطباق 24 بئرًا بكثافة الخلايا/بئر لمدة 24 ساعة. ثم، العينات في المجموعة الضابطة، NIR، ، و M-HMnO تمت معالجة مجموعات العلاج NIR بالتزامن مع الجسيمات النانوية المعنية لمدة 6 ساعات. تم غسل الخلايا بمحلول PBS وصبغها بـ diacetyldichlorofluorescein (DCFHDA، ) في لمدة 30 دقيقة، ثم تم تعريضه لليزر (808 نانومتر، تم غسلها ثلاث مرات بمحلول PBS، وتمت ملاحظتها تحت المجهر الفلوري. بالإضافة إلى ذلك، تم تلقيح خلايا هيلا في أطباق 24 بئرًا، وتم الكشف عن إنتاج ROS في نفس مجموعات العلاج بواسطة قياس التدفق الخلوي.

تم الحصول على فئران BALB/c عارية (من 6 إلى 8 أسابيع، 18-20 جرام) من شركة هونان سيلالك لتجارب الحيوانات. تم الموافقة على جميع تجارب الحيوانات من قبل لجنة أخلاقيات الحيوانات المخبرية في جامعة جنوب الوسطى (رقم CSU-20230227) وتم تنفيذها وفقًا لقانون جمهورية الصين الشعبية بشأن استخدام الحيوانات المخبرية. تم جمع خلايا HeLa وتفريقها في PBS. ثم تم حقنه تحت الجلد في الجهة اليمنى
الإبطين للفئران لإنشاء نموذج يحمل ورمًا. عندما وصل حجم الورم إلى تم استخدام الفئران في التجارب.

تم الحصول على عينات دم من فئران BALB/c العارية الطبيعية وتم طردها مركزيًا تم غسل كريات الدم الحمراء المستخرجة عدة مرات حتى أصبح السائل العلوي صافياً، و تم تحضير تعليق كريات الدم الحمراء باستخدام PBS. هذا التعليق ( ) أُضيف إلى سلسلة من أحجام متساوية من M- عند تركيزات من ، و وتم الحضانة المشتركة في لمدة ساعتين. ثم تم الطرد المركزي عند ، و تم نقل السائل العلوي إلى كل بئر من آبار 96. تم قياس الامتصاص عند 540 نانومتر وتم حساب معدل الانحلال باستخدام الكثافة الضوئية (OD) والصيغة التالية: معدل الانحلال .

تم حقن الفئران الحاملة للأورام في الوريد الذيل بـ ICG و M- ICG بنفس التركيز ( ). في “، وبعد 72 ساعة من الحقن، تم تخدير الفئران بالغاز وتم إجراء تصوير الفلورسنت داخل الجسم باستخدام نظام تصوير الحيوانات الصغيرة (Ani View) للتصوير الفلوري الخارجي، تم تنفيذ جميع الفئران بعد 72 ساعة من الحقن، وتم تشريح الأورام والأعضاء الرئيسية (القلب، الكبد، الطحال، الرئتين، والكليتين) وغسلها بمحلول PBS، وفحصها باستخدام نظام التصوير الداخلي.

خصائص التصوير بالرنين المغناطيسي T1 في المختبر لـ M- تم فحص @ICG باستخدام جهاز تصوير بالرنين المغناطيسي بقوة 7.0 تسلا. تم أخذ عينات تحتوي على تركيزات مختلفة ( ، و 1.38 مللي مول تم تفريقها في PBS (pH 6.0 أو 7.4) و GSH (10 مللي مول) تمت الإضافة. تم الحصول على معدلات استرخاء T1 من خلال الكشف عن شدة إشارة T1 في كل مجموعة. بالنسبة لفحص الرنين المغناطيسي في الجسم الحي، M-HMnO ICG ( تم حقنه (عن طريق الوريد أو داخل الورم) في ورم هيلا فئران تحمل الورم. بالنسبة لنموذج الحقن داخل الورم، تم إجراء التصوير بالرنين المغناطيسي على الفئران التي لم يتم حقنها وعلى الفئران المعالجة بعد 30 دقيقة و1 ساعة من الحقن. بالنسبة لنموذج الحقن الوريدي، تم إجراء التصوير بالرنين المغناطيسي في منطقة الورم على الفئران التي لم يتم حقنها وعلى الفئران المعالجة بعد 24 ساعة من الحقن.

تم تقسيم الفئران الحاملة للأورام إلى ثلاث مجموعات تم تشريحها بعد 12 و24 و48 ساعة من الحقن لجمع أنسجة الورم. بعد ذلك، تم معالجة جميع أنسجة الورم بحمض النيتريك المركز وتسخينها حتى أصبحت المحلول واضحًا. تم تحديد محتوى المنغنيز في المحلول باستخدام مطياف الانبعاث الضوئي البلازمي المقترن بالحث (ICP-OES)، وتم حساب محتوى المنغنيز في أنسجة ورم الفئران المجمعة.

أو تركيز تم حقنه في الفئران الحاملة للأورام. بعد أربع وعشرين ساعة من الحقن، تم تخدير الفئران لإشعاع موقع الورم. ) وتصوير الأشعة تحت الحمراء (ONE PRO; FLIR). تم مراقبة تسخين موقع الورم.

ورم هيلا تم تقسيم فئران BALB-c العارية الحاملة للعوامل بشكل عشوائي إلى ست مجموعات علاجية كل منها): PBS، NIR، ICG + NIR، ، و M-HMnO تم حقن الأدوية النانوية عبر الوريد الذيل في اليومين 0 و 5 من دورة العلاج، وفقًا للنافذة الزمنية المحددة مسبقًا لأقصى تراكم للدواء. بعد أربع وعشرين ساعة من الحقن، تم تخدير جميع الحيوانات وإشعاعها (1.35 تمت مراقبة وتسجيل وزن الحيوانات وحجم الورم كل يومين خلال فترة العلاج.
بعد 14 يومًا، تم euthanize الفئران وجمع عينات تمثيلية من أنسجة الورم، وتم تصويرها ووزنها. تم صبغ أنسجة الورم والأعضاء الرئيسية للفئران من مجموعات العلاج المختلفة بصبغة الهيماتوكسيلين والإيوزين (H&E)، وتم صبغ أنسجة ورم الفئران بواسطة نقل الديوكسي نيوكليوتيديل الطرفي dUTP لتحديد موت الخلايا المبرمج (TUNEL). للكشف عن نقص الأكسجة في خلايا HeLa، تم صبغ أنسجة الورم من كل مجموعة علاج بمضاد HIF-1. الأجسام المضادة، تم غسلها بمحلول PBS لإزالة بقايا الجسم المضاد الأولي، ثم تم تحضينها مع الغلوبولين المناعي G المضاد للأرانب من الماعز في لمدة ساعة واحدة. ثم تم ملاحظة الفلورية، حيث تمثل الفلورية الخضراء المناطق المهيأة.

لفحص السلامة الحيوية لـ تم euthanizing الفئران التي خضعت لعلاجات مختلفة لمدة 14 يومًا، وتم جمع عينات الدم، وتم الحصول على عينات المصل عن طريق الطرد المركزي. تم إجراء اختبارات كيميائية حيوية لتحديد مستويات الأسبارتات أمينوترانسفيراز، الألانين أمينوترانسفيراز، البروتين الكلي، الألبومين، نيتروجين اليوريا في الدم، الكرياتينين، الكوليسترول الكلي، ومستويات الدهون الثلاثية.

تُعبر البيانات عن المتوسطات الانحرافات المعيارية. تم استخدام GraphPad Prism 8 لإجراء الحسابات الإحصائية والرسم البياني. تم استخدام تحليل التباين أحادي الاتجاه وثنائي الاتجاه لمقارنة البيانات من مجموعات العلاج المختلفة. تم اعتبار 0.05 دليلاً على الأهمية.

أولاً، يحدث تفاعل أكسدة-اختزال بين و ، مما أدى إلى تشكيل طبقة على سطح متوزع بشكل جيد (الشكل 1A)، وبالتالي إنشاء (الشكل 1B). ثم، باستخدام الخصائص القلوية القوية لـ كعامل نقش، يتم إذابة الغلاف الداخلي من السيليكون للتحضير أكدت ملاحظات TEM أن جميع الجسيمات النانوية المحضرة كانت لها هياكل كروية منتظمة وأحجام تبلغ حوالي 110 نانومتر. كان لديها هياكل مجوفة نموذجية (الشكل 1C). كشفت تحليل المسح العنصري عن انخفاض كبير في إشارات العنصر السيليكون في الـ هيكل بالنسبة إلى (الشكل S1)، مما يؤكد نجاح حفر قشور السيليكون. تم ملاحظة إشارات عنصر المنغنيز بشكل ملحوظ في الهيكل (الشكل S2)، مما يؤكد تخليق الـ الأصداف. أظهرت حسابات BET مساحة سطح محددة قدرها وحجم المسام المتوسط 4 نانومتر لـ (الشكل 1D)، متوافق مع نوع IV النموذجي من إيزوثيرم لانغموير ويشير إلى وجود هيكل مجوف كبير ووفرة من المسام المتوسطة لتسهيل امتصاص الأدوية وتحميلها.

بعد @ICG التركيب، أظهرت ملاحظات TEM تشويش هيكل الجسيمات النانوية المجوفة وتجمعات شبيهة بالعناقيد حول هيكل القشرة-النواة (الشكل 1E). أكدت صور رسم الخرائط العنصرية والطيفيات الطيفية المشتتة للطاقة بالأشعة السينية وجود وتوزيع مكاني لـ ، و S في @ICG (الشكل 1F)، مما يؤكد احتواء ICG بواسطة الفوسفات.

تحت ظروف تفاعل ثابتة، قمنا بدراسة تأثير التعديلات المختلفة على الحامل على سعة تحميل الدواء وكفاءة الت encapsulation لـ ICG. لاحظنا أنه، مقارنةً بالعناصر مع و كناقلين، تعاملت المجموعة مع حيث أظهر الحامل أقل مستوى من الأشعة فوق البنفسجية/المرئية-الأشعة تحت الحمراء القريبة في السائل الفائق (الشكل 1G). أشارت امتصاصية الأشعة فوق البنفسجية/المرئية-الأشعة تحت الحمراء القريبة للسائل الفائق إلى وجود ICG غير المغلف (حر). تم إجراء تحليل كمي من خلال فحص العلاقة الخطية بين القمة المميزة وتركيز ICG المذاب في PB (الشكل S3). وجدنا أن هذه المعدلات كانت أعلى بشكل ملحوظ لـ ( و ، على التوالي) من أجل ( و على التوالي” و و ، على التوالي؛ الشكل 1 H يرجع ذلك أساسًا إلى ارتفاع ألفة ICG لتأثير تجميع الأنيونات الناتج عن الفوسفات/PAH.

أظهرت ملاحظات TEM أن المغلف كانت أسطح NP @ICG تحتوي على طبقة دهنية واضحة بسمك حوالي 8.6 نانومتر (الشكل 1I). أظهرت قياسات DLS أن حجم NP قد زاد من 240 إلى 258 نانومتر بعد تغليف غشاء الخلية (الشكل 1J). تم التحقق من تخليق M-HMnO2 @ICG من خلال مراقبة جهد زيتا.

إمكانات @ICG تغير من +21 إلى -10 مللي فولت، مما يشير إلى حدوث انقلاب بالنسبة لـ القدرة التي نُسبت إلى تحميل ICG الناجح. تم تقليل شحنة M-HMnO 2 @ICG NP بشكل أكبر إلى -29 مللي فولت مقارنةً بتلك الخاصة بـ بعد تغليف الغشاء الخلوي، والذي قد يُعزى إلى شحنة سطح الغشاء الخلوي (الشكل 1K).

تم الكشف عن قمم الامتصاص بواسطة مطيافية الإلكترونات بالأشعة السينية (XPS) لـ ، و S في (الشكل 1L). أظهر طيف XPS عالي الدقة لـ Mn 2p قممًا عند 642.3 و 653.3 إلكترون فولت (الشكل S4) تتوافق مع طاقات الربط لـ و من على التوالي، يقع ذروة الأقمار الصناعية للمنغنيز (Mnsat) على بعد حوالي 3 إلكترون فولت أعلى في الطاقة من الذروة الرئيسية، مما يشير إلى وجود المنغنيز في حالة أكسدة أعلى.

طيف XPS عالي الدقة لـ S2p أظهر و قمم تتوافق مع طاقة الربط لمجموعة الحمض السلفوني (- ; الشكل S5)، مع قمم N و P المنسوبة إلى غشاء الخلية المغلف بطبقة ثنائية من الفوسفوليبيد ووجود ، على التوالي (الشكل S6 و S7). قمم طيف الامتصاص UV/Vis-NIR لـ M- ICG و كانت جزيئات ICG متوافقة مع تلك لـ NPs في و ICG في (الشكل 1M). بشكل خاص، قمم ICG المنزاحة نحو الأحمر لـ تم نسب @ICG إلى تحويل مونومرات ICG إلى تجمعات J من خلال الكيمياء غير التساهمية. قمم امتصاص ICG المميزة لـ M- كانت متوافقة مع تلك الخاصة بـ مما يشير إلى أن الجسيمات النانوية المحملة بـ ICG تحافظ على سلامتها الوظيفية بعد التداخل الفيزيائي والتغليف في غشاء الخلية.

سلامة البروتينات السطحية بعد تم فحص تغليف NP ICG بشكل أعمق. كانت حزم البروتين لـ M-HMnO2 @ICG NPs مشابهة تقريبًا لتلك الموجودة في أغشية خلايا HeLa؛ لم يتم الكشف عن أي حزمة بروتين لـ (الشكل 1N). تم الكشف عن عدة بروتينات علامة على أسطح خلايا هيلا، بما في ذلك جزيئات الالتصاق الخلوية المعتمدة بشكل كبير على نوع الأيزوتيب (مثل، جزيء الالتصاق الخلوي الظهاري، جاليكتين-3، CD44، وCD47). CD44، وهو بروتين سكري عبر الغشاء الخلوي مميز لخلايا الورم، يشارك في التصاق خلايا الورم غير المتجانسة. CD47، بروتين سكري عبر الغشاء يتم التعبير عنه وزيادة تنظيمه على نطاق واسع في خلايا الورم، يرتبط ببروتين تنظيم الإشارة- على أسطح البلعميات وتقوم بإرسال إشارات لتثبيط بلعمة البلعميات، مما يلعب دورًا مهمًا في الهروب المناعي. تم الحفاظ على هذه البروتينات على أسطح خلايا هيلا، أغشيتها، وM- @ICG NPs، مما يشير إلى أن تحضير NP عن طريق التداخل المشترك لم يؤثر على وجودها (الشكل 1O). أكدت تقنية الويسترن بلوت أن هذه البروتينات المرتبطة بالاستهداف المتجانس والتحمل المناعي قد تم نقلها من أغشية الخلايا إلى أسطح NP، مما يوفر الأساس لعمل NPs.

بينما أظهر ICG المحمّل على M-HMnO2 @ICG امتصاصًا كبيرًا في منطقة الطيف NIR، مما يشير إلى أن هذه الجسيمات النانوية كانت لها خاصية كعامل فوتوحراري، قمنا بدراسة خصائصها الفوتوحرارية في المختبر بشكل منهجي. درجات حرارة التحويل الفوتوحرارية لـ أظهرت المحاليل ذات التركيزات المختلفة تحت إشعاع NIR لمدة 6 دقائق اعتمادًا واضحًا على التركيز؛ درجة حرارة تم تحقيقه بتركيز بالنسبة إلى للماء (التحكم؛ الشكل 2A). تم أيضًا دراسة العلاقة بين التسخين وقوة الليزر. كانت درجة حرارة زادت الإشعاعات تحت 6 دقائق مع كثافة طاقة الليزر (الشكل 2B)، مما يشير إلى أن هذه الجسيمات النانوية حولت فعليًا طاقة الليزر عند 808 نانومتر إلى طاقة حرارية. قمنا أيضًا بالتحقيق في استقرار الفوتوحرارة وكفاءة التحويل لـ M-HMnO. @ICG. في تجربة الإشعاع بدورة التشغيل/الإيقاف (808 نانومتر)، لم يُظهر أي تراجع واضح في درجة الحرارة بعد أربع دورات، مما يدل على استقرار حراري ضوئي جيد (الشكل 2C). كفاءة التحويل الحراري الضوئي هي الكفاءة التي يقوم بها عامل التحويل الحراري الضوئي بتحويل الطاقة الممتصة من الضوء القريب من الأشعة تحت الحمراء إلى طاقة حرارية، وهي معلمة رئيسية لتقييم أداء عوامل التحويل الحراري الضوئي. كفاءة التحويل الحراري الضوئي لـ الحل، الذي تم حسابه من خلال ملاءمة منحنى تغير درجة الحرارة مع مرور الوقت أثناء التبريد، كان (الشكل 2D). تم استخدام كاميرا حرارية بالأشعة تحت الحمراء أيضًا للحصول على صور فوتوحرارية لـ M- @ICG حلول بتركيزات مختلفة. تغير لون المحلول من الأصفر الفاتح إلى الأحمر الفاتح مع زيادة التركيز ومدة الإشعاع (الشكل 2E)، مما يؤكد كفاءة تحويل التحضير للحرارة الضوئية.