DOI: https://doi.org/10.1021/cbmi.5c00225
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/40894653
تاريخ النشر: 2026-04-15
المؤلف: Lorenzo Scipioni وآخرون
الموضوع الرئيسي: تقنيات المجهر الفلوري المتقدمة
نظرة عامة
تقدم البحث حزمة تصوير مبتكرة تهدف إلى تعزيز الوصول إلى المجهر الضوئي البيولومينسنت والفلوريسنت. تتكون هذه المنصة من ثلاثة مكونات رئيسية: PhasorViewer، الذي يسهل تصميم التجارب واختيار المجسات المثلى؛ PhasorScope، وهو إطار عمل مفتوح المصدر يقوم بتحديث المجاهر التقليدية؛ وPhasorAnalysis، وهو خط تحليل سهل الاستخدام لقياس بيانات تصوير الفازور. يتم إثبات فائدة هذه المنصة من خلال قدرتها على التصوير المتعدد والمتزامن للفلوريسنت والبيولومينسنت باستخدام أجهزة استشعار ضوئية متاحة بسهولة.
يسلط البحث الضوء على قيود المجهر الفلوري التقليدي، وخاصة القضايا المتعلقة بالتفتيح الضوئي والسمية الضوئية، التي تعيق ملاحظة العمليات الديناميكية على مستوى الخلية الواحدة. بالمقابل، تقدم المنصات البيولومينسنت حلاً من خلال استخدام مجموعة متنوعة من اللوسيفيراز، على الرغم من أن طيفها الواسع والمتداخل يعقد الدراسات متعددة المكونات. تعالج تقنية الفازور البيولومينسنت هذه التحديات من خلال تحويل التوقيعات الطيفية إلى إحداثيات فازور عالية الدقة، مما يمكّن من الاحتفاظ بمزيد من الفوتونات مقارنة بكاميرات RGB التقليدية. على الرغم من العروض السابقة لفعاليتها في التصوير متعدد الألوان وتصميم المستشعرات الحيوية، واجه النظام البيولومينسنت الفازوري الأول عقبات مثل المعايرة المعقدة ونقص أدوات التحليل سهلة الاستخدام، والتي تهدف هذه المنصة الجديدة إلى التغلب عليها.
طرق
في هذا القسم، يصف المؤلفون المواد والأساليب المستخدمة لتجارب زراعة الخلايا والتحويل. تم زراعة خطوط الخلايا البشرية HEK293 وMDA-MB-231 وHeLa وA549، بالإضافة إلى خلايا مهندسة تعبر عن مجسات مختلفة، في وسط DMEM كامل مدعوم بـ 10% من مصل العجل الجنيني، والجلوكوز، وL-glutamine، والبنسلين، والستربتوميسين. من أجل التحويل المؤقت، تم زرع خلايا HEK293 بكثافة 5×10^5 في أطباق 6 آبار وتم تحويلها بعد 24-48 ساعة عندما وصلت إلى 75-80% من التقاء الخلايا. تم إجراء التحويل باستخدام Lipofectamine 3000 مع إما luc2-IRES-eGFP أو Staygold-MS2-3-PP7 كطعم RNA.
بعد التحويل، تم حضانة الخلايا عند 37 درجة مئوية في بيئة رطبة تحتوي على 5% CO2 وتم التلاعب بها بعد 24-48 ساعة من التحويل. تم الحفاظ على الخلايا من خلال تمريرها بشكل متسلسل باستخدام التربسين. تؤسس هذه المنهجية إطار عمل قوي للتحقيق في استجابات الخلايا وتفاعلاتها في سياق الدراسة.
مناقشة
في هذا القسم، يوضح المؤلفون المنهجية المستخدمة لإنشاء وتصوير التركيبات اللينتيفيروسية التي تحتوي على بلازميدات تقارير مع علامة FLAG، تحديدًا YeNL وLumiScarlet، في خلايا Lenti X-293T. شمل عملية التحويل تحويل البلازميدات مع غلاف VSV-G وبلازميدات المساعد d8.2 gag/pol باستخدام بولي إيثيلين أمين (PEI) كعامل تحويل. بعد التحويل، تم جمع الجسيمات الفيروسية، وتركيزها عبر الطرد المركزي الفائق، واستخدامها لاحقًا لنقل خطوط الخلايا المستهدفة (MDA-MB-231 وA549). تم تصوير هذه الخلايا باستخدام كاميرات عالية الحساسية، تلتقط كل من إشارات الفلورسنت والبيولومينسنت.
بالإضافة إلى ذلك، يصف المؤلفون إنشاء خطوط خلايا مستقرة تعبر عن تركيبات لوسيفيراز مختلفة من خلال النقل اللينتيفيروسي، مع تسليط الضوء على استخدام وسائط محددة للتحريض الفيروسي والاختيار. شملت بروتوكولات التصوير أساليب متعددة النماذج، مدمجة الفلورسنت والبيولومينسنت وتصوير المجال الساطع لتحليل استجابات الخلايا وتحديد مواقع الأصباغ الخاصة بالعضيات. استخدمت معالجة البيانات كود PhasorAnalysis لقياس الإشارات وتصنيف الخلايا بناءً على مجساتها البيولومينسنت، مما يمكّن من تحليل شامل للديناميات الخلوية في سياق الدراسة.
DOI: https://doi.org/10.1021/cbmi.5c00225
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/40894653
Publication Date: 2026-04-15
Author(s): Lorenzo Scipioni et al.
Primary Topic: Advanced Fluorescence Microscopy Techniques
Overview
The research presents an innovative imaging package aimed at enhancing accessibility to bioluminescence and fluorescence microscopy. This platform consists of three main components: PhasorViewer, which facilitates experiment design and optimal probe selection; PhasorScope, an open-source framework that upgrades conventional microscopes; and PhasorAnalysis, a user-friendly analysis pipeline for quantifying phasor imaging data. The utility of this platform is demonstrated through its capability for multiplexed, simultaneous imaging of fluorescence and bioluminescence using readily available optical reporters.
The paper highlights the limitations of traditional fluorescence microscopy, particularly issues related to photobleaching and phototoxicity, which hinder the observation of dynamic processes at the single-cell level. In contrast, bioluminescent platforms offer a solution by utilizing a variety of luciferases, although their broad and overlapping spectra complicate multi-component studies. The introduction of bioluminescent phasor technology addresses these challenges by transforming spectral signatures into high-resolution phasor coordinates, enabling the retention of more photons compared to conventional RGB cameras. Despite previous demonstrations of its effectiveness for multicolor imaging and biosensor design, the initial bioluminescent phasor system faced hurdles such as complex calibration and a lack of user-friendly analysis tools, which this new platform aims to overcome.
Methods
In this section, the authors describe the materials and methods utilized for cell culture and transfection experiments. Human cell lines HEK293, MDA-MB-231, HeLa, and A549, along with engineered cells expressing various reporters, were cultured in complete DMEM media supplemented with 10% fetal bovine serum, glucose, L-glutamine, penicillin, and streptomycin. For transient transfection, HEK293 cells were plated at a density of 5×10^5 in 6-well dishes and transfected 24-48 hours later when they reached 75-80% confluence. The transfection was carried out using Lipofectamine 3000 with either luc2-IRES-eGFP or Staygold-MS2-3-PP7 as the RNA bait.
Following transfection, cells were incubated at 37 °C in a 5% CO2 humidified environment and were manipulated 24-48 hours post-transfection. The cells were maintained through serial passaging using trypsin. This methodology establishes a robust framework for investigating cellular responses and interactions in the context of the study.
Discussion
In this section, the authors detail the methodology for generating and imaging lentiviral constructs containing FLAG-tagged reporter plasmids, specifically YeNL and LumiScarlet, in Lenti X-293T cells. The transfection process involved co-transfecting plasmids with the VSV-G envelope and d8.2 gag/pol helper plasmids using polyethyleneimine (PEI) as a transfection reagent. Following transfection, viral particles were harvested, concentrated via ultracentrifugation, and subsequently used to transduce target cell lines (MDA-MB-231 and A549). Imaging of these cells was performed using high-sensitivity cameras, capturing both fluorescence and bioluminescence signals.
Additionally, the authors describe the generation of stable cell lines expressing various luciferase constructs through lentiviral transduction, highlighting the use of specific media for viral induction and selection. The imaging protocols included multimodal approaches, integrating fluorescence, bioluminescence, and brightfield imaging to analyze cellular responses and localization of organelle-specific dyes. The data processing utilized PhasorAnalysis code for quantifying the signals and classifying cells based on their bioluminescent reporters, thereby enabling a comprehensive analysis of cellular dynamics in the context of the study.