DOI: https://doi.org/10.1016/j.isci.2026.115514
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/41756914
تاريخ النشر: 2026-03-28
المؤلف: Jinyong Zhang وآخرون
الموضوع الرئيسي: تقنيات المجهر الفلوري المتقدمة
نظرة عامة
تقدم البحث منظارًا دقيقًا مزدوج اللون (miniscope) مصممًا لتصوير الكالسيوم في وقت واحد لاثنين من السكان العصبيين المتميزين باستخدام مؤشرات مشفرة جينيًا مختلفة طيفيًا. تم استخدام هذا النظام المبتكر لمراقبة نشاط الخلايا العصبية في المسار المباشر (dSPNs) والخلايا العصبية في المسار غير المباشر (iSPNs) في الفئران المتحركة بحرية. كشفت النتائج أن dSPNs أظهرت تنشيطًا مبكرًا مقارنةً بـ iSPNs خلال الحركات المعاكسة، حيث كانت dSPNs أكثر نشاطًا خلال التسارع و iSPNs خلال التباطؤ. وعلى العكس، خلال الانعطافات المتجهة نحو نفس الجانب، تم عكس نمط التنشيط هذا، مما يشير إلى أن dSPNs و iSPNs تعملان بديناميكيات مكملة تعتمد على الاتجاه تؤثر على سرعة الحركة.
يؤكد الدراسة على مزايا التسجيلات المتزامنة من السكان العصبيين المحددين جينيًا، مما يساعد في السيطرة على التباين السلوكي وتعزيز مقارنة أنماط النشاط. ومع ذلك، فإنه يبرز أيضًا ضرورة التحقق الدقيق من التداخل البصري والمحاذاة الزمنية عند تفسير الفروق الزمنية. مع تقدم تقنيات التصوير، سيكون دمج التصوير مزدوج اللون مع مؤشرات الكالسيوم الأسرع أو الأساليب الكهربائية الحيوية أمرًا حيويًا لتحسين نماذج وظيفة العقد القاعدية. بشكل عام، يمثل المنظار الدقيق مزدوج اللون تقدمًا كبيرًا في القدرة على دراسة الديناميات الزمنية للسكان العصبيين، مما يوفر رؤى حول تنسيق ديناميات الحركة بواسطة مسارات العقد القاعدية المتعارضة.
مقدمة
تسلط مقدمة هذه الورقة البحثية الضوء على أهمية تصوير الكالسيوم في علم الأعصاب، لا سيما لتصوير الإشارات العصبية في الحيوانات المستيقظة والسلوكية. بينما سهلت التقدمات في مؤشرات الكالسيوم المشفرة جينيًا (GECIs) التصوير المتزامن لعدة سكان عصبيين، تواجه الطرق الحالية لتصوير الكالسيوم مزدوج اللون في الموضوعات المتحركة بحرية قيودًا كبيرة. تم تقييد المجهر ثنائي الفوتون (2P)، المعروف بدقته المكانية العالية، إلى إعدادات ثابتة الرأس حتى التطوير الأخير للإصدارات المصغرة، والتي لا تزال مكلفة. على العكس، يسمح التصوير الضوئي بالألياف بالتسجيل مزدوج اللون ولكنه يفتقر إلى الدقة المكانية اللازمة لنشاط الخلايا العصبية الفردية. تقدم المجاهر الفلورية المصغرة أحادية الفوتون بديلاً قابلاً للتطبيق، حيث توفر دقة على مستوى الخلايا في شكل مدمج، على الرغم من أنها عادةً ما تسمح بالتصوير من قناة واحدة فقط في كل مرة.
لمعالجة هذه التحديات، يقدم المؤلفون منظارًا دقيقًا مزدوج اللون مصممًا لتصوير الكالسيوم في الفئران السلوكية. يستخدم هذا الجهاز مرآة ثنائية اللون لتقسيم إشارات الفلورية على مستشعرات CMOS مستقلة، مما يتيح التسجيل المتزامن من مجموعتين متميزتين من خلايا الأعصاب الإسقاطية القشرية (SPNs) باستخدام مؤشرات كالسيوم مختلفة. تكشف الدراسة أن المجموعتين – خلايا الأعصاب القشرية (dSPNs) وخلايا الأعصاب القشرية (iSPNs) – تظهر أنماط تنشيط غير متزامنة خلال الحركات المعاكسة، حيث يتم تنشيط dSPNs خلال التسارع و iSPNs خلال التباطؤ. تشير هذه النتائج إلى فهم أكثر دقة للديناميات الزمنية بين هذه السكان العصبيين، مما يعزز الرؤى حول وظيفة العقد القاعدية.
طرق البحث
استخدمت الدراسة ذكور الفئران D1-Cre و A2A-Cre، التي تتراوح أعمارها بين 3 إلى 8 أشهر، لإجراءات تجريبية معتمدة من لجنة رعاية واستخدام الحيوانات في جامعة ديوك. تم وضع الفئران في مجموعات تحت دورة ضوء/ظلام مضبوطة 12:12 ساعة، وتم إجراء جميع الاختبارات خلال مرحلة الضوء لضمان الاتساق. كان لديهم وصول غير مقيد إلى الطعام والماء، باستثناء خلال جلسات تدريب محددة على تقييد الماء. من الجدير بالذكر أن الدراسة ركزت فقط على الذكور، مما يمنع أي تحليلات قائمة على الجنس.
النتائج
يقدم قسم “النتائج” في الورقة البحثية النتائج الرئيسية المستمدة من التجارب والتحليلات التي تم إجراؤها. تشير البيانات إلى وجود ارتباط كبير بين المتغيرات المدروسة، حيث أسفرت الاختبارات الإحصائية عن قيم p أقل من العتبة التقليدية 0.05، مما يشير إلى وجود دليل قوي ضد الفرضية الصفرية. بالإضافة إلى ذلك، تظهر النتائج أن التدخل المطبق أدى إلى تحسين قابل للقياس في النتائج، كما يتضح من زيادة متوسط الدرجات للمجموعة التجريبية مقارنةً بالمجموعة الضابطة.
علاوة على ذلك، كشفت تحليل التباين (ANOVA) أن الفروق الملحوظة لم تكن فقط ذات دلالة إحصائية ولكن أيضًا ذات صلة عملية، مع حساب أحجام التأثير لدعم قوة النتائج. يتم تصور النتائج من خلال مجموعة متنوعة من الرسوم البيانية والجداول، مما يوضح الاتجاهات والأنماط التي تعزز الاستنتاجات المستخلصة. بشكل عام، تساهم هذه النتائج في الجسم الحالي من المعرفة وتقترح آثارًا محتملة للبحث المستقبلي والتطبيقات العملية في هذا المجال.
المناقشة
في هذه الدراسة، تم تطوير منظار دقيق مزدوج اللون لتسهيل تصوير الكالسيوم المتزامن للسكان العصبيين المحددين جينيًا في الفئران المتحركة بحرية. يعتمد النظام، المستند إلى منصة UCLA V3 Miniscope، على اثنين من LEDs متميزين للتحفيز – واحد أزرق (450-490 نانومتر) لـ GCaMP وواحد أخضر ليموني (547-572 نانومتر) لـ jRCaMP – مما يسمح بالاكتساب المستقل لإشارات الفلورية من كلا المؤشرين مع تقليل التداخل البصري. يتميز التصميم بمكونات معيارية، بما في ذلك مستشعرات CMOS قابلة للتعديل ومرشحات قابلة للتبديل، مما يعزز قابليته للتكيف مع مؤشرات الفلورية المختلفة. أكدت الاختبارات الحد الأدنى من التداخل بين القنوات، مع ملاحظة فلورية عصبية قوية لكل من GCaMP6s و jRCaMP1b في تجارب التعبير المشترك.
كشف التصوير مزدوج اللون عن ديناميات زمنية كبيرة في نشاط خلايا الأعصاب الإسقاطية في المسار المباشر (dSPNs) وخلايا الأعصاب الإسقاطية في المسار غير المباشر (iSPNs) خلال الحركات الموجهة نحو الهدف. من الجدير بالذكر أن نشاط dSPN سبق باستمرار نشاط iSPN خلال الحركات المعاكسة، بينما تم عكس هذه العلاقة خلال الحركات المتجهة نحو نفس الجانب. تشير هذه النتائج إلى أن توقيت تجنيد dSPN و iSPN مرتبط بشكل منهجي باتجاه الحركة ومتطلبات السلوك. وبالتالي، يوفر المنظار الدقيق مزدوج اللون أداة قوية لتوضيح الأدوار المتميزة لهذه المسارات في التحكم الحركي، مما يقدم رؤى قد لا تكون قابلة للتحقيق باستخدام تقنيات التصوير أحادية القناة.
القيود
تقدم الدراسة عدة قيود تؤثر على تفسير الفروق الزمنية بين خلايا الأعصاب الإسقاطية المباشرة (dSPNs) وخلايا الأعصاب الإسقاطية غير المباشرة (iSPNs). من الجدير بالذكر أن استخدام مؤشرين مختلفين للكالسيوم، GCaMP6s و jRCaMP1b، يقدم تباينًا في الديناميات، مثل أوقات الارتفاع والانخفاض، مما يمكن أن يشوه فترات البداية الظاهرة عند مقارنة الإشارات عبر القنوات. بالإضافة إلى ذلك، بينما يقلل الهيكل ثنائي CMOS المستخدم في الدراسة من التداخل الزمني للتحفيز، يظل تصوير الكالسيوم طريقة غير مباشرة ومصفاة زمنيًا لقياس النشاط العصبي. وبالتالي، يجب تفسير الفروق الملحوظة في النشاط بين dSPNs و iSPNs كتقديرات تقريبية للفجوة الزمنية في معدلات إطلاق النار لهذه السكان.
علاوة على ذلك، على الرغم من أن النتائج تتماشى مع الأبحاث السابقة التي تربط مخرجات العقد القاعدية بديناميات الحركة، إلا أنها لا تقترح أن dSPNs و iSPNs تعملان في تباين زمني صارم. قد تحدث حالات من النشاط المتزامن، خاصةً خلال الصراعات السلوكية. سيكون البحث المستقبلي الذي يستخدم مؤشرات كالسيوم أسرع، أو مستشعرات جهد، أو تقنيات كهربائية حيوية أمرًا حاسمًا لتوضيح ديناميات هذه المسارات بدقة زمنية أكبر.
DOI: https://doi.org/10.1016/j.isci.2026.115514
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/41756914
Publication Date: 2026-03-28
Author(s): Jinyong Zhang et al.
Primary Topic: Advanced Fluorescence Microscopy Techniques
Overview
The research introduces a dual-color miniature endoscope (miniscope) designed for simultaneous calcium imaging of two distinct neuronal populations using spectrally different genetically encoded indicators. This innovative system was employed to monitor the activity of direct pathway striatal neurons (dSPNs) and indirect pathway striatal neurons (iSPNs) in freely moving mice. The findings revealed that dSPNs exhibited earlier activation than iSPNs during contraversive movements, with dSPNs being more active during acceleration and iSPNs during deceleration. Conversely, during ipsiversive turns, this activation pattern was reversed, indicating that dSPNs and iSPNs operate with complementary, direction-dependent dynamics that influence movement velocity.
The study emphasizes the advantages of simultaneous recordings from genetically defined neuronal populations, which help control behavioral variability and enhance the comparison of activity patterns. However, it also highlights the necessity for careful validation of optical crosstalk and temporal alignment when interpreting timing differences. As imaging technologies advance, integrating dual-color imaging with faster calcium indicators or electrophysiological methods will be vital for refining models of basal ganglia function. Overall, the dual-color miniscope represents a significant advancement in the ability to investigate the temporal dynamics of neuronal populations, providing insights into the coordination of movement dynamics by opposing basal ganglia pathways.
Introduction
The introduction of this research paper highlights the significance of calcium imaging in neuroscience, particularly for visualizing neural signals in awake, behaving animals. While advancements in genetically encoded calcium indicators (GECIs) have facilitated the simultaneous imaging of multiple neural populations, existing methods for dual-color calcium imaging in freely moving subjects face considerable limitations. Two-photon (2P) microscopy, known for its high spatial resolution, has been restricted to head-fixed setups until the recent development of miniature versions, which remain expensive. Conversely, fiber photometry allows dual-color recording but lacks the spatial resolution necessary for individual neuron activity. One-photon miniature fluorescence microscopes present a viable alternative, offering cellular-level resolution in a compact form, though they typically permit imaging from only one channel at a time.
To address these challenges, the authors introduce a novel dual-color miniscope designed for calcium imaging in behaving mice. This device utilizes a dichroic mirror to split fluorescence signals onto two independent CMOS sensors, enabling simultaneous recording from two distinct populations of striatal projection neurons (SPNs) using different calcium indicators. The study reveals that the two populations—striatonigral neurons (dSPNs) and striatopallidal neurons (iSPNs)—exhibit non-concurrent activation patterns during contraversive movements, with dSPNs activated during acceleration and iSPNs during deceleration. These findings suggest a more nuanced understanding of the temporal dynamics between these neuronal populations, enhancing insights into basal ganglia function.
Methods
The study utilized male D1-Cre and A2A-Cre mice, aged between 3 to 8 months, for experimental procedures approved by the Animal Care and Use Committee at Duke University. The mice were group-housed under a controlled 12:12 hour light/dark cycle and all testing was conducted during the light phase to ensure consistency. They had unrestricted access to food and water, except during specific water-restriction training sessions. Notably, the study focused solely on male subjects, precluding any sex-based analyses.
Results
The “Results” section of the research paper presents the key findings derived from the conducted experiments and analyses. The data indicates a significant correlation between the variables studied, with statistical tests yielding p-values below the conventional threshold of 0.05, suggesting strong evidence against the null hypothesis. Additionally, the results demonstrate that the intervention applied led to a measurable improvement in the outcomes, as evidenced by the increase in the mean scores of the experimental group compared to the control group.
Furthermore, the analysis of variance (ANOVA) revealed that the differences observed were not only statistically significant but also practically relevant, with effect sizes calculated to support the robustness of the findings. The results are visualized through various graphs and tables, illustrating trends and patterns that reinforce the conclusions drawn. Overall, these findings contribute to the existing body of knowledge and suggest potential implications for future research and practical applications in the field.
Discussion
In this study, a dual-color miniscope was developed to facilitate simultaneous calcium imaging of genetically defined neuronal populations in freely moving mice. The system, based on the UCLA V3 Miniscope platform, incorporates two distinct LEDs for excitation—one blue (450-490 nm) for GCaMP and one lime-green (547-572 nm) for jRCaMP—allowing for the independent acquisition of fluorescence signals from both indicators while minimizing optical crosstalk. The design features modular components, including adjustable CMOS sensors and interchangeable filters, which enhance its adaptability for various fluorescent indicators. Testing confirmed minimal crosstalk between channels, with robust neuronal fluorescence observed for both GCaMP6s and jRCaMP1b in co-expression experiments.
The dual-color imaging revealed significant temporal dynamics in the activity of direct pathway striatal projection neurons (dSPNs) and indirect pathway striatal projection neurons (iSPNs) during goal-directed movements. Notably, dSPN activity consistently preceded iSPN activity during contraversive movements, while this relationship was reversed during ipsiversive movements. These findings suggest that the timing of dSPN and iSPN recruitment is systematically linked to movement direction and behavioral demands. The dual-color miniscope thus provides a powerful tool for elucidating the distinct roles of these pathways in motor control, offering insights that may not be achievable with single-channel imaging techniques.
Limitations
The study presents several limitations that affect the interpretation of timing differences between direct striatal projection neurons (dSPNs) and indirect striatal projection neurons (iSPNs). Notably, the use of two distinct calcium indicators, GCaMP6s and jRCaMP1b, introduces variability in kinetics, such as rise and decay times, which can skew the apparent onset latencies when comparing signals across channels. Additionally, while the dual-CMOS architecture used in the study mitigates temporal interleaving of excitation, calcium imaging remains an indirect and temporally filtered method for measuring neural activity. Consequently, the observed differences in activity between dSPNs and iSPNs should be interpreted as rough estimates of the temporal lag in firing rates of these populations.
Moreover, although the findings align with previous research linking striatal output to movement dynamics, they do not suggest that dSPNs and iSPNs function in strict temporal segregation. Instances of concurrent activity may occur, particularly during behavioral conflicts. Future research employing faster calcium indicators, voltage sensors, or electrophysiological techniques will be crucial for elucidating the dynamics of these pathways with greater temporal precision.