نتائج العلاج بالبكتيريوفاج المخصص لـ 100 حالة متتالية: دراسة رصدية استعادية متعددة المراكز ومتعددة الجنسيات Personalized bacteriophage therapy outcomes for 100 consecutive cases: a multicentre, multinational, retrospective observational study

المجلة: Nature Microbiology، المجلد: 9، العدد: 6
DOI: https://doi.org/10.1038/s41564-024-01705-x
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38834776
تاريخ النشر: 2024-06-04

نتائج العلاج بالبكتيريوفاج المخصص لـ 100 حالة متتالية: دراسة رصدية استعادية متعددة المراكز ومتعددة الجنسيات

تاريخ الاستلام: 10 سبتمبر 2023
تاريخ القبول: 19 أبريل 2024
تاريخ النشر على الإنترنت: 4 يونيو 2024
(أ) تحقق من التحديثات
تظهر قائمة المؤلفين وانتماءاتهم في نهاية الورقة
على عكس العديد من التقارير عن حالات ناجحة في العالم الحقيقي للعلاج بالبكتريوفاج المخصص (BT)، لم تنتج التجارب السريرية العشوائية للمنتجات غير المخصصة من البكتريوفاج النتائج المتوقعة. هنا نقدم نتائج تحليل رصدية بأثر رجعي لأولى 100 حالة متتالية من BT المخصص للعدوى الصعبة العلاج التي تم تسهيلها بواسطة اتحاد بلجيكي في 35 مستشفى، 29 مدينة و12 دولة خلال الفترة من 1 يناير 2008 إلى 30 أبريل 2022. قمنا بتقييم مدى تكرار إنتاج BT المخصص لنتيجة سريرية إيجابية (الفعالية العامة) وأجرينا تحليل انحدار لتحديد العلاقات الوظيفية. كانت المؤشرات الأكثر شيوعًا هي التهابات الجهاز التنفسي السفلي، الجلد والأنسجة الرخوة، والتهابات العظام، وشملت تركيبات من 26 بكتريوفاج و6 كوكتيلات بكتريوفاج محددة، تم اختيارها بشكل فردي وأحيانًا تم تكييفها مسبقًا لاستهداف مسببات الأمراض البكتيرية. تم الإبلاغ عن تحسن سريري واستئصال البكتيريا المستهدفة لـ و من العدوى، على التوالي. في مجموعة بياناتنا المكونة من 100 حالة، كان الاستئصال أقل احتمالًا عندما لم يتم استخدام مضادات حيوية مصاحبة (نسبة الأرجحية ; فترة الثقة ). تم توثيق اختيار مقاومة البكتريوفاج في الجسم الحي وتآزر البكتريوفاج والمضادات الحيوية في 43.8% (7/16 مريض) و90% (9/10) من المرضى الذين تم تقييمهم، على التوالي. لاحظنا مزيجًا من إعادة حساسية المضادات الحيوية وتقليل الفوعة في عزلات البكتيريا المقاومة للبكتريوفاج التي ظهرت خلال BT. تم ملاحظة تحييد المناعة للبكتريوفاج في 38.5% (5/13) من المرضى الذين تم فحصهم. تم الإبلاغ عن خمسة عشر حدثًا سلبيًا، بما في ذلك سبعة ردود فعل سلبية غير خطيرة يشتبه في ارتباطها بـ BT. بينما يقتصر تحليلنا على الطبيعة غير المنضبطة لهذه البيانات، فإنه يشير إلى أن BT يمكن أن يكون فعالًا بالاقتران مع المضادات الحيوية ويمكن أن يساهم في تصميم التجارب السريرية المنضبطة المستقبلية. دراسة BT100، ClinicalTrials.gov التسجيل: NCT05498363.
مقاومة المضادات الحيوية (AMR) هي تهديد صحي عالمي بارز مع تقديرات بحدوث 1.27 مليون وفاة مرتبطة بها في وهناك حاجة ملحة للبحث عن استراتيجيات مضادة للميكروبات بديلة. تم تطبيق العلاج بالبكتريوفاج (BT)، وهو استخدام البكتريوفاج – الفيروسات التي تصيب البكتيريا – لعلاج العدوى البكتيرية، لأول مرة بواسطة فيليكس ديريل في ، وتم تطويره وتطبيقه لاحقًا في الاتحاد السوفيتي السابق.
مراجعة منهجية حديثة أكدت أن BT يمكن اعتباره بشكل عام آمنًا، مع انخفاض في حدوث الأحداث السلبية، ويمكن أن يكون استراتيجية واعدة ضد . ومع ذلك، هناك حاجة إلى تجارب عالية الجودة لإجراء توقعات مفيدة حول نتائج علاجات البكتريوفاج. تحاول عدد من الشركات حاليًا تطوير وتسويق منتجات BT واسعة الطيف محددة تتوافق مع المتطلبات المعاصرة، والتي تتضمن شهادة ممارسات التصنيع الجيدة (GMP)، والبحث قبل السريري (السُمية والدوائية) وإجراء تجارب عشوائية محكومة (RCTs). ومع ذلك، فإن عددًا قليلاً من تجارب RCT للبكتريوفاج التي تم إجراؤها حتى الآن لم تحقق النتائج المتوقعة من حيث الفعالية . سبب شائع للإبلاغ عن هذه النتائج المخيبة هو استخدام منتجات البكتريوفاج غير المتغيرة التي تناسب الجميع .
على النقيض من ذلك، يتم الإبلاغ عن عدد متزايد من حالات BT الناجحة في الأدبيات العلمية . بغض النظر عن انحياز نشر النتائج الإيجابية الواضح، استخدمت معظم هذه الحالات الناجحة منتجات بكتريوفاج مخصصة. بالإضافة إلى ذلك، تم استخدام هذه التحضيرات المخصصة للبكتريوفاج، التي أظهرت استهداف البكتيريا المسببة للعدوى في المختبر قبل تطبيقها السريري، غالبًا بالاقتران مع المضادات الحيوية. عند الاقتضاء، تم تكييف تحضيرات البكتريوفاج لمواجهة مقاومة البكتيريا التي ظهرت ضد البكتريوفاجات المستخدمة خلال ، أو تم تكييف البكتريوفاجات مسبقًا (‘تدريبها’) أو هندستها لتكون أكثر فعالية.
هنا نبلغ عن التحليل الرصدي بأثر رجعي لأول 100 حالة BT متتالية من العدوى الصعبة العلاج، التي تم تمكينها بواسطة اتحاد بلجيكي. نظرًا لأن جميع حالات BT تم تضمينها في هذه الدراسة، وليس فقط الحالات الناجحة أو المثيرة للاهتمام أو التحديات، تمكنا من (1) تقييم مدى تكرار إنتاج BT المخصص لنتيجة سريرية إيجابية (الفعالية العامة) و(2) تحديد العلاقات الوظيفية التي تكون عامة في جميع الحالات.
بالنظر إلى العدد النسبي الكبير من المتغيرات الفئوية والعددية المجمعة في البيانات التي تم تحليلها، كانت الغالبية العظمى من المرضى حالات فريدة في معظم المتغيرات. نتيجة لذلك، لم يكن بالإمكان تطبيق أي إحصائيات استنتاجية على مجموعة البيانات هذه لأن هذه البيانات لم تكن عينة عشوائية أو تمثيلية من مجموعة مرضى تم علاجهم بـ BT. وبالتالي، يمكن تفسير أي تحليل بيانات فقط على أنه معلومات تتعلق بالسكان المرضى الذين تم تحليلهم.
ومع ذلك، من المحتمل أن تساعد المعرفة المكتسبة من هذه الحالات الأطباء في اختيار بروتوكولات العلاج الفعالة وتصميم التجارب السريرية المستقبلية.

النتائج

المرضى، العدوى البكتيرية وعلاج البكتريوفاج

ساعد اتحاد BT البلجيكي، الذي يتكون من مستشفى الملكة أستريد العسكري (QAMH)، جامعة KU Leuven وSciensano (المعهد العلمي للصحة العامة سابقًا)، في علاج حوالي 140 عدوى صعبة العلاج في المرضى في بلجيكا وخارجها (اعتبارًا من يوليو 2023)، دون احتساب المرضى الذين تم علاجهم في سياق التجارب السريرية المستقبلية. كانت عملية اختيار المرضى تعتمد إلى حد كبير على الحاجة السريرية، والموافقة التنظيمية وتوافر البكتريوفاجات المحددة جيدًا
التي تستهدف البكتيريا المسببة للعدوى (الشكل البياني للبيانات الموسعة 1). تم إنتاج تحضيرات البكتريوفاج المخصصة في QAMH وفقًا للقواعد السارية في الإقليم في وقت استخدامها في الممارسة السريرية. من الجدير بالذكر أن معظم الحالات المختارة كانت تتعلق بـ BT المخصص كعلاج إنقاذ بعد فشل العلاجات بالمضادات الحيوية القياسية. تم التحقق من جودة وسلامة تحضيرات البكتريوفاج بواسطة Sciensano وفقًا لمواصفات مونوغراف المادة الفعالة للبكتريوفاج البلجيكي (API) ، أي التحليل الجينومي للبكتريوفاج وموطن إنتاجه البكتيري (مع التركيز على السلامة)، وتحديد النشاط الليتي (العنوان)، ودرجة الحموضة، والحمل البيولوجي (إجمالي عدد الكائنات الحية الهوائية القابلة للحياة)، ومستوى السموم البكتيرية وتسلسل الجينوم (الهوية والنقاء) لكل دفعة من API البكتريوفاج. كانت بروتوكولات BT التي تم اقتراحها للأطباء المعالجين مستندة إلى تجارب معهد جورج إليافا للبكتريوفاج، وعلم الأحياء الدقيقة والفيروسات (معهد إليافا) في تبليسي، جورجيا (اتصالات شخصية)، وعلى تعليمات التطبيق من وزارات الصحة والصناعة الطبية وعلم الأحياء الدقيقة في الاتحاد السوفيتي السابق (USSR) .
خلال فترة الدراسة (من 1 يناير 2008 إلى 30 أبريل 2022)، تم تقديم 1,066 طلب BT إلى QAMH. أسفرت هذه الطلبات عن 100 حالة BT (9.4%). تم تحليل مائتي وستين طلب BT الموجهة إلى QAMH بين أبريل 2013 وأبريل 2018 بالتفصيل . أسفر 15 (5.8%) من هذه الطلبات الـ 260 عن BT فعلي. تم رفض مائتي وخمسة وأربعين طلبًا لأسباب متنوعة: 70 متقدمًا ( ) لم يستجيبوا لطلبات المعلومات الإضافية؛ 124 طلبًا ( ) الأنواع البكتيرية المعنية التي لم تتوفر ضدها بكتريوفاجات في QAMH؛ بالنسبة لـ 46 طلبًا (17.7%)، تم اعتبار خيارات علاجية أخرى أكثر ملاءمة؛ وفي 5 حالات (1.9%)، لم تستهدف البكتريوفاجات المتاحة سلالات البكتيريا المسببة للعدوى لدى المرضى. عادةً ما تم إحالة الطلبات المرفوضة إلى مراكز العلاج البكتريوفاجي في الخارج. نعتبر هذه النسب تمثيلية لمجموعة المرضى الحالية، مع الأخذ في الاعتبار زيادة في نسبة الطلبات التي أدت إلى العلاج البكتريوفاجي ( مقابل 5.8%)، وهو ما يرجع إلى العدد المتزايد من البكتيريوفاجات العلاجية في مجموعة QAMH. كان وقت العلاج يعتمد على ما إذا كانت البكتيريوفاجات ذات الجودة المناسبة متاحة على الفور (يمكن توفيرها على الفور)، أو ما إذا كان يجب إنتاج البكتيريوفاجات في QAMH وإجراء اختبارات الجودة والسلامة من قبل Sciensano (سيستغرق ذلك في المتوسط 3 أسابيع في الحالات غير الطارئة).
أظهرت تحليل رجعي لقاعدة بيانات BT غير المعروفة الهوية، التي تحتوي على بيانات ديموغرافية ومنتجات بكتريوفاج وبيانات سريرية، أن العلاج الشخصي باستخدام BT لـ 100 مريض متتالي استهدف 114 عدوى صعبة العلاج (كما تم تشخيصها من قبل الأطباء المعالجين)، بما في ذلك 14 عدوى في موقع ثانٍ. يتم تقديم الخصائص الأساسية للمرضى في الجدول التكميلي 1 والجدول البياني الموسع 1، وتوفر لمحة عامة عن هذه الحالات من BT، التي تم تنفيذها بواسطة إجمالي 63 مزودًا لعلاج البكتريوفاج في 35 مستشفى، و29 مدينة و12 دولة (الشكل 1a). تم الإبلاغ عن سبعة وعشرين من حالات BT/المرضى المئة سابقًا. . منذ عام 2008، زاد عدد حالات نقل الدم التي تم تنفيذها تحت مظلة أطر تنظيمية مختلفة وساعد عليها التحالف البلجيكي بشكل مستمر (الشكل 1ب). تظهر نسبة أنواع العدوى الرئيسية في الشكل 1ج. تشمل المؤشرات الأكثر شيوعًا لنقل الدم عدوى الجهاز التنفسي السفلي (LRTI؛ 25.4% (29/114 عدوى))، والجلد والأنسجة الرخوة
الشكل 1| خصائص مجموعة المرضى المشاركين في 100 حالة متتالية من العلاج بالبكتريوفاج التي تم تسهيلها بواسطة الكونسورتيوم البلجيكي. أ، الموقع الجغرافي لحالات العلاج بالبكتريوفاج. ب، عدد حالات العلاج بالبكتريوفاج وسياقها التنظيمي، حسب السنة. SOC MP، الرعاية القياسية مع تحضيرات البكتريوفاج المخصصة؛ DH، المادة 37 (التدخلات غير المثبتة في الممارسة السريرية) من إعلان هلسنكي؛ SOC UM، الرعاية القياسية مع الأدوية غير المرخصة؛ ATU MP، ‘التصريح المؤقت للاستخدام’ للتحضيرات المخصصة. ج، أنواع العدوى الأولية والثانوية (المتزامنة). AbdI، عدوى البطن؛
عدوى الأطراف الصناعية العظمية. د، توزيع عمر المرضى وجنسهم. يظهر الرسم البياني الصندوقي النطاق الربعي لعمر المرضى (بالسنوات). ): الربع الأول (29.5)، الوسيط (53) والربع الثالث (62). تمتد الشعيرات من الأرباع إلى آخر نقطة بيانات ضمن نطاق الربيع الربعي. النقاط البيانية المرسومة خارج حدود الشعيرات هي نقاط شاذة. تمثل المرضى الإناث بدوائر مملوءة باللون الأرجواني والمرضى الذكور بدوائر مملوءة باللون الأزرق. أنواع البكتيريا المستهدفة. في بعض الحالات، استهدفت الفيروسات البكتيرية نوعين أو ثلاثة من البكتيريا (مرتبطين بخطوط) في مريض واحد.
العدوى (SSTI؛ 22.8% (26/114))، عدوى العظام (Bonel؛ 14.0% (16/114)) وعدوى الجهاز التنفسي العلوي (URTI؛ 11.4% (13/114)). قدم أربعة عشر مريضًا عدوى في موقع ثانٍ، وبشكل أكثر تحديدًا عدوى في مجرى الدم (BSI؛ عدوى المسالك البولية (UTI؛ ) ،
ن أو يظهر توزيع العمر والجنس في الشكل 1d. كان العمر الوسيط للمرضى 53 عامًا. سنوات)، و كان من بين المرضى ذكور. ومن الجدير بالذكر أن 5 مرضى كانوا في عمر سنة أو أقل. تم استهداف أربعة عشر نوعًا من البكتيريا (الشكل 1e)، مع
الجدول 1 | نظرة عامة عامة على بروتوكولات علاج البكتريوفاج وفقًا لأنواع العدوى الرئيسية
نوع العدوى مسار التقديم حامل البكتريوفاج الحجم (مل) تركيز (وحدات لكل مل) ) جرعة مدة
عدوى الجهاز التنفسي السفلي الترذاذ 2-4 كل 6 ساعات 5 أيام – 6 أسابيع
عدوى الأطراف الصناعية العظمية والعظام داخل الآفة ٢-٧٠ 24 ساعة 5 أيام – 3 أسابيع
عدوى الجلد والأنسجة الرخوة موضعي NaCl 0.9% أو فلامينال هيدرو بشكل مفرط 24 ساعة 5 أيام – 3 أسابيع
عدوى الجهاز التنفسي العلوي رذاذ أنفي ١-١٥ ق8هـ 1-3 أسابيع
عدوى مجرى الدم أو أنواع أخرى من العدوى وريدي 50-100 24 ساعة 5-10 أيام
عندما اعتبر الطبيب المعالج أنه من الضروري تطبيق البكتريوفاجات بشكل نظامي. وحدات تشكيل اللويحات؛ كل.
أعلى انتشار لبكتيريا الزائفة الزنجارية (49/100 مريض) والمكورات العنقودية الذهبية (39/100 مريض).
تم استخدام ستة وعشرين بكتيريوفاج فردي (الجدول التكميلي 3) وستة كوكتيلات بكتيريوفاج محددة (الجدول التكميلي 4)، بما في ذلك كوكتيلين متاحين تجارياً (PyoPhage وIntestiPhage) تم إنتاجهما بواسطة معهد جورج إليافا للبكتيريوفاجات وعلم الأحياء الدقيقة والفيروسات (معهد إليافا) في تبليسي (جورجيا). تم توفير البكتيريوفاجات من قبل QAMH و16 متبرعاً للبكتيريوفاج مرتبطين بـ 10 معاهد في 7 دول.
التزم معظم مقدمي العلاج المناعي ببروتوكولات العلاج المناعي المقترحة من قبل أطباء QAMH، مما أدى إلى تفاوت صغير بشكل مدهش في بروتوكولات العلاج المناعي ضمن دلالة معينة. توفر الجدول 1 نظرة عامة عامة على هذه البروتوكولات، بينما يتم سرد البروتوكولات الفردية لـ 100 حالة في الجدول التكميلي 1. تم إعطاء البكتريوفاجات عن طريق الوريد لـ 20 مريضًا (الجدول التكميلي 1)؛ في 10 منهم كعلاج مناعي مستقل، وفي 10 بالتزامن مع العلاج داخل الآفة. ) ، مُبَخَّر ( ) ، موضوعي ( ) أو عام (طرق تطبيق متعددة؛ تم استخدام البكتريوفاجات عن طريق الوريد لعلاج أو منع عدوى مجرى الدم في 10 مرضى. تم إعطاء البكتريوفاجات في 69.3% (79/114) من العدوى المستهدفة بالاشتراك مع المضادات الحيوية القياسية.

التحضير المسبق للبكتريوفاجات

البكتيريوفاجات الأكثر استخدامًا، وهي بكتيريوفاج ستافيلوكوكوس ISP (33 مريضًا) و . تم تعديل الفيروسات البكتيرية Pseudomonas aeruginosa 14-1 (22 مريضًا)، PNM (21 مريضًا) و PT07 (18 مريضًا) (الجدول التكميلي 3) بانتظام (مرة إلى مرتين في السنة) باستخدام مجموعة من ثلاثة إلى خمسة سلالات بكتيرية حديثة تثير القلق. بالإضافة إلى ذلك، تم تكييف 13 فيروسًا بكتيريًا مسبقًا خصيصًا لتفكيك بكتيريا المريض بطريقة ذات صلة علاجية (الطرق)، أي لإنتاج تفكيك مستقر (دون ظهور طفرات مقاومة للفيروسات البكتيرية) في الثقافة السائلة عادةً عند مضاعفة العدوى (MOI) (البيانات الموسعة الجدول 2). تم تسلسل وتحليل ومقارنة جينومات البكتريوفاجات المعدلة مسبقًا مع تلك الخاصة بسلفها الأصلي كجزء من مشروع SAPHETY المنسق من قبل Sciensano (https://www.sciensano.be/ar/control-and-safety-assessment/تحضيرات البكتريوفاج العلاجية الآمنة)، التي تركز على وضع معايير جديدة لجودة وسلامة منتجات البكتريوفاج العلاجية. أدت إحدى جهود التكيف المسبق إلى زيادة نشاط بكتريوفاج S. aureus ISP ضد عزل سريري من S. epidermidis في سياق العلاج الشخصي. أسفر عملية التكيف المسبق (أربع تمريرات متسلسلة) عن طفرات غير صحيحة في ثلاثة جينات، بما في ذلك بروتين مرتبط بمجال ربط الكربوهيدرات وبروتين جليكوزيل يوراسيل-DNA (الشكل البياني الممتد 2)، والتي ترتبط ارتباطًا وثيقًا (أقرب نتائج BLAST) ببروتينين معروفين سابقًا مرتبطين بالمستقبلات. . ومع ذلك، كانت زيادة الفوعة وكبت المقاومة في المتغير ISP المعدل مسبقًا مصحوبة بانخفاض في نطاق المضيف. حيث أظهر النسخة الأصلية من ISP نشاطًا معتدلاً (كفاءة الطباعة ضد سلالات S. epidermidis، المتغير المتكيف
أظهر نشاطًا مقبولًا علاجيًا ضد سلالة المريض فقط.

اختبارات تشخيصية لدعم علاج البكتريوفاج

بالنسبة لـ 21 مريضًا، تم توفير عينات بكتيرية متتالية كافية وملائمة و/أو عينات مصل، مما يسمح بتقييم (1) إمكانية ظهور مقاومة في الجسم الحي ضد البكتيريوفاجات المستخدمة، (2) تفاعلات البكتيريوفاجات والمضادات الحيوية في المختبر و/أو (3) ظهور تحييد المناعة ضد البكتيريوفاجات (الجدول 2).

اختيار مقاومة البكتريوفاج

بالنسبة لـ 16 مريضًا، كانت هناك عينات بكتيرية كافية (معزولة قبل وأثناء وبعد العلاج بالتحويل) متاحة لتقييم إمكانية ظهور مقاومة البكتيريا للفيروسات البكتيرية. لم يكن توفر العينات الكافية مرتبطًا مباشرةً بالمؤشرات السريرية للعلاج بالتحويل، بل اعتمد بشكل رئيسي على مراكز العلاج وروتين المراقبة البكتريولوجية لديها. بالنسبة لـ 5 مرضى في الجدول 2، لم تكن هناك مجموعات عينات كافية متاحة (مشار إليها بـ ‘NSA، لا توجد عينات متاحة’ في الجدول 2). لاحظنا اختيار سلالات بكتيرية في الجسم تظهر نمطًا غير حساس للفيروسات البكتيرية، والارتباطات المحتملة بين النمط الظاهري والنمط الجيني في 7 من هؤلاء. المرضى (المرضى وتم إجراء تحليل تعدد أشكال النوكليوتيدات الفردية (SNP) على مستوى الجينوم الكامل للعزلات البكتيرية من المرضى الذين ظهرت لديهم مقاومة للعاثيات. في مريضين (64 و 82 في الجدول 2)، تم تحديد أن العزلات الحساسة للعاثيات والعزلات المقاومة للعاثيات من P. aeruginosa ليست متطابقة. أظهر المقارنة النشوية أنه بالنسبة للمريض 82، كانت السلالات الحساسة للعاثيات تنتمي إلى نوع تسلسل نادر ناشئ (ST)235، في حين كانت السلالات المقاومة للعاثيات تنتمي إلى النوع الأكثر انتشارًا والمقاوم المتعدد الأدوية ST357 (الجدول 2 والشكل 2a). بالنسبة للمريض 64، كانت السلالة القابلة للإصابة هي ST1233 (نفس السلالة مثل السلالات من المريض 91)، بينما تم تحديد السلالة المقاومة على أنها ST549 (الجدول 2 والشكل 2أ). في هذين المريضين، من المحتمل أن يكون العلاج قد اختار سلالات P. aeruginosa التي لم تكن مضيفًا مناسبًا للبكتريوفاجات المستخدمة. تم الإبلاغ عن تحسن سريري في كلا المريضين.
تم افتراض أن SNPs أو الحذف في الجينات المرتبطة بمستقبلات البكتريوفاج كانت أساس ظاهرة المقاومة لدى خمسة مرضى. و91 في الجدول 2). في ثلاثة منهم (المرضى 30 و54 و91)، لم يتم القضاء على سلالات P. aeruginosa المستهدفة. تم وصف اختيار طفرات مقاومة للبكتريوفاج في مريضين (16 و20) سابقًا. . في المريض 16، ظهرت عينة من سلالة Achromobacter xylosoxidans المستهدفة تحمل طفرة غير متجانسة في الجين الذي يشفر لمستقبل الكوليسين I المحتمل Cir، والذي تم تحديده كمستقبل لبكتريوفاج. في المريض 20، حدثت طفرة غير متجانسة في جين pilB المستهدف سلالة P. aeruginosa، بينما تم تعطيل جين pilM من خلال إدخال إنزيم IS5. كلا من pilB و pilM متورطان في تخليق الشعيرات من النوع الرابع (T4P)، وهو المستقبل لفيروس P. aeruginosa المطبق. .
الجدول 2 | نتائج الاختبارات الداعمة التي أجريت لـ 21 من أصل 100 حالة علاج بالبكتريوفاج المتتالية الحالية
رقم المريض نوع العدوى الأنواع البكتيرية المستهدفة البكتيريوفاج المطبق طرق إعطاء البكتريوفاج اختيار مقاومة الفيروسات البكتيرية في الجسم الحي: الآلية (الآليات) المحتملة الكامنة وراء ذلك تفاعلات البكتريوفاج والمضادات الحيوية في المختبر تحييد المناعة ضد البكتريوفاج تحسن سريري القضاء على البكتيريا المستهدفة مرجع
9 عدوى مرتبطة بالكسور كليبسيلا الرئوية M1 داخل الأنسجة (قسطرة) لم يُلاحظ تآزر M1 مع سيفتازيديم/أفيباكتام و ميروبيم ظهر تحييد M1 بين اليوم الثامن واليوم الثامن عشر بعد بدء العلاج بالـ BT نعم نعم مرجع
١٣ عدوى الجروح والدم المُكَوِّرَة الزُرقاء 14-1، PNM و ISP (BFC 1) موضعي ووريدي لم يُلاحظ لا مضادات حيوية مصاحبة ظهرت عملية التحييد 14-1 بعد 10 أيام من بدء BT نعم نعم مرجع
16 عدوى زراعة الرئة في التليف الكيسي أكروموباكتر زيلوسوكسيادانس JWAlpha، JWDelta، JWT و 2-1 (APC 1.1 و APC 2.1) الترذاذ نعم – طفرة MS Tyr601X في مستقبل كوليسين I Cir لا مضادات حيوية مصاحبة NSA نعم نعم مرجع
20 زراعة الكبد وعدوى مجرى الدم ب. الزائفة 14-1، PNM و ISP (BFC 1) داخل الأنسجة (حقن) ووريدي نعم – الطفرة MS Asp388Ala في PilB وتعطيل PilM عن طريق إدخال إنزيم IS5، كلاهما متورطان في تخليق الألياف من النوع الرابع، دون تأثير على الضراوة. تآزر PNM مع الكولستين، الأزترونام والجنتاميسين ظهرت تحييد ISP بعد 5 أسابيع من بدء BT. لا يوجد تحييد لـ 14-1 أو PNM. نعم نعم مرجع
21 عدوى طعم العظام المكورات العنقودية الذهبية 14-1، PNM و ISP (BFC 1) داخل الآفة (قسطرة) ووريدي لم يُلاحظ تآزر ISP مع الكليندامايسين، تأثير إضافي لـ ISP و السيبروفلوكساسين، تداخل معتدل لـ ISP مع الرفامبيسين NSA نعم نعم مرجع
٢٢ التهاب العظم والنخاع المزمن في الحوض ب. الزائفة و س. الإيبيدرميديس 14-1، PNM، ISP (BFC 1) داخل الورم (قسطرة) NSA غير متوفر بعد شهر من بدء العلاج، لم يكن هناك أي اكتشاف لتحييد البكتريوفاج. نعم نعم مرجع
23 التهاب العظم والنخاع المزمن في عظمة الفخذ المكورات العنقودية الذهبية 14-1، PNM، ISP (BFC 1) داخل الأنسجة (قسطرة) NSA غير متوفر بعد شهر من بدء العلاج، لم يكن هناك أي اكتشاف لتحييد البكتريوفاج. نعم نعم مرجع
٢٤ التهاب العظم والنخاع المزمن في عظمة الفخذ ب. الزائفة و س. الإيبيدرميديس 14-1، PNM، ISP (BFC 1) داخل الأنسجة (قسطرة) NSA غير متوفر بعد شهر واحد من بدء العلاج، لم يكن هناك أي اكتشاف لتحييد البكتريوفاج. نعم نعم مرجع
26 عدوى العمود الفقري ب. الزائفة 4029، 4032 و 4034 محلي ووريدي لم يُلاحظ غير متوفر وكالة الأمن القومي نعم نعم مرجع
27 عدوى العظام ب. الزائفة 14-1، PNM و ISP (BFC 1) محلي لم يُلاحظ التأثير التراكمي لمزيج البكتريوفاج مع سيفتازيديم/أفيباكتام وكالة الأمن القومي نعم نعم مرجع
30 التهاب الجيوب الأنفية المزمن المكورات العنقودية الذهبية و P. aeruginosa 14-1، PNM و ISP (BFC 1) رذاذ أنفي نعم – ب.ألا154 برو MS طفرة في PilC، متورطة في تخليق الألياف من النوع الرابع لا مضادات حيوية مصاحبة وكالة الأمن القومي لا لا غير منشور
42 التهاب العظم والنخاع المزمن في عظمة الفخذ إنتيروكوكوس فاسياليس بايوفاج داخل الأنسجة (قسطرة) NSA غير متوفر بعد شهر من بدء العلاج، لم يكن هناك أي اكتشاف لتحييد البكتريوفاج. نعم نعم مرجع
43 عدوى زراعة الكبد إنترococcus فاسيوم إفجر كن وإفجر إن جي وريدي لم يُلاحظ تآزر EfgrKN مع الفانكومايسين، فقدان مقاومة الفانكومايسين بعد 49 يومًا من بدء العلاج بالمضادات الحيوية، لم يكن بالإمكان اكتشاف أي تحييد للبكتريوفاج. نعم لا مرجع
الجدول 2 (مستمر) | نتائج الاختبارات الداعمة التي أجريت لـ 21 من أصل 100 حالة علاج بالبكتريوفاج المتتالية الحالية
رقم المريض نوع العدوى الأنواع البكتيرية المستهدفة البكتيريوفاج المطبق طرق إعطاء البكتريوفاج اختيار مقاومة الفيروسات البكتيرية في الجسم الحي: الآلية (الآليات) المحتملة الكامنة وراء ذلك تفاعلات البكتريوفاج والمضادات الحيوية في المختبر تحييد المناعة ضد البكتريوفاج تحسن سريري القضاء على البكتيريا المستهدفة مرجع
٥٤ التهاب الرئة المرتبط بجهاز التنفس الصناعي ب. الزائفة 14-1، PNM و PTO7 الترذاذ
نعم – p.Thr230Proline MS
Mut في PilR، المعنية بالنوع
تخليق ألياف IV
لا توجد تفاعلات واضحة بين PNM أو 14-1 وكوليستين بعد شهرين من بدء العلاج بالمضادات الحيوية، لم يكن بالإمكان الكشف عن تحييد البكتريوفاج. نعم لا غير منشور
٥٥ عدوى الجهاز العضلي الهيكلي مكورات جلدية إيجابية الغرام مزود خدمة الإنترنت و BEO6 داخل الآفة ووريدي لم يُلاحظ لا مضادات حيوية مصاحبة وكالة الأمن القومي لا لا غير منشور
64 ناسور شرجي المكورات الزائفة 14-1، PNM و PTO7 داخل الآفة نعم – اختيار سلالة أخرى، والتي ليست مضيفًا للبكتريوفاجات 14-1، PNM أو PT07 لا مضادات حيوية مصاحبة بعد 4 و 7 أشهر من بدء العلاج، لم يكن بالإمكان الكشف عن تحييد البكتريوفاج. نعم نعم غير منشور
66 عدوى الرئة الناتجة عن التليف الكيسي م. خُراج 8UZL النبوليزر والحقن الوريدي NSA غير متوفر ظهرت عملية تحييد 8UZL بعد 7 أيام من بدء BT لا لا غير منشور
71 عدوى الرئة ب. الزائفة PT07 الترذاذ لم يُلاحظ التأثير التراكمي لـ PTO7 والسيفتازيديم NSA نعم نعم غير منشور
82 عدوى الرئة الناتجة عن التليف الكيسي ب. الزائفة 4P و DP1 الترذاذ نعم – اختيار سلالة أخرى، والتي ليست مضيفًا للبكتريوفاجات 4P و DP1 تآزر 4P و DP1 مع ليفوفلوكساسين، لا توجد تفاعلات واضحة بين 4P أو DP1 وتوبراميسين وكالة الأمن القومي نعم نعم غير منشور
91 عدوى الرئة ب. الزائفة 14-1، PNM و PTO7 النبوليزر والحقن الوريدي
نعم-
تخليق LPS:
(هل 2 و 3) p.Trp139X NS Mut في WapH، (هل 2 و 3) p.Gln239X NS
موت في جالي، (إش 4 و 5) ص. ليو162برو MS
مت في WapR، (Is 4 و 5) p.Leu60_
Leu63del في WbpR
تخليق الألياف من النوع الرابع: (Is 4 و 5) p.Arg120fs X في FimV، مفقود أول 165 حمض أميني
أخرى:
(Is 6) p.Gly406Ser MS طفرة في بروتين تجميع الأهداب CupE5، (Is 2، 3، 4، 5 و 6) p.Arg994Gly MS طفرة في MexB من MexAB-OprM، (Is 4 و 5) p.His87Asp MS طفرة في GyrA
تآزر PT07 مع الكولستين والميكوبينيم بعد أسبوعين من بدء العلاج بالمضادات الحيوية، لم يكن بالإمكان الكشف عن تحييد البكتريوفاج. نعم لا غير منشور
92 التهاب اللفافة الناخر المعمم، الخراج، تعفن الدم المكورات العنقودية الذهبية، الزائفة الزنجارية و ستينوتروفوموناس مالطوفيلية مزود خدمة الإنترنت، 14-1، PNM، PTO7 وBUCT700 ISP: داخل الوريد، داخل الجنب، داخل البطن والتبخير؛ الكل: موضعي لم يُلاحظ تآزر ISP مع الفانكومايسين، السيفتارولين والكليندامايسين ظهرت تحييد مزود خدمة الإنترنت بعد 6 أيام من بدء العلاج بالـ BT نعم نعم غير منشور
aa، الأحماض الأمينية؛ del، الحذف؛ fs، تغيير الإطار؛ Is، العزلة؛ MS Mut، طفرة تغيير المعنى؛ NA، لم يتم التحليل؛ NS Mut، طفرة عدم المعنى؛ X، توقف.
تم عزل طفرات مقاومة للبكتريوفاج من مرضى 30 و54 و91 المصابين بـ P. aeruginosa (الجدول 2 والشكل 2b-d). من بين هذه الطفرات، تم تحديد SNPs التي تت correspond إلى مناطق مرتبطة بـ T4P في المرضى الثلاثة. في أحد المرضى (54)، كانت هذه الطفرة في جين pilR، الذي يشفر المنشط النسخي لنظام ثنائي المكونات الذي ينظم تعبير الوحدة الفرعية الرئيسية PilA (الشكل 2b). . في عينة مريض آخر (30)، كانت هذه الطفرة في جين يشفر لمكون الغشاء الداخلي، PilC، الضروري لتكوين T4P (الشكل 2c) بالنسبة للمريض 91، تم إدخال كودون توقف مبكر مما أدى إلى إنتاج نوع جيني مختصر من الجين fimV، الذي يعبر عن جزء من تجميع الغشاء الداخلي لـ T4P في P. aeruginosa (الشكل 2d). . بالإضافة إلى ذلك، تم إظهار أن هذه المريضة تحمل بكتيريا أظهرت مقاومة متزامنة لجميع الفيروسات البكتيرية الثلاثة الفريدة من P. aeruginosa من العلاج: PNM و PT07 و 14-1 (الجدول 2 والشكل 2d). ومن المثير للاهتمام، أننا لاحظنا نوعين متميزين من المتغيرات المقاومة للفيروسات البكتيرية من الهدف المستهدف في البداية سلالة P. aeruginosa، كل منها يظهر مقاومة للفيروسات البكتيرية الثلاثة المستخدمة، والتي كانت جميعها تحتوي على مستقبلات بكتيرية مختلفة. فيروس P. aeruginosa 14-1 يصيب عبر مستقبلات الليبوليكوساكاريد (LPS). لم يكن من المفاجئ أن تم تحديد SNPs في الجينات في النواة الخارجية لغشاء LPS الخاص بـ P. aeruginosa، وهي wapH و galU و wbpR (المنتجات الجينية المختصرة في هذه المتغيرات الثلاثة) و wapR. على الرغم من أن مستقبل بكتريوفاج P. aeruginosa PT07 غير معروف، إلا أن هناك تشابه في التسلسل مع بكتريوفاجات شبيهة بـ PAK-P1. تشير الهوية مع البكتيريوفاج PaP1 إلى أن هذا البكتيريوفاج يعتمد على مضخة إخراج الأدوية المتعددة MexAB-OprM في بكتيريا P. aeruginosa. . تم تحديد طافرة مقاومة من PT07 تحتوي على SNP في الجين mexB. تم عزل سلالتين من P. aeruginosa (Is 4 و 5 في الجدول 2) من المريض 91 وكانتا تحتويان على mex طفرة وأخرى في وحدة A من إنزيم الجيراز (gyrA) في الحمض النووي، وهو جزء من إنزيم التوبوإيزوميراز البكتيري. هذه الطفرة (H87A) تقع ضمن منطقة تحديد مقاومة الكينولون في GyrA (QRDR). لقد ارتبط تفاعل مضخة الطرد MexAB-OprM وطفرة جين الجيراز DNA بمقاومة عالية المستوى للفلووروكينولونات في . أيروجينوس . من المثير للاهتمام أن عزلات بكتيريا P. aeruginosa التي لا تتأثر بالعاثيات والتي تم استرجاعها من المريض 91 الحامل للطفرات المزدوجة في mexB و gyrA أظهرت إعادة حساسية لمضادات الفلوروكينولون بينما أظهرت ديناميات نمو غير متغيرة، كما يتضح من انخفاض التركيز المثبط الأدنى (MIC) من إلى للسيprofloksاسين ومن إلى لليفوفلوكساسين. من الجدير بالذكر أن المريض 91 تم علاجه في نفس الوقت مع البكتريوفاجات والمضادات الحيوية ميروبيم وكوليميسين وفانكومايسين.

اختبارات ضراوة جاليريا ميلونيللا

نظرًا لأن هذه الطفرات في العزلات من المرضى 30 و54 و91 موجودة في عوامل الفوعة المشفرة (الأهداب من النوع الرابع، الليبوبوليسكاريد)، قمنا بتنفيذ نموذج عدوى Galleria mellonella لتقييم فوعة المتغيرات الحساسة للبكتريوفاج مقابل المتغيرات المقاومة للبكتريوفاج من هذه السلالات من P. aeruginosa. أظهرت اليرقات المصابة بالعزلات الأصلية الحساسة للبكتريوفاج معدل وفيات سريعًا وملحوظًا خلال 48 ساعة (100% وفاة) (الشكل 3 من البيانات الموسعة). أظهرت المجموعات المصابة بالطفرات المقاومة للبكتريوفاج من المريض 91 مع طفرات متعددة (>2) في الجينات المشفرة لمناطق مختلفة (LPS، MexAB-OprM و/أو T4P و/أو DNA gyrase) معدلات بقاء أعلى بشكل ملحوظ. ) مقارنة باليرقات المصابة بالعزلة الأصلية في هذا النظام النموذجي. كما لوحظت معدلات بقاء أعلى بشكل ملحوظ لليرقات المصابة بالنمط المتغير المقاوم للبكتريوفاج من سلالة P. aeruginosa المعزولة من المريض 54 مقارنة بالنمط المتغير الأصلي القابل للإصابة بالبكتريوفاج ( ). ومع ذلك،
توفيت جميع اليرقات من هاتين المجموعتين خلال 18 ساعة. لم تظهر اليرقات المصابة بالعزلة المقاومة للبكتريوفاج من المريض 30 أي فرق في البقاء مقارنة بتلك المصابة بالعزلة الأصلية. وبالتالي، في المريض 91، رأينا مزيجًا من إعادة حساسية المضادات الحيوية وانخفاض ضراوة العزلات المقاومة للبكتريوفاج، مما قد يكون قد ساهم في نتيجة علاجية إيجابية في النهاية.

تفاعلات البكتريوفاج والمضادات الحيوية في المختبر

تم تحليل تفاعلات الفيروسات البكتيرية والمضادات الحيوية والبكتيريا لنسب غير مثالية من الفيروسات البكتيرية إلى البكتيريا. ) ومستويات subMIC ( الحد الأدنى من التركيز المثبط (MIC) للمضادات الحيوية. كانت هذه الظروف غير المثلى ضرورية لتمكين ملاحظة هذه التفاعلات. إذا تم تطبيق الفيروسات البكتيرية أو المضادات الحيوية تحت تركيزات مثلى، لكان ذلك قد أدى إلى قتل فعال لسلالات البكتيريا بواسطة إما المضادات الحيوية أو الفيروسات البكتيرية، مما يجعل من المستحيل إثبات التفاعلات التآزرية أو المضافة أو المتضادة المحتملة. كشفت تجارب تفاعل الفيروسات البكتيرية والمضادات الحيوية والبكتيريا في المختبر عن تأثير تآزري أو مضاف للفيروسات البكتيرية والمضادات الحيوية المطبقة في نفس الوقت في 9 من أصل 10 مرضى تم تقييمهم (9،20،21،27،43،71،82،91 و92). يتم تقديم نظرة عامة على نتائج الاختبار في الجدول 2. نتائج التجارب المتعلقة بأول 5 مرضى ( وتم الإبلاغ عن 43) تم تقديم النتائج التفصيلية (منحنيات نمو OmniLog) لأحدث 5 مرضى (54، 71، 82، 91 و 92) في الشكل 3. تم ملاحظة التآزر في المختبر مع البكتريوفاجات لعدد 9 مضادات حيوية (أزترونام (المريض 20)، سيفتارولين (92)، سيفتازيديم/ أفيباكتام (9)، كليندامايسين (21 و 92)، كولستين (20 و 91)، جنتاميسين (20)، ليفوفلوكساسين (82)، ميروبيم (9 و 91) وفانكومايسين (43 و 92))، وتأثير إضافي لثلاثة مضادات حيوية (سيفتازيديم/ أفيباكتام (27)، سيفتازيديم (71) وسيفروفلوكساسين (21)). بالنسبة لمريض واحد (54)، لم يتم ملاحظة تفاعلات ملحوظة في المختبر بين كولستين وبكتريوفاجات P.aeruginosa PNM (الشكل 3أ) أو 14-1 (الشكل 3ب). عملت البكتريوفاجات 4P و DP1 بتآزر مع ليفوفلوكساسين (الشكل 3د، هـ)، لكنها لم تظهر تفاعلًا واضحًا مع توبراميسين (الشكل 3و، ز)، عند اختبارها في المختبر ضد سلالة Pseudomonas aeruginosa من المريض 82. من المهم أن تم ملاحظة تداخل معتدل مع فيروس البكتيريا S. aureus ISP مع الرفامبيسين (المريض 21 في الجدول 2) في واحدة من حالات BT التي نشرناها سابقًا. من الجدير بالذكر أنه عندما تم إجراء معظم هذه الاختبارات، كانت العلاجات البيولوجية قد بدأت بالفعل ولم تؤثر نتائج الاختبارات على علاج المرضى. ومع ذلك، اليوم، استنادًا إلى هذه النتائج والملاحظة العامة بأن القضاء على الممرضات يكون أكثر احتمالًا عند استخدام الفاجات بالتزامن مع المضادات الحيوية، ننصح بشدة الأطباء بإجراء هذه الاختبارات قبل العلاج، إذا سمح الوقت بذلك.

تحييد المناعة ضد البكتريوفاج

لـ 13 مريضًا، كانت عينات المصل الكافية (المأخوذة قبل وأثناء وبعد العلاج بالفيروسات البكتيرية) متاحة للسماح بإجراء فحص كافٍ لتحييد المناعة ضد الفيروسات البكتيرية. كانت تركيزات المصل المستخدمة ( ) ووقت الحضانة ( 30 دقيقة ) يتوافق مع التقنية القياسية التي طورها م. هـ. آدامز في عام 1959 لاكتشاف نشاط تحييد البكتريوفاج بشكل محدد. تم ملاحظة تحييد المناعة للبكتريوفاج بين 6 و 35 يومًا بعد بدء BT في 5 من 13 ( ) المرضى الذين تم فحصهم (9، 13، 20، 66 و 92 في الجدول 2 والشكل 4 أ-د). كانت عملية تحييد المناعة ضد البكتريوفاج دائمًا تتضمن إدارات بكتريوفاج غازية (وريدية و/أو داخل الآفة). في 4 من هذه الحالات الخمس (المرضى 9، 13، 20 و 92)، تم ملاحظة تحسن سريري واستئصال للجرثومة البكتيرية المستهدفة. في مريض زراعة الكبد (43 في الجدول 2)، تم إعطاء البكتريوفاج عن طريق الوريد
الشكل 2| ظهور مقاومة البكتريوفاج في الجسم الحي خلال العلاج بالبكتريوفاج. تم مراقبتها من خلال تحليل الجينوم الكامل للعزلات البكتيرية المتسلسلة في المرضى 30، 54، 64، 82 و 91 (تم مناقشة ظهور مقاومة البكتريوفاج في المرضى 16 و 20 في الجدول 2). أ، شجرة النسب الجينية لأقصى احتمال لجينومات العزلات البكتيرية المتسلسلة التي تم تحليلها. ب-د، عرض دائري للجينومات البكتيرية للعزلات المتسلسلة (Is) من سلالات بكتيريا الزائفة الهوائية التي تم استرجاعها قبل (Is 1، الدائرة الداخلية) و
أثناء العلاج بالبكتريوفاج (Is 2-n) من المرضى 54 (ب)، 30 (ج) و 91 (د). تعرض الحلقات الخضراء جينومات العزلات الحساسة للبكتريوفاج، بينما تعرض الحلقات الحمراء الجينومات والطفرات ذات الصلة (لمقاومة البكتريوفاج البكتيرية) في العزلات المقاومة للبكتريوفاج. تعرض الحلقتان الخارجيّتان الملونتان تعليقات البروتين (الفئات) كما هو موجود في قاعدة بيانات مجموعات البروتينات المتجانسة (COGs). bp، أزواج القواعد؛ CDS، تسلسل الترميز؛ IS، تسلسل الإدخال؛ Mb، ميغابايت؛ nt، نيوكليوتيد؛ PTM، تعديل ما بعد الترجمة.
لم تؤدي البكتريوفاجات إلى أي تحييد مناعي. في مريض آخر زراعة كبد (20)، ظهرت مقاومة المناعة ضد البكتريوفاج، ولكن فقط بعد 5 أسابيع، وكانت تتعلق بأحد البكتريوفاجات الثلاثة التي تم تطبيقها (الجدول 2 والشكل 4 ج).

النتائج السريرية

تم الإبلاغ عن تحسن سريري في 77.2% (88/114) من العدوى المستهدفة وتمت ملاحظة استئصال البكتيريا المستهدفة في 61.3% (65/106) من العدوى التي كانت لها بيانات متابعة بكتريولوجية ذات صلة
الشكل 3| نتائج التقييم في المختبر للتأثيرات المشتركة للبكتريوفاجات والمضادات الحيوية المطبقة في نفس الوقت على السلالات البكتيرية المستهدفة. تم تحديدها بواسطة نظام OmniLog للمرضى 54، 71، 82، 91 و 92 (تم مناقشة المرضى و 43 في الجدول 2). يتم تقديم تكاثر البكتيريا من خلال وحدات نسبية من التنفس الخلوي. المريض 54.ج، التأثير التراكمي (تأخر نمو البكتيريا) للسيفتازيديم و
الشكل 4 | ظهور تحييد المناعة ضد البكتريوفاج.
أ-هـ، نشاط تحييد المناعة ضد البكتريوفاج (BIN) الزمني ضد البكتريوفاجات المطبقة في المصل الم collected قبل وأثناء وبعد العلاج بالبكتريوفاج في المرضى و . يتم عرض تطور نشاط BIN في المصل ضد البكتريوفاجات المطبقة كـ فقدان عيار البكتريوفاج (مقارنة بمصل التحكم قبل العلاج) بعد حضانة البكتريوفاجات مع عينات مصل متسلسلة لمدة 30 دقيقة. ظهر نشاط BIN
1-5 أسابيع بعد بدء العلاج بالبكتريوفاج. يتم تقديم البيانات كمتوسط انحراف معياري من ثلاث نسخ بيولوجية. ABCONCOM، العلاج بالمضادات الحيوية المتزامنة؛ الإدارة، الإدارة؛ CI، التحسن السريري؛ ERADIC، الاستئصال؛ IL، داخل الآفة؛ INDICATI، الإشارة؛ i.v.، وريدي؛ Kp، كليبسيلا الرئوية؛ Ma، المتفطرة القيحية؛ Nebul، التبخير؛ Pa، الزائفة الهوائية؛ Sa، المكورات العنقودية الذهبية؛ Sm، ستينوتروفوموناس مالطوفيلية؛ TARGET، الأنواع البكتيرية المستهدفة. يحتوي كوكتيل البكتريوفاج BFC1 على البكتريوفاجات ISP، 14-1 و PNM.
كانت البيانات متاحة (الجدول التكميلي 1). بالنسبة لـ 8 عدوى مستهدفة، في 8 مرضى، لم تكن هناك بيانات بكتريولوجية كافية بعد العلاج (الجدول التكميلي 1). بالنسبة لـ 7 من هذه الحالات، لم يجمع مركز العلاج البيانات البكتريولوجية اللازمة كجزء من المتابعة الروتينية للمرضى ولم يُسمح له بجمع البيانات بشكل استباقي. بالنسبة للحالة المتبقية، ليس من الواضح لماذا لم تكن البيانات البكتريولوجية متاحة. إما أن مركز العلاج لم يجمع هذه البيانات، أو فشل في استخراج هذه البيانات من الملفات الطبية، أو لم يكن قادرًا أو راغبًا في نقل هذه البيانات إلى مركز تنسيق علاج البكتريوفاج (PTCC).
أدى العلاج بالبكتريوفاج إلى تحسن سريري دون استئصال بكتيري في 18 من 106 ( ) عدوى مستهدفة ومراقبة بكتريولوجيًا (الجدول التكميلي 1). على العكس، في مريضين (44 و 93 في الجدول التكميلي 1)، تم ملاحظة استئصال الجراثيم المستهدفة دون تحسن سريري. في المريض 44، ظهرت عدوى مع نوع بكتيري إضافي (غير مستهدف بالعلاج) (Acinetobacter baumannii) خلال العلاج، مما أدى في النهاية إلى صدمة إنتانية رئوية من A. baumannii ووفاة المريض، على الرغم من إعطاء التيغيسيكلين عن طريق الوريد. توفي المريض 93 بسبب تقدم الورم والرعاية التلطيفية.
بالنسبة لـ 21 من 92 (22.8%) مريضًا كانت بيانات المتابعة البكتريولوجية متاحة، لم يكن بالإمكان ملاحظة أي تحسن سريري أو استئصال بكتيري. توفي خمسة من هؤلاء المرضى ( و 96 في الجدول التكميلي 1). كانت أسباب الوفاة هي الصدمة الإنتانية ( ), الصدمة القلبية ( ), فشل الأعضاء المتعددة ( ) وعدوى COVID-19 ( ). تم إعطاء المضادات الحيوية القياسية المتزامنة في 69.3% (79/114) من العدوى المستهدفة (الجدول التكميلي 1).
أظهر اختبار فيشر الدقيق لبيانات العد تأثيرات ذات دلالة إحصائية أحادية على الاستئصال للمتغيرات الفئوية التالية: الاستخدام المتزامن للمضادات الحيوية (نعم أو لا)، ملف مقاومة المضادات الحيوية للبكتيريا المستهدفة (مقاومة متعددة الأدوية أو لا) والإعداد السريري (خارج المستشفى أو داخل المستشفى). لم يتم ملاحظة أي تأثيرات لعمر المريض أو جنسه على استئصال البكتيريا المستهدفة باستخدام تحليل الانحدار اللوجستي الأحادي الذي يأخذ في الاعتبار العمر أو الجنس فقط. حدد تحليل الانحدار اللوجستي المتقدم خطوة بخطوة لاستئصال البكتيريا على جميع المتغيرات المستقلة أن الاستخدام المتزامن للمضادات الحيوية (المتغير ABCONCOM) كان المتغير الأكثر إفادة في مجموعة البيانات المختصرة (الجدول التكميلي 2). في مجموعة بياناتنا المكونة من 100 حالة متتالية، كان استئصال البكتيريا المستهدفة (المتغير ERADIC) أقل احتمالًا عندما لم يتم استخدام أي مضادات حيوية متزامنة (نسبة الأرجحية فترة الثقة ). كانت قيمة لاختبار فيشر للدقة بين ABCONCOM و ERADIC هي 0.01488. تُظهر جدول الطوارئ أن نموذج الانحدار اللوجستي لدينا صحيح من الوقت. لم يتم اختيار ملف مقاومة المضادات الحيوية للبكتيريا المستهدفة (ABRPROF) والإعداد السريري (CLINSETT) بالإضافة إلى تفاعلاتها مع الاستخدام المتزامن للمضادات الحيوية (ABCONCOM) في نموذج الانحدار اللوجستي العام. يمكن أن يُعزى ذلك إلى العلاقات المربكة بين هذه المتغيرات الثلاثة ضمن مجموعة البيانات هذه. وُجدت علاقة ذات دلالة إحصائية بين التحسن السريري واستئصال البكتيريا. من بين 23 مريضًا لم يظهروا تحسنًا سريريًا، أعرب مريضين فقط عن الاستئصال. من بين 69 مريضًا أظهروا تحسنًا سريريًا، كان 53 منهم قد تم استئصالهم بالكامل. لم يُظهر العلاج الوريدي بالبكتريوفاج، كعلاج مستقل أو متزامن، تأثيرًا كبيرًا على النتائج السريرية، كما وُجد أيضًا بالنسبة لعمر المريض أو جنسه، أو استمرار العدوى البكتيرية (مزمنة أو حادة)، أو استخدام أكثر من بكتريوفاج مستهدف لكل سلالة بكتيرية. لم يكن التحسن السريري أو استئصال البكتيريا مرتبطًا بشكل كبير بوجود إما P. aeruginosa أو S. aureus، حيث لم يتم اعتبار الأنواع الأخرى بشكل منفصل، حيث كانت انتشارها في هذه المجموعة السكانية منخفضة جدًا، أو مع أي بكتريوفاج فردي أو كوكتيل بكتريوفاج.
تم الإبلاغ عن خمسة عشر حدثًا سلبيًا، بما في ذلك سبعة ردود فعل سلبية غير خطيرة يُشتبه في ارتباطها بالعلاج بالبكتريوفاج (الجدول التكميلي 3). تم حل جميع ردود الفعل السلبية المشتبه بها. لم يكن هناك ارتباط
بين الأحداث السلبية ومنتج بكتريوفاج معين أو طريقة الإدارة.

المناقشة

في هذا العرض التقديمي لأولى 100 حالة متتالية من العلاج الشخصي باستخدام البكتريوفاج، نوضح أننا (1) تمكنا من إنتاج أكثر من 40 دفعة من المواد الفعالة للبكتريوفاج المخصصة، بعضها تم تكييفه مسبقًا. والتي تم اعتمادها لاحقًا للاستخدام في التحضيرات الصيدلانية؛ (2) عند استخدامها في علاج 114 عدوى صعبة العلاج من أنواع وأسباب مختلفة، بالاشتراك مع المضادات الحيوية في في الحالات، أدت هذه التحضيرات إلى تحسن سريري في 77.2% من الحالات والقضاء على البكتيريا المستهدفة في 61.3% من الحالات؛ (3) تم الإبلاغ عن سبع تفاعلات سلبية مشتبه بها غير خطيرة للأدوية.
التمثيل الساحق لبكتيريا P. aeruginosa (49% من المرضى) و S. aureus ( لأن هذه الأنواع البكتيرية المستهدفة هي في الأساس أسباب رئيسية للعدوى المستشفوية الشديدة، ولكنها أيضًا الكائنات الدقيقة الرئيسية التي تسبب عدوى جروح الحروق الغازية. الذي كان تاريخياً محور اهتمام كبير لعلماء الأمراض المعدية في QAMH، حيث تم إجراء أولى علاجات البكتريوفاج. .
من الجدير بالذكر أن جميع تحضيرات البكتريوفاج كانت مقدمة مجانًا. ومع ذلك، لم يكن من الممكن تحقيق هذا الجهد – توفير 43 دفعة من 26 بكتريوفاج لعلاج 100 مريض – إذا كان يتعين الامتثال للعدد الكبير من المتطلبات والإجراءات المكلفة والتي تستغرق وقتًا طويلاً لتصنيع المنتجات الطبية البيولوجية المرخصة وفقًا لممارسات التصنيع الجيدة (GMP). قد تتمكن الشركات التي تركز على تحضيرات البكتريوفاج المحددة للاستخدام في مؤشرات تجارية قابلة للتطبيق من التعامل مع المتطلبات الصارمة لمسار ترخيص المنتجات الطبية التقليدية (الأدوية)، بما في ذلك شهادة GMP، والاختبارات قبل السريرية، والتجارب السريرية. ومع ذلك، بالنسبة لمركز العلاج الجيني، تشكل هذه المتطلبات حاجزًا لا يمكن التغلب عليه من حيث الجداول الزمنية والتكلفة. لقد عايشنا بشكل مباشر مدى تعقيد وتعقيد مفاهيم العلاج الجيني المخصصة، مقارنة بالأساليب الموحدة، حيث تم تبادل سلالات البكتيريا والبكتريوفاج المتطابقة بين العشرات من المعاهد في 12 دولة. نتيجة لذلك، نحن نركز على تطوير نظام إنتاج فوري وموقعي للبكتريوفاج يعتمد على الذكاء الاصطناعي (AI) ومناهج البيولوجيا التركيبية. .
تحدد بروتوكولات BT لدينا جرعات منخفضة نسبيًا من البكتريوفاج، عادةً وحدات تشكيل اللويحات (p.f.u.s) في الولايات المتحدة، تقترح مجموعة قيادة مقاومة البكتيريا (ARLG) الخاصة بفريق عمل الفاج استخدام أعلى جرعة آمنة ومتحملة من منتج الفاج مع مستويات الإندوتوكسين أقل من الحدود المقبولة التي وضعتها إدارة الغذاء والدواء لتعظيم تركيزات الفاج في موقع العدوى وإصابة أكبر عدد ممكن من خلايا المضيف بالجرعة الأولى. ومع ذلك، تعترف مجموعة عمل الفاج ARLG بأن النتائج السريرية لا تتحسن دائمًا مع الجرعات الأعلى، مما يعكس تعقيد جرعات البكتريوفاج الفعالة. لقد لاحظنا زيادة في كفاءة البكتريوفاج في المختبر (النشاط الليتي) مع زيادة نسبة الجرعة إلى العدوى (MOI) حتى نقطة معينة، بعد ذلك يمكن ملاحظة إعادة النمو بشكل أكثر تكرارًا وفي وقت أبكر (الشكل 4 من البيانات الموسعة). كما تحدد الجرعات الفعالة من البكتريوفاج في الجسم عن طريق طريقة إعطاء البكتريوفاج. تعتمد معظم بروتوكولات العلاج المعتمدة المقدمة هنا على مبدأ أن البكتريوفاجات تُعطى بشكل أفضل مباشرة في موقع العدوى. لم تُستخدم الإدارات الفموية لأنه لم يتم علاج أي عدوى معوية.
في 17% (18/106) من العدوى المستهدفة التي كانت متاحة لها بيانات المتابعة البكتريولوجية، تم الإبلاغ عن تحسن سريري على الرغم من عدم القضاء على البكتيريا المستهدفة.
في عام 1943، تم الإبلاغ عن ظهور طفرات بكتيرية مقاومة للبكتريوفاج في الثقافات السائلة. مؤخراً، تم الإبلاغ عن تطور متوازي لمقاومة الفيروسات البكتيرية وفقدان الفوعة في استجابة P. aeruginosa لعلاج الفيروسات البكتيرية (في مريض واحد)، في الجسم الحي وفي المختبر. كانت المقاومة المختارة في الجسم مرتبطة بـ
معدلات النمو المنخفضة، في حين أن العزلات في المختبر تطورت لإنتاج المزيد من الأغشية الحيوية. أظهرت المرجع 46 أنه عندما يكون خطر الإصابة بالفيروسات البكتيرية مرتفعًا، يتم اختيار آليات المقاومة الدائمة، مثل طفرة مستقبل الفيروس البكتيري، من قبل العوائل البكتيرية، بدلاً من آليات المقاومة القابلة للتحفيز، مثل نظام التكرارات المتناظرة القصيرة المتباعدة بشكل منتظم (CRISPR). في الدراسة الحالية، لاحظنا اختيارًا في الجسم الحي لظاهرة مقاومة الفيروسات البكتيرية في 43.8% (7/16) من المرضى الذين كانت عينات البكتيريا المتابعة الكافية متاحة للاختبار. ومع ذلك، هناك تحذير؛ المرضى الذين يمكن تحليل ظهور مقاومة الفيروسات البكتيرية لديهم تم علاجهم في عدد قليل من المستشفيات حيث كانت المراقبة الروتينية للبكتيريا تنتج عينات مناسبة كافية. وهذا يعني أن بيانات مقاومة الفيروسات البكتيرية المقدمة ليست قابلة للتعميم. بالإضافة إلى ذلك، بسبب العدد المحدود من المرضى الذين تم إثبات المقاومة لديهم، لم يكن من الممكن إظهار تأثيرها المحتمل على القضاء على الهدف البكتيري إحصائيًا. على أي حال، لوحظ فشل في القضاء في من المرضى الذين تم اختيارهم لمقاومة البكتريوفاج، و22% (2/9) من المرضى الذين لا توجد لديهم مقاومة للبكتريوفاج. كانت الحالات التي نشأت فيها مقاومة البكتريوفاج في الغالب تتعلق بعدوى الجهاز التنفسي الناتجة عن P. aeruginosa. قد يكون من الممكن أن تكون مقاومة البكتريوفاج أكثر شيوعًا في هذا السيناريو، ولكن قد يكون ذلك أيضًا بسبب أن عدوى الجهاز التنفسي وعدوى P. aeruginosa هي الأكثر تمثيلاً. تم الافتراض أن SNPs غير المتناظرة أو الحذف في الجينات التي تؤثر على مستقبل البكتريوفاج أو التي تشفر لجيراز الحمض النووي كانت أساس الظاهرة المقاومة في خمس حالات. في حالتين، تم اختيار سلالات بكتيرية لم تكن مضيفًا للبكتريوفاجات المستخدمة. في بعض الحالات، أظهرت الطفرات المقاومة للبكتريوفاج التي تم اختيارها في الجسم إعادة الحساسية لبعض المضادات الحيوية وانخفاض الفوعة في نموذج يرقات الميلونيللا. لم يمنع اختيار البكتيريا المقاومة للفيروسات البكتيرية من القضاء النهائي على سلالات البكتيريا المستهدفة وتحسين الحالة السريرية لأربعة مرضى.
حتى الآن، قامت جميع التجارب السريرية العشوائية الخاصة بالعلاج البكتيري بتقييم منتجات الفيروسات البكتيرية المحددة كعلاجات مستقلة. بينما يتم الإبلاغ عن تآزر البكتريوفاج والمضادات الحيوية بشكل متزايد في الأدبيات استنادًا إلى بيانات BT السريرية التي تم توليدها في بيئات الاستخدام الرحيم، وبالاقتران مع العلاج بالمضادات الحيوية، اقترحت مجموعة عمل الفاج ARLG مؤخرًا أن يتم استخدام BT جنبًا إلى جنب مع المضادات الحيوية التقليدية. . وبالمثل، لاحظنا هنا وجود علاقة ذات دلالة إحصائية بين القضاء على البكتيريا المستهدفة والعلاج بالمضادات الحيوية القياسية المساعدة. بالإضافة إلى ذلك، في عدة حالات من الحالات المئة الحالية، تم الافتراض أن الحل السريري للعدوى المقاومة المتعددة للأدوية كان بسبب التأثير الإضافي أو التآزري لمجموعات مختلفة من الفيروسات البكتيرية والمضادات الحيوية. تم الافتراض، استنادًا إلى تجارب في المختبر، أن الاستخدام العلاجي للبكتريوفاجات المرتبطة بمضخات الطرد P. aeruginosa يمكن أن يختار عزلات مقاومة للبكتريوفاجات مع تغييرات في آلية مضخة الطرد، مما يؤدي إلى زيادة الحساسية لبعض المضادات الحيوية الكيميائية. في الدراسة الحالية، أظهرنا أن الاستخدام العلاجي للبكتريوفاج PT07، المتوقع أن يرتبط بمضخة الطرد المتعدد الأدوية MexAB-OprM، قد اختار بالفعل (داخل الجسم) طفرات مقاومة للبكتريوفاج مع تغييرات في آلية الطرد، مما أدى إلى زيادة الحساسية للفلووروكينولونات. وبالتالي، يمكن أن يؤدي استخدام بكتريوفاجات مختارة بشكل خاص (على سبيل المثال، تستهدف مضخات الطرد الدوائي) إلى إعادة حساسية البكتيريا تجاه نشاط المضادات الحيوية، مما يزيد من قتل البكتيريا عند استخدامها مع هذه المضادات الحيوية، وقد يقلل من اختيار النسخ المقاومة للمضادات الحيوية أو البكتريوفاج. ومع ذلك، يجب توخي الحذر، حيث يمكن أن تتداخل بعض المضادات الحيوية مع نشاط البكتريوفاج الليتي. لذا قد يكون من المستحسن قياس التآزر المحتمل أو التنافر للتوليفات المقترحة من البكتريوفاجات والمضادات الحيوية قبل تطبيقها سريرياً. .
تراكمت كمية كبيرة من البيانات التجريبية التي تظهر أن البكتريوفاج يمكن أن تؤثر بشكل كبير على خلايا جهاز المناعة، وقد تم الافتراض أن الأجسام المضادة المضادة للبكتريوفاج تظهر
على مدار فترة BT يمكن أن يقلل من النشاط الليتي للبكتريوفاجات ويتسبب في فشل العلاج وبالتالي، تم discouraging استخدام نفس البكتريوفاج (البكتريوفاجات) لعدة أسابيع في الاتحاد السوفيتي السابق. مؤخراً، أفاد المرجع 55 بتطور الأجسام المضادة المحايدة بعد شهرين من العلاج الوريدي بـ BT، مما أدى إلى فشل العلاج في مريض ذو مناعة طبيعية مصاب بعدوى الرئة بسبب المتفطرة الطفيلية. نصحت فرقة عمل الفاج ARLG بالنظر في قياس الأجسام المضادة المحايدة خلال دورات طويلة من BT. في الدراسة الحالية، لاحظنا ظهور تحييد المناعة ضد البكتريوفاج بعد 6-35 يومًا من بدء إعطاء البكتريوفاج الغازي.
نحن نعترف بأن تحليلنا، الذي شمل 100 مريض شديد المرض كانت العلاج بالفيروسات البكتيرية (BT) بالنسبة لهم علاجًا إنقاذيًا وكان هدفنا الأساسي هو مساعدة هؤلاء المرضى، له قيود داخلية. لم يتم وضع مجموعات تحكم، أو إخفاء، أو عشوائية، وشارك فيه تخصصات طبية وأنواع عدوى مختلفة. لم يكن تقييم السلامة والفعالية قائمًا على اختبارات معيارية محددة مسبقًا، بل على حكم الأطباء المعالجين، ورغم أنهم جميعًا كانوا ذوي خبرة، فإن هذا يقدم نوعًا من الذاتية. ومع ذلك، نعتبر أن هذه السلسلة من الحالات توفر رؤى رئيسية ليست فقط قيمة لعلاج المرضى في حالات الإنقاذ، ولكن أيضًا لتصميم التجارب السريرية المستقبلية مثل دراسة PHAGEFORCE. لقد أكدنا ملف الأمان لـ BT ومزايا دمج BT مع العلاج بالمضادات الحيوية القياسية. أظهرت التحليلات الإحصائية احتمالية أعلى بشكل ملحوظ للقضاء على الميكروبات عند دمج BT مع المضادات الحيوية القياسية، وتم إثبات التآزر بين البكتريوفاج والمضادات الحيوية في 9 من 10 حالات تم تحليلها. قدمت العينات التي سمحت بإجراء اختبارات داعمة في 21 مريضًا، من أجل إدارة علاج أفضل، مزيدًا من الضوء على بعض القضايا المتعلقة بـ BT مثل اختيار مقاومة البكتريوفاج في الجسم، وتآزر البكتريوفاج والمضادات الحيوية، وحياد المناعة للبكتريوفاج.
في الختام، نقدم أدلة على أن استخدام البكتريوفاجات بالإضافة إلى المضادات الحيوية القياسية يمكن أن يحسن بشكل كبير من معدل القضاء على البكتيريا المستهدفة في هذه الفئة من المرضى. يمكن أن تكون هذه البيانات مفيدة في تصميم تجارب سريرية محكومة مستقبلية والتي هي في حاجة ماسة لمساعدة مجال البكتريوفاج.

طرق

تصميم الدراسة والمرضى

قمنا بمراجعة أول 100 حالة متتالية من العلاج بالبكتيريوفاج التي تم تسهيلها بواسطة اتحاد بلجيكي بين 1 يناير 2008 و30 أبريل 2022. ضمن هذا الاتحاد، قامت QAMH بتنسيق معظم حالات العلاج بالبكتيريوفاج، واختيار وإنتاج البكتيريوفاجات، واقتراح بروتوكولات العلاج، بينما قامت KU Leuven بإجراء تحليلات جينية داعمة للبكتيريوفاجات قيد النظر وللجينومات البكتيرية، وتولت Sciensano مراقبة جودة وسلامة تحضيرات البكتيريوفاج الفردية. اختيار 100 مريض هو اختيار عشوائي وليس مرتبطًا بأي تحديد لحجم العينة المستقبلية.
طلب الأطباء الحصول على العلاج باستخدام تحضيرات البكتريوفاج من مركز QAMH لعلاج البكتريوفاج، وقد قدموا طلبًا للعلاج إلى مركز تنسيق علاج البكتريوفاج (PTCC) التابع لـ QAMH. يتم توضيح إجراء PTCC لاختيار المرضى للعلاج في الشكل التوضيحي الممتد رقم 1، ويعتمد بشكل كبير على الحاجة السريرية، والموافقة التنظيمية، وتوافر البكتريوفاجات المستهدفة للبكتيريا المسببة للعدوى. تم تنفيذ التطبيقات السريرية من قبل، وتحت مسؤولية، مقدمي علاج البكتريوفاج في عدة مستشفيات في بلجيكا وخارجها. لم يتم تنفيذ أي إخفاء أو تظليل أو عشوائية، وكان الباحثون والمرضى على علم بعلاج البكتريوفاج. تم جمع البيانات الديموغرافية والسريرية من خلال الأطباء المعالجين للمرضى. تم تقييم التحسن السريري (أو عدمه)، والقضاء على البكتيريا المستهدفة (أو عدمه)، وظهور وخطورة ومدة ردود الفعل السلبية المشتبه بها والأحداث من قبل الأطباء المعالجين.
تم الحصول على موافقة مستنيرة مكتوبة لعلاج BT من المرضى المعنيين أو ممثليهم القانونيين وفقًا للأحكام المحلية.
حيثما كان ذلك warranted، تم الحصول على موافقة لجنة الأخلاقيات المحلية لتجارب BT. وفقًا لائحة الاتحاد الأوروبي رقم 536/2014 (لائحة التجارب السريرية) ، وتحويله إلى القانون البلجيكي، واتباع نصيحة اللجنة الأخلاقية الرائدة في “مستشفى جامعة أنتويرب” و”جامعة أنتويرب” (ID 3644)، التي وافقت على بروتوكول الدراسة الرصدية، لم تُعتبر هذه التحليل الرجعي غير التدخلي لقاعدة بيانات نقل الدم الموجودة والمجهولة الهوية تجربة على الإنسان ولم تتطلب موافقة مستنيرة مخصصة. لم يكن هناك تعويض للمرضى عن المشاركة في هذه الدراسة. تم تسجيل بروتوكول الدراسة الرصدية على ClinicalTrials.gov (الدراسة BT100، المعرف: NCT05498363).

تصنيع المواد الفعالة للبكتريوفاج

تم عزل الفيروسات البكتيرية وتصنيفها بواسطة QAMH أو تم الحصول عليها من متبرعي الفيروسات البكتيرية. تم إنتاج تعليقات الفيروسات البكتيرية وفقًا للإرشادات المقدمة في مونوغراف API للفيروسات البكتيرية. ، والأساليب الموصوفة في المرجع 58، مع بعض التعديلات. تم إعداد مخزونات الفيروسات البكتيرية باستخدام طريقة التغطية المزدوجة بالآغار مع تعديلات طفيفة. تم استخدام ثلاثة إلى ستة ملليلترات من lysate الفيروسات البكتيرية التي تحتوي على تم إضافة وحدات تشكيل اللويحات (p.f.u.) من البكتريوفاجات إلى أنبوب فالكون معقم سعة 15 مل (Greiner Bio-One) وتم تكملته بـ 0.2 مل من تعليق بكتيري حساس للبكتريوفاج (التركيز النهائي لـ وحدات تشكيل المستعمرات ) ووسط دافئ معتدل (اختر مصدر بروتين بديل (APS) مرق ليوسين (LB) أو مرق الصويا التربتي (TSB) أو TSB + 0.5% جليسرول (جميعها مشتراة من بيكتون ديكنسون)) مع 0.6% أجار علوي (VWR International)، ليصل الحجم الكلي إلى 12 مل. تم صب هذا المزيج على طبق مربع ( طبق بتري (جرينر بيو-وان) مملوء بطبقة سفلية من APSLB أو TSB أو وسط TSB الجليسرول (جميعها من بيكتون ديكنسون) و1.5% أغار (VWR الدولية)، وتم حضنها في (لـ E. coli و K. pneumoniae و P. aeruginosa) أو (لكل الأنواع البكتيرية الأخرى) لمدة 16 ساعة أو 48 ساعة (لـ M. abscessus). تم كشط طبقة الأجار العلوية باستخدام قضيب على شكل L معقم (سيغما ألدريتش)، ونقلها إلى أنبوب فالكون معقم سعة 50 مل (غرينر بيو-وان) وتم الطرد المركزي لمدة 20 دقيقة عند باستخدام جهاز الطرد المركزي سورفال ليجند (ثيرمو فيشر). تم سحب السائل العلوي باستخدام حقنة معقمة سعة 30 مل (بي دي بلاستيباك، بيكتون ديكنسون) مع إبرة معقمة مقاس 18G (بي دي ميكرولانس 3، بيكتون ديكنسون) وتم ترشيحه بشكل متسلسل باستخدام و فلتر حقن غشاء بولي إيثر سلفون (PES) Millex-Gp (ميرك) أو استخدام نظام فلترة بالفراغ (نالجين، ثيرمو فيشر). تم طرد تعليق البكتريوفاج لمدة 90 دقيقة عند ( للفيروسات البودوفيروسية) باستخدام جهاز الطرد المركزي سورفال ليجند (ثيرمو فيشر). تم تخفيف راسب البكتيريوفاج في محلول ملحي مخفف من فوسفات دولبيكو بدون كالسيوم ومغنيسيوم (DPBS، لونزا) بعشر مرات أقل من تعليق البكتيريوفاج الأولي وترك الراسب ليذوب طوال الليل في تم تخفيف تعليق البكتريوفاج إلى تركيز نهائي عمومًا ب.ف.ي.س باستخدام DPBS (لونزا) وحجم من تم تصفية تعليق البكتريوفاج المخفف باستخدام فلتر حقن غشاء PES Millex-Gp (ميرك) وتمت تنقيته لاحقًا من الإندوتوكسينات باستخدام مجموعات متاحة تجاريًا مثل EndoTrap Blue (لونزا) أو EndoTrap HD (ليونكس)، وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. تم استخدام عمود واحد لكل 50 مل من تعليق البكتيريوفاج. تم تصفية تعليقات البكتيريوفاج المنقاة من الإندوتوكسينات باستخدام مواد طبية من الدرجة. مرشحات حقن Millex-Gp من بولي فينيليدين فلوريد (PVDF) (ميرك) وتم جمعها في زجاجات PETG نالجين معقمة سعة 125 أو 500 مل (ثيرمو فيشر). كانت العنوان النهائي لكل بكتريوفاج تم الحصول عليه بهذه الطريقة ب.ف.ي.س .

جودة وسلامة المواد الفعالة للبكتريوفاج

سيانسنو تحكمت في جودة وسلامة البكتريوفاجات. وفقًا لمؤلف API للبكتريوفاج. تم تنفيذ هذا التحكم على مستويينhttps://www.sciensano.be/ en/control-and-safety-assessment/safety-therapeutic-bacteriophagepreparations). أولاً، تم إجراء فحص جيني للتحقق من
سلامة الفيروسات البكتيرية المستخدمة في العلاج البشري. لهذا الغرض، تم عزل وتنقية الحمض النووي الجيني للفيروسات البكتيرية وموائلها البكتيرية، باستخدام مجموعة MagCore للحمض النووي الفيروسي ومجموعة MgC للحمض النووي البكتيري. حجم الإيلاution (Atrida)، وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. تم بناء مكتبات التسلسل باستخدام مجموعة تحضير عينات الحمض النووي Illumina Nextera XT وتم تسلسلها على جهاز Illumina MiSeq باستخدام بروتوكول مزدوج النهاية بطول 250 نقطة أساس (كيمياء MiSeq v3، Illumina). تم تقليم القراءات القصيرة باستخدام Trimmomatic (الإصدار 0.32) بالإضافة إلى ذلك، تم إجراء تسلسل طويل القراءة لسلالات الإنتاج البكتيرية باستخدام مجموعة الترميز السريع SQK-RBK004 من تكنولوجيا أكسفورد نانوبور (ONT) وخلايا تدفق MinION (الإصدار 9.4.1)، وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. تم إجراء استدعاء القواعد بدقة عالية جدًا باستخدام Guppy (الإصدار 6.0.1) (ONT) وتم إنشاء تجميعات هجينة باستخدام Unicycler (الإصدار 0.4.7). بالنسبة للبكتريوفاجات، تم إجراء تجميع الجينوم باستخدام SPAdes (Galaxy v.3.15.4+) بعد ذلك، تم توضيح الجينوم باستخدام بروكا (جالاكسي الإصدار 1.14.6) بمساعدة قاعدة بيانات PHROGS الإصدار 3 (https://phrogs. Imge.uca.fr/). لاكتشاف الجينات غير المرغوب فيها المرتبطة بمقاومة المضادات الحيوية أو الفوعة، تم تقديم الجينوم الكامل للبكتريوفاج إلى واجهة الويب blastn الخاصة بمركز المعلومات البيولوجية الوطني (NCBI) (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) للبحث عن التشابه في قواعد بيانات مختلفة: ARG-ANNOT (ARG-ANNOT NT الإصدار 6 يوليو 2019)، CARD (الإصدار 3.1.4 إلى 3.2.5)، ResFinder (https://bitbucket.org/تم البحث عن تحفيز البروفيج عن طريق رسم قراءات التسلسل لدفعة الإنتاج على جينوم مضيف البكتيريا باستخدام Bowtie2 (Galaxy v.2.5.0)، والبحث عن زيادة ملحوظة في التغطية في المواقع المتوقعة للبروفيج باستخدام PHASTER (https://phaster.ca/) وصائد البروفيجhttps://pro-hunter.bgi.com/) .
ثانياً، قامت Sciensano بتحليل معايير مختلفة لكل دفعة إنتاج من كل API بكتيريوفاج. تم تحديد هوية ونقاء البكتيريوفاج (المقاسة بنسبة قراءات تسلسل البكتيريوفاج) باستخدام استخراج الحمض النووي وتسلسل الجينوم كما هو موضح أعلاه. تم التحقق من قوة الدفعة باستخدام تخفيفات الأجار المزدوجة الكلاسيكية في ثلاث نسخ. تم تقييم الحمل البيولوجي (إجمالي عدد الكائنات الحية الهوائية القابلة للحياة) لكل دفعة API بكتيريوفاج باستخدام طريقة ترشيح الغشاء المعتمدة على الفصل 2.6.12 من الدليل الأوروبي للأدوية (Ph. Eur.). باختصار، تم إضافة 4 مل من دفعات API بكتيريوفاج (150-250 مل، 1.6-2.6%) إلى 36 مل من بيبتون NaCl، وبعد ذلك تم ترشيح 10 مل عبر الغشاء (مرشح غشاء نالجين، ). ثم تم حضن الغشاء على أجار التريبتو-كازين-الصويا (TCS) في لمدة لا تقل عن 72 ساعة و SCG (أجار سابورود ديكستروز + كلورامفينيكول + جنتاميسين) عند لمدة 5 أيام على الأقل. بعد الحضانة، تم تحديد عدد وحدات تشكيل المستعمرات لكل مل من الفيروسات البكتيرية API. تم استخدام عدة سلالات بكتيرية وخمائر كضوابط إيجابية.
محتوى الإندوتوكسين البكتيري لعينات 1 مل تم تحديده باستخدام اختبار Lysate (LAL) المعتمد من Limulus Amebocyte، وفقًا للفصل 2.6.14 من Ph. Eur. تم التعبير عن مستويات الإندوتوكسين البكتيرية بوحدات الإندوتوكسين (EU) لكل مل (1 EU تعادل 1 وحدة دولية (IU) من الإندوتوكسين). كانت معايير القبول (حد الإندوتوكسين) للتحضيرات النهائية للبكتريوفاج (المستحضرات المخففة من APIs للبكتريوفاج) هي كتلة الجسم بغض النظر عن طريق الإدارة.
شهادة تسمح باستخدام الفيروسات البكتيرية API في التحضيرات الصيدلانية (المحضرة) تُقدم من قبل Sciensano عند الانتهاء بنجاح من هذه الإجراءات ذات المستويين.
سيطرت سيسيان على جودة وسلامة 43 دفعة من المواد الفعالة الفردية للبكتريوفاج التي أنتجتها QAMH لعلاج أول 100 مريض. أظهرت هذه الدفعات متوسط تركيز بكتريوفاج قدره ب.ف.ي.س (س.د. درجة الحموضة 7.32 (انحراف معياري 0.037)، وحمولة حيوية تبلغ 0 وحدة تشكيل مستعمرات (و.ت.م.) (انحراف معياري 0 ) ومستوى متوسط من الإندوتوكسين (s.d. 89.14). كانت الفيروسات البكتيرية APIs، المكونات النشطة للتحضيرات الصيدلانية، مخففة في، و/أو مدمجة مع، المواد المساعدة اللازمة في صيدلية المستشفى ‘أوفيتشينا’ مباشرة قبل الاستخدام على أساس المرضى المحددين. حد السموم الداخلية
تم تحديد تحضيرات البكتريوفاج الماجسترال بناءً على الجرعة ووزن المريض. كانت جرعات الإندوتوكسين المعطاة، بغض النظر عن طريق الإدارة، دائمًا أقل بكثير من الجرعة الحموية العتبية للإدارة الوريدية، أي أقل من 5.0 وحدة من الإندوتوكسين. كتلة الجسم لم تحتوي جينومات البكتريوفاج على محددات جينية معروفة تمنح القدرة على التسبب في التعايش، أو السمية، أو الضراوة، أو مقاومة المضادات الحيوية. كانت البكتيريا المضيفة المستخدمة في عملية التصنيع آمنة (أو الأقل مسببة للأمراض) قدر الإمكان. وقد أظهرت بعض مضيفات الإنتاج وجود بروفاجات. إنتاجات البكتريوفاج مع لم يتم استخدام تسلسل القراءات المشتقة من الفيروسات البكتيرية المتكررة بنشاط في العلاج. لم يتم مراقبة جودة كوكتيلات الفيروسات البكتيرية التي أنتجها معهد إليافا (PyoPhage وIntestiPhage) من قبل ساينسانو. من المحتمل أن تحتوي هذه المنتجات على محتوى أعلى من الإندوتوكسين ومحتوى غير معروف من الفيروسات البكتيرية. لذلك، لم يتم إعطاؤها أبدًا عن طريق الوريد.

اختيار البكتريوفاجات المناسبة للعلاج

تم إرسال البكتيريا المسببة للعدوى من المرضى إلى مركز PTCC وتم تحديد حساسيتها للبكتريوفاج. تم اختبار حساسية سلالات البكتيريا تجاه كوكتيلات البكتريوفاج المتاحة أو APIs باستخدام اختبار البقعة كما هو موضح في المرجع 65. تم إضافة ثقافات جديدة ليلية من سلالات البكتيريا الخاصة بالمرضى إلى درجة حرارة دافئة. ) وسائط تحتوي على أجار (أجار علوي) وصب على شكل مربع (12 بوصة) أطباق بتري (غرينر بيو-وان) تحتوي على وسط مع أجار (أجار القاع). تم استخدام وسائط ثقافة مختلفة، وفقًا للأنواع البكتيرية المعنية. تم شراء الوسائط من بيكتون ديكنسون والأجار من VWR International. قطرات ( تم وضع ( ) من التخفيفات المتسلسلة لكل من حلول البكتيريوفاج المدروسة على طبقة الأجار العلوية. تم حضن أطباق بتري طوال الليل عند 32 أو ، وفقًا لنوع البكتيريا المدروسة. في اليوم التالي، تم فحص مناطق التحلل الناتجة عن الفيروسات البكتيرية النشطة في أرضية البكتيريا وتصنيفها على أنها تحلل متصل ( التحلل شبه المتقارب (3+)، التحلل المعتم (2+)، لويحات منفصلة (+) أو عدم النشاط (-). بعد ذلك، بالنسبة للبكتريوفاجات التي تنتج مناطق تحلل واضحة، تم تعريف EOP كما هو موصوف سابقًا. تم حساب EOP لسلالة البكتيريا الخاصة بالمريض من خلال المقارنة مع مضيف مرجعي شديد الحساسية، وتم تعريفه على أنه العدد الملحوظ من وحدات تشكيل المستعمرات (p.f.u.s) على سلالة البكتيريا الخاصة بالمريض (كما تم تحديده بواسطة اختبار البقعة الموصوف أعلاه) مقسومًا على العدد الملحوظ من وحدات تشكيل المستعمرات على سلالة البكتيريا المرجعية. وتم اعتبار قيمة EOP التي تم الحصول عليها من سلالة المضيف الإنتاجي شديد الحساسية كـ في حالة كانت الصورة غير واضحة (على سبيل المثال، مناطق التحلل غير الشفافة) وكانت النتائج صعبة أو غير قابلة للتفسير، تم استخدام طريقة التغطية المزدوجة بالأجار لتحديد وحدات تشكيل المستعمرات الفيروسية على سلالات المريض وموطن إنتاج البكتريوفاج، كما هو موضح أعلاه، لتحديد نسبة الفعالية بشكل أكثر دقة. عندما كانت نشاطات البكتريوفاجات لا تزال صعبة التقييم باستخدام الطرق المذكورة أعلاه المعتمدة على الوسائط الصلبة، تم استخدام ثقافات المرق السائلة لتقييم نشاط البكتريوفاج، باستخدام نظام أومني لوج (بيولوج). تم قياس تنفس البكتيريا بدون وجود البكتريوفاجات ومع وجودها. تم إجراء التجارب في أطباق ذات 96 بئر (ثيرمو فيشر) في حجم نهائي من من وسط LB أو TSB (بيكتون ديكنسون)، مكمل بمزيج صبغة التترازوليوم A أو H المخفف بمقدار 100 مرة (بيولوج). تم تلقيح الخلايا البكتيرية بتركيز من عدد الوحدات المكونة للcolonies لكل بئر، محسوب على أساس الكثافة الضوئية (OD) عند 600 نانومتر وتم التحقق منه باستخدام طريقة زراعة الألواح التقليدية. تم إضافة البكتريوفاجات بتركيز MOI يتراوح بين 100-0.0001، كما تم حسابه على أساس المضيف المتكاثر. تم حضن الألواح عند درجة حرارة محددة لنوع البكتيريا (32 أو ) لمدة 72 ساعة، وتم تسجيل تغير اللون الناتج عن اختزال صبغة التترازوليوم بسبب تنفس البكتيريا (أثناء النمو) كل 15 دقيقة بواسطة نظام أومني لوج. تم تحليل النتائج باستخدام برنامج تحليل بيانات بيولوج (الإصدار 1.7) وتم تصدير البيانات إلى ملفات Microsoft Excel.
اعتبرنا EOP النسبي كمقياس نسبي لكفاءة التحلل، والتي، في هذا السياق، تُعرف كنشاط التحلل (العنوان) للفيروسات البكتيرية على سلالة البكتيريا لدى المريض، مقسومًا على العنوان.
تمت ملاحظته في مضيف بكتيري مرجعي معروف بأنه شديد القابلية للإصابة بالفيروسات البكتيرية. اعتبرنا نسبة فعالية الفيروس على سلالة البكتيريا الخاصة بالمريض كعلاج مقبول بناءً على الخبرة من معهد إليافا. كانت جميع كوكتيلات البكتريوفاج تتكون من بكتريوفاجات ذات أنشطة متوافقة. منذ أبريل 2022، عندما أظهرت أكثر من بكتريوفاج نشاطًا كافيًا في المختبر، تم تحليل النشاط العام لمجموعات البكتريوفاج باستخدام نظام أومني لوج، كما هو موضح أعلاه. عندما لوحظت تأثيرات تآزرية أو إضافية، تم التوصية بمجموعات البكتريوفاج المعنية للاستخدام السريري.

التحضير المسبق للبكتريوفاجات

عندما اعتُبر أن قابلية البكتريوفاج للملاحظة منخفضة جدًا للتطبيق العلاجي، وإذا سمح الوقت والموارد، تم تكييف البكتريوفاج مسبقًا لزيادة إزالة الممرضات وتقليل تطور مقاومة البكتريوفاج. وفقًا لإرشادات وزارة الصحة في الاتحاد السوفيتي والخبرة التجريبية لمعهد إليافا، يجب أن تتسبب كوكتيلات البكتريوفاج المناسبة (وليس البكتريوفاجات الفردية) في تحلل مستقر، أي دون ظهور طفرات بكتيرية غير حساسة للبكتريوفاج، للبكتيريا المستهدفة في وسط سائل لفترة طويلة (عادةً ما تكون )، وعند MOI من 0.0001-0.00001 وتركيزات بكتيرية من وحدات تشكيل المستعمرات (المراجع 69-72). بالنسبة للبكتيريوفاجات الفردية، فإن نسب الجرعة إلى العدوى (MOIs) تم اعتبارها مناسبة. للحصول على عتبات شدة الفيروسات البكتيرية وكبح نمو البكتيريا، تم تطبيق طريقة أبيلمانز (المعدلة) للتكيف المسبق للفيروسات البكتيرية على سلالات البكتيريا، كما تم وصفه سابقًا. تم إضافة إلى أنبوب فالكون سعة 15 مل (جرينر بيو-وان): 4.5 مل من وسط LB أو TSB (بيكتون ديكنسون)، 0.5 مل من التخفيفات العشرية للفيروسات البكتيرية المعنية وحجم من سلالة البكتيريا الخاصة بالمريض أو مجموعة مسبقة الإنتاج من سلالات البكتيريا ‘المشكلة’ التي تم جمعها، للحصول على تركيز نهائي من .ف.ي.س . تم حضن الأنابيب عند درجة حرارة محددة لنوع البكتيريا (32 أو ) لمدة 48 ساعة. تم مراقبة نمو البكتيريا ونشاط الفيروسات البكتيرية عن طريق قياس OD عند 600 نانومتر باستخدام مطياف UV/VIS Lambda 12 (Perkin Elmer) بعد 24 و 48 ساعة من الحضانة ومقارنتها مع اثنين من الضوابط السلبية (فيروسات بكتيرية فقط ووسط LB أو TSB فقط) وضبط إيجابي (بكتيريا فقط). الأنبوب الذي يحتوي على أعلى تخفيف للفيروسات البكتيرية يظهر تم اختيار قيمة مشابهة للتحكم السلبي وتم إضافة الكلوروفورم إلى تركيز نهائي قدره تم هز الأنبوب وحضنه لمدة لا تقل عن ساعتين عند بعد الحضانة، تم سحب الطور العلوي (بدون كلوروفورم) باستخدام حقنة معقمة سعة 30 مل (BD Plastipak، بيكتون ديكنسون) مع إبرة معقمة مقاس 18G (BD microlance 3، بيكتون ديكنسون) وتم تصفيته باستخدام أو فلتر حقن غشاء PES Millex-Gp (ميرك). خضعت المستخلصات البكتريوفاجية الناتجة لعدة (على الأقل ثلاث) من التمريرات الموصوفة أعلاه حتى تم الحصول على مستويات كافية من الفوعة وكبح المقاومة.
تم نشر المقارنة بين الفيروسات البكتيرية وإصدارها المتكيف مع المريض مؤخرًا ومع ذلك، فإن المقارنة الجينية للفيروسات البكتيرية المتكيفة مسبقًا مع أسلافها غير المتكيفة تقع خارج نطاق هذه الدراسة.

استقرار تحضير البكتريوفاج

تمت مراقبة استقرار الفيروسات البكتيرية من خلال تحديد تركيزها عند شهريًا. APIs البكتريوفاج بتركيزات من ب.ف.ي.س احتفظوا بنشاطهم لمدة عام على الأقل يمكن تخفيف واحد أو أكثر من APIs البكتريوفاج و/أو مزجها مع ناقل (على سبيل المثال، محلول وريدي متساوي التوتر أو هيدروجيل) في تحضير صيدلاني تحت إشراف صيدلي المستشفى ووفقًا لأحكام وصفة طبية مقدمة من الطبيب المعالج للمريض. إن تخفيف ومزج أنواع مختلفة من البكتريوفاج هي أحداث يمكن أن تؤثر على استقرارها. وأظهرت التجارب أنه، بشكل عام، من الأفضل استخدام التحضيرات الصيدلانية خلال أسبوع واحد بعد تصنيعها.

بروتوكولات علاج البكتريوفاج

اقترح مركز الاتصالات العامة بروتوكولات BT استنادًا إلى تعليمات التطبيق من وزارة الصحة في الاتحاد السوفيتي. ومعهد إليافا، يمكن العثور على بعض منها في منشورات منتجاتهم من BT. هذه الوثائق (بالروسية) لا تذكر أي بيانات (منشورة). واحدة منها تنص على أن ‘تحييد البكتريوفاج يمكن أن يظهر بين 10 و 15 يومًا بعد التطبيق الوريدي’. لم نتمكن من تحديد ما إذا كانت هذه الإرشادات والتعليمات التي تعود إلى 30-40 عامًا قد تستند إلى دراسات منهجية، أو إذا كانت تعتمد إلى حد كبير على الخبرة التجريبية. لذلك، نفضل تصنيفها كدليل مستوى 5 من مركز الطب القائم على الأدلة (CEBM)، أي التوصيات التي صاغها الخبراء بناءً على تجاربهم المهنية الخاصة. من المحتمل أن تكون هذه الأدلة أيضًا مستندة إلى مراجعة البيانات من تقارير الحالة والدراسات غير المنهجية.
كانت فترات إعطاء البكتريوفاج متأثرة بشكل كبير بالمؤشرات السريرية وطرق الإعطاء. على سبيل المثال، من الأسهل تطبيق البكتريوفاج عدة مرات في اليوم على الرئتين المصابتين لمريض موصول بجهاز التنفس (التبخير) مقارنة بالجروح المحترقة المصابة (موضعي)، والتي عادة ما يتم فكها ومعالجتها مرة واحدة فقط في اليوم.
لتحضير رذاذ مستحضرات البكتريوفاج، تم التوصية باستخدام أجهزة الرذاذ من نوع الشبكة المهتزة لأنها أظهرت فقدانًا أقل في العنوان بسبب الأضرار الشكلية مقارنةً بأجهزة الرذاذ الهوائي. بالنسبة لعدوى الأطراف الصناعية العظمية والعظمية، أوصينا باستخدام قسطرة على شكل ذيل خنزير أو جهاز تصريف آخر لشطف تجاويف الجروح قبل تطبيق البكتريوفاج وللإدارة الفعلية للبكتريوفاجات. للاستخدام الموضعي، نصحنا بخلط البكتريوفاجات مع هيدروجيل مناسب. . بشكل عام، كانت بروتوكولاتنا توصي بجرعات منخفضة نسبيًا من البكتيريوفاج، عادةً ب.ف.ي.س ، وتتراوح بين ب.ف.ي.س لـ BT الوريدي المستمر إلى ب.ف.ي.س للعلاج الموضعي للبكتيريا الفيروسية في بعض حالات العدوى الجلدية. على النقيض من ذلك، تفضل بعض العيادات إعطاء جرعات أعلى بكثير، على سبيل المثال، تصل إلى وحدات تشكيل المستعمرات للعلاج الوريدي .

اختبارات تشخيصية لدعم العلاج بالبكتيريا الفيروسية

بالإضافة إلى اختبار حساسية البكتيريا الفيروسية، تم تقديم ثلاثة اختبارات داعمة للعلاج بالبكتيريا الفيروسية دون التزام لمقدمي العلاج بالبكتيريا الفيروسية للسماح بتحسين إدارة العلاج بالبكتيريا الفيروسية: (1) مراقبة ظهور مقاومة البكتيريا الفيروسية في الجسم باستخدام عينات بكتيرية متسلسلة تم عزلها خلال العلاج بالبكتيريا الفيروسية، (2) تحليل تفاعلات البكتيريا الفيروسية والمضادات الحيوية في المختبر قبل بدء العلاج بالبكتيريا الفيروسية و(3) تقييم تحييد المناعة للبكتيريا الفيروسية، أو قدرة مصل المريض على تحييد البكتيريا الفيروسية العلاجية.
اختيار مقاومة البكتيريا الفيروسية في الجسم. تم مراقبة اختيار مقاومة البكتيريا الفيروسية في الجسم باستخدام عينات بكتيرية متسلسلة تم عزلها خلال العلاج بالبكتيريا الفيروسية. تم تقييم حساسية البكتيريا الفيروسية باستخدام الطرق الموضحة سابقًا. عندما لوحظت حساسية منخفضة للبكتيريا الفيروسية، تم تسلسل جينوم العزلة وتحليله لتحديد التماثل للعزلة (مقارنة بالعزلة قبل العلاج بالبكتيريا الفيروسية) وللتحقيق في الخلفية الجينية لظاهرة مقاومة البكتيريا الفيروسية الملاحظة. لتسلسل الجينوم، تم اتباع الطريقة الموضحة في المرجع 6 مع بعض الانحرافات: لمعالجة النانو، تم استخدام Guppy (الإصدار 6.3.8) (ONT) (استدعاء القاعدة، فصل البيانات) وPorechop (الإصدار 0.2.4) (قص الشريط)https://github.com/rrwick/Porechop). تم تجميع الجينومات باستخدام Unicycler (الإصدار 0.4.8) وتم استدعاء متغيرات SNP باستخدام Snippy (الإصدار 4.6.0) (https://github.com/tseemann/snippy). تم إجراء توضيح الجينوم والتصور باستخدام EggNOG-mapper (الإصدار 2.1.8) , mobileOG-db (الإصدار 1.1.2) , Phigaro (الإصدار 2.3.0) , Circos (الإصدار 0.69.8) وGC-profile تم استخدامه. تم إجراء تحليل بان-جينوم باستخدام Roary (الإصدار 3.13.0) من الجينومات المعلنة (Prokka الإصدار 1.14.6) لإنشاء شجرة تطورية بأقصى احتمال باستخدام المحاذاة الأساسية في fasttree (الإصدار 2.1.10) وتم تصورها باستخدام iTOL (itol.embl.de) . بالنسبة لتحديد تسلسل متعدد المواقع (MLST)، تم فحص الجينومات ضد مخططات PubMLST (https://pubmlst.org/)، بما في ذلك
ST111 (O12-1709)، ST357 (B14130)، ST235 (NCGM2)، ST1233 (Pcyll-10) PAO1 (ST549) وATCC 27853 (ST155) كجينومات/أنماط تمثيلية. تم الوصول إلى البرامج Porechop وUnicycler وSnippy وEggNOG-mapper وRoary وProkka وFasttree وMLST من خلال خادم Galaxy (https://usegalaxy.eu/).
اختبارات الفوعة على دودة الجاليريا ميلونيللا. تم زراعة عشرة عزلات من P. aeruginosa (Pa30 (Is 1)، Pa 30 (Is 3)، Pa54 (Is 1)، Pa54 (Is 4) وPa91 (IS1-6)) في وسط LB (Becton Dickinson) إلى من . تم طرد ملليلتر واحد من الثقافات البكتيرية وإعادة تعليقها في DPBS معقم (Lonza). تم تجميع يرقات G. mellonella في مجموعات من 10 (موحدة للوزن) ثم تم حقنها في الساق الخلفية بأحد عينة من التخفيفات ( وحدات تشكيل المستعمرات) من الثقافات البكتيرية المغسولة. بعد العدوى، تم حضانة اليرقات في الظلام عند . تم مراقبة درجات النشاط كل 6 ساعات ومقارنتها بالتحكمات التي تم حقنها بـ DPBS. تراوحت درجات النشاط من 0 إلى 9، بناءً على مستوى النشاط (مع وبدون تحفيز)، والتصبغ والبقاء .
تفاعلات البكتيريا الفيروسية والمضادات الحيوية في المختبر. تم تحليل ديناميات نمو البكتيريا الفيروسية والمضادات الحيوية والبكتيريا بناءً على طلب الأطباء المعالجين باستخدام العزلات البكتيرية والبكتيريا الفيروسية التي تم الحصول عليها قبل بدء العلاج بالبكتيريا الفيروسية. بالنسبة للمرضى الذين تم علاجهم قبل أكتوبر 2021، تم إجراء هذه التقييمات بأثر رجعي على العزلات البكتيرية والبكتيريا الفيروسية المخزنة في في LB الجلسرين (Becton Dickinson). تم قياس تنفس البكتيريا باستخدام نظام OmniLog (Biolog). تم تقييم ديناميات نمو مسببات الأمراض البكتيرية المستهدفة في وجود البكتيريا الفيروسية فقط، والمضادات الحيوية ذات الصلة (التي سيتم استخدامها بالتزامن) فقط ومجموعات البكتيريا الفيروسية والمضادات الحيوية. تم إجراء التجارب في ثلاث نسخ (نسخ بيولوجية) في ألواح 96 بئر (Thermo Fisher) في حجم نهائي من من وسط LB أو TSB (Becton Dickinson) معزز بمزيج صبغة التترازوليوم المخفف 100 مرة A أو H (Biolog). تم تلقيح الخلايا البكتيرية بتركيز وحدات تشكيل المستعمرات لكل بئر، محسوبة على أساس القياسات وتم التحقق منها باستخدام طريقة زراعة الألواح التقليدية. تمت إضافة المضادات الحيوية والبكتيريا الفيروسية بمستويات دون الحد الأدنى من التركيز المثبط ( الحد الأدنى من التركيز المثبط) وMOIs (محسوبة على مضيف التكاثر)، على التوالي. تم تأكيد عناوين البكتيريا الفيروسية بعد كل تجربة باستخدام طريقة التغطية المزدوجة التقليدية. تم حضانة الألواح عند لمدة 72 ساعة وسجل التغيير في اللون الناتج عن تقليل صبغة التترازوليوم بسبب تنفس البكتيريا (أثناء النمو) كل 15 دقيقة بواسطة نظام OmniLog. تم تحليل النتائج باستخدام برنامج تحليل بيانات Biolog (الإصدار 1.7) وتم تصدير البيانات إلى ملفات Excel من Microsoft. قمنا بتعريف مجموعات البكتيريا الفيروسية والمضادات الحيوية على أنها تآزرية عندما تكون فترة تثبيط نمو البكتيريا الناتجة عن إضافة كل من البكتيريا الفيروسية والمضاد الحيوي أطول بوضوح من مجموع فترات التثبيط الناتجة عن البكتيريا الفيروسية والمضاد الحيوي بشكل منفصل.
تحييد المناعة للبكتيريا الفيروسية. تم تقييم إمكانية ظهور تحييد المناعة للبكتيريا الفيروسية، أو قدرة مصل المريض على تحييد البكتيريا الفيروسية العلاجية، وفقًا للمرجع 87، مع بعض التعديلات. تم جمع عينات الدم الكاملة قبل بدء العلاج بالبكتيريا الفيروسية وفي نقاط زمنية مختلفة خلال وبعد تطبيق البكتيريا الفيروسية. تم السماح للدم بالتخثر لمدة 30 دقيقة على الأقل في وضع عمودي ثم تم طرده في دوار سلة متأرجحة لمدة 10 دقائق عند في درجة حرارة الغرفة. تم تخزين عينات المصل الناتجة في . لتقييم تأثير عينات المصل على نشاط البكتيريا الفيروسية، تم خلط 0.9 مل من المصل المخفف 1:100 مع 0.1 مل من تعليق البكتيريا الفيروسية بتركيز وحدات تشكيل المستعمرات وتم حضانتها لمدة 30 دقيقة عند . تم تحديد نشاط البكتيريا الفيروسية (العنوان) قبل وبعد الحضانة مع عينات مصل المريض باستخدام اختبار الألواح المزدوجة التقليدية (كما تم وصفه سابقًا). سمح مقارنة النشاط المائي قبل وبعد الحضانة بتحديد نسبة البكتيريا الفيروسية التي تم تحييدها. تم اختبار كل عينة مصل في ثلاث نسخ.

النتيجة السريرية

تم تقييم التحسن السريري، والقضاء على البكتيريا المستهدفة وظهور وخطورة ومدة ردود الفعل أو الأحداث السلبية المشتبه بها من قبل الأطباء المعالجين. لم يتم جمع بيانات السلامة بشكل استباقي، ولم يتم تعريف الأوصاف مسبقًا للأطباء.

جمع البيانات

قبل العلاج بالبكتيريا الفيروسية، تم جمع البيانات الديموغرافية والسريرية من خلال نموذج طبي، تم ملؤه من قبل مقدمي العلاج بالبكتيريا الفيروسية. تم تسجيل وصفة الطبيب للعلاج بالبكتيريا الفيروسية، والمعلومات المتعلقة بمنتج البكتيريا الفيروسية المطبق وطريقة إدارته، والجرعة، والمدة والمعلومات المتعلقة بالعلاجات المصاحبة المحتملة (المضادات الحيوية). تم أيضًا أرشفة ‘فاغوجرامات’ التي تتعلق بتقييم حساسية البكتيريا الفيروسية لعزلات البكتيريا الخاصة بالمريض التي تم أخذها قبل وأحيانًا أثناء العلاج. إذا تم إجراء العلاج بالبكتيريا الفيروسية في مستشفى، تم ملء نموذج متابعة سريرية يطلب معلومات حول النتيجة السريرية (بما في ذلك ردود الفعل والأحداث السلبية المشتبه بها) من قبل الطبيب المعالج وفريق التمريض وإرساله إلى PTCC. في حالة العلاج بالبكتيريا الفيروسية الخارجي، تم جمع معلومات متابعة سريرية مباشرة من المرضى. تم تسجيل جميع البيانات الديموغرافية وبيانات منتج البكتيريا الفيروسية والبيانات السريرية في قاعدة بيانات مصممة باستخدام نظام جمع البيانات الإلكترونية للبحث (REDCap) . لم يتم إجراء جمع البيانات وتحليلها بشكل أعمى على ظروف التجارب.

التعريفات

وفقًا لإرشادات اقتراح خبير دولي لتعريفات المعايير المؤقتة لمقاومة الجراثيم المكتسبة، تم تعريف مقاومة الأدوية المتعددة (MDR) على أنها عدم القابلية المكتسبة على الأقل لعميل واحد في ثلاث فئات أو أكثر من الفئات المضادة للميكروبات، وتم تعريف مقاومة الأدوية الواسعة (XDR) على أنها عدم القابلية على الأقل لعميل واحد في جميع الفئات المضادة للميكروبات باستثناء فئتين أو أقل، وتم تعريف مقاومة الأدوية الشاملة (PDR) على أنها عدم القابلية لجميع العملاء في جميع الفئات المضادة للميكروبات. تم استخدام مصطلح ‘مقاومة الأدوية المعتادة’ (UDR) لوصف العزلات التي ليست حساسة تمامًا، ولكن يمكن علاجها بسهولة (على الأقل بناءً على اختبارات الحساسية في المختبر) باستخدام العلاجات القياسية. إذا استمرت العدوى لأكثر من 6 أشهر، اعتبرت ‘عدوى مزمنة’. تم تعريف التحسن السريري على أنه تحسن في عرض واحد على الأقل مرتبط بالعدوى البكتيرية، كما تم تقييمه من قبل الطبيب المعالج. لم يتم تطبيق أي مقاييس سريرية (على سبيل المثال، درجات شدة المرض). لم يتم تحديد تأثير التدخلات الأخرى (الطبية/الجراحية). تم تعريف القضاء على البكتيريا المستهدفة على أنه غياب العامل المسبب الأصلي للعدوى البكتيرية في الثقافة، أو عندما استنتج الطبيب المعالج للمريض، بناءً على مسح متابعة، أن المريض قد تم تحريره من العامل الممرض البكتيري المستهدف. لم يتم تقييم القضاء الميكروبيولوجي بشكل استباقي أو منهجي. كانت الفترة بين بدء العلاج وتقييم النتيجة السريرية تختلف وفقًا للطبيب المعالج والدلالة، وكانت تتراوح من شهر واحد إلى سنة واحدة، والأخيرة للعدوى العظمية التي يصعب علاجها.

طرق إحصائية

تم تحليل المتغيرات التالية لـ 92 من 100 مريض (لذين كانت مجموعة البيانات الكاملة متاحة): القضاء على البكتيريا المستهدفة، التحسن السريري، الاستخدام المتزامن للمضادات الحيوية، ملف مقاومة المضادات الحيوية للبكتيريا المستهدفة، ردود الفعل السلبية المشتبه بها والإعداد السريري (علاج خارجي أو مريض مقيم). كانت جميع هذه المتغيرات ثنائية الفئات. بالإضافة إلى ذلك، تم مراقبة 14 نوعًا من العدوى و21 نوعًا من البكتيريا المستهدفة بواسطة العلاج على مقاييس فئات اسمية. تم تحليل العمر والجنس على مقاييس عددية. تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام بيئة البرمجيات الإحصائية SAS (الإصدار 9.4). استخدمنا إجراء اختيار تدريجي للأمام على مجموعة بيانات مختصرة (الجدول التكميلي 2) لتحديد المتغير الأكثر معلوماتية في مجموعة البيانات، مع
المتغير ‘القضاء (ERADIC)’ كمتغير استجابة لنموذج الانحدار اللوجستي لدينا. النموذج المحتمل هو ERADIC = ‘نعم’ (أي، القضاء الناجح). تم تصوير مخطط (يسار) وجدول الطوارئ (يمين) لنموذج الانحدار اللوجستي المستخدم لتحليل مجموعة البيانات المختصرة (الجدول التكميلي 2) أدناه.
نموذج لوجيت:
جدول الطوارئ (n=92)
: التقاطع
: لا يوجد استخدام متزامن ( )
نسبة الأرجحية:
احتمال أن يكون القضاء “نعم”
احتمال “لا” القضاء
استخدام المضادات المتزامن
لا نعم
20 19
13 40
تم إجراء اختبار فيشر الدقيق باستخدام R (الإصدار 4.3.0) (https://www.Rproject.org/) ، وتم استخدام حزمة R Stats (الإصدار 4.3.2) للبحث عن الارتباطات المهمة بين المتغيرات. تم تحليل البيانات المقدمة في الشكل 1 (خصائص مجموعة المرضى) والشكل 4 (تحييد المناعة بواسطة البكتريوفاج) باستخدام R (الإصدار 4.3.0) وتم تصورها باستخدام الحزم التالية: tidyverse (الإصدار 2.0.0) ، UpSetR (الإصدار 1.4.0) ، ggmap (الإصدار 3.0.2) و rnaturalearth (إصدار حزمة R 0.3.2.9000) . تم استخدام اختبار لوغاريتم الرانك مع تصحيح بونفيروني للمقارنات المتعددة (GraphPad الإصدار 0.5.1) لمقارنات منحنى بقاء G. mellonella.

ملخص التقرير

معلومات إضافية حول تصميم البحث متاحة في ملخص تقرير Nature Portfolio المرتبط بهذه المقالة.

توفر البيانات

بروتوكولات سريرية مفصلة، نتائج وبيانات إضافية متاحة في الورقة وفي الجداول التكملية 1 و 2. البروتوكول للدراسة الاستعادية، الملاحظة متاح على https://clinicaltrials. gov/ct2/show/NCT05498363?term=NCT05498363&draw=2&rank=1. يمكن استرجاع تسلسلات جينوم البكتريوفاج في قاعدة بيانات GenBank تحت رموز الوصول المدرجة في الجدول التكميلي 3. يمكن الوصول إلى بيانات الجينوم للعزلات البكتيرية عبر NCBI BioProject PRJNA975428. جميع البيانات الأخرى التي تدعم نتائج هذه الدراسة متاحة ضمن الورقة. يمكن للقراء التقدم للحصول على الوصول إلى البيانات، والتي ستُقدم وفقًا للالتزامات والمسؤوليات التي يتحملها الباحثون تجاه المرضى المشاركين في الدراسة. يتم توفير بيانات المصدر مع هذه الورقة.

References

  1. Antimicrobial Resistance Collaborators. Global burden of bacterial antimicrobial resistance in 2019: a systematic analysis. Lancet 399, 629-655 (2022).
  2. Dublanchet, A. & Fruciano, E. Brève histoire de la phagothérapie [A short history of phage therapy]. Med. Mal. Infect. 38, 415-420 (2008).
  3. Uyttebroek, S. et al. Safety and efficacy of phage therapy in difficult-to-treat infections: a systematic review. Lancet Infect. Dis. 22, e208-e220 (2022).
  4. Pirnay, J.-P. & Kutter, E. Bacteriophages: it’s a medicine, Jim, but not as we know it. Lancet Infect. Dis. 21, 309-311 (2021).
  5. Schooley, R. T. et al. Development and use of personalized bacteriophage-based therapeutic cocktails to treat a patient with a disseminated resistant Acinetobacter baumannii infection. Antimicrob. Agents Chemother. 61, e00954-17 (2017).
  6. Eskenazi, A. et al. Combination of pre-adapted bacteriophage therapy and antibiotics for treatment of fracture-related infection due to pandrug-resistant Klebsiella pneumoniae. Nat. Commun. 13, 302 (2022).
  7. Dedrick, R. M. et al. Engineered bacteriophages for treatment of a patient with a disseminated drug-resistant Mycobacterium abscessus. Nat. Med. 25, 730-733 (2019).
  8. Pirnay, J. P. et al. The magistral phage. Viruses 10, 64 (2018).
  9. Instructions for the Administration of Liquid Staphylococcal Bacteriophage Preparations for Injection (in Russian) (Ministry of Health and Ministry of Medical and Microbiological Industry of the USSR, 1987).
  10. Instructions for the Application of Liquid Streptococcal Bacteriophage Preparations (in Russian) (Ministry of Health and Ministry of Medical and Microbiology Industry of the USSR, 1987).
  11. Instructions for the Application of Combined Liquid Pyobacteriophage Preparations (in Russian) (Ministry of Medical and Microbiology Industry of the USSR, 1989).
  12. Djebara, S. et al. Processing phage therapy requests in a Brussels military hospital: lessons identified. Viruses 11, 265 (2019).
  13. Young, M. J. et al. Phage therapy for diabetic foot infection: a case series. Clin. Ther. 45, 797-801 (2023).
  14. Vogt, D. et al. “Beyond antibiotic therapy” – Zukünftige antiinfektiöse Strategien – Update 2017 [Beyond antibiotic therapy – Future antiinfective strategies – Update 2017]. Unfallchirurg 120, 573-584 (2017).
  15. Jennes, S. et al. Use of bacteriophages in the treatment of colistin-only-sensitive Pseudomonas aeruginosa septicaemia in a patient with acute kidney injury-a case report. Crit. Care 21, 129 (2017).
  16. Lebeaux, D. et al. A case of phage therapy against pandrug-resistant Achromobacter xylosoxidans in a 12-year-old lung-transplanted cystic fibrosis patient. Viruses 13, 60 (2021).
  17. Van Nieuwenhuyse, B. et al. Bacteriophage-antibiotic combination therapy against extensively drug-resistant Pseudomonas aeruginosa infection to allow liver transplantation in a toddler. Nat. Commun. 13, 5725 (2022).
  18. Van Nieuwenhuyse, B. et al. A case of in situ phage therapy against Staphylococcus aureus in a bone allograft polymicrobial biofilm infection: outcomes and phage-antibiotic interactions. Viruses 13, 1898 (2021).
  19. Onsea, J. et al. Bacteriophage application for difficult-to-treat musculoskeletal infections: development of a standardized multidisciplinary treatment protocol. Viruses 11, 891 (2019).
  20. Ferry, T. et al. Personalized bacteriophage therapy to treat pandrug-resistant spinal Pseudomonas aeruginosa infection. Nat. Commun. 13, 4239 (2022).
  21. Racenis, K. et al. Use of phage cocktail BFC 1.10 in combination with ceftazidime-avibactam in the treatment of multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa femur osteomyelitis – a case report. Front. Med. 9, 851310 (2022).
  22. Bakuradze, N. et al. Characterization of a bacteriophage GEC_vB_ Bfr_UZM3 active against Bacteroides fragilis. Viruses 15, 1042 (2023).
  23. Paul, K. et al. Bacteriophage rescue therapy of a vancomycin-resistant Enterococcus faecium infection in a one-year-old child following a third liver transplantation. Viruses 13, 1785 (2021).
  24. Tkhilaishvili, T. et al. Successful case of adjunctive intravenous bacteriophage therapy to treat left ventricular assist device infection. J. Infect. 83, e1-e3 (2021).
  25. Racenis, K. et al. Successful bacteriophage-antibiotic combination therapy against multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa left ventricular assist device driveline infection. Viruses 15, 1210 (2023).
  26. Blasco, L. et al. Case report: analysis of phage therapy failure in a patient with a Pseudomonas aeruginosa prosthetic vascular graft infection. Front. Med. 10, 1199657 (2023).
  27. Takeuchi, I. et al. The presence of two receptor-binding proteins contributes to the wide host range of staphylococcal twort-like phages. Appl. Environ. Microbiol. 82, 5763-5774 (2016).
  28. Treepong, P. et al. Global emergence of the widespread Pseudomonas aeruginosa ST235 clone. Clin. Microbiol. Infect. 24, 258-266 (2018).
  29. Hrabák, J. et al. Regional spread of Pseudomonas aeruginosa ST357 producing IMP-7 metallo- -lactamase in Central Europe. J. Clin. Microbiol. 49, 474-475 (2011).
  30. Ceyssens, P. J. et al. Phenotypic and genotypic variations within a single bacteriophage species. Virol. J. 8, 134 (2011).
  31. Kilmury, S. L. N. & Burrows, L. L. The Pseudomonas aeruginosa PilSR two-component system regulates both twitching and swimming motilities. mBio 9, e01310-e01318 (2018).
  32. Nunn, D., Bergman, S. & Lory, S. Products of three accessory genes, pilB, pilC, and pilD, are required for biogenesis of Pseudomonas aeruginosa pili. J. Bacteriol. 172, 2911-2919 (1990).
  33. Wehbi, H. et al. The peptidoglycan-binding protein FimV promotes assembly of the Pseudomonas aeruginosa type IV pilus secretin. J. Bacteriol. 193, 540-550 (2011).
  34. Kropinski, A. M., Chan, L., Jarrell, K. & Milazzo, F. H. The nature of Pseudomonas aeruginosa strain PAO bacteriophage receptors. Can. J. Microbiol. 23, 653-658 (1977).
  35. Koderi Valappil, S. et al. Survival comes at a cost: a coevolution of phage and its host leads to phage resistance and antibiotic sensitivity of Pseudomonas aeruginosa multidrug resistant strains. Front. Microbiol. 12, 783722 (2021).
  36. Yoshida, H., Bogaki, M., Nakamura, M. & Nakamura, S. Quinolone resistance-determining region in the DNA gyrase gyrA gene of Escherichia coli. Antimicrob. Agents Chemother. 34, 1271-1272 (1990).
  37. Takenouchi, T., Sakagawa, E. & Sugawara, M. Detection of gyrA mutations among 335 Pseudomonas aeruginosa strains isolated in Japan and their susceptibilities to fluoroquinolones. Antimicrob. Agents Chemother. 43, 406-409 (1999).
  38. Yonezawa, M. et al. Analysis of the -terminal 87th amino acid of Escherichia coli GyrA in quinolone-resistance. Microbiol. Immunol. 39, 517-520 (1995).
  39. Nakajima, A., Sugimoto, Y., Yoneyama, H. & Nakae, T. High-level fluoroquinolone resistance in Pseudomonas aeruginosa due to interplay of the MexAB-OprM efflux pump and the DNA gyrase mutation. Microbiol. Immunol. 46, 391-395 (2002).
  40. Church, D., Elsayed, S., Reid, O., Winston, B. & Lindsay, R. Burn wound infections. Clin. Microbiol. Rev. 19, 403-434 (2006).
  41. Rose, T. et al. Experimental phage therapy of burn wound infection: difficult first steps. Int. J. Burns Trauma 4, 66-73 (2014).
  42. Pirnay, J.-P. Phage therapy in the year 2035. Front. Microbiol. 11, 1171 (2020).
  43. Suh, G. A. et al. Considerations for the use of phage therapy in clinical practice. Antimicrob. Agents Chemother. 66, e0207121 (2022).
  44. Luria, S. E. & Delbrück, M. Mutations of bacteria from virus sensitivity to virus resistance. Genetics 28, 491-511 (1943).
  45. Castledine, M. et al. Parallel evolution of Pseudomonas aeruginosa phage resistance and virulence loss in response to phage treatment in vivo and in vitro. Elife 11, e73679 (2022).
  46. Westra, E. R. et al. Parasite exposure drives selective evolution of constitutive versus inducible defense. Curr. Biol. 25, 1043-1049 (2015).
  47. Gu Liu, C. et al. Phage-antibiotic synergy is driven by a unique combination of antibacterial mechanism of action and stoichiometry. mBio 11, e01462-20 (2020).
  48. Fungo, G. B. N. et al. “Two Is Better Than One”: the multifactorial nature of phage-antibiotic combinatorial treatments against ESKAPE-induced infections. Phage 4, 55-67 (2023).
  49. Torres-Barceló, C. & Hochberg, M. E. Evolutionary rationale for phages as complements of antibiotics. Trends Microbiol. 24, 249-256 (2016).
  50. Torres-Barceló, C. Phage therapy faces evolutionary challenges. Viruses 10, 323 (2018).
  51. Chan, B. K. et al. Phage selection restores antibiotic sensitivity in MDR Pseudomonas aeruginosa. Sci. Rep. 6, 26717 (2016).
  52. Abedon, S. T. Phage-antibiotic combination treatments: antagonistic impacts of antibiotics on the pharmacodynamics of phage therapy? Antibiotics 8, 182 (2019).
  53. Górski, A. et al. Phage as a modulator of immune responses: practical implications for phage therapy. Adv. Virus Res. 83, 41-71 (2012).
  54. Instructions for the Application of a Liquid Staphylococcal Phage Preparation for Injection (in Russian) (Ministry of Health of the USSR, 1986).
  55. Dedrick, R. M. et al. Potent antibody-mediated neutralization limits bacteriophage treatment of a pulmonary Mycobacterium abscessus infection. Nat. Med. 27, 1357-1361 (2021).
  56. Onsea, J. et al. Bacteriophage therapy for difficult-to-treat infections: the implementation of a multidisciplinary phage task force (The PHAGEFORCE Study Protocol). Viruses 13, 1543 (2021).
  57. Regulation (EU) No 536/2014 OF THE European Parliament and of the Council of 16 April 2014 on Clinical Trials On Medicinal Products For Human Use, And Repealing Directive 2001/20/EC (Official Journal of the European Union, 2014).
  58. Merabishvili, M. et al. Quality-controlled small-scale production of a well-defined bacteriophage cocktail for use in human clinical trials. PLoS ONE 4, e4944 (2009).
  59. Bolger, A. M., Lohse, M. & Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics 30, 2114-2120 (2014).
  60. Wick, R. R., Judd, L. M., Gorrie, C. L. & Holt, K. E. Unicycler: resolving bacterial genome assemblies from short and long sequencing reads. PLoS Comput. Biol. 13, e1005595 (2017).
  61. Prjibelski, A., Antipov, D., Meleshko, D., Lapidus, A. & Korobeynikov, A. Using SPAdes de novo assembler. Curr. Protoc. Bioinformatics 70, e102 (2020).
  62. Seemann, T. Prokka: rapid prokaryotic genome annotation. Bioinformatics 30, 2068-2069 (2014).
  63. Arndt, D. et al. PHASTER: a better, faster version of the PHAST phage search tool. Nucleic Acids Res. 44, W16-W21 (2016).
  64. Song, W. et al. Prophage Hunter: an integrative hunting tool for active prophages. Nucleic Acids Res. 47, W74-W80 (2019).
  65. Kutter, E. Phage host range and efficiency of plating. Methods Mol. Biol. 501, 141-149 (2009).
  66. Friman, V. P. et al. Pre-adapting parasitic phages to a pathogen leads to increased pathogen clearance and lowered resistance evolution with Pseudomonas aeruginosa cystic fibrosis bacterial isolates. J. Evol. Biol. 29, 188-198 (2016).
  67. Appelmans, R. Le dosage du Bacteriophage. (in French) Compt. Rend. Soc. Biol. 85, 1098 (1921).
  68. Burrowes, B. H., Molineux, I. J. & Fralick, J. A. Directed in vitro evolution of therapeutic bacteriophages: the Appelmans Protocol. Viruses 11, 241 (2019).
  69. Department for Industrial Bacterial and Viral Preparations. Guidelines for the Production of Combined Pyobacteriophage Solutions. N242-82 (in Russian) (Ministry of Health of the USSR, 1982).
  70. Guidelines for the Production of Staphylococcal Bacteriophage Solutions for Injection (in Russian) (Ministry of Health of the USSR, 1986).
  71. Department for the Monitoring of the Introduction of New Medicines and Medical Equipment. Staphylococcal Bacteriophage Solutions for Injection. ВФС 42-68BC-87 (in Russian) (Ministry of Health of the USSR, Pharmacopoeia Commission, 1987).
  72. Pharmacopoeia Article Concerning Combined Pyobacteriophage Solutions. AC 42-240BC-8 (in Russian) (Ministry of Health of the USSR, Pharmacopoeia Commission, 1989).
  73. Merabishvili, M., Pirnay, J.-P. & De Vos, D. Guidelines to compose an ideal bacteriophage cocktail. Methods Mol. Biol. 1693, 99-110 (2018).
  74. Duyvejonck, H. et al. Evaluation of the stability of bacteriophages in different solutions suitable for the production of magistral preparations in Belgium. Viruses 13, 865 (2021).
  75. Merabishvili, M. et al. Stability of bacteriophages in burn wound care products. PLoS ONE 12, e0182121 (2017).
  76. Astudillo, A., Leung, S. S. Y., Kutter, E., Morales, S. & Chan, H. K. Nebulization effects on structural stability of bacteriophage PEV 44. Eur. J. Pharm. Biopharm. 125, 124-130 (2018).
  77. Carrigy, N. B. et al. Anti-tuberculosis bacteriophage D29 delivery with a vibrating mesh nebulizer, jet nebulizer, and soft mist inhaler. Pharm. Res. 34, 2084-2096 (2017).
  78. Aslam, S. et al. Lessons learned from the first 10 consecutive cases of intravenous bacteriophage therapy to treat multidrug-resistant bacterial infections at a single center in the United States. Open Forum Infect. Dis. 7, ofaa389 (2020).
  79. Cano, E. J. et al. Phage therapy for limb-threatening prosthetic knee Klebsiella pneumoniae infection: case report and in vitro characterization of anti-biofilm activity. Clin. Infect. Dis. 73, e144-e151 (2021).
  80. Cantalapiedra, C. P., Hernández-Plaza, A., Letunic, I., Bork, P. & Huerta-Cepas, J. eggNOG-mapper v2: functional annotation, orthology assignments, and domain prediction at the metagenomic scale. Mol. Biol. Evol. 38, 5825-5829 (2021).
  81. Brown, C. L. et al. mobileOG-db: a manually curated database of protein families mediating the life cycle of bacterial mobile genetic elements. Appl. Environ. Microbiol. 88, e0099122 (2022).
  82. Starikova, E. V. et al. Phigaro: high-throughput prophage sequence annotation. Bioinformatics 36, 3882-3884 (2020).
  83. Krzywinski, M. et al. Circos: an information aesthetic for comparative genomics. Genome Res. 19, 1639-1645 (2009).
  84. Gao, F. & Zhang, C. T. GC-Profile: a web-based tool for visualizing and analyzing the variation of GC content in genomic sequences. Nucleic Acids Res. 34, W686-W691 (2006).
  85. Page, A. J. et al. Roary: rapid large-scale prokaryote pan genome analysis. Bioinformatics 31, 3691-3693 (2015).
  86. Letunic, I. & Bork, P. Interactive Tree Of Life (iTOL) v5: an online tool for phylogenetic tree display and annotation. Nucleic Acids Res. 49, W293-W296 (2021).
  87. Adams, M. H. Bacteriophages (Interscience Publishers, 1959).
  88. Harris, P. A. et al. Research electronic data capture (REDCap) a metadata-driven methodology and workflow process for providing translational research informatics support. J. Biomed. Inform. 42, 377-381 (2009).
  89. Magiorakos, A. P. et al. Multidrug-resistant, extensively drug-resistant and pandrug-resistant bacteria: an international expert proposal for interim standard definitions for acquired resistance. Clin. Microbiol. Infect. 18, 268-281 (2012).
  90. McDonnell, A. et al. Efficient delivery of investigational antibacterial agents via sustainable clinical trial networks. Clin. Infect. Dis. 63, S57-S59 (2016).
  91. R Core Team. R: A Language and Environment for Statistical Computing (R Foundation for Statistical Computing, 2016).
  92. Wickham, H. et al. Welcome to the tidyverse. J. Open Source Softw. 4, 1686 (2019).
  93. Conway, J. R., Lex, A. & Gehlenborg, N. UpSetR: an R package for the visualization of intersecting sets and their properties. Bioinformatics 33, 2938-2940 (2017).
  94. Kahle, D. & Wickham, H. ggmap: spatial visualization with ggplot2. R J. 5, 144-161 (2013).
  95. Massicotte, P. & South, A. rnaturalearth: world map data from natural earth. R package version 0.3.2.9000 https://cran.r-project. org/package=rnaturalearth (2023).

الشكر والتقدير

تم تحمل معظم تكاليف البحث والتطوير والتصنيع من قبل المعهد الملكي العالي للدفاع، QAMH، Sciensano و KU Leuven. تم دعم C.C. و G.S. و M.M. و T.G. من قبل المعهد الملكي العالي للدفاع، بروكسل، بلجيكا. تم دعم C.L. من خلال تفويض ما بعد الدكتوراه من KU Leuven (PDMt2/21/038) وزمالة ما بعد الدكتوراه الشابة من مؤسسة البحث فلاندرز (FWO) (12D8623N). لم يكن من الممكن أن تتم هذه العمل دون دعم E. Kutter و M. Vaneechoutte و R. Adamia و A. Vanderkelen و P. Neirinckx و G. Laire. لم يكن للممولين دور في التصور أو التصميم أو جمع البيانات أو التحليل أو اتخاذ القرار للنشر أو إعداد المخطوطة.

مساهمات المؤلفين

M.M. و G.S. و J.G. و N.C. و M.K. و C.C. و T.G. و S.D.S. و مانحي البكتريوفاج عزلوا وميزوا وجعلوا البكتريوفاجات متاحة للاستخدام السريري. قام M.M. و G.S. و J.G. بإجراء المطابقة في المختبر (فاغوغرام) للبكتريوفاجات مع البكتيريا المسببة للعدوى لدى المرضى. قام M.M. و B.V.N. بإجراء اختبارات تفاعل البكتريوفاج والمضادات الحيوية. قام M.M. و G.S. و J.G. بإنتاج APIs للبكتريوفاج وجزء كبير من تحضيرات البكتريوفاج الماجسترالية. قام M.d.J. و P.-J.C. و J.W. و C.L. و S.G. و R.L. و مانحي البكتريوفاج بتسلسل وتحليل الجينومات للبكتريوفاجات والبكتيريا المختارة. صمم S.G. وأجرى تجارب Galleria mellonella. قام M.M. و B.V.N. و J.O. بإجراء اختبارات تحييد المناعة بواسطة البكتريوفاج. قام M.d.J. و P.-J.C. و J.-P.D. و G.V. بتصميم نظام إدارة الجودة، وأجروا وحققوا في مراقبة الجودة لتحضيرات البكتريوفاج. قام S.D. و J.O. و B.V.N. و N.C. و M.K. و P.S. و J.-P.P. بفحص طلبات العلاج بالبكتريوفاج، واختيار وتنسيق حالات العلاج بالبكتريوفاج، بما في ذلك اقتراح بروتوكولات العلاج بالبكتريوفاج. سهل S.D. و A.S. و E.V.B. و D.D.V. و J.-P.P. أو أجروا حالات العلاج بالبكتريوفاج. قام E.S. و C.L. و J.-P.P. بإجراء التحليل الإحصائي. قام C.L. و S.G. و J.-P.P. بإعداد الأشكال والجداول. أعد J.-P.P. المسودة الأولى من الورقة. قام جميع المؤلفين بمراجعة النسخة النهائية ووافقوا على تقديم النسخة النهائية.

المصالح المتنافسة

R.N.-P. كان مستشارًا علميًا لشركة BiomX Inc.، وشارك وكان محققًا رئيسيًا وعضوًا في مجالس مراقبة سلامة البيانات لتجربة سريرية من قبل Technophage S. A. M.D.L. و N.C. هما مؤسسا شركة Fagoterapia Lab s.r.l. T.F. هو المحقق الرئيسي لدراسة PhagoDAIR I وهو
استشاري لشركة PHAXIAM لتصميم التجارب السريرية (لا تمويل مباشر، عقد موقّع مع hospices Civils de Lyon). R.N.-P. و S.M. و T.F. و J.-P.P.، على التوالي، يشغلون مناصب رئيس، سكرتير، مسؤول التعليم/المسؤول السريري وضابط العلوم في مجموعة دراسة ESCMID للعلاج المضاد للبكتيريا غير التقليدي (ESGNTA)، بازل، سويسرا.

معلومات إضافية

البيانات الموسعة متاحة لهذه الورقة على https://doi.org/10.1038/s41564-024-01705-x.
المعلومات التكميلية النسخة الإلكترونية تحتوي على مواد تكميلية متاحة على https://doi.org/10.1038/s41564-024-01705-x.
يجب توجيه المراسلات والطلبات للحصول على المواد إلى جان-بول بيرني.
معلومات مراجعة الأقران تشكر مجلة Nature Microbiology جيريمي بار، جوناثان إيريديل، فرانك كلاوون وروبرت سكولي على مساهمتهم في مراجعة هذا العمل. تقارير مراجعي الأقران متاحة.
معلومات إعادة الطباعة والتصاريح متاحة علىwww.nature.com/reprints.
ملاحظة الناشر: تظل شركة سبرينجر ناتشر محايدة فيما يتعلق بالمطالبات القضائية في الخرائط المنشورة والانتماءات المؤسسية.
الوصول المفتوح هذه المقالة مرخصة بموجب رخصة المشاع الإبداعي النسب 4.0 الدولية، التي تسمح بالاستخدام والمشاركة والتكيف والتوزيع وإعادة الإنتاج بأي وسيلة أو صيغة، طالما أنك تعطي الائتمان المناسب للمؤلفين الأصليين والمصدر، وتوفر رابطًا لرخصة المشاع الإبداعي، وتوضح إذا ما تم إجراء تغييرات. الصور أو المواد الأخرى من طرف ثالث في هذه المقالة مشمولة في رخصة المشاع الإبداعي الخاصة بالمقالة، ما لم يُشار إلى خلاف ذلك في سطر الائتمان للمواد. إذا لم تكن المادة مشمولة في رخصة المشاع الإبداعي الخاصة بالمقالة وكان استخدامك المقصود غير مسموح به بموجب اللوائح القانونية أو يتجاوز الاستخدام المسموح به، فسيتعين عليك الحصول على إذن مباشرة من صاحب حقوق الطبع والنشر. لعرض نسخة من هذه الرخصة، قم بزيارةhttp://creativecommons. org/licenses/by/4.0/.
(ج) المؤلفون 2024

جان-بول بيرني سارة جبارة غريت ستورز يوهان غريزيلان كريستيل كوشيه ستيفن دي سوار تي غلنتي أن سبايسنز إميلي فاندن بيرغ سابرينا غرين © جيرون واغيمانس © سيدريك لود © إيدي شريفنز نينا تشانيشفيلي مزية كوتاتيلادزه (1) ماثيو دي جود بيتر-يان سيسينس جان-بيير دراي غيلبرت فيربكين دانيال دي فوس¹، توماس روز¹، جوليين أونسي بريوك فان نيوينهويز © مقدمو علاج البكتريوفاج*، متبرعو البكتريوفاج*، باتريك سونتينس روب لافين © ومايا ميرابيشفلي

مقدمو علاج البكتريوفاج

كيم وين بانغ ويليم-يان ميتسماكرز ديمتري فان دير ليندن أولغا شاتزيس أنايس إسكينازي أنجل لوبيز أدريان دي فويغت آن فرانçois روسو آن تيلمان دافني فينز جان جيرين بريس لايو إريكا فليغه إنغريد بار سابرين فان إيرسل يوهان فان ليتيم جوليان جيو صوفي دي روك سيرج جينيس سارتجي أويتبروك لورا فان جيرفن بيتر و. هيلينغز ليفين دوبونت إيف ديبايف ديفيد ديفولدر إيزابيل سبرية بول دي مونتر ميليسا ديبيبر ميشيل فانفليترن أوليفييه كورنو ستين فيرهولست تين بوي ستوفل لاموت ثيبوت فان زيل غريغوار وييرس سيسيل كورتان ديفيد ليبو جاك سارتر تريستان فيري فريديريك لوران كيفن بول ماريا غراتسيا دي لوكا ستيفان غوتشليتش تمتا تخيلايشفيلي نوفيللا سيتا كارليس راسينس تلما باربوسا لويس إدواردو لوبيز-كورتيس ماريا توماس مارتن هوبر ترونغ-ثانه فام بول ناغتيغال ياب تين أوفر يوهانس دانييلز مارتجي لوبرت غرياني إحب يوشوا جونز ليزلي هول وماثيو يونغ

مانحو البكتريوفاج

نانا بالارجشفيلي مارينا تيدياشفيلي يغانغ تونغ كريستين رود يوهانس ويتمن رونين هازان ران نير-باز جوانا أزيريدو فيكتور كريلوف ديفيد كاميرون ميليسا بيتون يوك-آي كوي غريغوري ريش شونا مكالين ماثيو دان و صموئيل كيلشر
كلية علوم الحياة والتكنولوجيا، جامعة بكين للتكنولوجيا الكيميائية، بكين، الصين. معهد لايبنيز DSMZ، المجموعة الألمانية للميكروبات وزراعة الخلايا GmbH، براونشفايغ، ألمانيا. مركز العلاج بالفيروسات البكتيرية الإسرائيلي (IPTC) في مركز هداسا الطبي وجامعة العبرية، القدس، إسرائيل. قسم الهندسة البيولوجية، جامعة مينهو، براغا، البرتغال. معهد ميشنكوف لأبحاث اللقاحات والامصال، موسكو، روسيا. قسم طب العناية المركزة، مستشفى جامعة برن، جامعة برن، برن، سويسرا. مختبر البكتريوفاجات، مستشفى جامعة لوزان، لوزان، سويسرا. قسم الأعصاب والمسالك البولية، مستشفى بالغرست الجامعي، جامعة زيورخ، زيورخ، سويسرا. معهد الغذاء والتغذية والصحة، ETH زيورخ، زيورخ، سويسرا.
البيانات الموسعة الجدول 1 | الخصائص الأساسية لـ 100 مريض متتاليين تم علاجهم باستخدام البكتريوفاجات
الخصائص الأساسية لـ 100 مريض تم تحليلهم
عدد الحالات 100
الجنس (أنثى)، % )* ٤٣.٣٪ (٣٩)
فئة العمر، % ( )*
0 إلى أقل من 24 شهرًا 5.6% (5)
من 2 إلى أقل من 20 سنة 13.3% (12)
من 20 إلى أقل من 40 سنة 14.4% (13)
40 إلى أقل من 60 سنة 33.3% (30)
60 إلى أقل من 80 سنة 28.9% (26)
80 إلى أقل من 100 سنة ٤.٤٪ (٤)
إعداد الرعاية، % ( )
مُستشفى 77% (77)
الرعاية المتنقلة 21% (21)
الرعاية في المستشفى والرعاية المتنقلة 2% (2)
السياق التنظيمي، % )
معيار الرعاية مع تحضيرات البكتريوفاج المخصصة ٤٨٪ (٤٨)
المادة 37 من إعلان هلسنكي 39% (39)
معيار الرعاية مع الأدوية غير المرخصة 10% (10)
“ترخيص مؤقت للاستخدام” للتحضيرات الصيدلانية 3% (3)
أنواع العدوى، % )**
عدوى الجهاز التنفسي السفلي 25.4% (29)
عدوى الجلد والأنسجة الرخوة 22.8% (26)
عدوى العظام 14.0% (16)
عدوى الجهاز التنفسي العلوي 11.4% (13)
عدوى مجرى الدم 8.8% (10)
عدوى البطن 5.3% (6)
عدوى الأطراف الصناعية العظمية 5.3% (6)
عدوى المسالك البولية 1.8% (2)
آخر 5.3% (6)
ملف مقاومة المضادات الحيوية للعدوى المستهدفة، % )**
مقاومة الأدوية المعتادة ٤٧.٤٪ (٥٤)
مقاومة متعددة الأدوية 25.4% (29)
مقاومة شديدة للأدوية 20.2% (23)
مقاومة الأدوية المتعددة 5.3% (6)
مقاومة شديدة للأدوية ومقاومة متعددة للأدوية 0.9% (1)
مقاومة شديدة للأدوية ومقاومة عادية 0.9% (1)
علاج المضادات الحيوية القياسي المرافق، % ( )** 69.3% (79)
  • (لـ 10 مرضى، لم يتم الكشف عن العمر والجنس) ** (بما في ذلك 14 عدوى في موقع ثانوي).
البيانات الموسعة الجدول 2 | خصائص حالات علاج البكتريوفاج التي استدعت التكيف المسبق للبكتريوفاجات
رقم المريض نوع العدوى الأنواع البكتيرية المستهدفة بكتيريوفاجات مُهيأة مسبقًا # مقاطع تسلسلية مستخدمة للتكيف المسبق إجهاد التكاثر المستخدم في الإنتاج تحسن سريري القضاء على البكتيريا المستهدفة
9 عدوى مرتبطة بالكسور كليبسيلا الرئوية M1 15 ضغط المريض نعم نعم
16 عدوى زراعة الرئة في التليف الكيسي أكروموباكتر زيلوسوكسيادانس JWAlpha، JWDelta، JWT، و 2-1 (APC 1.1 و APC 2.1) ٣ ضغط المريض نعم نعم
40 التهاب العظم والنخاع المزمن باكتيرويدس فراجيلس UZM3 ٤ ضغط المريض لا لا
43 عدوى زراعة الرئة إنترococcus فاسيوم إفجر كن وإفجر إن جي 2 ضغط المريض نعم لا
٤٦ توسع القصبات المنتشر المكورات العنقودية الذهبية ستينوتروفوموناس مالطوفيلية مزود خدمة الإنترنت BUCT700 ٦ ٢ ضغط المريض نعم لا
٥٥ عدوى الركبة الاصطناعية المكورات العنقودية الإيبييديرميديس مزود خدمة الإنترنت* ٤ ATCC6538 لا لا
66 عدوى الرئة الناتجة عن التليف الكيسي المتفطرة السلية 8UZL ٥ ضغط المريض لا لا
82 عدوى الرئة الناتجة عن التليف الكيسي المكورات الزائفة الأرجوانية 4P و DP1 ٣ 573 نعم نعم
*تم تكييف بكتيريوفاج ستافيلوكوكوس أوريوس ISP مسبقًا (باستخدام 4 تمريرات متسلسلة) على خمسة سلالات، من خمسة مرضى مختلفين، لاستهداف سلالات ستافيلوكوكوس إpidermidis بشكل أفضل.
البيانات الموسعة الجدول 3 | ردود الفعل السلبية المشتبه بها والأحداث في 100 حالة علاج بالبكتريوفاج المتتالية، المبلغ عنها باستخدام مصطلحات EudraVigilance
رقم المريض معلومات عن الأدوية رد فعل / حدث
دواء (منتج بكتريوفاج) طريق الإعطاء مدة الإدارة (أيام) إشارة مدرا LLT المدة (بالأيام) علاقة الدواء بالتفاعل/الحدث إجراء تم اتخاذه مع الدواء نتيجة جدية
٣ BFC 1 تنفسي (استنشاق) ٤ عدوى الجهاز التنفسي السفلي صدمة إنتانية 2 غير مشبوه سحب الدواء قاتل الموت
11 بي إف سي 2 تنفسي (استنشاقي) وفموي 10 عدوى الجهاز التنفسي السفلي السعال بعد استنشاق الدواء* ٦ مشتبه به الجرعة لم تتغير تم الشفاء / تم الحل غير جاد
20 BFC 1 داخل الورم وداخل الوريد 7 (داخل الورم) 86 (عن طريق الوريد) عدوى البطن والدم انزعاج بطني* 2 مشتبه به سحب الدواء تم الشفاء / تم الحل غير جاد
31 مزود خدمة الإنترنت أنفي 21 عدوى الأذن والأنف والحنجرة شفاه متهورة* 1 مشتبه به سحب الدواء تم الشفاء / تم الحل غير جاد
٣٩ مزود خدمة الإنترنت داخل الآفة 10 عدوى العظام حمى* 1 مشتبه به الجرعة لم تتغير تم الشفاء / تم الحل غير جاد
42 بايوفاج (إيلايفا) داخل الآفة ٧ عدوى العظام احمرار وألم في موقع التطبيق* 1 مشتبه به الجرعة لم تتغير تم الشفاء / تم الحل غير جاد
٤٤ M1 التنفس (الاستنشاق) وداخل المثانة 14 (تنفسي) 10 (داخل المثانة) عدوى الجهاز التنفسي السفلي وعدوى الجهاز البولي صدمة إنتانية 11 غير مشبوه سحب الدواء قاتل الموت
٥٨ مزود خدمة الإنترنت موضعي ٦ عدوى القدم السكري فشل القلب ٢ غير مشبوه سحب الدواء تم الشفاء / تم الحل يهدد الحياة
69 M1 داخل الآفة ١٨ عدوى البطن صدمة قلبية غير معروف غير مشبوه سحب الدواء قاتل الموت
79 PNM و PTO7 وريدي ٤ التهاب الفقرات والقرص المزمن انسداد الأمعاء بعد الجراحة 1 غير مشبوه سحب الدواء قاتل الموت
٨٨ E4 و Efs7 داخل المفصل وداخل الوريد 3 (داخل المفصل) 15 (وريدي) عدوى العظام زيادة في درجة حرارة الجسم* 1 مشتبه به الجرعة لم تتغير تم الشفاء / تم الحل غير جاد
93 14-1 داخل الآفة والتنفس (استنشاق) 7 (داخل الآفة) 14 (تنفسي) الانصباب الجنبي وسرطان الخلايا الشوكية تقدم الورم والرعاية التلطيفية 10** غير مشبوه سحب الدواء قاتل الموت
96 14-1، PNM و PTO7 موضعي ووريدي 1 (موضعي) 5 (وريدي) عدوى الحروق وعدوى مجرى الدم صدمة إنتانية ٤ غير مشبوه سحب الدواء قاتل الموت
99 مزود خدمة الإنترنت أنفي 21 التهاب الجيوب الأنفية المزمن إسهال وألم في البطن* ٢٥ مشتبه به الجرعة لم تتغير تم الشفاء / تم الحل غير جاد
100 مزود خدمة الإنترنت داخل الآفة ٧ عدوى جرح جراحي مع ناسور غثيان 1 غير مشبوه الجرعة لم تتغير تم الشفاء / تم الحل غير جاد
تم الاشتباه في العلاقة بين BT والحدث وتم الإبلاغ عنها. **توفي المرضى بعد 10 أيام من بدء الرعاية التلطيفية ووقف BT.
الشكل البياني الممتد 1| عملية اختيار المرضى في مركز تنسيق علاج الفيروسات البكتيرية لعلاج الفيروسات البكتيرية.
مَوْقِع أثر علامة الموقع منتج موضح تنبؤ HHPRED/HMMER/Phyre
41566 متغير خطأ في المعنى c.1745A>C p.Lys582Thr HOQ69_gp039 بروتين هيكلي (ESI-MS) بروتين مجال ربط الكربوهيدرات المفترض (فيروس المكورات العنقودية K)
43215 متغير خطأ في المعنى c.1068G>T p.Lys356Asn HOQ69_gp041 بروتين هيكلي (ESI-MS) بروتين ربط المستقبل المفترض (فيروس المكورات العنقودية K)
60502 متغير خطأ في المعنى c.91T>C p.Ser31Pro HOQ69_gp060 بوليميراز الحمض النووي المفترض غليكوزيلاز اليوراسيل-DNA
82393 متغير خطأ في المعنى c.170G>A p.Ser57Asn HOQ69_gp095 بروتين افتراضي /
الشكل البياني الموسع 2 | طفرات تغيير المعنى في المتغير المعدل مسبقًا لـ S0022283617305879)، HMMR (https://nar.oxfordjournals.org/content/46/W1/
بكتريوفاج ISP، مقارنةً بالنسخة الأصلية (قبل التكيف). تم استخدام W200) و Phyre (https://www.nature.com/articles/nprot.2009.2)
HHpred (https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/ للتنبؤ الوظيفي. مطيافية الكتلة بتقنية التأين بالرش الكهربائي.
الشكل 3 من البيانات الموسعة | مخططات كابلان-ماير ودرجات النشاط ليرقات جاليريا ميلونيللا بعد العدوى. تم تلقيح عشرة يرقات في كل مجموعة إما بمحلول ملحي فوسفاتي (PBS، مجموعة التحكم)، أو بالعزلات القابلة للإصابة بالبكتريوفاج الأولية (النوع البري، wt)، أو بالطفرات المقاومة للبكتريوفاج المختارة في الجسم من سلالات الزائفة الزنجارية.
معزولة من المريض (P) 91، 54، و30. أ-ب، P54 (Is1 و4). ج-د، P30 (Is1 و3). هـ-و، P91 (Is1 إلى 6). تمثل القيم المتوسطة لدرجات النشاط برمز نقطة. تم حساب القيم باستخدام اختبار لوغ-رانك مع تصحيح بونفيروني للمقارنات المتعددة. Is، عزل؛ mut، طفرة.
الشكل 4 من البيانات الموسعة | نتائج التقييم في المختبر لتأثير تعدد حالات العدوى المتسلسلة (MOIs) على الضراوة وعلى قمع المقاومة لفيروس العاثية Pseudomonas aeruginosa 4 K على
سلالة البكتيريا المضيفة CN573، كما تم تحديدها في الثقافة السائلة، باستخدام نظام OmniLog. يتم تقديم تكاثر البكتيريا من خلال وحدات نسبية من التنفس الخلوي على مدى الوقت (72 ساعة).

محفظة الطبيعة

المؤلف (المؤلفون) المراسلون: جان-بول بيرني
آخر تحديث من المؤلفين: 27 مارس 2024

ملخص التقرير

تسعى Nature Portfolio إلى تحسين إمكانية تكرار العمل الذي ننشره. يوفر هذا النموذج هيكلًا للاتساق والشفافية في التقرير. لمزيد من المعلومات حول سياسات Nature Portfolio، يرجى الاطلاع على سياسات التحرير وقائمة مراجعة سياسة التحرير.

الإحصائيات

لجميع التحليلات الإحصائية، تأكد من أن العناصر التالية موجودة في أسطورة الشكل، أسطورة الجدول، النص الرئيسي، أو قسم الطرق.

تم التأكيد


حجم العينة بالضبط ( ) لكل مجموعة/شرط تجريبي، معطاة كرقم منفصل ووحدة قياس

بيان حول ما إذا كانت القياسات قد أُخذت من عينات متميزة أو ما إذا كانت نفس العينة قد تم قياسها عدة مرات

اختبار(ات) الإحصاء المستخدمة وما إذا كانت أحادية الجانب أو ثنائية الجانب
يجب أن تُوصف الاختبارات الشائعة فقط بالاسم؛ واصفًا التقنيات الأكثر تعقيدًا في قسم الطرق.

وصف لجميع المتغيرات المشتركة التي تم اختبارها

وصف لأي افتراضات أو تصحيحات، مثل اختبارات الطبيعية والتعديل للمقارنات المتعددة

وصف كامل للمعلمات الإحصائية بما في ذلك الاتجاه المركزي (مثل المتوسطات) أو تقديرات أساسية أخرى (مثل معامل الانحدار) وَ التباين (مثل الانحراف المعياري) أو تقديرات مرتبطة بعدم اليقين (مثل فترات الثقة)
إكس
لاختبار الفرضية الصفرية، إحصائية الاختبار (على سبيل المثال، ) مع فترات الثقة، أحجام التأثير، درجات الحرية و قيمة ملحوظة أعطِ القيم كقيم دقيقة كلما كان ذلك مناسبًا.
لتحليل بايزي، معلومات حول اختيار القيم الأولية وإعدادات سلسلة ماركوف مونت كارلو
للتصاميم الهرمية والمعقدة، تحديد المستوى المناسب للاختبارات والتقارير الكاملة عن النتائج
تقديرات أحجام التأثير (مثل حجم تأثير كوهين) بيرسون )، مما يشير إلى كيفية حسابها
تحتوي مجموعتنا على الويب حول الإحصائيات لعلماء الأحياء على مقالات تتناول العديد من النقاط المذكورة أعلاه.

البرمجيات والشيفرة

معلومات السياسة حول توفر كود الكمبيوتر

جمع البيانات

REDCap (نظام جمع البيانات الإلكترونية للبحوث) وMicrosoft Excel (الإصدار 16.77)

تحليل البيانات

تريموماتيك (الإصدار 0.32)، غابي (الإصدارات 6.0.1 و 6.3.8)، يوني سايكلر (الإصدارات 0.4.7 و 0.4.8)، SPAdes (إصدار جالاكسي 3.15.4+)، بروكا (الإصدار جالاكسي 1.14.6)، فاسترhttps://phaster.ca/), صائد البروفيج (https://pro-hunter.bgi.com/“), برنامج تحليل بيانات البيولوجيا (الإصدار 1.7)، Porechop (الإصدار 0.2.4)، Snippy (الإصدار 4.6.0)، EggNOG-mapper (الإصدار 2.1.8)، mobileOG-db (الإصدار 1.1.2)، Phigaro (الإصدار 2.3.0)، circos (الإصدار 0.69.8)، و GC-profile، Roary (الإصدار 3.13.0)، fasttree (الإصدار 2.1.10)، iTOL (itol.embl.de), قاعدة بيانات PHROGS v3 (النسخة 9.4 من SAS، النسخة 4.3.0 من R، النسخة 2.0.0 من tidyverse، النسخة 1.4.0 من UpSetR، النسخة 3.0.2 من ggmap، النسخة 0.3.2.9000 من حزمة rnaturalearth، والنسخة 0.5.1 من GraphPad V)، https://phrogs.lmge.uca.fr/)ARG-ANNOT (ARG-ANNOT NT V6 يوليو 2019)، CARD (الإصدارات 3.1.4 إلى 3.2.5)، ResFinder (https://bitbucket.org/genomicepidemiology/resfinder_db), واجهة الويب لـ blastn (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), قاعدة بيانات VFDB الكاملة (تم تنزيلها في 20 أبريل 2022)، Bowtie2 (إصدار جالاكسي 2.5.0)
بالنسبة للمخطوطات التي تستخدم خوارزميات أو برامج مخصصة تكون مركزية في البحث ولكن لم يتم وصفها بعد في الأدبيات المنشورة، يجب أن تكون البرمجيات متاحة للمحررين والمراجعين. نحن نشجع بشدة على إيداع الشيفرة في مستودع مجتمعي (مثل GitHub). راجع إرشادات مجموعة Nature لتقديم الشيفرة والبرمجيات لمزيد من المعلومات.

بيانات

معلومات السياسة حول توفر البيانات

يجب أن تتضمن جميع المخطوطات بيانًا حول توفر البيانات. يجب أن يتضمن هذا البيان المعلومات التالية، حيثما ينطبق:
  • رموز الانضمام، معرفات فريدة، أو روابط ويب لمجموعات البيانات المتاحة للجمهور
  • وصف لأي قيود على توفر البيانات
  • بالنسبة لمجموعات البيانات السريرية أو بيانات الطرف الثالث، يرجى التأكد من أن البيان يتماشى مع سياستنا
البروتوكولات السريرية المفصلة، والنتائج، والبيانات الإضافية متاحة في المخطوطة وفي الجداول التكميلية 1 و 2. البروتوكول للدراسة الاستعادية، الملاحظة متاح على:https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT05498363?term=NCT05498363&draw=2&rank=lيمكن استرجاع تسلسلات جينوم البكتريوفاج في قاعدة بيانات GenBank تحت رموز الوصول المدرجة في الجدول 1 للبيانات الموسعة. يمكن الوصول إلى بيانات جينوم العزلات البكتيرية عبر مشروع NCBI BioProject PRJNA975428. قاعدة بيانات PHROGS v3 متاحة علىhttps://phrogs.lmge.uca.fr/يعلن المؤلفون أن جميع البيانات الأخرى التي تدعم نتائج هذه الدراسة متاحة ضمن المقال.

البحث الذي يتضمن مشاركين بشريين، بياناتهم، أو مواد بيولوجية

معلومات السياسة حول الدراسات التي تشمل مشاركين بشريين أو بيانات بشرية. انظر أيضًا معلومات السياسة حول الجنس، الهوية/التقديم الجنسي، والتوجه الجنسي والعرق، والعرقية والعنصرية.

التقارير عن الجنس والنوع

التقارير عن العرق أو الإثنية أو غيرها من التجمعات الاجتماعية ذات الصلة

خصائص السكان

التوظيف

رقابة الأخلاقيات
كان متوسط عمر المرضى 53 عامًا سنوات)، و كان من بين المرضى ذكور. لم يتم العثور على تأثيرات للعمر أو الجنس على الإزالة باستخدام تحليل الانحدار اللوجستي.
لم يتم اعتبار أو الإبلاغ عن العرق أو الإثنية أو أي مجموعات اجتماعية ذات صلة.
كان متوسط عمر المرضى 53 عامًا سنوات)، و كان من بين المرضى ذكور. لم يتم العثور على أي تأثيرات للعمر أو الجنس على الإزالة باستخدام تحليل الانحدار اللوجستي.
تتناول هذه الدراسة أول 100 حالة متتالية من علاج البكتريوفاج (BT) التي تم تسهيلها بواسطة اتحاد بلجيكي (مجموعة واحدة، مفتوحة). قدم الأطباء الذين يطلبون علاج البكتريوفاج باستخدام تحضيرات البكتريوفاج لمرضاهم طلبًا لعلاج البكتريوفاج إلى مركز تنسيق علاج البكتريوفاج (PTCC) في QAMH. يتم توضيح إجراء PTCC لاختيار المرضى لعلاج البكتريوفاج في الشكل البياني الممتد 1، ويعتمد بشكل كبير على الحاجة السريرية، والموافقة التنظيمية، وتوافر البكتريوفاجات المستهدفة للبكتيريا المسببة للعدوى.
وفقًا للائحة الاتحاد الأوروبي رقم 536/2014 (لائحة التجارب السريرية)، وتحويلها إلى القانون البلجيكي، وبناءً على نصيحة اللجنة الأخلاقية الرائدة في “مستشفى جامعة أنتويرب” و”جامعة أنتويرب” (معرف 3644)، التي وافقت على بروتوكول الدراسة الملاحظة. لم تُعتبر هذه التحليل الرجعي غير التدخلي لقاعدة بيانات BT الموجودة والمجهولة الهوية تجربة على الإنسان ولم تتطلب موافقة مستنيرة مخصصة. كما تم تقديم هذه المعلومات في المخطوطة.
يرجى ملاحظة أنه يجب أيضًا تقديم معلومات كاملة حول الموافقة على بروتوكول الدراسة في المخطوطة.

التقارير المتخصصة في المجال

يرجى اختيار الخيار أدناه الذي يناسب بحثك بشكل أفضل. إذا لم تكن متأكدًا، اقرأ الأقسام المناسبة قبل اتخاذ قرارك.
علوم الحياة العلوم السلوكية والاجتماعية العلوم البيئية والتطورية والبيئية
لنسخة مرجعية من الوثيقة بجميع الأقسام، انظرnature.com/documents/nr-reporting-summary-flat.pdf

تصميم دراسة العلوم الحياتية

يجب على جميع الدراسات الإفصاح عن هذه النقاط حتى عندما يكون الإفصاح سلبياً.
حجم العينة 100 مريضًا (تقرير استعادي لا عينة محددة مسبقًا). بالنسبة لحجم عينة Galleria mellonella، كان مستندًا إلى منشور سابق Nieuwenhuyse وآخرون، 2022)
استثناءات البيانات بالنسبة لنموذج جاليريا، تم استبعاد تجربة واحدة من التحليل حيث تم أخذ نقاط زمنية وقياسات مختلفة.
استنساخ تم إجراء اختبار تآزر البكتريوفاج – المضادات الحيوية مرة واحدة فقط، في إطار روتيني طارئ، قبل تطبيق البكتريوفاجات. بالنسبة لنموذج جاليريا، تم تكرار هذا التجربة مرة واحدة. تم تكرار جميع التجارب الأخرى على الأقل 3 مرات.
العشوائية لم يتم توزيع المرضى عشوائيًا. الدراسة لها تصميم مجموعة واحدة. بالنسبة لـ G. mellonella، تم تعيين اليرقات عشوائيًا.
مُعَمي لم يكن هناك تعمية. الدراسة لها تصميم مفتوح. بالنسبة لـ G. mellonella، لم تكن التقييمات معتمدة على التعمية.

التقارير عن مواد وأنظمة وطرق محددة

نحتاج إلى معلومات من المؤلفين حول بعض أنواع المواد والأنظمة التجريبية والأساليب المستخدمة في العديد من الدراسات. هنا، يرجى الإشارة إلى ما إذا كانت كل مادة أو نظام أو طريقة مدرجة ذات صلة بدراستك. إذا لم تكن متأكدًا مما إذا كان عنصر من القائمة ينطبق على بحثك، يرجى قراءة القسم المناسب قبل اختيار رد.
المواد والأنظمة التجريبية طرق
غير متوفر غير متوفر

الحيوانات وغيرها من الكائنات البحثية

معلومات السياسة حول الدراسات التي تشمل الحيوانات؛ توجيهات ARRIVE الموصى بها للإبلاغ عن أبحاث الحيوانات، والجنس والنوع في البحث
الحيوانات المخبرية النوع هو Galleria mellonella؛ السلالة غير محددة؛ الجنس غير مهم؛ المرحلة يرقات؛ العمر حوالي 3 أسابيع
الحيوانات البرية لم يتم استخدام حيوانات برية في هذه الدراسة
التقارير عن الجنس لم يُعتبر الجنس
عينات تم جمعها من الميدان لم تتضمن الدراسة عينات تم جمعها من الميدان
رقابة الأخلاقيات تم اعتبار أن استخدام هذا النموذج اللافقاري لا يتطلب توجيهات محددة.
يرجى ملاحظة أنه يجب أيضًا تقديم معلومات كاملة حول الموافقة على بروتوكول الدراسة في المخطوطة.

البيانات السريرية

معلومات السياسة حول الدراسات السريرية

يجب أن تتوافق جميع المخطوطات مع إرشادات ICMJE لنشر الأبحاث السريرية ويجب أن تتضمن جميع التقديمات قائمة مراجعة CONSORT مكتملة.
تسجيل التجارب السريرية الدراسة BT100، المعرف: NCT05498363
بروتوكول الدراسة بروتوكول الدراسة الاستعادية الملاحظة متاح على: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT0S498363? term=NCTOS498363&draw=2&rank=l.
جمع البيانات قبل العلاج بالبكتيريوفاج، تم جمع البيانات السكانية والسريرية من خلال استمارة طبية، تم ملؤها من قبل مقدمي علاج البكتيريوفاج. تم تسجيل وصفة الطبيب المعالج لعلاج البكتيريوفاج، ومعلومات حول المنتج المستخدم من البكتيريوفاج وطريقة إدارته، والجرعة، والمدة، ومعلومات بشأن العلاجات المصاحبة المحتملة (المضادات الحيوية). كما تم أرشفة “فحوصات البكتيريوفاج”، التي تتعلق بتقييم حساسية البكتيريوفاج لعزلات البكتيريا الخاصة بالمريض التي تم أخذها قبل وأحيانًا أثناء العلاج. إذا تم إجراء علاج البكتيريوفاج في مستشفى، تم ملء استمارة متابعة سريرية، تطلب معلومات حول النتائج السريرية (بما في ذلك الأحداث والتفاعلات السلبية المحتملة)، من قبل الطبيب المعالج وفريق التمريض وإرسالها إلى مركز علاج البكتيريوفاج. في حالة العلاج الخارجي بالبكتيريوفاج، تم جمع معلومات المتابعة السريرية مباشرة من المرضى. تم تسجيل جميع البيانات السكانية وبيانات المنتج البكتيريوفاج والبيانات السريرية في قاعدة بيانات مصممة باستخدام REDCap (التقاط البيانات الإلكترونية للأبحاث). تتضمن التفاصيل حول الإعدادات والأماكن التي تم جمع البيانات فيها والفترات التي تم جمعها فيها.
النتائج تم تقييم التحسن السريري، والقضاء على البكتيريا المستهدفة، وظهور وشدة ومدة الأحداث أو التفاعلات السلبية من قبل الطبيب المعالج.
  1. البريد الإلكتروني: jean-paul.pirnay@mil.be
  2. ¹مختبر التكنولوجيا الجزيئية والخلوية، مستشفى الملكة أستريد العسكري، بروكسل، بلجيكا. جمعية ESCMID الأوروبية لعلم الميكروبيولوجيا السريرية والأمراض المعدية، مجموعة دراسة العلاج المضاد للبكتيريا غير التقليدي (ESGNTA)، بازل، سويسرا. مركز الأمراض المعدية، مستشفى الملكة أستريد العسكري، بروكسل، بلجيكا. مختبر تكنولوجيا الجينات، قسم نظم الحياة، جامعة KU Leuven، لوفين، بلجيكا. قسم نظم الحياة، جامعة KU Leuven، لوفين، بلجيكا. معهد إليافا للبكتريوفاجات وعلم الأحياء الدقيقة وعلم الفيروسات، تبليسي، جورجيا. الأمراض البكتيرية، ساينسانو، بروكسل، بلجيكا. قسم جراحة الصدمات، مستشفيات جامعة لوفين؛ قسم التنمية والتجديد، جامعة KU لوفين، لوفين، بلجيكا. معهد البحث التجريبي والسريري، قسم الأطفال، جامعة لوكسمبورغ، بروكسل، بلجيكا. ساهم هؤلاء المؤلفون بالتساوي: جان-بول بيرني، سارة جبارة. قام هؤلاء المؤلفون بالإشراف المشترك على هذا العمل: باتريك سونتينجنز، روب لافين، مايا ميرابيشفلي. *تظهر قوائم المؤلفين وانتماءاتهم في نهاية الورقة. -البريد الإلكتروني: jean-paul.pirnay@mil.be
  3. أمراض العدوى لدى الأطفال، قسم الأطفال، العيادات الجامعية سانت لوك، الجامعة الكاثوليكية في لوفان – UCLouvain، بروكسل، بلجيكا.
    عيادة الأمراض المعدية، مستشفى إيراسم، بروكسل، بلجيكا. مركز الأنف والأذن والحنجرة سيمرينغ، فيينا، النمسا. قسم الطب، قسم أمراض الدم، المركز الاستشفائي الجامعي في لييج، جامعة لييج، لييج، بلجيكا. قسم العناية المركزة ومركز الحروق، مستشفى الجامعة، جامعة لييج، لييج، بلجيكا. كلية الطب، الجامعة الحرة في بروكسل، بروكسل، بلجيكا. قسم الأمراض المعدية للأطفال والوقاية من العدوى ومكافحتها، مستشفى جامعة الأطفال الملكة فابيولا، الجامعة الحرة في بروكسل (ULB)، بروكسل، بلجيكا. قسم الطب الباطني، مستشفى دلتا (CHIREC)، بروكسل، بلجيكا. مستشفى دلتا (CHIREC)، بروكسل، بلجيكا. قسم الطب الباطني العام، الأمراض المعدية والطب الاستوائي، مستشفى جامعة أنتويرب، إيديجيم، بلجيكا. قسم طب العناية الحرجة، مستشفى جامعة أنتويرب، جامعة أنتويرب، إيديجيم، بلجيكا. قسم الطب الباطني والأمراض المعدية، جامعة فريي في جامعة بروكسل، مستشفى جامعة بروكسل، بروكسل، بلجيكا. قسم الأمراض الرئوية، مستشفى جامعة لييج، دومين يونيفيرسيتير دو سارت-تيلمان، لييج، بلجيكا. مستشفى الملكة أستريد العسكري، بروكسل، بلجيكا. قسم الأنف والأذن والحنجرة، جراحة الرأس والعنق، مستشفيات جامعة لوفين؛ الأنف والأذن والحنجرة التجريبية، أبحاث الأنف، قسم علوم الأعصاب، جامعة KU لوفين، لوفين، بلجيكا. قسم الأمراض الرئوية، مستشفيات جامعة لوفين؛ الأمراض التنفسية وجراحة الصدر، قسم الأمراض المزمنة والتمثيل الغذائي، جامعة KU لوفين، لوفين، بلجيكا. قسم طب العناية المركزة، مستشفيات جامعة لوفين؛ قسم الطب الخلوي والجزيئي، جامعة KU لوفين، لوفين، بلجيكا. قسم الصيدلة، مستشفيات جامعة لوفين، لوفين، بلجيكا. قسم الصيدلة، مستشفيات جامعة لوفين؛ علم الأدوية السريرية والعلاج الدوائي، قسم العلوم الصيدلانية والدوائية، جامعة KU لوفين، لوفين، بلجيكا. قسم الطب الباطني العام، مستشفيات جامعة لوفين؛ قسم الميكروبيولوجيا، المناعة وزراعة الأعضاء، جامعة KU لوفين، لوفين، بلجيكا. قسم الطب المخبري، مستشفيات جامعة لوفين؛ مختبر البكتيريا السريرية والفطريات، جامعة KU لوفين، لوفين، بلجيكا. عيادة سانت يوزيف، إيزغيم، بلجيكا. قسم جراحة العظام، مستشفى جامعة سانت لوك، بروكسل، بلجيكا. قسم طب الأطفال، مستشفى جامعة أنتويرب، إيديجيم، بلجيكا. قسم طب العناية المركزة، AZ غروينينغ، كورترجيك، بلجيكا. قسم الأنف والأذن والحنجرة، مستشفى جامعة UZ غنت، غنت، بلجيكا. قسم الطب الباطني العام، عيادة سانت بيير، أوتين، بلجيكا. قسم الأمراض الجلدية، عيادات سانت بيير، أوتين، بلجيكا. قسم الميكروبيولوجيا، الوحدة المتنقلة للأمراض المعدية، AP-HP، مستشفى جورج بومبيدو الأوروبي، باريس، فرنسا. مختبر البيولوجيا الطبية، المركز الطبي في فالنس، فالنس، فرنسا. مركز مرجعي للعدوى المعقدة في العظام والمفاصل في ليون (CRIOAc Lyon)، مستشفيات مدنية فرنسا، ليون، فرنسا. معهد العوامل المعدية – مستشفيات مدنية ليون، المركز الدولي للبحث في الأمراض المعدية، ليون، فرنسا. مستشفى الأطفال الجامعي، مركز الطب الجامعي هامبورغ-إيبندورف، هامبورغ، ألمانيا. قسم البيولوجيا، جامعة بيزا، بيزا، إيطاليا. براكسيس كوردس وغوتشليتش وهيز وشيرل، ريندسبورغ، ألمانيا. قسم جراحة القلب والصدر والأوعية الدموية، مركز القلب الألماني، برلين، ألمانيا. دورة دكتوراه في الميكروبيولوجيا، المناعة، الأمراض المعدية، وزراعة الأعضاء (MIMIT)، جامعة روما تور فيرغاتا، روما، إيطاليا. قسم البيولوجيا والميكروبيولوجيا، جامعة ريجا سترادين، ريجا، لاتفيا. قسم طب الأطفال، مركز الأم والطفل في الشمال (CMIN)، مركز مستشفى بورتو (CHUP)، بورتو، البرتغال. الأمراض المعدية والميكروبيولوجيا السريرية، مستشفى جامعة فيرجن ماكارينا، إشبيلية، إسبانيا. مجموعة الميكروبيولوجيا الانتقالية والمتعددة التخصصات (MicroTM) – معهد البحث البيولوجي في لاكورونيا، قسم الميكروبيولوجيا في مستشفى لاكورونيا (CHUAC)، جامعة لاكورونيا (UDC)، لاكورونيا، إسبانيا. قسم الجراحة الحشوية، مستشفى جامعة لوزان CHUV، جامعة لوزان (UNIL)، لوزان، سويسرا. قسم الأمراض المعدية، قسم الطب، مستشفيات جامعة جنيف، جنيف، سويسرا. قسم الأنف والأذن والحنجرة وجراحة الرأس والعنق، إيراسموس MC، روتردام، هولندا. قسم الطب الباطني ومركز رادبود للأمراض المعدية، مركز رادبود الطبي، نيميغن، هولندا. قسم الطب الرئوي، مستشفى أمستردام UMC موقع VUmc، أمستردام، هولندا. مركز ميديشين مياندير، أميرسفورت، هولندا. عيادة سانت أوغستين، تونس، تونس. مدرسة إدنبرة الطبية: العلوم البيولوجية، جامعة إدنبرة، إدنبرة، المملكة المتحدة. السكري والغدد الصماء، مستشفى الملكة إليزابيث الجامعي، غلاسكو، المملكة المتحدة. عيادة قدم السكري، المستشفى الملكي، إدنبرة، المملكة المتحدة.

Journal: Nature Microbiology, Volume: 9, Issue: 6
DOI: https://doi.org/10.1038/s41564-024-01705-x
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38834776
Publication Date: 2024-06-04

Personalized bacteriophage therapy outcomes for 100 consecutive cases: a multicentre, multinational, retrospective observational study

Received: 10 September 2023
Accepted: 19 April 2024
Published online: 4 June 2024
(A) Check for updates
A list of authors and their affiliations appears at the end of the paper
In contrast to the many reports of successful real-world cases of personalized bacteriophage therapy (BT), randomized controlled trials of non-personalized bacteriophage products have not produced the expected results. Here we present the outcomes of a retrospective observational analysis of the first 100 consecutive cases of personalized BT of difficult-to-treat infections facilitated by a Belgian consortium in 35 hospitals, 29 cities and 12 countries during the period from 1 January 2008 to 30 April 2022. We assessed how often personalized BT produced a positive clinical outcome (general efficacy) and performed a regression analysis to identify functional relationships. The most common indications were lower respiratory tract, skin and soft tissue, and bone infections, and involved combinations of 26 bacteriophages and 6 defined bacteriophage cocktails, individually selected and sometimes pre-adapted to target the causative bacterial pathogens. Clinical improvement and eradication of the targeted bacteria were reported for and of infections, respectively. In our dataset of 100 cases, eradication was less probable when no concomitant antibiotics were used (odds ratio ; confidence interval ). In vivo selection of bacteriophage resistance and in vitro bacteriophage-antibiotic synergy were documented in 43.8% (7/16 patients) and 90% (9/10) of evaluated patients, respectively. We observed a combination of antibiotic re-sensitization and reduced virulence in bacteriophage-resistant bacterial isolates that emerged during BT. Bacteriophage immune neutralization was observed in 38.5% (5/13) of screened patients. Fifteen adverse events were reported, including seven non-serious adverse drug reactions suspected to be linked to BT. While our analysis is limited by the uncontrolled nature of these data, it indicates that BT can be effective in combination with antibiotics and can inform the design of future controlled clinical trials. BT100 study, ClinicalTrials.gov registration: NCT05498363.
Antimicrobial resistance (AMR) is a prominent global health threat with an estimated 1.27 million attributable deaths in and there is an urgent need to seek alternative antimicrobial strategies. Bacteriophage therapy (BT), the use of bacteriophages-the viruses of bacteria-to treat bacterial infections, was first applied by Félix d’Hérelle in , and further developed and applied in the former Soviet Union.
A recent systematic review confirmed that BT can generally be considered as safe, with a low incidence of adverse events, and could be a promising strategy against . However, high-quality trials are required to make useful predictions on the outcome of bacteriophage treatments. A number of companies are currently attempting to develop and market defined broad-spectrum BT products in compliance with contemporary requirements, which involves good manufacturing practices (GMP) certification, preclinical research (toxicity and pharmacology) and conducting randomized controlled trials (RCTs). However, the handful of bacteriophage RCTs that have been performed so far have not brought the expected results in terms of effectiveness . A commonly reported reason for these disappointing results is the use of invariable one-size-fits-all bacteriophage products .
In contrast, an increasing number of successful BT cases are reported in the scientific literature . Irrespective of an obvious positive-result publication bias, most of these successful cases used tailored bacteriophage products. In addition, these personalized bacteriophage preparations, which were shown to target the infecting bacteria in vitro before their clinical application, were often used in combination with antibiotics. When appropriate, bacteriophage preparations were adapted to counter bacterial resistance that had emerged against the applied bacteriophages during , or bacteriophages were pre-adapted (‘trained’) or engineered to be more effective.
Here we report the retrospective, observational analysis of the first 100 consecutive BT cases of difficult-to-treat infections, enabled by a Belgian consortium. Because all BT cases were included in this study, not only successful, interesting, or challenging cases, we were able to (1) evaluate how often personalized BT produced a positive clinical outcome (general efficacy) and (2) identify functional relationships that are general in all cases.
Considering the relatively high number of combined categorical and numerical variables in the analysed data, the majority of patients were unique cases in most of the variables. As a result, on this dataset, no inferential statistics could be applied because these data were neither a random nor a representative sample of a population of BT-treated patients. As such, any data analysis can only be interpreted as information pertaining to the analysed patient population.
Nevertheless, the knowledge gained from these cases is likely to help physicians to select effective treatment protocols and design future clinical trials.

Results

Patients, bacterial infections and bacteriophage therapy

A Belgian BT consortium, consisting of the Queen Astrid Military Hospital (QAMH), KU Leuven and Sciensano (formerly known as the Scientific Institute of Public Health), facilitated BT in about 140 difficult-to-treat infections in patients in Belgium and abroad (as of July 2023), not taking into account the patients treated in the context of prospective clinical trials. The selection of patients was largely based on clinical need, regulatory approval and the availability of well-characterized
bacteriophages targeting the infecting bacteria (Extended Data Fig.1). Personalized bacteriophage preparations were produced at the QAMH in accordance with the rules in force in the territory at the time of their use in clinical practice. Of note, most selected cases concerned personalized BT as salvage therapy after standard antibiotic treatments had failed. Quality and safety of the bacteriophage preparations were verified by Sciensano according to the specifications of the Belgian bacteriophage active pharmaceutical ingredient (API) monograph , that is, the genomic analysis of the bacteriophage and its bacterial production host (with an emphasis on safety), and the determination of lytic activity (titre), pH, bioburden (total viable aerobic count), bacterial endotoxin level and genome sequence (identity and purity) of each bacteriophage API batch. The BT protocols that were suggested to the treating physicians were based on the experiences of the George Eliava Institute of Bacteriophages, Microbiology and Virology (Eliava Institute) in Tbilisi, Georgia (personal communications), and on the application instructions of the Ministries of Health and of Medical and Microbiology Industry of the former Union of Soviet Socialist Republics (USSR) .
During the study period (1January 2008 to 30 April 2022), 1, 066 BT requests were submitted to the QAMH. These requests resulted in 100 BT cases (9.4%). Two hundred and sixty BT requests addressed to the QAMH between April 2013 and April 2018 were analysed in detail . Only 15 (5.8%) of these 260 requests resulted in actual BT. Two hundred and forty-five requests were rejected for diverse reasons: 70 applicants ( ) did not respond to requests for additional information; 124 requests ( ) concerned bacterial species against which no bacteriophages were available at the QAMH; for 46 requests (17.7%), other therapeutic options were considered more opportune; and in 5 cases (1.9%) the available bacteriophages did not target the patients’ infecting bacterial strains. Rejected applications were usually referred to BT centres abroad. We consider these percentages as representative of the present patient cohort, minding an increase in the percentage of requests that resulted in BT ( versus 5.8%), which is due to the increasing number of therapeutic bacteriophages in the QAMH collection. Time to treatment was dependent on whether suitable quality-controlled bacteriophages were available on hand (these could be provided immediately), or whether bacteriophages needed to be produced at the QAMH and quality and safety tests performed by Sciensano (this would take on average of 3 weeks in non-emergency cases).
A retrospective analysis of a de-identified BT database containing demographic, bacteriophage product and clinical data showed that personalized BT of 100 consecutive patients targeted 114 difficult-to-treat infections (as diagnosed by the treating physicians), including 14 second-site infections. Baseline characteristics of the patients are presented in Supplementary Table 1 and Extended Data Table 1, and provide an overview of these BT cases, which were performed by a total of 63 Bacteriophage Therapy Providers in 35 hospitals, 29 cities and 12 countries (Fig. 1a). Twenty-seven of the 100 BT cases/patients were previously reported . Since 2008, the number of BT cases performed under the umbrella of different regulatory frameworks and facilitated by the Belgian consortium has increased steadily (Fig.1b). The prevalence of the main infection types is shown in Fig. 1c. The most common indications for BT include lower respiratory tract infections (LRTI; 25.4% (29/114 infections)), skin and soft tissue
Fig. 1| Characteristics of the patient population involved in the 100 consecutive BT cases facilitated by the Belgian consortium. a, Geographic location of the BT cases. b, Number of BT cases and their regulatory context, per year.SOC MP, standard-of-care with magistral bacteriophage preparations; DH, article 37 (unproven interventions in clinical practice) of the Declaration of Helsinki; SOC UM, standard-of-care with unlicensed medicines; ATU MP, ‘Autorisation Temporaire d’Utilisation’ of magistral preparations. c, Primary and secondary (concomitant) infection types. AbdI, abdominal infection;
OPI, orthopaedic prostheses infection. d, Patient age and gender distribution. Boxplot shows the interquartile range of the age (years) of the patients ( ): first quartile (29.5), median (53) and third quartile (62). The whiskers extend from the quartiles to the last data point within the interquartile range. Data points plotted outside the boundary of the whiskers are outliers. Female patients are represented by purple filled circles and male patients by blue filled circles. , Targeted bacterial species. In some cases, bacteriophages targeted two or three bacterial species (connected by lines) in one patient.
infections (SSTI;22.8%(26/114)),bone infections (Bonel; 14.0%(16/114)) and upper respiratory tract infections (URTI;11.4% (13/114)). Fourteen patients presented with a second-site infection, more specifically a bloodstream infection (BSI; ), a urinary tract infection (UTI; ),
an or a . Age and gender distribution are shown in Fig. 1d. The median age of the patients was 53 years ( years), and of the patients were male. Of note, 5 patients were 1 year or younger. Fourteen bacterial species were targeted (Fig. 1e), with the
Table 1 | General overview of bacteriophage therapy protocols according to the main infection types
Infection type Application route Bacteriophage carrier Volume (ml) Concentration (p.f.u.s ml ) Dose Duration
Lower respiratory tract infections Nebulization 2-4 q6h 5days-6weeks
Bone and orthopaedic prostheses infections Intralesional 2-70 q24h 5 days-3weeks
Skin and soft tissue infections Topical NaCl 0.9% or Flaminal Hydro In excess q24h 5days-3weeks
Upper respiratory tract infections Nasal spray 1-15 q8h 1-3 weeks
Bloodstream infections or other infection types Intravenous 50-100 q24h 5-10days
When the treating physician considered it was necessary to apply bacteriophages systemically. p.f.u.s, plaque forming units; q, every.
highest prevalence for Pseudomonas aeruginosa (49/100 patients) and Staphylococcus aureus (39/100 patients).
Twenty-six individual bacteriophages (Supplementary Table3) and six defined bacteriophage cocktails (Supplementary Table 4), including two commercially available cocktails (PyoPhage and IntestiPhage) produced by the George Eliava Institute of Bacteriophages, Microbiology and Virology (Eliava Institute) in Tbilisi (Georgia), were used. Bacteriophages were provided by the QAMH and 16 Bacteriophage Donors affiliated to 10 institutes in 7 countries.
Most BT providers adhered to BT protocols proposed by QAMH physicians, which resulted in a surprisingly small variation in BT protocols within a given indication. Table 1 provides a general overview of these protocols, while the individual protocols of the 100 cases are listed in Supplementary Table 1. Bacteriophages were administered intravenously to 20 patients (Supplementary Table 1); in 10 of them as stand-alone BT, in 10 concomitantly with intralesional ( ), nebulized ( ), topical ( ) or generalized (multiple application routes; ) bacteriophage application. In 10 patients, intravenous bacteriophages were used to treat or prevent bloodstream infections. In 69.3% (79/114) of targeted infections, bacteriophages were administered in combination with standard-of-care antibiotics.

Pre-adaptation of bacteriophages

The most frequently used bacteriophages, that is,Staphylococcus bacteriophage ISP (33 patients) and . aeruginosa bacteriophages 14-1 (22 patients), PNM (21 patients) and PT07 (18 patients) (Supplementary Table 3), were regularly (one to two times per year) adapted using a selection of three to five recent bacterial strains of concern. In addition, 13 bacteriophages were specifically pre-adapted to lyse the patient’s bacteria in a therapeutically relevant manner (Methods), that is, to produce stable lysis (without emergence of bacteriophage-insensitive mutants) in liquid culture for typically at a multiplicity of infection (MOI) (Extended Data Table2). The genomes of the pre-adapted bacteriophages were sequenced, analysed and compared to those of their original precursors as part of the Sciensano coordinated SAPHETY project (https://www.sciensano.be/en/control-and-safety-assessment/ safety-therapeutic-bacteriophage-preparations), which focuses on setting new standards for the quality and safety of therapeutic bacteriophage products. One pre-adaptation effort increased the activity of S. aureus bacteriophage ISP against an S. epidermidis clinical isolate in view of personalized BT. The pre-adaptation process (four serial passages) resulted in missense mutations in three genes, including a carbohydrate-binding domain protein and a uracil-DNA glycosylase (Extended Data Fig. 2), which are closely related (closest BLAST hits) to two previously identified receptor binding proteins . However, the increased virulence and resistance suppression of the pre-adapted ISP variant was accompanied by a decreased host range. Where the original ISP clone showed a moderate activity (efficiency of plating against S. epidermidis strains, the adapted variant
showed a therapeutically acceptable activity against the patient’s strain only.

Diagnostic tests to support bacteriophage therapy

For 21 patients, sufficient and adequate consecutive bacterial samples and/or serum samples were provided, allowing assessment of (1) the potential in vivo emergence of resistance against the applied bacteriophages, (2) in vitro bacteriophage-antibiotic interactions and/or (3) the emergence of bacteriophage immune neutralization (Table2).

Selection of bacteriophage resistance

For 16 patients, sufficient bacterial samples (isolated before, during and after BT) were available to evaluate the possible emergence of bacterial bacteriophage resistance. Whether adequate samples were available was not directly linked to the clinical indications for BT but depended mainly on the treatment centres and their bacteriological monitoring routines. For 5 patients in Table 2, no adequate sample sets were available (indicated with ‘NSA, no samples available’ in Table 2). We observed the in vivo selection of bacterial strains exhibiting a bacteriophage-insensitive phenotype, and the possible underlying phenotype-genotype associations in 7 of these patients (patients and 91 in Table2). Whole-genome single nucleotide polymorphism (SNP) analysis was performed for bacterial isolates from the patients where bacteriophage insensitivity emerged. In two patients ( 64 and 82 in Table 2), sequential bacteriophage-susceptible and bacteriophage-insensitive P. aeruginosa isolates were determined not to be clonal. Phylogenetic comparison showed that for patient 82, bacteriophage-susceptible strains belonged to an emerging rare sequence type (ST)235, whereas bacteriophage-resistant strains belonged to the more prevalent multidrug-resistant ST357 (Table 2 and Fig. 2a) . For patient 64, the susceptible strain was ST1233 (same ST as the strains from patient 91), while the resistant strain was determined to be ST549 (Table 2 and Fig. 2a). In these two patients, BT probably selected for P. aeruginosa strains that were not a suitable host for the applied bacteriophages. Clinical improvement was reported in both patients.
SNPs or deletions in genes related to the bacteriophage receptor were assumed to be the basis of the resistance phenotype in five patients ( and 91 in Table 2). In three of them (patients 30,54 and 91), the targeted P. aeruginosa strains were not eradicated. The selection of bacteriophage-resistant mutants in two patients ( 16 and 20) was previously described . In patient 16, an isolate of the targeted Achromobacter xylosoxidans strain emerged to harbour a missense mutation in the gene coding for the putative colicin I receptor Cir, which was identified as a bacteriophage receptor. In patient 20, a missense mutation occurred in the pilB gene of the targeted . aeruginosa strain, while the pilM gene was inactivated by the insertion of IS5 transposase. Both pilB and pilM are involved in the biosynthesis of Type IV pilus (T4P), the receptor for the applied P. aeruginosa bacteriophage .
Table 2 | Results of the supportive tests performed for 21 of the present 100 consecutive bacteriophage therapy cases
Patient number Infection type Targeted bacterial species Applied bacterio-phage(s) Bacteriophage administration route(s) In vivo selection of bacteriophage resistancepossible underlying mechanism(s) In vitro bacteriophageantibiotic interactions Bacteriophage immune neutralization Clinical improve-ment Eradication of targeted bacteria Reference
9 Fracture-related infection Klebsiella pneumoniae M1 Intralesional (catheter) Not observed M1 synergy with ceftazidime/avibactam and meropenem M1 neutralization emerged between days 8 and 18 after BT initiation Yes Yes Ref.
13 Wound and bloodstream infection Pseudomonas aeruginosa 14-1, PNM and ISP (BFC 1) Topical and intravenous Not observed No concomitant antibiotics 14-1 neutralization emerged 10 days after BT initiation Yes Yes Ref.
16 Cystic fibrosis lung transplant infection Achromobacter xylosoxidans JWAlpha, JWDelta, JWT and 2-1 (APC 1.1 and APC 2.1) Nebulization Yes-p.Tyr601X MS Mut in colicin I receptor Cir No concomitant antibiotics NSA Yes Yes Ref.
20 Liver transplant and bloodstream infection P. aeruginosa 14-1, PNM and ISP (BFC 1) Intralesional (infusions) and intravenous Yes-p.Asp388Ala MS Mut in PilB and deactivation of PilM by insertion of IS5 transposase, both involved in Type IV pili biosynthesis, without impact on virulence PNM synergy with colistin, aztreonam and gentamycin ISP neutralization emerged 5 weeks after BT initiation. No neutralization of 14-1 or PNM Yes Yes Ref.
21 Bone allograft infection Staphylococcus aureus 14-1, PNM and ISP (BFC 1) Intralesional (catheter) and intravenous Not observed ISP synergy with clindamycin, additive effect of ISP and ciprofloxacin, moderate ISP antagonism with rifampicin NSA Yes Yes Ref.
22 Chronic osteomyelitis of the pelvis P. aeruginosa and S. epidermidis 14-1, PNM, ISP (BFC 1) Intralesional (catheter) NSA NA 1month after BT initiation, no bacteriophage neutralization could be detected Yes Yes Ref.
23 Chronic osteomyelitis of the femur S. aureus 14-1, PNM, ISP (BFC 1) Intralesional (catheter) NSA NA 1month after BT initiation, no bacteriophage neutralization could be detected Yes Yes Ref.
24 Chronic osteomyelitis of the femur P. aeruginosa and S. epidermidis 14-1, PNM, ISP (BFC 1) Intralesional (catheter) NSA NA 1month after BT initiation, no bacteriophage neutralization could be detected Yes Yes Ref.
26 Spinal infection P. aeruginosa 4029, 4032 and 4034 Local and intravenous Not observed NA NSA Yes Yes Ref.
27 Orthopaedic infection P. aeruginosa 14-1, PNM and ISP (BFC 1) Local Not observed Additive effect of the bacteriophage cocktail with ceftazidime/avibactam NSA Yes Yes Ref.
30 Chronic sinusitis P. aeruginosa and S. aureus 14-1, PNM and ISP (BFC 1) Nasal spray Yes-p.Ala154 Pro MS Mut in PilC, involved in Type IV pili biosynthesis No concomitant antibiotics NSA No No Unpublished
42 Chronic osteomyelitis of the femur Enterococcus faecalis PyoPhage Intralesional (catheter) NSA NA 1 month after BT initiation, no bacteriophage neutralization could be detected Yes Yes Ref.
43 Liver transplant infection Enterococcus faecium EfgrKN and EfgrNG Intravenous Not observed Synergy of EfgrKN with vancomycin, loss of vancomycin resistance 49 days after BT initiation, no bacteriophage neutralization could be detected Yes No Ref.
Table 2 (continued) | Results of the supportive tests performed for 21 of the present 100 consecutive bacteriophage therapy cases
Patient number Infection type Targeted bacterial species Applied bacterio-phage(s) Bacteriophage administration route(s) In vivo selection of bacteriophage resistancepossible underlying mechanism(s) In vitro bacteriophageantibiotic interactions Bacteriophage immune neutralization Clinical improve-ment Eradication of targeted bacteria Reference
54 Ventilator-associated pneumonia P. aeruginosa 14-1, PNM and PTO7 Nebulization
Yes- p.Thr230Proline MS
Mut in PilR, involved in Type
IV pili biosynthesis
No clear interaction between PNM or 14-1 and colistin 2 months after BT initiation, no bacteriophage neutralization could be detected Yes No Unpublished
55 Musculoskeletal infection S. epidermidis ISP and BEO6 Intralesional and intravenous Not observed No concomitant antibiotics NSA No No Unpublished
64 Anal fistula P. aeruginosa 14-1, PNM and PTO7 Intralesional Yes-selection of another strain, which is not a host for bacteriophages 14-1, PNM or PT07 No concomitant antibiotics 4 and 7 months after BT initiation, no bacteriophage neutralization could be detected Yes Yes Unpublished
66 Cystic fibrosis lung infection M. abscessus 8UZL Nebulization and intravenous NSA NA 8UZL neutralization emerged 7days after BT initiation No No Unpublished
71 Lung infection P. aeruginosa PT07 Nebulization Not observed Additive effect of PTO7 and ceftazidime NSA Yes Yes Unpublished
82 Cystic fibrosis lung infection P. aeruginosa 4P and DP1 Nebulization Yes-selection of another strain, which is not a host for bacteriophages 4P and DP1 Synergy of 4P and DP1 with levofloxacin, no clear interaction between 4P or DP1 and tobramycin NSA Yes Yes Unpublished
91 Lung infection P. aeruginosa 14-1, PNM and PTO7 Nebulization and intravenous
Yes-
LPS biosynthesis:
(Is 2 and 3) p.Trp139X NS Mut in WapH, (Is 2 and 3) p.Gln239X NS
Mut in Gale, (Is 4 and 5) p.Leu162Pro MS
Mut in WapR, (Is 4 and 5) p.Leu60_
Leu63del in WbpR
Type IV pili biosynthesis: (Is 4 and 5) p.Arg120fs X in FimV, missing the first 165 aa
Other:
(Is 6) p.Gly406Ser MS Mut in CupE5 fimbrae assembly protein, (Is 2, 3, 4, 5 and 6) p.Arg994Gly MS Mut in MexB of MexAB-OprM, (Is 4 and 5 ) p.His87Asp MS Mut in GyrA
PT07 synergy with colistin and meropenem 2 weeks after BT initiation, no bacteriophage neutralization could be detected Yes No Unpublished
92 Generalized necrotizing fasciitis, empyema, bacteremia S. aureus, P. aeruginosa and Stenotro-phomonas maltophilia ISP, 14-1, PNM, PTO7 and BUCT700 ISP: intravenous, intrapleural, intraperitoneal and nebulization; All: topical Not observed ISP synergy with vancomycin, ceftarolin and clindamycin ISP neutralization emerged 6days after BT initiation Yes Yes Unpublished
aa, amino acids; del, deletion; fs, frameshift; Is, isolate; MS Mut, missense mutation; NA, not analysed; NS Mut, nonsense mutation; X, stop.
Bacteriophage-resistant P. aeruginosa mutants were also isolated from patients 30, 54 and 91 infected with P. aeruginosa (Table 2 and Fig. 2b-d). Among these mutations, SNPs were identified that corresponded to regions related to T4P in all three patients. In one patient (54), this mutation was in the pilR gene, coding for the transcriptional activator of a two-component system that regulates expression of the major pilin subunit PilA (Fig. 2b) . In another patient (30) isolate, this mutation was in a gene coding for an inner membrane component, PilC, essential for T4P biogenesis (Fig. 2c) . For patient 91, a premature stop codon was introduced producing a truncated gene variant of the gene fimV, which expresses a part of the inner membrane assembly of T4P in P. aeruginosa (Fig. 2d) . In addition, this patient was shown to harbour bacteria that exhibited simultaneous resistance to all three unique P. aeruginosa bacteriophages from treatment: PNM, PT07 and 14-1 (Table 2 and Fig. 2d). Interestingly, we observed two distinct bacteriophage-resistant variants of the initially targeted . aeruginosa strain, each showing resistance to the three applied bacteriophages, which all had different bacterial receptors. P. aeruginosa bacteriophage 14-1 infects via a lipopolysaccharide (LPS) receptor . Unsurprisingly, SNPs were identified in genes in the outer core of the P. aeruginosa LPS membrane, that is, wapH, galU, wbpR (gene products truncated in these three mutant variants) and wapR. Although the receptor for P. aeruginosa bacteriophage PT07 is not known, sequence similarity to PAK-P1-like bacteriophages ( identity to bacteriophage PaP1) suggests that this bacteriophage is dependent on the P. aeruginosa MexAB-OprM multidrug efflux pump . A resistance mutant of PT07 was identified with an SNP in the gene mexB. Two P. aeruginosa isolates (Is 4 and 5 in Table 2) from patient 91 had both the mex mutation and another mutation in DNA gyrase subunit A (gyrA), part of the bacterial DNA topoisomerase. This mutation (H87A) is within the GyrA quinolone-resistance determining region (QRDR) . The interplay of the MexAB-OprM efflux pumpanda DNA gyrase mutation has been associated with high-level fluoroquinolone resistance in . aeruginos . Interestingly, the bacteriophage-insensitive P. aeruginosa isolates retrieved from patient 91 carrying the double mutation in mexB and gyrA showed a re-sensitization to fluoroquinolones while displaying unaltered growth kinetics, illustrated by a decrease in the minimum inhibitory concentration (MIC) from to for ciprofloxacin and from to for levofloxacin. Of note, patient 91 was treated concomitantly with bacteriophages and the antibiotics meropenem, colimycin and vancomycin.

Galleria mellonella virulence assays

Since these mutations in isolates from patients 30, 54 and 91 are in encoded virulence factors (Type IV pili, lipopolysaccharide), we implemented a Galleria mellonella infection model to readily assess the virulence of bacteriophage-susceptible versus bacteriophage-resistant variants of these P. aeruginosa strains. Larvae infected with original, bacteriophage-susceptible isolates showed rapid and significant mortality within 48 h (100% death) (Extended Data Fig.3). The groups infected with bacteriophage-resistant mutants from patient 91 with multiple mutations(>2) ingenes encoding for different regions (LPS, MexAB-OprM and/or T4P and/or DNA gyrase) showed significantly higher survival rates ( ) compared with the larvae infected with the original isolate in this model system. Significantly higher survival rates were also observed for the larvae infected with the bacteriophage-resistant variant of the P. aeruginosa strain isolated from patient 54 as compared with the original bacteriophage-susceptible variant ( ). However,
all larvae from these two groups died in 18 h . The larvae infected with the bacteriophage-resistant isolate from patient 30 showed no difference in survival compared with those infected with the original isolate. Consequently, in patient 91 we saw a combination of antibiotic re-sensitization and reduced virulence of bacteriophage-resistant isolates, which may have contributed to an eventual favourable treatment outcome.

In vitro bacteriophage-antibiotic interactions

Bacteriophage-antibiotic-bacteria interactions were analysed for suboptimal ratios of bacteriophages to bacteria ( ) and subMIC levels ( MIC) of antibiotics. These suboptimal conditions were necessary to enable the observation of these interactions. If either bacteriophages or antibiotics were applied under optimal concentrations, this would have led to the efficient killing of the bacterial strains by either antibiotics or bacteriophages, making it impossible to demonstrate possible synergistic, additive, or antagonistic interactions. In vitro bacteriophage-antibiotic-bacteria interaction experiments revealed a synergistic or additive effect of bacteriophages and concomitantly applied antibiotics in 9 out of 10 evaluated patients (9,20,21,27,43,71, 82,91 and 92). An overview of the test results is presented in Table 2. The results of the experiments concerning the first 5 patients ( and 43 ) were reported previously . The detailed results (OmniLog growth curves) for the 5 most recent patients (54,71,82,91 and 92) are presented in Fig. 3. In vitro synergy with bacteriophages was observed for 9 antibiotics (aztreonam (patient 20), ceftaroline (92), ceftazidime/ avibactam (9), clindamycin (21 and 92), colistin (20 and 91), gentamicin (20), levofloxacin (82), meropenem (9 and 91) and vancomycin (43 and 92)), and an additive effect for three antibiotics (ceftazidime/ avibactam (27), ceftazidime (71) and ciprofloxacin (21)). For one patient (54), no significant in vitro interactions between colistin and P.aeruginosa bacteriophages PNM (Fig. 3a) or 14-1 (Fig. 3b) were observed. Bacteriophages 4P and DP1 acted in synergy with levofloxacin (Fig. 3d,e), but showed no clear interaction with tobramycin (Fig. 3f,g), when tested in vitro against the . aeruginosa strain of patient 82 . Importantly, a moderate antagonism was observed for S. aureus bacteriophage ISP with rifampicin (patient 21 in Table 2) in one of our previously published BT cases . Of note, when most of these tests were performed, BT had already started and test results did not influence patient treatment. However, today, on the basis of these results and the overall observation that pathogen eradication is more likely when phages are applied in combination with antibiotics, we strongly advise physicians to have these tests performed before treatment, if time permits.

Bacteriophage immune neutralization

For 13 patients, sufficient serum samples (obtained before, during and after BT) were available to allow for an adequate bacteriophage immune neutralization screening. The applied serum concentration ( ) and incubation time ( 30 min ) conform to the standard technique developed by M. H. Adams in 1959 to specifically detect bacteriophage neutralization activity. Bacteriophage immune neutralization was observed between 6 and 35 days after initiation of BT in 5 of 13 ( ) screened patients (9,13,20,66 and 92 in Table 2 and Fig. 4a-d). Bacteriophage immune neutralization always involved invasive (intravenous and/ or intralesional) bacteriophage administrations. In 4 of these 5 cases (patients 9, 13, 20 and 92), clinical improvement and eradication of the targeted bacterial pathogen were nevertheless observed. In a liver transplant patient (43 in Table 2), the intravenous administration of
Fig. 2| The in vivo emergence of bacteriophage resistance during BT. Monitored by whole-genome analysis of sequential bacterial isolates in patients 30,54,64,82 and 91 (in vivo emergence of bacteriophage resistance in patients 16 and 20 discussed in Table 2). a, Maximum likelihood phylogenetic tree of the genomes of the analysed sequential bacterial isolates. b-d, Circular chromosomic view (CCV) of the bacterial genomes of sequential isolates (Is) of Pseudomonas aeruginosa strains retrieved just before (Is 1 , inner circle) and
during BT (Is 2-n) from patients 54 (b), 30 (c) and 91 (d). Green rings display the genomes of bacteriophage-susceptible isolates, while the red rings display the genomes and relevant (for bacterial bacteriophage resistance) mutations in bacteriophage-resistant isolates. The two multicoloured outer rings display the protein annotations (categories) as present in the Clusters of Orthologous Groups of proteins (COGs) database. bp, basepairs; CDS, coding sequence; IS, insertion sequence; Mb, megabases; nt, nucleotide; PTM, post-translational modification.
bacteriophages did not elicit any immune neutralization. In another liver transplant patient (20), bacteriophage immune neutralization emerged, but only after 5 weeks, and it concerned 1 of the 3 bacteriophages that had been applied (Table 2 and Fig. 4c).

Clinical outcomes

Clinical improvement was reported in 77.2% (88/114) of targeted infections and eradication of the targeted bacteria was observed in 61.3% (65/106) of infections for which relevant bacteriological follow-up data
Fig. 3| Results of the in vitro evaluation of the combined effects of bacteriophages and concomitantly applied antibiotics on the targeted bacterial strains. Determined by an OmniLog system for patients 54, 71, 82, 91 and 92 (those for patients and 43 are discussed in Table 2). Bacterial proliferation is presented through relative units of cellular respiration. patient 54.c, Additive effect (delayed bacterial growth) of ceftazidime and
Fig. 4 | Emergence of bacteriophage immune neutralization.
a-e, Chronological bacteriophage immune neutralization (BIN) activity against the applied bacteriophages in sera collected before, during and after BT in patients and . The evolution over time of the serum BIN activity against the applied bacteriophages is shown as bacteriophage titre loss (compared to pre-BT control sera) after incubation of the bacteriophages with sequential serum samples for 30 min . BIN activity appeared
1-5 weeks after BT initiation. Data are presented as mean s.d. of three biological replicates. ABCONCOM, concomitant antibiotherapy; admin, administration; CI, clinical improvement; ERADIC, eradication; IL, intralesional; INDICATI, indication; i.v., intravenous; Kp, Klebsiella pneumoniae; Ma, Mycobacterium abscessus; Nebul, nebulization; Pa, Pseudomonas aeruginosa; Sa, Staphylococcus aureus; Sm, Stenotrophomonas maltophilia; TARGET, targeted bacterial species. Bacteriophage cocktail BFC1 contains bacteriophages ISP, 14-1 and PNM.
were available (Supplementary Table1). For 8 targeted infections, in 8 patients, no adequate post BT bacteriological data were available (Supplementary Table1). For 7 of these cases, the treatment centre did not collect the necessary bacteriological data as part of their routine follow up of patients and was not allowed to collect the data prospectively. For the remaining case, it is not clear why the bacteriological data were not available. The treatment centre either did not collect these data, failed to extract these data from the medical files, or was not able or willing to transfer these data to the Phage Therapy Coordination Centre (PTCC).
BT resulted in clinical improvement without bacterial eradication in 18 of 106 ( ) targeted and bacteriologically monitored infections (Supplementary Table 1). Conversely, in 2 patients ( 44 and 93 in Supplementary Table 1), eradication of the targeted pathogens was observed without clinical improvement. In patient 44, an infection with an additional (non-BT-targeted) bacterial species (Acinetobacter baumannii) surfaced during BT, which ultimately resulted in an A. baumannii pulmonary septic shock and the patient’s death, despite intravenous administration of tigecycline. Patient 93 succumbed to tumour progression and palliative care.
For 21 of the 92 (22.8%) patients for which bacteriological follow-up data were available, neither clinical improvement nor bacterial eradication could be observed. Five of these patients ( and 96 in Supplementary Table 1) died. The causes of death were septic shock ( ), cardiogenic shock ( ), multi-organ failure ( ) and COVID-19 infection ( ). In 69.3% (79/114) of targeted infections, concomitant standard-of-care antibiotics were administered (Supplementary Table 1).
Fisher’s exact test for count data showed univariate significant effects on eradication for the following categorical variables: concomitant use of antibiotics (yes or no), antibiotic resistance profile of the targeted bacteria (multidrug resistant or not) and the clinical setting (ambulatory or hospitalized). No effects of patient age or gender on eradication of the targeted bacteria were observed using univariate logistic regression considering solely age or gender, respectively. A stepwise, forward selection logistic regression analysis of eradication on all independent variables determined that the concomitant use of antibiotics (variable ABCONCOM) was the most informative variable in the reduced dataset (Supplementary Table2). In our dataset of 100 consecutive cases, eradication of the targeted bacteria (variable ERADIC) was less probable when no concomitant antibiotics were used (odds ratio confidence interval ). The value for Fisher’s exact test of independence between ABCONCOM and ERADIC was 0.01488 . The contingency table shows that our logistic regression model is right of the time. The antibiotic resistance profile of the target bacteria (ABRPROF) and the clinical setting (CLINSETT) as well as their interactions with the concomitant use of antibiotics (ABCONCOM) were not selected in the overall logistic regression model. This could be attributed to confounding relations between these three variables within this dataset. A significant association was found between clinical improvement and bacterial eradication. Of the 23 patients with no clinical improvement, only 2 patients expressed eradication. Of the 69 patients with clinical improvement, 53 had full eradication. Intravenous BT, as stand-alone or concomitant therapy, was not shown to significantly impact clinical outcome, as also found for patient age or gender, the persistence of the bacterial infection (chronic or acute), or the use of more than one targeting bacteriophage per bacterial strain. Clinical improvement or bacterial eradication was not significantly correlated with the presence of either P. aeruginosa or S. aureus, where other species were not considered separately, as their prevalence in this study population was too low, or with any individual bacteriophage or bacteriophage cocktail.
Fifteen adverse events were reported, including seven non-serious adverse drug reactions suspected to be linked to BT (Extended Data Table3). All suspected adverse drug reactions resolved. No correlation
between adverse events and a certain bacteriophage product or administration route could be made.

Discussion

In this overview of the first 100 consecutive real-world cases of personalized BT treatment, we show that (1) we were able to produce more than 40 batches of personalized bacteriophage APIs, some of them pre-adapted , which were subsequently certified for use in pharmaceutical preparations; (2) when used in the treatment of 114 difficult-to-treat infections of various types and aetiology, in combination with antibiotics in of cases, these preparations led to clinical improvement in 77.2% and eradication of the targeted bacteria in 61.3% of cases; (3) seven non-serious suspected adverse drug reactions were reported.
The overwhelming representation of P. aeruginosa (49% of patients) and S. aureus ( of patients) as targeted bacterial species is because these are overall major causes of severe nosocomial infections, but are also the main microorganisms causing invasive burn wound infection , which is historically a major focus of attention of the infectiologists of the QAMH, where the first bacteriophage treatments were carried out .
Of note, all bacteriophage preparations were offered free of charge. However, this endeavour-providing 43 batches of 26 bacteriophages for the treatment of 100 patients-would not have been possible if one had to comply with the large body of costly and time-consuming requirements and procedures for GMP manufacturing and licensing of biological medicinal products. Companies focusing on defined bacteriophage preparations for use in commercially viable indications might be able to deal with the demanding requirements of the conventional medicinal product (drug) licensing pathway, including GMP certification, preclinical testing and clinical trials. However, for a BT centre, these requirements form an insurmountable barrier in terms of timelines and cost. We experienced first-hand how elaborate and logistically complex personalized BT concepts are, compared with one-size-fits-all approaches, with bacterial strains and matching bacteriophages being exchanged between dozens of institutes in 12 countries. As a result, we are focusing on the development of an instant and on-site production system for bacteriophages based on artificial intelligence (AI) and synthetic biology approaches .
Our BT protocols prescribe relatively low bacteriophage doses, usually plaque forming units (p.f.u.s) . In the United States, the Antibacterial Resistance Leadership Group (ARLG) Phage Taskforce suggests using the highest safe and tolerated dose of a bacteriophage product with endotoxin levels below the acceptable limits set by the Food and Drug Administration to maximize bacteriophage concentrations at the site of infection and infect as many host cells as possible with the first dose . The ARLG Phage Taskforce, however, acknowledges that clinical outcomes are not always improved with higher doses, reflecting the complexity of effective bacteriophage dosing. We observed an increase in in vitro bacteriophage efficiency (lytic activity) with increasing MOI up to a certain MOI, after which regrowth can be observed more frequently and at an earlier point in time (Extended Data Fig. 4). The effective bacteriophage doses in the body are also determined by the route of bacteriophage administration. Most established BT protocols presented here are based on the principle that bacteriophages are best administered directly into the site of infection. Oral administrations were not used because no gastrointestinal infections were treated.
In 17% (18/106) of targeted infections for which bacteriological follow-up data were available, clinical improvement was reported even though the targeted bacteria were not eradicated.
In 1943, the emergence of bacteriophage-resistant bacterial mutants in liquid cultures was reported . Recently, parallel evolution of bacteriophage resistance and virulence loss in P. aeruginosa response to bacteriophage treatment (in one patient), in vivo and in vitro was reported . In vivo selected resistance was associated with
reduced growth rates, whereas in vitro isolates evolved greater biofilm production. Reference 46 showed that when bacteriophage infection risk is high, constitutive resistance mechanisms, such as a mutation of the bacteriophage receptor, are selected by the bacterial hosts, rather than inducible resistance mechanisms, such as a clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) system . In the present study, we observed in vivo selection of a bacteriophage resistance phenotype in 43.8% (7/16) of patients for which adequate follow-up bacterial samples were available for testing. However, there is a caveat; patients for whom the possible emergence of bacterial bacteriophage resistance could be analysed were treated in only a few hospitals where routine bacterial monitoring generated sufficient suitable samples. This means that the presented bacteriophage resistance data are not generalizable. In addition, due to the limited number of patients in which resistance was demonstrated, it was not possible to statistically show its potential impact on bacterial target eradication. Regardless, failure of eradication was observed in of patients with bacteriophage resistance selection and in 22% (2/9) of patients without bacteriophage resistance. Cases where bacteriophage resistance arose were predominantly P. aeruginosa respiratory tract infections. It can be that bacteriophage resistance is more common in this scenario, but it may also be because respiratory tract infections and P. aeruginosa infections are the most represented. Non-synonymous SNPs or deletions in genes affecting the bacteriophage receptor or coding for a DNA gyrase were assumed to be at the basis of the resistance phenotype in five cases. In two patients, bacterial strains that were not hosts for the applied bacteriophages were selected. In some cases, the in vivo selected bacteriophage-resistant mutants were shown to exhibit re-sensitization to certain antibiotics and reduced virulence in a . mellonella larvae model. The selection of bacteriophage-insensitive bacteria did not prevent the ultimate eradication of the targeted bacterial strains and clinical improvement in four patients.
So far, all BT RCTs have evaluated defined bacteriophage products as stand-alone therapies , while bacteriophage-antibiotic synergy is increasingly reported in the literature . On the basis of BT clinical data generated in compassionate use settings, in combination with antibiotic therapy, the ARLG Phage Taskforce recently suggested that BT should be used in conjunction with conventional antibiotics . Correspondingly, here we observed a statistically significant correlation between the eradication of the targeted bacteria and adjunctive standard-of-care antibiotic therapy. In addition, in several of the present 100 cases, it was assumed that the clinical resolution of multidrug-resistant infections was due to the additive or synergistic effect of various bacteriophage-antibiotic combinations . It was hypothesized, on the basis of in vitro experiments, that the therapeutic use of bacteriophages binding to P. aeruginosa efflux pumps could select bacteriophage-resistant isolates with changes in the efflux pump mechanism, causing increased sensitivity to certain chemical antibiotics . In the present study, we demonstrated that the therapeutic use of bacteriophage PT07, predicted to bind to the MexAB-OprM multidrug efflux pump, indeed selected (in vivo) bacteriophage-resistant mutants with changes to the efflux pump mechanism, resulting in increased sensitivity to fluoroquinolones. The use of specifically chosen bacteriophages (for example, targeting drug efflux pumps) could therefore re-sensitize bacteria towards antibiotic activity, increasing bacterial killing when used in combination with these antibiotics, and potentially decreasing selection of antibioticor bacteriophage-resistant clones. However, caution is warranted, as certain antibiotics can interfere with bacteriophage lytic activity . It might thus be advisable to measure potential synergy or antagonism for the proposed combinations of bacteriophages and antibiotics before their clinical application .
A considerable body of experimental data has accumulated showing that bacteriophages can substantially affect immune system cells, and it has been assumed that anti-bacteriophage antibodies appearing
over the course of BT could decrease the lytic activity of bacteriophages and cause therapeutic failure . Consequently, the use of the same bacteriophage(s) for several weeks was discouraged in the former Soviet Union . More recently, ref. 55 reported on the development of neutralizing antibodies after 2 months of intravenous BT, which led to treatment failure in an immunocompetent patient with Mycobacterium abscessus pulmonary infection . The ARLG Phage Taskforce advised considering measurement of neutralizing antibodies during prolonged courses of BT . In the present study, we observed bacteriophage immune neutralization emerging 6-35 days after initiation of invasive bacteriophage administration.
We acknowledge that our analysis, involving 100 severely ill patients for whom BT was a salvage therapy and our primary aim was to help these patients, has intrinsic limitations. No control groups, blinding or randomization were put in place and different medical specialties and infection types were involved. Evaluation of safety and efficacy was not based on pre-defined standardized tests but on the judgement of the treating physicians, and although they were all experienced, this introduces a certain subjectivity. However, we consider that this case series provides key insights that are not only valuable for the treatment of last resort patients, but also for the design of prospective clinical trials such as the PHAGEFORCE study . We confirmed the safety profile of BT and the advantages of combining BT with standard-of-care antibiotic therapy. Statistical analysis showed a significantly higher probability of microbial eradication when BT was combined with standard-of-care antibiotics, and in vitro bacte-riophage-antibiotic synergy was demonstrated in 9 of 10 analysed cases. Samples allowing supportive tests in 21 patients, in view of better treatment management, shed more light on some BT issues such as the in vivo selection of bacteriophage resistance, bacteriophage-antibiotics synergy and bacteriophage immune neutralization.
In conclusion, we present evidence that the use of bacteriophages in addition to standard-of-care antibiotics can significantly improve the eradication rate of targeted bacteria in this patient population. These data can be useful for designing future controlled clinical trials that are urgently needed to assist the BT field.

Methods

Study design and patients

We reviewed the first 100 consecutive BT cases facilitated by a Belgian consortium between 1 January 2008 and 30 April 2022. Within this consortium, the QAMH coordinated most BT cases, selecting and producing bacteriophages, and suggesting BT protocols, while KU Leuven performed supporting genomic analyses of bacteriophages under consideration and of bacterial genomes, and Sciensano controlled the quality and safety of individual bacteriophage preparations. The choice for 100 patients is arbitrary and not linked to any prospective sample size determination.
Physicians requesting BT with QAMH bacteriophage preparations for their patients submitted a BT request to the Phage Therapy Coordination Centre (PTCC) of the QAMH. The PTCC procedure for selecting patients for BT is depicted in Extended Data Fig. 1 and is largely determined by clinical need, regulatory approval and the availability of bacteriophages targeting the infecting bacteria. Clinical applications were performed by, and under the responsibility of, Bacteriophage Therapy Providers in several hospitals in Belgium and abroad. No blinding, masking or randomization were implemented, and investigators and patients were aware of the bacteriophage treatment. Demographic and clinical data were collected through the patients’ treating physicians. Clinical improvement (or not), eradication of the targeted bacterium (or not), and the advent, seriousness and duration of suspected adverse drug reactions and events were assessed by the treating physicians.
Written informed consent for BT was obtained from the involved patients or their legal representatives according to local provisions.
Where warranted, local ethics committee approval for BT was obtained. According to EU Regulation No 536/2014 (Clinical Trials Regulation) , its transposition to Belgian Law, and following advice of the Leading Ethical Committee of the ‘Universitair Ziekenhuis Antwerpen’ and the ‘Universiteit Antwerpen’ (ID 3644), which approved the observational study protocol, the present retrospective non-interventional analysis of an existing and de-identified BT database was not considered as an experiment on the human person and did not require a dedicated informed consent. There was no patient compensation for participation in this study. The observational study protocol was registered on ClinicalTrials.gov (Study BT100, ID: NCT05498363).

Manufacture of bacteriophage APIs

Bacteriophages were isolated and characterized by QAMH or were sourced from Bacteriophage Donors. Bacteriophage suspensions were produced in accordance with the guidelines provided by the bacteriophage API monograph , and the methods described in ref. 58 , with some modifications. Bacteriophage stocks were prepared using the double agar overlay method with minor modifications. Three to six millilitres of bacteriophage lysate containing plaque-forming units (p.f.u.) of bacteriophages were added to a sterile 15 ml Falcon tube (Greiner Bio-One) and complemented with 0.2 ml of a bacteriophage-sensitive bacterial suspension (end concentration of c.f.u.s ) and lukewarm medium (Select Alternative Protein Source (APS) lysogeny broth (LB), tryptic soy broth (TSB) or TSB + 0.5% glycerol (all purchased from Becton Dickinson)) with 0.6% top agar (VWR International), to a total volume of 12 ml . This mixture was plated onto a square ( ) Petri dish (Greiner Bio-One) filled with a bottom layer of APSLB, TSB or TSB medium glycerol (all Becton Dickinson) and 1.5% agar (VWR International), and incubated at (for E. coli, K. pneumoniae and P. aeruginosa) or (for all the other bacterial species) for 16 h or 48 h (for M. abscessus). The top agar layer was scraped off using a sterile L-shaped rod (Sigma Aldrich), transferred to a sterile 50 ml sterile Falcon tube (Greiner Bio-One) and centrifuged for 20 min at using a Sorvall Legend centrifuge (Thermo Fisher). The supernatant was aspirated using a sterile 30 ml syringe (BD Plastipak, Becton Dickinson) with an 18G sterile needle (BD microlance 3, Becton Dickinson) and filtered sequentially using a and a polyethersulfone (PES) Millex-Gp membrane syringe filter (Merck) or using a vacuum filter system (Nalgene, Thermo Fisher). The bacteriophage suspension was centrifuged for 90 min at ( for podoviruses) using a Sorvall Legend centrifuge (Thermo Fisher). The resulting bacteriophage pellet was diluted in ten times less Dulbecco’s phosphate buffered saline without calcium and magnesium (DPBS, Lonza) than the initial bacteriophage suspension and the pellet was left to dissolve overnight at . The bacteriophage suspension was further diluted to a final concentration of generally p.f.u.s using DPBS (Lonza) and a volume of . The diluted bacteriophage suspension was filtered using a PES Millex-Gp membrane syringe filter (Merck) and subsequently purified from endotoxins using the commercially available kits EndoTrap Blue (Lonza) or EndoTrap HD (Lionex), according to manufacturer instructions. One column was utilized per 50 ml of bacteriophage suspension. Endotoxin-purified bacteriophage suspensions were filtered using medical-grade polyvinylidene difluoride (PVDF) Millex-Gp syringe filters (Merck) and collected into sterile 125 or 500 ml PETG Nalgene bottles (Thermo Fisher). The final titre of each thus obtained bacteriophage API was p.f.u.s .

Quality and safety of bacteriophage APIs

Sciensano controlled the quality and safety of the bacteriophages. In accordance with the bacteriophage API monograph , this control was implemented on two levels (https://www.sciensano.be/ en/control-and-safety-assessment/safety-therapeutic-bacteriophagepreparations). First, a genetic control was performed to check the
safety of the bacteriophage to be used in human therapy. For this purpose, genomic DNA of the bacteriophages and their bacterial hosts were isolated and purified, respectively using a MagCore Viral Nucleic Acid and an MgC Bacterial DNA kit with a elution volume (Atrida), following manufacturer instructions. Sequencing libraries were constructed using the Illumina Nextera XT DNA sample preparation kit and sequenced on an Illumina MiSeq instrument with a 250 bp paired-end protocol (MiSeq v3 chemistry, Illumina). Trimming of short reads was performed with Trimmomatic (v.0.32) . In addition, for bacterial production strains, long-read sequencing was performed using Oxford Nanopore Technologies (ONT)’s rapid barcoding kit SQK-RBK004 and a MinION flow cell (v.9.4.1), according to manufacturer instructions. Super high accuracy base calling was performed using Guppy (v.6.0.1) (ONT) and hybrid assemblies were generated using Unicycler (v.0.4.7) . For bacteriophages, genome assembly was performed using SPAdes (Galaxy v.3.15.4+) , after which the genome was annotated using Prokka (Galaxy v.1.14.6) with assistance of the PHROGS v. 3 database (https://phrogs. Imge.uca.fr/). To detect undesired genes associated with antibiotic resistance or virulence, the complete bacteriophage genome was submitted to the NCBI (National Center for Biotechnology) blastn web interface (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) for a similarity search in different databases: ARG-ANNOT (ARG-ANNOT NT v. 6 July 2019), CARD (v.3.1.4 to 3.2.5), ResFinder (https://bitbucket.org/ genomicepidemiology/resfinder_db) and VFDB full (downloaded on 20 April 2022). Prophage induction was searched by mapping sequencing reads of the production batch to the bacterial production host genome using Bowtie2 (Galaxy v.2.5.0), and looking for significantly increased coverage in predicted prophage positions using PHASTER (https:// phaster.ca/) and Prophage Hunter (https://pro-hunter.bgi.com/) .
Second, Sciensano analysed various parameters of each production lot of each bacteriophage API. Bacteriophage identity and purity (scored by the percentage of bacteriophage sequence reads) was determined using DNA extraction and genome sequencing as described above. The potency of the lot was verified using classical double agar dilutions in triplicate. The bioburden (total viable aerobic count) of each bacteriophage API lot was assessed using a validated membrane filtration method based on European Pharmacopoeia (Ph. Eur.) chapter 2.6.12. Briefly, 4 ml of the 150-250 ml bacteriophage API batches (1.6-2.6%) was added to 36 ml of NaCl peptone, after which 10 ml was membrane filtered (Nalgene membrane filter, ). The membrane was then incubated on trypto-casein-soy (TCS) agar at for at least 72 h and SCG (Sabouraud dextrose agar + chloramphenicol + gentamicin) at for at least 5 days. After incubation, the number of c.f.u.s per ml of bacteriophage API was determined. Several bacterial and yeast strains were used as positive controls.
Bacterial endotoxin content of 1 ml samples ( ) was determined using a validated Limulus Amebocyte Lysate (LAL) test, according to Ph. Eur. chapter 2.6.14. Bacterial endotoxin levels were expressed in endotoxin units (EU) per ml ( 1 EU is equal to 1 international unit (IU) of endotoxin). The acceptance criterion (endotoxin limit) for the final bacteriophage magistral preparations (diluted bacteriophage APIs) was body mass , irrespective of the administration route.
A certificate allowing the bacteriophage API to be used in pharmaceutical (magistral) preparations is provided by Sciensano upon successful completion of this two-tiered procedure.
Sciensano controlled the quality and safety of 43 batches of individual bacteriophage APIs produced by QAMH to treat the first 100 patients. These batches exhibited an average bacteriophage titre of p.f.u.s (s.d. ), a pH of 7.32 (s.d. 0.037 ), a bioburden of 0 colony-forming units (c.f.u.) (s.d. 0 ) and a median endotoxin level of (s.d. 89.14). The bacteriophage APIs, active ingredients of magistral preparations, were diluted in, and/or combined with, the necessary excipients in a hospital pharmacy ‘officina’ immediately before use on a named-patient basis. The endotoxin limit
for the bacteriophage magistral preparations was defined on the basis of dosage and the patient’s weight. The administered endotoxin doses were, irrespective of the administration route, always well below the threshold pyrogenic dose for intravenous administration, that is, <5.0 EU endotoxin body mass . Bacteriophage genomes contained no genetic determinants known to confer lysogeny, toxicity, virulence or antibiotic resistance. Host bacteria used in the manufacturing process were as safe (or least pathogenic) as possible. Some production hosts were shown to contain prophages. Bacteriophage productions with of sequencing reads derived from actively replicating prophages were not used in therapy. Bacteriophage cocktails produced by the Eliava Institute (PyoPhage and IntestiPhage) were not quality-controlled by Sciensano. These products probably have higher endotoxin content and an unknown prophage content. Hence, they were never administered intravenously.

Selection of adequate bacteriophages for therapy

The patients’ infecting bacteria were sent to the PTCC and their bacteriophage susceptibility was determined. Susceptibility of bacterial strains towards the available bacteriophage cocktails or APIs was tested using the spot test as described in ref. 65. Fresh overnight cultures of the patient’s bacterial strains were added to lukewarm ( ) media containing agar (top agar) and poured onto square ( 12 ) Petri dishes (Greiner Bio-One) containing media with agar (bottom agar). Different culture media were used, according to the considered bacterial species. Media were purchased from Becton Dickinson and agar from VWR International. Droplets ( ) of serial dilutions of each of the considered bacteriophage solutions were spotted on the top agar layer. Petri dishes were incubated overnight at 32 or , according to the considered bacterial species. The next day, the lysis zones produced by active bacteriophages in the bacterial lawn were examined and classified as confluent lysis ( ), semi-confluent lysis (3+), opaque lysis (2+), separate plaques (+) or no activity (-). Next, for bacteriophages producing clear lysis zones, EOP was defined as previously described . The EOP for the patient’s bacterial strain was calculated by comparison with a highly susceptible reference host and defined as the observed number of p.f.u.s on the patient’s bacterial strain (as determined by the above-described spot test) divided by the observed number of p.f.u.s on the reference bacterial strain. The EOP value obtained with the highly susceptible production host strain was considered as . In case the picture was unclear (for example, opaque lysis zones) and the results difficult or un-interpretable, the double agar overlay method was used to determine the p.f.u.s on the patient’s strains and the bacteriophage production host, as described above, to define EOP more precisely. When the activity of the bacteriophages was still difficult to assess using the above-mentioned methods based on solid media, liquid broth cultures were used to assess bacteriophage activity, using the OmniLog system (Biolog). Bacterial respiration was measured without and with bacteriophages. Experiments were performed in 96 -well plates (Thermo Fisher) in a final volume of of LB or TSB medium (Becton Dickinson), supplemented with 100 -fold diluted tetrazolium dye mix A or H (Biolog). Bacterial cells were inoculated at a concentration of c.f.u.s per well, calculated on the basis of optical density (OD) at 600 nm and validated using a classical plate culture method. Bacteriophages were added at an MOI range of 100-0.0001, as calculated on the propagation host. Plates were incubated at a bacterial species-specific temperature ( 32 or ) for 72 h , and the colour change caused by reduction of the tetrazolium dye due to bacterial respiration (during growth) was recorded every 15 min by the OmniLog system. The results were analysed with Biolog Data Analysis software (v.1.7) and data were exported to Microsoft Excel files.
We considered the relative EOP as a relative measure of lysis efficiency, which, in this context, is defined as the lytic activity (titre) of the bacteriophage on the patient’s bacterial strain, divided by the titre
observed in a reference bacterial host known to be highly susceptible to the bacteriophage. We considered an EOP on the patient’s bacterial strain as therapeutically acceptable on the basis of the expertise from the Eliava Institute. All bacteriophage cocktails were composed of bacteriophages with compatible activities. Since April 2022, when more than one bacteriophage showed adequate in vitro activity, the overall activity of the bacteriophage combinations was analysed using the OmniLog system, as described above. When synergistic or additive effects were observed, the concerned bacteriophage combinations were recommended for clinical use.

Pre-adaptation of bacteriophages

When the observed bacteriophage susceptibility was deemed too low for therapeutic application, and if time and resources permitted, bacteriophages were pre-adapted to increase pathogen clearance and to reduce bacteriophage resistance evolution . According to the guidelines of the Ministry of Health of the USSR and the empirical experience of the Eliava Institute, adequate bacteriophage cocktails (not individual bacteriophages) should cause stable lysis, that is, without the emergence of bacteriophage-insensitive bacterial mutants, of the target bacteria in liquid medium for a prolonged period (typically ), and at an MOI of 0.0001-0.00001 and bacterial concentrations of c.f.u.s (refs. 69-72). For individual bacteriophages, MOIs were deemed appropriate. To obtain these bacteriophage virulence and bacterial regrowth suppression thresholds, the (modified) Appelmans method was applied for the pre-adaptation of bacteriophages on bacterial strains, as previously described . To a 15 ml Falcon tube (Greiner Bio-One) were added: 4.5 ml of LB or TSB medium (Becton Dickinson), 0.5 ml of tenfold dilutions of the considered bacteriophage and a volume of either the patient’s bacterial strain or a pre-production panel of collected ‘problematic’ bacterial strains, to obtain a final concentration of .f.u.s . The tubes were incubated at a bacterial species-specific temperature ( 32 or ) for 48 h . Bacterial growth and bacteriophage activity were monitored by OD measurement at 600 nm using a Lambda 12 UV/VIS spectrometer (Perkin Elmer) after 24 and 48 h of incubation and compared to two negative controls (bacteriophage only and LB or TSB medium only) and a positive control (bacteria only). The tube with the highest bacteriophage dilution showing an value similar to the negative controls was selected and chloroform was added to a final concentration of . The tube was shaken and incubated for at least 2 h at . After incubation, the upper phase (without chloroform) was aspirated using a sterile 30 ml syringe (BD Plastipak, Becton Dickinson) with an 18G sterile needle (BD microlance 3, Becton Dickinson) and filtered using a or a PES Millex-Gp membrane syringe filter (Merck). The obtained bacteriophage lysate underwent several (at least three) of the above-described passages until adequate virulence and resistance suppression levels were obtained.
The comparison between a bacteriophage and its patient-adapted version was recently published . However, the genetic comparison of pre-adapted phages with their unadapted ancestors falls outside the scope of this study.

Bacteriophage preparation stability

The stability of the bacteriophage APIs was monitored by determining their titre at monthly. Bacteriophage APIs with titres of p.f.u.s retained their activity for at least 1 year . One or more bacteriophage APIs can be diluted and/or mixed with a carrier (for example, an isotonic intravenous solution or a hydrogel) into a magistral preparation under the supervision of a hospital pharmacist and according to the provisions of a medical prescription provided by the patient’s treating physician. Diluting and mixing various bacteriophages are events that can compromise their stability , and experiments showed that, in general, magistral preparations are best used within 1 week after their manufacture.

Bacteriophage therapy protocols

The PTCC suggested BT protocols on the basis of the application instructions of the Ministry of Health of the USSR and the Eliava Institute, some of which can be found in the leaflets of their BT products. These documents (in Russian) do not mention any (published) data. One of them states that ‘bacteriophage neutralization can emerge between 10 and 15 days after intravenous application’. We have not been able to determine whether these 30-40-year-old guidelines and instructions may be based on systematic studies, or if they are largely based on empirical experience. Therefore, we prefer to catalogue them as Centre for Evidence-Based Medicine (CEBM) evidence level 5, that is, recommendations formulated by experts on the basis of their own professional experiences. This evidence is probably also based on the review of data from case reports and non-systematic studies.
Bacteriophage administration intervals were largely influenced by clinical indications and administration routes. For instance, it is more straightforward to apply bacteriophages several times per day to the infected lungs of an intubated patient (nebulization) than to infected burn wounds (topical), which are generally unpacked and treated only once a day.
For nebulization of bacteriophage preparations, vibrating mesh type nebulizers were advised because they were shown to induce less titre loss due morphological damage than air-jet nebulizers . For bone and orthopaedic prosthesis infections, we advised the use of a pigtail catheter or another draining device for rinsing the wound cavities before bacteriophage application and for the actual administration of bacteriophages . For topical application, we advised mixing of the bacteriophages with an adequate hydrogel . In general, our protocols prescribed relatively low bacteriophage doses, usually p.f.u.s , and ranging from p.f.u.s for continuous intravenous BT to p.f.u.s for topical BT in a few SSTI cases. In contrast, some clinics prefer the administration of considerably higher doses, for instance, up to p.f.u.s for intravenous .

Diagnostic tests in support of bacteriophage therapy

In addition to bacteriophage susceptibility testing, three BT supportive tests were offered without obligation to the Bacteriophage Therapy Providers to allow for improved BT management: (1) monitoring of the in vivo emergence of bacteriophage resistance using sequential bacterial samples isolated during BT, (2) analysis of the in vitro bacterio-phage-antibiotic interactions before the start of BT and (3) evaluation of bacteriophage immune neutralization, or the ability of the patient’s serum to neutralize therapeutic bacteriophages.
In vivo selection of bacteriophage resistance. The in vivo selection of bacteriophage resistance was monitored using sequential bacterial samples isolated during BT. Bacteriophage susceptibility was evaluated using the methods described earlier. When decreased bacteriophage sensitivity was observed, the isolate’s genome was sequenced and analysed to determine the clonality of the isolate (compared with the pre-BT isolate) and to investigate the genetic background for the observed bacteriophage resistance phenotype. For genome sequencing, the method described in ref. 6 was followed with some deviations: for nanopore processing, Guppy (v.6.3.8) (ONT) (base calling, demultiplexing) and Porechop (v.0.2.4) (barcodeclipping) (https://github.com/ rrwick/Porechop) were used. Genomes were assembled with Unicycler (v.0.4.8) and SNP variants were called using Snippy (v.4.6.0) (https:// github.com/tseemann/snippy). For genome annotation and visualization, EggNOG-mapper (v.2.1.8) , mobileOG-db (v.1.1.2) , Phigaro (v.2.3.0) , Circos (v.0.69.8) and GC-profile were used. A pan-genome analysis using Roary (v.3.13.0) from annotated genomes (Prokka v.1.14.6) was performed to create a maximum likelihood phylogenetic tree using core alignment in fasttree (v.2.1.10) visualized with iTOL (itol. embl.de) . For multilocus sequence typing (MLST), genomes were scanned against PubMLST (https://pubmlst.org/) schemes, including
ST111 (O12-1709), ST357 (B14130), ST235 (NCGM2), ST1233 (Pcyll-10) PAO1 (ST549) and ATCC 27853 (ST155) as representative genomes/STs. The programs Porechop, Unicycler, Snippy, EggNOG-mapper, Roary, Prokka, Fasttree and MLST were accessed through the Galaxy server (https://usegalaxy.eu/).
Galleria mellonella virulence assays. Ten P. aeruginosa isolates (Pa30 (Is 1), Pa 30 (Is 3), Pa54 (Is 1), Pa54 (Is 4) and Pa91 (IS1-6)) were grown in LB broth (Becton Dickinson) to an of . One millilitre of the bacterial cultures was centrifuged and resuspended in sterile DPBS (Lonza). G. mellonella larvae were grouped in batches of 10 (standardized for weight) and then injected in the hindmost proleg with a aliquot of dilutions ( c.f.u.s) of the washed bacterial cultures. After infection, the larvae were incubated in the dark at . Activity scores were monitored every 6 h and compared to DPBS-injected controls. Activity scores ranged from 0 to 9 , based on activity level (with and without stimulation), melanization and survival .
In vitro bacteriophage-antibiotic interactions. Bacteriophage-anti-biotic-bacteria growth kinetics were analysed upon request of the treating physicians using the bacterial and bacteriophage isolates obtained before the start of BT. For patients treated before October 2021, these evaluations were performed retrospectively on bacterial and bacteriophage isolates stored at in LB glycerol (Becton Dickinson). Bacterial respiration was measured using the OmniLog system (Biolog). The growth kinetics of the targeted bacterial pathogens were assessed in the presence of the bacteriophages only, the relevant antibiotics (to be used concomitantly) only and bacteriophage-antibiotic combinations. Experiments were performed in triplicate (biological replicates) in 96-well plates (Thermo Fisher) in a final volume of of LB or TSB medium (Becton Dickinson) supplemented with 100 -fold diluted tetrazolium dye mix A or H (Biolog). Bacterial cells were inoculated at a concentration of c.f.u.s per well, calculated on the basis of measurements and validated using a classical plate culture method. Antibiotics and bacteriophages were added at subMIC ( MIC) levels and MOIs (calculated on the propagation host), respectively. The titres of the bacteriophages were confirmed after each experiment using the classical double agar overlay method. Plates were incubated at for 72 h and the colour change caused by reduction of the tetrazolium dye due to bacterial respiration (during growth) was recorded every 15 min by the OmniLog system. The results were analysed with Biolog Data Analysis software (v.1.7) and data were exported to Microsoft excel files. We defined bacteriophage-antibiotic combinations as synergistic when the bacterial growth suppression period produced by the addition of both the bacteriophage and the antibiotic is clearly longer than the simple sum of the suppression periods induced by the bacteriophage and the antibiotic separately.
Bacteriophage immune neutralization. The possible emergence of bacteriophage immune neutralization, or the ability of the patient’s serum to neutralize therapeutic bacteriophages, was evaluated according to ref. 87, with some modifications. Whole blood samples were collected before BT initiation and at various time points during and after bacteriophage application. Blood was allowed to clot for at least 30 min in a vertical position and then centrifuged in a swinging bucket rotor for 10 min at at room temperature. The obtained serum samples were stored at . To assess the effect of the serum samples on bacteriophage lytic activity, 0.9 ml of 1:100 diluted sera was mixed with 0.1 ml of the bacteriophage suspension at a concentration of p.f.u.s and incubated for 30 min at . Bacteriophage lytic activity (titre) was determined before and after incubation with the patient’s serum samples using the double agar overlay plaque assay (as previously described). Comparison of pre- and post-incubation lytic activity allowed for the determination of the proportion of neutralized bacteriophages. Each serum sample was tested in triplicate.

Clinical outcome

Clinical improvement, eradication of the targeted bacterium and the advent, seriousness and duration of suspected adverse drug reactions or events were assessed by the treating physicians. Neither safety data were prospectively collected, nor were the descriptors defined in advance to clinicians.

Data collection

Before BT, demographic and clinical data were collected through a medical form, which was completed by the Bacteriophage Therapy Providers. The medical doctor’s BT prescription, information regarding the applied bacteriophage product and its administration route, dosage, duration and information regarding possible concomitant (antibiotic) treatments were also recorded. The ‘phagograms’ reporting on the evaluation of the bacteriophage susceptibility of the patient’s bacterial isolates sampled before and sometimes during treatment were also archived. If the bacteriophage treatment was performed in a hospital, a clinical follow-up form requesting information about the clinical outcome (including suspected adverse drug reactions and events) was completed by the treating physician and the nursing team and sent to the PTCC. In case of ambulatory BT, clinical follow-up information was collected directly from the patients. All demographic, bacteriophage product and clinical data were recorded in a Research Electronic Data Capture (REDCap) designed database . Data collection and analysis were not performed blind to the conditions of the experiments.

Definitions

In accordance with the guidelines of an international expert proposal for interim standard definitions for acquired resistance, multidrug resistance (MDR) was defined as acquired non-susceptibility to at least one agent in three or more antimicrobial categories, extensive drug resistance (XDR) as non-susceptibility to at least one agent in all but two or fewer antimicrobial categories, and pandrug resistance (PDR) as non-susceptibility to all agents in all antimicrobial categories . The term ‘usual drug resistance’ (UDR) was used to describe isolates that are not fully susceptible, but could nonetheless be readily treated (at least on the basis of the in vitro susceptibility assays) using standard therapies . If an infection persisted for more than 6 months, it was considered a ‘chronic infection’. Clinical improvement was defined as the improvement of at least one symptom associated with the bacterial infection, as assessed by the treating physician. No clinical metrics were applied (for example, illness severity scores). The influence of other (medical/surgical) interventions was not determined. Eradication of the targeted bacterium was defined as the absence of the originally targeted causative agent of the bacterial infection in culture, or when the patient’s treating physician concluded, on the basis of a follow-up survey, that the patient was freed of the targeted bacterial pathogen. Microbiological eradication was not prospectively or systematically evaluated. The period between the start of BT and the evaluation of the clinical outcome varied according to the treating physician and the indication, and ranged from 1 month to 1 year, the latter for difficult-to-treat bone infections.

Statistical methods

The following variables were analysed for 92 of the 100 patients (for which a complete dataset was available): eradication of the targeted bacteria, clinical improvement, concomitant use of antibiotics, antibiotic resistance profile of the target bacteria, suspected adverse drug reactions and the clinical setting (ambulatory treatment or hospitalized). All these variables were binary categorical. In addition, the 14 infection types and 21 bacterial species targeted by BT were monitored on nominal categorical scales. Age and gender were analysed on numeric scales. The statistical analysis was conducted using the statistical software environment SAS (v.9.4). We used a stepwise, forward selection procedure on a reduced dataset (Supplementary Table2) to determine the most informative variable in the dataset, with
the variable ‘Eradication (ERADIC)’ as response variable for our logistic regression model. The probability modelled is ERADIC = ‘Yes’ (that is, successful eradication). A sketch (left) and the contingency table (right) of the logistic regression model used to analyse the reduced dataset (Supplementary Table 2) are depicted below.
Logit model:
Contigency table (n=92)
: Intercept
: No concommitant ( )
Odds-ratio:
probability that eradication is “Yes”
probability of “No” eradication
Concomittant AB
No Yes
20 19
13 40
Fisher’s exact test was performed using R (v.4.3.0) (https://www.Rproject.org/) , and the R Stats Package (v.4.3.2) was used to search for significant correlations between variables. The data presented in Fig. 1 (patient population characteristics) and Fig. 4 (bacteriophage immune neutralization) were analysed using R (v.4.3.0) and visualized with the following packages: tidyverse (v.2.0.0) , UpSetR (v.1.4.0) , ggmap (v.3.0.2) and rnaturalearth (R package version 0.3.2.9000) . The log-rank test with Bonferroni correction for multiple comparisons (GraphPad v.0.5.1) was used for G. mellonella survival curve comparisons.

Reporting summary

Further information on research design is available in the Nature Portfolio Reporting Summary linked to this article.

Data availability

Detailed clinical protocols, results and additional data are available in the paper and in Supplementary Tables 1 and 2. The protocol for the retrospective, observational study is available at https://clinicaltrials. gov/ct2/show/NCT05498363?term=NCT05498363&draw=2&rank=1. The bacteriophage genome sequences can be retrieved in the GenBank database under the accession codes listed in Supplementary Table 3. The genome data of the bacterial isolates can be accessed via NCBI BioProject PRJNA975428. All other data supporting the findings of this study are available within the paper. Readers can apply for access to data, which will be supplied in compliance with the obligations and responsibilities that the investigators hold for the patients involved in the study. Source data are provided with this paper.

References

  1. Antimicrobial Resistance Collaborators. Global burden of bacterial antimicrobial resistance in 2019: a systematic analysis. Lancet 399, 629-655 (2022).
  2. Dublanchet, A. & Fruciano, E. Brève histoire de la phagothérapie [A short history of phage therapy]. Med. Mal. Infect. 38, 415-420 (2008).
  3. Uyttebroek, S. et al. Safety and efficacy of phage therapy in difficult-to-treat infections: a systematic review. Lancet Infect. Dis. 22, e208-e220 (2022).
  4. Pirnay, J.-P. & Kutter, E. Bacteriophages: it’s a medicine, Jim, but not as we know it. Lancet Infect. Dis. 21, 309-311 (2021).
  5. Schooley, R. T. et al. Development and use of personalized bacteriophage-based therapeutic cocktails to treat a patient with a disseminated resistant Acinetobacter baumannii infection. Antimicrob. Agents Chemother. 61, e00954-17 (2017).
  6. Eskenazi, A. et al. Combination of pre-adapted bacteriophage therapy and antibiotics for treatment of fracture-related infection due to pandrug-resistant Klebsiella pneumoniae. Nat. Commun. 13, 302 (2022).
  7. Dedrick, R. M. et al. Engineered bacteriophages for treatment of a patient with a disseminated drug-resistant Mycobacterium abscessus. Nat. Med. 25, 730-733 (2019).
  8. Pirnay, J. P. et al. The magistral phage. Viruses 10, 64 (2018).
  9. Instructions for the Administration of Liquid Staphylococcal Bacteriophage Preparations for Injection (in Russian) (Ministry of Health and Ministry of Medical and Microbiological Industry of the USSR, 1987).
  10. Instructions for the Application of Liquid Streptococcal Bacteriophage Preparations (in Russian) (Ministry of Health and Ministry of Medical and Microbiology Industry of the USSR, 1987).
  11. Instructions for the Application of Combined Liquid Pyobacteriophage Preparations (in Russian) (Ministry of Medical and Microbiology Industry of the USSR, 1989).
  12. Djebara, S. et al. Processing phage therapy requests in a Brussels military hospital: lessons identified. Viruses 11, 265 (2019).
  13. Young, M. J. et al. Phage therapy for diabetic foot infection: a case series. Clin. Ther. 45, 797-801 (2023).
  14. Vogt, D. et al. “Beyond antibiotic therapy” – Zukünftige antiinfektiöse Strategien – Update 2017 [Beyond antibiotic therapy – Future antiinfective strategies – Update 2017]. Unfallchirurg 120, 573-584 (2017).
  15. Jennes, S. et al. Use of bacteriophages in the treatment of colistin-only-sensitive Pseudomonas aeruginosa septicaemia in a patient with acute kidney injury-a case report. Crit. Care 21, 129 (2017).
  16. Lebeaux, D. et al. A case of phage therapy against pandrug-resistant Achromobacter xylosoxidans in a 12-year-old lung-transplanted cystic fibrosis patient. Viruses 13, 60 (2021).
  17. Van Nieuwenhuyse, B. et al. Bacteriophage-antibiotic combination therapy against extensively drug-resistant Pseudomonas aeruginosa infection to allow liver transplantation in a toddler. Nat. Commun. 13, 5725 (2022).
  18. Van Nieuwenhuyse, B. et al. A case of in situ phage therapy against Staphylococcus aureus in a bone allograft polymicrobial biofilm infection: outcomes and phage-antibiotic interactions. Viruses 13, 1898 (2021).
  19. Onsea, J. et al. Bacteriophage application for difficult-to-treat musculoskeletal infections: development of a standardized multidisciplinary treatment protocol. Viruses 11, 891 (2019).
  20. Ferry, T. et al. Personalized bacteriophage therapy to treat pandrug-resistant spinal Pseudomonas aeruginosa infection. Nat. Commun. 13, 4239 (2022).
  21. Racenis, K. et al. Use of phage cocktail BFC 1.10 in combination with ceftazidime-avibactam in the treatment of multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa femur osteomyelitis – a case report. Front. Med. 9, 851310 (2022).
  22. Bakuradze, N. et al. Characterization of a bacteriophage GEC_vB_ Bfr_UZM3 active against Bacteroides fragilis. Viruses 15, 1042 (2023).
  23. Paul, K. et al. Bacteriophage rescue therapy of a vancomycin-resistant Enterococcus faecium infection in a one-year-old child following a third liver transplantation. Viruses 13, 1785 (2021).
  24. Tkhilaishvili, T. et al. Successful case of adjunctive intravenous bacteriophage therapy to treat left ventricular assist device infection. J. Infect. 83, e1-e3 (2021).
  25. Racenis, K. et al. Successful bacteriophage-antibiotic combination therapy against multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa left ventricular assist device driveline infection. Viruses 15, 1210 (2023).
  26. Blasco, L. et al. Case report: analysis of phage therapy failure in a patient with a Pseudomonas aeruginosa prosthetic vascular graft infection. Front. Med. 10, 1199657 (2023).
  27. Takeuchi, I. et al. The presence of two receptor-binding proteins contributes to the wide host range of staphylococcal twort-like phages. Appl. Environ. Microbiol. 82, 5763-5774 (2016).
  28. Treepong, P. et al. Global emergence of the widespread Pseudomonas aeruginosa ST235 clone. Clin. Microbiol. Infect. 24, 258-266 (2018).
  29. Hrabák, J. et al. Regional spread of Pseudomonas aeruginosa ST357 producing IMP-7 metallo- -lactamase in Central Europe. J. Clin. Microbiol. 49, 474-475 (2011).
  30. Ceyssens, P. J. et al. Phenotypic and genotypic variations within a single bacteriophage species. Virol. J. 8, 134 (2011).
  31. Kilmury, S. L. N. & Burrows, L. L. The Pseudomonas aeruginosa PilSR two-component system regulates both twitching and swimming motilities. mBio 9, e01310-e01318 (2018).
  32. Nunn, D., Bergman, S. & Lory, S. Products of three accessory genes, pilB, pilC, and pilD, are required for biogenesis of Pseudomonas aeruginosa pili. J. Bacteriol. 172, 2911-2919 (1990).
  33. Wehbi, H. et al. The peptidoglycan-binding protein FimV promotes assembly of the Pseudomonas aeruginosa type IV pilus secretin. J. Bacteriol. 193, 540-550 (2011).
  34. Kropinski, A. M., Chan, L., Jarrell, K. & Milazzo, F. H. The nature of Pseudomonas aeruginosa strain PAO bacteriophage receptors. Can. J. Microbiol. 23, 653-658 (1977).
  35. Koderi Valappil, S. et al. Survival comes at a cost: a coevolution of phage and its host leads to phage resistance and antibiotic sensitivity of Pseudomonas aeruginosa multidrug resistant strains. Front. Microbiol. 12, 783722 (2021).
  36. Yoshida, H., Bogaki, M., Nakamura, M. & Nakamura, S. Quinolone resistance-determining region in the DNA gyrase gyrA gene of Escherichia coli. Antimicrob. Agents Chemother. 34, 1271-1272 (1990).
  37. Takenouchi, T., Sakagawa, E. & Sugawara, M. Detection of gyrA mutations among 335 Pseudomonas aeruginosa strains isolated in Japan and their susceptibilities to fluoroquinolones. Antimicrob. Agents Chemother. 43, 406-409 (1999).
  38. Yonezawa, M. et al. Analysis of the -terminal 87th amino acid of Escherichia coli GyrA in quinolone-resistance. Microbiol. Immunol. 39, 517-520 (1995).
  39. Nakajima, A., Sugimoto, Y., Yoneyama, H. & Nakae, T. High-level fluoroquinolone resistance in Pseudomonas aeruginosa due to interplay of the MexAB-OprM efflux pump and the DNA gyrase mutation. Microbiol. Immunol. 46, 391-395 (2002).
  40. Church, D., Elsayed, S., Reid, O., Winston, B. & Lindsay, R. Burn wound infections. Clin. Microbiol. Rev. 19, 403-434 (2006).
  41. Rose, T. et al. Experimental phage therapy of burn wound infection: difficult first steps. Int. J. Burns Trauma 4, 66-73 (2014).
  42. Pirnay, J.-P. Phage therapy in the year 2035. Front. Microbiol. 11, 1171 (2020).
  43. Suh, G. A. et al. Considerations for the use of phage therapy in clinical practice. Antimicrob. Agents Chemother. 66, e0207121 (2022).
  44. Luria, S. E. & Delbrück, M. Mutations of bacteria from virus sensitivity to virus resistance. Genetics 28, 491-511 (1943).
  45. Castledine, M. et al. Parallel evolution of Pseudomonas aeruginosa phage resistance and virulence loss in response to phage treatment in vivo and in vitro. Elife 11, e73679 (2022).
  46. Westra, E. R. et al. Parasite exposure drives selective evolution of constitutive versus inducible defense. Curr. Biol. 25, 1043-1049 (2015).
  47. Gu Liu, C. et al. Phage-antibiotic synergy is driven by a unique combination of antibacterial mechanism of action and stoichiometry. mBio 11, e01462-20 (2020).
  48. Fungo, G. B. N. et al. “Two Is Better Than One”: the multifactorial nature of phage-antibiotic combinatorial treatments against ESKAPE-induced infections. Phage 4, 55-67 (2023).
  49. Torres-Barceló, C. & Hochberg, M. E. Evolutionary rationale for phages as complements of antibiotics. Trends Microbiol. 24, 249-256 (2016).
  50. Torres-Barceló, C. Phage therapy faces evolutionary challenges. Viruses 10, 323 (2018).
  51. Chan, B. K. et al. Phage selection restores antibiotic sensitivity in MDR Pseudomonas aeruginosa. Sci. Rep. 6, 26717 (2016).
  52. Abedon, S. T. Phage-antibiotic combination treatments: antagonistic impacts of antibiotics on the pharmacodynamics of phage therapy? Antibiotics 8, 182 (2019).
  53. Górski, A. et al. Phage as a modulator of immune responses: practical implications for phage therapy. Adv. Virus Res. 83, 41-71 (2012).
  54. Instructions for the Application of a Liquid Staphylococcal Phage Preparation for Injection (in Russian) (Ministry of Health of the USSR, 1986).
  55. Dedrick, R. M. et al. Potent antibody-mediated neutralization limits bacteriophage treatment of a pulmonary Mycobacterium abscessus infection. Nat. Med. 27, 1357-1361 (2021).
  56. Onsea, J. et al. Bacteriophage therapy for difficult-to-treat infections: the implementation of a multidisciplinary phage task force (The PHAGEFORCE Study Protocol). Viruses 13, 1543 (2021).
  57. Regulation (EU) No 536/2014 OF THE European Parliament and of the Council of 16 April 2014 on Clinical Trials On Medicinal Products For Human Use, And Repealing Directive 2001/20/EC (Official Journal of the European Union, 2014).
  58. Merabishvili, M. et al. Quality-controlled small-scale production of a well-defined bacteriophage cocktail for use in human clinical trials. PLoS ONE 4, e4944 (2009).
  59. Bolger, A. M., Lohse, M. & Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics 30, 2114-2120 (2014).
  60. Wick, R. R., Judd, L. M., Gorrie, C. L. & Holt, K. E. Unicycler: resolving bacterial genome assemblies from short and long sequencing reads. PLoS Comput. Biol. 13, e1005595 (2017).
  61. Prjibelski, A., Antipov, D., Meleshko, D., Lapidus, A. & Korobeynikov, A. Using SPAdes de novo assembler. Curr. Protoc. Bioinformatics 70, e102 (2020).
  62. Seemann, T. Prokka: rapid prokaryotic genome annotation. Bioinformatics 30, 2068-2069 (2014).
  63. Arndt, D. et al. PHASTER: a better, faster version of the PHAST phage search tool. Nucleic Acids Res. 44, W16-W21 (2016).
  64. Song, W. et al. Prophage Hunter: an integrative hunting tool for active prophages. Nucleic Acids Res. 47, W74-W80 (2019).
  65. Kutter, E. Phage host range and efficiency of plating. Methods Mol. Biol. 501, 141-149 (2009).
  66. Friman, V. P. et al. Pre-adapting parasitic phages to a pathogen leads to increased pathogen clearance and lowered resistance evolution with Pseudomonas aeruginosa cystic fibrosis bacterial isolates. J. Evol. Biol. 29, 188-198 (2016).
  67. Appelmans, R. Le dosage du Bacteriophage. (in French) Compt. Rend. Soc. Biol. 85, 1098 (1921).
  68. Burrowes, B. H., Molineux, I. J. & Fralick, J. A. Directed in vitro evolution of therapeutic bacteriophages: the Appelmans Protocol. Viruses 11, 241 (2019).
  69. Department for Industrial Bacterial and Viral Preparations. Guidelines for the Production of Combined Pyobacteriophage Solutions. N242-82 (in Russian) (Ministry of Health of the USSR, 1982).
  70. Guidelines for the Production of Staphylococcal Bacteriophage Solutions for Injection (in Russian) (Ministry of Health of the USSR, 1986).
  71. Department for the Monitoring of the Introduction of New Medicines and Medical Equipment. Staphylococcal Bacteriophage Solutions for Injection. ВФС 42-68BC-87 (in Russian) (Ministry of Health of the USSR, Pharmacopoeia Commission, 1987).
  72. Pharmacopoeia Article Concerning Combined Pyobacteriophage Solutions. AC 42-240BC-8 (in Russian) (Ministry of Health of the USSR, Pharmacopoeia Commission, 1989).
  73. Merabishvili, M., Pirnay, J.-P. & De Vos, D. Guidelines to compose an ideal bacteriophage cocktail. Methods Mol. Biol. 1693, 99-110 (2018).
  74. Duyvejonck, H. et al. Evaluation of the stability of bacteriophages in different solutions suitable for the production of magistral preparations in Belgium. Viruses 13, 865 (2021).
  75. Merabishvili, M. et al. Stability of bacteriophages in burn wound care products. PLoS ONE 12, e0182121 (2017).
  76. Astudillo, A., Leung, S. S. Y., Kutter, E., Morales, S. & Chan, H. K. Nebulization effects on structural stability of bacteriophage PEV 44. Eur. J. Pharm. Biopharm. 125, 124-130 (2018).
  77. Carrigy, N. B. et al. Anti-tuberculosis bacteriophage D29 delivery with a vibrating mesh nebulizer, jet nebulizer, and soft mist inhaler. Pharm. Res. 34, 2084-2096 (2017).
  78. Aslam, S. et al. Lessons learned from the first 10 consecutive cases of intravenous bacteriophage therapy to treat multidrug-resistant bacterial infections at a single center in the United States. Open Forum Infect. Dis. 7, ofaa389 (2020).
  79. Cano, E. J. et al. Phage therapy for limb-threatening prosthetic knee Klebsiella pneumoniae infection: case report and in vitro characterization of anti-biofilm activity. Clin. Infect. Dis. 73, e144-e151 (2021).
  80. Cantalapiedra, C. P., Hernández-Plaza, A., Letunic, I., Bork, P. & Huerta-Cepas, J. eggNOG-mapper v2: functional annotation, orthology assignments, and domain prediction at the metagenomic scale. Mol. Biol. Evol. 38, 5825-5829 (2021).
  81. Brown, C. L. et al. mobileOG-db: a manually curated database of protein families mediating the life cycle of bacterial mobile genetic elements. Appl. Environ. Microbiol. 88, e0099122 (2022).
  82. Starikova, E. V. et al. Phigaro: high-throughput prophage sequence annotation. Bioinformatics 36, 3882-3884 (2020).
  83. Krzywinski, M. et al. Circos: an information aesthetic for comparative genomics. Genome Res. 19, 1639-1645 (2009).
  84. Gao, F. & Zhang, C. T. GC-Profile: a web-based tool for visualizing and analyzing the variation of GC content in genomic sequences. Nucleic Acids Res. 34, W686-W691 (2006).
  85. Page, A. J. et al. Roary: rapid large-scale prokaryote pan genome analysis. Bioinformatics 31, 3691-3693 (2015).
  86. Letunic, I. & Bork, P. Interactive Tree Of Life (iTOL) v5: an online tool for phylogenetic tree display and annotation. Nucleic Acids Res. 49, W293-W296 (2021).
  87. Adams, M. H. Bacteriophages (Interscience Publishers, 1959).
  88. Harris, P. A. et al. Research electronic data capture (REDCap) a metadata-driven methodology and workflow process for providing translational research informatics support. J. Biomed. Inform. 42, 377-381 (2009).
  89. Magiorakos, A. P. et al. Multidrug-resistant, extensively drug-resistant and pandrug-resistant bacteria: an international expert proposal for interim standard definitions for acquired resistance. Clin. Microbiol. Infect. 18, 268-281 (2012).
  90. McDonnell, A. et al. Efficient delivery of investigational antibacterial agents via sustainable clinical trial networks. Clin. Infect. Dis. 63, S57-S59 (2016).
  91. R Core Team. R: A Language and Environment for Statistical Computing (R Foundation for Statistical Computing, 2016).
  92. Wickham, H. et al. Welcome to the tidyverse. J. Open Source Softw. 4, 1686 (2019).
  93. Conway, J. R., Lex, A. & Gehlenborg, N. UpSetR: an R package for the visualization of intersecting sets and their properties. Bioinformatics 33, 2938-2940 (2017).
  94. Kahle, D. & Wickham, H. ggmap: spatial visualization with ggplot2. R J. 5, 144-161 (2013).
  95. Massicotte, P. & South, A. rnaturalearth: world map data from natural earth. R package version 0.3.2.9000 https://cran.r-project. org/package=rnaturalearth (2023).

Acknowledgements

Most research and development and manufacturing costs were borne by the Royal Higher Institute for Defense, the QAMH, Sciensano and KU Leuven. C.C., G.S., M.M. and T.G. were supported by the Royal Higher Institute for Defence, Brussels, Belgium. C.L. was supported by a Postdoctoral Mandate from KU Leuven (PDMt2/21/038) and a junior postdoctoral fellowship from the Research Foundation Flanders (FWO) (12D8623N). This work would not have been possible without the support of E. Kutter, M. Vaneechoutte, R. Adamia, A. Vanderkelen, P. Neirinckx and G. Laire. The funders had no role in the conceptualization, design, data collection, analysis, decision to publish or preparation of the manuscript.

Author contributions

M.M., G.S., J.G., N.C., M.K., C.C., T.G., S.D.S. and Bacteriophage Donors isolated, characterized and made bacteriophages available for clinical use. M.M., G.S. and J.G. performed the in vitro matching (phagogram) of bacteriophages to the patients’ infecting bacteria. M.M. and B.V.N. performed the bacteriophage-antibiotic interaction assays. M.M., G.S. and J.G. produced the bacteriophage APIs and a substantial part of the magistral bacteriophage preparations. M.d.J., P.-J.C., J.W., C.L., S.G., R.L. and Bacteriophage Donors sequenced and analysed the genomes of the selected bacteriophages and bacteria. S.G. designed and performed the Galleria mellonella experiments. M.M., B.V.N. and J.O. performed the bacteriophage immune neutralization assays. M.d.J., P.-J.C., J.-P.D. and G.V. designed the quality management system, and performed and validated the quality control of the bacteriophage preparations. S.D., J.O., B.V.N., N.C., M.K., P.S. and J.-P.P. screened the BT requests, selected and coordinated BT cases, including the suggestion of BT protocols. S.D., J.O., B.V.N., N.C., M.K., T.R., J.-P.P. and Bacteriophage Therapy Providers facilitated or performed BT cases. S.D., A.S., E.V.B., D.D.V. and J.-P.P. collected and summarized all relevant clinical and epidemiological data. E.S., C.L. and J.-P.P. performed the statistical analysis. C.L., S.G. and J.-P.P. drafted the figures and tables. J.-P.P. prepared the first draft of the paper. All authors revised the final version and agreed to the submission of the final version.

Competing interests

R.N.-P. has been a scientific consultant for BiomX Inc., and has participated and served as a principal investigator and member of Data Safety Monitoring Boards for a clinical trial by Technophage S. A. M.D.L. and N.C. are co-founders of the startup Fagoterapia Lab s.r.l. T.F. is the principal investigator of the PhagoDAIR I study and is
consultant for PHAXIAM to conceive clinical trials (no direct funding, contract signed with hospices Civils de Lyon). R.N.-.P, S.M., T.F. and J.-P.P., respectively, serve as Chair, Secretary, Education Officer/ Clinical Officer and Science Officer of the European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases (ESCMID) Study Group for Non-Traditional Antibacterial Therapy (ESGNTA), Basel, Switzerland.

Additional information

Extended data is available for this paper at https://doi.org/10.1038/s41564-024-01705-x.
Supplementary information The online version contains supplementary material available at https://doi.org/10.1038/s41564-024-01705-x.
Correspondence and requests for materials should be addressed to Jean-Paul Pirnay.
Peer review information Nature Microbiology thanks Jeremy Barr, Jonathan Iredell, Frank Klawonn and Robert Schooley for their contribution to the peer review of this work. Peer reviewer reports are available.
Reprints and permissions information is available at www.nature.com/reprints.
Publisher’s note Springer Nature remains neutral with regard to jurisdictional claims in published maps and institutional affiliations.
Open Access This article is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License, which permits use, sharing, adaptation, distribution and reproduction in any medium or format, as long as you give appropriate credit to the original author(s) and the source, provide a link to the Creative Commons licence, and indicate if changes were made. The images or other third party material in this article are included in the article’s Creative Commons licence, unless indicated otherwise in a credit line to the material. If material is not included in the article’s Creative Commons licence and your intended use is not permitted by statutory regulation or exceeds the permitted use, you will need to obtain permission directly from the copyright holder. To view a copy of this licence, visit http://creativecommons. org/licenses/by/4.0/.
(c) The Author(s) 2024

Jean-Paul Pirnay 、Sarah Djebara , Griet Steurs , Johann Griselain , Christel Cochez , Steven De Soir , Tea Glonti , An Spiessens , Emily Vanden Berghe , Sabrina Green © , Jeroen Wagemans © , Cédric Lood © , Eddie Schrevens , Nina Chanishvili , Mzia Kutateladze (1) , Mathieu de Jode , Pieter-Jan Ceyssens , Jean-Pierre Draye , Gilbert Verbeken , Daniel De Vos¹, Thomas Rose¹, Jolien Onsea , Brieuc Van Nieuwenhuyse © , Bacteriophage Therapy Providers*, Bacteriophage Donors*, Patrick Soentjens , Rob Lavigne © & Maya Merabishvili

Bacteriophage Therapy Providers

Kim Win Pang , Willem-Jan Metsemakers , Dimitri Van der Linden , Olga Chatzis , Anaïs Eskenazi , Angel Lopez , Adrien De Voeght , Anne Françoise Rousseau , Anne Tilmanne , Daphne Vens , Jean Gérain , Brice Layeux , Erika Vlieghe , Ingrid Baar , Sabrina Van Ierssel , Johan Van Laethem , Julien Guiot , Sophie De Roock , Serge Jennes , Saartje Uyttebroek , Laura Van Gerven , Peter W. Hellings , Lieven Dupont , Yves Debaveye , David Devolder , Isabel Spriet , Paul De Munter , Melissa Depypere , Michiel Vanfleteren , Olivier Cornu , Stijn Verhulst , Tine Boiy , Stoffel Lamote , Thibaut Van Zele , Grégoire Wieërs , Cécile Courtin , David Lebeaux , Jacques Sartre , Tristan Ferry , Frédéric Laurent , Kevin Paul , Mariagrazia Di Luca , Stefan Gottschlich , Tamta Tkhilaishvili , Novella Cesta , Karlis Racenis , Telma Barbosa , Luis Eduardo López-Cortés , Maria Tomás , Martin Hübner , Truong-Thanh Pham , Paul Nagtegaal , Jaap Ten Oever , Johannes Daniels , Maartje Loubert , Ghariani Iheb , Joshua Jones , Lesley Hall & Matthew Young

Bacteriophage Donors

Nana Balarjishvili , Marina Tediashvili , Yigang Tong , Christine Rohde , Johannes Wittmann , Ronen Hazan , Ran Nir-Paz , Joana Azeredo , Victor Krylov , David Cameron , Melissa Pitton , Yok-Ai Que , Gregory Resch , Shawna McCallin , Matthew Dunne & Samuel Kilcher
College of Life Science and Technology, Beijing University of Chemical Technology, Beijing, China. Leibniz Institute DSMZ, German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH, Braunschweig, Germany. Israeli Phage Therapy Center (IPTC) of Hadassah Medical Center and the Hebrew University, Jerusalem, Israel. Department of Biological Engineering, University of Minho, Braga, Portugal. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera, Moscow, Russia. Department of Intensive Care Medicine, Bern University Hospital, University of Bern, Bern, Switzerland. Laboratory of Bacteriophages, Lausanne University Hospital, Lausanne, Switzerland. Department of Neuro-Urology, Balgrist University Hospital, University of Zürich, Zürich, Switzerland. Institute of Food, Nutrition and Health, ETH Zurich, Zurich, Switzerland.
Extended Data Table 1 | Baseline characteristics of the first 100 consecutive patients treated with bacteriophages
Baseline characteristics of the 100 analysed patients
Number of cases 100
Sex (female), % ( )* 43.3% (39)
Age group, % ( )*
0 to < 24 months 5.6% (5)
2 to < 20 years 13.3% (12)
20 to < 40 years 14.4% (13)
40 to < 60 years 33.3% (30)
60 to < 80 years 28.9% (26)
80 to < 100 years 4.4% (4)
Care setting, % ( )
Hospitalized 77% (77)
Ambulatory care 21% (21)
Hospitalized & ambulatory care 2% (2)
Regulatory context, % ( )
Standard-of-care with magistral bacteriophage preparations 48% (48)
Article 37 of the Declaration of Helsinki 39% (39)
Standard-of-care with unlicensed medicines 10% (10)
‘Autorisation Temporaire d’Utilisation’ of magistral preparations 3% (3)
Infection types, % ( )**
Lower respiratory tract infection 25.4% (29)
Skin & soft tissue infection 22.8% (26)
Bone infection 14.0% (16)
Upper respiratory tract infection 11.4% (13)
Bloodstream infection 8.8% (10)
Abdominal infection 5.3% (6)
Orthopaedic prostheses infection 5.3% (6)
Urinary tract infection 1.8% (2)
Other 5.3% (6)
Antibiotic resistance profile of targeted infections, % ( )**
Usual drug resistance 47.4% (54)
Multidrug resistance 25.4% (29)
Extensive drug resistance 20.2% (23)
Pandrug resistance 5.3% (6)
Extensive drug resistance & multidrug resistance 0.9% (1)
Extensive drug resistance & usual resistance 0.9% (1)
Concomitant standard-of-care antibiotic treatment, % ( )** 69.3% (79)
  • (for 10 patients, age and gender were not disclosed) ** (including 14 second-site infections).
Extended Data Table 2 | Characteristics of the bacteriophage therapy cases that necessitated pre-adaptation of bacteriophages
Patient number Infection type Targeted bacterial species Pre-adapted bacteriophage(s) # serial passages used for pre-adaptation Propagation strain used in production Clinical improvement Eradication of the targeted bacteria
9 Fracture-related infection Klebsiella pneumoniae M1 15 Patient strain Yes Yes
16 Cystic fibrosis lung transplant infection Achromobacter xylosoxidans JWAlpha, JWDelta, JWT, and 2-1 (APC 1.1 and APC 2.1) 3 Patient strain Yes Yes
40 Chronic osteomyelitis Bacteroides fragilis UZM3 4 Patient strain No No
43 Lung transplant infection Enterococcus faecium EfgrKN and EfgrNG 2 Patient strain Yes No
46 Disseminated bronchiectasis Staphylococcus aureus Stenotrophomonas maltophilia ISP BUCT700 6 2 Patient strain Yes No
55 Prosthetic knee infection Staphylococcus epidermidis ISP* 4 ATCC6538 No No
66 Cystic fibrosis lung infection Mycobacterium abscessus 8UZL 5 Patient strain No No
82 Cystic fibrosis lung infection Pseudomonas aeruginosa 4P and DP1 3 573 Yes Yes
*Staphylococcus aureus bacteriophage ISP was pre-adapted (using 4 serial passages), on five strains, from five different patients to better target Staphylococcus epidermidis strains.
Extended Data Table 3 | Suspected adverse drug reactions and events in the 100 consecutive bacteriophage therapy cases, reported using EudraVigilance terminology
Patient number Drug information Reaction / Event
Drug (Bacteriophage product) Route of administration Duration of administration (days) Indication MedDRA LLT Duration (days) Relatedness of drug to reaction/event Action taken with drug Outcome Seriousness
3 BFC 1 Respiratory (inhalation) 4 Lower respiratory tract infection Septic shock 2 Not suspected Drug withdrawn Fatal Death
11 BFC 2 Respiratory (inhalation) and oral 10 Lower respiratory tract infection Coughing after drug inhalation* 6 Suspected Dose not changed Recovered/ resolved Not serious
20 BFC 1 Intralesional and intravenous 7 (intralesional) 86 (intravenous) Abdominal and bloodstream infection Abdominaldiscomfort* 2 Suspected Drug withdrawn Recovered/ resolved Not serious
31 ISP Nasal 21 Ear, nose and throat infection Rash lips* 1 Suspected Drug withdrawn Recovered/ resolved Not serious
39 ISP Intralesional 10 Bone infection Fever* 1 Suspected Dose not changed Recovered/ resolved Not serious
42 PyoPhage (Eliava) Intralesional 7 Bone infection Application site redness and pain* 1 Suspected Dose not changed Recovered/ resolved Not serious
44 M1 Respiratory (inhalation) and intravesical 14 (respiratory) 10 (intravesical) Lower respiratory tract and urinary tract infection Septic shock 11 Not suspected Drug withdrawn Fatal Death
58 ISP Topical 6 Diabetic foot infection Heart failure 2 Not suspected Drug withdrawn Recovered/ resolved Life threatening
69 M1 Intralesional 18 Abdominal infection Cardiogenic shock Unknown Not suspected Drug withdrawn Fatal Death
79 PNM and PTO7 Intravenous 4 Chronic spondylodiscitis Postoperative ileus 1 Not suspected Drug withdrawn Fatal Death
88 E4 and Efs7 Intra-articular and intravenous 3 (intra-articular) 15 (intravenous) Bone infection Body temperature increased* 1 Suspected Dose not changed Recovered/ resolved Not serious
93 14-1 Intralesional and respiratory (inhalation) 7 (intralesional) 14 (respiratory) Empyema and spinocellular carcinoma Tumour progression and palliative care 10** Not suspected Drug withdrawn Fatal Death
96 14-1, PNM and PTO7 Topical and intravenous 1 (topical) 5 (intravenous) Burninfection and bloodstream infection Septic shock 4 Not suspected Drug withdrawn Fatal Death
99 ISP Nasal 21 Chronic sinusitis Diarrhoea and abdominal pain* 25 Suspected Dose not changed Recovered/ resolved Not serious
100 ISP Intralesional 7 Surgical wound infection with fistula Nausea 1 Not suspected Dose not changed Recovered/ resolved Not serious
relationship between BT and the event was suspected and reported. **The patients died 10 days after the start of palliative care and the discontinuation of BT.
Extended Data Fig. 1| The Phage Therapy Coordination Centre’s patient selection process for bacteriophage therapy.
POSITION EFFECT LOCUS_TAG ANNOTATED PRODUCT PREDICTION HHPRED/HMMER/Phyre
41566 missense_variant c.1745A>C p.Lys582Thr HOQ69_gp039 Structural protein (ESI-MS) Putative carbohydrate-binding domain protein (Staphylococcus virus K)
43215 missense_variant c.1068G>T p.Lys356Asn HOQ69_gp041 Structural protein (ESI-MS) Putative receptor binding protein (Staphylococcus virus K)
60502 missense_variant c.91T>C p.Ser31Pro HOQ69_gp060 Putative DNA polymerase Uracil-DNA glycosylase
82393 missense_variant c.170G>A p.Ser57Asn HOQ69_gp095 Hypothetical protein /
Extended Data Fig. 2 | Missense mutations in the pre-adapted variant of S0022283617305879), HMMR (https://nar.oxfordjournals.org/content/46/W1/
bacteriophage ISP, as compared to the original clone (before adaptation). W200), and Phyre (https://www.nature.com/articles/nprot.2009.2) were used
HHpred (https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/ for functional prediction. ESI-MS, electrospray ionization mass spectrometry.
Extended Data Fig. 3 | Kaplan-Meier plots and activity scores of Galleria mellonella larvae post-infection. Ten larvae in each group were either inoculated with phosphate buffered saline (PBS, control), with the initial bacteriophage-susceptible isolates (wild type, wt), or with the in vivo selected bacteriophage-insensitive mutants of the Pseudomonas aeruginosa strains
isolated from patient (P) 91, 54, and 30. a-b, P54 (Is1 and 4). c-d, P30 (Is1 and 3). e-f, P91 (Is1 to 6). Mean values of activity scores are represented by a dot symbol. values were calculated using the log-rank test with Bonferroni correction for multiple comparisons. Is, isolate; mut, mutation.
Extended Data Fig. 4 | Results of the in vitro evaluation of the influence of serial multiplicities of infection (MOIs) on the virulence and on the resistance suppression of Pseudomonas aeruginosa bacteriophage 4 K on
the bacterial host strain CN573, as determined in liquid culture, using an OmniLog” system. Bacterial proliferation is presented through relative units of cellular respiration over time ( 72 h).

natureportfolio

Corresponding author(s): Jean-Paul Pirnay
Last updated by author(s): March 27, 2024

Reporting Summary

Nature Portfolio wishes to improve the reproducibility of the work that we publish. This form provides structure for consistency and transparency in reporting. For further information on Nature Portfolio policies, see our Editorial Policies and the Editorial Policy Checklist.

Statistics

For all statistical analyses, confirm that the following items are present in the figure legend, table legend, main text, or Methods section.

Confirmed


The exact sample size ( ) for each experimental group/condition, given as a discrete number and unit of measurement

A statement on whether measurements were taken from distinct samples or whether the same sample was measured repeatedly

The statistical test(s) used AND whether they are one- or two-sided
Only common tests should be described solely by name; describe more complex techniques in the Methods section.

A description of all covariates tested

A description of any assumptions or corrections, such as tests of normality and adjustment for multiple comparisons

A full description of the statistical parameters including central tendency (e.g. means) or other basic estimates (e.g. regression coefficient) AND variation (e.g. standard deviation) or associated estimates of uncertainty (e.g. confidence intervals)
X
For null hypothesis testing, the test statistic (e.g. ) with confidence intervals, effect sizes, degrees of freedom and value noted Give values as exact values whenever suitable.
For Bayesian analysis, information on the choice of priors and Markov chain Monte Carlo settings
For hierarchical and complex designs, identification of the appropriate level for tests and full reporting of outcomes
Estimates of effect sizes (e.g. Cohen’s , Pearson’s ), indicating how they were calculated
Our web collection on statistics for biologists contains articles on many of the points above.

Software and code

Policy information about availability of computer code

Data collection

REDCap (Research Electronic Data Capture) and Microsoft Excel (version 16.77)

Data analysis

Trimmomatic (version 0.32), Guppy (versions 6.0.1 and 6.3.8), Unicycler (versions 0.4.7 and 0.4.8), SPAdes (Galaxy Version 3.15.4+), Prokka (version Galaxy 1.14.6), PHASTER (https://phaster.ca/), Prophage Hunter (https://pro-hunter.bgi.com/), Biolog Data Analysis software (version 1.7), Porechop (version 0.2.4), Snippy (version 4.6.0), EggNOG-mapper (version 2.1.8), mobileOG-db (version 1.1.2), Phigaro (version 2.3.0), circos (version 0.69.8), and GC-profile, Roary (version 3.13.0), fasttree (version 2.1.10), iTOL (itol.embl.de), SAS (version 9.4), R (version 4.3.0), tidyverse (version 2.0.0), UpSetR (version 1.4.0), ggmap (version 3.0.2), rnaturalearth (R package version 0.3.2.9000), and GraphPad V (version 0.5.1), the PHROGS v3 database (https://phrogs.lmge.uca.fr/)ARG-ANNOT (ARG-ANNOT NT V6 July 2019), CARD (Versions 3.1.4 to 3.2.5), ResFinder (https://bitbucket.org/genomicepidemiology/resfinder_db), blastn web interface (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), VFDB full (downloaded on 20 April 2022), Bowtie2 (Galaxy Version 2.5.0)
For manuscripts utilizing custom algorithms or software that are central to the research but not yet described in published literature, software must be made available to editors and reviewers. We stronglyencourage code deposition in a community repository (e.g. GitHub). See the Nature Portfolio guidelines for submitting code & software for further information.

Data

Policy information about availability of data

All manuscripts must include a data availability statement. This statement should provide the following information, where applicable:
  • Accession codes, unique identifiers, or web links for publicly available datasets
  • A description of any restrictions on data availability
  • For clinical datasets or third party data, please ensure that the statement adheres to our policy
Detailed clinical protocols, results, and additional data are available in the manuscript and in Supplementary Tables 1 and 2. The protocol for the retrospective, observational study is available at: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT05498363?term=NCT05498363&draw=2&rank=l. The bacteriophage genome sequences can be retrieved in the GenBank database under the accession codes listed in Extended Data Table 1. The genome data of the bacterial isolates can be accessed via the NCBI BioProject PRJNA975428. PHROGS v3 database available at https://phrogs.lmge.uca.fr/. The authors declare that all other data supporting the findings of this study are available within the article.

Research involving human participants, their data, or biological material

Policy information about studies with human participants or human data. See also policy information about sex, gender (identity/presentation), and sexual orientation and race, ethnicity and racism.

Reporting on sex and gender

Reporting on race, ethnicity, or other socially relevant groupings

Population characteristics

Recruitment

Ethics oversight
The median age of the patients was 53 years ( years), and of the patients were male. No effects of age or gender on eradication were found using a logistic regression analysis.
Race, ethnicity, or other socially relevant groupings were not considered or reported.
The median age of the patients was 53 years ( years), and of the patients were male. No effects of age or gender on eradication were found using a logistic regression analysis.
This study concerns the first 100 consecutive bacteriophage therapy (BT) cases facilitated by a Belgian consortium (single group, open label). Physicians requesting BT with bacteriophage preparations for their patients submitted a BT request to the Phage Therapy Coordination Centre (PTCC) of the QAMH. The PTCC procedure for selecting patients for BT is depicted in Extended Data Figure 1 and is largely determined by clinical need, regulatory approval, and the availability of bacteriophages targeting the infecting bacteria.
According to EU Regulation No 536/2014 (Clinical Trials Regulation), its transposition to Belgian Law, and per advice of the Leading Ethical Committee of the “Universitair Ziekenhuis Antwerpen” and the “Universiteit Antwerpen” (ID 3644), which approved the observational study protocol. The present retrospective non-interventional analysis of an existing and de-identified BT database was not considered as an experiment on the human person and did not require a dedicated informed consent. This information is also provided in the manuscript.
Note that full information on the approval of the study protocol must also be provided in the manuscript.

Field-specific reporting

Please select the one below that is the best fit for your research. If you are not sure, read the appropriate sections before making your selection.
Life sciences Behavioural & social sciences Ecological, evolutionary & environmental sciences
For a reference copy of the document with all sections, see nature.com/documents/nr-reporting-summary-flat.pdf

Life sciences study design

All studies must disclose on these points even when the disclosure is negative.
Sample size 100 patients (retrospective report no sample predetermined). For Galleria mellonella sample size was based on previous publication Nieuwenhuyse et al., 2022)
Data exclusions For Galleria model one experiment was excluded from the analysis as different time points and measurements were taken.
Replication Bacteriophage – antibiotic synergy testing was performed only once, in an emergency routine setting, prior to the application of bacteriophages. For Galleria model this experiment was repeated once. All other experiments were repeated at least 3 times.
Randomization Patients were not randomised. The study has a single group design. For G. mellonella, larvae were randomly assigned.
Blinding There was no blinding. The study has an open label design. For G. mellonella the assessment was not blinded.

Reporting for specific materials, systems and methods

We require information from authors about some types of materials, experimental systems and methods used in many studies. Here, indicate whether each material, system or method listed is relevant to your study. If you are not sure if a list item applies to your research, read the appropriate section before selecting a response.
Materials & experimental systems Methods
n/a n/a

Animals and other research organisms

Policy information about studies involving animals; ARRIVE guidelines recommended for reporting animal research, and Sex and Gender in. Research
Laboratory animals Species is Galleria mellonella; strain is unspecified; sex indifferent; stage larvae; age about 3 weeks
Wild animals No wild animals used in this study
Reporting on sex Sex was not considered
Field-collected samples The study did not involve samples collected from the field
Ethics oversight It was considered that use of this invertebrate model did not require specific guidance.
Note that full information on the approval of the study protocol must also be provided in the manuscript.

Clinical data

Policy information about clinical studies

All manuscripts should comply with the ICMJE guidelines for publication of clinical research and a completed CONSORT checklist must be included with all submissions.
Clinical trial registration Study BT100, ID: NCT05498363
Study protocol The protocol for the retrospective, observational study is available at: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT0S498363? term=NCTOS498363&draw=2&rank=l.
Data collection Prior to BT, demographic and clinical data were collected through a medical form, which was completed by the Bacteriophage Therapy Providers. The medical doctor’s BT prescription, information regarding the applied bacteriophage product and its administration route, dosage, duration, and information with regard to possible concomitant (antibiotic) treatments were also recorded. The “phagograms”, reporting on the evaluation of the bacteriophage susceptibility of the patient’s bacterial isolates sampled before and sometimes during treatment were also archived. If the bacteriophage treatment was performed in a hospital, a clinical follow-up form, requesting information about the clinical outcome (incl. possible adverse events and reactions), was completed by the treating physician and the nursing team and sent to the PTCC. In case of ambulatory BT, clinical follow-up information was collected directly from the patients. All demographic, bacteriophage product, and clinical data were recorded in a REDCap (Research Electronic Data Capture) designed database. Details on settings, places where the data were collected and periods when collected and data collection are included in the manuscript.
Outcomes Clinical improvement, eradication of the targeted bacterium, and the advent, severity and duration of adverse events or reactions were assessed by the treating physician.
  2. ¹Laboratory for Molecular and Cellular Technology, Queen Astrid Military Hospital, Brussels, Belgium. European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases (ESCMID) Study Group for Non-traditional Antibacterial Therapy (ESGNTA), Basel, Switzerland. Center for Infectious Diseases, Queen Astrid Military Hospital, Brussels, Belgium. Laboratory of Gene Technology, Department of Biosystems, KU Leuven, Leuven, Belgium. Department of Biosystems, KU Leuven, Leuven, Belgium. Eliava Institute of Bacteriophages, Microbiology and Virology, Tbilisi, Georgia. Bacterial Diseases, Sciensano, Brussels, Belgium. Department of Trauma Surgery, University Hospitals Leuven; Department of Development and Regeneration, KU Leuven, Leuven, Belgium. Institute of Experimental and Clinical Research, Pediatric Department, UCLouvain, Brussels, Belgium. These authors contributed equally: Jean-Paul Pirnay, Sarah Djebara. These authors jointly supervised this work: Patrick Soentjens, Rob Lavigne, Maya Merabishvili. *Lists of authors and their affiliations appear at the end of the paper. -mail: jean-paul.pirnay@mil.be
  3. Pediatric Infectious Diseases, Pediatric Department, Cliniques Universitaires Saint-Luc, Université Catholique de Louvain-UCLouvain, Brussels, Belgium.
    Clinic of Infectious Diseases, Erasme Hospital, Brussels, Belgium. HNO-Zentrum Simmering, Vienna, Austria. Department of Medicine, Division of Hematology, Centre Hospitalier Universitaire de Liège, University of Liège, Liège, Belgium. Department of Intensive Care and Burn Center, University Hospital, University of Liège, Liège, Belgium. Faculté de Médecine, Université Libre de Bruxelles, Brussels, Belgium. Division of Pediatric Infectious Diseases and Infection Prevention and Control, Hôpital Universitaire des Enfants Reine Fabiola, Université Libre de Bruxelles (ULB), Brussels, Belgium. Department of Internal Medicine, Delta Hospital (CHIREC), Brussels, Belgium. Delta Hospital (CHIREC), Brussels, Belgium. Department of General Internal Medicine, Infectious Diseases and Tropical Medicine, University Hospital Antwerp, Edegem, Belgium. Department of Critical Care Medicine, University Hospital Antwerp, University of Antwerp, Edegem, Belgium. Department of Internal Medicine and Infectious Diseases, Vrije Universiteit Brussel, Universitair Ziekenhuis Brussel, Brussels, Belgium. Pneumology Department, CHU Liège, Domaine Universitaire du Sart-Tilman, Liège, Belgium. Queen Astrid Military Hospital, Brussels, Belgium. Department of Otorhinolaryngology, Head and Neck Surgery, University Hospitals Leuven; Experimental Otorhinolaryngology, Rhinology Research, Department of Neurosciences, KU Leuven, Leuven, Belgium. Department of Pneumology, University Hospitals Leuven; Respiratory Diseases and Thoracic Surgery, Department of Chronic Diseases and Metabolism, KU Leuven, Leuven, Belgium. Department of Intensive Care Medicine, University Hospitals Leuven; Department of Cellular and Molecular Medicine, KU Leuven, Leuven, Belgium. Pharmacy Department, University Hospitals Leuven, Leuven, Belgium. Pharmacy Department, University Hospitals Leuven; Clinical Pharmacology and Pharmacotherapy, Department of Pharmaceutical and Pharmacological Sciences, KU Leuven, Leuven, Belgium. Department of General Internal Medicine, University Hospitals Leuven; Department of Microbiology, Immunology and Transplantation, KU Leuven, Leuven, Belgium. Department of Laboratory Medicine, University Hospitals Leuven; Laboratory of Clinical Bacteriology and Mycology, KU Leuven, Leuven, Belgium. St-Jozefskliniek Izegem, Izegem, Belgium. Department of Orthopaedic Surgery, University Hospital Saint Luc, Brussels, Belgium. Department of Pediatrics, Antwerp University Hospital, Edegem, Belgium. Department of Intensive Care Medicine, AZ Groeninge, Kortrijk, Belgium. Department of Otorhinolaryngology, UZ Ghent University Hospital, Ghent, Belgium. Service de Médecine Interne Générale, Clinique Saint Pierre, Ottignies, Belgium. Service de Dermatologie, Cliniques Saint-Pierre, Ottignies, Belgium. Service de Microbiologie, Unité Mobile d’Infectiologie, AP-HP, Hôpital Européen Georges Pompidou, Paris, France. Laboratoire de biologie médicale, Centre Hospitalier de Valence, Valence, France. Centre de Référence des Infections Ostéo-Articulaires Complexes de Lyon (CRIOAc Lyon), Hospices Civils de France, Lyon, France. Institut des agents Infectieux – Hospices Civils de Lyon, Centre International de Recherche en Infectiologie, Lyon, France. University Children’s Hospital, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, Hamburg, Germany. Department of Biology, University of Pisa, Pisa, Italy. Praxis Cordes and Gottschlich and Heß and Scherl, Rendsburg, Germany. Department of Cardiothoracic and Vascular Surgery, Charité German Heart Center, Berlin, Germany. PhD Course in Microbiology, Immunology, Infectious Diseases, and Transplants (MIMIT), University of Rome Tor Vergata, Rome, Italy. Department of Biology and Microbiology, Riga Stradins University, Riga, Latvia. Department of Pediatrics, Maternal Child Center of the North (CMIN), University Hospital Center of Porto (CHUP), Porto, Portugal. Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica, Hospital Universitario Virgen Macarena, Sevilla, Spain. Translational and Multidisciplinary Microbiology Group (MicroTM) – Institute of Biomedical Research A Coruña, Microbiology Department of Hospital of A Coruña (CHUAC), University of A Coruña (UDC), A Coruña, Spain. Department of Visceral Surgery, Lausanne University Hospital CHUV, University of Lausanne (UNIL), Lausanne, Switzerland. Division of Infectious Diseases, Department of Medicine, Geneva University Hospitals, Geneva, Switzerland. Department of Otorhinolaryngology and Head and Neck Surgery, Erasmus MC, Rotterdam, the Netherlands. Department of Internal Medicine and Radboud Centre for Infectious Diseases, Radboud University Medical Center, Nijmegen, the Netherlands. Department of Pulmonary Medicine, Amsterdam UMC Locatie VUmc, Amsterdam, the Netherlands. Meander Medisch Centrum, Amersfoort, the Netherlands. Clinique Saint Augustin, Tunis, Tunisia. Edinburgh Medical School: Biomedical Sciences, University of Edinburgh, Edinburgh, UK. Diabetes and Endocrinology, Queen Elizabeth University Hospital, Glasgow, UK. Diabetes Foot Clinic, Royal Infirmary, Edinburgh, UK.