© المؤلفون 2023

بحث الخلايا (2024) 34:13-30؛https://doi.org/10.1038/s41422-023-00864-6

الفوسفوريلATION التأكسدية (OXPHOS) هي العملية الرئيسية لإنتاج ATP التي تتطلب الأكسجين. تقوم خلايا العضلات بزيادة تنظيم OXPHOS لزيادة إمدادات الطاقة أثناء التمرين. يتم تحقيق ذلك جزئيًا من خلال التحول إلى أكسدة اللاكتات عبر OXPHOS. على الرغم من أن هذه العمليات تتماشى مع زيادة إمداد ATP الموزع عبر الشبكة الميتوكوندرية لعملية انقباض العضلات أثناء التمرين، يثير هذا سؤالاً حول كيفية الحفاظ على توازن بين استهلاك الأكسجين من خلال عملية الفسفرة التأكسدية (OXPHOS) التي تولد ATP والظروف الناجمة عن نقص الأكسجين التي تخلقها التمارين. وذلك لأنه، على الرغم من أن إمدادات الأكسجين داخل العضلات تزداد من خلال تحسين قدرة الانتشار الرئوي، وإنتاج القلب، وقدرة الدم على حمل الأكسجين، واستخراج الأكسجين من العضلات الهيكلية أثناء التمرين، نقص الأكسجين، أي انخفاض الضغط الجزئي للأكسجين ) من تور، في حالة الراحة، إلى 3-4 تور تحت التمرين عند حوالي 65% من استهلاك الأكسجين الأقصى يتم تحفيزه في العضلات. علاوة على ذلك، فإن الآلية التي تستخدمها خلايا العضلات لمنع الإفراط في إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS)، والتي تحدث تحت نقص الأكسجين المرتبط بالتمارين الهوائية. ويؤدي إلى الإجهاد التأكسدي في الخلايا والأنسجة، لا يزال غير واضح.

تتكيف الفسيولوجيا الخلوية مع توفر الأكسجين من خلال استشعار توفر الأكسجين عبر الهيدروكسيلاز البروتين (PHDs) – فون هيبل-لينداو (VHL). -عامل نقص الأكسجين القابل للتحفيز (HIFa) محور. تستخدم الدكتوراه الأكسجين و -كيتوجلوتارات كركائز لهيكله هيدروكسيلي لذرات البرولين في البروتينات التي تحتوي على تسلسلات معترف بها من قبل PHD. تُعترف البروتينات الهيدروكسيليّة، مثل HIF1a، وتُحلل لاحقًا بواسطة VHL، وهو إنزيم E3. تعتبر عوامل النسخ HIFas عوامل تنظيمية تتحكم في مجموعة من العمليات، مثل امتصاص الجلوكوز، وتحلل السكر، وتكوين الأوعية الدموية التي توفر الركائز لعملية الفسفرة التأكسدية. ومع ذلك، فإن عوامل الاستجابة لنقص الأكسجين لا تنظم مباشرة عملية الفسفرة التأكسدية في خلايا العضلات، بل تمارس فقط تنظيمًا نسخيًا، والذي يستغرق ساعات ليكون فعالًا، وبالتالي تتأخر عن التغيرات الناتجة عن التمرين في عملية الفسفرة التأكسدية في العضلات التي تستغرق دقائق فقط لتظهر بعد بدء التمرين.

يتم تحفيز اللاكتات بسرعة بواسطة التمرين أو نبض القلب، بسبب زيادة التحلل الجليكولي الهوائي وتحلل الجليكوجين الذي يرفع مستوى البيروفات. الذي يتم تحويله بعد ذلك بشكل حراري ديناميكي ملائم إلى لاكتات بواسطة إنزيم لاكتات ديهيدروجيناز A (LDHA). بجانب LDHA، يتم تحديد توازن اللاكتات أيضًا بواسطة مركب ديهيدروجيناز البيروفات (PDC) الذي يوجه البيروفات إلى الأسيتيلCoA. ) كمادة أساسية في نظام أكسدة الفوسفور. في خلايا العضلات، فإن PDC،

الذي يتم تفعيله أثناء التمرين بسبب التغيرات التي تحدث في NADH/NAD نسبة وأيونات المعادن، يمكن أن يتم تعطيله عن طريق الأسيتيل. ومن خلال ارتباط PHD3 بـ PDC E1 بيتا (PDHE1B)، كلاهما يؤديان إلى زيادة في فسفرة السيرينات 232 و293 و300 من PDHA1، الوحدة الحفازة من PDC. الحد من AcCoA، الذي ينشأ من الجلوكوز، والجليكوجين، واللاكتات التحلل عبر أو من أكسدة الأحماض الدهنية (FAO)، تثبط OXPHOS وتقلل من استهلاك الأكسجين. ومع ذلك، فإن اللاكتات، بينما تعمل كمصدر وقود مفضل لعضلات القلب والخلايا عبر OXPHOS، تثبط تحلل الدهون. ونقل الأحماض الدهنية إلى الميتوكوندريا بواسطة الكارنيتين بالميتويل ترانسفيراز 1 (CPT1)، يظهر أن اللاكتات تمارس تنظيمًا إيجابيًا وسلبيًا لعملية الفسفرة التأكسدية.

تظل الآليات الكامنة وراء استشعار اللاكتات وكذلك توليد إشارات اللاكتات لتنظيم التنفس الخلوي المؤكسد غير واضحة. يتم تسليط الضوء على إشارات اللاكتات من خلال تعديل الليسين في البروتينات بواسطة اللاكتات. على الرغم من أن إنزيم اللاكتيل ترانسفيراز الحقيقي لا يزال بعيد المنال. الطفرات في إنزيم الألانين-تRNA سينثيتاز 2 (AARS2)، الذي يحفز تشكيل الألانيل-tRNA في تخليق البروتينات الميتوكوندرية ويحفز الألانيلات من الليسين في البروتينات، تسبب في ضعف OXPHOS، واضطراب حمض اللاكتيك وفقدان وظيفة العضلات، مع آليات غير محددة. لقد أثار اهتمامنا احتمال أن يعمل AARS2 كإنزيم نقل اللاكتيل المحتمل الذي ينظم عملية الفسفرة التأكسدية في العضلات. في هذه الدراسة، هدفنا إلى تحديد ما إذا كان AARS2 يعمل كإنزيم نقل اللاكتيل الميتوكوندري الذي يدمج إشارات نقص الأكسجين داخل الخلايا وإشارات اللاكتات لتنظيم عملية الفسفرة التأكسدية في خلايا العضلات.

البروتين AARS2 البرولين 377 (P377) يقع في تسلسل يتعرف على PHD، الذي لا يوجد في التسلسل المقابل لإنزيم الألانين-تRNA سينثيتاز 1 (AARS1) (الشكل 1أ)، مما يشير إلى أن P377 قد يتم هيدروكسيله، مما يسمح بمستويات AARS2 مشابهة لـ HIF1a، لتنظيمه خلال نقص الأكسجين. وقد تم تأكيد ذلك من خلال الملاحظة أنه، على الرغم من أن نقص الأكسجين أدى بشكل زمني إلى زيادة تعبير AARS2 في كل من الميتوكوندريا والسيتوبلازم لخلايا الميوبلasts المتكاثرة C2C12، وخلايا القلب HL-1 للفئران، وخلايا الكبد الأولية للفئران، إلا أن AARS1 تم التعبير عنه فقط في السيتوسول ولم يتم تحفيزه بواسطة نقص الأكسجين (الشكل 1ب؛ المعلومات التكميلية، الشكل S1أ، ب). كما أدى نقص الأكسجين إلى زيادة مستويات بروتين AARS2 في خلايا الميوبلasts الأولية للفئران مع مرور الوقت (المعلومات التكميلية، الشكل S1ج). علاوة على ذلك، لم تتغير مستويات بروتين AARS2 مع نقص الأكسجين عندما تم تحويل P377 إلى ليوسين (الشكل 1ج)، مما دعم الملاحظة أن زيادة مستويات بروتين AARS2 التي يسببها نقص الأكسجين تتطلب P377. أدى إسكاة أو حذف Phd2، ولكن ليس غيره من هيدروكسيلاز البرولين الحساس للأكسجين، مثل Phd1 و Phd3، في خلايا C2C12 إلى رفع مستويات AARS2 الذاتية (المعلومات التكميلية، الشكل S1د) ومنع تراكم AARS2 الذاتي الناتج عن نقص الأكسجين (الشكل 1د). هذه النتائج، جنبًا إلى جنب مع الملاحظة أن زيادة تعبير PHD2 قللت من مستويات AARS2 في خلايا C2C12 (الشكل 1هـ)، في حين أن تثبيط PHDs باستخدام روكسايدوستات زاد منها (المعلومات التكميلية، الشكل S1هـ)، أكدت أن PHD2 يعمل كـ هيدروكسيلاز برولين ومستشعر للأكسجين لـ AARS2.

بحثنا عن ببتيدات تحتوي على P377 (P377OH) هيدروكسيلية في 120 طيف كتلة مزدوجة (MS/MS) لمكتبة ببتيدات إنزيم غلوتاميك-سي (Glu-C) من خلايا HEK293T التي تعبر عن AARS2 بشكل مفرط (معلومات إضافية، الجدول S1)، ووجدنا 3 أطياف تتطابق مع الطيف المتوقع لـ MS/MS لببتيد AARS2 المحتوي على P377OH (معلومات إضافية، الشكل S1f). نظرًا لأن ببتيد AARS2 المحتوي على P377OH الذي تم تصنيعه أنتج طيفًا مطابقًا لذلك الطيف المحدد (معلومات إضافية، الشكل S1f)، استنتجنا أن P377 تم هيدروكسيله في الجسم الحي. لذلك، لاكتشاف P377OH في الخلايا، قمنا بإنشاء جسم مضاد محدد لموقع P377OH يتعرف بشكل خاص على في الببتيد الخاص بـ AARS2 السليم
(معلومات إضافية، الشكل S1g، h). تم تقليل مستويات P377OH المعبر عنها بشكل غير طبيعي لـ AARS2 في خلايا C2C12 وخلايا العضلات الأولية من الفئران بشكل يعتمد على الوقت نتيجة التعرض لنقص الأكسجين في وجود MG132، وهو مثبط للبروتيازوم (الشكل 1f؛ معلومات إضافية، الشكل S1i). انخفضت مستويات P377OH في عضلات أرجل الفئران التي تم فيها تثبيط تحلل البروتين بواسطة MG132 (الشكل 1g) بعد أن تم تحفيز نقص الأكسجين عن طريق الجري (معلومات إضافية، الشكل S1j)، مما يؤكد أن P377OH يتم تنظيمه بواسطة توفر الأكسجين بشكل فسيولوجي. بالإضافة إلى ذلك، زاد التعبير المفرط لـ PHD2 من مستويات P377OH في خلايا C2C12، وعلاوة على ذلك، عزز كل من MG132 و PHD2 مستويات P377OH الخلوية بشكل تآزري (الشكل 1h، i). أكدت هذه النتيجة أن P377OH، الذي يعمل على الأرجح كمنظم سلبي لـ AARS2، يتم تعديله بدوره بواسطة PHD2.

تمت التعبير عن VHL بشكل غير طبيعي وترافق مع AARS2 المفرط التعبير وAARS2 الداخلي في خلايا C2C12 (الشكل 2أ، ب)، مما يتماشى مع تفاعل AARS2 الداخلي مع PHD2 وVHL الداخلي في خلايا العضلات الأولية للفئران (معلومات إضافية، الشكل S1ك)، مما يشير إلى أن AARS2 هو ركيزة لـ VHL. عند التعبير المشترك في خلايا C2C12، كان التفاعل بين AARS2 البري وVHL أكبر من ذلك بين AARS2 الذي يحمل P377L وVHL (الشكل 2ج)؛ علاوة على ذلك، تم تقليل تفاعل AARS2-VHL وزيادته بواسطة نقص الأكسجة (الشكل 2د) وزيادة التعبير عن PHD2 (الشكل 2هـ)، على التوالي، مما يشير إلى أن P377OH زاد من تفاعل VHL-AARS2. زاد التعبير المفرط عن VHL من مستويات يوبكويتين AARS2 المعبر عنها في خلايا HEK293T (الشكل 2و)، بينما قلل من مستويات بروتين AARS2 الداخلي في الميتوكوندريا والسيتوسول في خلايا C2C12 (الشكل 2ز). على العكس، زاد حذف Vhl (KO) في خلايا C2C12 من مستويات AARS2 الداخلية وألغى الزيادة في مستويات AARS2 الناتجة عن نقص الأكسجة (الشكل 2ح). أكدت هذه النتائج مجتمعة أن VHL يقوم بتفكيك AARS2.

أدى الإفراط في التعبير عن AARS2 إلى تقليل معدل استهلاك الأكسجين (OCR) في خلايا C2C12 (الشكل 3أ). تم حذف Aars2 (Aars2 زادت OCR وانخفضت استجابة OCR لنقص الأكسجين في خلايا C2C12، وتم إنقاذ هذه العواقب من خلال إعادة إدخال AARS2 البري، ولكن ليس الطفرة AARS2 P377L إلى Aars2. الخلايا (الشكل 3ب، ج)، مما يشير إلى أن AARS2 استجاب لنقص الأكسجين عن طريق تثبيط التنفس الخلوي. بالإضافة إلى ذلك، أدى الإفراط في التعبير عن AARS2 إلى انخفاض مستويات Ac-CoA ولكنه زاد من مستويات البيروفات واللاكتات في خلايا C2C12 (الشكل 3د)، مما يوحي بأن AARS2 ينظم سلبًا PDC، وهو معقد الإنزيم الذي يحول البيروفات إلى . وقد تم دعم ذلك بشكل أكبر من خلال الملاحظة التي تفيد بأن التعبير المفرط عن AARS2 بشكل غير طبيعي لزيادة مستويات AARS2 في الخلايا أدى إلى تقليل النشاط النوعي لـ PDHA1 (الشكل 3e)، في حين أن حذف Aars2 زاد من هذا النشاط (الشكل 3f). زادت أنشطة PDHA1 بينما تم إلغاء استجابتها لنقص الأكسجين في خلايا Aars2 KO C2C12؛ ومع ذلك، تم استعادة الاستجابات لنقص الأكسجين من خلال إعادة إدخال AARS2 من النوع البري، ولكن ليس الطفرة P377L (معلومات إضافية، الشكل S2a). علاوة على ذلك، لم يؤثر التعبير المفرط عن AARS2 على مستويات الفسفرة للسرينات 232 و293 و300 من PDHA1 (معلومات إضافية، الشكل S2b)، والتي من المعروف أنها تعطل PDHA1، مما يعني أن AARS2 يعطل PDHA1 من خلال آلية جديدة تحت سيطرة نقص الأكسجين وAARS2.

نظرًا لأن تثبيط CPT1/2/FAO قد يساهم أيضًا في تثبيط استهلاك الأكسجين، من خلال تقليل إمداد Ac-CoA إلى OXPHOS، تم استخدام -بالميتات للتحقيق فيما إذا كان CPT1/2/FAO مثبطًا بواسطة AARS2 (معلومات إضافية، الشكل S2c). أدى الإفراط في التعبير عن AARS2 إلى تقليل التسمية المزدوجة (M2) -إنتاج أسيتيل-CoA من -بالميتات (الشكل 3g)، مما يشير إلى أن AARS2 قام بتثبيط CPT1/2/FAO. فقط الكارنيتين بالميتويل ترانسفيراز 2 (CPT2) الداخلي، وليس CPT1 أو إنزيمات FAO، تفاعلت مع AARS2 المعبر عنها بشكل خارجي (معلومات إضافية، الشكل S2d). علاوة على ذلك، أدى الإفراط في التعبير عن AARS2 إلى تقليل نشاط CPT2 (الشكل 3h)، في حين أن KO Aars2 زاد منه (الشكل 3i)، مما يؤكد أن AARS2 يقوم بتعطيل CPT2 ربما عبر

الشكل 1 الأكسجين ينظم مستويات بروتين AARS2 عبر PHD2. أ يحمل AARS2 تسلسلًا يتعرف عليه PHD. تم محاذاة تسلسل الأحماض الأمينية (aa) من 369 إلى 380 من AARS2 وتسلسله المقابل AARS1 (aa 343-354) مع تسلسل التعرف على PHD. تم تمييز بقايا PHD المتوافقة باللون الأزرق. ب يتم تنظيم مستويات بروتين AARS2 بواسطة نقص الأكسجين. AARS1 و AARS2 و HIF1 في الميتوكوندريا والسيتوسول. تم الكشف عن مستويات في خلايا C2C12 المزروعة في غرفة نقص الأكسجين لفترات زمنية محددة. تم استخدام COXIV والأكتين لإظهار العزل الناجح للميتوكوندريا والسيتوبلازم، على التوالي (تم استخدام نفس الطريقة لتجزئة الخلايا الفرعية من الآن فصاعدًا). تم مراقبة مستويات الأكسجين في الغرفة. c P377 مطلوب لتنظيم مستويات بروتين AARS2 بواسطة نقص الأكسجين. تم التعبير عن AARS2 بشكل مستقر. و AARS2 تم قياس مستويات بروتين (P377L) في خلايا C2C12 بعد زراعة الخلايا في غرفة نقص الأكسجين لمدة الزمن المحددة. د، هـ ينظم PHD2 مستويات بروتين AARS2. تم قياس مستويات AARS1 و AARS2 الميتوكوندرية والسيتوسولية في خلايا C2C12 أو خلايا Phd2 KO C2C12 المزروعة في غرفة نقص الأكسجين لمدة الزمن المحددة (د) وفي خلايا C2C12 التي تعبر عن PHD2 بشكل مفرط (هـ). ف-ي ينظم نقص الأكسجين و PHD2 هيدروكسلة P377. تم تحديد مستويات P377OH عبر اختبار الويسترن بلوت في خلايا C2C12 المزروعة في غرفة نقص الأكسجين لمدة الزمن المحددة في وجود MG132 في وسط الزراعة لمنع التحلل البروتيني (ف)؛ في عضلات الساق الهيكلية للفئران المستريحة والتي تم حقنها وريدياً مع أو بدون MG132 مرتين في الأسبوع لمدة 4 أسابيع متتالية ) ( ); في خلايا C2C12 التي تعبر عن PHD2 بشكل مفرط والمعالجة بـ MG132 ( تم قياس مستويات P377OH في خلايا C2C12 التي تعبر عن PHD2 بشكل مفرط في وجود وغياب MG132 بواسطة مطيافية الكتلة (i) ( جميع البيانات مُبلغ عنها كمتوسط SEM لثلاث تجارب مستقلة. تم تقييم الدلالة الإحصائية بواسطة تحليل التباين الثنائي. ؛ .

تعديل تساهمي. علاوة على ذلك، أدى نقص Aars2 إلى تنشيط CPT2 وتقليل استجابة نشاط CPT2 لنقص الأكسجين، والتي تم إنقاذها من خلال إعادة إدخال AARS2 البري، ولكن ليس الطفرة AARS2 P377L (معلومات إضافية، الشكل S2e). أدى نقص Cpt2 في خلايا C2C12 إلى جعل إنتاج غير مستجيب لزيادة التعبير عن AARS2 (الشكل 3g). أخيرًا، لم يكن هناك نشاط محدد لـ CPT1 (المكمل)
لم تتأثر المعلومات (الشكل S2f) أو مستوى البروتين (المعلومات التكميلية، الشكل S2g) بزيادة تعبير AARS2. تشير هذه البيانات مجتمعة إلى أن AARS2 يقوم بتعطيل CPT2 لمنع أكسدة الأحماض الدهنية.

استخدمنا -المُوسومة بالجلوتامين لتتبع – كيتوجلوتارات ( -KG) تدفق، وهو النقطة التي تتغذى فيها الأحماض الأمينية في دورة TCA (معلومات إضافية، الشكل S2h). الـ المستويات

لم تتأثر بزيادة تعبير AARS2 (المعلومات التكميلية، الشكل S2i)، مما يشير إلى أن استقلاب الأحماض الأمينية لم يكن منظمًا بواسطة AARS2. هذه النتائج مجتمعة تشير إلى أن AARS2 يثبط التنفس عن طريق تقليل إمداد Ac-CoA من التحلل السكري واستقلاب الأحماض الدهنية من خلال تعطيل PDHA1 وCPT2، وليس عبر استقلاب الأحماض الأمينية (المعلومات التكميلية، الشكل S2j).

بعد ذلك، تحققنا مما إذا كانت نقص الأكسجين يتوسط تنظيم PDHA1 و CPT2 عبر AARS2 في الجسم الحي. كانت مستويات بروتين HIFas و AARS2
تم تحفيز ذلك في عضلات الساق الهيكلية للفئران بطريقة تعتمد على الوقت بينما كانت الفئران تجري على جهاز المشي (الشكل 3j). علاوة على ذلك، كان مستوى Ac-CoA في العضلات قد انخفض بشكل معتدل بينما استمرت الأنشطة المحددة لـ PDC- (الشكل 3k) و CPT2- (الشكل 3l) في الانخفاض، واستمرت نقص الأكسجة في عضلات الساق (معلومات إضافية، الشكل S3a) بالإضافة إلى مستويات اللاكتات والبيروفات في الزيادة، بعد بدء الجري (الشكل 3m). وكان ذلك متزامناً مع زيادة قصيرة في النشاط الكلي لـ PDC في عضلات الساق للفئران.

الشكل 2 AARS2 يعمل كركيزة لآلية البروتيازوم PHD2-VHL. يتفاعل VHL مع AARS2. تم الكشف عن AARS2 المترافق مع المناعة، والمتعبّر عنه بشكل مشترك (أ) وAARS2 الداخلي (ب) في خلايا C2C12 التي تعبر عن VHL بشكل غير طبيعي. يظهر الطفرة P377L affinity ضعيفة لـ VHL. تم الكشف عن التفاعلات بين VHL وAARS2، وبين VHL وP377L عبر الترسيب المناعي المشترك عندما تم التعبير عنهما بشكل مشترك في خلايا C2C12. تم توفير تحليل كثافة الصور. د، هـ تفاعل VHL-AARS2 يتم تنظيمه بواسطة نقص الأكسجة وPHD2. تم تحديد كمية AARS2 المترافقة مع VHL تحت الظروف الطبيعية ونقص الأكسجة لمدة 8 ساعات (د)، وكذلك مع أو بدون التعبير المفرط عن PHD2 (هـ) في خلايا C2C12. تم توفير تحليل كثافة الصور. تتوسط VHL تحلل البروتينات بواسطة البروتيازوم. تم اختبار AARS2 المعبر عنه بشكل غير طبيعي في خلايا HEK293T من حيث الت ubiquitination عندما تم التعبير عنه بمفرده وعندما تم التعبير عنه مع اليوبكويتين أو VHL، أو كليهما، في وجود وغياب MG132. g تقوم VHL بتقليل مستويات بروتين AARS2. تم قياس مستويات AARS2 الميتوكوندري والسايتوزولي في خلايا C2C12 مع أو بدون فرط التعبير عن VHL. تسبب نقص الأكسجين في تراكم AARS2 بطريقة تعتمد على VHL. تم قياس مستويات AARS2 الميتوكوندري والسايتوسولي في خلايا C2C12 وخلايا C2C12 المعدلة وراثيًا VhI، التي تم زراعتها في غرفة نقص الأكسجين لمدة الأوقات المحددة. جميع البيانات مُبلغ عنها كمتوسط. SEM لثلاث تجارب مستقلة. تم تقييم الدلالة الإحصائية بواسطة اختبار الطالب غير المتزاوج ذو الطرفين. -اختبار: .
العضلات، التي تلاها بعد ذلك انخفاض إلى مستويات أقل من مستويات الراحة (الشكل 3ن). كان الارتفاع الأولي في نشاط PDC الكلي متسقًا مع انخفاض أولي في فسفرة PDHA1 (معلومات إضافية، الشكل S3ب) و علاج الفوسفاتاز لتقليل تأثيرات الفسفرة (المعلومات التكميلية، الشكل S3c) ألغى الزيادة الأولية (الشكل 3n). ومع ذلك، لم يتأثر الانخفاض في نشاط PDC مع وقت الجري حتى بعد علاج الفوسفاتاز (الشكل 3ن). هذه، جنبًا إلى جنب مع الملاحظة بأن مستويات البروتين لمكونات PDC وCPT2 (المعلومات التكميلية، الشكل S3د) ولا مستويات البروتين وأنشطة LDHs (المعلومات التكميلية، الشكل S3د، هـ) تأثرت طوال 30 دقيقة من الجري، مما يشير إلى أن AARS2 قد يتوسط آلية تعديل تساهمي تعطل PDC دون أن تتضمن فسفرة PDHA1.

انخفضت أنشطة PDHA1 وCPT2 الخاصة عند إضافة اللاكتات (الشكل 4أ). تم استخدام ميثيل-لاكتات القابل لاختراق غشاء الخلية (Me-Lac) لتحليل تأثيرات اللاكتات. لوحظت زيادة في معدلات استهلاك الأكسجين (OCRs) بالإضافة إلى انخفاض أنشطة PDHA1 وCPT2 الخاصة في خلايا C2C12 المعالجة بـ 2 مللي مول من Me-Lac، مما زاد من مستويات حمض اللاكتيك الميتوكوندري إلى 0.6 مللي مول إلى 1.0 مللي مول؛ ومع ذلك، فإن Me-Lac بتركيز 10 مللي مول، الذي زاد من حمض اللاكتيك الميتوكوندري إلى 3.2 مللي مول، أدى إلى انخفاض في معدلات استهلاك الأكسجين، بالإضافة إلى الأنشطة الخاصة لـ PDHA1 وCPT2 (الشكل 4ب-د؛ معلومات إضافية، الشكل S4أ). كانت نتائج معالجة 2 مللي مول من Me-Lac متوافقة مع الملاحظة التي تفيد بأن اللاكتات تغذي خلايا العضلات عبر دورة TCA. ومع ذلك، فإن معالجة 10 مللي مول من Me-Lac تؤدي إلى مستويات داخل الخلايا من اللاكتات تشبه تلك الموجودة في العضلات أثناء التمرين، مما يشير إلى أن اللاكتات تلعب أيضًا أدوارًا مثبطة في OXPHOS، على الأرجح من خلال تعديل تساهمي لـ PDHA1 وCPT2، وهو مفهوم تم تأكيده من خلال انخفاض نشاط PDHA1 وCPT2 في خلايا C2C12، ولكن ليس في خلايا Aars2 KO C2C12 (معلومات إضافية، الشكل S4b، c). تم تأكيد هذا المفهوم بشكل أكبر من خلال فحص إنتاج Ac-CoA في خلايا C2C12 وHL-1 التي تقوم بأكسدة اللاكتات، والتي كشفت أن 10 مللي مول من Me-Lac قد خفضت الإنتاج من -جلوكوز (الشكل 4e، f) و -بالميتات (الشكل 4g، h) بطريقة تعتمد على AARS2. ومن المثير للاهتمام أن فقدان AARS2 زاد من الإنتاج من -جلوكوز و -بالميتات (الشكل 4e-h)، مما يشير إلى أن اللاكتات أوقفت PDHA1 وCPT2 عبر AARS2، وأن اللاكتات لا توقف PDHA1 وCPT2 وOXPHOS عبر حموضتها. علاوة على ذلك، فإن 10 مللي مول من Me-Lac أوقف OCR في الخلايا العضلية الأولية بطريقة تعتمد على AARS2 (معلومات إضافية، الشكل S4d). علاوة على ذلك، كان لتأثير Me-Lac ضئيل على -أنتاج كجم من -جلوتامين (معلومات إضافية، الشكل S4e)، والذي كان متسقًا مع أن تحلل الأحماض الأمينية لم يكن منظمًا بواسطة حمض اللبنيك.

حمض اللبنيك مشابه هيكليًا للألانين (الشكل 5أ). تم نمذجة ارتباط حمض اللبنيك بـ AARS2 باستخدام تحليل ربط الجزيئات (المعلومات التكميلية، الشكل S4f) وتم تأكيده من خلال قياس الحرارة التلقائية (ITC) (المعلومات التكميلية، الشكل S4g).

علاوة على ذلك، تفاعلت AARS2 المفرطة التعبير مع كل من PDHA1 الداخلي (المعلومات التكميلية، الشكل S4h) وCPT2 المعبر عنه بشكل خارجي (المعلومات التكميلية، الشكل S4i). تشير هذه النتائج مجتمعة إلى أن AARS2 قد تعمل كـ lactyltransferase لـ PDHA1 وCPT2. لتأكيد هذه الفرضية، بحثنا أولاً عن بقايا الليسين الملبدة باللاكتيل في PDHA1 وCPT2. باستخدام مكتبة ببتيد تريبتيك من PDHA1 المنقى ومكتبة ببتيد Glu-C من CPT2 المنقى، وجدنا أن الليسين 336 في PDHA1 (المعلومات التكميلية، الشكل S5a) والليسين 457 و458 في CPT2 (المعلومات التكميلية، الشكل S5b) قد تكون ملبدة باللاكتيل (Lac-K336، Lac-K457/8). تم تأكيد وجود Lac-K336، بالإضافة إلى Lac-K457/8، من خلال مطابقة طيف MS/MS للببتيدات الاصطناعية التي تحتوي على Lac-K336 وLac-K457/8 مع تلك الموجودة في مكتبة الببتيد (المعلومات التكميلية، الشكل S5a، b).

قمنا بتقييم قدرة AARS2 على إضافة مجموعة لاكتيل إلى ببتيدات PDHA1 K336 وCPT2 K457/8 الاصطناعية والبروتينات السليمة PDHA1 وCPT2 في المختبر. على عكس AARS2 المتحور، الذي لديه تبديل الأسباراجين 104 إلى التيروزين، يعادل تبديل الأسباراجين 71 إلى التيروزين في AARS1 (AARS1 الصيغة غير النشطة من AARS1 ) (معلومات إضافية، الشكل S6a)، قام AARS2 بإضافة اللاكتيل إلى الببتيد الاصطناعي PDHA1 الذي يحتوي على K336 بالإضافة إلى ببتيد CPT2 الذي يحتوي على K457/8 (الشكل 5b؛ معلومات إضافية، الشكل S6b) من خلال آليات تعتمد على اللاكتات وATP وقابلة للتثبيط بواسطة البيروفوسفات. ومع ذلك، لم يقم AARS2 بإضافة اللاكتيل إلى تلك الببتيدات التي تم تغيير بقايا الليسين فيها إلى ألانين (معلومات إضافية، الشكل S6c). هذه النتائج اقترحت أن الآلية التي يستخدمها AARS2 لإضافة اللاكتات إلى الليسين هي نفسها المستخدمة لإضافة الألانين إلى الليسين. (معلومات إضافية، الشكل S6d). كان تأثير AARS2 على ببتيد PDHA1 الاصطناعي المحتوي على K336 ضمن مستويات اللاكتات الفسيولوجية البالغة 5.21 مللي مول، في حين أن رقم الدوران ( كان AARS2 لهذا الببتيد 1.19 (الشكل 5c)، مما يشير إلى أن AARS2 كان ناقل لاكتيل فعال.

قمنا بتوليد أجسام مضادة متعددة النسائل محددة الموقع التي تعرفت على Lac-K336 (المعلومات التكميلية، الشكل S6e) وLacK457/8 (المعلومات التكميلية، الشكل S6f). أدى العلاج بـ 10 مللي مول من Me-Lac إلى زيادة مستويات Lac-K336 وLac-K457/8 من PDHA1 المعبر عنه بشكل خارجي (الشكل 5d) وCPT2 (الشكل 5e) في خلايا C2C12 وHL-1 (المعلومات التكميلية، الشكل S6g). ومع ذلك، لم يتم ملاحظة اللاتيل عندما تم حذف Aars2 (الشكل 5d، e). أيضًا، زادت مستويات Lac-K336 وLac-K457/8 في الخلايا العضلية الأولية التي تعبر عن AARS2 بشكل مفرط وانخفضت بعد حذف Aars2 (المعلومات التكميلية، الشكل S6h). تشير هذه النتائج إلى أن AARS2 يعمل كـ lactyltransferase لـ PDHA1 K336 وCPT2 K457/8. علاوة على ذلك، يتماشى مع الملاحظة بأن اللاكتات يمكن أن تُنقل إلى الميتوكوندريا بواسطة الناقل أحادي الكربوكسيلات 1 (MCT1)، زيادة مكملات Me-Lac في وسائط الثقافة، بينما تم تثبيط MCT1 باستخدام حمض الأسيانو-4-هيدروكسي سيناميك. ) انخفضت مستويات اللاكتات الميتوكوندريا (الشكل 5f)، وكانت هذه النتيجة متوافقة مع علاج a-CHCA الذي قلل من مستويات Lac-K336 وLac-K457/458 في خلايا C2C12 (الشكل هذه النتائج، جنبًا إلى جنب مع الملاحظة بأن مستويات اللاكتات الميتوكوندريالية زادت بشكل متناسب مع مستويات اللاكتات في المستخلص، كلاهما في نطاق AARS2. نحو اللاكتات، في عضلات الساق الهيكلية للفئران بعد الجري

(الشكل 5i)، مما يشير إلى أن اللاكتات الناتجة عن التمرين قد تنظم اللاكتيل في الميتوكوندريا.

تشغيل مستويات Lac-K336 وLac-K457/8 المعززة في خلايا عضلات الفئران (الشكل 5j)، بما يتماشى مع الاكتشاف الذي أظهر أن نقص الأكسجين زاد من كل من اللاكتات في السائل الخلوي والميتوكوندريا (المكملات
المعلومات، الشكل S6i) ومستويات Lac-K336 وLac-K457/8 في خلايا C2C12 (الشكل 5k، I). زاد تثبيط PHD عبر الروكسايدوستات من Lac-K336 وLac-K457/8 (المعلومات التكميلية، الشكل S6j، k) في خلايا C2C12، مما يبرز الأهمية الفسيولوجية لـ Lac-K336 وLac-K457/8. أظهرت التقديرات عبر MS أن

الشكل 3 AARS2 يثبط إنتاج Ac-CoA و OXOPHOS. أ، ب AARS2 ينظم OCR. تأثيرات التعبير المفرط عن AARS2 (يسار، قياسات OROBOROS Oxygraph-2K؛ يمين، الكمية) (أ)، و Aars2 KO باستخدام sgRNAs مستقلة (ب) على OCR. تدفق لكل حجم من الخلايا، تم تحديدها تقوم AARS2 بتنظيم OCR استجابةً لمستويات الأكسجين. تأثيرات إعادة إدخال AARS2 من النوع البري أو P377L إلى Aars تم تحديد خلايا C2C12 في خلايا تحت ظروف طبيعية من الأكسجين وخلايا تعرضت لنقص الأكسجين لمدة 8 ساعات. ). AARS2 ينظم مستويات المستقلبات. المستويات النسبية (بالنسبة لمستويات خلايا C2C12) من اللاكتات، البيروفات، و Ac-CoA في خلايا C2C12 وخلايا C2C12 التي تعبر عن AARS2 بشكل مفرط. تم تقييمها. تنظم AARS2 نشاط PDHA1 المحدد. تم تحديد الأنشطة المحددة النسبية (بالنسبة لتلك المستخلصة من خلايا C2C12) لـ PDHA1 المنقى من خلايا C2C12 التي تعبر عن AARS2 بشكل مفرط (e) وخلايا C2C12 التي تم حذف Aars2 منها (f). ). تنظم AARS2 إنتاج Ac-CoA بواسطة CPT2. النسب المئوية للمواد غير المعلمة ( )، مُعَلَّمَة واحدة ( ) ، وذو تسميات مزدوجة ( ) أسيتيل-CoA من -بالميتات في خلايا C2C12 وخلايا C2C12 التي تم فيها حذف Cpt2 باستخدام sgRNAs مستقلة، تم تحديدها مع أو بدون فرط التعبير عن AARS2؛ تم إجراء مطاردة بالبالميتات لـ تمت مقارنة النسب M+2 في خلايا C2C12 مع وبدون فرط التعبير عن AARS2 من حيث الدلالة. تنظم AARS2 نشاط CPT2 المحدد. تم تحديد النشاط النسبي المحدد (بالنسبة لتلك المستمدة من خلايا C2C12) لـ CPT2، المعزول من خلايا C2C12 التي تعبر عن AARS2 بشكل مفرط (h) وخلايا Aars2 KO C2C12 (i). الجري يحفز HIF تعبير s و AARS2 في عضلات الساق الهيكلية للفئران. HIF1 ، HIF2 ، HIF3 تم تحديد مستويات AARS1 و AARS2 في عضلات الساق الهيكلية للفئران قبل وبعد الجري لمدة الزمن المحددة. ). ك، إن الجري ينشط PDC و CPT2 في الجسم الحي. تم تحديد الأنشطة النوعية النسبية (بالنسبة لتلك الموجودة في الفئران المستريحة) لـ PDC (ك) و CPT2 (ل) في عضلات الساق الهيكلية للفئران بعد أن بدأت الفئران الجري لفترات زمنية محددة ( ). تراكم اللاكتات الناتج عن الجري التحمل وتقليل أسيتيل-CoA. تم تحديد مستويات اللاكتات والبيوفيرات وأسيتيل-CoA في عضلات الساق الهيكلية للفئران بعد السماح للفئران بالجري لمدة الفترات المحددة. ). يُعطّل AARS2 PDC من خلال آلية غير الفسفرة. تُظهر الأنشطة النسبية لـ PDC (بالنسبة لكمية البروتين) في عضلات الساق الهيكلية للفئران البرية و Aars2-/- التي تم أخذ عينات منها في نقاط زمنية مختلفة بعد بدء الجري مع أو بدون إزالة الفسفرة التي تم تحفيزها بواسطة تم تحديد الفوسفاتاز، ). تم تحديد الأنشطة في الوقت 0 على أنها جميع البيانات مُبلغ عنها كمتوسط SEM لثلاث تجارب مستقلة. تم تقييم الدلالة الإحصائية بواسطة اختبار الطالب غير المتزاوج ذو الطرفين. -اختبار t وتحليل التباين ثنائي الاتجاه: ؛ ؛ ؛ ; لا أهمية.

كانت مستويات Lac-K336 و Lac-K457/8 في عضلات الساق الهيكلية للفئران مرتفعة كما هو الحال في تحت التعبير المفرط المتزامن لـ AARS2 وعلاج Me-Lac (الشكل 5 م)، وبلغت بعد جري الفئران لمدة 30 دقيقة (الشكل 5ن) أو عندما تتعرض عضلات الفئران لنقص الأكسجين (الشكل 50)، مما يشير إلى أن جزءًا كبيرًا من PDHA1 وCPT2 يتم لاكتيله تحت نقص الأكسجين داخل خلايا العضلات وارتفاع مستوى اللاكتات في الجسم، وهي حالة تحاكي تمارين التحمل.

تحويل K336 من PDHA1 و K457/8 من CPT2 إلى K336Q و من المقلد اللاكتيل، الجلوتامين (Q)، قلل من أنشطة كلا الإنزيمين بينما تم تغيير K336 و K457/8 إلى K336R و إن المقلد غير اللاكتيل، الأرجينين (R)، أثر بشكل ضئيل على أنشطتهم المحددة (الشكل 5p، q)، مما يشير إلى أن اللاكتيل قد عطل PDHA1 وCPT2. على الرغم من أن زيادة التعبير عن AARS2 (الشكل 5p، q) وإضافة Me-Lac (الشكل 5r، s) زادت من Lac-K336 وLac-K457/8 وعطلت PDHA1 وCPT2، إلا أنها لم تغير من لاكتيل اللاكتيل لموقع اللاكتيل الخالي من الطفرات في PDHA1 وCPT2، وهو ما يتماشى مع الملاحظة التي تفيد بأن Aars أظهرت عضلة الساق في الفأر زيادة في نشاط PDC وCPT2 (المعلومات التكميلية، الشكل S6I)، مما يؤكد أن اللاكتيلation هي التي تقف وراء تعطيل PDHA1 وCPT2 بواسطة AARS2.

أخيرًا، فشل مستوى الألانين الفسيولوجي في تثبيط اللاكتيلation K336 في المختبر (معلومات إضافية، الشكل S6m)؛ كان لتكملة الميثيل-ألانين تأثير ضئيل على Lac-K336 وLac-K457/8 وعلى الأنشطة المحددة لـ PDHA1 وCPT2 (معلومات إضافية، الشكل S6n، o)، مما يلغي إمكانية تأثير الألانين على اللاكتيلation، وأن الألانيلation البروتيني، الناتج عن زيادة تنظيم AARS2، ينظم أنشطة PDHA1 وCPT2.

للتحقيق فيما إذا كانت مستويات Lac-K336 وLac-K457/8 منظمة ديناميكيًا، قمنا بتقييم استجابتهما للنيكوتيناميد (NAM)، وهو مثبط عام للسيرتوينات والديميدازات التي تزيل تعديلات البروتين المرتبطة بالاميد المتعددة. علاج NAM زاد من مستويات Lac-K336 وLac-K457/8 للبروتينات المعبر عنها بشكل غير طبيعي PDHA1 وCPT2 في خلايا C2C12، على التوالي (الشكل 6a). نظرًا لأن Lac-K336 وLac-K457/8 هما تعديلات بروتينية ميتوكوندرية، قمنا بتقييم أنشطة الديلاكتيلز لإنزيمات السيتوينات الميتوكوندرية، وهي SIRT3 وSIRT4 وSIRT5. قامت SIRT3 بإزالة اللاكتيل من ببتيدات Lac-K336 وLac-K457/8 الاصطناعية عبر NAD. مسار معتمد، في حين أن المجال التحفيزي لـ SIRT4 أو SIRT5 لم يفعل (الشكل 6ب)، مما يشير إلى أن SIRT3 هو ديلكتيلز لـ Lac-K336 وLac-K457/8. وقد تم تأكيد ذلك بشكل أكبر من خلال الملاحظة أن كل من PDHA1 وCPT2 تفاعلا مع SIRT3.
(معلومات إضافية، الشكل S7a، b)، وأن النوع البري من SIRT3 قلل من مستويات Lac-K336 وLac-K457/8 من PDHA1 النقي السليم (الشكل 6c) وCPT2 (الشكل 6d)، في حين أن SIRT3 المعطل بواسطة الأميداز طافرة لم يحدث. علاوة على ذلك، أدى الإفراط في التعبير عن SIRT3 إلى تقليل مستويات Lac-K336 وLac-K457/8 في خلايا C2C12 من النوع البري، ولكن ليس في تلك التي تحمل طفرات PDHA1 وCPT2 الخالية من مواقع اللاكتيل (الشكل 6e، f). علاوة على ذلك، تم تنقية PDHA1 وCPT2 من عضلات الساق الهيكلية لفئران Sirt3 KO (Sirt3 أظهرت الفئران مستويات أعلى من Lac-K336 وLac-K457/8، على التوالي، مقارنة بتلك الموجودة في عضلات الساق لدى الفئران من النوع البري (الشكل 6g).

كانت الأنشطة المحددة لـ PDHA1 و CPT2 المعبر عنها في خلايا C2C12 التي تعبر عن SIRT3 بشكل مفرط وخلايا Sirt3 KO أعلى وأقل، على التوالي، من تلك المعبر عنها في خلايا C2C12 (الشكل 6h، i). ومع ذلك، لم يؤثر لا التعبير المفرط عن SIRT3 ولا Sirt3 KO على الأنشطة المحددة لطفرات PDHA1 و CPT2 التي لا تحتوي على مواقع اللاكتيل (معلومات إضافية، الشكل S7c-f). علاوة على ذلك، زاد التعبير المفرط عن SIRT3 وقلل Sirt3 KO الإنتاج من -جلوكوز (الشكل 6j، k) و -بالميتات (الشكل 6ل، م)، على التوالي، في خلايا C2C12.

علاوة على ذلك، أدى الإفراط في التعبير عن SIRT3 إلى انخفاض مستويات اللاكتات (الشكل 6ن) والأحماض الدهنية الحرة (الشكل 60) في خلايا C2C12، في حين أن نقص Sirt3 زاد من هذه المستويات (الشكل 6ص، ق). كانت هذه النتائج متسقة مع أن SIRT3 قام بإزالة اللاكتيل وعكس تأثيرات اللاكتيل على PDHA1 وCPT2. أخيرًا، قد يؤدي الإفراط في التعبير عن SIRT3 إلى إزالة اللاكتيل وكذلك إزالة الأسيتيل من PDHA1. نتج عن ذلك تنشيط PDHA1 بشكل أكثر وضوحًا في خلايا C2C12 مقارنةً بخلايا Aars2 KO C2C12، مما يشير إلى أن اللاكتيل هو آلية رئيسية لتعطيل PDHA1 (معلومات إضافية، الشكل S7g).

تعرض أنسجة أرجل الفئران في ظروف نقص الأكسجين في المختبر أدى إلى تحفيز Lac-K336 و Lac-K457/8 في النوع البري، ولكن ليس في Aars2. أنسجة أرجل الفئران، مما يشير إلى أن نقص الأكسجين يحفز AARS2 بالإضافة إلى Lac-K336 وLac-K457/8 (معلومات إضافية، الشكل S8a). لتأكيد أن نقص الأكسجين داخل العضلات الناتج عن التمارين قد يكون مدفوعًا بتفعيل عملية التنفس الخلوي في العضلات التي تعمل كمصرف للأكسجين، إن إضافة وسائط الثقافة إما بالجلوكوز أو بالبالميتات أو باللاكتات المنخفضة لتعزيز OXPHOS (المعلومات التكميلية، الشكل S8b) أدت إلى تحفيز HIF1a جنبًا إلى جنب مع AARS2 و Lac-K336 و Lac-K457/8 في خلايا C2C12، بينما أدى إلغاء OXPHOS الخلوي باستخدام الروتينون إلى تقليل هذه التأثيرات (الشكل 7a). هذه النتائج تدعم تلك الدراسات التي أظهرت أن تعزيز OXPHOS يحفز HIF1a في أنواع خلايا أخرى. وأكدت أن تعزيز OXPHOS يؤدي إلى نقص الأكسجين داخل العضلات و

اللاكتيلation. علاوة على ذلك، فإن إعادة الأكسجة للخلايا C2C12 المعالجة بنقص الأكسجين لم تقلل فقط من مستويات Lac-K336 وLac-K457/8، بل أيضًا فعلت PDHA1 وCPT2 وزادت من إنتاج Ac-CoA (معلومات إضافية، الشكل S8c، d)، مما يتماشى مع أن نقص الأكسجين الناتج عن OXPHOS هو المحرك لتثبيط OXPHOS. ومع ذلك، فإن إعادة الأكسجة أثرت بشكل ضئيل على نشاط SIRT3 (معلومات إضافية، الشكل S8e)، مما يشير إلى أن OXPHOS يستجيب بسرعة للاكتيلation التي تتوسطها AARS2 ولكن ليس للديلاكتيلation التي تتوسطها SIRT3.

حقنة من أدى حامض اللبنيك إلى تحفيز HIF1a وAARS2 في عضلة الفخذ الخلفية للفأر (الشكل 7ب)، وLac-K336/Lac-K457/8 (المعلومات التكميلية، الشكل S8f)، بينما تم تثبيط LDHA باستخدام قلل FX-11 من إنتاج اللاكتات في عضلات الفئران أثناء الجري (المعلومات التكميلية، الشكل S8g) وألغى إلى حد كبير التحفيز المرتبط بالجري لـ HIF1a و AARS2 و Lac-K336 و Lac-K457/8 في أفخاذ الساق الخلفية للفئران (الشكل 7c)، مما يعكس أن مثبط LDHA الأوكزامات يثبط Lac-K336 و Lac-K457/8 في خلايا C2C12 (المعلومات التكميلية، الشكل S8h). تبرز هذه البيانات حقيقة أن إنتاج اللاكتات والأكسدة يلعبان دورًا رئيسيًا في تحفيز نقص الأكسجة في خلايا العضلات واللاكتيل أثناء التمرين. ومن الجدير بالذكر أن الجري لمدة 30 دقيقة، الذي أدى إلى تراكم كبير للاكتات في كل من عضلات الفئران الهيكلية من النوع الأول الغني بالميتوكوندريا وقدرة التحمل والنوع الثاني الفقير بالميتوكوندريا وقدرة السرعة (الشكل 7d)، أدى إلى المزيد من
تم نطق HIF1a و AARS2 و Lac-K336 و Lac-K457/8 في العضلات من النوع الأول (الشكل 7e)، مما يشير إلى أن اللاكتيل يضبط أكسدة الفوسفور في العضلات الهيكلية من النوع الأول وقدرة التحمل في التمارين أكثر مما يضبط أكسدة الفوسفور في العضلات الهيكلية من النوع الثاني وقدرة العدو. تدعم الملاحظة بأن انخفاض ATP في العضلات من النوع الأول حدث بالتزامن مع تحفيز Lac-K336 و Lac-K457/8، على عكس انخفاض ATP في العضلات من النوع الثاني الذي حدث قبل تحفيز Lac-K336 و Lac-K457/8 (الأشكال 7f، 5j)، هذه الفرضية. علاوة على ذلك، Aars2 من النوع البري، منخفض اللاكتيل و Sirt3 المفرط في اللاكتيل كانت الفئران جميعها تتمتع بقدرات جري مشابهة (معلومات إضافية، الشكل S8i)، لأن حقن حمض اللبنيك في فخذ الساق الخلفية للفأر أثر فقط بشكل ضئيل على قدراتهم في الجري (معلومات إضافية، الشكل S8j). بالمقابل، كانت أوقات نفاد الطاقة أثناء الجري عالي الكثافة لدى الفئران مرتبطة بشكل إيجابي معتدل بمستويات SIRT3 في عضلات الساق الأساسية (معلومات إضافية، الشكل S8k) ومرتبطة بشكل عكسي قوي بمستويات AARS2 في عضلات الساق الأساسية (الشكل 7g؛ معلومات إضافية، الشكل S8I). علاوة على ذلك، فإن زيادة التعبير عن AARS2 بشكل محدد في عضلات الهيكل العظمي للفئران من خلال عبور فئران تعبير hAARS2 مع فئران CKMM-cre (معلومات إضافية، الشكل S8m) وإسقاط Sirt3، زادت كل من Lac-K336 وLac-K457/8 (الشكل 6g؛ معلومات إضافية، الشكل S8n)، لكنها قللت من تدفق Ac-CoA (الشكل 7h)، وOCR (الشكل 7i)، ومستويات ATP (الشكل 7j) في عضلات الساق الهيكلية وأدت إلى تقصير نفاد الطاقة أثناء الجري.

nالوقت (الشكل 7k). علاوة على ذلك، على عكس حقن اللاكتات الذي قلل من وقت نفاد جهد الفئران، حقن الألانين في عضلة الفخذ في الساق الخلفية قلل من Lac-K336 وLac-K457/8 (معلومات إضافية، الشكل S8f)، مما يتماشى مع ذلك. الألانين كان نظيرًا للألانين (الشكل 5أ) الذي يرتبط بالألانين-
جيب الربط لـ AARS2 (معلومات إضافية، الشكل S4f، g)، مما يقلل من مستويات Lac-K336 و Lac-K457/8 في المختبر (معلومات إضافية، الشكل S9a، b)، وينشط PDHA1 و CPT2 (معلومات إضافية، الشكل S9c، d)، ويزيد من مستويات Ac-CoA (معلومات إضافية، الشكل S9e)، OCR (معلومات إضافية

الشكل 5 يقوم AARS2 بتعطيل PDHA1 وCPT2 عن طريق إضافة مجموعة لاكتيل إلى هذه البروتينات. أ حمض اللبنيك، -ألانين، والألانين هما نظيران. محاذاة الهياكل الكيميائية للألانين، وحمض اللبنيك، و -ألانين. يقوم AARS2 بإضافة اللاكتيل إلى ببتيدات PDHA1 K336 وCPT2 K457/8 في المختبر. الكشف عن ببتيدات PDHA1 K336 وCPT2 K457/8 الاصطناعية المضافة باللاكتيل بواسطة AARS2 وAARS2 باستخدام تقنية قياس الطيف الكتلي. ملخصة ( لا يوجد منتج مكتشف، : تم اكتشاف المنتج : تم الكشف عن منتج أقل؛ انظر المعلومات التكميلية، الشكل S6b لنتائج MS). ج AARS2 هو ناقل لاكتيل فعال. و تم تحديد نشاط AARS2 المؤتلف تجاه اللاكتات عندما تم الاحتفاظ بالببتيد PDHA1 المحتوي على K336 الاصطناعي في . د، هـ KO يلغي التحفيز المرتبط باللاكتات لـ Lac-K336 و Lac-K457/8. تم الكشف عن مستويات Lac-K336 (د) ومستويات Lac-K457/8 (هـ) لـ PDHA1 و CPT2 المنقاة من خلايا C2C12 وخلايا C2C12 التي تم فيها حذف Aars2 باستخدام sgRNAs مستقلة، مع أو بدون 10 مللي مول من Me-Lac في وسط الثقافة. إن تثبيط استيراد اللاكتات إلى الميتوكوندريا يقلل من مستويات Lac-K336 وLac-K457/8. خلايا C2C12 التي لم تُعالج أو التي تم علاجها بـ -CHCA لمدة ساعتين، أو مع 10 مللي مول من اللاكتات لمدة 4 ساعات. لاكتات الميتوكوندريا (ف) ( تم الكشف عن Lac-K336 (g) وLac-K457/8 (h). يزيد الجري بشكل متناسب من مستويات اللاكتات في الميتوكوندريا. تم الكشف عن مستويات اللاكتات في الميتوكوندريا والمستخلصات في عضلات الساق الهيكلية للفئران قبل وبعد 30 دقيقة من الجري. تم تأكيد نجاح استخراج وعزل الميتوكوندريا من خلال صبغ كل من علامة الميتوكوندريا COXIV وعلامة السيتوسول GAPDH (كما هو موضح لاحقًا). الجري يحفز Lac-K336 وLac-K457/8. تم الكشف عن مستويات Lac-K336 وLac-K457/8 في PDHA1 وCPT2 المنقاة من عضلات الساق الهيكلية للفأر بعد الجري لفترات زمنية محددة. تم الكشف عن مستويات PDHA1 وCPT2 في خلايا C2C12 قبل وبعد تعرضها لنقص الأكسجين. زادت العلاجات المشتركة لـ AARS2 واللاكتات من مستويات Lac-K336 و Lac-K457/8. تم تقدير مستويات Lac-K336 و Lac-K457/8 في عضلات الساق الهيكلية للفئران المستريحة والفئران التي تعبر عن AARS2 بشكل مفرط والتي تم إعطاؤها حقن اللاكتات في عضلة الساق باستخدام تقنية الطيف الكتلي (MS). ). ، زاد الجري ونقص الأكسجين من مستويات Lac-K336 وLac-K457/8. مستويات Lac-K336 وLac-K457/8 في عضلات الساق الهيكلية للفأر قبل وبعد 30 دقيقة من الجري (n) وتم ضخها بمحلول كريبس رينجر المؤكسج أو بدون. في نظام اختبار العضلات المعزولة السليمة 1200 A لمدة 30 دقيقة (o) تم تقديرها باستخدام MS ( ). يعمل AARS2 على تعطيل PDHA1 وCPT2 من خلال تحفيز اللاكتيل. تأثيرات زيادة تعبير AARS2 على مستويات اللاكتيل والأنشطة المحددة ) من PDHA1 ( ) و CPT2 ( ) وتم الكشف عن طفرات مواقع اللاكتيل الخاصة بهم. يؤدي اللاكتات إلى تعطيل PDHA1 وCPT2 من خلال تحفيز اللاكتيل. تأثيرات 10 مللي مول من Me-Lac على Lac-K336 والأنشطة المحددة لـ PDHA1 وطفرات موقع اللاكتيل الخاصة به. ) ، وتم الكشف عن تأثيرات Me-Lac على Lac-K457/8 والنشاطات المحددة لـ CPT2 وطفرات موقع اللاكتيل (s) الخاصة به ( جميع البيانات مُبلغ عنها كمتوسط SEM لثلاث تجارب مستقلة. تم تقييم الدلالة الإحصائية بواسطة اختبار الطالب غير المتزاوج ذو الطرفين. -اختبار t وتحليل التباين ثنائي الاتجاه: ؛ ؛ ; لا أهمية.
المعلومات، الشكل S9f)، ومستويات ATP (المعلومات التكميلية، الشكل S9g) في خلايا C2C12. أدى تناول -ألانين إلى زيادة في وقت نفاد الجري في فئران C57BL/6 (الشكل 7I) وكذلك في الفئران التي تحتوي على AARS2، ولكن ليس في الفئران التي تفتقر إلى AARS2 (الشكل 7m). وأخيرًا، تم دعم الفكرة القائلة بأن Lac-K336 وLac-K457/8 تثبط OXPHOS وتقيّد الجري التحمل من خلال الاكتشاف بأن كل من التنفس الأساسي والحد الأقصى لعضلات الساق الهيكلية للفئران قد زاد بسبب نقص Aars2، ولكنه انخفض بسبب فرط تعبير AARS2 أثناء التمرين، وكانت استجابات التنفس مرتبطة بمستويات AARS2 (معلومات إضافية، الشكل S9h).

يمكن تسليط الضوء على الأدوار الفسيولوجية المحتملة التي تلعبها Lac-K336 وLac-K457/8 في التمرين من خلال فحص Aars2 الخالي من Lac-K336 وLac-K457/8. الفئران. بينما Aars2 تحملت الفئران جريًا مكثفًا وأظهرت الفئران التي تعبر عن AARS2 بشكل مفرط ضعفًا في الجري المكثف (الشكل 7م)، Aars2 تراكمت الفئران مستويات أعلى من أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) ومؤشر مالونديالديهايد (MDA) الناتج عن ROS، وعلامة تلف الأكسدة الناتجة عن تأكسد الدهون. في عضلات الساق الهيكلية لديهم أكثر من تلك الموجودة في عضلات الساق الهيكلية للفئران من النوع البري، في وقت الإرهاق (الشكل 7ن، 7ع). وهذا يشير إلى أن خلايا العضلات قد تستخدم بروتين الميتوكوندريا اللاكتيل لحماية نفسها من الأضرار التأكسدية المحتملة أثناء تمارين التحمل. وبالتالي، بينما يتطلب تعزيز OXPHOS تحويل الأسيتيل- CoA الناتج عن اللاكتات والجلوكوز والأحماض الدهنية إلى ATP أثناء تمارين التحمل، فإن تدفق Ac-CoA إلى OXPHOS يتم تثبيطه بالتغذية الراجعة بواسطة نقص الأكسجين داخل الخلايا الناتج عن OXPHOS (الشكل 7ص).

لقد أظهرنا أن نظام الفسفرة المؤكسدة (OXPHOS) يخضع لتنظيم سلبي بواسطة اللاكتيل من البروتينات الميتوكوندرية، والذي يتم تحفيزه بواسطة نقص الأكسجين داخل الخلايا الناتج عن OXPHOS. لذلك، يمثل اللاكتيل من البروتينات الميتوكوندرية آلية تغذية راجعة للحد من OXPHOS. بالإضافة إلى ارتباط حمض اللبنيك بمستقبلات الأحماض الهيدروكربوكسيلية. وتفعيل ميتالوبروتيناز المصفوفة-2 لتنشيط TGF- إشارة تمثل عملية اللاكتيلation التي تتوسطها AARS2 وسيلة أخرى للإشارة باللاكتات. نظرًا لأن اللاكتيلation البروتينية الميتوكوندرية تستجيب لنقص الأكسجين داخل الخلايا، يجب أن تشمل أهميتها على الأقل منع عيوب نقص الأكسجين، مثل الإفراط في إنتاج الجذور الحرة الضارة (ROS) والأضرار الناتجة عنها كما لوحظ في الدراسة الحالية. من المتوقع أن تكون هناك أهمية فسيولوجية أو مرضية أكبر للاكتيلation البروتينية الميتوكوندرية لأن المستويات العالية
تحدث استجابات حمض اللبنيك ونقص الأكسجة في عمليات فسيولوجية مثل التمرين وتطور الأجنة، وفي عمليات مرضية مثل السرطانات.

تدمج عملية لاكتيل بروتين الميتوكوندريا بين الأيض ونقص الأكسجين، وهما مترابطان، للحد من عملية الفسفرة التأكسدية. إن ارتفاع حمض اللاكتيك في تطور الأجنة والسرطان يعود إلى زيادة الحاجة إلى المواد الأيضية بما في ذلك سلف حمض اللاكتيك البيروفات، وارتفاع حمض اللاكتيك أثناء التمرين يعود إلى تعزيز التحلل السكري وتحلل الجليكوجين الذي يزيد من مستوى البيروفات. علاوة على ذلك، يمكن أكسدة حمض اللاكتيك فقط عبر عملية الفسفرة التأكسدية، التي تستهلك الأكسجين داخل الخلايا. هذه العوامل، بالإضافة إلى أن مستويات حمض اللاكتيك تختلف بشكل كبير في هذه العمليات، تجعل من لاكتيل بروتين الميتوكوندريا آلية فعالة للحد من عملية الفسفرة التأكسدية. ومن الجدير بالذكر أنه على الرغم من أن اللاكتات يمكن أن تكون ركيزة لعملية الفسفرة التأكسدية عندما لا يكون الأكسجين داخل الخلايا مستنفدًا، إلا أن لاكتيل بروتين الميتوكوندريا يؤثر على تثبيط عملية الفسفرة التأكسدية عندما يتم تحفيز نقص الأكسجين داخل الخلايا، كما هو الحال خلال المرحلة المرهقة من تمارين التحمل. إنها تختلف عن آليات تنظيم عملية الفسفرة التأكسدية الأخرى، مثل الأسيتيل، والتنظيم الألستيري لـ PDHA1، التي تدمج المغذيات (أسيتيل-CoA) والإشارات الهرمونية. لتسهيل إمداد ATP بعد بدء التمرين، حيث لا يتم تحفيز نقص الأكسجة داخل الخلايا وتكون الحالة الحرجة لأقصى تنفس ميتوكوندري يكون منخفضًا كما تُور لضمان وظيفة كاملة لنظام أكسدة الفسفور المؤكسد. لا نستبعد إمكانية أن تنظيم بروتين الميتوكوندريا عن طريق اللاكتيل قد يؤثر أيضًا على القدرة على ممارسة الرياضة من خلال التأثير على خلايا أخرى غنية بالميتوكندريا وتستخدم اللاكتات، بما في ذلك خلايا القلب، كما لاحظنا في خلايا القلب المزروعة، ونظرًا لأن طفرات AARS2 قد ارتبطت باعتلال عضلة القلب.

يُعرف كل من AARS2 و SIRT3 كمنظّمين لعملية الفسفرة التأكسدية (OXPHOS) واللاكتات ووظيفة العضلات. تؤدي طفرة AARS2 إلى ضعف OXPHOS، واعتلال عضلة القلب الميتوكوندري، وفقدان وظيفة العضلات، وتراكم اللاكتات في الأنسجة. فقدان SIRT3 يسبب ضعف في OXPHOS وتراكم اللاكتات. علاوة على ذلك، يتم تحفيز SIRT3 خلال التدريب، مما يشير إلى أن SIRT3 قد يلعب دورًا في التكيف مع التدريب. يمتلك SIRT3 أدوارًا متعددة في تنظيم OXPHOS. في ظل الظروف الهوائية، يقلل SIRT3 من أسيتيل PDHA1 لتعزيز إنتاج اللاكتات وأكسدة الأحماض الدهنية في عضلات الفئران. بينما تحت ظروف نقص الأكسجين، يقلل من لاكتيلation PDHA1 لتعزيز OXPHOS. من خلال أي من العمليتين، يعزز SIRT3 إنتاج ATP في خلايا العضلات أثناء التمرين. علاوة على ذلك، قد يؤدي تقليل لاكتيلation البروتين الميتوكوندري من خلال استهداف كل من AARS2 و SIRT3 إلى

تعزيز مؤقت لوظيفة أكسدة الفسفور المؤكسد في خلايا العضلات وقدرة التحمل أثناء التمارين كما لاحظنا في الفئران. ومع ذلك، لا ينبغي تشجيع هذه الأساليب التي تعزز قدرة التحمل أثناء التمارين، حيث إن فقدان حماية بروتين الميتوكوندريا من اللاكتيل قد يؤدي إلى تلف الجذور الحرة.

المواد الكيميائية والمواد المتفاعلة: ATP (رقم الكاتالوج A6559)، لاكتات (رقم الكاتالوج L6661)، ميثيل لاكتات (رقم الكاتالوج 230340)، -ألانين (رقم الكاتالوج 146064)، L-ألانين (رقم الكاتالوج A7627)، DAPI (رقم الكاتالوج D9542)، MG132 (رقم الكاتالوج M8699)، PPi (رقم الكاتالوج 433314)، NAM (رقم الكاتالوج

الشكل 6 SIRT3 يعكس Lac-K336 وLac-K457/8. أ. تزيد علاجات NAM من Lac-K336 وLac-K457/8. تم الكشف عن مستويات Lac-K336 وLac-K457/8 من PDHA1 وCPT2 المنقاة من خلايا C2C12 وخلايا C2C12 المعالجة بـ NAM. تم فحص الخلايا بعد 3 ساعات من علاج 5 مليمول NAM. ب. يقوم SIRT3 بإزالة اللاكتيل من Lac-K336 وLac-K457/8. تم تحليل قدرة SIRT3، وSIRT4 المجال التحفيزي، وSIRT5 على إزالة اللاكتيل من الببتيدات الاصطناعية التي تحتوي على Lac-K336 وLac-K457/8 عبر MS للكشف عن تكوين الأنواع اللاكتيلية. ج-و. يقلل SIRT3 من مستويات Lac-K336 وLac-K457/8. تم الكشف عن مستويات Lac-K336 وLac-K457/8 في PDHA1 المنقى (ج) وCPT2 (د) قبل وبعد إزالة اللاكتيل باستخدام SIRT3 أو SIRT3 غير الفعال تحفيزياً. تم الكشف عن تأثيرات تعبير SIRT3 على النوع البري، وPDHA1 الخالي من اللاكتيل (e)، وCPT2 (f) في خلايا C2C12. إزالة Sirt3 تزيد من مستويات Lac-K336 وLac-K457/8 في الجسم الحي. مستويات Lac-K336 وLac-K457/8 من النوع البري وSirt3 تم الكشف عن عضلات الهيكل العظمي لساق الفأر . h، i SIRT3 ينظم أنشطة PDHA1 و CPT2. الأنشطة النسبية لـ PDHA1 و CPT2 التي تم تنقيتها من خلايا C2C12 والتي تعبر عن SIRT3 بشكل مفرط ( ) أو خلايا C2C12 KO Sirt3 (i) تم مقارنتها ( ). ينظم SIRT3 إنتاج Ac-CoA من التحلل السكري وأكسدة الأحماض الدهنية. ، و “ نسب من Ac-CoA من -جلوكوز ( ) و -بالميتات ( ) تم اكتشافها في خلايا C2C12 التي تعبر عن SIRT3 بشكل مفرط ( ) أو التي تم فيها حذف Sirt3 باستخدام sgRNAs مستقلة ( ) ( ). وقت المطاردة لـ -جلوكوز و كان زمن الـ -بالميتات 1 ساعة و 12 ساعة، على التوالي. SIRT3 ينظم مستويات اللاكتات والأحماض الدهنية الحرة. اللاكتات ( ) ومستويات الأحماض الدهنية الحرة ( ) في خلايا C2C12 التي تعبر عن SIRT3 بشكل مفرط ( ) أو خلايا C2C12 التي تم فيها حذف Sirt3 عبر sgRNAs مستقلة ( ) تم اكتشافها ( جميع البيانات مُبلغ عنها كمتوسط SEM لثلاث تجارب مستقلة. تم تقييم الدلالة الإحصائية بواسطة اختبار Student ذو الطرفين غير المتزاوج. -اختبار t وتحليل التباين ثنائي الاتجاه: ؛ ؛ .
72340) -بالميتات (رقم الكاتالوج 605573) ومجموعة عد الخلايا-8 (رقم الكاتالوج 96992) تم شراؤها من سيغما-ألدريش. أوليغوميسين A (رقم الكاتالوج S1478)، FCCP (رقم الكاتالوج S8276)، α-CHCA (رقم الكاتالوج S8612) وروكسايدوستات (رقم الكاتالوج S1007) تم شراؤها من سيلك. FX-11 (رقم الكاتالوج HY-16214) تم شراؤه من ميد كيم إكسبريس. تم شراء فوسفاتاز البروتين لامبدا (رقم الكاتالوج P0753) من نيو إنجلاند بايو لابز. تم شراء C-glucose (رقم الكاتالوج CLM1396) من مختبرات كامبريدج لل isotopes. تم شراء كريات سيباروز بروتين-A (رقم الكاتالوج 16-156) من ميرك ميليبور. تم شراء بنسلين-ستربتوميسين (رقم الكاتالوج 15070063) من إنفيتروجين. CellTiter-Glo تم شراء مجموعة الكواشف (رقم الكات G9241) من شركة بروميجا. تم شراء مجموعة اختبار نشاط إنزيم اللاكتات ديهيدروجيناز (رقم الكات K726) ومجموعة قياس الأحماض الدهنية الحرة (رقم الكات K612) من شركة بيوفيجن. تم شراء مجموعة اختبار نشاط إنزيم بيروفات ديهيدروجيناز (PDH) في صفيحة ميكرو (رقم الكات ab109902) ومجموعة اختبار نشاط SIRT3 (رقم الكات ab156067) من شركة أبكام. تم شراء الببتيدات الاصطناعية من شركة توب ببتيد. تم شراء الأوليغونيوكليوتيدات الاصطناعية من شركة جينفارما.

الأجسام المضادة: تم شراء anti-AARS1 (رقم الكاتالوج sc165990) من سانتا كروز. تم شراء anti-VHL (رقم الكاتالوج ab140989)، anti-HIF2a (رقم الكاتالوج ab109616)، anti-HIF3a (رقم الكاتالوج ab2165)، anti-CPT2 (رقم الكاتالوج ab110293)، anti-PDHA1-pS293 (رقم الكاتالوج ab177461)، anti-COXIV (رقم الكاتالوج ab202554)، anti-GAPDH (رقم الكاتالوج ab1439) و anti-Actin (رقم الكاتالوج ab1440) من أبكام. تم شراء anti-AARS2 (رقم الكاتالوج 22696-1-AP)، anti-PDHA1 (رقم الكاتالوج 18068-1-AP)، anti-DLD (رقم الكاتالوج 16431-1-AP)، anti-DLAT (رقم الكاتالوج 13426-1-AP)، anti-PDHB (رقم الكاتالوج 14744-1-AP)، anti-PHD1 (رقم الكاتالوج 12984-1-AP)، anti-PHD2 (رقم الكاتالوج 19886-1-AP)، anti-PHD3 (رقم الكاتالوج 18325-1-AP)، anti-CPT1A (رقم الكاتالوج 15184-1-AP)، anti-EHHADH (رقم الكاتالوج 26570-1-AP)، anti-ACADS (رقم الكاتالوج 16623-1-AP)، anti-ACADM (رقم الكاتالوج 55210-1-AP) و anti-ACADL (رقم الكاتالوج 17526-1-AP) من بروتين تك. تم شراء anti-HIF1a (رقم الكاتالوج 36169S) من تكنولوجيا الإشارات الخلوية. تم شراء anti-PDHA1-pS232 (رقم الكاتالوج LS-C265964/64724) من لايف سبان بيوساينس. تم شراء anti-PDHA1-pS300 (رقم الكاتالوج ABS194) من شركة EMD Millipore. تم شراء anti-Laminin (رقم الكاتالوج L9393) من سيغما-ألدريش. تم شراء anti-Flag (رقم الكاتالوج M20008)، anti-HA (رقم الكاتالوج M20002)، anti-Myc (رقم الكاتالوج M20003) من أب مارت. تم شراء Goat anti-rabbit IgG (رقم الكاتالوج 111-035-003) و Goat anti-mouse IgG (رقم الكاتالوج 115-035-003) من جاكسون. تم تصنيع anti-LacK336، anti-LacK457/8، anti-P377OH و anti-ECHS1 محليًا في هذه الدراسة.

تم الحصول على ذكور فئران C57BL/6J من شركة شنغهاي SLAC للحيوانات المخبرية المحدودة (شنغهاي، الصين). تم وضع الفئران في أقفاص تحت دورة ضوء/ظلام مدتها 12 ساعة في غرفة تتحكم في درجة الحرارة والرطوبة، وتم إطعامها طعام مختبر قياسي وماء حسب الحاجة. ثم تم تقسيمها عشوائيًا إلى مجموعات ضابطة وتجريبية. تم إنتاج فئران ترانسجينية hAARS2 مشروطة في خلفية جينية C57BL/6 عن طريق إدخال CAG-LSL-hAARS2-WPRE-PA في جين Rosa26 باستخدام نظام تحرير الجينوم المعتمد على CRISPR-Cas9 من قبل مركز شنغهاي لنماذج الكائنات الحية، Inc. (شنغهاي، الصين). تم إنتاج فئران hAARS2 ترانسجينية محددة عن طريق تزاوج فئران hAARS2 ترانسجينية مشروطة مع فئران CKMM-cre (رقم مخزون جاكسون #029100). Aars2 تم الحصول على فئران تحتوي على موقعين loxP يحيطان بالإكسون 1-5 من شركة جيم فارما تك المحدودة (شنغهاي، الصين). تم إنتاج فئران ترانسجينية محددة للعضلات عن طريق تزاوج فئران Aars2 KO الشرطية مع فئران CKMMcre. Sirt3 تم الحصول على الفئران من مركز شنغهاي لنماذج الكائنات الحية، وتم تأكيد أنماطها الجينية عبر تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). تم إجراء جميع إجراءات الحيوانات وفقًا للجنة رعاية الحيوانات في جامعة فودان.

تم شراء خطوط خلايا العضلات الهيكلية للفئران C2C12، وخلايا عضلة القلب للفئران HL-1، وخلايا الكلى الجنينية البشرية HEK293T من مجموعة الثقافة الأمريكية (الولايات المتحدة الأمريكية). تم زراعة جميع خطوط الخلايا المذكورة أعلاه في وسط دالبكو المعدل من إيجل (DMEM) (هايكلاون، الولايات المتحدة الأمريكية) مع إضافة مصل جنيني من الأبقار (جيبكو، الولايات المتحدة الأمريكية) في تحت في حاضنة مرطبة. تم اختبار جميع خطوط الخلايا وتوثيقها من خلال تقييم شكلها ومعدل نموها؛ جميعها خالية من الميكوبلازما.

تم عزل الخلايا الكبدية الأولية من الفئران باستخدام طريقة التروية ذات الخطوتين. تم حقن الفئران داخل الصفاق بـ 1% نيمبوتال، وتم قسطرة الأوردة البابية. بعد ذلك، تم استخدام 0.5 مللي مول من EDTA و تم تسخين الكولاجيناز IV (سيغما ألدريتش، الولايات المتحدة الأمريكية) مسبقًا، وتم ضخه بشكل متتابع في الكبد حتى تفتت هيكل الكبد وتشتت الخلايا. وتم تصفية التعليق الخلوي الناتج من خلال تم تصفية (NEST، ووكسي، الصين)، وغسلها بمحلول ويليام E المتوسط (جيبكو، الولايات المتحدة الأمريكية)، وتنقيتها باستخدام محلول بيركول (GE، الولايات المتحدة الأمريكية). تم زراعة خلايا الكبد بكثافة خلايا/بئر في وسط ويليام الخالي من المصل. تم التحقق من خلايا الكبد الأولية للفئران من خلال تقييم شكل الخلايا وتعبير الألبومين. تم عزل خلايا العضلات الأولية للفئران وتم تعديل ظروف الزراعة من البروتوكولات المنشورة. تم عزل عضلات الأطراف الخلفية من الفئران البالغة ثم تم هضمها في وسط DMEM يحتوي على مل من الكولاجيناز II (سيغما ألدريتش، الولايات المتحدة الأمريكية) و هيبز. تم تصفية المعلقات من خلال ثم مرشحات. تم تعليق الخلايا في وسط F-10 يحتوي على 20% من مصل العجل الجنينى. عامل نمو الألياف الأساسية (bFGF) في طبق مغطى مسبقًا بمادة ماتريجل، محفوظ في لمدة 72 ساعة. ثم تم نقل الخلايا إلى طبق غير مغطى بمادة ماتريجيل لمدة 45 دقيقة لإزالة الخلايا الليفية التي التصقت في هذه الخطوة. تم نقل السائل الخلوي إلى طبق جديد مغطى مسبقًا بمادة ماتريجيل وزرعه.

تم إنتاج أجسام مضادة متعددة النسائل محددة لموقع اللاكتيل في أرنب نيوزيلندي ذكر عمره 3 أشهر باستخدام ببتيد PDHA1 المحتوي على Lac-K336 أو ببتيد CPT2 المحتوي على Lac-K457/8. تم ربط هذه الببتيدات من خلال سيستين في الطرف C إلى هيموسيانين قوقع المفتاح (KLH). تم تحصين الأرانب بـ تم حقن المستحضر في معزز فريد الكامل. تم إجراء حقن معززة كل 4 أسابيع. تم استئصال دم الأرانب بعد 10-14 يومًا من الحقنة النهائية. تم جمع 50 مل من الدم من كل أرنب وتم طرده مركزيًا. تم تنقية الطور العلوي (المصل) باستخدام ببتيدات المستضد وفقًا للبروتوكولات المنشورة. تم إنتاج أجسام مضادة متعددة النسائل محددة بموقع الهيدروكسيل باستخدام ببتيد AARS2 المحتوي على OH-P377 كما هو موضح أعلاه. المستضد المستخدم:

ببتيد PDHA1 المحتوي على Lac-K336: ASVEEL(K-Lac)EIDVEV-C
ببتيد CPT2 المحتوي على Lac-K457/8: EFLK(K-Lac)QKLS-C
ببتيد AARS2 المحتوي على OH-P377: C-GSLV(P-OH)VVVET

تم استنساخ AARS2 و VHL في pcDNA3.1(b+)-Flag و pcDNA3.1(b+)Myc، على التوالي، بين مواقع Xhol و EcoRI. تم استنساخ PDHA1 و CPT2 في pcDNA3.1(b+)-Flag بين مواقع Xhol و EcoRI. تم استنساخ PDH2 في pcDNA3.1(b+)-Myc بين مواقع Xhol و EcoRI، وتم استنساخ SIRT3 في pcDNA3.1(b+)-HA بين مواقع Xhol و EcoRI.

تم إجراء نقل البلازميد باستخدام بولي إيثيلين إيمين (PEI، بوليساينس، الولايات المتحدة الأمريكية) أو ليبوفكتامين 8000 (بيوتايم، شنغهاي، الصين).

لإجراء نقل الجينات باستخدام PEI، تم إضافة البلازميد و PEI إلى DMEM خالي من المصل مع التحريك بقوة، وتم احتضان المزيج لمدة 15 دقيقة قبل إضافته إلى وسط زراعة الخلايا. أما بالنسبة لنقل الجينات باستخدام Lipofectamine 8000، فقد تم إضافة البلازميد و Lipofectamine 8000 إلى DMEM خالي من المصل، وتم خلطه برفق باستخدام ماصة، ثم أضيف مباشرة إلى وسط زراعة الخلايا. تم استبدال وسط الزراعة كل بعد التحويل. تم جمع الخلايا بعد 36 ساعة.

مي-لاكتات، ألانين، -ألانين وNAM. تم زراعة الخلايا في وسط RMPI 1640 القياسي (US Biological، الولايات المتحدة الأمريكية)، وتم نقلها إلى RMPI 1640 خالي من الأحماض الأمينية لمدة 30 دقيقة قبل المعالجات. التركيزات المحددة من لاكتات، ألانين، و تم إضافة -ألانين إلى وسط الثقافة عندما وصلت كثافة الخلايا إلى التقاء عند قبل الحصاد. تمثل معالجة NAM في إضافة 5 مللي مول من NAM إلى وسط DMEM خالي من المصل قبل الحصاد.

الشكل 7 يدفع OXPHOS إلى اللاتيل لتحديد حدود OXPHOS وقدرة التحمل في الجري. أ. يحفز OXPHOS نقص الأكسجة داخل الخلايا. HIF ومستويات AARS2 في خلايا C2C12 في قاعدة DMEM والجلوكوز- بالميتات- وميلك- تم اختبار وسائط DMEM المدعمة في وجود أو غياب روتينون الذي يثبط OXPHOS. حقن اللاكتات يسبب نقص الأكسجين في عضلات الفئران. HIF1 تم الكشف عن مستويات AARS2 في أفخاذ الساقين الخلفيتين للفأر قبل وبعد تم حقن اللاكتات في عضلة الساق الخلفية ( إنتاج اللاكتات ضروري لتحفيز نقص الأكسجة واللاكتيل في عضلات أرجل الفئران. HIF1 تم تقييم مستويات AARS2 واللاكتيل في أفخاذ أرجل الفئران الخلفية غير المعالجة والفئران التي تم معالجتها مسبقًا بـ FX-11 عندما بدأت في الجري. يؤدي الجري إلى تراكم اللاكتات في عضلات أرجل الفئران الهيكلية. تم تحديد مستويات اللاكتات النسبية في عضلات الفئران الهيكلية من النوع الأول والنوع الثاني قبل وبعد 30 دقيقة من الجري. تسبب الجري في زيادة ملحوظة في اللاكتيل في العضلات من النوع الأول. HIF1 تم تحديد مستويات AARS2، بالإضافة إلى Lac-K336 وLac-K457/8 في عضلات الهيكل العظمي للفئران من النوع الأول والنوع الثاني عند بدء الجري. انخفاض ATP في العضلات الهيكلية من النوع الأول مرتبط بزيادة في Lac-K336 وLac-K457/8. تم مراقبة مستويات ATP في عضلات الساق الهيكلية من النوعين الأول والثاني في الفئران بعد الجري لفترات زمنية محددة. تظهر التغيرات في Lac-K336 و Lac-K457/8 (الشكل 5j). g مستويات AARS2 الأساسية في عضلات الساق الهيكلية للفئران مرتبطة عكسياً مع وقت نفاد جهدها أثناء الجري. كان هناك ارتباط بين وقت نفاد الجهد أثناء الجري عالي الكثافة ومستويات AARS2 في عضلات الساق أثناء الراحة. ). يعيق Lac-K336 و Lac-K457/8 تدفق Ac-CoA في عضلات الهيكل العظمي للفئران. -مستويات Ac-CoA في النوع البري، وذوات التعبير المفرط لـ AARS2 وSirt3 تم الكشف عن عضلات الهيكل العظمي لساق الفأر بعد ساعة واحدة من تلقي كل فأر “ حقن الجلوكوز عبر الوريد الذيل تقلل اللاكتيلation من معدلات استهلاك الأكسجين في العضلات الهيكلية للفئران وإنتاج ATP. مستويات استهلاك الأكسجين (i) و ATP (j) في الميتوكوندريا في عضلات الساق الهيكلية في حالة الراحة، وذوات التعبير المفرط عن AARS2، و Sirt3. تم تحليل الفئران يعيق Lac-K336 وLac-K457/8 وقت نفاد جري الفئران. تم قياس وقت نفاد جري الفئران عالي الكثافة في النوع البري، والفئران التي تعبر عن AARS2 في العضلات، وSirt3. فئران أنا أرضع و -ألانين ينظم بشكل عكسي وقت نفاد جري الفئران. أوقات نفاد الجري عالية الكثافة للفئران غير المعالجة أو المعالجة باللاكتات أو تم قياس -ألانين عن طريق حقن عضلة الساق، على التوالي. ). -ألانين يطيل وقت إرهاق الفئران بطريقة تعتمد على AARS2. أوقات إرهاق الجري عالي الكثافة من النوع البري، وذوي التعبير المفرط عن AARS2، وAars2 فئران مع أو بدون عضلة الساق حقن الألانين تم قياس (. فقدان اللاتيل يؤدي إلى زيادة تلف الجذور الحرة. مستويات الجذور الحرة ( ) ومستويات المالونديالديهايد المحفزة ( النوع البري و Aars الفئران في وقت نفاد الطاقة أثناء الجري ) تم مقارنتها. يوضح الرسم البياني أن التمارين تعزز أكسدة اللاكتات من خلال OXPHOS، مما يعزز نقص الأكسجة داخل الخلايا الذي يحفز AARS2 و Lac-K336 و Lac-K457/8 لتثبيط تدفقات Ac-CoA من اللاكتات/تحلل السكر و FAO و OXPHOS. الآليات التي تم الكشف عنها في هذه الدراسة موضحة بأسهم حمراء. جميع البيانات مُبلغ عنها كمتوسط. SEM لثلاث تجارب مستقلة. تم تقييم الدلالة الإحصائية بواسطة اختبار الطالب غير المتزاوج ذو الطرفين. -اختبار t وتحليل التباين ثنائي الاتجاه: ؛ ؛ ؛ ; لا دلالة.

روتينون. تم إضافة الروتينون إلى وسائط الثقافة للحصول على محلول قبل 20 دقيقة من جمع الخلايا.
تم إضافة مثبط ناقل أحادي الكربوكسيلات a-CHCA (5 مللي مول، التركيز النهائي) إلى وسط الثقافة قبل ساعتين من الحصاد.

روكسادستات. روكسادستات ( تم إضافة (التركيز النهائي) إلى وسط الثقافة قبل الحصاد بـ 6 ساعات.

نقص الأكسجين. تم زراعة الخلايا تحت ظروف النورموكسي قبل نقلها إلى حاضنة نقص الأكسجين (ثيرمو فيشر ساينتيفيك، الولايات المتحدة الأمريكية) مع خليط غازي يحتوي على و تم التوازن مع النيتروجين. تم جمع الخلايا في النقاط الزمنية المحددة التي لم تتجاوز 8 ساعات بعد التعرض لنقص الأكسجين. تم مراقبة مستويات الأكسجين في الحجرة في أوقات أخذ العينات.

محلول عازل مفرط التخفيف يحتوي على 20 مللي مول من HEPES (رقم الهيدروجين 7.5) EDTA، و تم إضافة خليط من مثبطات البروتياز والفوسفاتاز إلى الخلايا بعد غسلها بمحلول PBS. ثم تم كشط الخلايا وكسرها باستخدام حقنة. وتم طرد المستحلب في جهاز الطرد المركزي عند لمدة 10 دقائق لفصل النواة وبقية الحطام. ثم تم طرد السائل الطافي في جهاز الطرد المركزي عند و لمدة 30 دقيقة. كانت السائل الناتج يتكون من البلازما. بعد ذلك، تم غسل الراسب ثلاث مرات بمحلول مفرط التوتر يحتوي على 20 مللي مول من HEPES (رقم الهيدروجيني 7.5)، EDTA ، في PBS. كان الراسب النهائي يحتوي على الميتوكوندريا. تم التحقق من نقاء البلازما والميتوكوندريا باستخدام علامات البلازما والميتوكوندريا، الأكتين، وCOXIV، من خلال اختبارات الوسترن بلوت.

حقن عضلة الساق. لاكتات، ألانين، و تم تحضير -ألانين في محلول ملحي للحصول على تركيز نهائي قدره 500 مللي مول، تم ضبط الرقم الهيدروجيني له على 7.4. تم حقن جرعة من كل دواء في عضلة الساق الخلفية للفئران عن طريق الحقن العضلي. تم حقن حجم مماثل من تم حقن محلول ملحي في نفس العضلات كتحكم.

حقن MG132 عن طريق الوريد. تم تحضير MG132 في محلول ملحي للحصول على تركيز نهائي قدره 500 مللي مولار، وتم ضبط الرقم الهيدروجيني على 7.4. تم حقن الفئران عن طريق الوريد بـ تم استخدام MG132 مرتين في الأسبوع لمدة 4 أسابيع قبل استخدامه للتجارب وتم أخذ عينات من العضلات للكشف.

حقن FX-11. تم حقن الفئران عن طريق البطن بـ دي إم إس أو كتحكم أو تم إعطاء مثبط LDHA FX-11 المذاب في DMSO يوميًا لمدة أسبوعين، وبعد ذلك تم إجراء اختبارات الجري على الفئران.

تم تعديل اختبار أداء العدو للفئران من البروتوكولات المنشورة. أولاً، تم وضع الفئران التي تبلغ من العمر 20 أسبوعًا على جهاز المشي ZH-PT/5S المزود بشبكة تحفيز كهربائية خلفية توفر صدمة كهربائية بقوة 0.2 مللي أمبير. تم تسخين الفئران أولاً على جهاز المشي لمدة 3 دقائق عند تم زيادة السرعة إلى لمدة 30 ثانية. بعد ذلك، قمنا بزيادة السرعة من إلى مع زيادة قدرها ، مع استمرار كل زيادة لمدة 15 ثانية (إجمالي تم تكرار النمط بسرعة متزايدة حتى لم يعد بإمكان الفئران مواكبة السرعة واستسلمت عند الشبكة.

تم تعديل اختبار إرهاق تمارين الشدة العالية للفئران من البروتوكولات المنشورة. باختصار، تم تكييف الفئران التي تبلغ من العمر 20 أسبوعًا مع جهاز المشي قبل يومين من التجارب عن طريق الجري على لمدة 5 دقائق و دقيقة واحدة لمدة 5 دقائق تليها لمدة دقيقة واحدة كل يوم. بالنسبة لتجارب التمرين، تم زيادة السرعة. كل 5 دقائق حتى تم الوصول إلى النقطة التي تم فيها زيادة الميل بمقدار 5 درجات كل 5 دقائق حتى الإرهاق.

تم تعديل إعداد العضلات من البروتوكولات المنشورة. باختصار، تم euthanize الفئران وتم تشريح عضلات السوليوس (SOL) التي تتكون أساسًا من العضلات البطيئة (النوع الأول)، وعضلات الباسطة للأصابع الطويلة (EDL) التي تتكون أساسًا من العضلات السريعة (النوع الثاني)، وتم إخضاعها للاختبارات التالية.

تم euthanizing الفئران وتم تشريح عضلات الساق الهيكلية الخاصة بها ووضعها على الفور في محلول كريبس رينجر. د-جلوكوز , HEPES) في حوض مائي معزول من نظام اختبار العضلات السليمة 1200 A (أورورا ساينتيفيك، كندا)، ومن ثم تم تهويته مع أو بدون و في لمدة 30 دقيقة.

تم تشريح عضلات أرجل الفأر وغسلها في محلول عزل الميتوكوندريا البارد الذي يحتوي على 70 مللي مول من السكروز، 210 مللي مول من المانيتول، 5 مللي مول من MOPS، إي جي تي إيه، و ألبومين مصل البقر خالي من الأحماض الدهنية (pH 7.2). ثم تم تجانس الأنسجة باستخدام مطحنة الأنسجة (شنغهاي جينغ شين، شنغهاي، الصين) عند تمت عملية الطرد المركزي للمستحلب عند و لمدة 10 دقائق لإزالة النوى وفضلات الخلايا. ثم تم طرد السائل الطافي الغني بالميتوكندريا. و تم استخدام الراسب الناتج عن الميتوكوندريا لمدة 10 دقائق في الاختبارات.

تم جمع الدم الشرياني على الفور في أنابيب مضادة للتخثر من الشريان الأبهر البطني للفئران التي جرت لفترات زمنية محددة. تم تحديده باستخدام جهاز تحليل الإلكتروليتات وغاز الدم IDEXX VetStat (IDEXX B.V.، هولندا).

تم إجراء اختبارات ROS لعضلات الساق في الفئران باستخدام مجموعة اختبار ROS (رقم الكاتالوج E-BC-K138-F، شركة Elabscience Biotechnology Inc.، هيوستن، تكساس، الولايات المتحدة الأمريكية) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. تم هضم الأنسجة إلى تعليق خلوى مفرد عبر هضم الكولاجيناز. ثم، تم حضانة الخلايا مع تم استخدام كاشف DCFH-DA لمدة 30 دقيقة. بعد الطرد المركزي بسرعة 1000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق، تم غسل كريات الخلايا مرتين وإعادة تعليقها في الكاشف 3 قبل تحليلها في جهاز قياس التدفق FACS Calibur.

تم تقييم أكسدة الدهون باستخدام مجموعة اختبار MDA (ab233471، Discovery Drive، Cambridge Biomedical Campus، Cambridge، CB2 0AX، المملكة المتحدة) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. لتحضير مستخلص الأنسجة، تم تجانس 50 ملغ من العضلات الهيكلية الطازجة بسرعة على الثلج في محلول فوسفات (pH 3-3.2) مع ترايتون X100 يليه الطرد المركزي عند لمدة 15 دقيقة عند تمت إزالة المواد غير القابلة للذوبان، وتم تخزين السائل العلوي على الثلج لاستخدامه لاحقًا. قبل الاستخدام، تم توازن جميع المواد والمركبات المحضرة إلى درجة حرارة الغرفة مع التحريك بلطف. بعد ذلك، تم إضافة عينات الاختبار، وعيّنة تحكم فارغة (محلول التخفيف)، ومعايير MDA المخففة بالتسلسل إلى لوحة ميكروية ذات قاع شفاف مكونة من 96 بئرًا. تلا ذلك حضانة خليط التفاعل في درجة حرارة الغرفة لمدة . ثم، تم إضافة محلول التفاعل لزيادة حجم العينة الإجمالي إلى حسنًا. تم تحضين خليط التفاعل النهائي في درجة حرارة الغرفة لمدة تم قياس الامتصاص عند نقطة النهاية باستخدام جهاز قراءة الامتصاص مع تصحيح مسار الضوء عند .

تم إعداد مقاطع بارافين لعضلات الساق الهيكلية للفئران من النوع البري، والفئران التي تعبر عن AARS2 بشكل محدد في العضلات، والفئران التي جرت. تم إزالة البارافين من المقاطع، وإعادة ترطيبها، واسترجاع المستضد في محلول استرجاع المستضد EDTA (pH 8.0)، وتم حجبها بـ تمت معالجة العينة بمحلول BSA لمدة 30 دقيقة. تم صبغ النوى بصبغة DAPI. تم صبغ HIF1a وpS293-PDHA1 وAARS2 وCOXIV باستخدام الأجسام المضادة الأولية والثانوية الخاصة بها. تم التقاط صور للشرائح المحضرة تحت ميكروسكوب الفلورسنت.

تم التضحية بالفئران وتم تجانس 50 ملغ من العضلات الهيكلية الطازجة بسرعة على الثلج في محلول التحليل الذي يحتوي على تريس- HCl (pH 7.5) و150 مللي مولار NaCl، وتم الطرد المركزي عند لمدة 15 دقيقة عند ، وبعد ذلك تم إزالة المواد غير القابلة للذوبان. ثم تم جمع السائل العلوي على الثلج للاختبار التالي. بعد ذلك، تم استخدام 400 وحدة من -فوسفاتاز (نيو إنجلاند بيو لاب) و تمت إضافتها إلى السائل الفائق وتم تحضينها عند لمدة 30 دقيقة، وتم استخدام السائل الطافي لاختبار نشاط PDHA1.

تم تصنيع الأوليغونيوكليوتيدات المستخدمة في كتم التعبير عن VHL و PHD1 و PHD2 و PHD3 و AARS2 و SIRT3 بواسطة GenePharma (شنغهاي، الصين). تم إدخال الأوليغونيوكليوتيدات إلى الخلايا. قبل الحصاد. تم التحقق من كفاءة التثبيط باستخدام اختبارات الوسترن بلوت. تسلسلات siRNA المستخدمة لاستهداف الجينات هي كما يلي:

Phd1 siRNA: 5′-أكوتشاويوغويوتشويوأغغغ-3′
Phd2 siRNA: 5′-UGGAUUUGUACCAUUCUUCUG-3′
siRNA Phd3: -يو سي جي إيه إيه إيه سي يو سي تي يو جي إيه إيه جي إيه إيه جي جي-3′

لإسقاط Phd2 و Vhl و Aars2 و Cpt2 و Sirt3 في خلايا C2C12، تم استخدام بروتوكولات CRISPR/Cas9. تم نقل RNA الدليل الذي يحتوي على تسلسل الهدف إلى خلايا C2C12، والتي تم اختيارها بعد 36 ساعة باستخدام برومايسين (أمريسكو، الولايات المتحدة الأمريكية) لمدة 3 أيام. تم جمع الخلايا التي نجت في النهاية وزرعها في لوحة 96 بئر بكثافة

1 خلية/بئر. تم التحقق من نجاح إلغاء كل جين من خلال اختبارات الوسترن بلوت.
تسلسل الدلائل كما يلي:
nsgPhd2 #1:
ف: -CACCGACACCGGCAAGTTCACGGAC-3′
R: 5′-AAACGTCCGTGAACTTGCCGGTGTC-3′
nsgPhd2 #2:
5′-CACCGCAAGTTCACGGACGGGCAGC-3′
ر: -AAACGCTGCCCGTCCGTGAACTTGC-3′
nsgAars2 #1:
ف: -CACCGCTGCTAAGTACCGGGGCCGT-3′
R: 5′-AAACACGGCCCCGGTACTTAGCAGC-3′
nsgAars2 #2:
ف: -CACCGCGAGCGGCTGCGCTTTGACG-3′
ر: -AAACCGTCAAAGCGCAGCCGCTCGC-3′
nsgCpt2 #1:
F: 5′-CACCGATCGTCCCGGGCGGCAATGG-3′
R: 5′-AAACCCATTGCCGCCCGGGACGATC-3′
nsgCpt2 #2:
ف: -CACCGAGGCGCGGCATCATCGTCCC-3′
ر: -AAACGGGACGATGATGCCGCGCCTC-3′
nsgVhl #1:
ف: -CACCGCGTTCCAATAATGCCCCGGA-
ر: -AAACTCCGGGGCATTATTGGAACGC-3′
nsgVhl #2:
F: 5′-CACCGCCGATCTTACCACCGGGCAC-3′
ر: -AAACGTGCCCGGTGGTAAGATCGGC-3′
nsgSirt3 #1:
ف: -CACCGCCAGTACAGACAGGGCAGCGGGG-3′
ر: -AAACCCCCGCTGCCCTGTCTGTACTGGC-
nsgSirt3 #2:
F: 5′-CACCGCTTTCAACAAACCTCCAGGGAGG-3′
R: 5′-AAACCCTCCCTGGAGGTTTGTTGAAAGC-3′

تم تحلل الخلايا باستخدام محلول التحلل الذي يحتوي على محلول عازل NP-40 (50 ملليمول من تريس-هيدروكلوريد، pH 7.5) نونيديت بي- أبروتينين مل من لوبيبتين تم تجانس الأنسجة في محلول التحلل قبل عملية التحلل. تمت إضافة كريات الأجسام المضادة المرتبطة إلى المستخلص لزيادة تركيز البروتينات المستهدفة. تم غسل البروتينات الغنية على الكريات بمحلول 0.5% NP-40 ثلاث مرات قبل خلطها بمحلول تحميل SDS-PAGE لتحرير البروتينات للتحليل.

تم تحطيم الخلايا المزروعة وغليها مع محلول تحميل SDS-PAGE. تم تجانس أنسجة الفئران باستخدام محلول التحلل الذي يحتوي على 0.5% NP-40، و50 مليمول من تريس- HCl (pH 7.5). Nonidet P-40، ومزيج من مثبطات البروتياز (سيغما-ألدريتش)، قبل أن يتم غليه مع تحميل المخزن. بعد الطرد المركزي عند و لمدة 15 دقيقة، تم جمع السائل الطافي من المستخلصات لاختبار الوسترن بلوت وفقًا للإجراءات القياسية. تم الكشف عن إشارات الوسترن بلوت باستخدام جهاز Typhoon FLA 9500 (GE Healthcare، ليتل تشالفونت، المملكة المتحدة).

تم تخفيف الببتيدات بـ بالتخفيفات المحددة. تم نقل العينات إلى أغشية نيتروسليلوز، وتركها لتجف في الهواء عند درجة حرارة الغرفة. تم حجب الغشاء بـ الحليب، ثم تم حضنه مع جسم مضاد أولي للتعرف على الببتيد وجسم مضاد ثانوي للكشف. تم الكشف عن إشارات التلطيخ باستخدام جهاز Typhoon FLA 9500 (GE، الولايات المتحدة الأمريكية).

لتحليل اليوبكويتين، تم نقل البلازميدات المسمّاة بـ HA-tagged ubiquitin والهدف معًا إلى الخلايا. بعد 36 ساعة من النقل، تم إضافة MG132 إلى الوسط من أجل قبل الحصاد. تم جمع الخلايا، وتحليلها، وغليها في محلول 1% SDS (تريس-هيدروكلوريك، الرقم الهيدروجيني تم إجراء الترسيب المناعي في مستخلصات مخففة بعشرة أضعاف مع EDTA و 1 مM DTT لمدة 10 دقائق. تم تحليل عازلة NP-40، وتم تحليل ubiquitination وفقًا لبروتوكولات الوسترن بلوت القياسية.

تم التعبير عن PDHA1-Flag و PDHB-Myc بشكل مشترك في الخلايا المحددة. تم تحلل الخلايا على الثلج باستخدام محلول NP-40 المدعوم بالبروتياز
المثبطات. تم تنقية PDHA1 باستخدام كرات العلم (سيغما ألدريتش) ثم تم غسلها ثلاث مرات بـ عازل NP-40. تم قياس PDHB الذي تم تنقيته مع PDHA1 عبر تقنية الويسترن بلوت باستخدام الأجسام المضادة لمركب Myc، واستخدم لتطبيع نشاط PDHA1. تم إجراء اختبار نشاط PDHA1 كما هو موصوف سابقًا. باختصار، يحتوي محلول التفاعل على (درجة الحموضة 7.0)، تم إضافة البيروفات الصوديوم، 0.2 مللي مول من ثيامين ثنائي الفوسفات، و0.1 مللي مول من 2,6-ثنائي كلوروفينول إندوفينول (2,6-DCPIP) إلى مركب PDHA1/PDHB المنقى لبدء التفاعل. تم الحفاظ على التفاعلات عند تمت مراقبة التفاعل من خلال قياس انخفاض 2,6-DCPIP عند 600 نانومتر باستخدام مطياف ضوئي من شركة روش (بازل، سويسرا).

تم قياس نشاط إنزيم مركب PDC باستخدام مجموعة اختبار نشاط إنزيم PDH (Abcam، الولايات المتحدة الأمريكية) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. تم جمع الخلايا وأنسجة الفئران لاستخراج البروتينات. تم تحميل العينات على اللوحة وتمت الحضانة في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 ساعات. تمت إضافة محلول الاختبار إلى كل بئر، وتم تحديد نشاط PDH من خلال متابعة تقليل إلى NADH، المرتبط بتقليل صبغة المراسل لإنتاج منتج تفاعل ملون (أصفر)، تم مراقبة تركيزه من خلال قياس الامتصاص عند 450 نانومتر.

تم قياس نشاط CPT2 من خلال قياس الانخفاض في مستويات CoA. تم إجراء التفاعلات في “ خليط التفاعل يحتوي على 50 مللي مول من تريس- HCl (رقم الهيدروجيني 7.5) EDTA، 2 مللي مول CoA، و2 مللي مول بالميتيل-ل-كارنيتين. بعد ذلك، تم ترسيب CPT2 من خلايا HEK293T. تم بدء الاختبار في حاضنة اهتزاز حرارية عند 1000 دورة في الدقيقة و ، وتم جمع الخليط في ، و 30 دقيقة. تم إنهاء التفاعل بإضافة من 10 مللي مولار DTNB. تم مراقبة السائل العلوي باستخدام قارئ الميكرو بلايت عند 410 نانومتر.

تم استخدام مجموعة اختبار لقياس نشاط LDH بطريقة الكروماتوغرافيا اللونية (بيوفيجن، الولايات المتحدة الأمريكية). باختصار، تم تجانس الخلايا مع محلول الفحص البارد، وتم حضنها على الثلج لمدة 10 دقائق، ثم تم الطرد المركزي عند لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك، تم نقل السائل العلوي إلى أنبوب جديد، و من خليط التفاعل ( عينة محلول العينة، و تم نقل مزيج التفاعل إلى لوحة 96 بئر. تم قياس الامتصاص على الفور عند 450 نانومتر في وضع الحركة في لـ تم قياس نشاط LDH بناءً على التغير في الامتصاص خلال فترة زمنية محددة.

تم قياس نشاط CPT1A في مستخلصات الخلايا طيفيًا من خلال متابعة إطلاق CoA-SH من بالميتويل-CoA باستخدام الكاشف العام للثيول DTNB. تم تحضين خلطات التفاعل التي تحتوي على محلول DTNB ومستخلص الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة لإزالة جميع مجموعات الثيول التفاعلية. بعد التحضين، تم قياس الامتصاص عند 412 نانومتر. لبدء التفاعل، تم استخدام بالميتويل-CoA. تم إضافة محلول L-carnitine (1 مللي مول، التركيز النهائي في 1 م مول من Tris، pH 8.0) إلى خلطات التفاعل. تم حضن خلطات التفاعل لمدة 10 دقائق عند بعد الحضانة، تم قياس الامتصاص عند 412 نانومتر. الفرق بين الامتصاص مع وبدون الركائز يقيس إطلاق CoA-SH. تم تعريف النشاط على أنه نانومول من CoA-SH المحرر. تم تحديد محتوى البروتين في مستخلصات الخلايا وفقًا لطريقة برادفورد.

تم استخدام مجموعة اختبار نشاط SIRT3 (Abcam، الولايات المتحدة الأمريكية) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. يحتوي خليط التفاعل على محلول الاختبار، ببتيد الفلورو-ركيزة، NAD، المطور، والعينات. اقرأ شدة الفلورية لمدة 30 دقيقة إلى 60 دقيقة بفواصل زمنية تتراوح بين 1 دقيقة إلى 2 دقيقة باستخدام مقياس فلورية لوحات الميكروتيتر مع تحفيز عند والانبعاث في قم بقياس وحساب معدل التفاعل بينما تظل سرعة التفاعل ثابتة.

تم قياس تركيز اللاكتات في دم الوريد الذيل باستخدام جهاز Lactate Scout4 (SensLab GmbH، ألمانيا). تم قطع ذيل كل فأر باستخدام شفرة، وتم مسح القطره الأولى من الدم. تم الضغط برفق على الذيل، وكانت القطره الثانية من الدم كافية لملء الـ
غرفة القياس لمستشعر اللاكتات التي تتيح تحديد التركيز.

تم إجراء اختبارات OCR باستخدام وحدة OROBOROS Oxygraph-2K (Oroboros Instruments GmbH، النمسا). تم تطبيع قيم استهلاك الأكسجين وفقًا لعدد الخلايا أو محتوى الميتوكوندريا.

بالنسبة للخلايا المزروعة، حوالي تم هضم الخلايا وإعادة تعليقها في PBS. تم تحديد معدل التنفس الأساسي باستخدام الركيزة (5 مللي مول من البيروفات و0.1 مللي مول من الماليك). تم تحديد قدرة إنتاج ATP والتنفس الأقصى بشكل متتابع باستخدام علاجات أوليغوميسين A وFCCP (سيلك، الصين) على التوالي.

تم عزل الميتوكوندريا من عينات عضلات الفئران وفقًا لبروتوكول منشور، وتم إعادة تعليق عينات الميتوكوندريا المعزولة في محلول التنفس (0.5 مللي مول EDTA، 3 مللي مول MgCl، 60 مللي مول حمض اللاكتوبيونيك، 20 مللي مول التورين، هيبز، 110 مللي مولار د-سكروز و بروتين ألبومين مصل البقر خالي من الأحماض الدهنية، pH 7.2).

تم تحويل المتجه pGEX-6p-1-AARS2 إلى سلالة الإشريكية القولونية BL21 (DE3). ثم تم تحفيز الخلايا المحولة باستخدام 0.2 مللي مول من IPTG عندما كان . بعد زراعتها في الليل في تم جمع البكتيريا، وتجانسها في محلول عازل يحتوي على 50 ملليمول من TrisHCl و150 ملليمول من NaCl، ثم تم الطرد المركزي عند و لمدة 30 دقيقة. تم تحميل السائل العلوي على جهاز AKTA Purifier (GE، الولايات المتحدة) مع عمود His-Ni. تم قياس تركيز البروتين الذي تم الحصول عليه باستخدام مجموعة اختبار بروتين BSA.

تم تحديد المعلمات الحركية لـ AARS2 من خلال قياس لاكتيلation الركائز الببتيدية (PDHA1: MVNSNLASVEELKEIDVEVR؛ CPT2: EFLKKQKLS). و تم تقدير مستويات اللاكتات من خلال تغيير مستويات اللاكتات من بينما كانت الركائز الببتيدية ثابتة عند تم إجراء تفاعلات اللاكتيل في خليط التفاعل يحتوي على 50 ملليمول من HEPES عند pH 7.5 تم تحديد الببتيد المشتق من اللاكتيل باستخدام مطياف الكتلة (MS) مع تركيزات معروفة من الببتيدات الاصطناعية (PDHA1: MVNSNLASVEELK) بوجود 4 مللي مول من ATP و10 نانومول من AARS2. عيد الفطر; CPT2: EFLK ) كضوابط داخلية. و تم استنتاجها باستخدام معادلة ميكاليز-مينتن.

تم تحديد تفاعل البروتين مع الجزيئات الصغيرة باستخدام جهاز MicroCal PEAQ-ITC (مالفرن باناليتيكال، المملكة المتحدة) في اللاكتات، الألانين، و تم إذابة “-ألانين” في 50 مللي مول من تريس-هيدروكلوريد و150 مللي مول من كلوريد الصوديوم بتركيز تم تخفيف AARS2 المؤتلف إلى ، ثم أضيفت إلى خلية العينة. تم إسقاط الجزيئات في خلية العينة كل دقيقتين لمدة 20 مرة.

تم إجراء تفاعلات اللاكتيل في المختبر في “ خليط التفاعل يحتوي على 50 مللي مول من HEPES (رقم هيدروجيني 7.5) لاكتات، 4 مللي مول ATP، 10 نانومول AARS2، و الببتيد الركيزة الاصطناعية. تم ضبط الرقم الهيدروجيني النهائي لمزيج التفاعل على 7.5 قبل إضافة AARS2. تم السماح للتفاعل بالاستمرار لمدة 3 ساعات عند تم إزالة الأملاح من الببتيد باستخدام C18 ZipTip (Millipore، الولايات المتحدة الأمريكية)، وتم إخضاعه للتحليل باستخدام مطياف الكتلة MALDI-TOF/TOF (SCIEX-5800، AB Sciex، فريمينغهام، ماساتشوستس، الولايات المتحدة الأمريكية). تسلسلات الببتيدات الاصطناعية هي كما يلي:

ببتيد PDHA1 الاصطناعي: Ac-MVNSNLASVEELKEIDVEVR
ببتيد PDHA1 K336A الاصطناعي: Ac-MVNSNLASVEELAEIDVEVR
ببتيد CPT2 الاصطناعي: Ac-EFLKKQKLS
ببتيد CPT2 K457/8 A الاصطناعي: Ac-EFLAAQALS

تم إجراء تفاعلات إزالة اللاكتيل في المختبر في خليط التفاعل يحتوي على 50 مللي مول من HEPES (رقم هيدروجيني 7.5) دي تي تي ، الببتيد اللاكتيل الاصطناعي أو بروتين PDHA1 و CPT2 المؤتلف، SIRT3 و 1 مللي مول من PMSF. تم السماح للتفاعل بالاستمرار لمدة 4 ساعات في تم إزالة الأملاح من الببتيد عن طريق تمريره عبر C18 ZipTip قبل إخضاعه للتحليل باستخدام مطياف الكتلة MALDI-TOF/TOF (SCIEX-5800). تم إخضاع PDHA1 و CPT2 الناتجين لتحليل Western blot واختبار نشاط الإنزيم. تسلسلات الببتيدات الاصطناعية هي كما يلي:

الببتيد الاصطناعي PDHA1 K336: MVNSNLASVEELK عيدفير
ببتيد CPT2 K457/8 الاصطناعي: EFLK

تم تنقية بروتينات AARS2 أو CPT2 التي تم التعبير عنها بشكل مفرط في الخلايا باستخدام التنقية بال affinity وتم هضمها باستخدام إنزيم البروتيناز Glu-C. تم تنقية PDHA1 المفرط التعبير من خلايا C2C12 باستخدام التنقية بال affinity وتم هضمه باستخدام التربسين. تم تحليل الببتيدات الهيدروكسيلية أو اللاكتيلية عبر تسلسل MS/MS.

تمت معالجة قمم الكروماتوغرافيا السائلة التي تم فصلها في نفس الوقت مع تلك الخاصة بالببتيدات الاصطناعية القياسية بواسطة تحليل الطيف الكتلي باستخدام مطياف الكتلة Orbitrap Fusion (ThermoFisher Scientific، الولايات المتحدة الأمريكية). تم مقارنة عدد الببتيدات و/أو مناطق العينات بتلك الخاصة بالببتيدات الاصطناعية القياسية. تم ضبط جهاز الطيف الكتلي في وضع يعتمد على البيانات للتبديل تلقائيًا بين اكتساب MS و MS/MS. تم الحصول على طيف MS الكامل (m/z 350-1600) في جهاز Orbitrap بدقة كتلة تبلغ 60,000 عند تم تحديد هدف AGC عند 300,000 ، وكانت أقصى مدة حقن 50 مللي ثانية. تم إجراء اكتساب MS/MS في Orbitrap بدورة زمنية مدتها 3 ثوانٍ، بدقة 15,000. . كانت عتبة الكثافة 50,000، وكان الحد الأقصى لوقت الحقن 200 مللي ثانية. تم تعيين هدف AGC على 200,000، وكانت نافذة العزل تم تكسير الأيونات بحالات شحن 2+ و3+ و4+ بشكل متتابع عبر تفكك تصادمي عالي الطاقة مع طاقة تصادم موحدة. ، وتم تعيين الكتلة الثابتة الأولى على 120. في جميع الحالات، تم تسجيل مسح ميكروي واحد يستمر لمدة 30 ثانية باستخدام الاستبعاد الديناميكي. تم تحقيق تقدير الببتيد المستهدف المخلّق عبر قياس الكتلة. باختصار، تم حساب نسبة إشارة الببتيد المخلّق (إجمالي عدد الأيونات (TIC) للصيغة المخلّقة) إلى إجمالي إشارة الببتيد (TIC للصيغة المخلّقة + TIC للصيغة غير المخلّقة) وفقًا للمعادلة التالية: TICK-Lac/(TICK-Lac + TICnon-K-Lac) = نسبة K-Lac (RK-Lac). تسلسلات الببتيدات الاصطناعية هي كما يلي:

ببتيد AARS2 الاصطناعي: ILKAPPGFLGSLVPVVVE
ببتيد AARS2 P377OH الاصطناعي: ILKAPPGFLGSLVP VVVE
ببتيد PDHA1 الاصطناعي: MVNSNLASVEELKEIDVEVR
الببتيد الاصطناعي PDHA1 K336: MVNSNLASVEELK عيدفير
ببتيد CPT2 الاصطناعي: FLKKQKLSPD
الببتيد الاصطناعي CPT2 K457/8: FLK ك QKLSPD