الكلمات الرئيسية: زراعة خلايا ثلاثية الأبعاد (3D)، السقالات، الهيدروجيل، الأنسجة المنزوعة الخلايا، الميكروفلويديات، المصفوفة خارج الخلية (ECM)

السرطان هو مجموعة من الأمراض التي تتميز بالنمو غير المنضبط وانتشار الخلايا غير الطبيعية في الجسم. إنه واحد من الأسباب الرئيسية للوفاة في جميع أنحاء العالم، مع ملايين الحالات الجديدة والوفيات كل عام [1]. على الرغم من التقدم الكبير في أبحاث السرطان والعلاج على مر السنين، لا يزال المرض يمثل تحديًا كبيرًا للصحة العامة وعبئًا كبيرًا على المرضى والعائلات والمجتمع. تعتبر أبحاث السرطان ضرورية لتطوير علاجات جديدة وفعالة، وتحسين نتائج المرضى، وإيجاد علاجات لهذا المرض. مع استمرار تطور فهم بيولوجيا السرطان وعلم الوراثة، تتطور أيضًا الأساليب المستخدمة لتشخيص المرض وعلاجه والوقاية منه. ومع ذلك، لا يزال هناك الكثير لنتعلمه عن الآليات المعقدة التي تكمن وراء تطور السرطان وتقدمه والتحديات الفريدة التي تطرحها أنواع مختلفة من السرطانات [2]. بالإضافة إلى ذلك، هناك حاجة لتطوير علاجات أكثر تخصيصًا واستهدافًا يمكن أن تحسن نتائج المرضى وتقلل من الآثار الجانبية. لذلك، يجب أن تستمر أبحاث السرطان في الابتكار والتقدم لمواكبة الفهم المتطور للمرض. يشمل ذلك استكشاف علاجات جديدة
طرق العلاج، وتطوير أدوات تشخيصية أكثر تطورًا، وفهم الآليات الجينية والجزيئية المعنية في تطوره وتقدمه [3].

تعتبر زراعة الخلايا ثنائية الأبعاد (2D) تقنية شائعة الاستخدام لزراعة وصيانة الخلايا في المختبر. تستخدم أبحاث السرطان هذه التقنية على نطاق واسع لدراسة الخلايا في ظروف محكومة، حيث تنمو على سطح مستوٍ مزود بوسيط سائل غني بالمغذيات يوفر العناصر الغذائية اللازمة لنمو الخلايا وبقائها. يختلف وسط النمو المستخدم في زراعة الخلايا اعتمادًا على نوع السرطان المدروس والأهداف المرغوبة للدراسة. واحدة من الجوانب الأكثر أهمية في زراعة الخلايا لأبحاث السرطان هي الحفاظ على حيوية الخلايا ووظيفتها، حيث أن خلايا السرطان حساسة للغاية للتغيرات البيئية [4]. تحدٍ آخر يواجه زراعة الخلايا لأبحاث السرطان هو القدرة على نمذجة تعقيد الأورام البشرية بدقة. هذه الأورام عادة ما تكون متغايرة للغاية، وتتكون من أنواع خلايا مختلفة، بما في ذلك خلايا السرطان، وخلايا الستروما، وخلايا المناعة. من المفهوم أن زراعة الخلايا ثنائية الأبعاد لا تحاكي بدقة البيئة ثلاثية الأبعاد للأورام [5].

تختلف بنية وتنظيم الخلايا في بيئة ثلاثية الأبعاد عن تلك الموجودة في بيئة ثنائية الأبعاد، مما يمكن أن يؤثر على سلوك الخلايا واستجابتها للأدوية. إن إعادة إنشاء هذا التعقيد في بيئة المختبر أمر صعب، حيث يتطلب تطوير ظروف زراعة تعزز نمو وتفاعل أنواع خلايا متعددة في بيئة متعددة الأوجه [6]. لذلك، تم تطوير نماذج زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد لأنها تقدم منصات متطورة تعكس التعقيدات الهيكلية والوظيفية للأنسجة الحية، مما يوفر رؤى قيمة لأبحاث السرطان وتطوير الأدوية. يسلط هذا المقال الاستعراضي الضوء على المزايا الرئيسية لزراعات الخلايا ثلاثية الأبعاد، وتقنيات الزراعة الأكثر شيوعًا القائمة على السقالات، والأدبيات ذات الصلة حول التطبيقات في أبحاث السرطان، والتحديات المرتبطة بهذه التقنيات الزراعية. نظرًا لشمولية الموضوع، يركز هذا البحث على دراسة نماذج زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد القائمة على السقالات.

تعتبر الأورام هياكل معقدة تتكون من خلايا سرطانية، وخلايا غير سرطانية (مثل خلايا المناعة، والأرومات الليفية، والخلايا البطانية، إلخ)، ومكونات مختلفة من المصفوفة خارج الخلية (ECM). تلعب المصفوفة خارج الخلية دورًا حاسمًا وتساهم في سمات السرطان في تقدم الورم، والانتقال، والاستجابة للعلاج [7، 8]. يمكن أن تقوم المصفوفة خارج الخلية (1) بإفراز عوامل النمو والسيتوكينات التي تعزز تكاثر الخلايا وبقائها [9]، (2) تعديل تعبير الجينات المعنية في تنظيم دورة الخلية والموت الخلوي المبرمج [10]، (3) التحكم في تعبير التيلوميراز، وهو إنزيم يمدد التيلوميرات في الكروموسومات، (4) إفراز عوامل تكوين الأوعية الدموية التي تعزز تشكيل أوعية دموية جديدة، مما يوفر للورم العناصر الغذائية والأكسجين اللازمين لنموه [11]، (5) تعزيز الانتقال من الظهارة إلى الميسانشيم (EMT)، وهي عملية تكتسب فيها الخلايا الظهارية القدرة على الهجرة وغزو أنسجة أخرى [12]، و (6) تعديل الاستجابة المناعية من خلال التأثير على تجنيد ووظيفة خلايا المناعة في البيئة الدقيقة للورم [13]. اختبر روميرو لوبيز وزملاؤه [14] كيف أثر المصفوفة خارج الخلية المشتقة من الأنسجة الطبيعية والورمية على الأوعية الدموية ونمو الورم باستخدام المصفوفة خارج الخلية المعاد تكوينها. تم إخضاع نسيج الورم المستخرج من نقائل الكبد لأورام القولون لتلوين الهيماتوكسيليين والإيوزين (H&E) لتأكيد إزالة الخلايا بنجاح من كل من أنسجة القولون والورم. بعد ذلك، لوحظت تركيبات بروتينية وصلابة مميزة بين المصفوفات المعاد تكوينها، مما أدى إلى اختلافات ملحوظة في تشكيل الشبكة الوعائية ونمو الورم في كل من المختبر وفي الجسم. تم استخدام مجهر التصوير بالفلوريسين لقياس نسب NADH الحرة/المربوطة في خلايا الورم والخلايا البطانية للإشارة إلى
الحالة الأيضية الخلوية. من الجدير بالذكر أن الخلايا المزروعة في المصفوفة خارج الخلية للورم أظهرت مستويات مرتفعة من NADH الحرة، مما يشير إلى زيادة في معدل التحلل الجليكولي مقارنة بتلك المزروعة في المصفوفة خارج الخلية الطبيعية. تؤكد هذه النتائج التأثير الكبير للمصفوفة خارج الخلية على نمو خلايا السرطان والأوعية الدموية المصاحبة (مثل زيادة طول الأوعية، وزيادة تغايرية الأوعية). يمكن أن تُعزى التغيرات في تركيبة المصفوفة خارج الخلية للورم، مثل زيادة ترسيب وتداخل ألياف الكولاجين، إلى التواصل بين خلايا الورم وخلايا الستروما المرتبطة بالورم.

كل نوع من الأنسجة له تركيبة مميزة من المصفوفة خارج الخلوية (ECM) والتوبولوجيا والتنظيم [15]. تلعب هذه العوامل دورًا كبيرًا في التحكم في وظيفة الخلايا وسلوكها وتفاعلاتها مع البيئة الدقيقة، حيث تولد تدرجات مكانية من المواد الكيميائية والتمثيل الغذائي التي قد تستحث بدورها استجابات مميزة تعتمد على الخلايا (مثل التمايز، والهجرة) [16]. قام لانغهانز [17] بتحليل المكونات الكيميائية للمصفوفة خارج الخلوية وأفاد بأنها تحتوي على الماء والكربوهيدرات والبروتينات، مثل بروتينات المصفوفة الليفية، والجليكوبروتينات، والبروتيوغليكانات، والجليكوزامينوجليكانات، وعوامل النمو، ومثبطات البروتياز، والإنزيمات البروتوليتية. وبالتالي، يمكن أن يؤثر تنظيم المصفوفة خارج الخلوية على الأنماط الجينية والظاهرة للخلايا، حيث يمكن استكشاف هذه التأثيرات من خلال زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد [16، 18]. على سبيل المثال، أثرت التغيرات في التعبير الجيني ونشاط بروتينات مستقبلات عامل النمو الظهاري (EFGR) وبروتين كيناز B الفسفوري (phospho-AKT) وبروتينات كيناز MAPK المنشطة بالميتوجين (phospho-MAPK) في خطوط خلايا سرطان القولون (مثل HT-29، CACO-2، DLD-1) على النمط الجيني والظاهرة للخلايا في الثقافات ثلاثية الأبعاد، مقارنةً بالطبقات أحادية البعد [19، 20]. علاوة على ذلك، يمكن أن تؤثر المصفوفة خارج الخلوية على شكل الخلايا وتعبير مستقبلات الكيموكين. أظهر كيس وآخرون [21] أن خلايا سرطان البروستاتا المزروعة ثلاثية الأبعاد (مثل LNCaP، PC3) أظهرت مستوى عالٍ من التفاعل بين الخلايا والمصفوفة خارج الخلوية، مما أدى إلى زيادة التعبير المفرط لمستقبلات الكيموكين CXCR7 وCXCR4. بينما كانت زراعة الخلايا ثنائية الأبعاد هي الأساس في أبحاث السرطان في المختبر، أصبح من الواضح بشكل متزايد أن هذا النهج غير كافٍ في تكرار الظروف الحية التي تواجهها الخلايا في جسم الإنسان. نتيجة لذلك، بدأ الباحثون في الاتجاه نحو زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد كنموذج أكثر ملاءمة من الناحية الفسيولوجية لدراسة العمليات الخلوية والأمراض. ميزة رئيسية للنماذج ثلاثية الأبعاد في أبحاث السرطان هي أنها يمكن أن تحاكي بشكل أفضل البيئة الدقيقة المعقدة للأورام، بما في ذلك شكل الأورام وتضاريسها، وزيادة بروتينات الترويج لتكوين الأوعية، وتشتت العوامل البيولوجية والكيميائية، وتفاعلات الخلية-الخلية والخلية-المصفوفة، وتدرجات الأكسجين والمواد الغذائية، وتركيبة المصفوفة خارج الخلوية الأكثر واقعية [6، 22، 23]. نخر، نقص الأكسجين، خمول، موت خلوي، وتكاثر

غالبًا ما توجد الخلايا في تجمعات خلوية كروية في مراحل مختلفة من التطور [24]. نظرًا لأن الطبقة الخارجية من الكتلة الكروية تتعرض بشكل أكبر للوسط المدعوم بالمغذيات، فإنها تحتوي على عدد أكبر من الخلايا المتكاثرة. الخلايا في قلب الكتلة الكروية تعاني من نقص الأكسجين وغالبًا ما تكون ساكنة لأنها تتلقى كميات أقل من الأكسجين وعوامل النمو والمغذيات من الوسط. وهذا يؤدي إلى تدرجات أكثر ملاءمة من الناحية الفسيولوجية في تكوين الأنسجة يمكن أن تُفيد بشكل أفضل في اكتشاف الأدوية وتطويرها [24]. علاوة على ذلك، فإن زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد تصوّر بدقة استجابة الخلايا للأدوية والعوامل العلاجية الأخرى. تؤثر الخصائص المكانية والفيزيائية لمثل هذا النموذج على نقل الإشارات بين الخلايا، مما يغير التعبير الجيني وسلوك الخلايا [25]. أظهر لويسنر وآخرون [26] طريقة زراعة ثلاثية الأبعاد مرنة حيث وفرت مصفوفة هيدروجيل صناعية ذات خصائص حيوية حيوية نظامًا لدراسة ديناميات الخلايا والمصفوفة المتعلقة بتكون الأورام. كانت الخلايا المزروعة ثلاثية الأبعاد تعبر عن mRNA لمستقبلات على سطحها (مثل، بروتياز، مقارنةً بالخلايا المزروعة في 2D. علاوة على ذلك، كانت تقدم وتكاثر الكتل الكروية يعتمد على قدرة الخلايا على تحويل ECM وتفاعلات الخلايا مع الإنتغرين بشكل بروتيني. ونتيجة لذلك، أظهرت الكتل الكروية ثلاثية الأبعاد معدلات بقاء أعلى مقارنةً بالطبقات الأحادية ثنائية الأبعاد بعد التعرض للعامل الكيميائي باكليتاكسيل، مما يشير إلى أنها تحفز بشكل أفضل حساسية العلاج الكيميائي والأحداث المرضية الفسيولوجية في الجسم. الجدول 1 أدناه يلخص الدراسات التي استخدمت نماذج ثلاثية الأبعاد مختلفة للتحقيق في أنواع مختلفة من السرطانات.
تُلخص الشكل 1 الخصائص الرئيسية لزراعة الخلايا ثنائية وثلاثية الأبعاد. إن الانتقال إلى زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد هو تقدم كبير في البحث المختبري، حيث يوفر نموذجًا أكثر ملاءمة من الناحية الفسيولوجية لدراسة الخلايا.
العمليات والأمراض. بينما لا تزال بعض التحديات بحاجة إلى معالجة، فإن مزايا الثقافة ثلاثية الأبعاد تفوق قيود الثقافة ثنائية الأبعاد. مع استمرار تطور التكنولوجيا، من المحتمل أن تصبح الثقافة ثلاثية الأبعاد أداة حاسمة بشكل متزايد في أبحاث السرطان وحقول العلوم الطبية الحيوية الأخرى.

يوفر الجدول 2 أدناه نظرة شاملة على أنظمة النمذجة ثنائية وثلاثية الأبعاد وغيرها المستخدمة في أبحاث السرطان. بالإضافة إلى زراعة الخلايا ثنائية وثلاثية الأبعاد، تقدم الأنسجة والأعضاء تعقيدات هيكلية ووظيفية، مما يعكس استجابات محددة للأعضاء ولكنه يطرح تحديات في الصيانة والوصول. علاوة على ذلك، تحاكي الحيوانات النموذجية الاستجابات النظامية في الجسم، ومع ذلك، فإن المخاوف الأخلاقية، والتكاليف العالية، واختلافات الأنواع تحد من فائدتها. بينما تعتبر العينات المأخوذة من المرضى ذات صلة سريرية، فإنها تقدم تحديات في التحكم التجريبي وتنوع العينات. من الجدير بالذكر تسليط الضوء على الفرق بين الكريات العضوية والكريات الكروية حيث إن كلاهما مصطلحات شائعة الاستخدام في نطاق زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد. الكريات العضوية والكريات الكروية هما نماذج زراعة خلايا ثلاثية الأبعاد مختلفة يمكن زراعتها بتقنيات مختلفة. الكريات العضوية، التي تتميز بهياكل معقدة تحاكي الأعضاء أو الأنسجة الحقيقية، تتكون من أنواع خلايا متعددة تتنظم ذاتيًا لتعكس بنية تشبه الأنسجة، وتشتق من خلايا جذعية أو سلفيات محددة للأنسجة. نظرًا لأهميتها البيولوجية العالية، فإنها تجد تطبيقات في نمذجة الأمراض، واختبار الأدوية، وفهم تطور الأعضاء. بالإضافة إلى الكريات العضوية، فإن الكريات الورمية (أي الكريات العضوية الشبيهة بالورم)، المشتقة من أنسجة سرطان المرضى التي تحتوي على خلايا الورم والخلايا الداعمة من البيئة المجاورة للورم، أصبحت منصات زراعة ثلاثية الأبعاد متقدمة لتقييم الأدوية وتطويرها بشكل مخصص. في المقابل، فإن الكريات الكروية هي نماذج خلوية كروية أبسط.

تفتقر التجمعات إلى الهياكل العضوية المميزة للأورغانويد. تتكون من نوع واحد أو عدة أنواع من الخلايا، وتستخدم الكريات لدراسة السلوكيات الخلوية الأساسية واستجابات الأدوية في بيئة ثلاثية الأبعاد. بينما يساهم كلاهما في دراسات زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد، فإن الأورغانويد تشبه الأعضاء الحقيقية بشكل أكبر مقارنة بالتجمعات الخلوية الأبسط التي تمثلها الكريات. تعتبر نماذج المرضى أدوات قيمة تهدف إلى تكرار تعقيدات الأورام البشرية، مما يوفر رؤى حول آليات المرض، واستجابات العلاج، واستراتيجيات العلاج الشخصية. يمكن استخدامها في زراعة الأنسجة المستمدة من المرضى (PDX)، والأورغانويد، وزراعات ثلاثية الأبعاد، وخطوط الخلايا المستمدة من المرضى، والخزعات السائلة، والتجارب السريرية.

في زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد، تحقيق توازن مثالي بين التجانس والاختلاف مرتبط بشكل معقد بمصدر الخلايا، مع الأخذ في الاعتبار الخلايا الجذعية، والخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs)، أو الخلايا الأولية المختلطة المشتقة من الأنسجة. تشمل الخلايا الجذعية في زراعة الخلايا في المختبر الخلايا الجذعية الجنينية (ESCs)، والخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs)، والخلايا الجذعية البالغة أو الجسدية. تتمتع الخلايا الجذعية الجنينية بقدرة عالية على التعددية، قادرة على التمايز إلى أي نوع من الخلايا، لكن استخدامها يثير مخاوف أخلاقية بسبب أصلها من الأجنة. يتم إنتاج الخلايا الجذعية المستحثة من الخلايا الجسدية (مثل خلايا الجلد أو الدم) من خلال إعادة البرمجة، مما يعيدها إلى حالة متعددة القدرات تشبه الجنين، لكنها تواجه تحديات في كفاءة إعادة البرمجة وإمكانية التسبب في الأورام. هذه التحويلة تخلق مجموعة واسعة ومتنوعة.
خزان من خلايا الإنسان، قادر على التطور إلى أي نوع من الخلايا المطلوبة للتطبيقات العلاجية. خلايا الجذع المستحثة متعددة القدرات (HiPSCs) ذات صلة خاصة في أبحاث السرطان (الجدول 3) [47]. وبالتالي، فإن عملية إعادة البرمجة التي روج لها شينيا ياماناكا قد فتحت آفاقًا جديدة لتقدم علم السرطان، واكتشاف الأدوية، والطب التجديدي في علاج السرطان. أخيرًا، خلايا الجذع البالغة أو الجسدية هي خلايا محددة الأنسجة، تعكس خصائص أصلها، وتثير مخاوف أخلاقية أقل لأنها مشتقة من أنسجة بالغة. ومع ذلك، فإن لديها قدرة محدودة على التمايز وعمرًا محدودًا في الثقافة. يؤثر اختيار مصدر الخلايا بشكل كبير على التركيب والسلوك في الثقافة ثلاثية الأبعاد. خلايا الجذع و iPSCs، المعروفة بتعدد قدراتها، تقدم تباينًا متأصلًا بسبب قدرتها على التمايز إلى أنواع مختلفة من الخلايا [45، 46].

علاوة على ذلك، تمتلك الخلايا الأولية، المستمدة مباشرة من الكائنات الحية، خصائص فريدة تجعلها لا تقدر بثمن للدراسات في المختبر. مع الحفاظ على الصلة البيولوجية، تحاكي هذه الخلايا عن كثب الأنسجة أو الأعضاء التي تم عزلها منها، مما يعكس تعقيدات الظروف داخل الجسم. مع وجود تباين خاص بالمتبرع، تتيح الخلايا الأولية للباحثين استكشاف تأثير التنوع الجيني على سلوك الخلايا، وقابلية الإصابة بالأمراض، واستجابات الأدوية. مع الاحتفاظ بالوظائف الخاصة بالأنسجة، تعتبر الخلايا الأولية المتمايزة ضرورية لدراسة العمليات الفسيولوجية المحددة والأمراض المرتبطة بأنسجة معينة. ومع ذلك، تواجه هذه الخلايا تحديات، بما في ذلك عمر محدود وحساسية.

لظروف الثقافة. تسهم القدرة التكرارية المحدودة والحساسية في التباين الملحوظ في ثقافات الخلايا ثلاثية الأبعاد، مما يبرز أهمية النظر بعناية في ظروف الثقافة والتباينات الخاصة بالمتبرعين لتمثيل السيناريوهات الحية بدقة. على الرغم من هذه التحديات، فإن الخلايا الأولية ضرورية في تعزيز فهمنا لبيولوجيا الخلايا وآليات الأمراض وتطوير العلاجات. وبالمثل، يمكن أن تسهم استخدام خلايا أولية مختلطة مستمدة من الأنسجة في تكوين تركيبة خلوية أكثر تباينًا، تشبه التعقيد الموجود في الأنسجة الأصلية. إن تحقيق التوازن الصحيح أمر حاسم، حيث أن درجة مفرطة من التباين قد
إن الاستجابات المحددة الغامضة، في حين أن التماثل المفرط قد يبسط بشكل مفرط تمثيل بيئة الأنسجة الدقيقة. لذلك، فإن فهمًا دقيقًا لمصدر الخلايا أمر ضروري لتكييف نماذج زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد لتعكس بدقة تعقيدات الأنسجة والأعضاء الفعلية.

كما تم الشرح أعلاه، فإن تطوير تقنيات زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد التي تحاكي بيئة الورم بشكل أكثر دقة هو مجال رئيسي في أبحاث السرطان [6، 59]. توجد طرق مختلفة لزراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد ويمكن أن تكون بشكل عام

تنقسم إلى طرق قائمة على الدعائم وطرق خالية من الدعائم. تشير زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد الخالية من الدعائم إلى تقنية زراعة خلايا حيث يتم زراعة الخلايا وتجميعها في هياكل ثلاثية الأبعاد دون استخدام مواد دعائم خارجية. بدلاً من أن تكون مدفونة داخل مصفوفة داعمة، تتجمع الخلايا ذاتيًا وتتفاعل مع الخلايا المجاورة لتشكيل هياكل تشبه الأنسجة ثلاثية الأبعاد. تسمح هذه الثقافات بتفاعلات خلوية أكثر دقة، وتنظيم مكاني، واستجابات فسيولوجية، مما يجعلها أدوات قيمة لمجموعة متنوعة من التطبيقات، بما في ذلك اختبار الأدوية. كما أن لديها عادةً كثافات خلوية أعلى من النماذج القائمة على الدعائم، مما يمكن أن يؤثر على سلوك الخلايا، وتعبير الجينات، ووظائف الخلايا. أخيرًا، توفر النماذج الخالية من الدعائم مرونة وقابلية للتخصيص من حيث أنواع الخلايا، وظروف الزراعة، وتصاميم التجارب. ومع ذلك، من الضروري مراعاة أن الأساليب الخالية من الدعائم قد تواجه قيودًا في توفير الدعم الميكانيكي، والتحكم في الشكل، وقابلية التكرار مقارنة بأساليب زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد القائمة على الدعائم [60]. وبالتالي، غالبًا ما يختار الباحثون الطريقة المناسبة لزراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد بناءً على أهداف بحثهم المحددة والنظام النسيجي أو العضوي الذي يهدفون إلى نمذجته أو هندسته. نظرًا لشمولية الموضوع، فإن نطاقات الورقة محدودة
إلى فحص النماذج القائمة على الدعائم لزراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد. تعتبر الدعائم مكونات أساسية في أنظمة زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد، حيث توفر بيئة ثلاثية الأبعاد لنمو الخلايا وتفاعلها مع بعضها البعض ومع محيطها [61، 62]. يمكن تصنيف المواد الحيوية المستخدمة في مثل هذه النماذج إلى المجموعات الرئيسية التالية: دعائم بوليمرية، هيدروجيل، دعائم أنسجة غير خلوية، ودعائم هجينة (مثل دمج أجهزة ميكروفلويديك). تلخص الجداول 4 و 5 مزايا وقيود تقنيات زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد الخالية من الدعائم والقائمة على الدعائم على التوالي.

تحدث ثورة في زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد من خلال توفير بيئة حيوية تحاكي ECM الطبيعي، مما يعزز تكاثر الخلايا وتمايزها، غالبًا بكفاءة ودقة ملحوظة. تقدم هذه الدعائم منصة متعددة الاستخدامات لدراسة سلوكيات الخلايا المعقدة وتحمل وعدًا هائلًا في تطبيقات أبحاث السرطان. يمكن تصنيفها عمومًا على أنها طبيعية أو مصنعة (انظر الشكل 2). تصنع الدعائم البوليمرية الطبيعية من بوليمرات تحدث بشكل طبيعي. يمكن معالجتها إلى أشكال مختلفة، بما في ذلك الألياف، والأفلام،

أو الهياكل المسامية. يمكن تصنيفها بشكل أكبر إلى فئتين رئيسيتين: الهياكل القائمة على البروتين والهياكل القائمة على البوليسكاريد. الهياكل القائمة على البروتين مشتقة من جزيئات كبيرة تتكون من الأحماض الأمينية (مثل الكولاجين، الحرير، الجيلاتين، الفيبرو نكتين [93، 94]). نظرًا لخصائصها النشطة حيويًا، توفر هذه الهياكل مواقع لالتصاق الخلايا ويمكن أن تنظم سلوك الخلايا وتطور الأنسجة. تم تطوير منصة زراعة خلايا ثلاثية الأبعاد باستخدام هياكل الكولاجين للتحقيق في قدرة الخلايا الجذعية السرطانية (CSCs) على تكوين الأورام في سرطان الثدي [95]. كشفت الدراسة أن نظام زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد أظهر زيادة في التعبير عن عوامل النمو المحفزة لتكوين الأوعية الدموية، مما يشير إلى دور محتمل في تعزيز تشكيل الأوعية الدموية. علاوة على ذلك، لوحظ التعبير المفرط عن علامات CSC مثل OCT4A و SOX2، بالإضافة إلى علامات خلايا سرطان الثدي الجذعية بما في ذلك SOX4 و JAG1، في الهياكل ثلاثية الأبعاد، مما يشير إلى أن النموذج ثلاثي الأبعاد نجح في تكرار الخصائص الجزيئية المرتبطة بـ CSCs. من حيث السلوك، كان النموذج ثلاثي الأبعاد أكثر تشابهًا مع خصائص CSCs مقارنةً بنموذج in vivo، مما يدل على فعاليته في التقاط الخصائص المسببة للأورام لـ CSCs. لذلك، قدمت منصة زراعة خلايا ثلاثية الأبعاد القائمة على هياكل الكولاجين أداة قيمة لدراسة قدرة CSC على تكوين الأورام في سرطان الثدي، مما يظهر زيادة في تنظيم عوامل النمو المحفزة لتكوين الأوعية الدموية، والتعبير المفرط عن علامات CSC وعلامات خلايا سرطان الثدي الجذعية، وتشابه وثيق مع سلوك CSC عند مقارنته بنموذج in vivo. دراسة أخرى أجراها مكغراث وآخرون [96] استخدمت مصفوفة كولاجين ثلاثية الأبعاد (GELFOAM لإنشاء نموذج لجيب عظمي داخلي (EN) يُشار إليه باسم 3D-EN، لدراسة سكون وسلوكيات خمول خلايا سرطان الثدي. ساعد نموذج 3D-EN بشكل فعال في تحديد العديد من الجينات المرتبطة بعمليات إعادة تنشيط الخمول، حيث أظهرت خلايا MDA-MB-231 فقط من بين خطوط الخلايا المختبرة سلوك الخمول، مما يشير إلى أن لديها ميلاً لدخول حالة خمول في الظروف الفسيولوجية المحاكية.
من ناحية أخرى، تتكون الدعائم المعتمدة على البوليسكاريد من سلاسل طويلة من جزيئات السكر (مثل الكيتوزان وحمض الهيالورونيك). إنها متوافقة حيوياً وقابلة للتحلل البيولوجي، وغالباً ما يمكن تعديلها لضبط خصائصها الفيزيائية والبيولوجية. طور آريا وآخرون [97] نموذج زراعة خلايا ثلاثي الأبعاد باستخدام دعامة من الكيتوزان، وهو بوليمر طبيعي مشتق من الكيتين، لدراسة سلوك سرطان الثدي. تم ربط الدعامة مع الجينيبين، وهو رابط طبيعي، لتعزيز استقرارها. وجدت الدراسة أن دعامة الكيتوزان-جيلاتين (GC) وفرت بيئة مناسبة لنمو خلايا سرطان الثدي MCF-7، حيث أظهرت الخلايا التصاقاً جيداً وتكاثراً. كما دعمت الدعامة تشكيل تجمعات خلوية، والتي تمثل ظروف الورم في الجسم الحي بشكل أفضل مقارنة بالزراعات ثنائية الأبعاد. الدراسة
خلصت الدراسة إلى أن الهيكل الداعم من الكيتوزان/الجيلاتين يمكن أن يكون مفيدًا لدراسة سرطان الثدي في المختبر، حيث يوفر نموذجًا أكثر ملاءمة من الناحية الفسيولوجية مقارنة بالثقافات التقليدية ثنائية الأبعاد. لقد أظهرت هياكل GC أنها تدعم تشكيل الأورام الصغيرة التي تحاكي الأورام التي تنمو في الجسم، مما يجعلها نموذجًا محسنًا للأورام في المختبر. تم استخدام هذه الهياكل بنجاح لدراسة سرطان الرئة، بالإضافة إلى أنواع أخرى من السرطان، مثل سرطان الثدي، وسرطان عنق الرحم، وسرطان العظام. لقد أظهرت هذه الهياكل ملفات تعبير جيني مشابهة لتلك الموجودة في الأورام التي تنمو في الجسم، مما يشير إلى إمكانياتها لدراسة تقدم السرطان واختبار الأدوية للأورام الصلبة. كما أظهرت هياكل GC أنها تحسن من القدرة التنبؤية للدراسات قبل السريرية وتعزز من الترجمة السريرية للعلاجات. بشكل عام، توفر هياكل GC أداة قيمة لدراسة تطور الأورام وتقييم فعالية الأدوية المضادة للسرطان في بيئة المختبر.

يمكن تصميم الهياكل الداعمة الاصطناعية (مثل حمض البولي لاكتيك (PLA) وحمض البولي جليكوليك (PGA) وحمض البولي كابرو لاكتون (PCL)) لتكون لها خصائص ميكانيكية وكيميائية حيوية محددة. ومع ذلك، قد تكون أقل توافقًا حيويًا من البوليمرات الطبيعية وقد تتطلب تعديلات على السطح لتعزيز ارتباط الخلايا ونموها [60]. اختبر بالوميراس وآخرون [101] كفاءة هياكل PCL المطبوعة بتقنية ثلاثية الأبعاد لزراعة خلايا سرطان الثدي MCF7. وجد الباحثون أن تصميم الهيكل، وبشكل خاص زاوية الإيداع، أثرت بشكل كبير على ارتباط الخلايا ونموها. كانت الهياكل ذات زاوية إيداع أظهرت أعلى عدد من الخلايا بعد العلاج بالتربسين. علاوة على ذلك، وجدت الدراسة أن الثقافة ثلاثية الأبعاد في هياكل PCL زادت من عدد خلايا الساق السرطانية (CSC) مقارنةً بالتحكم في الثقافة ثنائية الأبعاد، مما زاد من مؤشر تشكيل الماموسفير (MFI) لديهم. خلصت الدراسة إلى أن ثقافة هياكل PCL ثلاثية الأبعاد يمكن أن تحفز خلايا MCF7 على توليد مجموعة خلوية بخصائص CSC. وهذا يشير إلى إمكانياتها لدراسة خصائص CSC وفحص عوامل علاجية جديدة تستهدف مجموعات CSC. تبرز هذه الجهود إمكانيات هياكل البوليمر الطبيعية في إنشاء نماذج ثقافة خلوية ثلاثية الأبعاد أكثر ملاءمة من الناحية الفسيولوجية لأبحاث السرطان. يمكن أن تعزز استخدام هذه الهياكل من فهم سلوك خلايا السرطان وقد تؤدي إلى اكتشاف استراتيجيات علاجية أكثر فعالية. بالمثل، استخدم ريجال وآخرون هياكل بوليمر صناعية معدلة تعتمد على الرغوة الغازية من حمض (PLGA) وPCL لإجراء ثقافات أنسجة ثلاثية الأبعاد ونماذج حيوانية في أبحاث سرطان الثدي. قامت مجموعة البحث بالتحقيق في استجابة خلايا MDA-MB-231 للأدوية المضادة للسرطان، وفعاليتها، وشكلها، وتكاثرها، وتعبيرها عن المستقبلات، وقدرتها على تطوير أورام حية باستخدام الهياكل ثلاثية الأبعاد. تم زراعة خلايا MDA-MB-231 على شرائح زجاجية مجهرية ثنائية الأبعاد مغطاة بـ PLGA وفي هياكل PLGA مسامية ثلاثية الأبعاد لفحص السرطان.

بقاء الخلايا على الركائز البوليمرية. كان عدد الخلايا الميتة المكتشفة على شرائح الزجاج المغلفة بـ PLGA وهياكل PLGA ثلاثية الأبعاد ضئيلاً في اليوم الأول. ومع ذلك، لوحظ زيادة كبيرة في عدد الخلايا الميتة على شرائح الزجاج المغلفة بـ PLGA مقارنةً بالهياكل ثلاثية الأبعاد في اليوم الرابع عشر. بالإضافة إلى ذلك، تم التحقيق في تعبير بروتينات ECM ومستقبلات سطح الخلايا على البوليمرات الاصطناعية، حيث كانت هناك إشارات تلوين قوية للكولاجين من النوع الأول والإنتغرين. تم اكتشافها في كلا نوعي الخلايا باستخدام مجهر المناعة الفلورية (IF). ومن الجدير بالذكر أن الإنتغرين الذي يعمل كمستقبل رئيسي للكولاجين من النوع الأول، أظهر مستوى تعبير أساسي في النموذج ثلاثي الأبعاد. قد يعزز نمط التعبير هذا هجرة خلايا سرطان الثدي ونمو الورم، حيث تميل المستويات العالية من مستقبل الإنتغرين إلى تثبيط هجرة خلايا السرطان. ومن الجدير بالذكر أن الإنتغرين أظهرت المستقبلات تواجدًا بارزًا مع الكولاجين من النوع الأول، لا سيما حول حواف الخلايا، مما يشير إلى ترسيب محلي للكولاجين من النوع الأول والارتباط اللاحق بالإنتجرين. المستقبلات، تسهل ارتباط الخلايا وهجرتها. أخيرًا، لتقييم قدرات تشكيل الورم للهياكل المسامية البوليمرية في الفئران، تم تغليف خلايا MDA-MB-231 على هياكل PLGA المسامية وزرعها في وسادات الدهون الثديية لفئران NOD/SCID. كانت الهياكل الفارغة بدون خلايا بمثابة التحكم السلبي. كما هو متوقع، كان علامة البروتين النووي للخلايا المتكاثرة لم يتم الكشف عنه في العينة الفارغة
زراعة الدعامات. في الوقت نفسه، كانت تعبيره مرتفعًا بشكل ملحوظ داخل الأورام المستمدة من دعامات PLGA المحملة بخلايا MDA-MB-231. تشير هذه النتيجة إلى أن مجموعة خلايا السرطان داخل الدعامات أظهرت تكاثرًا سريعًا عند تضمينها في الأنسجة الثديية الأصلية.

الهيدروجيلات هي شبكات ثلاثية الأبعاد من البوليمرات المحبة للماء (يمكن أن تكون طبيعية أو صناعية أو هجينة)، التي يمكنها امتصاص كميات كبيرة من الماء أو السوائل البيولوجية مع الحفاظ على سلامتها الهيكلية [102]. توضح الشكل 3 تقنيات شائعة لزراعة الخلايا باستخدام هياكل الهيدروجيل. في تقنية القبة (انظر الشكل 3A)، يتم خلط الخلايا مع الهيدروجيلات الحساسة للحرارة ثم تُزرع كقطرات داخل وعاء زراعة الخلايا. تعتمد هذه التقنية على التحكم الدقيق في درجة الحرارة للسماح للهيدروجيل بالبوليمرة وتشكيل هيكل قبة. بمجرد أن يتم بوليمرة الهيدروجيل وتثبيت قطرة الخلايا والهيدروجيل، يتم تغطيته برفق بوسائط زراعة الخلايا. وهذا يسمح بزراعة خلايا ثلاثية الأبعاد محلية في وعاء أكبر ويمكن أن ينشئ مجموعات خلايا فردية أو كريات في طبق واحد. ومع ذلك، فإن الحفاظ على سلامة القبة يمكن أن يكون تحديًا مع مرور الوقت وقد يتأثر بتغيرات درجة الحرارة أو الاضطرابات الفيزيائية. أيضًا، قد لا تكون مناسبة للزراعة طويلة الأمد أو للخلايا التي تتطلب دعمًا هيكليًا معقدًا بسبب النسبي.
هيكل ثلاثي الأبعاد بسيط ومعزول. توضح الشكل 3B تقنية الآبار المضافة، التي تتكون من إضافات مسامية لحمل خليط الخلايا والهيدروجيل بينما يتم إضافة وسط زراعة الخلايا إلى البئر المحيط بالإضافة. تخلق هذه الفجوة بيئة تفاضلية، مما يسمح بتبادل المغذيات مع الحفاظ على ثقافة ثلاثية الأبعاد متميزة داخل الإضافة. ستتشكل كريات غير متجانسة في النهاية في قاع الإضافة بسبب الجاذبية وتفاعلات الخلايا. يمكن استخدام مثل هذا النموذج لدراسة غزو الخلايا أو هجراتها عن طريق وضع خليط الخلايا والهيدروجيل على جانب واحد من غشاء قابل للاختراق والمواد الكيميائية الجاذبة على الجانب الآخر. تتضمن طريقة دعم قاع الهلام (انظر الشكل 3C) إنشاء طبقة سميكة من الهيدروجيل في قاع بئر الزراعة، يتم وضع تعليق الخلايا فوقها. على سبيل المثال، يمكن استخدام هذه الطريقة لتضمين الخلايا داخل هياكل هيدروجيل ذات مسام كبيرة، مثل AlgiMatrix. (ثيرمو فيشر ساينتيفيك / لايف تكنولوجيز، كارلسباد، الولايات المتحدة الأمريكية) – هيكل جيل أيوني مجفف ومجفف يتم توفيره بشكل مريح في شكل أقراص معقمة محملة مسبقًا في أطباق ثقافة الخلايا القياسية [103، 104]. لبدء ثقافة الخلايا، يتم زرع تعليق خلايا مركّز في وسط الثقافة على سطح الهيدروجيل، حيث يتم امتصاصه لاحقًا، مما يؤدي إلى احتجاز الخلايا داخل الهيكل المسامي للهيدروجيل. أخيرًا، في تقنية التضمين (انظر الشكل 3D)، يتم خلط الخلايا مع هيدروجيل ووضعها مباشرة في قاع وعاء الثقافة، تليها طبقة من وسط الثقافة، مما يسمح للخلايا بالنمو داخل مصفوفة الهيدروجيل، وبالتالي تحاكي بدقة أكبر البيئة ثلاثية الأبعاد في الجسم. هذه التقنية مفيدة لدراسة تفاعلات الخلايا مع بعضها البعض ومع المصفوفة، والغزو، والهجرة، واستجابات الأدوية. ومع ذلك، قد يكون من الصعب تقنيًا تضمين الخلايا بشكل متساوٍ في جميع أنحاء الهيدروجيل؛ يمكن أن يكون استرداد الخلايا من المصفوفة للتحليل اللاحق تحديًا. قد تحتاج نفاذية الهيدروجيل إلى المغذيات والغازات والنفايات إلى تحسين دقيق لتجنب خلق بيئة نقص الأكسجين أو حرمان المغذيات للخلايا الموجودة في داخل الجل. يجب اختيار كل من هذه الطرق بناءً على احتياجات التجربة المحددة ونوع الخلايا التي يتم زراعتها. بالإضافة إلى ذلك، يجب ضبط تركيبة الهيدروجيل وخصائصه الميكانيكية وفقًا لخصائص ECM الأصلية لنوع الخلايا المعني.
نظرًا لخصائصها القابلة للتعديل، تقدم الهيدروجيل الاصطناعية فوائد ملحوظة في ثقافة الخلايا ثلاثية الأبعاد. ببتيد RADA16-I هو ببتيد يتجمع ذاتيًا مستمد من جزء من زيوت، وهو بروتين يرتبط بـ Z-DNA بيد اليسار تم اكتشافه في الأصل في الخميرة. لقد ظهر هذا الببتيد كمادة نانوية جديدة بسبب قدرته على تشكيل هياكل نانوية. وبالتالي، توفر هذه الهياكل إطارًا داعمًا يعزز نمو الخلايا ويعزز بيئة ثلاثية الأبعاد ملائمة لثقافة الخلايا.
يمكن تعديل تسلسل الببتيد لدمج مجموعات وظيفية محددة، مما يتيح ضبط الخصائص الميكانيكية والكيميائية والبيولوجية للهيكل الناتج. هذه المرونة الرائعة تمكن من التخصيص لتتناسب بدقة مع المتطلبات الفريدة للخلايا المزروعة أو الأهداف التجريبية المقصودة. هذه الهياكل، التي يبلغ قطرها حوالي 10 نانومتر، مدفوعة بمتبقيات مشحونة إيجابيًا وسلبيًا من خلال تفاعلات أيونية مكملة. عند إذابتها في الماء، يشكل ببتيد RADA16-I هيدروجيل مستقر (شبكات ألياف نانوية بحجم مسام حوالي ) بمحتوى مائي مرتفع للغاية عند تركيزات من ، مما يحاكي عن كثب المسامية والهيكل الإجمالي لـ ECMs، مما يجعلها مناسبة لتصنيع أماكن خلوية صناعية لتطبيقات في بيولوجيا الأورام. أعد يانغ وزهاو [105] هيدروجيل ببتيد RADA16-I الذي قدم بيئة ميكروية ثلاثية الأبعاد معقدة لخلايا سرطان المبيض استجابةً للتضاريس المحيطة. أظهرت ثقافات الخلايا ثلاثية الأبعاد زيادة تتراوح بين مرتين إلى خمس مرات في مقاومة الأدوية (باكليتاكسيل، كركمين، وفلورويوراسيل) مقارنةً بالطبقات الأحادية ثنائية الأبعاد، التي أظهرت تمثيلًا جيدًا للورم الأساسي ومن المحتمل أن تحاكي الخصائص البيولوجية في الجسم لخلايا سرطان المبيض. وبالمثل، أثبت سونغ وآخرون [106] أيضًا أن هيدروجيل RADA16-I يمكن أن يوفر هياكل ألياف نانوية بارزة وديناميكية لدعم نمو الخلايا وحيويتها. تم زراعة خلايا HO-8910PM، وهي خلايا سرطان المبيض البشرية النقيلي، في ثلاثة مواد حيوية هيدروجيل، وهي هيدروجيل RADA16-I، ماتريجيل، وكولاجين I. أظهر ببتيد RADA16-I المصمم خصيصًا هيكل شبكة ألياف نانوية محددة جيدًا داخل الهيدروجيل، مما يوفر بيئة ميكروية خلوية قائمة على الألياف النانوية مشابهة لماتريجيل وكولاجين I. من الجدير بالذكر أن خلايا HO-8910PM أظهرت أنماط نمو مميزة داخل المصفوفات الثلاث، بما في ذلك تجمعات الخلايا، مستعمرات، مجموعات، شرائط، وكريات ورم متعددة الخلايا (MCTS). علاوة على ذلك، كانت التعبيرات الجزيئية للإنترجرين ، E-cadherin، وN-cadherin في MCTS المزروعة ثلاثية الأبعاد من خلايا HO-8910PM مرتفعة، وتم تقليل حساسيتها الكيميائية تجاه سيسبلاتين وباكليتاكسيل مقارنةً بثقافة الخلايا ثنائية الأبعاد، كما يتضح من قيم IC ومعدلات التثبيط.

علاوة على ذلك، تعتبر هيدروجيل حمض الهيالورونيك (HA) متعددة التكافؤ اصطناعية، حيث يتم إنشاؤها عادةً من خلال تعديل كيميائي لجزيئات HA، مما يقدم عوامل ربط أو مجموعات وظيفية تمكن من تشكيل هيكل شبيه بالهلام. يسمح هذا التعديل بالتحكم في الخصائص الفيزيائية والميكانيكية للهيدروجيل، مثل صلابته، ومعدل تحلله، ونشاطه الحيوي. قام سو وآخرون [107] بتصميم هيكل هيدروجيل يحاكي ECM لتكرار البيئة الميكروية الأصلية لسرطان الثدي لتوفير

نموذج فعال في المختبر لدراسة تقدم سرطان الثدي. تم إعداد هيدروجيل HA من مشتقات HA متعددة التكافؤ من خلال عملية ربط مزدوج مبتكرة تشمل تفاعلات هيدرازون وphoto-crosslinking. يعتبر ربط الهيدرازون عملية متعددة الاستخدامات وقابلة للعكس تسمح بالتجليد السريع، بينما يثبت الربط الضوئي الهيدروجيل المتكون. باستخدام هذا النهج، تمكنوا من إنتاج هيدروجيل HA بكفاءة في أقل من 120 ثانية. وُجد أن هيدروجيل HA المطور يشبه عن كثب التضاريس والخصائص الميكانيكية للأورام الثديية، ويمكن ضبط خصائصها (أي، الصلابة والمسامية) عن طريق تعديل كمية الألدهيد-HA في تركيبة الهيدروجيل. تفتح هذه القدرة على تعديل الخصائص الميكانيكية للهيدروجيل إمكانيات لنمذجة مراحل مختلفة من تقدم الورم أو أنواع مختلفة من الأورام. علاوة على ذلك، كانت ميزة حاسمة من هيدروجيل HA المطور هي سلوك تحللها الثنائي الاستجابة، والذي وُجد أنه يستجيب للجلوتاثيون و
هيالورونيداز. يسمح الاستجابة للجلوتاثيون بالتحلل استجابةً للبيئة المؤكسدة، والتي غالبًا ما تتعطل في خلايا السرطان. في الوقت نفسه، تجعل استجابة الهيالورونيداز الهيدروجيل حساسًا لإنزيم يتم تنظيمه عادةً في خلايا السرطان الغازية. بشكل ملحوظ، أظهرت خلايا MCF-7 المزروعة في هيدروجيل HA زيادة في التعبير عن عامل نمو بطانة الأوعية الدموية (VEGF)، والإنترلوكين-8 (IL-8)، وعامل نمو الألياف الأساسية (bFGF) مقارنةً بنظيراتها المزروعة ثنائية الأبعاد. هذه الجزيئات هي وسطاء رئيسيون في تكوين الأوعية الدموية والالتهاب في السرطان، مما يشير إلى أن بيئة هيدروجيل HA تحاكي بشكل أفضل الظروف التي تعزز هذه العمليات في الأورام. بالإضافة إلى ذلك، أظهرت الخلايا المزروعة في الهيدروجيل قدرات معززة على الهجرة والغزو، وهي سمات رئيسية لخلايا السرطان العدوانية. دعمت الدراسات في الجسم هذه النتائج وأكدت القدرة الورمية المتفوقة لخلايا MCF-7 المزروعة في هيدروجيل HA مقارنةً بتلك المزروعة في 2D. من المتوقع أن تكون نتائج هذا البحث
لها آثار بعيدة المدى على كل من دراسة سرطان الثدي في المختبر وتطوير استراتيجيات علاجية فعالة.
أيدت دراسة أخرى أجراها وانغ وزملاؤه [108] أن مستوى الميثاكريليشن أثر بشكل كبير على الميكروستركشر للهيدروجيل، والخصائص الميكانيكية، وقدرته على امتصاص السوائل والتحلل. عرض الهيدروجيل المكرر، الذي تم تصنيعه من خلال الربط الضوئي لحمض الهيالورونيك الميثاكريل، هيكلًا مساميًا عاليًا، ونسبة انتفاخ متوازنة عالية، وخصائص ميكانيكية مناسبة، وعملية تحلل تستجيب للهيالورونيداز. وُجد أن هيدروجيل حمض الهيالورونيك يعزز نمو وتكاثر خلايا MCF-7، التي شكلت تجمعات داخل الهيدروجيل. بالإضافة إلى ذلك، أظهرت خلايا MCF-7 المزروعة في بيئة ثلاثية الأبعاد زيادة في تعبير VEGF وbFGF وinterleukin-8، وقدرات متزايدة على الغزو وتكوين الأورام مقارنة بنظيراتها المزروعة في بيئة ثنائية الأبعاد. وبالتالي، أثبت هيدروجيل حمض الهيالورونيك أنه بديل موثوق لبناء نماذج الأورام. الجيلاتين الميثاكريلي (GelMA) هو مادة حيوية طبيعية أخرى تُستخدم بشكل شائع في هياكل الهيدروجيل ثلاثية الأبعاد في أبحاث السرطان. يتم اشتقاق GelMA من الجيلاتين، وهو بروتين طبيعي يتم الحصول عليه من مصادر غنية بالكولاجين. يتم تعديله عن طريق إضافة مجموعات ميثاكريلويل التي تمكنه من الخضوع للربط الضوئي عند تعرضه للأشعة فوق البنفسجية (UV). تتيح هذه الخاصية لـ GelMA تشكيل شبكات هيدروجيل مستقرة، مما يجعله مناسبًا لإنشاء هياكل ثلاثية الأبعاد تحاكي بيئة الورم الدقيقة (TME). تجعل الخصائص الميكانيكية والبيوكيميائية القابلة للتعديل لهيدروجيل GelMA، والتوافق الحيوي، والقدرة على دعم نمو الخلايا منها أدوات قيمة لدراسة سلوك خلايا السرطان، وغزو الورم، واختبار الأدوية، وغيرها من جوانب أبحاث السرطان. طور كيم وزملاؤه [109] نموذج زراعة خلايا ثلاثي الأبعاد للمثانة من خلال استخدام مصفوفة خلوية جديدة ومفاعل حيوي. تم استخدام GelMA كهيكل ثلاثي الأبعاد لزراعة خلايا سرطان المثانة، مع ارتفاع هيكل مثالي يبلغ 0.08 مم ووقت ربط يبلغ 120 ثانية [110]. بعد ذلك، تم زراعة خلايا 5637 وT24 في بيئات ثنائية وثلاثية الأبعاد وتعرضت لعلاجات دوائية باستخدام الراباميسين وبكتيريا كالميت-غرين (BCG). وُجد أن نموذج زراعة خلايا سرطان المثانة ثلاثي الأبعاد أظهر عملية إنشاء أسرع وثباتًا أكبر مقارنة بالنموذج ثنائي الأبعاد. علاوة على ذلك، أظهرت خلايا السرطان المزروعة في بيئة ثلاثية الأبعاد مقاومة متزايدة للأدوية وحساسية منخفضة مقارنة بالخلايا المزروعة في بيئة ثنائية الأبعاد. بالإضافة إلى ذلك، لاحظ الباحثون تفاعل الخلايا مع بعضها البعض ونشاطًا قاعديًا في النموذج ثلاثي الأبعاد، مما يشبه البيئة داخل الجسم.
على نفس المنوال، قام آريا وآخرون [111] بالتحقيق في ملاءمة هلاميات GelMA كنظم زراعة ثلاثية الأبعاد في المختبر لنمذجة الخصائص الرئيسية للانتقال.
تقدم سرطان الثدي، تحديدًا الغزارة والاستجابة للعلاج الكيميائي. تم ضبط الخصائص الميكانيكية والشكلية للهيدروجيل من خلال تغيير نسبة GelMA المستخدمة. أظهرت اختبارات الضغط أن صلابة كانت هلامات GelMA ضمن النطاق المبلغ عنه لنسج الثدي، مما يجعلها مصفوفات مناسبة لمحاكاة اللزوجة المرنة للثدي في المختبر، كما أن الخلايا المزروعة على أظهرت هلاميات GelMA معدل تكاثر أعلى مقارنة بـ جلبت GelMA في كلا خطي الخلايا المختبرين، مما يجعلها أنظمة قوية لزراعة الخلايا على المدى الطويل. علاوة على ذلك، أظهرت دراسات التكاثر أن هلامات GelMA يمكن أن تدعم خلايا سرطان الثدي لفترة أطول من الثقافات ثنائية الأبعاد. كما لوحظت زيادة في التعبير عن الجينات المرتبطة بالعدوانية في خلايا سرطان الثدي المزروعة ثلاثية الأبعاد، مما يشير إلى تغييرات محتملة مهمة للتقدم النقيلي. تم تقييم الاستجابة للأدوية الكيميائية، ولوحظ أن الكريات ثلاثية الأبعاد من خلايا سرطان الثدي المزروعة على هلامات GelMA أظهرت حساسية أقل تجاه أدوية التاكسين مثل باكليتاكسيل. أبرزت الدراسة أهمية حجم مسام المصفوفة المناسب لاختراق الخلايا، والهجرة، والتكاثر، وتبادل الأكسجين، والمواد المغذية، والمواد waste داخل وخارج هياكل الثقافة ثلاثية الأبعاد. بشكل ملحوظ، أكدت هذه الدراسات على أهمية نموذج زراعة خلايا السرطان ثلاثية الأبعاد في إنشاء نموذج مشابه للمرضى. يمكن أن يؤدي استخدام مثل هذه النماذج إلى تقييم أكثر دقة لاستجابات الأدوية، مما قد يؤدي إلى تقدم في علاج السرطان وأمراض أخرى.

من المعروف أن الخلايا تستجيب لبيئتها الميكانيكية في عملية تُعرف باسم التحويل الميكانيكي، حيث تقوم بتحويل المحفزات الميكانيكية إلى إشارات بيولوجية كيميائية، مما يؤدي لاحقًا إلى تغييرات في سلوك الخلايا وعملياتها الوظيفية. قام كورتيس وآخرون [112] بدراسة تأثير المحفزات الميكانيكية على تكاثر الخلايا ونموها وتعبير البروتينات في خلايا سرطان الثدي 4T1، التي تُعتبر نموذجًا للخلايا التي تنتشر إلى العظام. استخدم الباحثون خلايا سرطان الثدي 4T1 وزرعوها في هيدروجيل الجيلاتين-mTGase الذي يحاكي الخصائص الميكانيكية لنخاع العظام. كانت للهيدروجيلات معاملات مختلفة إما 1 أو 2.7 كيلو باسكال. تم زراعة الخلايا تحت ظروف مختلفة، بما في ذلك الزراعة الثابتة، وتدفق الوسط عبر الهيدروجيل، وتدفق مشترك مع ضغط ميكانيكي دوري لمدة ساعة واحدة في اليوم لمدة 4 أيام. تم زراعة عينات التحكم تحت ظروف انتفاخ حر. تم استخدام تقنيات التلوين المناعي لتحليل تعبير البروتين داخل الكتل الخلوية التي تشكلت خلال الزراعة. وجدت الدراسة أن المحفزات الميكانيكية أثرت بشكل كبير على سلوك خلايا سرطان الثدي 4T1. شكلت الخلايا كتلًا خلال فترة الزراعة، مع ملاحظة كتل أكبر في التركيبات المزروعة بشكل ثابت مقارنة بتلك المعرضة للتدفق.
or الضغط. في الجيلاتين الأكثر صلابة، أدت الهياكل المضغوطة إلى تكوين كريات أصغر مقارنة بالتروية وحدها، بينما لم يكن للضغط تأثير كبير في الجيلاتين الأكثر ليونة. أظهر التلوين المناعي تعبير البروتينات المرتبطة بالانتقال العظمي داخل الكريات، بما في ذلك الأوستيوپونتين، وبروتين هرمون الغدة الجار درقية، والفبرونكتين. كان علامة التكاثر Ki67 موجودة في جميع الكريات في اليوم الرابع. اختلفت شدة تلوين Ki67 اعتمادًا على ظروف الثقافة وصلابة الجيلاتين. وأبرزت الحساسية الميكانيكية لخلايا سرطان الثدي 4T1 وأظهرت كيف يمكن أن تؤثر المحفزات الميكانيكية على تكاثرها وتعبير البروتينات داخل المواد اللينة التي تحاكي الخصائص الميكانيكية لنخاع العظام. وأكدت النتائج على دور البيئة الميكانيكية في العظام لكل من نماذج السرطان في الجسم الحي وفي المختبر.

فهم تأثير العوامل الميكانيكية على سلوك خلايا السرطان أمر حاسم لتطوير استراتيجيات فعالة لمنع وعلاج النقائل إلى العظام، مما قد يؤدي إلى تحسين النتائج السريرية للمرضى الذين يعانون من سرطان متقدم. وبالمثل، قام كافو وآخرون [113] بالتحقيق في تأثير مرونة الركيزة على نشاط خلايا سرطان الثدي الغدية باستخدام هيدروجيل الألجينات المعدل ميكانيكياً. وقد قيمت الدراسة قابلية الحياة، ومعدلات التكاثر، وتنظيم الكتل لخلايا سرطان الثدي MCF-7 في هيدروجيل الألجينات ثلاثي الأبعاد مقارنة بالبيئات ثنائية الأبعاد القياسية. تم قياس معاملات المرونة لهيدروجيل الألجينات المختلفة باستخدام المجهر الذري (AFM). أظهرت النتائج أن صلابة الركيزة تؤثر بشكل مباشر على مصير الخلايا في البيئات ثنائية وثلاثية الأبعاد. في الهيدروجيل ثلاثي الأبعاد الذي له معامل مرونة أظهرت خلايا MCF-7 تكاثرًا غير مقيد، مكونة تجمعات خلوية مع و الأقطار بعد 1 و 2 أسبوع، على التوالي. إن نمو الخلايا غير المقيد الذي لوحظ في الهيدروجيلات الأكثر ليونة كان يحاكي المراحل الأولية لتكوين الأوعية الدموية ونمو الأورام الصلبة. علاوة على ذلك، فإن التكوين الشبيه بالعناقيد متعددة الخلايا الذي لوحظ في الهيدروجيلات ثلاثية الأبعاد كان يشبه بشكل وثيق تنظيم الأورام الصلبة في الجسم الحي، مما يبرز ميزة نماذج السرطان ثلاثية الأبعاد في تكرار تفاعلات الخلايا مع بعضها البعض ومع المصفوفة. كما سلطت الدراسة الضوء على تأثير أبعاد البيئة الدقيقة على شكل الخلايا، حيث أظهرت الخلايا شكلًا مسطحًا في الثقافات ثنائية الأبعاد بينما اتخذت شكلًا دائريًا في البيئة ثلاثية الأبعاد. كان تكاثر الخلايا في الإعداد ثلاثي الأبعاد يعتمد بشكل كبير على صلابة الركيزة، مما أثر على انتشار المغذيات والإشارات داخل الخلايا من خلال آلية نقل ميكانيكي. تؤكد النتائج على أهمية مراعاة صلابة الركيزة في تصميم نماذج السرطان ثلاثية الأبعاد، حيث تؤثر بشكل مباشر على حيوية الخلايا وتكاثرها وتنظيمها. من خلال فهم العلاقة بين
من خلال صلابة الركيزة وسلوك الخلايا، يمكن للباحثين تطوير نماذج في المختبر أكثر واقعية تعكس بشكل أفضل البيئة الدقيقة للأورام الصلبة. يمكن أن تعزز هذه النماذج فهمنا لتطور السرطان وتساعد في تطوير العلاجات المستهدفة من خلال السماح بالتحقيق في تفاعلات الخلايا مع بعضها البعض وتفاعلات الخلايا مع المصفوفة في بيئة أكثر دقة.

تمت إزالة المكونات الخلوية من الأنسجة غير الخلوية، مما ترك وراءه المصفوفة خارج الخلوية. يمكن استخدام الأنسجة غير الخلوية كدعائم لزراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد، مما يوفر بيئة طبيعية لنمو الخلايا وتفاعلها. يوفر استخدام الأنسجة غير الخلوية كدعائم لزراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد عدة مزايا. أولاً، تحتفظ بتكوين المصفوفة خارج الخلوية المعقدة، بما في ذلك البروتينات الهيكلية، وعوامل النمو، وجزيئات الإشارة، التي تلعب أدوارًا حاسمة في سلوك الخلايا وتنظيم الأنسجة. وهذا يمكّن خلايا السرطان من التفاعل مع المصفوفة خارج الخلوية بشكل يشبه الظروف داخل الجسم، مما يؤثر على التصاقها، وهجرتها، وغزوها، وتمايزها. علاوة على ذلك، توفر الأنسجة غير الخلوية تنظيمًا مكانيًا وإشارات معمارية توجه سلوك الخلايا. إن الحفاظ على الطبوغرافيا الخاصة بالأنسجة، مثل الأوعية الدموية، يسمح بدراسة عمليات تكوين الأوعية الدموية والتوعية في تقدم السرطان. كما توفر هذه الدعائم دعمًا ميكانيكيًا وصلابة تؤثر على نقل الإشارات الميكانيكية للخلايا، مما يؤثر على شكل الخلايا، وتكاثرها، وأنماط التعبير الجيني. يمكن أن تُستمد من مصادر متنوعة، بما في ذلك الأعضاء الصلبة، مثل الكبد أو الرئة، أو أقسام الأنسجة المحددة، مثل الغشاء القاعدي غير الخلوي الغني بالمصفوفة خارج الخلوية.

افترض لاندبرغ وآخرون [115] أن استخدام منصة قبل السريرية تعتمد على هياكل خلوية مستخلصة من المرضى كركائز للنمو يمكن أن تساعد في حساب المعلومات السريرية المخفية وتساعد في نمذجة الخصائص الفردية للبيئات الدقيقة، مما يمكن تحسينه لتخطيط العلاج الشخصي. تقنيات إزالة الخلايا المختلفة، مثل الطرق الكيميائية أو الفيزيائية أو الإنزيمية، تزيل المكونات الخلوية مع الحفاظ على سلامة المصفوفة خارج الخلية (انظر الجدول 6) [116]. يعتمد اختيار طريقة إزالة الخلايا على نوع الأنسجة، وخصائص المصفوفة المرغوبة، والمتطلبات المحددة للدراسة. يمكن أيضًا استخدام تركيبات من تقنيات مختلفة لتحقيق نتائج مثلى في إزالة الخلايا. ومع ذلك، لا تزال هناك تحديات في هذا المجال. يجب مراعاة المناعية الحيوية والتوافق الحيوي للأنسجة المستخلصة بعناية لمنع ردود الفعل السلبية عند إدخال مصفوفات غريبة في أنظمة زراعة الخلايا. كما أن توحيد وإعادة إنتاج بروتوكولات إزالة الخلايا أمران حاسمان لضمان الاتساق عبر الدراسات وتسهيل مقارنة النتائج. التكامل مع التقنيات المتقدمة
يمكن أن تعزز تقنيات مثل الميكروفلويديات أو أنظمة الأعضاء على شريحة الوظائف والأهمية لنماذج الأنسجة الخالية من الخلايا.

طور د’أنجيليو وآخرون [117] نموذجًا ثلاثي الأبعاد أكثر تمثيلاً لانبثاث سرطان القولون والمستقيم في الكبد باستخدام هياكل مستمدة من المرضى. هذه الهياكل، التي تم إنشاؤها عن طريق إزالة الخلايا من مصفوفة خارج الخلية الخاصة بالنسيج، تحتفظ بالخصائص البيولوجية والسمات الهيكلية للبيئة الدقيقة الانبثاثية. تم زراعة خط خلايا HT-29 لسرطان القولون والمستقيم داخل هذه الهياكل، التي تم الحصول عليها بشكل خاص من مرضى السرطان. لاحظت الدراسة زيادة في تكاثر الخلايا وهجرتها في الهياكل المستمدة من السرطان، مما يبرز قدرتها على توفير بيئة أكثر ملاءمة لنمو خلايا الورم وانتشارها. علاوة على ذلك، أظهر نظام الثقافة ثلاثي الأبعاد استجابة مخفضة للعلاج الكيميائي. أظهرت خلايا HT-29 المزروعة في البيئات الدقيقة ثلاثية الأبعاد الخاصة بالسرطان انخفاضًا في الحساسية للعلاج باستخدام 5-فلورويوراسيل ومزيج من 5-فلورويوراسيل مع إيرينوتيكان، عند استخدامهما بتركيزات IC50 القياسية. يسمح استخدام الهياكل المستمدة من المرضى بدراسة تقدم انبثاث سرطان القولون والمستقيم وتقييم استجابتها لوكلاء العلاج الكيميائي، لتطوير استراتيجيات علاجية جديدة وعلاجات مخصصة. بالإضافة إلى ذلك، يوفر فرصة لتحديد العلامات البيولوجية التنبؤية المحتملة والأهداف العلاجية المحددة لانبثاث الصفاق. أجرى فارينيلي وآخرون [118] دراسة استخدمت نموذجًا هندسيًا للأنسجة للتحقيق في الانبثاثات الصفاقية (PM) في المختبر، مما أسفر عن استنتاجات مماثلة. شمل النموذج زراعة الأورام العضوية المستمدة من PM على مصفوفات خارج الخلية غير الخلوية (dECMs) المستمدة من الصفاق، مما أتاح استكشاف التفاعلات المعقدة بين الخلايا النيوبلستية ومصفوفة ECM في نظام PM. تم استخدام كل من نسيج الصفاق النيوبلستي والنسيج الطبيعي المقابل لإنشاء 3D-dECMs. باستخدام تقنيات المجهر الضوئي الانعكاسي والمجهر الضوئي المستقطب، لاحظت الدراسة اختلافات في نسيج الأنسجة وتوزيع وسلامة ألياف الكولاجين الفردية بين الأنسجة الطبيعية والمستمدة من النيوبلستية التي تم الحصول عليها من ثلاثة مرضى PM متميزين. أظهرت النتائج أن 3D-dECMs المستمدة من الصفاق النيوبلستي أظهرت نسبة أعلى بشكل ملحوظ من -الخلايا الإيجابية بعد 5 و 12 يومًا. علاوة على ذلك، تم العثور على مستويات تعبير مرتفعة لعدد من الجينات المحددة التي تعتبر حاسمة لهيكل الأنسجة، والصلابة، وإعادة تشكيل مصفوفة extracellular، وتوليد الألياف، وتمايز الخلايا الظهارية، ومقاومة الضغط، وتنظيم تكوين الأوعية الدموية في مصفوفات الدي ECM ثلاثية الأبعاد المولدة من الأنسجة الورمية مقارنة بتلك المأخوذة من الأنسجة الطبيعية أو النماذج المعتمدة على ماتريجيل. باختصار، من خلال استخدام الدعائم المستمدة من المرضى والتقنيات المتطورة، نجح الباحثون في تطوير نماذج أكثر ملاءمة من الناحية الفسيولوجية والتي بشكل كبير
تساهم في فهمنا لسرطان القولون والمستقيم وبيولوجيا النقائل. توفر هذه النماذج، إلى جانب نماذج أخرى، رؤى قيمة حول التفاعل المعقد بين خلايا الورم والمصفوفة خارج الخلوية، مما يمهد الطريق لاكتشاف أهداف علاجية جديدة وتطوير استراتيجيات علاج شخصية للنقائل البريتونية.

علاوة على ذلك، توفر الدعائم النسيجية غير الخلوية منصة فعالة لدراسة التفاعلات بين المكونات المختلفة الموجودة بكثرة في المصفوفة خارج الخلوية، مثل البلعميات والخلايا البطانية. تُعرف البلعميات والخلايا البطانية بمشاركتها في تقدم السرطان في سياق المصفوفة خارج الخلوية داخل الأورام الصلبة، حيث غالبًا ما توجد بأعداد كبيرة. يمكن أن يتم “اختطاف” البلعميات داخل الورم (التي تُعرف غالبًا باسم البلعميات المرتبطة بالورم أو TAMs) بواسطة خلايا السرطان وإعادة برمجتها لدعم نمو الورم وتقدمه. على سبيل المثال، يمكن أن تعزز تكاثر خلايا السرطان، وتزيد من تشكيل الأوعية الدموية (تكوين الأوعية)، وتساعد في إعادة تشكيل الأنسجة، وتثبط الاستجابة المناعية ضد الورم. قام بينتو وآخرون [123] بالتحقيق في كيفية تأثير مصفوفات الأورام القولونية البشرية على استقطاب البلعميات ودورها اللاحق في غزو خلايا السرطان. لتسهيل ذلك، تم استخدام نموذج عضوي ثلاثي الأبعاد جديد باستخدام أنسجة غير خلوية من الاستئصال الجراحي لمرضى سرطان القولون. حافظ هذا النموذج على خصائص الأنسجة الأصلية، بما في ذلك المكونات الرئيسية للمصفوفة خارج الخلوية، والهندسة المعمارية، والخصائص الميكانيكية، مع إزالة الحمض النووي ومكونات خلوية أخرى. وجدت الدراسة أن البلعميات داخل مصفوفات الأورام أظهرت نمطًا ظاهريًا مضادًا للالتهابات يشبه M2، يتميز بزيادة التعبير عن IL-10 وTGF- ، و CCL18، وانخفاض تعبير CCR7 و TNF. علاوة على ذلك، لوحظ أن البلعميات المتعلمة من ECM الورمي تعزز بشكل فعال غزو خلايا السرطان من خلال آلية تتضمن CCL18، كما تم إثباته من خلال اختبارات غزو Matrigel. يرتبط التعبير العالي لـ CCL18 في الجبهة الغازية للأورام القولونية البشرية بتقدم مراحل الورم، مما يبرز أهميته السريرية. تسلط النتائج الضوء على إمكانية استخدام مصفوفات خلوية خالية من الورم كدعائم استثنائية لإعادة إنشاء بيئات دقيقة معقدة، مما يمكّن من فهم أكثر شمولاً لآليات تقدم السرطان ومقاومة العلاج.

بالإضافة إلى TAMs، تعبر الخلايا البطانية عن مجموعة متنوعة من جزيئات الالتصاق والكيماويات، مثل السليكتينات، والإنتغرينات، وأعضاء عائلة الأجسام المضادة الفائقة، التي يمكن أن تتفاعل مع الروابط على خلايا السرطان، مما يسهل التصاقها بطبقة الخلايا البطانية. هذا الالتصاق هو خطوة حاسمة في عملية الخروج من الأوعية الدموية، حيث تخرج خلايا السرطان من مجرى الدم وتغزو الأنسجة المحيطة لتكوين النقائل. علاوة على ذلك، فإن الخلايا البطانية

يمكن أن تشير وتستقطب البلعميات وغيرها من خلايا المناعة إلى موقع الورم. بمجرد وصولها، يمكن أن تتلقى البلعميات “تعليمًا” من الورم لتبني نمط ظاهري مؤيد للورم، مما يثبط الاستجابة المناعية ويعزز نمو الورم. لذلك، فإن المصفوفات غير الخلوية مناسبة لدراسة مثل هذه التفاعلات لأنها تشبه عن كثب البيئة الطبيعية للورم، بما في ذلك مواقع الالتصاق الأصلية، وجزيئات الإشارة، والإشارات الميكانيكية. قام هلال-نيتو وآخرون [124] بدراسة تأثير الدECM الناتج عن خط خلايا الميلانوما البشرية عالية الانتشار (MV3) على تنشيط خلايا البطانة وإشارات تمايز الخلايا داخلها.
مسارات. درس الباحثون الفروق في التنظيم فوق المجهري وتكوين ECM المشتق من الخلايا الميلانية (NGM-ECM) و ECM المشتق من الميلانوما (MV3-ECM). تم الكشف عن مستويات أعلى من التيناسين-C واللامينين وتعبير أقل عن الفيبرو نكتين في MV3-ECM. علاوة على ذلك، خضعت الخلايا البطانية المزروعة في MV3-ECM لتحولات شكلية وأظهرت زيادة في الالتصاق والحركة والنمو وتكوين الأنابيب. أدت التفاعلات بين الخلايا البطانية والمصفوفة الخلوية المنزوعة إلى تنشيط إشارة الإنتغرين، مما أدى إلى فسفرة كيناز الالتصاق البؤري (FAK) وارتباطه بـ Src (وهو بروتين غير مستقبل).

بروتين كيناز التيروزين). أدى تنشيط Src بدوره إلى تحفيز تنشيط مستقبل عامل نمو بطانة الأوعية الدموية 2 (VEGFR2)، مما عزز استجابة المستقبل لـ VEGF. تم تثبيط تنشيط VEGF والارتباط بين FAK وSrc عن طريق حجب الإنترغرين، الذي قلل من تكوين الأنابيب. في الختام، أشارت النتائج إلى أن تفاعل الخلايا البطانية مع المصفوفة خارج الخلوية للورم الميلانيني أدى إلى تفعيل إشارات تعتمد على الإنترغرين، مما أدى إلى تنشيط مسار Src الذي زاد بشكل متسلسل من تنشيط VEGFR2 وعزز تكوين الأوعية الدموية. وبالتالي، يعتمد التقدم في بيولوجيا السرطان على فهم الاستجابات الخلوية المحددة التي تؤثر عليها إشارات المصفوفة داخل المصفوفة خارج الخلوية، حيث تفرض طبيعتها بشكل جوهري تباينات مكانية على الإشارات الخلوية، والتركيب، والطبوغرافيا، والعوامل الكيميائية الحيوية. تلخص الجدول 7 بعض الدراسات التي استخدمت الهيدروجيل وهياكل الأنسجة غير الخلوية لزراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد.

إن دمج أنواع متعددة من الهياكل يوفر إمكانية إنشاء أنظمة زراعة خلايا ثلاثية الأبعاد تحاكي عن كثب الظروف الفسيولوجية للأنسجة الحية. تتيح هذه الطريقة للباحثين تطوير نماذج أكثر دقة وذات صلة بيولوجية لدراسة سلوك الخلايا، وتقدم المرض، واستجابات العلاج. من خلال دمج مواد هياكل مختلفة، مثل البوليمرات الطبيعية والاصطناعية أو الهلاميات، يمكن للباحثين تكرار تعقيد وتنوع البيئة الدقيقة للأنسجة الأصلية. يمكن أن توفر هذه الهياكل الهجينة مجموعة من الإشارات الفيزيائية والكيميائية والميكانيكية التي تؤثر على سلوك الخلايا، بما في ذلك التصاق الخلايا، والهجرة، والتكاثر، والتمايز. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يعزز دمج الهياكل من وظيفة أنظمة زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد من خلال دمج ميزات محددة، مثل الإفراج المنظم عن عوامل النمو أو تضمين الشبكات الوعائية الدقيقة. إن استخدام أنواع متنوعة من الهياكل في زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد يقدم نهجًا مبتكرًا واعدًا لتعزيز فهمنا لبيولوجيا الأنسجة، وآليات المرض، وتطوير علاجات أكثر فعالية. تناول باسي وآخرون [98] قيود العلاجات التقليدية لسرطان العظام، وهو نوع من سرطان العظام، من خلال تقديم نهجين مبتكرين في هندسة الأورام تهدف إلى تحسين نتائج العلاج. استخدمت الدراسة هياكل قائمة على هيدروكسيباتيت تحاكي البيئة الدقيقة في الجسم، مع التركيز بشكل خاص على مكان خلايا السرطان الجذعية. تم استخدام نوعين من الهياكل: هيكل مركب هجيني حيوي تم الحصول عليه من خلال التمعدن الحيوي، والذي يتضمن النواة المباشرة لهيدروكسيباتيت المدعوم بالمغنيسيوم (MgHA) على ألياف الكولاجين ذات التجميع الذاتي (MgHA/Coll)، وهياكل هيدروكسيباتيت المسامية (HA) التي تم إنتاجها من خلال عملية الرغوة المباشرة. قدمت هذه الهياكل إطارًا للتحقيق اللاحق في الجوانب البيولوجية.
أداء خطوط خلايا الساركوما العظمية البشرية (MG63 و SAOS-2) وخلايا السركومة الجذعية الغنية ضمن هذه النماذج المعقدة لزراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد. تم استخدام تقنية التألق المناعي وتقنيات توصيف أخرى لتقييم استجابة خطوط خلايا الساركوما العظمية وخلايا السركومة الجذعية للهياكل البيولوجية المقلدة. أظهرت النتائج التكوين الناجح للكرات السركومية، وهي كريات مستقرة غنية بخلايا السركومة الجذعية، بحد أدنى من القطر مقارنةً بين نماذج زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد المتقدمة وأنظمة الزراعة ثنائية الأبعاد التقليدية، كشفت الدراسة عن تفوق النماذج الأولى في محاكاة بيئة خلايا جذعية الساركوما العظمية وتعزيز القدرة التنبؤية للدراسات ما قبل السريرية. تؤكد النتائج على أهمية البيئة المجهرية للورم وتبرز إمكانية دمج خلايا الساركوما الجذعية مع الهياكل البيوميميتية كنهج واعد لتطوير استراتيجيات علاجية جديدة للساركوما العظمية. يمكن توجيه المزيد من الجهود نحو تطوير نماذج ثلاثية الأبعاد أكثر تعقيدًا تعكس بدقة تباين البيئة المجهرية للساركوما العظمية، مع دمج خلايا مأخوذة من المرضى وعناصر مثل خلايا المناعة والأوعية الدموية. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تكون نماذج زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد المتقدمة أدوات قيمة لفحص الأدوية وطرق الطب الشخصي، مما يساهم بشكل أكبر في تقدم أبحاث وعلاجات الساركوما العظمية.

تم استخدام تقنية زراعة خلايا فريدة تعرف باسم “الزراعة المتسلسلة” لإنشاء بيئة ميكروية عظمية تحاكي الطبيعة، مما سهل التحول الظهاري-المتوسط (EMT) لخلايا سرطان البروستاتا المنتشرة [141]. تضمنت الطريقة دمج عوامل حيوية نشطة من التحفيز العظمي لخلايا السلالة الوسيطة البشرية (MSCs) داخل هياكل ثلاثية الأبعاد مسامية، وتحديداً هياكل مركبة من البوليمر والطين (PCN)، من خلال دمج طين هيدروكسيباتيت (HAP) في PCL. كما قام الباحثون بتعديل طين مونتموريلونيت الصوديوم (Na-MMT) باستخدام حمض 5-أمين فاليريك لإنشاء طين HAP من خلال التمعدن الحيوي للهيدروكسيباتيت في الطين النانوي المدخل. قاموا بإجراء استخراج RNA وتحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي (qRT-PCR) للتحقيق في تغييرات التعبير الجيني. بالإضافة إلى ذلك، قاموا بإجراء تحليل مقارن لنقائل العظام بين خطوط الخلايا ذات الانبثاث المنخفض والعالي، مما قدم رؤى حول استجاباتها المختلفة لبيئة العظام. وقد أظهر أن كل من خط خلايا سرطان البروستاتا عالي الانبثاث PC-3 وخط الخلايا غير الانبثاثية MDAPCa2b قد خضعا لانتقال MET عند تعرضهما لبيئة العظام المحاكية في نموذج الهيكل ثلاثي الأبعاد. ومع ذلك، لوحظت اختلافات ملحوظة في خصائصهما الشكلية والتصاق الخلايا، مما يشير إلى استجابات متميزة للبيئة الميكروية. بالإضافة إلى ذلك، لوحظت اختلافات كمية في التعبير الجيني بين الأورام الناتجة باستخدام خطي الخلايا.
بيئة العظام الدقيقة. هذه النتائج أساسية لتطوير استراتيجيات علاجية مستهدفة ضد نقائل سرطان البروستاتا في العظام. أجرى باي وزملاؤه [142] دراسة قاموا فيها بإدماج أكسيد الجرافين (GO) في بوليمر مشترك من حمض الأكريليك-ج-حمض البولي لاكتيك (PAA-g-PLLA) لإنشاء هيكل استجابة للتحفيز. هذا الهيكل، المدمج مع PCL وحمض الجامبوغ (GA)، أظهر استجابة انتقائية تجاه الأورام وأظهر تراكمًا كبيرًا لـ GO/GA في خلايا سرطان الثدي (خلايا MCF-7) في ظروف حمضية (pH 6.8)، بينما أظهر تأثيرًا ضئيلًا على الخلايا الطبيعية (خلايا MCF-10A) عند pH الفسيولوجي (pH 7.4). كشفت الدراسة أيضًا أن الاستخدام التآزري للتحويل الضوئي الحراري المستجيب لـ pH كان أكثر فعالية في تثبيط نمو الورم مقارنة بالعلاجات المستقلة. أظهرت التجارب الحية تثبيطًا ملحوظًا للورم (تخفيض بنسبة 99% خلال 21 يومًا) من خلال تفتت أنسجة الورم، والتنكس، والتثبيط العام للورم عند العلاج بهياكل GO-GA المدمجة مع العلاج الضوئي الحراري، مقارنة بالمجموعات الضابطة أو تلك المعالجة إما بهياكل GO-GA أو الإشعاع تحت الأحمر القريب (NIR) بمفرده.
توفر الميكروفلويديات منصة متعددة الاستخدامات لزراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد، حيث تقدم كل من الأساليب المعتمدة على الدعائم والأساليب الخالية من الدعائم. يمكن للباحثين تخصيص المنصة لتناسب المتطلبات المحددة لتجاربهم، سواء كانت تتضمن دعائم محملة بالخلايا أو تجمع الخلايا لتشكيل كتل كروية أو عضيات. يسمح الإعداد الميكروفلويدي بالتحكم الدقيق في البيئة الدقيقة، بما في ذلك تدفق المغذيات والأكسجين، فضلاً عن القدرة على إدخال تدرجات من جزيئات محددة. استخدم لي وآخرون [143] الطباعة اللينة لتصنيع لوحة قنوات ميكروفلويدية مكونة من 7 قنوات باستخدام بولي ديميثيل سيليكون (PDMS). داخل قنوات منفصلة، تم زراعة خلايا سرطان البنكرياس PANC-1 وخلايا النجمية البنكرياسية (PSCs) داخل مصفوفة الكولاجين I. لاحظت الدراسة تشكيل كتل كروية ثلاثية الأبعاد بواسطة خلايا PANC-1 خلال خمسة أيام. ومن المثير للاهتمام، أن وجود PSCs المزروعة معًا أدى إلى زيادة عدد الكتل الكروية، مما يشير إلى تأثير محتمل لـ PSCs على نمو الورم. في إعداد الزراعة المشتركة، أظهرت PSCs تعبيرًا مرتفعًا عن -أكتين العضلات الملساء ( -SMA)، علامة مرتبطة بتنشيط الخلايا الليفية، بالإضافة إلى مجموعة متنوعة من العلامات المتعلقة بعملية التحول الظهاري، بما في ذلك الفيمنتين، وعامل النمو المحول بيتا (TGF- )، TIMP1، و IL-8. أشارت هذه النتائج إلى أن خلايا PSCs قد تحفز نمط ظاهري مشابه لعملية التحول الظهاري في خلايا PANC-1، مما قد يعزز غزو الورم، مقاومة العلاج الكيميائي، والانتقال. عند معالجة الثقافة المشتركة بالجمسيتابين، لم تظهر بقاء الكتل الخلوية تغييرات ملحوظة. ومع ذلك، عند دمجها مع باكليتاكسيل، أظهرت الكتل الورمية تأثيرًا مثبطًا ملحوظًا على النمو. النموذج
كشفت عن تفاعل معقد بين خلايا PANC-1 وخلايا PSCs داخل البيئة المجهرية للورم. ومع ذلك، أظهر الجمع بين الجيمسيتابين والباكليتاكسيل وعدًا في التغلب على المقاومة وكبح نمو الورم. إن تداعيات هذه النتائج مهمة لفهم التفاعل المعقد بين خلايا الورم والخلايا الداعمة المحيطة بها داخل البيئة المجهرية للورم. تلعب تفاعلات الورم والدعامة دورًا حاسمًا في تقدم السرطان واستجابة العلاج. يسمح استخدام نماذج الزراعة المشتركة ثلاثية الأبعاد المعتمدة على الميكروفلويديك للباحثين بإعادة تمثيل الظروف داخل الجسم بشكل أفضل، مما يوفر تمثيلًا أكثر دقة لسلوك الورم واستجابات العلاج.

وبالمثل، طور تشين وآخرون [144] نموذجًا قائمًا على لوحات القنوات الدقيقة للتعايش لإعادة إنشاء البيئة المجهرية للورم في الجسم الحي من خلال دمج كريات الورم Hepa1-6 مع خلايا JS-1 النجمية (سرطان الكبد) – كان الهدف من النموذج الجديد هو محاكاة الجوانب الرئيسية لظاهرة التحول الظهاري ومقاومة العلاج الكيميائي التي لوحظت في الأورام. سمح دمج هذه الأنواع الخلوية في آبار دقيقة مقعرة ثلاثية الأبعاد بتكوين كريات ورم ثلاثية الأبعاد في غضون 3 أيام. تم تحسين إعداد التجربة لضمان ظروف تكاثر مثالية للتربية وتفاعلات مناسبة بين خلايا Hepa1-6 و JS-1. أظهرت خلايا JS-1 المتعايشة تغييرات ملحوظة في شكل الخلايا، بما في ذلك زيادة في التعبير عن . في المقابل، أظهرت الكريات الكروية من Hepa1-6 المزروعة معًا مستويات تعبير أعلى من TGF- من تلك المزروعة بمفردها. أشارت هذه النتائج إلى أن خلايا JS-1 النجمية حفزت نمطًا شبيهًا بعملية التحول الظهاري في خلايا Hepa1-6، مما قد يسهم في زيادة القدرة على الغزو ومقاومة العلاج الكيميائي. أجرى جونغ وآخرون [145] دراسة مماثلة تضمنت تشكيل كريات ثلاثية الأبعاد مكونة من خلايا سرطان القولون البشرية (HT29) باستخدام شريحة ميكروفلويديك. وأفادوا بزيادة ملحوظة في نمو HT-29 عند زراعتها مع الألياف (انظر الشكل 5). وقد تم إثبات هذه الزيادة من خلال زيادة بنسبة 1.5 مرة في نسبة التغير في قطر الكريات على مدى 5 أيام. علاوة على ذلك، بعد 6 أيام من الزراعة، أظهرت الكريات المزروعة معًا انخفاضًا في التعبير عن ، وهو علامة مرتبطة بالتكاثر، بينما يظهر زيادة في تعبير الفيبروكتين. أشارت هذه النتائج إلى سلوك خلوي متغير مقارنة بالثقافات الأحادية الكروية. كما أدى وجود الخلايا الليفية في بيئة الثقافة المشتركة إلى تنشيطها، كما يتضح من زيادة تعبير -أكتين العضلات الملساء ( -SMA) وزيادة في النشاط الهجري. هذه التفاعلات المتبادلة بين الكريات السطحية والأرومات الليفية داخل شريحة ميكروفلويدية أنشأت علاقة ديناميكية. بالإضافة إلى ذلك، عند التعرض للباسيتاكسيل، أظهرت الثقافة المشتركة ميزة بقاء مقارنة بالثقافة الأحادية ثنائية الأبعاد، مما يشير إلى الدور المحتمل للأرومات الليفية في منح مقاومة الأدوية. دمج

توفر كرات الأورام ثلاثية الأبعاد والخلايا الليفية المتوسطة داخل رقاقة ميكروفلويديك المدمجة في مصفوفة الكولاجين أداة قيمة لدراسة البيئة المجهرية للورم وتقييم فحص الأدوية وفعاليتها. سمح هذا النهج بتكرار التفاعلات الأساسية بين خلايا الورم ومكونات السدى، والتي من المعروف أنها تؤثر على تقدم السرطان واستجابة العلاج. من خلال استخدام نموذج الرقاقة المعتمد على الميكروفلويديك المقترح، يمكن للباحثين التعمق في الديناميات المعقدة للبيئة المجهرية للورم واستكشاف أساليب علاجية جديدة. توفر القدرة على التحكم في الظروف داخل الجسم ومحاكاتها بشكل أفضل داخل الرقاقة منصة قيمة للتحقيق في استجابات الأدوية وتقييم فعالية العلاجات المضادة للسرطان. قد تؤدي المزيد من الاستكشافات وتحسين هذا النموذج إلى تقدم كبير في فهمنا لبيولوجيا الورم وتطوير العلاجات المستهدفة لتحسين نتائج المرضى. تلخص الجدول 8 بعض الدراسات التي تستخدم أنظمة قائمة على الميكروفلويديك لتطوير ثقافات خلايا ثلاثية الأبعاد.

بينما تقدم زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد العديد من المزايا مقارنة بزراعة الخلايا ثنائية الأبعاد التقليدية، فإنها تواجه أيضًا بعض التحديات الفريدة التي يجب معالجتها لتحقيق إمكاناتها في تعزيز البحث بشكل كامل. أحد التحديات الكبيرة هو الحفاظ على نظام زراعة مستقر وقابل للتكرار. غالبًا ما تتطلب أنظمة زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد معدات متخصصة، مثل المفاعلات الحيوية والأجهزة الدقيقة، والتي يمكن أن تكون مكلفة وصعبة الاستخدام. يمكن أن تكون هذه الأنظمة أكثر تحديًا في التكرار مقارنة بالأنظمة ثنائية الأبعاد بسبب التعقيد المتزايد والتنوع العالي في بيئة الزراعة، حيث غالبًا ما تكون الخلايا مدفونة في مصفوفات أو هياكل، مما يجعل من الصعب التحكم في عوامل مثل درجة الحرارة، ودرجة الحموضة، ووجود عوامل النمو و/أو جزيئات الإشارة الأخرى. بالإضافة إلى ذلك، غالبًا ما يكون هناك درجة عالية من التباين بين دفعات مختلفة من الخلايا وبين التجارب، مما يجعل من الصعب استخلاص استنتاجات مدعومة إحصائيًا. عند النظر في زراعات الخلايا ثلاثية الأبعاد، يجب الالتزام بمبادئ الجودة الجيدة.

مبادئ ممارسات التصنيع الجيدة (GMP) ضرورية لترجمة هذه النماذج المتقدمة من البحث إلى التطبيقات السريرية والتجارية. ومع ذلك، تظهر عدة تحديات واعتبارات عند تنفيذ معايير GMP، بما في ذلك توحيد ظروف الثقافة، وقابلية التوسع، ومراقبة الجودة، ومصادر المواد الخام والبيولوجية، والامتثال التنظيمي، وسلامة البيانات، والتوثيق. تتطلب عمليات التصنيع المتوافقة مع GMP تكرارًا عاليًا وتحكمًا في المعلمات الحرجة مثل مصادر الخلايا، ووسائط الثقافة، والمكملات الثقافية، وظروف البيئة. كما ذُكر أعلاه، يمكن أن يكون تحقيق هذا الاتساق تحديًا، نظرًا للتنوع البيولوجي الفطري للخلايا الأولية وحساسية الثقافات ثلاثية الأبعاد للتغيرات الطفيفة في ظروف الثقافة. علاوة على ذلك، يعد تلبية المتطلبات التنظيمية تحديًا رئيسيًا في ترجمة الثقافات الكروية ثلاثية الأبعاد إلى التطبيقات السريرية. تمتلك الهيئات التنظيمية، مثل إدارة الغذاء والدواء (FDA) في الولايات المتحدة والوكالة الأوروبية للأدوية (EMA) في أوروبا، إرشادات محددة لاستخدام العلاجات والمنتجات المعتمدة على الخلايا. إن الامتثال لممارسات التصنيع الجيدة ضروري للتنقل في هذه المسارات التنظيمية والحصول على الموافقة للتجارب السريرية والتسويق.
علاوة على ذلك، تعتبر إمكانية الوصول إلى الأكسجين اعتبارًا حاسمًا في طرق زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد، وتنوعه داخل هذه البيئات يمثل تحديًا كبيرًا في تكرار الظروف الفسيولوجية والحصول على نتائج تجريبية دقيقة. غالبًا ما تواجه الخلايا الموجودة في داخل الهياكل ثلاثية الأبعاد، مثل الكريات، توفرًا محدودًا من الأكسجين بسبب عوامل البيئة الدقيقة (أي، تتطور الكريات الورمية بشكل طبيعي إلى مناطق ناقصة الأكسجين بسبب التوعية غير المنتظمة في الأورام) وحواجز الانتشار (مثل، الخلايا المعبأة بكثافة، المصفوفات خارج الخلية، هياكل الدعم) [153]. مع تكاثر الخلايا وتشكيلها لهياكل ثلاثية الأبعاد، تزداد الحاجة إلى الأكسجين بسبب الحجم الأكبر الذي يجب أن يقطعه الأكسجين. يصبح انتشار الأكسجين من وسط الزراعة المحيط معوقًا بشكل متزايد مع زيادة المسافة من سطح الزراعة إلى داخل الهيكل ثلاثي الأبعاد. وهذا يؤدي إلى تدرج في الأكسجين، حيث تمتلك الخلايا القريبة من المحيط كمية كافية من الأكسجين، ولكن تلك الموجودة في القلب تواجه نقصًا في الأكسجين، مما يؤدي إلى نقص الأكسجين. غالبًا ما تظهر خلايا القلب الناقصة الأكسجين تعبيرًا جينيًا متغيرًا، وتكاثرًا منخفضًا، وتغيرات في المسارات الأيضية عندما تدخل في حالة سكون وتتوقف عن الدورة عندما تُحرم من الأكسجين والمواد الغذائية. تجعل هذه النشاطات المنخفضة منها مقاومة نسبيًا للأدوية الساكنة التي تستهدف بشكل أساسي الخلايا التي تنقسم بنشاط، مما يؤدي إلى زيادة مقاومة الأدوية، كما هو الحال غالبًا في الأورام الصلبة [154، 155]. يمكن استخدام المجهر الضوئي المجهري لرؤية الخلايا الساكنة عن طريق وسمها بنظير نوكليوزيد، مما يسمح بتحديد كميتها وتمييزها عن الخلايا التي تنقسم بنشاط
الخلايا. يتم تخفيف هذا النظير في الخلايا التي تنقسم بنشاط. ومع ذلك، فإنه يبقى محتفظًا به في خلايا السرطان الساكنة وغير المنقسمة، مما يوفر أداة قيمة لتمييزها عن الخلايا المحيطة التي تنقسم بنشاط [156]. من خلال الاستفادة من هذه الخاصية للكريات ثلاثية الأبعاد، فإنها تقدم طرقًا محتملة لتطوير علاجات جديدة تستهدف خلايا السرطان المقاومة للأدوية الساكنة المضادة للسرطان. قام وينزل وآخرون [157] بزراعة خلايا سرطان الثدي T47D في زراعات ثلاثية الأبعاد واستخدموا التصوير المجهري التداخلي لتمييز الخلايا داخل القلب الداخلي عن تلك الموجودة في القلب الخارجي المحيط. أظهرت الخلايا في القلب الداخلي، التي تعاني من وصول محدود إلى الأكسجين والمواد الغذائية، نشاطًا أيضيًا منخفضًا مقارنة بنظيراتها في القلب الخارجي. من خلال فحص مكتبات الجزيئات الصغيرة ضد هذه الزراعات ثلاثية الأبعاد، حدد المؤلفون تسعة مركبات تستهدف وتقتل خلايا سرطان القلب الداخلي بشكل انتقائي بينما تترك الخلايا الخارجية الأكثر انقسامًا. أثرت الأدوية المحددة بشكل أساسي على مسار سلسلة التنفس، مما يتماشى مع النشاط الأيضي المتغير للخلايا التي تعاني من نقص الأكسجين والتي تنتقل من الأيض الهوائي إلى الأيض اللاهوائي. وبالتالي، فإن المركبات التي تستهدف خلايا السرطان الساكنة بشكل انتقائي حسنت بشكل كبير من فعالية الأدوية الساكنة المضادة للسرطان المستخدمة عادة. بدلاً من ذلك، يمكن استخدام أجهزة ميكروفلويديك التي تمكن من إنشاء تدرجات أكسجين محكومة داخل الزراعات، ودمج مواد قابلة لاختراق الأكسجين، وإضافة مركبات تطلق الأكسجين لتوفير توزيع أكثر تجانسًا للأكسجين في المختبر. ومع ذلك، من المهم الاعتراف بأن هذه الاستراتيجيات قد لا تعيد إنتاج تعقيد تدرجات الأكسجين في الأنسجة الحقيقية بالكامل [158]. قدم بويز وآخرون [159] تصميمًا وتوصيفًا لجهاز معياري استغل خصائص نفاذية الغاز من السيليكون لإنشاء تدرجات أكسجين داخل المناطق المحتوية على خلايا. تم بناء الجهاز المجهري عن طريق تكديس صفائح الأكريليك المطبوعة بالليزر وصفائح مطاط السيليكون، حيث لم يسهل السيليكون فقط تشكيل تدرجات الأكسجين ولكن أيضًا عمل كحاجز، يفصل الغازات المتدفقة عن وسط زراعة الخلايا لمنع التبخر أو تكوين الفقاعات خلال فترات الحضانة الممتدة. قدمت مكونات الأكريليك استقرارًا هيكليًا، مما يضمن بيئة زراعة معقمة. باستخدام أفلام استشعار الأكسجين، يمكن تحقيق تدرجات ذات نطاقات وزوايا مختلفة في الجهاز المجهري عن طريق ضبط تركيبة الغازات المتدفقة عبر عناصر السيليكون. علاوة على ذلك، أظهرت تجربة قائمة على الخلايا أن الاستجابات الخلوية لنقص الأكسجين كانت متناسبة مباشرة مع توتر الأكسجين الذي تم إنشاؤه داخل النظام، مما يثبت الفعالية.

تظهر تحديات عملية أخرى في الزراعة ثلاثية الأبعاد من تعقيد استخراج الخلايا من الهياكل ثلاثية الأبعاد المعتمدة على المواد الحيوية. عادةً، يتضمن بناء
دعائم الهيدروجيل القابلة للتحلل دمج روابط قابلة للكسر و/أو مكونات قابلة للتفكيك في الهيكل البوليمري أو دمج مكونات ECM القابلة للتحلل بشكل طبيعي مثل حمض الهيالورونيك، واللامينين، والفبرونيكتين، والكولاجين [160]. ومع ذلك، فإن تقنيات التفكيك التقليدية تثبت أنها غير فعالة بشكل ملحوظ وتتأثر بالتعقيدات الهيكلية الفطرية لنظام الزراعة. يعتبر التحلل الإنزيمي، على سبيل المثال بواسطة الكولاجيناز، طريقة مستخدمة على نطاق واسع لاسترجاع الخلايا من دعائم زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد المعتمدة على الكولاجين. يتم اختيار الإنزيم ليتناسب مع نوع الكولاجين المحدد في الدعامة. خلال الحضانة، يقوم الكولاجيناز بتفكيك ألياف الكولاجين إنزيميًا، مما يحرر الخلايا التي كانت مدمجة أو ملتصقة بهذه الألياف. بمجرد أن يتم تفكيك الكولاجين، يتم جمع الخلايا كتعليق في وسط الزراعة [161]. عادةً ما يتم إجراء تقييمات لسلامة الخلايا ووظيفتها للحفاظ على صحة الخلايا ووظيفتها. بينما يعتبر استخدام التحلل الإنزيمي لدعائم زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد شائعًا، إلا أنه يظل نهجًا معقدًا مرتبطًا بعدة قيود. من المهم عدم التقليل من تأثير الكولاجيناز أو الإنزيمات الأخرى على سلامة الخلايا ووظيفتها. إن تحسين وقت الهضم وتركيز الإنزيم بعناية أمر ضروري لتحقيق توازن بين تفكيك الدعامة بكفاءة والحفاظ على جودة الخلايا [162]. بالإضافة إلى ذلك، فإن التغيرات المحتملة في نمط الخلايا أثناء الهضم تمثل مصدر قلق كبير، مما يتطلب مراقبة دقيقة لمعايير الهضم. في الدعائم ثلاثية الأبعاد المعقدة، وخاصة تلك ذات الهياكل المعقدة، قد يكون التحلل الإنزيمي أقل فعالية، مما يدفع الباحثين لاستكشاف طرق استرجاع بديلة أو تعديل عملية الهضم. كما تلعب الاعتبارات الأخلاقية دورًا، خاصة عند العمل مع خلايا مشتقة من البشر أو الحيوانات، مما يثير القلق بشأن استخدام إنزيمات مثل الكولاجيناز. الالتزام بالإرشادات الأخلاقية واللوائح المؤسسية أمر حاسم للحفاظ على ممارسات البحث المسؤولة والأخلاقية.

لذا، تم توجيه جهود بحثية واسعة نحو تطوير تقنيات محسنة لاسترجاع الخلايا من زراعات الخلايا ثلاثية الأبعاد المعتمدة على الدعائم دون المساس بسلامة الخلايا. على سبيل المثال، طور كيكاليوا وآخرون [163] خط أنابيب مبتكر لاستخراج الحويصلات خارج الخلوية (EVs) من الكريات السرطانية ثلاثية الأبعاد باستخدام دعائم السليلوز النانوي (NFC) كشبكة لزراعة الخلايا. شمل هذا الخط أنبوبين متميزين: طريقة دفعة محسنة لتحقيق أقصى عائد من الحويصلات في نهاية فترة الزراعة، وطريقة حصاد مصممة لتسهيل جمع الحويصلات حسب الزمن، مما يسمح بدمج تحليل الحويصلات مع تطوير الكريات. قدمت كلا الطريقتين إعدادًا مريحًا، وتنفيذًا سريعًا، وأنتجت بشكل موثوق عددًا كبيرًا من الحويصلات الكهربائية (EVs). مقارنةً بزراعات الكريات ثلاثية الأبعاد الخالية من الدعائم على تفضيل منخفض للغاية
تظهر الطريقة المعتمدة على NFC إنتاجًا مشابهًا للـ EV لكل خلية، مما يوفر قابلية التوسع، ويحافظ على نمط الخلية وسلامتها، ويزيد من بساطة التشغيل، مما يؤدي في النهاية إلى زيادة إنتاجية الـ EV. تعتمد طريقة أخرى على التحلل الذي تسببه الخلايا للهياكل الهلامية، حيث تقوم الخلايا الحية بتفكيك الهيكل الهلامي بنشاط. تعتبر هذه الآلية التحليلية ذات صلة خاصة في هندسة الأنسجة والطب التجديدي. عندما يتم احتواء الخلايا داخل هيكل هلامي، يمكنها إفراز إنزيمات وجزيئات أخرى تتفاعل مع مكوناته، مما يؤدي إلى تحلله التدريجي. مع تكاثر الخلايا وإعادة تشكيل بيئتها الدقيقة، قد تقوم بتغيير خصائص الهيكل وفي النهاية تسهل تحلله. تسمح هذه العملية الديناميكية بالإفراج المنظم عن الخلايا وعوامل النمو وغيرها من المواد الحيوية النشطة داخل الهلام، مما يجعلها تقنية قيمة لتطبيقات توصيل الأدوية.

بينما تعتبر الدعائم البوليمرية القابلة للتحلل الاصطناعي مهمة لتطوير نماذج زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد، فإن هناك قلقًا بشأن توافقها الحيوي في المختبر وفي الجسم يتعلق بوجود عناصر ومواد كيميائية قد تكون سامة تم استخدامها خلال عملية بلمرة الهلاميات الاصطناعية أو ربط سلاسل الهلاميات البوليمرية الطبيعية، خاصة عندما تكون نسبة تحويل التفاعل أقل من . هذه المواد تطلق مونومرات غير متفاعلة، ومثبتات، ومبادرات، ومذيبات عضوية، ومستحلبات. هذه العناصر أساسية في عملية تحضير الهيدروجيل ولكن قد تشكل ضرراً إذا تسربت إلى الخلايا أو الأنسجة المزروعة [165، 166]. على سبيل المثال، تم ملاحظة أن مبادرات الضوء الحرة المستخدمة على نطاق واسع (مثل Irgacure) تقلل من حيوية الخلايا، حتى عند تركيزات منخفضة [167، 168]. وبالتالي، فإن هياكل الهيدروجيل المخصصة لزرع الخلايا في الثقافات ثلاثية الأبعاد تتطلب عادةً التنقية (مثل عن طريق الغسيل أو الغسيل بالمذيبات) لإزالة أي مواد كيميائية خطرة متبقية قبل الزرع. ومع ذلك، في بعض السيناريوهات، تكون تنقية هياكل الهيدروجيل أكثر تحدياً أو غير ممكنة، خاصة عند التعامل مع الهيدروجيل الناتج من التجلط في الموقع. في مثل هذه الحالات، يتم إدخال الخلايا إلى المواد المتفاعلة اللازمة لتخليق الهيدروجيل بينما لا تزال في محلول ما قبل البوليمر. نتيجة لذلك، عند استخدام تقنيات التجلط في الموقع، يجب توخي أقصى درجات الحذر لضمان أن جميع المكونات غير سامة وآمنة.

علاوة على ذلك، فإن تحديًا آخر مرتبط بزراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد هو صعوبة تصنيف استجابة الخلايا للأدوية والعوامل العلاجية الأخرى. في زراعة الخلايا ثنائية الأبعاد، يتم عادةً تحليل الخلايا باستخدام مجموعة من الاختبارات القياسية التي تم تأسيسها بشكل جيد وسهلة التفسير. ومع ذلك، في زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد، غالبًا ما يكون هناك نقص في مثل هذه الاختبارات والبروتوكولات القياسية. وأبرز فنج وإجلين [169] أن التركيب المعقد للزراعات، ووظيفتها، وهندستها المعمارية تعيق تطبيق
بعض الفحوصات البيوكيميائية المتطورة جيدًا لأنظمة ثلاثية الأبعاد. تميل الخلايا إلى التجمع في كتل كثيفة و/أو كبيرة مع مرور الوقت، حتى في الدعائم المسامية الكبيرة، مما يسبب قيودًا في الانتشار عند إجراء فحوصات التوصيف في الموقع. تنشأ القيود بسبب عرقلة الانتشار وحصر الغازات والمواد المغذية والنفايات والمواد الكيميائية داخل النظام، بالإضافة إلى التحديات عند قياس وتطبيع البيانات بين الثقافات البيولوجية المقلدة المختلفة. على سبيل المثال، أظهر توتي وآخرون أن تقييم ثقافة خلايا سرطان البنكرياس في دعائم من رغوة البولي يوريثان المسامية الكبيرة باستخدام اختبار 3-(4،5-ثنائي ميثيل ثيازول-2-يل)-5-(3-كربوكسي ميثوكسي فينيل)-2-(4-سلفوفينيل)-2H-تيترازوليوم (MTS) أظهر اختلافات طفيفة بين ظروف الدعائم المختلفة (مثل طلاءات ECM على الدعائم). ومع ذلك، كشفت عملية القطع، والتلوين المناعي، والتصوير عن تمايز أوضح في تكاثر الخلايا، والشكل، والنمو بين الظروف. وبالمثل، فشل اختبار 3-(4،5-ثنائي ميثيل ثيازول-2-يل)-2،5-ثنائي فينيل-2H-تيترازوليوم بروميد (MTT) في التقاط الاختلافات في حيوية خلايا البنكرياس المزروعة في دعائم البولي يوريثان بعد فحص الأدوية والإشعاع، والتي تم إدراكها باستخدام المجهر المتقدم والتصوير. لذلك، من الضروري أن يأخذ الباحثون في الاعتبار بعناية النهج التحليلي المناسب الذي يتماشى مع أهداف دراستهم قبل البدء في تحليل أي ثقافات ثلاثية الأبعاد. كما يجب أن يكونوا على دراية بأن بعض الأساليب الكلاسيكية المعتمدة المستخدمة في الثقافات ثنائية الأبعاد قد لا تكون قابلة للتطبيق مباشرة في البيئات ثلاثية الأبعاد، كما أظهر حمدي وآخرون أنه من غير الممكن استخراج الخلايا من الكتل الكروية لاختبارات تشكيل المستعمرات، والتي تستخدم لتطوير منحنيات البقاء بعد العلاج. وبالتالي، اقترح الباحثون قراءات التوصيف في الموقع، والتي هي جديدة و/أو مختلفة عن بروتوكولات الثقافة ثنائية الأبعاد الحالية.

استخدام خلايا الجذع وعلامات التمايز أمر حاسم لتوصيف ومراقبة التركيب الخلوي وحالة التمايز داخل الكريات ثلاثية الأبعاد. يمكن أن تساعد هذه العلامات الباحثين في تحقيق أهداف ونتائج محددة، مثل تقييم إمكانيات تمايز خلايا الجذع، وتتبع تقدم التمايز، ودراسة ديناميات تجمعات الخلايا في الكريات [176، 177]. ومع ذلك، فإن استخدام مثل هذه العلامات في ثقافات الكريات ثلاثية الأبعاد يطرح تحديات معينة تحتاج إلى معالجة للحصول على نتائج دقيقة وذات مغزى. أحد التحديات الرئيسية هو تباين خلايا الجذع داخل الكريات. غالبًا ما تتكون الكريات من مزيج من خلايا الجذع والخلايا المتمايزة، لذا قد لا تحدد علامات خلايا الجذع بشكل حصري وتفصل تجمع خلايا الجذع، مما يؤدي إلى صعوبة في دراسة السلوك المحدد لخلايا الجذع داخل الكرية. تحدٍ آخر هو التباين في تعبير علامات خلايا الجذع. يمكن أن يتقلب تعبير هذه العلامات.
مكانيًا وزمانيًا داخل الكُرَيَّات، مما يجعل من الصعب تتبع وتفسير التغيرات في تعبير العلامات على مر الزمن. بالإضافة إلى ذلك، في الكُرَيَّات الأكبر، قد لا تخترق علامات الخلايا الجذعية بشكل فعال قلب الكُرَيَّة، مما يحد من القدرة على تقييم مجموعة الخلايا الجذعية في المناطق الداخلية. يمكن للباحثين استخدام عدة استراتيجيات للتغلب على هذه التحديات واستخدام علامات الخلايا الجذعية بفعالية في ثقافات الكُرَيَّات ثلاثية الأبعاد. تتضمن طريقة بديلة دمج الخلايا الجذعية وعلامات خلوية أخرى لفهم أفضل للتكوين الخلوي داخل الكُرَيَّة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة متعددة العلامات في التخفيف من المشكلات المتعلقة بتنوع العلامات. علاوة على ذلك، يمكن أن توفر تقنيات التصوير الحي، مثل المجهر الضوئي المجهري، رؤى في الوقت الحقيقي حول ديناميات تعبير العلامات داخل الكُرَيَّات. يعد التحكم في حجم الكُرَيَّات استراتيجية أخرى لتعزيز اختراق العلامات والوصول إلى الخلايا الداخلية. يسمح استخدام تقنيات الميكروفلويديك بتنظيم دقيق لحجم الكُرَيَّات، مما يضمن اختراقًا فعالًا للعلامات في جميع مناطق الكُرَيَّة. بالإضافة إلى ذلك، تمكّن طرق تحليل الخلايا الفردية، مثل تسلسل RNA للخلايا الفردية والتحليل البروتيني، من توصيف الخلايا الفردية داخل الكُرَيَّات. يمكن أن تحدد هذه الطريقة أنماط التعبير الجيني أو البروتيني الفريدة وتسلط الضوء على سلوك مجموعات الخلايا الجذعية. استراتيجية قيمة أخرى هي إنشاء كُرَيَّات مع مراسلين جينيين للخلايا الجذعية، والتي تنتج إشارات فلورية أو مضيئة في الخلايا الجذعية، مما يجعلها أكثر وضوحًا وقابلية للتتبع. أخيرًا، يمكن أن يساعد تقليد مكان الخلايا الجذعية أو البيئة الدقيقة ضمن ظروف الثقافة ثلاثية الأبعاد في الحفاظ على خصائص الخلايا الجذعية وتعبير العلامات في الكُرَيَّات.

على الرغم من أن التصوير يوفر معلومات قيمة حول توزيع الخلايا وارتباطها، إلا أن القياسات الكمية باستخدام تحليل الصور في الثقافات ثلاثية الأبعاد غالبًا ما تفتقر إلى الاتساق في عدد الخلايا عبر العينات. تكمن التحديات في عدم القدرة على تصور مجموعة الخلايا بالكامل، مما يؤدي إلى صعوبات في الحصول على بيانات دقيقة وموثوقة من الثقافة بأكملها. ويرجع ذلك إلى ضعف انتشار العلامات الفلورية، ويرجع ذلك أساسًا إلى حجمها الكبير، الذي تحكمه التباين الفطري في الثقافات ثلاثية الأبعاد. إحدى الحلول المحتملة هي قياس عدد الخلايا من المقاطع العرضية القابلة للتصوير؛ ومع ذلك، أشار سيرينكو وآخرون إلى أن تداخلات الضوء وقيود انتشار الصبغة أدت إلى نتائج غير موثوقة، حيث اختلف عدد الخلايا المعدود بشكل كبير عن عدد الخلايا المزروعة. بالإضافة إلى ذلك، يجب أيضًا مراعاة القيود التقنية مثل التكاليف المرتفعة وقابلية التوسع المحدودة. قد تتطلب أنظمة الثقافة ثلاثية الأبعاد تكاليف أعلى مقارنة بأنظمة الثقافة ثنائية الأبعاد، وذلك بسبب الحاجة إلى معدات ومواد وخبرات متخصصة.

183]. بالمثل، يمكن أن يكون توسيع أنظمة الثقافة ثلاثية الأبعاد للاستخدامات الصناعية أو السريرية تحديًا بسبب التعقيد المتزايد لبيئة الثقافة والحاجة إلى معدات متخصصة [184]. يمكن أن يحد هذا من إمكانية الاعتماد الواسع لتقنيات الثقافة ثلاثية الأبعاد في هذه الإعدادات.
لقد تم إحراز تقدم كبير في إنشاء هياكل ديناميكية يمكن أن تستجيب أو توجه الخلايا المقيمة. على سبيل المثال، أثبتت الهلاميات الحرارية مثل بولي-نيسوبروبيل أكريلاميد (pNIPAm) فعاليتها في جمع تجمعات الخلايا. علاوة على ذلك، ساهم دمج تقنيات المقياس المجهري لزراعة الخلايا مع تصاميم الهلاميات القابلة للتكيف في تسهيل العديد من التحقيقات. تشمل هذه التحقيقات دراسة هجرة الخلايا داخل الهلاميات الميكروفلويدية وإقامة منصات فحص عالية الإنتاجية لاستكشاف التفاعلات بين الخلايا والمواد. ومن الجدير بالذكر أن مجال الميكانيوبولوجيا مهتم بمجموعة متنوعة من الهلاميات الديناميكية ميكانيكياً التي يمكن أن تتصلب أو تطرى أو تنتقل بشكل عكسي بين هذه الحالات لدراسة استجابات الخلايا. توفر هذه الركائز الديناميكية وسيلة لفحص كيفية تأثير الإشارات الميكانيكية على سلوك الخلايا، مشابهة لدراسة العوامل القابلة للذوبان على مدى عقود. كما تتقدم التقنيات لإدخال التباين وأنواع الخلايا المتعددة داخل الهياكل ثلاثية الأبعاد. يشمل ذلك طرقاً مبتكرة حيث تعمل الهلاميات كحبر حيوي لطباعة الخلايا، إما طبقة تلو الأخرى من قاعدة ثنائية الأبعاد أو مباشرة داخل فضاء ثلاثي الأبعاد محاط بهلام آخر. مع تقدم هذه المنصات، من المتوقع أن تصبح أكثر سهولة في الوصول. في هذه الأثناء، يبقى من الضروري الحفاظ على حوار مفتوح وتعاوني بين علماء الخلايا وعلماء المواد والمهندسين. ستضمن هذه الجهود التعاونية أن تكون الجيل القادم من أنظمة زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد المعتمدة على الهياكل مجهزة جيدًا لمواجهة التحديات الكبيرة التي تطرحها التعقيدات البيولوجية والتقنية المتزايدة.

في الختام، ظهرت زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد المعتمدة على الهياكل كأداة قيمة في أبحاث السرطان، حيث توفر بيئة أكثر ملاءمة من الناحية الفسيولوجية لدراسة سلوك الأورام، استجابات الأدوية، والتفاعلات بين خلايا السرطان والبيئة المحيطة. تم استكشاف مواد هياكل متنوعة، بما في ذلك البوليمرات، الأنسجة المنزوعة الخلايا، الهلاميات، والهجائن مع الميكروفلويديات، لإنشاء نماذج ثلاثية الأبعاد معقدة ومحاكاة حيوية. توفر الهياكل المعتمدة على البوليمرات خصائص ميكانيكية قابلة للتعديل وسهلة التصنيع نسبيًا، مما يجعلها متعددة الاستخدامات لزراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد. يمكن أن يؤثر اختيار البوليمرات على سلوك الخلايا، التكاثر، والهجرة، مما يسمح للباحثين بدراسة تقدم السرطان والانتقال في سياق أكثر واقعية. بالإضافة إلى ذلك، فإن دمج الجزيئات النشطة حيويًا في هياكل البوليمر
يمكن أن تمكّن الإفراج المنظم عن الأدوية وعوامل النمو، مما يسهل فحص الأدوية وتطوير العلاجات المستهدفة. علاوة على ذلك، توفر الهيدروجيل توافقًا حيويًا عاليًا ويمكن تفعيله بإشارات حيوية لتوجيه سلوك الخلايا وتكوين الأنسجة. في أبحاث السرطان، توفر الهيدروجيل منصة للتحقيق في تأثير الإشارات الميكانيكية على نمو الورم، وتسلل خلايا المناعة، وتكوين الأوعية الدموية. بالإضافة إلى ذلك، فإن سهولة دمج أنواع خلايا متعددة داخل الهيدروجيل يمكّن من دراسة تفاعلات الورم مع النسيج المحيط. وبالمثل، تحتفظ الدعائم النسيجية غير الخلوية بتكوين ECM الأصلي، والتضاريس، والخصائص الميكانيكية، مما يحاكي عن كثب البيئة الدقيقة الطبيعية للورم. نتيجة لذلك، يمكن أن تظهر خلايا السرطان المزروعة في الدعائم النسيجية غير الخلوية سلوكيات ورمية أكثر دقة، بما في ذلك الغزو وتكوين الأوعية. علاوة على ذلك، يمكن أن تُشتق هذه الدعائم من أنسجة محددة للمرضى، مما يمكّن من اتباع نهج الطب الشخصي ويحسن من قابلية التنبؤ باستجابة الأدوية. أخيرًا، توفر الدعائم الهجينة التي تدمج قنوات ميكروفلويديك مزايا فريدة لأبحاث السرطان. من خلال دمج زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد مع الميكروفلويديك، يمكن للباحثين دراسة تكوين الأوعية الدموية في الورم، والانتقال، واختراق الأدوية بطريقة أكثر ملاءمة فسيولوجيًا. علاوة على ذلك، يمكن أن تسهل الميكروفلويديك الفحص عالي الإنتاجية للأدوية المضادة للسرطان، مما يمكّن من اختبار سريع وفعال من حيث التكلفة للعلاجات المحتملة.

يود المؤلفون أن يعبروا عن شكرهم للدعم المالي من منح البحث من كلية الجامعة الأمريكية في الشارقة، ومؤسسة الجليلة [AJF 2015555]، ومؤسسة القاسمي، ولجنة أصدقاء المرضى – الشارقة، ومعهد بحوث علوم الحياة والهندسة الحيوية [BBRI18-CEN-11]، وبرنامج التمويل المشترك لدول مجلس التعاون الخليجي [IRF17-003]، وبرنامج تكامل [P OC-00028-18]، وجوائز الابتكار التكنولوجي الرائدة في الرعاية الصحية، وجائزة الشيخ حمدان للعلوم الطبية [MRG-57-2019-2020]، وكرسي دانا غاز الممول للهندسة الكيميائية. كما نود أن نعبر عن شكرنا لتمويل الطلاب من برنامج الدكتوراه في علوم المواد والهندسة في AUS.

قام WHA بصياغة المخطوطة. قام GAH و WGP بمراجعة وتحرير المخطوطة. قرأ جميع المؤلفين ووافقوا على النسخة النهائية.

غير قابل للتطبيق.

يعلن المؤلفون عدم وجود أي تضارب في المصالح.

برنامج الدكتوراه في علوم المواد والهندسة، كلية الآداب والعلوم، الجامعة الأمريكية في الشارقة، ص.ب. 26666، الشارقة، الإمارات العربية المتحدة. قسم الهندسة الكيميائية والبيولوجية، كلية الهندسة، الجامعة الأمريكية في الشارقة، صندوق بريد 26666، الشارقة، الإمارات العربية المتحدة. قسم الهندسة الكيميائية، جامعة بريغهام يونغ، بروفو، يوتا 84602، الولايات المتحدة الأمريكية.

تاريخ الاستلام: 3 أغسطس 2023 تاريخ القبول: 4 يناير 2024
نُشر على الإنترنت: 14 يناير 2024

2D- and 3D-culture models as drug-testing platforms in breast cancer. Oncol Rep. 2015;33(4):1837-43.
26. Loessner D, Stok KS, Lutolf MP, Hutmacher DW, Clements JA, Rizzi SC. Bioengineered 3D platform to explore cell-ECM interactions and drug resistance of epithelial ovarian cancer cells. Biomaterials. 2010;31(32):8494-506.
27. Zhou CH, Yang SF, Li PQ. Human lung cancer cell line SPC-A1 contains cells with characteristics of cancer stem cells. Neoplasma. 2012;59(6):685-92.
28. Gamerith G, Rainer J, Huber JM, Hackl H, Trajanoski Z, Koeck S, Lorenz E, Kern J, Kofler R, Kelm JM, Zwierzina H, Amann A, Gamerith G, Rainer J, Huber JM, HackI H, Trajanoski Z, Koeck S, Lorenz E, Kern J, Kofler R, Kelm JM, Zwierzina H, Amann A. 3D-cultivation of NSCLC cell lines induce gene expression alterations of key cancer-associated pathways and mimic in-vivo conditions. Oncotarget. 2017;8(68):112647-61.
29. Jiang R, Huang J, Sun X, Chu X, Wang F, Zhou J, Fan Q, Pang L. Construction of in vitro 3-D model for lung cancer-cell metastasis study. BMC Cancer. 2022;22(1):1-9. https://doi.org/10.1186/s12885-022-09546-9.
30. Chong YK, Toh TB, Zaiden N, Poonepalli A, Leong SH, Ong CEL, Yu Y, Tan PB, See SJ, Ng WH, Ng I, Hande MP, Kon OL, Ang BT, Tang C. Cryopreservation of neurospheres derived from human glioblastoma multiforme. Stem Cells. 2009;27(1):29.
31. Panchalingam K, Paramchuk W, Hothi P, Shah N, Hood L, Foltz G, Behie LA, Panchalingam K, Paramchuk W, Hothi P, Shah N, Hood L, Foltz G, Behie LA. Large-scale production of human glioblastoma-derived cancer stem cell tissue in suspension bioreactors to facilitate the development of novel oncolytic therapeutics. Cancer Stem Cells-The Cutting Edge. 2011;475-502.
32. Sutherland RM, Inch WR, McCredie JA, Kruuv J. A multi-component radiation survival curve using an in vitro tumour model. Int J Radiat Biol Relat Stud Phys Chem Med. 1970;18(5):491-5.
33. Youn BS, Sen A, Behie LA, Girgis-Gabardo A, Hassell JA. Scale-up of breast cancer stem cell aggregate cultures to suspension bioreactors. Biotechnol Prog. 2006;22(3):801-10. https://doi.org/10.1021/bp050 430z.
34. Kuo CT, Chiang CL, Chang CH, Liu HK, Huang GS, Huang RYJ, Lee H, Huang CS, Wo AM. Modeling of cancer metastasis and drug resistance via biomimetic nano-cilia and microfluidics. Biomaterials. 2014;35(5):1562-71.
35. Ware MJ, Keshishian V, Law JJ, Ho JC, Favela CA, Rees P, Smith B, Mohammad S, Hwang RF, Rajapakshe K, Coarfa C, Huang S, Edwards DP, Corr SJ, Godin B, Curley SA. Generation of an in vitro 3D PDAC stroma rich spheroid model. Biomaterials. 2016;108:129-42.
36. Rice AJ, Cortes E, Lachowski D, Cheung BCH, Karim SA, Morton JP, Del Río Hernández A. Matrix stiffness induces epithelial-mesenchymal transition and promotes chemoresistance in pancreatic cancer cells. Oncogenesis. 2017;6(7):e352.
37. Kuo CT, Chiang CL, Huang RYJ, Lee H, Wo AM. Configurable 2D and 3D spheroid tissue cultures on bioengineered surfaces with acquisition of epithelial-mesenchymal transition characteristics. NPG Asia Mater. 2012;4(9):e27.
38. Michy T, Massias T, Bernard C, Vanwonterghem L, Henry M, Guidetti M, Royal G, Coll JL, Texier I, Josserand V, Hurbin A. Verteporfin-loaded lipid nanoparticles improve ovarian cancer photodynamic therapy in vitro and in vivo. Cancers. 2019;11(11):1760.
39. Hirst J, Pathak HB, Hyter S, Pessetto ZY, Ly T, Graw S, Koestler DC, Krieg AJ, Roby KF, Godwin AK. Licofelone enhances the efficacy of paclitaxel in ovarian cancer by reversing drug resistance and tumor stem-like properties. Cancer Res. 2018;78(15):4370-85. https://doi.org/10.1158/ 0008-5472.CAN-17-3993.
40. Goodwin TJ, Milburn Jessup J, Wolf DA. Morphologic differentiation of colon carcinoma cell lines HT-29 and HT-29KM in rotating-wall vessels. In Vitro Cell Dev Biol. 1992;28A(1):47-60.
41. Dainiak MB, Savina IN, Musolino I, Kumar A, Mattiasson B, Galaev IY. Biomimetic macroporous hydrogel scaffolds in a high-throughput screening format for cell-based assays. Biotechnol Prog. 2008;24(6):1373-83.
42. Chandrasekaran S, Deng H, Fang Y. PTEN deletion potentiates invasion of colorectal cancer spheroidal cells through 3D Matrigel. Integr Biol (Camb). 2015;7(3):324-34.
43. Poornima K, Francis AP, Hoda M, Eladl MA, Subramanian S, Veeraraghavan VP, El-Sherbiny M, Asseri SM, Hussamuldin ABA, Surapaneni KM, Mony U, Rajagopalan R. Implications of three-dimensional cell culture in cancer therapeutic research. Front Oncol. 2022;12.
44. Gunti S, Hoke ATK, Vu KP, London NR. Organoid and spheroid tumor models: techniques and applications. Cancers (Basel). 2021;13(4):1-18.
45. Lovitt CJ, Shelper TB, Avery VM. Advanced cell culture techniques for cancer drug discovery. Biology. 2014;3(2):345-67.
46. Zeilinger K, Freyer N, Damm G, Seehofer D, Knöspel F. Cell sources for in vitro human liver cell culture models. Exp Biol Med (Maywood). 2016;241(15):1684-98.
47. Eglen RM, Reisine T. Human iPS cell-derived patient tissues and 3D cell culture part 2: spheroids, organoids, and disease modeling. SLAS Technol. 2019;24(1):18-27.
48. Su J, Zhang L, Zhang W, Choi DS, Wen J, Jiang B, Chang CC, Zhou X. Targeting the biophysical properties of the myeloma initiating cell niches: a pharmaceutical synergism analysis using multi-scale agent-based modeling. PLoS ONE. 2014;9(1):e85059.
49. Valyi-Nagy K, Kormos B, Ali M, Shukla D, Valyi-Nagy T. Stem cell marker CD271 is expressed by vasculogenic mimicry-forming uveal melanoma cells in three-dimensional cultures. Mol Vis. 2012;18:588.
50. Lombardo Y, Filipovicá A, Molyneux G, Periyasamy M, Giamas G, Hu Y, Trivedi PS, Wang J, Yaguë E, Michel L, Coombes RC. Nicastrin regulates breast cancer stem cell properties and tumor growth in vitro and in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 2012;109(41):16558-63.
51. Sgodda M, Dai Z, Zweigerdt R, Sharma AD, Ott M, Cantz T. A scalable approach for the generation of human pluripotent stem cell-derived hepatic organoids with sensitive hepatotoxicity features. Stem Cells Dev. 2017;26(20):1490-504.
52. Meier F, Freyer N, Brzeszczynska J, Knöspel F, Armstrong L, Lako M, Greuel S, Damm G, Ludwig-Schwellinger E, Deschl U, Ross JA, Beilmann M, Zeilinger K. Hepatic differentiation of human iPSCs in different 3D models: a comparative study. Int J Mol Med. 2017;40(6):1759.
53. Weng KC, Kurokawa YK, Hajek BS, Paladin JA, Shirure VS, George SC. Human induced pluripotent stem-cardiac-endothelial-tumor-on-achip to assess anticancer efficacy and cardiotoxicity. Tissue Eng Part C Methods. 2020;26(1):44-55. https://doi.org/10.1089/ten.tec.2019.0248.
54. Liu S, Fang C, Zhong C, Li J, Xiao Q. Recent advances in pluripotent stem cell-derived cardiac organoids and heart-on-chip applications for studying anti-cancer drug-induced cardiotoxicity. Cell Biol Toxicol. 2023;39:2527.
55. Han R, Sun Q, Wu J, Zheng P, Zhao G. Sodium butyrate upregulates miR203 expression to exert anti-proliferation effect on colorectal cancer cells. Cell Physiol Biochem. 2016;39(5):1919-29.
56. Fontoura JC, Viezzer C, dos Santos FG, Ligabue RA, Weinlich R, Puga RD, Antonow D, Severino P, Bonorino C. Comparison of 2D and 3D cell culture models for cell growth, gene expression and drug resistance. Mater Sci Eng, C. 2020;1(107): 110264.
57. Ingram M, Techy GB, Saroufeem R, Yazan O, Narayan KS, Goodwin TJ, Spaulding GF. Three-dimensional growth patterns of various human tumor cell lines in simulated microgravity of a NASA bioreactor. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 1997;33(6):459-66.
58. Lv D, Yu SC, Ping YF, Wu H, Zhao X, Zhang H, Cui Y, Chen B, Zhang X, Dai J, Bian XW, Yao XH. A three-dimensional collagen scaffold cell culture system for screening anti-glioma therapeutics. Oncotarget. 2016;7(35):56904.
59. Spill F, Reynolds DS, Kamm RD, Zaman MH. Impact of the physical microenvironment on tumor progression and metastasis. Curr Opin Biotechnol. 2016;40:41-8.
60. Ravi M, Paramesh V, Kaviya SR, Anuradha E, Paul Solomon FD. 3D cell culture systems: advantages and applications. J Cell Physiol. 2015;230(1):16-26. https://doi.org/10.1002/jcp.24683.
61. Campuzano S, Pelling AE. Scaffolds for 3D cell culture and cellular agriculture applications derived from non-animal sources. Front Sustain Food Syst. 2019;17(3):38.
62. Hippler M, Lemma ED, Bertels S, Blasco E, Barner-Kowollik C, Wegener M, Bastmeyer M. 3D scaffolds to study basic cell biology. Adv Mater. 2019. https://doi.org/10.1002/adma.201808110.
63. Cavo M, Delle Cave D, D’Amone E, Gigli G, Lonardo E, del Mercato LL. A synergic approach to enhance long-term culture and manipulation of MiaPaCa-2 pancreatic cancer spheroids. Sci Rep. 2020;10(1).
64. Ware MJ, Colbert K, Keshishian V, Ho J, Corr SJ, Curley SA, Godin B. Generation of homogenous three-dimensional pancreatic cancer cell spheroids using an improved hanging drop technique. Tissue Eng Part C Methods. 2016;22(4):312-21.
65. Foty R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of spheroids. J Vis Exp. 2011;51(51).
66. Timmins NE, Nielsen LK. Generation of multicellular tumor spheroids by the hanging-drop method. Methods Mol Med. 2007;140:141-51.
67. Zhao L, Xiu J, Liu Y, Zhang T, Pan W, Zheng X, Zhang X. A 3D printed hanging drop dripper for tumor spheroids analysis without recovery. Sci Rep. 2019;9(1):1-14.
68. Gao W, Wu D, Wang Y, Wang Z, Zou C, Dai Y, Ng CF, Teoh JYC, Chan FL. Development of a novel and economical agar-based non-adherent three-dimensional culture method for enrichment of cancer stemlike cells. Stem Cell Res Ther. 2018;9(1):243. https://doi.org/10.1186/ s13287-018-0987-x.
69. Madoux F, Tanner A, Vessels M, Willetts L, Hou S, Scampavia L, Spicer TP. A 1536-well 3D viability assay to assess the cytotoxic effect of drugs on spheroids. SLAS Discov. 2017;22(5):516-24.
70. Khawar IA, Park JK, Jung ES, Lee MA, Chang S, Kuh HJ. Three dimensional mixed-cell spheroids mimic stroma-mediated chemoresistance and invasive migration in hepatocellular carcinoma. Neoplasia. 2018;20(8):800-12.
71. Song Y, Kim JS, Choi EK, Kim J, Kim KM, Seo HR, Song Y, Kim JS, Kyung Choi E, Kim J, Mo Kim K, Ran Seo H. TGF- -independent CTGF induction regulates cell adhesion mediated drug resistance by increasing collagen I in HCC. Oncotarget. 2017;8(13):21650-62.
72. Ma L, Li Y, Wu Y, Aazmi A, Zhang B, Zhou H, Yang H. The construction of in vitro tumor models based on 3D bioprinting. Biodes Manuf. 2020;3(3):227-36.
73. Xie M, Gao Q, Fu J, Chen Z, He Y. Bioprinting of novel 3D tumor array chip for drug screening. Biodes Manuf. 2020;3(3):175-88.
74. Datta P, Dey M, Ataie Z, Unutmaz D, Ozbolat IT. 3D bioprinting for reconstituting the cancer microenvironment. NPJ Precis Oncol. 2020;4(1).
75. LaBarge W, Morales A, Pretorius D, Kahn-Krell AM, Kannappan R, Zhang J. Scaffold-free bioprinter utilizing layer-by-layer printing of cellular spheroids. Micromachines (Basel). 2019;10(9):570.
76. Khoshnood N, Zamanian A. A comprehensive review on scaffold-free bioinks for bioprinting. Bioprinting. 2020;1(19): e00088.
77. Norotte C, Marga FS, Niklason LE, Forgacs G. Scaffold-free vascular tissue engineering using bioprinting. Biomaterials. 2009;30(30):5910-7.
78. Anil-Inevi M, Delikoyun K, Mese G, Tekin HC, Ozcivici E. Magnetic levitation assisted biofabrication, culture, and manipulation of 3D cellular structures using a ring magnet based setup. Biotechnol Bioeng. 2021;118(12):4771-85.
79. Anil-Inevi M, Yaman S, Yildiz AA, Mese G, Yalcin-Ozuysal O, Tekin HC, Ozcivici E. Biofabrication of in situ self assembled 3D cell cultures in a weightlessness environment generated using magnetic levitation. Sci Rep. 2018;8(1).
80. Türker E, Demirçak N, Arslan-Yildiz A. Correction: scaffold-free threedimensional cell culturing using magnetic levitation. Biomater Sci. 2018;6(7):1996.
81. Haisler WL, Timm DM, Gage JA, Tseng H, Killian TC, Souza GR. Three-dimensional cell culturing by magnetic levitation. Nat Protoc. 2013;8(10):1940-9.
82. Jaganathan H, Gage J, Leonard F, Srinivasan S, Souza GR, Dave B, Godin B. Three-dimensional in vitro co-culture model of breast tumor using magnetic levitation. Sci Rep. 2014;4.
83. Caleffi JT, Aal MCE, de Gallindo H, Caxali GH, Crulhas BP, Ribeiro AO, Souza GR, Delella FK. Magnetic 3D cell culture: state of the art and current advances. Life Sci. 2021;286:120028.
84. Rogers M, Sobolik T, Schaffer DK, Samson PC, Johnson AC, Owens P, Codreanu SG, Sherrod SD, McLean JA, Wikswo JP, Richmond A. Engineered microfluidic bioreactor for examining the three-dimensional breast tumor microenvironment. Biomicrofluidics. 2018;12(3):34102.
85. Xu Z, Gao Y, Hao Y, Li E, Wang Y, Zhang J, Wang W, Gao Z, Wang Q. Application of a microfluidic chip-based 3D co-culture to test drug sensitivity for individualized treatment of lung cancer. Biomaterials. 2013;34(16):4109-17.
86. Ruedinger F, Lavrentieva A, Blume C, Pepelanova I, Scheper T. Hydrogels for 3D mammalian cell culture: a starting guide for laboratory practice. Appl Microbiol Biotechnol. 2015;99(2):623-36.
87. Zhang N, Milleret V, Thompson-Steckel G, Huang NP, Vörös J, Simona , Ehrbar M. Soft hydrogels featuring in-depth surface density gradients for the simple establishment of 3D tissue models for screening applications. SLAS Discovery. 2017;22(5):635-44.
88. Rijal G, Bathula C, Li W. Application of synthetic polymeric scaffolds in breast cancer 3D tissue cultures and animal tumor models. Int J Biomater. 2017;2017:9.
89. Unnikrishnan K, Thomas LV, Ram Kumar RM. Advancement of scaffoldbased 3D cellular models in cancer tissue engineering: an update. Front Oncol. 2021;11.
90. van Tienderen GS, Conboy J, Muntz I, Willemse J, Tieleman J, Monfils K, Schurink IJ, Demmers JAA, Doukas M, Koenderink GH, van der Laan LJW, Verstegen MMA. Tumor decellularization reveals proteomic and mechanical characteristics of the extracellular matrix of primary liver cancer. Biomater Adv. 2023;1(146): 213289.
91. Li X, Valadez AV, Zuo P, Nie Z. Microfluidic 3D cell culture: potential application for tissue-based bioassays. Bioanalysis. 2012;4(12):1509.
92. Zhong Q, Ding H, Gao B, He Z, Gu Z. Advances of microfluidics in biomedical engineering. Adv Mater Technol. 2019;4(6).
93. Santos SC, Custódio CA, Mano JF. Human protein-based porous scaffolds as platforms for xeno-free 3D cell culture. Adv Healthc Mater. 2022;11(12).
94. Afewerki S, Sheikhi A, Kannan S, Ahadian S, Khademhosseini A. Gelatin-polysaccharide composite scaffolds for 3D cell culture and tissue engineering: Towards natural therapeutics. Bioeng Transl Med. 2018;4(1):96-115.
95. Chen L, Xiao Z, Meng Y, Zhao Y, Han J, Su G, Chen B, Dai J. The enhancement of cancer stem cell properties of MCF-7 cells in 3D collagen scaffolds for modeling of cancer and anti-cancer drugs. Biomaterials. 2012;33(5):1437-44.
96. McGrath J, Panzica L, Ransom R, Withers HG, Gelman IH. Identification of genes regulating breast cancer dormancy in 3D bone endosteal niche cultures. Mol Cancer Res. 2019;17(4):860-9.
97. Arya N, Sardana V, Saxena M, Rangarajan A, Katti DS. Recapitulating tumour microenvironment in chitosan-gelatin three-dimensional scaffolds: an improved in vitro tumour model. J R Soc Interface. 2012;9(77):3288-302.
98. Bassi G, Panseri S, Dozio SM, Sandri M, Campodoni E, Dapporto M, Sprio S, Tampieri A, Montesi M. Scaffold-based 3D cellular models mimicking the heterogeneity of osteosarcoma stem cell niche. Sci Rep. 2020;10(1):22294.
99. Kievit FM, Wang K, Erickson AE, Lan Levengood SK, Ellenbogen RG, Zhang M. Modeling the tumor microenvironment using chitosanalginate scaffolds to control the stem-like state of glioblastoma cells. Biomater Sci. 2016;4(4):610.
100. Li W, Hu X, Wang S, Xing Y, Wang H, Nie Y, Liu T, Song K. Multiple comparisons of three different sources of biomaterials in the application of tumor tissue engineering in vitro and in vivo. Int J Biol Macromol. 2019;130:166-76.
101. Palomeras S, Rabionet M, Ferrer I, Sarrats A, Garcia-Romeu ML, Puig T, Ciurana J. Breast cancer stem cell culture and enrichment using Poly( Caprolactone) scaffolds. Molecules. 2016;21(4):537.
102. Pradhan S, Clary JM, Seliktar D, Lipke EA. A three-dimensional spheroidal cancer model based on PEG-fibrinogen hydrogel microspheres. Biomaterials. 2017;1(115):141-54.
103. Godugu C, Patel AR, Desai U, Andey T, Sams A, Singh M. AlgiMatrix based 3D cell culture system as an in-vitro tumor model for anticancer studies. PLoS ONE. 2013;8(1): e53708. https://doi.org/10.1371/journal. pone. 0053708.
104. Andersen T, Auk-Emblem P, Dornish M. 3D cell culture in alginate hydrogels. Microarrays. 2015;4(2):133-61.
105. Yang Z, Zhao X. A 3D model of ovarian cancer cell lines on peptide nanofiber scaffold to explore the cell-scaffold interaction and chemotherapeutic resistance of anticancer drugs. Int J Nanomed. 2011;6:310.
106. Song H, Cai GH, Liang J, Ao DS, Wang H, Yang ZH. Three-dimensional culture and clinical drug responses of a highly metastatic human ovarian cancer HO-8910PM cells in nanofibrous microenvironments of three hydrogel biomaterials. J Nanobiotechnol. 2020;18(1):90.
107. Suo A, Xu W, Wang Y, Sun T, Ji L, Qian J. Dual-degradable and injectable hyaluronic acid hydrogel mimicking extracellular matrix for 3D culture of breast cancer MCF-7 cells. Carbohydr Polym. 2019;211:336-48.
108. Wang J, Xu W, Qian J, Wang Y, Hou G, Suo A. Photo-crosslinked hyaluronic acid hydrogel as a biomimic extracellular matrix to recapitulate in vivo features of breast cancer cells. Colloids Surf B Biointerfaces. 2022;209:112159.
109. Kim MJ, Chi BH, Yoo JJ, Ju YM, Whang YM, Chang IH. Structure establishment of three-dimensional (3D) cell culture printing model for bladder cancer. PLoS ONE. 2019;14(10):e0223689.
110. Loessner D, Meinert C, Kaemmerer E, Martine LC, Yue K, Levett PA, Klein TJ, Melchels FPW, Khademhosseini A, Hutmacher DW. Functionalization, preparation and use of cell-laden gelatin methacryloyl-based hydrogels as modular tissue culture platforms. Nat Protoc. 2016;11(4):727-46.
111. Arya AD, Hallur PM, Karkisaval AG, Gudipati A, Rajendiran S, Dhavale V, Ramachandran B, Jayaprakash A, Gundiah N, Chaubey A. Gelatin methacrylate hydrogels as biomimetic three-dimensional matrixes for modeling breast cancer invasion and chemoresponse in vitro. ACS Appl Mater Interfaces. 2016;8(34):22005-17.
112. Curtis KJ, Schiavi J, Mc Garrigle MJ, Kumar V, McNamara LM, Niebur GL. Mechanical stimuli and matrix properties modulate cancer spheroid growth in three-dimensional gelatin culture. J R Soc Interface. 2020;17(173):20200568.
113. Cavo M, Fato M, Peñuela L, Beltrame F, Raiteri R, Scaglione S. Microenvironment complexity and matrix stiffness regulate breast cancer cell activity in a 3D in vitro model. Sci Rep. 2016;6(1):1-13.
114. VandenHeuvel SN, Farris HA, Noltensmeyer DA, Roy S, Donehoo DA, Kopetz S, Haricharan S, Walsh AJ, Raghavan S. Decellularized organ biomatrices facilitate quantifiable in vitro 3D cancer metastasis models. Soft Matter. 2022;18(31):5791-806.
115. Landberg G, Fitzpatrick P, Isakson P, Jonasson E, Karlsson J, Larsson E, Svanström A, Rafnsdottir S, Persson E, Gustafsson A, Andersson D, Rosendahl J, Petronis S, Ranji P, Gregersson P, Magnusson Y, Håkansson J, Ståhlberg A. Patient-derived scaffolds uncover breast cancer promoting properties of the microenvironment. Biomaterials. 2020;1(235): 119705.
116. Zhang , Chen , Hong , Hu R, Liu J, Liu C. Decellularized extracellular matrix scaffolds: recent trends and emerging strategies in tissue engineering. Bioact Mater. 2021;10:15-31.
117. D’angelo E, Natarajan D, Sensi F, Ajayi O, Fassan M, Mammano E, Pilati P, Pavan P, Bresolin S, Preziosi M, Miquel R, Zen Y, Chokshi S, Menon K, Heaton N, Spolverato G, Piccoli M, Williams R, Urbani L, Agostini M. Patientderived scaffolds of colorectal cancer metastases as an organotypic 3D model of the liver metastatic microenvironment. Cancers (Basel). 2020;12(2):364.
118. Varinelli L, Guaglio M, Brich S, Zanutto S, Belfiore A, Zanardi F, lannelli F, Oldani A, Costa E, Chighizola M, Lorenc E, Minardi SP, Fortuzzi S, Filugelli M, Garzone G, Pisati F, Vecchi M, Pruneri G, Kusamura S, Baratti D, Cattaneo L, Parazzoli D, Podestà A, Milione M, Deraco M, Pierotti MA, Gariboldi M. Decellularized extracellular matrix as scaffold for cancer organoid cultures of colorectal peritoneal metastases. J Mol Cell Biol. 2023;14(11).
119. Tian X, Werner ME, Roche KC, Hanson AD, Foote HP, Yu SK, Warner SB, Copp JA, Lara H, Wauthier EL, Caster JM, Herring LE, Zhang L, Tepper JE, Hsu DS, Zhang T, Reid LM, Wang AZ. Organ-specific metastases obtained by culturing colorectal cancer cells on tissue-specific decellularized scaffolds. Nat Biomed Eng. 2018;2(6):443-52.
120. Li H, Dai W, Xia X, Wang R, Zhao J, Han L, Mo S, Xiang W, Du L, Zhu G, Xie J, Yu J, Liu N, Huang M, Zhu J, Cai G. Modeling tumor development and metastasis using paired organoids derived from patients with colorectal cancer liver metastases. J Hematol Oncol. 2020;13(1):1-6. https://doi. org/10.1186/s13045-020-00957-4.
121. Parkinson GT, Salerno S, Ranji P, Håkansson J, Bogestål Y, Wettergren Y, Ståhlberg A, Bexe Lindskog E, Landberg G. Patient-derived scaffolds as a model of colorectal cancer. Cancer Med. 2021;10(3):867-82.
122. Jian M, Ren L, Ren L, He G, He G, Lin Q, Lin Q, Tang W, Tang W, Chen Y, Chen J, Chen J, Liu T, Ji M, Ji M, Wei Y, Wei Y, Chang W, Chang W, Xu J, Xu J. A novel patient-derived organoids-based xenografts model for preclinical drug response testing in patients with colorectal liver metastases. J Transl Med. 2020;18(1):1-17. https://doi.org/10.1186/ s12967-020-02407-8.
123. Pinto , Rios , Silva , Neves , Caires HR, Pinto AT, Durães C, Carvalho FA, Cardoso AP, Santos NC, Barrias CC, Nascimento DS, Pinto-do-Ó P, Barbosa MA, Carneiro F, Oliveira MJ. Decellularized human colorectal cancer matrices polarize macrophages towards an anti-inflammatory phenotype promoting cancer cell invasion via CCL18. Biomaterials. 2017;124:211-24.
124. Helal-Neto E, Brandão-Costa RM, Saldanha-Gama R, Ribeiro-Pereira C, Midlej V, Benchimol M, Morandi V, Barja-Fidalgo C. Priming endothelial cells with a melanoma-derived extracellular matrix triggers the activation of avß3/VEGFR2 axis. J Cell Physiol. 2016;231(11):2464-73.
125. Fontana F, Raimondi M, Marzagalli M, Sommariva M, Limonta P, Gagliano N. Epithelial-to-mesenchymal transition markers and CD44 isoforms are differently expressed in 2D and 3D cell cultures of prostate cancer cells. Cells. 2019;8(2):143.
126. Li GN, Livi LL, Gourd CM, Deweerd ES, Hoffman-Kim D. Genomic and morphological changes of neuroblastoma cells in response to threedimensional matrices. Tissue Eng. 2007;13(5):1035-47.
127. Sarwar M, Sykes PH, Chitcholtan K, Evans JJ. Collagen I dysregulation is pivotal for ovarian cancer progression. Tissue Cell. 2022;74.
128. Tsai S, McOlash L, Palen K, Johnson B, Duris C, Yang Q, Dwinell MB, Hunt , Evans DB, Gershan J, James MA. Development of primary human pancreatic cancer organoids, matched stromal and immune cells and 3D tumor microenvironment models. BMC Cancer. 2018;18(1):1-13. https://doi.org/10.1186/s12885-018-4238-4.
129. Sha H, Zou Z, Xin K, Bian X, Cai X, Lu W, Chen J, Chen G, Huang L, Blair AM, Cao P, Liu B. Tumor-penetrating peptide fused EGFR single-domain antibody enhances cancer drug penetration into 3D multicellular spheroids and facilitates effective gastric cancer therapy. J Control Release. 2015;28(200):188-200.
130. Monteiro MV, Gaspar VM, Ferreira LP, Mano JF. Hydrogel 3D in vitro tumor models for screening cell aggregation mediated drug response. Biomater Sci. 2020;8(7):1855-64.
131. Kundu B, Saha P, Datta K, Kundu SC. A silk fibroin based hepatocarcinoma model and the assessment of the drug response in hyaluronan-binding protein 1 overexpressed HepG2 cells. Biomaterials. 2013;34(37):9462-74.
132. Simon KA, Mosadegh B, Minn KT, Lockett MR, Mohammady MR, Boucher DM, Hall AB, Hillier SM, Udagawa T, Eustace BK, Whitesides GM. Metabolic response of lung cancer cells to radiation in a paper-based 3D cell culture system. Biomaterials. 2016;1(95):47-59.
133. Loessner D, Rizzi SC, Stok KS, Fuehrmann T, Hollier B, Magdolen V, Hutmacher DW, Clements JA. A bioengineered 3D ovarian cancer model for the assessment of peptidase-mediated enhancement of spheroid growth and intraperitoneal spread. Biomaterials. 2013;34(30):7389-400.
134. Stratmann AT, Fecher D, Wangorsch G, Göttlich C, Walles T, Walles H, Dandekar T, Dandekar G, Nietzer SL. Establishment of a human 3D lung cancer model based on a biological tissue matrix combined with a Boolean in silico model. Mol Oncol. 2014;8(2):351-65. https://doi.org/ 10.1016/j.molonc.2013.11.009.
135. Dunne LW, Huang Z, Meng W, Fan X, Zhang N, Zhang Q, An Z. Human decellularized adipose tissue scaffold as a model for breast cancer cell growth and drug treatments. Biomaterials. 2014;35(18):4940-9.
136. Çetin EA. Investigation of the viability of different cancer cells on decelIularized adipose tissue. Celal Bayar Univ J Sci. 2023;19(2):113-9.
137. Sensi F, D’angelo E, Piccoli M, Pavan P, Mastrotto F, Caliceti P, Biccari A, Corallo D, Urbani L, Fassan M, Spolverato G, Riello P, Pucciarelli S, Agostini M. Recellularized colorectal cancer patient-derived scaffolds as in vitro pre-clinical 3D model for drug screening. Cancers (Basel). 2020;12(3).
138. Mazza G, Telese A, Al-Akkad W, Frenguelli L, Levi A, Marrali M, Longato L, Thanapirom K, Vilia MG, Lombardi B, Crowley C, Crawford M, Karsdal MA, Leeming DJ, Marrone G, Bottcher K, Robinson B, Del Rio HA, Tamburrino D, Spoletini G, Malago M, Hall AR, Godovac-Zimmermann J, Luong TV, De Coppi P, Pinzani M, Rombouts K. Cirrhotic human liver extracellular matrix 3D scaffolds promote smad-dependent TGF- epithelial mesenchymal transition. Cells. 2019;9(1):83.
139. Zhao L, Huang L, Yu S, Zheng J, Wang H, Zhang Y. Decellularized tongue tissue as an in vitro model for studying tongue cancer and tongue regeneration. Acta Biomater. 2017;58:122-35.
140. Blanco-Fernandez B, Rey-Vinolas S, Bağcl G, Rubi-Sans G, Otero J, Navajas D, Perez-Amodio S, Engel E. Bioprinting decellularized breast tissue
for the development of three-dimensional breast cancer models. ACS Appl Mater Interfaces. 2022;14(26):29467-82. https://doi.org/10.1021/ acsami.2c00920.
141. Molla MDS, Katti DR, Katti KS. An in vitro model of prostate cancer bone metastasis for highly metastatic and non-metastatic prostate cancer using nanoclay bone-mimetic scaffolds. Springer Link. 2019;4(21):120713. https://doi.org/10.1557/adv.2018.682.
142. Bai G, Yuan P, Cai B, Qiu X, Jin R, Liu S, Li Y, Chen X. Stimuli-responsive scaffold for breast cancer treatment combining accurate photothermal therapy and adipose tissue regeneration. Adv Funct Mater. 2019. https://doi.org/10.1002/adfm.201904401.
143. Lee JH, Kim SK, Khawar IA, Jeong SY, Chung S, Kuh HJ. Microfluidic co-culture of pancreatic tumor spheroids with stellate cells as a novel 3D model for investigation of stroma-mediated cell motility and drug resistance. J Exp Clin Cancer Res. 2018;37(1):1-12. https://doi.org/10. 1186/s13046-017-0654-6.
144. Chen Y, Sun W, Kang L, Wang Y, Zhang M, Zhang H, Hu P. Microfluidic co-culture of liver tumor spheroids with stellate cells for the investigation of drug resistance and intercellular interactions. Analyst. 2019;144(14):4233-40.
145. Jeong SY, Lee JH, Shin Y, Chung S, Kuh HJ. Co-culture of tumor spheroids and fibroblasts in a collagen matrix-incorporated microfluidic chip mimics reciprocal activation in solid tumor microenvironment. PLoS ONE. 2016;11(7):e0159013.
146. Shin CS, Kwak B, Han B, Park K. Development of an in vitro 3D tumor model to study therapeutic efficiency of an anticancer drug. Mol Pharm. 2013;10(6):2167-75. https://doi.org/10.1021/mp300595a.
147. Hübner J, Raschke M, Rütschle I, Gräßle S, Hasenberg T, Schirrmann K, Lorenz A, Schnurre S, Lauster R, Maschmeyer I, Steger-Hartmann T, Marx U. Simultaneous evaluation of anti-EGFR-induced tumour and adverse skin effects in a microfluidic human 3D co-culture model. Sci Rep. 2018;8(1):1-12.
148. Dorayappan KDP, Gardner ML, Hisey CL, Zingarelli RA, Smith BQ, Lightfoot MDS, Gogna R, Flannery MM, Hays J, Hansford DJ, Freitas MA, Yu L, Cohn DE, Selvendiran K. A microfluidic chip enables isolation of exosomes and establishment of their protein profiles and associated signaling pathways in ovarian cancer. Cancer Res. 2019;79(13):3503-13.
149. Booij TH, Price LS, Danen EHJ. 3D cell-based assays for drug screens: challenges in imaging, image analysis, and high-content analysis. SLAS Discovery. 2019;24(6):615-27.
150. Eskes C, Boström AC, Bowe G, Coecke S, Hartung T, Hendriks G, Pamies D, Piton A, Rovida C. Good cell culture practices & in vitro toxicology. Toxicol In Vitro. 2017;1(45):272-7.
151. Coecke S, Balls M, Bowe G, Davis J, Gstraunthaler G, Hartung T, Hay R, Merten OW, Price A, Schechtman L, Stacey G, Stokes W. Guidance on good cell culture practice: a report of the Second ECVAM Task Force on good cell culture practice. Altern Lab Anim. 2005;33(3):261-87.
152. Kasendra M, Troutt M, Broda T, Bacon WC, Wang TC, Niland JC, Helmrath MA. The engineered gut: use of stem cells and tissue engineering to study physiological mechanisms and disease processes: intestinal organoids: roadmap to the clinic. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2021;321(1):G1.
153. Al-Ani A, Toms D, Kondro D, Thundathil J, Yu Y, Ungrin M. Oxygenation in cell culture: critical parameters for reproducibility are routinely not reported. PLoS ONE. 2018;13(10):e0204269.
154. Blatchley MR, Hall F, Ntekoumes D, Cho H, Kailash V, Vazquez-Duhalt R, Gerecht S. Discretizing three-dimensional oxygen gradients to modulate and investigate cellular processes. Adv Sci. 2021;8(14):2100190. https://doi.org/10.1002/advs. 202100190.
155. Martinez NJ, Titus SA, Wagner AK, Simeonov A. High-throughput fluorescence imaging approaches for drug discovery using in vitro and in vivo three-dimensional models. Expert Opin Drug Discov. 2015;10(12):1347-61.
156. Robertson FM, Ogasawara MA, Ye Z, Chu K, Pickei R, Debeb BG, Woodward WA, Hittelman WN, Cristofanilli M, Barsky SH. Imaging and analysis of 3D tumor spheroids enriched for a cancer stem cell phenotype. J Biomol Screen. 2010;15(7):820-9.
157. Wenzel C, Riefke B, Gründemann S, Krebs A, Christian S, Prinz F, Osterland M, Golfier S, Räse S, Ansari N, Esner M, Bickle M, Pampaloni F, Mattheyer C, Stelzer EH, Parczyk K, Prechtl S, Steigemann P. 3D high-content
screening for the identification of compounds that target cells in dormant tumor spheroid regions. Exp Cell Res. 2014;323(1):131-43.
158. Palacio-Castañeda V, Velthuijs N, Le Gac S, Verdurmen WPR. Oxygen control: the often overlooked but essential piece to create better in vitro systems. Lab Chip. 2022;22(6):1068-92.
159. Boyce MW, Simke WC, Kenney RM, Lockett MR. Generating linear oxygen gradients across 3D cell cultures with block-layered oxygen controlled chips (BLOCCs). Anal Methods. 2020;12(1):18.
160. Li Y, Yang HY, Lee DS. Biodegradable and injectable hydrogels in biomedical applications. Biomacromol. 2022;23(3):609-18. https://doi.org/ 10.1021/acs.biomac.1c01552.
161. Osaki T, Sivathanu V, Kamm RD. Engineered 3D vascular and neuronal networks in a microfluidic platform. Sci Rep. 2018;8(1):1-13.
162. Virumbrales-Muñoz M, Ayuso JM, Lacueva A, Randelovic T, Livingston MK, Beebe DJ, Oliván S, Pereboom D, Doblare M, Fernández L, Ochoa I. Enabling cell recovery from 3D cell culture microfluidic devices for tumour microenvironment biomarker profiling. Sci Rep. 2019;9(1):1-14.
163. Kyykallio H, Faria AVS, Hartmann R, Capra J, Rilla K, Siljander PRM. A quick pipeline for the isolation of 3D cell culture-derived extracellular vesicles. J Extracell Vesicles. 2022;11(10).
164. Hubbell JA. Materials as morphogenetic guides in tissue engineering. Curr Opin Biotechnol. 2003;14(5):551-8.
165. Bartnikowski M, Bartnikowski NJ, Woodruff MA, Schrobback K, Klein TJ. Protective effects of reactive functional groups on chondrocytes in photocrosslinkable hydrogel systems. Acta Biomater. 2015;1(27):66-76.
166. El-Sherbiny IM, Yacoub MH. Hydrogel scaffolds for tissue engineering: progress and challenges. Glob Cardiol Sci Pract. 2013;2013(3):316.
167. Bryant SJ, Nuttelman CR, Anseth KS. Cytocompatibility of UV and visible light photoinitiating systems on cultured NIH/3T3 fibroblasts in vitro. J Biomater Sci Polym Ed. 2000;11(5):439-57.
168. Liu S, Borjigin T, Schmitt M, Morlet-Savary F, Xiao P, Lalevée J. Highperformance photoinitiating systems for LED-induced photopolymerization. Polymers (Basel). 2023;15(2):342.
169. Fang Y, Eglen RM. Three-dimensional cell cultures in drug discovery and development. SLAS Discovery. 2017;22(5):456-72. https://doi.org/10. 1177/1087057117696795.
170. Sirenko O, Mitlo T, Hesley J, Luke S, Owens W, Cromwell EF. High-content assays for characterizing the viability and morphology of 3d cancer spheroid cultures. Assay Drug Dev Technol. 2015;13(7):402-14. https:// doi.org/10.1089/adt.2015.655.
171. Zustiak SP, Boukari H, Leach JB. Solute diffusion and interactions in cross-linked poly(ethylene glycol) hydrogels studied by Fluorescence Correlation Spectroscopy. Soft Matter. 2010;6(15):3609-18.
172. Shanbhag S, Woo Lee J, Kotov N. Diffusion in three-dimensionally ordered scaffolds with inverted colloidal crystal geometry. Biomaterials. 2005;26(27):5581-5.
173. Totti S, Allenby MC, Dos Santos SB, Mantalaris A, Velliou EG. A 3D bioinspired highly porous polymeric scaffolding system for in vitro simulation of pancreatic ductal adenocarcinoma. RSC Adv. 2018;8(37):20928-40.
174. Gupta P, Totti S, Pérez-Mancera PA, Dyke E, Nisbet A, Schettino G, Webb R, Velliou EG. Chemoradiotherapy screening in a novel biomimetic polymer based pancreatic cancer model. RSC Adv. 2019;9(71):41649-63.
175. Hamdi DH, Barbieri S, Chevalier F, Groetz JE, Legendre F, Demoor M, Galera P, Lefaix JL, Saintigny Y. In vitro engineering of human 3D chondrosarcoma: a preclinical model relevant for investigations of radiation quality impact. BMC Cancer. 2015;15(1):1-14. https://doi.org/10.1186/ s12885-015-1590-5.
176. Okere B, Alviano F, Costa R, Quaglino D, Ricci F, Dominici M, Paolucci P, Bonsi L, lughetti L. In vitro differentiation of human amniotic epithelial cells into insulinproducing 3D spheroids. Int J Immunopathol Pharmacol. 2015;28(3):390-402.
177. Paris F, Marrazzo P, Pizzuti V, Marchionni C, Rossi M, Michelotti M, Petrovic B, Ciani E, Simonazzi G, Pession A, Bonsi L, Alviano F. Characterization of perinatal stem cell spheroids for the development of cell therapy strategy. Bioengineering. 2023;10(2):189.
178. Kim W, Park E, Yoo HS, Park J, Jung YM, Park JH. Recent advances in monitoring stem cell status and differentiation using nano-biosensing technologies. Nanomaterials. 2022;12(17):2934.
179. Burdick JA, Vunjak-Novakovic G. Engineered microenvironments for controlled stem cell differentiation. Tissue Eng Part A. 2009;15(2):205-19.
180. De León SE, Pupovac A, McArthur SL. Three-Dimensional (3D) cell culture monitoring: opportunities and challenges for impedance spectroscopy. Biotechnol Bioeng. 2020;117(4):1230-40. https://doi.org/ 10.1002/bit.27270.
181. Sirenko O, Hancock MK, Hesley J, Hong D, Cohen A, Gentry J, Carlson CB, Mann DA. Phenotypic characterization of toxic compound effects on liver spheroids derived from ipsc using confocal imaging and threedimensional image analysis. Assay Drug Dev Technol. 2016;14(7):38194. https://doi.org/10.1089/adt.2016.729.
182. Jensen , Teng . Is it time to start transitioning from to cell culture? Front Mol Biosci. 2020;7:33.
183. Ajjarapu SM, Tiwari A, Kumar S. Applications and utility of threedimensional in vitro cell culture for therapeutics. Future Pharmacol. 2023;3(1):213-28.
184. Basu A, Dydowiczová A, Trosko JE, Bláha L, Babica P. Ready to go 3D? A semi-automated protocol for microwell spheroid arrays to increase scalability and throughput of 3D cell culture testing. Toxicol Mech Methods. 2020;30(8):590-604. https://doi.org/10.1080/15376516.2020.1800881.
185. Burdick JA, Murphy WL. Moving from static to dynamic complexity in hydrogel design. Nat Commun. 2012;3(1):1-8.
186. Nash ME, Healy D, Carroll WM, Elvira C, Rochev YA. Cell and cell sheet recovery from pNIPAm coatings; motivation and history to present day approaches. J Mater Chem. 2012;22(37):19376-89.
187. Abuwatfa WH, Awad NS, Pitt WG, Husseini GA. Thermosensitive polymers and thermo-responsive liposomal drug delivery systems. Polymers. 2022;14(5):925.
188. Young EWK, Beebe DJ. Fundamentals of microfluidic cell culture in controlled microenvironments. Chem Soc Rev. 2010;39(3):1036-48.
189. Guvendiren M, Burdick JA. Stiffening hydrogels to probe short- and long-term cellular responses to dynamic mechanics. Nat Commun. 2012;3.
190. Highley CB , Rodell CB , Burdick JA. Direct 3D printing of shear-thinning hydrogels into self-healing hydrogels. Adv Mater. 2015;27(34):5075-9.
191. Malda J, Visser J, Melchels FP, Jüngst T, Hennink WE, Dhert WJA, Groll J, Hutmacher DW. 25th anniversary article: engineering hydrogels for biofabrication. Adv Mater. 2013;25(36):5011-28.

تظل شركة سبرينجر ناتشر محايدة فيما يتعلق بالمطالبات القضائية في الخرائط المنشورة والانتماءات المؤسسية.

Keywords Three－dimensional（3D）cell culture，Scaffolds，Hydrogels，Decellularized tissues，Microfluidics，Extracellular matrix（ECM）

Cancer is a group of diseases characterized by the uncontrolled growth and spread of abnormal cells in the body. It is one of the leading causes of death worldwide, with millions of new cases and deaths each year [1]. Despite significant advances in cancer research and treatment over the years, the disease remains a major public health challenge and a substantial burden on patients, families, and society. Cancer research is crucial to develop new and effective treatments, improve patient outcomes, and find cures for this disease. As understanding of cancer biology and genetics continues to evolve, so do the approaches used to diagnose, treat, and prevent the disease. However, there is still much to learn about the complex mechanisms underlying cancer development and progression and the unique challenges posed by different types of cancers [2]. In addition, there is a need to develop more personalized and targeted therapies that can improve patient outcomes and minimize side effects. As such, cancer research must continue to innovate and advance to keep pace with the evolving understanding of the disease. This includes exploring new treatment
modalities, developing more sophisticated diagnostic tools, and understanding the genetic and molecular mechanisms involved in its development and progression [3].

Two-dimensional (2D) cell culture is a commonly used technique to grow and maintain cells in the laboratory. Cancer research extensively uses it to study cells under controlled conditions, where they are grown on a flat surface supplied with a nutrient-rich liquid medium that provides the necessary nutrients for cell growth and survival. The growth medium used in cell culture varies depending on the type of cancer being studied and the desired goals of the study. One of the most critical aspects of cell culture for cancer research is maintaining cell viability and function, as cancer cells are highly susceptible to environmental changes [4]. Another challenge facing cell culture for cancer research is the ability to accurately model the complexity of human tumors. These are typically highly heterogeneous, comprising different cell types, including cancer, stromal, and immune cells. Understandably, 2D cell culture does not accurately mimic tumors’ three-dimensional (3D) environment [5].

The architecture and organization of cells in a 3D environment differ from those in a 2D environment, which can affect cell behavior and drug response. Recreating this complexity in a laboratory setting is difficult, as it requires the development of culture conditions that promote the growth and interaction of multiple cell types in a multifaceted environment [6]. Therefore, 3D cell culture models were developed as they offer sophisticated platforms that mirror the structural and functional complexities of in vivo tissues, providing valuable insights for cancer research and drug development. This review article highlights the key advantages of 3D cell cultures, the most common scaffold-based 3D culturing techniques, pertinent literature about applications in cancer research, and the challenges associated with these culturing techniques. Due to the topic’s vastness, this paper focuses on examining scaffold-based models of 3D cell cultures.

Tumors are complex structures composed of cancer cells, non-cancerous cells (i.e., immune cells, fibroblasts, endothelial cells, etc.), and various extracellular matrix (ECM) components. The ECM plays a crucial role and contributes to the hallmarks of cancer in tumor progression, metastasis, and response to therapy [7, 8]. The ECM can (1) secrete growth factors and cytokines that promote cell proliferation and survival [9], (2) modulate the expression of genes involved in cell cycle regulation and apoptosis [10], (3) control the expression of telomerase, an enzyme that extends the telomeres of chromosomes, (4) secrete angiogenic factors that promote the formation of new blood vessels, thereby providing the tumor with the nutrients and oxygen it needs to grow [11], (5) promote the epithelial-to-mesenchymal transition (EMT), a process by which epithelial cells acquire the ability to migrate and invade other tissues [12], and (6) temper the immune response by influencing the recruitment and function of immune cells in the TME [13]. RomeroLópez and colleagues [14] tested how the ECM derived from normal and tumor tissues impacted blood vessels and tumor growth using reconstituted ECM. Tumor tissue obtained from liver metastases of colon tumors was subjected to hematoxylin and eosin (H&E) staining to confirm the successful decellularization of both colon and tumor tissues. Subsequently, significantly distinct protein composition and stiffness were observed among the reconstituted matrices, leading to notable variations in vascular network formation and tumor growth in both in vitro and in vivo. Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy was employed to evaluate the free/bound ratios of the nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) cofactor in tumor and endothelial cells to indicate
cellular metabolic state. Notably, cells seeded in tumor ECM exhibited elevated levels of free NADH, indicating an increased glycolytic rate compared to those seeded in normal ECM. These findings underscore the substantial influence of ECM on cancer cell growth and the accompanying vasculature (e.g., increased vessel length, increased vascular heterogeneity). Alterations in the composition of tumor ECM, such as augmented deposition and crosslinking of collagen fibers, can be attributed to communication between tumor cells and tumor-associated stromal cells.

Every tissue type has a distinct ECM composition, topology, and organization [15]. These factors play a significant role in controlling cell function, behavior, and interactions with the microenvironment, as they generate spatial gradients of biochemicals and metabolites that, in turn, may elicit distinctive cell-mediated responses (e.g., differentiation, migration) [16]. Langhans [17] analyzed the chemical components of ECM and reported that it contains water, carbohydrates, and proteins, such as fibrous matrix proteins, glycoproteins, proteoglycans, glycosaminoglycans, growth factors, protease inhibitors, and proteolytic enzymes. Thus, ECM organization can influence cell genotypes and phenotypes, where such effects can be explored through 3D cell cultures [16, 18]. For example, variations in the gene and protein expression and activity of the epidermal growth factor receptors (EFGR), phosphorylated protein kinase B (phospho-AKT), and p42/44 mitogen-activated protein kinases (phospho-MAPK) in colorectal cancer cell lines (e.g., HT-29, CACO-2, DLD-1) affected the genotype and phenotype of cells in 3D cultures, as compared to 2D monolayers [19, 20]. Moreover, the ECM can influence cell morphology and expression of chemokine receptors. Kiss et al. [21] showed that 3D cultured prostate cancer cells (e.g., LNCaP, PC3) exhibited a high level of interaction between the cells and ECM, which resulted in the upregulation and overexpression of the CXCR7 and CXCR4 chemokine receptors. While 2D cell culture has been the mainstay of laboratory cancer research, it has become increasingly clear that this approach is inadequate in replicating the in vivo conditions that cells experience in the human body. As a result, researchers have been turning to 3D cell culture as a more physiologically relevant model for studying cellular processes and disease. A key advantage of 3D models for cancer research is that they can better mimic the complex microenvironment of tumors, including tumor morphology and topography, upregulation of pro-angiogenic proteins, dispersion of biological and chemical factors, cell-cell and cell-matrix interactions, gradients of oxygen and nutrients, and a more realistic ECM composition [6, 22, 23]. Necrotic, hypoxic, quiescent, apoptotic, and proliferative

cells are often found in spheroid cell clusters at different phases of development [24]. Since the outer layer of the spheroid has greater exposure to the nutrient-supported medium, it contains a higher number of proliferating cells. Cells in the spheroid core are hypoxic and often quiescent as they receive less oxygen, growth agents, and nutrients from the media. This results in more physiologically relevant gradients in tissue composition that can better inform drug discovery and development [24]. Furthermore, 3D cell culture accurately depicts the cellular response to drugs and other therapeutic agents. Such a model’s spatial and physical characteristics influence the transmission of signals between cells, which alters gene expression and cell behavior [25]. Loessner et al. [26] demonstrated a flexible 3D culture method where a synthetic hydrogel matrix with crucial biomimetic properties provided a system for studying cell-matrix dynamics related to tumorigenesis. The 3D cultured cells overexpressed mRNA for receptors on their surface (e.g., protease, integrins) compared to 2D cultured cells. Moreover, spheroid progression and proliferation depended on the cells’ ability to proteolytically transform their ECM and cell-integrin interactions. Consequently, the 3D spheroids showed higher survival rates in contrast to 2D monolayers after exposure to the chemotherapeutic agent paclitaxel, which indicates that it better stimulates in vivo chemosensitivity and pathophysiological events. Table 1 below summarizes studies using different 3D models to investigate different types of cancers.
Figure 1 summarizes the main characteristics of 2D and 3D cell cultures. The shift to 3D cell culture is a significant advancement in laboratory research, as it provides a more physiologically relevant model for studying cellular
processes and disease. While some challenges remain to be addressed, the advantages of 3D culture outweigh the limitations of 2D culture. As technology continues to evolve, 3D culture is likely to become an increasingly crucial tool in cancer research and other fields of biomedical science.

Table 2 below provides a comprehensive overview of 2D, 3D, and other model systems employed in cancer research. Besides 2D and 3D cell cultures, tissues and organs present structural and functional intricacies, capturing organ-specific responses but posing challenges in maintenance and accessibility. Furthermore, model animals mimic in vivo systemic responses, yet ethical concerns, high costs, and species differences limit their utility. While clinically relevant, patient-derived samples present challenges in experimental control and sample heterogeneity [43]. It is noteworthy to highlight the difference between spheroids and organoids as both are commonly used terms within the scope of 3D cell cultures [44]. Organoids and spheroids are different 3D cell culture models that can be cultured with different techniques. Organoids, characterized by intricate structures replicating real organs or tissues, are composed of multiple cell types that self-organize to mirror tissue-like architecture, deriving from stem cells or tissue-specific progenitors. Due to their high biological relevance, they find applications in disease modeling, drug testing, and understanding organ development. Beyond organoids, tumoroids (i.e., tumor-like organoids), derived from patient cancer tissues containing tumor and stroma cells of the TME, are becoming advanced 3D culture platforms for personalized drug evaluation and development. In contrast, spheroids are simpler spherical cellular

aggregates lacking the distinct organ-like structures of organoids. Comprising one or multiple cell types, spheroids are used to study fundamental cellular behaviors and drug responses in a 3D environment. While both contribute to 3D cell culture studies, organoids closely resemble real organs compared to the simpler cellular aggregates represented by spheroids [44]. Patient models are valuable tools that aim to replicate the complexities of human tumors, providing insights into disease mechanisms, therapeutic responses, and personalized treatment strategies. They can be utilized in Patient-Derived Xenografts (PDX), organoids and 3D cultures, patientderived cell lines, liquid biopsies, and clinical trials [45].

In 3D cell culture, achieving an optimal balance between homogeneity and heterogeneity is intricately linked to the cellular source, considering stem cells, induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs), or mixed primary cells derived from tissues [46]. Stem cells in in vitro cell culture encompass embryonic stem cells (ESCs), induced pluripotent stem cells (iPSCs), and adult or somatic stem cells. Embryonic stem cells exhibit high pluripotency, capable of differentiating into any cell type, but their use raises ethical concerns due to their origin from embryos. iPSCs are generated from somatic cells (e.g., skin or blood cells) through reprogramming, reverting them to an embryonic-like pluripotent state, but face reprogramming efficiency and potential tumorigenicity challenges. This transformation creates an extensive and diverse
reservoir of human cells, capable of developing into any cell type required for therapeutic applications. Humaninduced pluripotent Stem Cells (HiPSCs) are particularly relevant in cancer research (Table 3) [47]. Thus, the reprogramming process pioneered by Shinya Yamanaka has opened new avenues for advancing cancer biology, drug discovery, and regenerative medicine in cancer treatment. Lastly, adult or somatic stem cells are tissuespecific, mirroring the characteristics of their origin, and present fewer ethical concerns as they are derived from adult tissues. However, they have limited differentiation potential and a finite lifespan in culture. The selection of the cell source significantly influences the composition and behavior of the 3D culture. Stem cells and iPSCs, known for their pluripotency, introduce an inherent heterogeneity due to their ability to differentiate into various cell types [45, 46].

Furthermore, primary cells, derived directly from living organisms, possess unique characteristics that make them invaluable for in vitro studies. Maintaining biological relevance, these cells closely mimic the tissue or organ from which they are isolated, reflecting the intricacies of in vivo conditions. With donor-specific variability, primary cells allow researchers to explore genetic diversity’s impact on cell behavior, disease susceptibility, and drug responses. Retaining tissue-specific functions, differentiated primary cells are crucial for studying specific physiological processes and diseases associated with particular tissues [46]. However, these cells have challenges, including a limited lifespan and sensitivity

to culture conditions. The finite replicative capacity and sensitivity contribute to the heterogeneity observed in 3D cell cultures, emphasizing the importance of carefully considering culture conditions and donor-specific variations to accurately represent in vivo scenarios. Despite these challenges, primary cells are vital in advancing our understanding of cell biology, disease mechanisms, and therapeutic development. Similarly, using mixed primary cells derived from tissues can contribute to a more heterogeneous cellular composition, resembling the complexity found in native tissues. Striking the right balance is crucial, as an excessive degree of heterogeneity may
obscure specific responses, while too much homogeneity might oversimplify the representation of the tissue microenvironment. Therefore, a nuanced understanding of the cellular source is essential for tailoring 3D cell culture models to accurately reflect the intricacies of actual tissues and organs.

As explained above, developing 3D cell culture techniques that more accurately model the TME is a major area of focus in cancer research [6, 59]. Different approaches for 3D cell cultures exist and can be generally

divided into scaffold-based and scaffold-free methods. Scaffold-free 3D cell culture refers to a cell culture technique in which cells are cultured and assembled into 3D structures without external scaffold material. Instead of being embedded within a supportive matrix, the cells self-assemble and interact with neighboring cells to form 3D tissue-like structures. Such cultures allow for more accurate cell-cell interactions, spatial organization, and physiological responses, making them valuable tools for various applications, including drug testing. They also usually have higher cell densities than scaffold-based models, which can influence cellular behavior, gene expression, and cellular functions. Lastly, non-scaffold models offer versatility and customizability in terms of cell types, culture conditions, and experimental designs. However, it is essential to consider that scaffold-free approaches might have limitations in providing mechanical support, shape control, and reproducibility compared to scaffold-based 3D cell culture methods [60]. As such, researchers often select the appropriate 3D cell culture method based on their specific research goals and the tissue or organ system they aim to model or engineer. Due to the topic’s vastness, the paper’s purviews’ are limited
to the examination of scaffold-based models of 3D cell cultures. Scaffolds are essential components in 3D cell culture systems, as they provide a 3D environment for cells to grow and interact with each other and their surroundings [61, 62]. Biomaterials employed in such models can be categorized into the following primary groups: polymer scaffolds, hydrogels, decellularized tissue scaffolds, and hybrid scaffolds (e.g., incorporating microfluidic devices). Tables 4 and 5 summarize the advantages and limitations of commonly used scaffold-free and scaf-fold-based 3D cell culture techniques, respectively.

Polymer scaffolds revolutionize 3D cell culture by providing a biomimetic environment imitating the natural ECM, fostering cell proliferation and differentiation, often with remarkable efficiency and precision. These scaffolds offer a versatile platform for studying complex cell behaviors and hold immense promise in cancer research applications. They can be generally classified as natural or synthetic-derived (see Fig. 2). Natural polymer scaffolds are made from naturally occurring polymers. They can be processed into various forms, including fibers, films,

or porous structures. They can be further classified into two main categories: protein-based and polysaccharidebased scaffolds. Protein-based scaffolds are derived from large molecules composed of amino acids (e.g., collagen, silk, gelatin, fibronectin [93, 94]). Due to their bioactive properties, these scaffolds provide cell adhesion sites and can regulate cell behavior and tissue development. A 3D cell culture platform using collagen scaffolds was developed to investigate the tumorigenicity of cancer stem cells (CSCs) in breast cancer [95]. The study revealed that the 3D cell culture system demonstrated increased expression of pro-angiogenic growth factors, indicating a potential role in promoting blood vessel formation. Moreover, the overexpression of CSC markers such as OCT4A and SOX2, as well as breast cancer stem cell markers including SOX4 and JAG1, was observed in the 3D scaffolds, suggesting that the 3D model successfully replicated the molecular characteristics associated with CSCs. In terms of behavior, the 3D model more closely mimicked the characteristics of CSCs compared to an in vivo model, indicating its effectiveness in capturing the tumorigenic properties of CSCs. Therefore, the collagen scaffold-based 3D cell culture platform provided a valuable tool for studying CSC tumorigenicity in breast cancer, demonstrating the upregulation of pro-angiogenic growth factors, the overexpression of CSC and breast cancer stem cell markers, and a close resemblance to CSC behavior when compared to an in vivo model. Another study by McGrath et al. [96] used a 3D collagen matrix (GELFOAM ) to create an endosteal bone niche (EN) model, referred to as 3D-EN, for studying breast cancer cells’ quiescence and dormancy behaviors. The 3D-EN model effectively facilitated the identification of several genes associated with dormancy-reactivation processes, where among the tested cell lines, only MDA-MB-231 cells exhibited dormancy behavior, suggesting that they have a propensity for entering a dormant state in the simulated physiological conditions.
On the other hand, polysaccharide-based scaffolds are composed of long chains of sugar molecules (e.g., chitosan and hyaluronic acid). They are biocompatible, biodegradable, and can often be modified to adjust their physical and biological properties. Arya et al. [97] developed a 3D cell culture model using a chitosan scaffold, a natural polymer derived from chitin, to study breast cancer behavior. The scaffold was cross-linked with genipin, a natural cross-linker, to enhance its stability. The study found that the chitosan-gelatin (GC) scaffold provided a suitable environment for the growth of MCF-7 breast cancer cells, with the cells showing good adhesion and proliferation. The scaffold also supported the formation of cell clusters, which are more representative of in vivo tumor conditions compared to 2D cultures. The study
concluded that the chitosan/gelatin scaffold could be useful for studying breast cancer in vitro, providing a more physiologically relevant model than traditional 2D cultures. GC scaffolds have been shown to support the formation of tumoroids that mimic tumors grown in vivo, making them an improved in vitro tumor model. These scaffolds have been successfully used to study lung cancer, as well as other types of cancer, such as breast, cervix, and bone [98]. These scaffolds have demonstrated gene-expression profiles similar to tumors grown in vivo, indicating their potential for studying cancer progression and drug screening for solid tumors [99]. The GC scaffolds have also been shown to improve the predictivity of preclinical studies and enhance the clinical translation of therapies [100]. Overall, the GC scaffolds provide a valuable tool for studying tumor development and evaluating the efficacy of anti-cancer drugs in an in vitro setting.

Synthetic polymer scaffolds (e.g., polylactic acid (PLA), polyglycolic acid (PGA), and polycaprolactone (PCL) can be tailored to have specific mechanical and biochemical properties. However, they can be less biocompatible than natural polymers and may require surface modifications to promote cell attachment and growth [60]. Palomeras et al. [101] tested the efficiency of 3D-printed PCL scaffolds for the culture of MCF7 breast cancer cells. The researchers found that the scaffold’s design, specifically the deposition angle, significantly influenced cell attachment and growth. Scaffolds with a deposition angle of showed the highest cell counting after treatment with trypsin. Furthermore, the study found that the 3D culture in PCL scaffolds enriched the cancer stem cell (CSC) population compared to 2D culture control, increasing their Mammosphere Forming Index (MFI). The study concluded that 3D PCL scaffold culture could spur MCF7 cells to generate a cell population with CSC properties. This suggests its potential for studying CSC properties and screening new therapeutic agents targeting CSC populations. These efforts highlight the potential of natural polymer scaffolds in creating more physiologically relevant 3D cell culture models for cancer research. Using these scaffolds can enhance the understanding of cancer cell behavior and potentially lead to the discovery of more effective therapeutic strategies. Similarly, Rijal et al. [88] utilized modified gas foaming-based synthetic polymer scaffolds from poly(lactic-co-glycolic) acid (PLGA) and PCL for conducting 3D tissue cultures and animal models in breast cancer research. The research group investigated the response of MDA-MB-231 cells to anticancer drugs, their viability, morphology, proliferation, receptor expression, and ability to develop in vivo tumors using the 3D scaffolds. MDA-MB-231 cells were cultured on PLGA-coated 2D microscopic glass slides and in 3D-porous PLGA scaffolds to examine cancer

cells’ survival on the polymeric substrata. The number of dead cells detected on the PLGA-coated glass slides and PLGA 3D scaffolds was negligible on Day 1. However, a significant increase in the number of dead cells was observed on the PLGA-coated glass slides compared to the 3D scaffolds on day 14. Additionally, the expression of ECM proteins and cell surface receptors on the synthetic polymers was investigated, where strong staining signals of type I collagen and integrin were detected in both cell types using immunofluorescence (IF) microscopy. It is worth noting that integrin , which acts as a primary receptor for type I collagen, displayed a basal expression level in the 3D model. This expression pattern may promote breast cancer cell migration and tumor growth, as high levels of the integrin receptor tend to inhibit cancer cell migration. Notably, integrin receptors showed a prominent colocalization with type I collagen, particularly around the cell edges, suggesting local deposition of type I collagen and subsequent binding of integrin receptors, facilitating cell attachment and migration. Lastly, to evaluate the tumor formation capabilities of the polymeric porous scaffolds in mice, MDA-MB-231 cells were coated onto porous PLGA scaffolds and implanted into the mammary fat pads of NOD/SCID mice. Blank scaffolds without cells served as the negative control. As anticipated, the proliferating cell nuclear antigen biomarker was not detected in the blank
scaffold implants. At the same time, its expression was significantly high within the tumors derived from the MDA-MB-231 cell-laden PLGA scaffolds. This finding suggested that the cancer cell population within the scaffolds exhibited rapid proliferation when embedded in the native breast tissues.

Hydrogels are 3D networks of hydrophilic polymers (can be natural, synthetic, or hybrid), that can absorb large amounts of water or biological fluids while maintaining their structural integrity [102]. Figure 3 shows common techniques for culturing with hydrogel scaffolds. In the dome technique (see Fig. 3A), cells are mixed with tem-perature-sensitive hydrogels and then seeded as droplets within a cell culture vessel. This technique relies on careful temperature control to allow the hydrogel to polymerize and form a dome structure. Once the hydrogel has polymerized and the cell-hydrogel droplet is stabilized, it is delicately covered with cell culture media. This allows for a localized 3D cell culture in a larger vessel and can create multiple individual cell clusters or spheroids in a single plate. However, the maintenance of dome integrity can be challenging over time and might be affected by changes in temperature or physical disturbance. Also, it may not be suitable for long-term culture or cells requiring complex structural support due to the relatively
simple and isolated 3D structure. Figure 3B illustrates the insert wells technique, which consists of porous inserts to hold the cell-hydrogel mixture while cell culture media is added to the well surrounding the insert. This separation creates a differential environment, allowing for nutrient exchange while maintaining a distinct 3D culture within the insert. Heterogeneous spheroids will eventually form on the insert bottom due to gravitational pull and cellcell interactions. Such a model can be used to study cell invasion or migration by placing the cell-hydrogel mixture on one side of a permeable membrane and chemoattractants on the other. The gel-bottom support method (see Fig. 3C) involves creating a thick layer of hydrogel at the bottom of a culture well, on top of which the cell suspension is placed. For instance, this method can be used for embedding cells within macroporous hydrogel scaffolds, such as AlgiMatrix (Thermo Fisher Scientific/ Life Technologies, Carlsbad, USA)-an ionically gelled and dried scaffold that is conveniently provided in sterile pre-loaded disc format in standard cell culture well plates [103, 104]. To initiate the cell culture, a concentrated cell suspension in culture media is seeded on top of the hydrogel, where it is subsequently absorbed, resulting in the entrapment of the cells within the porous structure of the hydrogel. Lastly, in the embedding technique (see Fig. 3D), the cells are mixed with a hydrogel and directly placed at the bottom of a culture vessel, followed by a layer of culture media, allowing the cells to grow within the matrix of the hydrogel, thereby more accurately mimicking the in vivo 3D environment. This technique is beneficial for studying cell-cell and cell-matrix interactions, invasion, migration, and drug responses. However, it can be more technically challenging to embed cells evenly throughout the hydrogel; retrieving cells from the matrix for downstream analysis can be challenging. The permeability of the hydrogel to nutrients, gases, and wastes may need careful optimization to avoid creating a hypoxic environment or nutrient deprivation for cells located in the interior of the gel. Each of these methods must be selected based on the needs of the specific experiment and the type of cells being cultured. Additionally, the hydrogel composition and mechanical properties should be tuned according to the native ECM properties of the cell type of interest.
Due to their adjustable properties, synthetic hydrogels offer notable benefits in 3D cell culture. The RADA16-I peptide is a self-assembling peptide derived from a segment of Zuotin, a left-handed Z-DNA-binding protein originally discovered in yeast. This peptide has emerged as a novel nano-biomaterial due to its ability to form nanofiber scaffolds. Consequently, these scaffolds provide a supportive framework that promotes cell growth and fosters a conducive 3D milieu for cell culture. The
peptide sequence can be modified to incorporate specific functional groups, thus fine-tuning the mechanical, chemical, and biological attributes of the resultant scaffold. This remarkable flexibility enables customization to align precisely with the unique demands of the cultured cells or the intended experimental objectives. These scaffolds, which are about 10 nm in diameter, are driven by positively and negatively charged residues through complementary ionic interactions. When dissolved in water, the RADA16-I peptide forms a stable hydrogel (nanofiber networks with pore sizes of about ) with extremely high water content at concentrations of , which closely mimics the porosity and gross structure of ECMs, making it suitable for the fabrication of artificial cell niches for applications in tumor biology. Yang and Zhao [105] prepared a RADA16-I peptide hydrogel that provided an elaborate 3D microenvironment for ovarian cancer cells in response to the surrounding topography. The 3D cell cultures exhibited a two to five-fold increase in drug resistance (paclitaxel, curcumin, and fluorouracil) compared to the 2D monolayers, which showed a good representation of the primary tumor and were likely to simulate the in vivo biological characteristics of ovarian cancer cells. Similarly, Song et al. [106] also proved that RADA16-I hydrogels can provide prominent and dynamic nanofiber frameworks to sustain robust cell growth and vitality. HO-8910PM cells, metastatic human ovarian cancer cells, were cultured in three hydrogel biomaterials, namely RADA16-I hydrogel, Matrigel, and collagen I. The specially designed RADA16-I peptide exhibited a well-defined nanofiber network structure within the hydrogel, providing a nanofiber-based cellular microenvironment similar to Matrigel and collagen I. Notably, the HO-8910PM cells exhibited distinctive growth patterns within the three matrices, including cell aggregates, colonies, clusters, strips, and multicellular tumor spheroids (MCTS). Moreover, the molecular expression of integrin , E-cadherin, and N-cadherin in 3D-cultured MCTS of HO-8910PM cells was elevated, and their chemosensitivity was reduced to cisplatin and paclitaxel in comparison to the 2D cell culture, evidenced by IC values and inhibition rates.

Furthermore, polyvalent hyaluronic acid (HA) hydrogels are considered synthetic, as they are typically created through chemical modification of HA molecules, introducing crosslinking agents or functional groups that enable the formation of a gel-like structure. This modification allows for control over the physical and mechanical properties of the hydrogel, such as its stiffness, degradation rate, and bioactivity. Suo et al. [107] engineered an ECM-mimicking hydrogel scaffold to replicate the native breast cancer microenvironment to provide an

effective in vitro model for studying breast cancer progression. HA hydrogels from polyvalent HA derivatives were prepared through an innovative dual crosslinking process involving hydrazone and photo-crosslinking reactions. Hydrazone crosslinking is a versatile, reversible process that allows for rapid gelation, while photocrosslinking stabilizes the formed hydrogel. Using this approach, they could efficiently produce HA hydrogels in under 120 s . It was found that the developed HA hydrogels closely resembled the topography and mechanical properties of breast tumors, and their characteristics (i.e., rigidity and porosity) could be fine-tuned by adjusting the amount of aldehyde-HA in the hydrogel formulation. This ability to modulate the mechanical properties of the hydrogels opens up possibilities for modeling different stages of tumor progression or different types of tumors. Moreover, a critical feature of the developed HA hydrogels was their dual-responsive degradation behavior, which was found to be responsive to glutathione and
hyaluronidase. The glutathione responsiveness allows for degradation in response to the redox environment, which is often disturbed in cancer cells. Meanwhile, responsiveness of hyaluronidase makes the hydrogels sensitive to an enzyme that is typically upregulated in invasive cancer cells. Significantly, the HA hydrogel-cultured MCF-7 cells displayed upregulated expression of vascular endothelial growth factor (VEGF), interleukin-8 (IL-8), and basic fibroblast growth factor (bFGF) compared to their 2D cultured counterparts. These molecules are key mediators of angiogenesis and inflammation in cancer, suggesting that the HA hydrogel environment better replicates the conditions that promote these processes in tumors. Besides, the hydrogel-cultured cells exhibited enhanced migration and invasion abilities, which are key hallmarks of aggressive cancer cells. In vivo studies supported these results and confirmed the superior tumorigenic capacity of the MCF-7 cells cultured in HA hydrogels compared to those cultured in 2D. The outcomes of this research
are anticipated to have far-reaching implications for both the in vitro study of breast cancer and the development of effective therapeutic strategies.
Another investigation by Wang et al. [108] supported that the level of methacrylation significantly influenced the hydrogel’s microstructure, mechanical characteristics, and capacity for liquid absorption and degradation. The refined hydrogel, synthesized through the photocrosslinking of methacrylated HA, displayed a highly porous structure, a high equilibrium swelling ratio, appropriate mechanical properties, and a degradation process responsive to hyaluronidase. It was found that the HA hydrogel promoted the growth and proliferation of MCF-7 cells, which formed aggregates within the hydrogel. In addition, 3D-cultured MCF-7 cells showed an increased expression of VEGF, bFGF, and interleu-kin-8, and enhanced invasion and tumorigenesis capabilities compared to their 2D-cultured counterparts. As such, the HA hydrogel has proven to be a dependable alternative for constructing tumor models. Gelatin methacryloyl (GelMA) is another commonly used natural biomaterial for 3D hydrogel scaffolds in cancer research. GelMA is derived from gelatin, a natural protein obtained from collagen-rich sources. It is modified by adding methacryloyl groups that enable it to undergo photocrosslinking when exposed to ultraviolet (UV) light. This property allows GelMA to form stable hydrogel networks, making it suitable for creating 3D scaffolds that mimic the tumor microenvironment (TME). The tunable mechanical and biochemical properties of GelMA hydrogels, biocompatibility, and ability to support cell growth make them valuable tools for studying cancer cell behavior, tumor invasion, drug screening, and other aspects of cancer research. Kim et al. [109] developed a 3D cell culture model for the bladder by employing a novel acellular matrix and bioreactor. GelMA was utilized as a 3D scaffold for the bladder cancer cell culture, with an optimal scaffold height of 0.08 mm and a crosslinking time of 120 s [110]. Subsequently, 5637 and T24 cells were cultured in 2D and 3D environments and subjected to rapamycin and Bacillus Calmette-Guérin (BCG) drug treatments. It was found that the 3D bladder cancer cell culture model exhibited a faster establishment process and greater stability when compared to the 2D model. Moreover, the 3D-cultured cancer cells demonstrated heightened drug resistance and reduced sensitivity compared to the 2D-cultured cells. Additionally, the researchers observed cell-to-cell interaction and basal activity in the 3D model, closely resembling the in vivo environment.
Along the same lines, Arya et al. [111] investigated the suitability of GelMA hydrogels as in vitro 3D culture systems for modeling key characteristics of metastatic
progression in breast cancer, specifically invasiveness and chemo-responsiveness. The mechanical and morphological properties of the hydrogels were tuned by varying the percentage of GelMA used. Compression testing revealed that the stiffness of GelMA hydrogels was within the range reported for breast tissue, making them suitable matrices for mimicking the breast viscoelasticity in vitro, as cells cultured on GelMA hydrogels exhibited a higher proliferation rate compared to GelMA in both cell lines tested, making them robust systems for long-term cell culture. Furthermore, proliferation studies showed that the GelMA hydrogels could sustain breast cancer cells longer than 2D cultures. Overexpression of genes associated with invasiveness was also observed in 3D cultured breast cancer cells, suggesting potential changes important for metastatic progression. The response to chemotherapeutic drugs was evaluated, and it was observed that 3D spheroids of breast cancer cells cultured on GelMA hydrogels exhibited decreased sensitivity to taxane drugs like paclitaxel. The study highlighted the importance of an adequate matrix pore size for cell penetration, migration, proliferation, exchanging oxygen, nutrients, and waste materials in and out of the 3D culture scaffolds. Significantly, these studies emphasized the importance of the 3D cancer cell culture model in establishing a patient-like model. Utilizing such models can achieve a more precise evaluation of drug responses, potentially leading to advancements in cancer treatment and other diseases.

Cells are known to respond to their mechanical environment in a process known as mechano-transduction, where they transmute mechanical stimuli into biochemical signals, subsequently prompting alterations in cellular behavior and functional operations. Curtis et al. [112] investigated the influence of mechanical stimuli on the cell proliferation, growth, and protein expression of 4T1 breast cancer cells, serving as a model for cells that metastasize to bone. The researchers used 4T1 breast cancer cells and implanted them in gelatin-mTGase hydrogels that mimicked the mechanical properties of bone marrow. The hydrogels had different moduli of either 1 or 2.7 kPa . The cells were cultured under different conditions, including static culture, perfusion of media through the hydrogel, and combined perfusion with cyclic mechanical compression for 1 h per day for 4 days. Control samples were cultured under free-swelling conditions. Immunostaining techniques were used to analyze the protein expression within the cell spheroids formed during the culture. The study found that mechanical stimuli significantly influenced the behavior of the 4T1 breast cancer cells. The cells formed spheroids during the culture period, with larger spheroids observed in statically cultured constructs than those exposed to perfusion
or compression. In the stiffer gelatin, compressed constructs resulted in smaller spheroids compared to perfusion alone, while compression had no significant effect in the softer gelatin. The immunostaining revealed the expression of proteins associated with bone metastasis within the spheroids, including osteopontin, parathyroid hormone-related protein, and fibronectin. The proliferative marker Ki67 was present in all spheroids on day 4. The intensity of Ki67 staining varied depending on the culture conditions and gelatin stiffness. It highlighted the mechanical sensitivity of 4T1 breast cancer cells and demonstrated how mechanical stimuli can impact their proliferation and protein expression within soft materials that mimic the mechanical properties of bone marrow. The findings emphasized the role of the mechanical environment in the bone for both in vivo and in vitro models of cancer metastasis.

Understanding the influence of mechanical factors on cancer cell behavior is crucial for developing effective strategies to prevent and treat metastasis to bone, potentially leading to improved clinical outcomes for patients with advanced cancer. Similarly, Cavo et al. [113] investigated the impact of substrate elasticity on breast adenocarcinoma cell activity using mechanically tuned alginate hydrogels. The study evaluated the viability, proliferation rates, and cluster organization of MCF-7 breast cancer cells in 3D alginate hydrogels compared to standard 2D environments. The elastic moduli of the different alginate hydrogels were measured using atomic force microscopy (AFM). The results demonstrated that substrate stiffness directly influenced cell fate in 2D and 3D environments. In the 3D hydrogels with an elastic modulus of , the MCF-7 cells exhibited uninhibited proliferation, forming cell clusters with and diameters after 1 and 2 weeks, respectively. This unimpeded cell growth observed in softer hydrogels mimicked the initial stages of solid tumor pre-vascularization and growth. Furthermore, the multicellular, cluster-like conformation observed in the 3D hydrogels closely resembled the in vivo organization of solid tumors, demonstrating the advantage of 3D cancer models for replicating cell-cell and cell-matrix interactions. The study also highlighted the influence of microenvironment dimensionality on cellular morphology, as cells displayed a flat shape in 2D cultures while adopting a round shape in the 3D environment. Cell proliferation in the 3D setting depended highly on substrate stiffness, which impacted nutrient diffusion and intracellular signaling through a mechano-transduction mechanism. The findings underscore the importance of considering substrate stiffness in the design of 3D cancer models, as it directly affects cell viability, proliferation, and organization. By understanding the relationship between
substrate stiffness and cellular behavior, researchers can develop more realistic in vitro models that better mimic the microenvironment of solid tumors. These models can advance our understanding of cancer development and aid in the development of targeted therapies by allowing for the investigation of cell-cell and cell-matrix interactions in a more accurate setting.

Decellularized tissues have had their cellular components removed, leaving behind the ECM. Decellularized tissues can be used as scaffolds for 3D cell culture, providing a natural environment for cells to grow and interact [114]. The use of decellularized tissues as 3D cell culture scaffolds offers several advantages. Firstly, they retain the intricate ECM composition, including structural proteins, growth factors, and signaling molecules, which play critical roles in cell behavior and tissue organization. This enables cancer cells to interact with the ECM more akin to in vivo conditions, influencing their adhesion, migration, invasion, and differentiation. Moreover, decellularized tissues offer spatial organization and architectural cues that guide cellular behavior. Preserving tissue-specific topography, such as vasculature, allows for studying angiogenesis and vascularization processes in cancer progression. These scaffolds also provide mechanical support and stiffness that influence cellular mechanotransduction, impacting cell morphology, proliferation, and gene expression patterns. They can be derived from various sources, including solid organs, such as the liver or lung, or specific tissue compartments, such as the ECM-rich decellularized basement membrane (see Fig. 4).

Landberg et al. [115] hypothesized that using a preclinical platform based on decellularized patient-derived scaffolds as growth substrates to account for hidden clinically relevant information and aid in modeling the individualized properties of microenvironments could be optimized for personalized treatment planning. Different decellularization techniques, such as chemical, physical, or enzymatic methods, remove cellular components while preserving the ECM integrity (see Table 6) [116]. The choice of decellularization method depends on the tissue type, desired scaffold characteristics, and the specific requirements of the study. Combinations of different techniques may also be employed to achieve optimal decellularization outcomes. However, challenges remain in the field. The immunogenicity and biocompatibility of decellularized tissues must be carefully considered to prevent adverse reactions when introducing foreign matrices into cell culture systems. Standardization and reproducibility of decellularization protocols are also crucial to ensure consistency across studies and facilitate comparison of results. Integration with advanced
technologies, such as microfluidics or organ-on-a-chip systems, can further enhance the functionality and relevance of decellularized tissue models.

D’Angelo et al. [117] developed a more representative 3D model of colorectal cancer liver metastasis using patient-derived scaffolds. These scaffolds, created by decellularizing tissue-specific ECM, retain the metastatic microenvironment’s biological properties and structural characteristics. The HT-29 CRC cell line was cultured within these scaffolds, obtained explicitly from cancer patients. The study observed increased cell proliferation and migration in the cancer-derived scaffolds, highlighting their ability to provide a more conducive environment for tumor cell growth and spreading. Furthermore, the 3D culture system demonstrated a reduced response to chemotherapy. HT-29 cells cultured in the cancer-specific 3D microenvironments showed decreased sensitivity to treatment with 5-fluorouracil and a combination of 5-fluorouracil with Irinotecan, when used at standard IC50 concentrations. The use of patient-derived scaffolds allows for the study of colorectal cancer metastasis progression and the assessment of their response to chemotherapy agents, to develop new therapeutic strategies and personalized treatments. Additionally, it provides an opportunity to identify potential prognostic biomarkers and therapeutic targets specific to peritoneal metastasis. Varinelli et al. [118] conducted a study that employed a tissue-engineered model for investigating peritoneal metastases (PM) in vitro, yielding similar conclusions. The model involved seeding PM-derived organoids onto decellularized extracellular matrices (dECMs) sourced from the peritoneum, enabling the exploration of intricate interactions between neoplastic cells and the ECM in the PM system. Both neoplastic peritoneum and corresponding normal peritoneum tissues were utilized to generate 3D-dECMs. Utilizing confocal reflection and polarized light microscopy techniques, the study observed disparities in tissue texture and the distribution and integrity of individual collagen fibers between normal and neoplastic-derived tissues obtained from three distinct PM patients. The results demonstrated that 3D-dECMs derived from neoplastic peritoneum exhibited a notably higher proportion of -positive cells after 5 and 12 days. Furthermore, expression levels of specific genes critical for tissue architecture, stiffness, ECM remodeling, fibril generation, epithelial cell differentiation, resistance to compression, and regulation of angiogenesis were found to be elevated in 3D-dECMs generated from neoplastic tissue compared to those from normal tissue or Matrigel-based models. In summary, by utilizing patient-derived scaffolds and cuttingedge techniques, the researchers successfully developed more physiologically relevant models that significantly
contribute to our comprehension of colorectal cancer and PM biology. These models, alongside others [119122], offer valuable insights into the intricate interplay between tumor cells and the ECM, paving the way for the potential discovery of novel therapeutic targets and the development of personalized treatment strategies for peritoneal metastases.

Furthermore, decellularized tissue scaffolds provide an efficient platform to study the interactions between different components abundantly found in the ECM, like macrophages and endothelial cells. Macrophages and endothelial cells are known for their involvement in cancer progression in the context of the ECM within solid tumors, as they are often found in large numbers [123]. Macrophages within the tumor (often referred to as tumor-associated macrophages or TAMs) can be “hijacked” by cancer cells and reprogrammed to support tumor growth and progression. For example, they can promote cancer cell proliferation, enhance blood vessel formation (angiogenesis), assist in tissue remodeling, and suppress the immune response against the tumor. Pinto et al. [123] investigated how human colorectal tumor matrices influence macrophage polarization and their subsequent role in cancer cell invasion. To facilitate this, a novel 3D-organotypic model was utilized using decellularized tissues from surgical resections of colorectal cancer patients. This model preserved native tissue characteristics, including major ECM components, architecture, and mechanical properties, while removing DNA and other cellular components. The study found that macrophages within tumor matrices displayed an M2-like anti-inflammatory phenotype, characterized by higher expression of IL-10, TGF- , and CCL18, and lower expression of CCR7 and TNF. Furthermore, it was observed that tumor ECM-educated macrophages effectively promoted cancer cell invasion through a mechanism involving CCL18, as demonstrated by Matrigel invasion assays. The high expression of CCL18 at the invasive front of human colorectal tumors correlates with advanced tumor staging, underscoring its clinical significance. The findings highlight the potential of using tumor-decellularized matrices as exceptional scaffolds for recreating complex microenvironments, thereby enabling a more comprehensive understanding of cancer progression mechanisms and therapeutic resistance.

Besides TAMs, endothelial cells express various adhesion molecules and chemokines, such as selectins, integrins, and members of the immunoglobulin superfamily, which can interact with ligands on cancer cells, facilitating their adhesion to the endothelial cell layer. This adhesion is a critical step in the extravasation process, where cancer cells exit the bloodstream and invade surrounding tissues to form metastases. Moreover, endothelial cells

can signal and recruit macrophages and other immune cells to the tumor site. Once there, macrophages can be “educated” by the tumor to adopt a pro-tumor phenotype, suppressing the immune response and promoting tumor growth. Therefore, decellularized matrices are suitable for studying such interactions as they closely resemble the natural tumor environment, including native adhesion sites, signaling molecules, and mechanical cues. Helal-Neto et al. [124] examined the influence of dECM produced by a highly metastatic human melanoma cell line (MV3) on the activation of endothelial cells and their intracellular cell differentiation signaling
pathways. The researchers studied the differences in the ultrastructural organization and composition of mel-anocyte-derived ECM (NGM-ECM) and melanomaderived (MV3-ECM). Higher levels of tenascin-C and laminin and lower fibronectin expression were detected in MV3-ECM. Moreover, endothelial cells cultured in the MV3-ECM underwent morphological transformations and exhibited increased adhesion, mobility, growth, and tubulogenesis. The interaction between the endothelial cells and decellularized matrix induced integrin signaling activation, resulting in focal adhesion kinase (FAK) phosphorylation and its association with Src (a non-receptor

tyrosine kinase protein). Src activation, in turn, stimulated the activation of vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR2), enhancing the receptor’s response to VEGF. The activation of VEGF and the association between FAK and Src was inhibited by blocking the integrin, which reduced tubulogenesis. In conclusion, the findings suggested that the interaction of endothelial cells with melanoma-ECM triggered integrin-dependent signaling, which led to the activation of the Src pathway that sequentially potentiated VEGFR2 activation and enhanced angiogenesis. Thus, progress in cancer biology relies on understanding the specific cellular responses influenced by the matrix signals within the ECM, as its nature inherently imposes spatial variations on cellular signaling, composition, topography, and biochemical factors. Table 7 summarizes some studies using hydrogel and decellularized tissue scaffolds for 3D cell cultures.

Integrating multiple scaffold types offers the potential to create 3D cell culture systems that closely mimic the physiological conditions of living tissues. This approach enables researchers to develop more accurate and biologically relevant models for studying cellular behavior, disease progression, and therapeutic responses. By combining different scaffold materials, such as natural and synthetic polymers or hydrogels, researchers can replicate the complexity and heterogeneity of the native tissue microenvironment. These hybrid scaffolds can provide a range of physical, chemical, and mechanical cues that influence cell behavior, including cell adhesion, migration, proliferation, and differentiation. Additionally, the combination of scaffolds can enhance the functionality of the 3D cell culture systems by incorporating specific features, such as the controlled release of growth factors or the inclusion of microvascular networks. Utilizing diverse scaffold types in 3D cell culture offers an innovative and promising approach for advancing our understanding of tissue biology, disease mechanisms, and developing more effective therapies. Bassi et al. [98] addressed the limitations of conventional therapies for osteosarcoma, a type of bone cancer, by introducing two innovative approaches in tumor engineering that aim to improve therapy outcomes. The study utilized hydroxyapatitebased scaffolds that mimic the in vivo TME, specifically emphasizing the CSC niche. Two types of scaffolds were employed: a biomimetic hybrid composite scaffold obtained through biomineralization, involving the direct nucleation of magnesium-doped hydroxyapatite (MgHA) on self-assembling collagen fibers (MgHA/Coll), and porous hydroxyapatite scaffolds (HA) produced by a direct foaming process. These scaffolds provided a framework for the subsequent investigation of the biological
performance of human osteosarcoma cell lines (MG63 and SAOS-2) and enriched CSCs within these complex 3D cell culture models. Immunofluorescence and other characterization techniques were employed to evaluate the response of the osteosarcoma cell lines and CSCs to the biomimetic scaffolds. The results demonstrated the successful formation of sarcospheres, which are stable spheroids enriched with CSCs, with a minimum diameter of . Comparing the advanced 3D cell culture models with conventional 2D culture systems, the study revealed the former’s superiority in mimicking the osteosarcoma stem cell niche and enhancing the predictivity of preclinical studies. The findings underscore the significance of the TME and emphasize the potential of combining CSCs with biomimetic scaffolds as a promising approach to developing novel therapeutic strategies for osteosarcoma. Further efforts can be focused on developing more sophisticated 3D models that accurately replicate the heterogeneity of the osteosarcoma microenvironment, incorporating patient-derived cells and elements such as immune cells and vasculature. Additionally, the advanced 3D cell culture models can serve as valuable tools for drug screening and personalized medicine approaches, further contributing to advancing osteosarcoma research and treatment strategies.

A unique cell culture technique known as “sequential culture” was used to establish a biomimetic bone microenvironment that facilitated the EMT of metastasized prostate cancer cells [141]. The approach involved incorporating bioactive factors from the osteogenic induction of human mesenchymal stem cells (MSCs) within porous 3D scaffolds, specifically polymer-clay composite (PCN) scaffolds, by incorporating hydroxyapatite (HAP) clay into PCL. The researchers also modified sodium clay Montmorillonite (Na-MMT) clay using 5-amino valeric acid to create HAPclay through in situ hydroxyapatite biomineralization into the intercalated nano clay. They performed RNA extraction and quantitative realtime polymerase chain reaction (qRT-PCR) analysis to investigate gene expression changes. Additionally, they conducted a comparative analysis of bone metastasis between the low and high metastatic cell lines, providing insights into their differential responses to the bone microenvironment. It was shown that both, the highly metastatic prostate cancer cell line PC-3 and the non-metastatic cell line MDAPCa2b, underwent MET transition when exposed to the biomimetic bone microenvironment in the 3D scaffold model. However, notable differences were observed in their morphological characteristics and cell-cell adhesion, suggesting distinct responses to the microenvironment. Additionally, quantitative variations in gene expression were observed between tumors generated using the two cell lines in the
bone microenvironment. These findings are essential for developing targeted therapeutic strategies against prostate cancer bone metastasis. Bai et al. [142] conducted a study in which they incorporated graphene oxide (GO) onto a copolymer of polyacrylic acid-g-polylactic acid (PAA-g-PLLA) to create a stimuli-responsive scaffold. This scaffold, combined with PCL and gambogic acid (GA), exhibited a selective response towards tumors and demonstrated a significant accumulation of GO/GA in vitro breast tumor cells (MCF-7 cells) under acidic conditions ( pH 6.8 ), while showing minimal impact on normal cells (MCF-10A cells) at physiological pH ( pH 7.4). The study further revealed that the synergistic use of pH-responsive photo-thermal conversion was more effective in inhibiting tumor growth than independent treatments. In vivo experiments showed remarkable tumor suppression (99% reduction within 21 days) through tumor tissue disintegration, degeneration, and overall tumor suppression when treated with GO-GA scaffolds combined with photo-thermal therapy, in comparison to control groups or those treated with either GO-GA scaffolds or near-infrared (NIR) irradiation alone.
Microfluidics provide a versatile platform for 3D cell culture, offering both scaffold-based and scaffold-free approaches. Researchers can tailor the platform to suit the specific requirements of their experiments, whether involving cell-laden scaffolds or the aggregation of cells to form spheroids or organoids. The microfluidic setup allows for precise control over the microenvironment, including the flow of nutrients and oxygen, as well as the ability to introduce gradients of specific molecules. Lee et al. [143] utilized soft lithography to fabricate a 7-channel microchannel plate using poly-dimethylsiloxane (PDMS). Within separate channels, PANC-1 pancreatic cancer cells and pancreatic stellate cells (PSCs) were cultured within a collagen I matrix. The study observed the formation of 3D tumor spheroids by PANC-1 cells within five days. Intriguingly, the presence of co-cultured PSCs resulted in an increased number of spheroids, suggesting a potential influence of PSCs on tumor growth. In the co-culture setup, PSCs exhibited heightened expression of -smooth muscle actin ( -SMA), a marker associated with fibroblast activation, as well as various EMT-related markers, including vimentin, transforming growth fac-tor-beta (TGF- ), TIMP1, and IL-8. These findings indicated that PSCs may induce an EMT-like phenotype in PANC-1 cells, potentially promoting tumor invasiveness, chemoresistance, and metastasis. Upon treating the co-culture with gemcitabine, the survival of the spheroids did not exhibit significant changes. However, when combined with paclitaxel, the tumor spheroids demonstrated a notable inhibitory effect on growth. The model
revealed a complex interplay between PANC-1 cells and PSCs within the TME. Nonetheless, the combination of gemcitabine and paclitaxel showed promise to overcome resistance and inhibit tumor growth. The implications of these findings are significant for understanding the complex interplay between tumor cells and the surrounding stromal cells within the TME. Tumor-stroma interactions play a critical role in cancer progression and therapy response. Using microfluidic-based 3D co-culture models allows researchers to better recapitulate the in vivo conditions, providing a more accurate representation of tumor behavior and therapeutic responses.

Likewise, Chen et al. [144] developed a microchannel plate-based co-culture model to recreate the in vivo TME by combining Hepa1-6 tumor spheroids with JS-1 stellate cells (liver cancer)-the novel model aimed to mimic key aspects of EMT and chemoresistance observed in tumors. The integration of these cell types in 3D concave microwells allowed for the formation of 3D tumor spheroids in 3 days. The experimental setup was optimized to ensure optimal culture proliferation conditions and appropriate interactions between Hepa1-6 and JS-1 cells. Co-cultured JS-1 cells displayed noticeable changes in cellular morphology, including an increase in the expression of . In contrast, the co-cultured Hepa1-6 spheroids exhibited higher expression levels of TGF- than those cultured alone. These findings suggested that JS-1 stellate cells induced an EMT-like phenotype in the Hepa1-6 cells, potentially contributing to increased invasiveness and resistance to chemotherapy. Jeong et al. [145] conducted a similar study involving the formation of 3D spheroids composed of human colorectal carcinoma cells (HT29) using a microfluidic chip. They reported a notable enhancement in HT-29 growth when co-cultured with fibroblasts (see Fig. 5). This enhancement was demonstrated by a 1.5 -fold increase in the percentage change in spheroid diameter over 5 days. Furthermore, after 6 days of culture, the co-cultured spheroids exhibited reduced expression of , a marker associated with proliferation, while showing increased fibronectin expression. These findings indicated altered cellular behavior compared to the spheroid monocultures. The presence of fibroblasts in the co-culture environment also led to their activation, as evidenced by an upregulation in the expression of -smooth muscle actin ( -SMA) and an increase in migratory activity. This reciprocal interaction between the spheroids and fibroblasts within a microfluidic chip established a dynamic relationship. Additionally, when exposed to paclitaxel, the co-culture displayed a survival advantage over 2D monoculture, suggesting the potential role of fibroblasts in conferring drug resistance. Integrating the

3D tumor spheres and CAFs within a collagen matrixincorporated microfluidic chip provided a valuable tool for studying the TME and evaluating drug screening and efficacy. This approach allowed for the replication of essential interactions between tumor cells and stromal components, which are known to influence cancer progression and therapeutic response. By utilizing the proposed microfluidic chip-based model, researchers can delve into the intricate dynamics of the TME and explore novel therapeutic approaches. The ability to control and better mimic the in vivo conditions within the chip provides a valuable platform for investigating drug responses and evaluating the effectiveness of anticancer treatments. Further exploration and refinement of this model could lead to significant advancements in our understanding of tumor biology and the development of targeted therapies for improved patient outcomes. Table 8 summarizes some studies using microfluidic-based systems to develop 3D cell cultures.

While 3D cell culture offers many advantages over traditional 2D culture, it also presents some unique challenges that must be addressed to realize its potential for advancing research fully. One significant challenge is maintaining a stable and reproducible culture system. 3D cell culture systems often require specialized equipment, such as bioreactors and microfluidic devices, which can be expensive and difficult to use. These systems can be more challenging to reproduce compared to 2D systems due to the increased complexity and high heterogeneity of the culture environment, as cells are often embedded in matrices or scaffolds, making it difficult to control factors such as temperature, pH , and the presence of growth factors and/or other signaling molecules [149]. In addition, there is often a high degree of variability between different batches of cells and between experiments, making it difficult to draw statistically supported conclusions. Considering 3D cell cultures, adhering to Good

Manufacturing Practices (GMP) principles is essential for translating these advanced models from research to clinical and commercial applications. However, several challenges and considerations arise when implementing GMP standards, including standardization of culture conditions, scalability, quality control, raw materials and biologics sourcing, regulatory compliance, data integrity, and documentation. GMP-compliant manufacturing processes require high reproducibility and control over critical parameters such as cell sourcing, culture media, culture supplements, and environmental conditions [150, 151]. As mentioned above, achieving this consistency can be challenging, given the inherent biological variability of primary cells and the sensitivity of 3D cultures to slight changes in culture conditions. Furthermore, meeting regulatory requirements is a paramount challenge in translating 3D spheroid cultures to clinical applications. Regulatory bodies, such as the Food and Drug Administration (FDA) in the United States and the European Medicines Agency (EMA) in Europe, have specific guidelines for the use of cell-based therapies and products [152]. GMP compliance is necessary to navigate these regulatory pathways and obtain approval for clinical trials and commercialization.
Moreover, oxygen accessibility is a critical consideration in 3D cell culture methods, and its heterogeneity within these environments poses a significant challenge in replicating physiological conditions and obtaining accurate experimental results. Cells located in the interior of 3D structures, such as spheroids, often encounter limited oxygen availability due to microenvironmental factors (i.e., tumor spheroids naturally develop hypoxic regions due to irregular vascularization in tumors) and diffusion barriers (e.g., densely packed cells, ECM, scaffolding matrices) [153]. As cells proliferate and form 3D structures, the demand for oxygen increases due to the larger volume that oxygen must traverse. Oxygen diffusion from the surrounding culture medium becomes progressively hindered as the distance from the culture surface to the interior of the 3D structure increases. This results in an oxygen gradient, where cells near the periphery have sufficient oxygen, but those in the core encounter oxygen deficiency, leading to hypoxia. Hypoxic core cells often exhibit altered gene expression, reduced proliferation, and changes in metabolic pathways as they enter a dormant state and cease cycling when deprived of oxygen and nutrients. This reduced activity renders them relatively resistant to cytostatic drugs that predominantly target actively dividing cells, leading to increased drug resistance, as is often observed in solid tumors [154, 155]. Confocal microscopy can be used to visualize dormant cells by labeling them with a nucleoside analog, allowing for their quantification and distinction from actively
proliferating cells. This analog gets diluted in actively dividing cells. Still, it remains retained in quiescent, non-dividing cancer cells, thus providing a valuable tool for distinguishing them from the surrounding actively proliferating cells [156]. Leveraging this characteristic of 3D spheroids, they offer potential avenues for developing novel therapeutics targeting cancer cells resistant to cytostatic anticancer drugs. Wenzel et al. [157] cultivated T47D breast cancer cells in 3D cultures and used confocal imaging to differentiate cells within the inner core from those in the surrounding outer core. Cells in the inner core, experiencing limited access to oxygen and nutrients, exhibited reduced metabolic activity compared to their counterparts in the outer core. Through screening small molecule libraries against these 3D cultures, the authors identified nine compounds that selectively targeted and killed the inner core cancer cells while sparing the more actively proliferating outer cells. The identified drugs primarily affected the respiratory chain pathway, aligning with the altered metabolic activity of oxygendeprived cells transitioning from aerobic to anaerobic metabolism. Hence, compounds selectively targeting dormant cancer cells significantly improved the effectiveness of commonly employed cytostatic anticancer drugs. Alternatively, the use of microfluidic devices that enable the creation of controlled oxygen gradients within cultures, the incorporation of oxygen-permeable materials, and the addition of oxygen-releasing compounds to provide a more uniform distribution of oxygen in vitro. However, it is important to acknowledge that these strategies may not fully replicate the complexity of oxygen gradients in real tissues [158]. Boyce et al. [159] presented the design and characterization of a modular device that capitalized on the gas-permeable properties of silicone to create oxygen gradients within cell-containing regions. The microfabricated device was constructed by stacking laser-cut acrylic and silicone rubber sheets, where the silicone not only facilitated oxygen gradient formation but also served as a barrier, separating the flowing gases from the cell culture medium to prevent evaporation or bubble formation during extended incubation periods. The acrylic components provided structural stability, ensuring a sterile culture environment. Using oxygen-sensing films, gradients with varying ranges and steepness in the microdevice can be achieved by adjusting the composition of gases flowing through the silicone elements. Furthermore, a cell-based reporter assay illustrated that cellular responses to hypoxia were directly proportional to the oxygen tension established within the system, proving efficacy.

Another practical challenge in 3D cultures arises from the intricacy of extracting cells from biomaterialbased 3D constructs. Typically, the construction of
degradable hydrogel scaffolds involves integrating breakable crosslinks and/or cleavable components into the polymer structure or incorporating naturally biodegradable ECM constituents such as hyaluronic acid, laminin, fibronectin, and collagen [160]. Yet, traditional dissociation techniques prove to be notably inefficient and are influenced by the inherent structural complexities of the culture system. Enzymatic degradation, for example by collagenase, is a widely employed method for retrieving cells from 3D cell culture collagen-based scaffolds. The enzyme is selected to match the specific collagen type in the scaffold. During incubation, collagenase enzymatically cleaves the collagen fibers, releasing cells that were embedded or adhered to these fibers. Once the collagen has been broken down, the cells are collected as a suspension in the culture medium [161]. Cell viability and functionality assessments are typically performed to maintain the cells’ health and functionality. While using enzymatic degradation for 3D cell culture scaffolds is common, it remains an intricate approach associated with several limitations. It is important not to underestimate the impact of collagenase or other enzymes on cell viability and functionality. Careful optimization of digestion time and enzyme concentration is essential to balance efficient scaffold degradation and preserving cell quality [162]. Additionally, potential changes in cell phenotype during digestion are a significant concern, necessitating diligent monitoring of digestion parameters. In complex 3D scaffolds, particularly those with intricate structures, enzymatic digestion may be less effective, prompting researchers to explore alternative retrieval methods or adapt the digestion process. Ethical considerations also come into play, especially when working with human or animal-derived cells, raising concerns about using enzymes like collagenase. Adherence to ethical guidelines and institutional regulations is crucial for maintaining responsible and ethical research practices.

Hence, extensive research efforts have been directed toward developing improved techniques for cell retrieval from scaffold-based 3D cell cultures without compromising the cells’ integrity. For instance, Kyykallio et al. [163] developed an innovative pipeline for extracting extracellular vesicles (EVs) from 3D cancer spheroids using nanofibrillar cellulose (NFC) scaffolds as a cell culture matrix. This pipeline encompassed two distinct approaches: a batch method optimized for maximal EV yield at the conclusion of the culture period, and a harvesting method designed to facilitate time-dependent EV collection, allowing integration of EV profiling with spheroid development. Both approaches provided convenient setup, quick execution, and reliably produced a significant number of electric vehicles (EVs). Compared to scaffold-free 3D spheroid cultures on ultra-low affinity
plates, the NFC-based approach demonstrated similar EV production per cell, offering scalability, preserved cell phenotype and integrity, and greater operational simplicity, ultimately leading to higher EV yields. Another approach is based on cell-mediated degradation of hydrogel scaffolds, where living cells actively break down the hydrogel structure [164]. This degradation mechanism is particularly relevant in tissue engineering and regenerative medicine. When cells are encapsulated within a hydrogel scaffold, they can secrete enzymes and other molecules that interact with its components, leading to its gradual breakdown. As cells proliferate and remodel their microenvironment, they may alter the scaffold’s properties and eventually facilitate its degradation. This dynamic process allows for the controlled release of cells, growth factors, and other bioactive substances within the hydrogel, making it a valuable technique for drug delivery applications.

While synthetic degradable polymer scaffolds are significant for developing 3D cell culture models, a concern regarding their in vitro and in vivo biocompatibility pertains to the presence of potentially toxic elements and chemicals utilized during the polymerization of synthetic hydrogels or the crosslinking of natural polymer hydrogel precursors, especially when the reaction conversion is less than . These substances release unreacted monomers, stabilizers, initiators, organic solvents, and emulsifiers. These are integral to the hydrogel preparation process but may pose harm if they seep into the seeded cells or tissues [165, 166]. For instance, widely employed free radical photo-initiators (e.g., Irgacure) have been observed to diminish cell viability, even at minimal concentrations [167, 168]. Consequently, hydrogel scaffolds intended for embedding cells in 3D cultures typically require purification (e.g., by dialysis or solvent washing) to eliminate any residual hazardous chemicals before seeding. However, in certain scenarios, the purification of hydrogel scaffolds is more challenging or unfeasible, particularly when dealing with hydrogels generated through in situ gelation. In such cases, cells are introduced to the reactants necessary for hydrogel synthesis while still in a pre-polymer solution. As a result, when employing in situ gelation techniques, utmost caution must be exercised to ensure that all components are non-toxic and safe.

Furthermore, another challenge associated with 3D cell culture is the difficulty characterizing the cellular response to drugs and other therapeutic agents. In 2D cell culture, cells are typically analyzed using a range of standard assays that are well-established and easy to interpret. However, in 3D cell culture, there is often a lack of such standardized assays and protocols. Fang and Eglen [169] highlighted that the cultures’ complex morphology, functionality, and architecture hampered the application of
some well-developed biochemical assays to 3D systems. Cells tend to aggregate into dense and/or large clusters over time, even in macroporous scaffolds, causing diffusional limitations when carrying out in situ characterization assays. Limitations arise due to the impeded diffusion and confinement of gases, nutrients, waste, and reagents within the system, compounded by challenges when quantifying and normalizing data between different biomimetic cultures [170-172]. For instance, Totti et al. [173] demonstrated that assessing a culture of pancreatic cancer cells in macroporous polyurethane foam-type scaffolds with the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium (MTS) assay showed minimal differences between various scaffold conditions (e.g., ECM coatings on the scaffolds). However, sectioning, immunostaining, and imaging revealed clearer cell proliferation, morphology, and growth distinctions between the conditions. Likewise, the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl2 H -tetrazolium bromide (MTT) assay failed in capturing the differences in pancreatic cells’ viability cultured in polyurethane scaffolds after drug and irradiation screening, which were realized using advanced microscopy and imaging [174]. Hence, it is crucial for researchers to carefully consider the appropriate analytical approach that aligns with their study objectives before commencing the analysis of any 3D cultures. Also, they must be aware that some of the classical gold-standard approaches used in 2D cultures may not be directly applicable in 3D settings, as Hamdi et al. [175] showed that it is unfeasible to extract cells from spheroids for colony formation assays, which are used for developing post-treatment survival curves. Consequently, the researchers suggested in situ characterization readouts, which are novel and/or different from the existing 2D culture protocols.

Using stem cells and differentiated markers is crucial for characterizing and monitoring the cellular composition and differentiation status within 3D spheroids. These markers can help researchers achieve specific goals and outcomes, such as assessing the differentiation potential of stem cells, tracking the progression of differentiation, and studying the dynamics of cell populations in the spheroids [176, 177]. However, using such markers in 3D spheroid cultures presents certain challenges that need to be addressed for accurate and meaningful results. One primary challenge is the heterogeneity of stem cells within spheroids. Spheroids often comprise a mixture of stem cells and differentiated cells, so the stem cell markers may not exclusively identify and isolate the stem cell population, leading to difficulty in studying the specific behavior of stem cells within the spheroid. Another challenge is the variability in the expression of stem cell markers. These markers’ expression can fluctuate
spatially and temporally within the spheroid, making it complex to track and interpret changes in marker expression over time. Additionally, in larger spheroids, stem cell markers may not effectively penetrate the core of the spheroid, limiting the ability to assess the stem cell population in the inner regions [176, 177]. Researchers can employ several strategies to overcome these challenges and effectively use stem cell markers in 3D spheroid cultures [178, 179]. An alternative method involves combining stem cells and other cellular markers to better understand the cellular composition within the spheroid. This multi-marker approach can help mitigate the issues related to marker heterogeneity. Moreover, live imaging techniques, such as confocal microscopy, can provide real-time insights into the dynamics of marker expression within spheroids. Controlling the size of spheroids is another strategy to enhance marker penetration and access to the innermost cells. Utilizing microfluidic techniques allows for the accurate regulation of spheroid size, ensuring effective penetration of markers throughout all regions of the spheroid [178, 179]. Additionally, singlecell analysis methods, such as single-cell RNA sequencing and proteomic analysis, enable the characterization of individual cells within spheroids. This approach can identify unique gene or protein expression patterns and shed light on the behavior of stem cell populations. Another valuable strategy is creating spheroids with genetically encoded stem cell reporters, which produce fluorescent or luminescent signals in stem cells, making them more visible and trackable. Lastly, mimicking the stem cell niche or microenvironment within 3D culture conditions can help maintain stemness and marker expression in spheroids [179].

Although imaging provides valuable information about cell distribution and binding, quantitative measurements using image analysis in 3D cultures are often lacking because they require cell count consistency across samples [180]. The challenge lies in the inability to visualize the whole-cell population, leading to difficulties obtaining accurate and reliable data from the entire culture. This is due to the hampered diffusion of fluorescent markers, primarily due to their large size, governed by the inherent heterogeneity of 3D cultures. One potential solution is to measure cell number from imageable cross-sections; however, Sirenko et al. [181] noted that light interferences and dye diffusion limitations resulted in unreliable results, as the number of cells counted substantially differed from the number of cells seeded. In addition, technical limitations such as prohibitive costs and limited scalability must also be considered [149]. Implementing 3D culture systems may incur higher costs compared to 2D culture systems, attributed to the requirement for specialized equipment, materials, and expertise [182,

183]. Similarly, scaling up 3D culture systems for industrial or clinical applications can be challenging due to the increased complexity of the culture environment and the need for specialized equipment [184]. This can limit the potential for the widespread adoption of 3D culture techniques in these settings.
Significant strides have been made in creating dynamic scaffolds that can respond to or guide resident cells [185]. For example, thermoresponsive hydrogels like poly-Nisopropylacrylamide (pNIPAm) have been proven effective for cell population harvesting [186, 187]. Moreover, the fusion of microscale technologies for cell culture with adaptable hydrogel designs has facilitated various investigations. These include investigating cell migration within microfluidic hydrogels and establishing high-throughput screening platforms to explore interactions between cells and materials [188]. Notably, the mechanobiology field is intrigued by various mechanically dynamic hydrogels that can either stiffen, soften, or reversibly transition between these states to examine cellular responses. These dynamic substrates offer a means to scrutinize how mechanical cues influence cell behavior, similar to the study of soluble factors over decades [189]. Techniques for introducing heterogeneity and multiple cell types within 3D constructs are also advancing. This includes innovative methods where hydrogels serve as bio-inks to print cells, either layer-by-layer from a 2D base or directly within a 3D space enclosed by another hydrogel. As these platforms progress, they are expected to become more widely accessible [190, 191]. In the interim, it remains crucial to maintain an open and collaborative dialogue between cell biologists, materials scientists, and engineers. This collaborative effort will ensure that the next generation of scaffold-based 3D cell culturing systems is well-equipped to address the significant challenges posed by the increasing biological and technical complexities.

To conclude, scaffold-based 3D cell culture has emerged as a valuable tool in cancer research, providing a more physiologically relevant environment for studying tumor behavior, drug responses, and interactions between cancer cells and the surrounding microenvironment. Various scaffold materials, including polymers, decellularized tissue, hydrogels, and hybrids with microfluidics, have been explored to create complex and biomimetic 3D models. Polymer-based scaffolds offer tunable mechanical properties and are relatively easy to fabricate, making them versatile for 3D cell culture. The choice of polymers can influence cell behavior, proliferation, and migration, allowing researchers to study cancer progression and metastasis in a more realistic context. Additionally, incorporating bioactive molecules into polymer scaffolds
can enable the controlled release of drugs and growth factors, facilitating drug screening and targeted therapy development. Furthermore, hydrogels offer high biocompatibility and can be functionalized with bioactive signals to direct cell behavior and tissue formation. In cancer research, hydrogels provide a platform to investigate the effect of mechanical cues on tumor growth, immune cell infiltration, and angiogenesis. Additionally, the ease of incorporating multiple cell types within hydrogels enables the study of tumor-stroma interactions. Likewise, decellularized tissue scaffolds retain native ECM composition, topography, and mechanical properties, closely mimicking the natural tumor microenvironment. As a result, cancer cells cultured in decellularized tissue scaffolds can exhibit more accurate tumor behaviors, including invasion and angiogenesis. Moreover, these scaffolds can be derived from patient-specific tissues, enabling personalized medicine approaches and improving the predictability of drug responses. Lastly, hybrid scaffolds that integrate microfluidic channels offer unique advantages for cancer research. By combining 3D cell culture with microfluidics, researchers can study tumor angiogenesis, metastasis, and drug penetration in a more physiologically relevant manner. Furthermore, microfluidics can facilitate high-throughput screening of anticancer drugs, enabling rapid and cost-effective testing of potential therapies.

The authors would like to acknowledge the financial support of the American University of Sharjah Faculty Research Grants, the AI-Jalila Foundation [AJF 2015555], the Al Qasimi Foundation, the Patient’s Friends Committee-Sharjah, the Biosciences and Bioengineering Research Institute [BBRI18-CEN-11], GCC Co-Fund Program [IRF17-003], the Takamul Program [P OC-00028-18], the Technology Innovation Pioneer (T IP) Healthcare Awards, Sheikh Hamdan Award for Medical Sciences [MRG-57-2019-2020], and the Dana Gas Endowed Chair for Chemical Engineering. We also would like to acknowledge student funding from the Material Science and Engineering Ph.D. program at AUS.

WHA drafted the manuscript. GAH and WGP reviewed and edited the manuscript. All authors read and approved the final version.

Not applicable.

The authors declare no competing interest.

Materials Science and Engineering Ph.D. Program, College of Arts and Sciences, American University of Sharjah, P.O. Box. 26666, Sharjah, United Arab Emirates. Department of Chemical and Biological Engineering, College of Engineering, American University of Sharjah, P.O. Box 26666, Sharjah, United Arab Emirates. Department of Chemical Engineering, Brigham Young University, Provo, UT 84602, USA.

Received: 3 August 2023 Accepted: 4 January 2024
Published online: 14 January 2024

2D- and 3D-culture models as drug-testing platforms in breast cancer. Oncol Rep. 2015;33(4):1837-43.
26. Loessner D, Stok KS, Lutolf MP, Hutmacher DW, Clements JA, Rizzi SC. Bioengineered 3D platform to explore cell-ECM interactions and drug resistance of epithelial ovarian cancer cells. Biomaterials. 2010;31(32):8494-506.
27. Zhou CH, Yang SF, Li PQ. Human lung cancer cell line SPC-A1 contains cells with characteristics of cancer stem cells. Neoplasma. 2012;59(6):685-92.
28. Gamerith G, Rainer J, Huber JM, Hackl H, Trajanoski Z, Koeck S, Lorenz E, Kern J, Kofler R, Kelm JM, Zwierzina H, Amann A, Gamerith G, Rainer J, Huber JM, HackI H, Trajanoski Z, Koeck S, Lorenz E, Kern J, Kofler R, Kelm JM, Zwierzina H, Amann A. 3D-cultivation of NSCLC cell lines induce gene expression alterations of key cancer-associated pathways and mimic in-vivo conditions. Oncotarget. 2017;8(68):112647-61.
29. Jiang R, Huang J, Sun X, Chu X, Wang F, Zhou J, Fan Q, Pang L. Construction of in vitro 3-D model for lung cancer-cell metastasis study. BMC Cancer. 2022;22(1):1-9. https://doi.org/10.1186/s12885-022-09546-9.
30. Chong YK, Toh TB, Zaiden N, Poonepalli A, Leong SH, Ong CEL, Yu Y, Tan PB, See SJ, Ng WH, Ng I, Hande MP, Kon OL, Ang BT, Tang C. Cryopreservation of neurospheres derived from human glioblastoma multiforme. Stem Cells. 2009;27(1):29.
31. Panchalingam K, Paramchuk W, Hothi P, Shah N, Hood L, Foltz G, Behie LA, Panchalingam K, Paramchuk W, Hothi P, Shah N, Hood L, Foltz G, Behie LA. Large-scale production of human glioblastoma-derived cancer stem cell tissue in suspension bioreactors to facilitate the development of novel oncolytic therapeutics. Cancer Stem Cells-The Cutting Edge. 2011;475-502.
32. Sutherland RM, Inch WR, McCredie JA, Kruuv J. A multi-component radiation survival curve using an in vitro tumour model. Int J Radiat Biol Relat Stud Phys Chem Med. 1970;18(5):491-5.
33. Youn BS, Sen A, Behie LA, Girgis-Gabardo A, Hassell JA. Scale-up of breast cancer stem cell aggregate cultures to suspension bioreactors. Biotechnol Prog. 2006;22(3):801-10. https://doi.org/10.1021/bp050 430z.
34. Kuo CT, Chiang CL, Chang CH, Liu HK, Huang GS, Huang RYJ, Lee H, Huang CS, Wo AM. Modeling of cancer metastasis and drug resistance via biomimetic nano-cilia and microfluidics. Biomaterials. 2014;35(5):1562-71.
35. Ware MJ, Keshishian V, Law JJ, Ho JC, Favela CA, Rees P, Smith B, Mohammad S, Hwang RF, Rajapakshe K, Coarfa C, Huang S, Edwards DP, Corr SJ, Godin B, Curley SA. Generation of an in vitro 3D PDAC stroma rich spheroid model. Biomaterials. 2016;108:129-42.
36. Rice AJ, Cortes E, Lachowski D, Cheung BCH, Karim SA, Morton JP, Del Río Hernández A. Matrix stiffness induces epithelial-mesenchymal transition and promotes chemoresistance in pancreatic cancer cells. Oncogenesis. 2017;6(7):e352.
37. Kuo CT, Chiang CL, Huang RYJ, Lee H, Wo AM. Configurable 2D and 3D spheroid tissue cultures on bioengineered surfaces with acquisition of epithelial-mesenchymal transition characteristics. NPG Asia Mater. 2012;4(9):e27.
38. Michy T, Massias T, Bernard C, Vanwonterghem L, Henry M, Guidetti M, Royal G, Coll JL, Texier I, Josserand V, Hurbin A. Verteporfin-loaded lipid nanoparticles improve ovarian cancer photodynamic therapy in vitro and in vivo. Cancers. 2019;11(11):1760.
39. Hirst J, Pathak HB, Hyter S, Pessetto ZY, Ly T, Graw S, Koestler DC, Krieg AJ, Roby KF, Godwin AK. Licofelone enhances the efficacy of paclitaxel in ovarian cancer by reversing drug resistance and tumor stem-like properties. Cancer Res. 2018;78(15):4370-85. https://doi.org/10.1158/ 0008-5472.CAN-17-3993.
40. Goodwin TJ, Milburn Jessup J, Wolf DA. Morphologic differentiation of colon carcinoma cell lines HT-29 and HT-29KM in rotating-wall vessels. In Vitro Cell Dev Biol. 1992;28A(1):47-60.
41. Dainiak MB, Savina IN, Musolino I, Kumar A, Mattiasson B, Galaev IY. Biomimetic macroporous hydrogel scaffolds in a high-throughput screening format for cell-based assays. Biotechnol Prog. 2008;24(6):1373-83.
42. Chandrasekaran S, Deng H, Fang Y. PTEN deletion potentiates invasion of colorectal cancer spheroidal cells through 3D Matrigel. Integr Biol (Camb). 2015;7(3):324-34.
43. Poornima K, Francis AP, Hoda M, Eladl MA, Subramanian S, Veeraraghavan VP, El-Sherbiny M, Asseri SM, Hussamuldin ABA, Surapaneni KM, Mony U, Rajagopalan R. Implications of three-dimensional cell culture in cancer therapeutic research. Front Oncol. 2022;12.
44. Gunti S, Hoke ATK, Vu KP, London NR. Organoid and spheroid tumor models: techniques and applications. Cancers (Basel). 2021;13(4):1-18.
45. Lovitt CJ, Shelper TB, Avery VM. Advanced cell culture techniques for cancer drug discovery. Biology. 2014;3(2):345-67.
46. Zeilinger K, Freyer N, Damm G, Seehofer D, Knöspel F. Cell sources for in vitro human liver cell culture models. Exp Biol Med (Maywood). 2016;241(15):1684-98.
47. Eglen RM, Reisine T. Human iPS cell-derived patient tissues and 3D cell culture part 2: spheroids, organoids, and disease modeling. SLAS Technol. 2019;24(1):18-27.
48. Su J, Zhang L, Zhang W, Choi DS, Wen J, Jiang B, Chang CC, Zhou X. Targeting the biophysical properties of the myeloma initiating cell niches: a pharmaceutical synergism analysis using multi-scale agent-based modeling. PLoS ONE. 2014;9(1):e85059.
49. Valyi-Nagy K, Kormos B, Ali M, Shukla D, Valyi-Nagy T. Stem cell marker CD271 is expressed by vasculogenic mimicry-forming uveal melanoma cells in three-dimensional cultures. Mol Vis. 2012;18:588.
50. Lombardo Y, Filipovicá A, Molyneux G, Periyasamy M, Giamas G, Hu Y, Trivedi PS, Wang J, Yaguë E, Michel L, Coombes RC. Nicastrin regulates breast cancer stem cell properties and tumor growth in vitro and in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 2012;109(41):16558-63.
51. Sgodda M, Dai Z, Zweigerdt R, Sharma AD, Ott M, Cantz T. A scalable approach for the generation of human pluripotent stem cell-derived hepatic organoids with sensitive hepatotoxicity features. Stem Cells Dev. 2017;26(20):1490-504.
52. Meier F, Freyer N, Brzeszczynska J, Knöspel F, Armstrong L, Lako M, Greuel S, Damm G, Ludwig-Schwellinger E, Deschl U, Ross JA, Beilmann M, Zeilinger K. Hepatic differentiation of human iPSCs in different 3D models: a comparative study. Int J Mol Med. 2017;40(6):1759.
53. Weng KC, Kurokawa YK, Hajek BS, Paladin JA, Shirure VS, George SC. Human induced pluripotent stem-cardiac-endothelial-tumor-on-achip to assess anticancer efficacy and cardiotoxicity. Tissue Eng Part C Methods. 2020;26(1):44-55. https://doi.org/10.1089/ten.tec.2019.0248.
54. Liu S, Fang C, Zhong C, Li J, Xiao Q. Recent advances in pluripotent stem cell-derived cardiac organoids and heart-on-chip applications for studying anti-cancer drug-induced cardiotoxicity. Cell Biol Toxicol. 2023;39:2527.
55. Han R, Sun Q, Wu J, Zheng P, Zhao G. Sodium butyrate upregulates miR203 expression to exert anti-proliferation effect on colorectal cancer cells. Cell Physiol Biochem. 2016;39(5):1919-29.
56. Fontoura JC, Viezzer C, dos Santos FG, Ligabue RA, Weinlich R, Puga RD, Antonow D, Severino P, Bonorino C. Comparison of 2D and 3D cell culture models for cell growth, gene expression and drug resistance. Mater Sci Eng, C. 2020;1(107): 110264.
57. Ingram M, Techy GB, Saroufeem R, Yazan O, Narayan KS, Goodwin TJ, Spaulding GF. Three-dimensional growth patterns of various human tumor cell lines in simulated microgravity of a NASA bioreactor. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 1997;33(6):459-66.
58. Lv D, Yu SC, Ping YF, Wu H, Zhao X, Zhang H, Cui Y, Chen B, Zhang X, Dai J, Bian XW, Yao XH. A three-dimensional collagen scaffold cell culture system for screening anti-glioma therapeutics. Oncotarget. 2016;7(35):56904.
59. Spill F, Reynolds DS, Kamm RD, Zaman MH. Impact of the physical microenvironment on tumor progression and metastasis. Curr Opin Biotechnol. 2016;40:41-8.
60. Ravi M, Paramesh V, Kaviya SR, Anuradha E, Paul Solomon FD. 3D cell culture systems: advantages and applications. J Cell Physiol. 2015;230(1):16-26. https://doi.org/10.1002/jcp.24683.
61. Campuzano S, Pelling AE. Scaffolds for 3D cell culture and cellular agriculture applications derived from non-animal sources. Front Sustain Food Syst. 2019;17(3):38.
62. Hippler M, Lemma ED, Bertels S, Blasco E, Barner-Kowollik C, Wegener M, Bastmeyer M. 3D scaffolds to study basic cell biology. Adv Mater. 2019. https://doi.org/10.1002/adma.201808110.
63. Cavo M, Delle Cave D, D’Amone E, Gigli G, Lonardo E, del Mercato LL. A synergic approach to enhance long-term culture and manipulation of MiaPaCa-2 pancreatic cancer spheroids. Sci Rep. 2020;10(1).
64. Ware MJ, Colbert K, Keshishian V, Ho J, Corr SJ, Curley SA, Godin B. Generation of homogenous three-dimensional pancreatic cancer cell spheroids using an improved hanging drop technique. Tissue Eng Part C Methods. 2016;22(4):312-21.
65. Foty R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of spheroids. J Vis Exp. 2011;51(51).
66. Timmins NE, Nielsen LK. Generation of multicellular tumor spheroids by the hanging-drop method. Methods Mol Med. 2007;140:141-51.
67. Zhao L, Xiu J, Liu Y, Zhang T, Pan W, Zheng X, Zhang X. A 3D printed hanging drop dripper for tumor spheroids analysis without recovery. Sci Rep. 2019;9(1):1-14.
68. Gao W, Wu D, Wang Y, Wang Z, Zou C, Dai Y, Ng CF, Teoh JYC, Chan FL. Development of a novel and economical agar-based non-adherent three-dimensional culture method for enrichment of cancer stemlike cells. Stem Cell Res Ther. 2018;9(1):243. https://doi.org/10.1186/ s13287-018-0987-x.
69. Madoux F, Tanner A, Vessels M, Willetts L, Hou S, Scampavia L, Spicer TP. A 1536-well 3D viability assay to assess the cytotoxic effect of drugs on spheroids. SLAS Discov. 2017;22(5):516-24.
70. Khawar IA, Park JK, Jung ES, Lee MA, Chang S, Kuh HJ. Three dimensional mixed-cell spheroids mimic stroma-mediated chemoresistance and invasive migration in hepatocellular carcinoma. Neoplasia. 2018;20(8):800-12.
71. Song Y, Kim JS, Choi EK, Kim J, Kim KM, Seo HR, Song Y, Kim JS, Kyung Choi E, Kim J, Mo Kim K, Ran Seo H. TGF- -independent CTGF induction regulates cell adhesion mediated drug resistance by increasing collagen I in HCC. Oncotarget. 2017;8(13):21650-62.
72. Ma L, Li Y, Wu Y, Aazmi A, Zhang B, Zhou H, Yang H. The construction of in vitro tumor models based on 3D bioprinting. Biodes Manuf. 2020;3(3):227-36.
73. Xie M, Gao Q, Fu J, Chen Z, He Y. Bioprinting of novel 3D tumor array chip for drug screening. Biodes Manuf. 2020;3(3):175-88.
74. Datta P, Dey M, Ataie Z, Unutmaz D, Ozbolat IT. 3D bioprinting for reconstituting the cancer microenvironment. NPJ Precis Oncol. 2020;4(1).
75. LaBarge W, Morales A, Pretorius D, Kahn-Krell AM, Kannappan R, Zhang J. Scaffold-free bioprinter utilizing layer-by-layer printing of cellular spheroids. Micromachines (Basel). 2019;10(9):570.
76. Khoshnood N, Zamanian A. A comprehensive review on scaffold-free bioinks for bioprinting. Bioprinting. 2020;1(19): e00088.
77. Norotte C, Marga FS, Niklason LE, Forgacs G. Scaffold-free vascular tissue engineering using bioprinting. Biomaterials. 2009;30(30):5910-7.
78. Anil-Inevi M, Delikoyun K, Mese G, Tekin HC, Ozcivici E. Magnetic levitation assisted biofabrication, culture, and manipulation of 3D cellular structures using a ring magnet based setup. Biotechnol Bioeng. 2021;118(12):4771-85.
79. Anil-Inevi M, Yaman S, Yildiz AA, Mese G, Yalcin-Ozuysal O, Tekin HC, Ozcivici E. Biofabrication of in situ self assembled 3D cell cultures in a weightlessness environment generated using magnetic levitation. Sci Rep. 2018;8(1).
80. Türker E, Demirçak N, Arslan-Yildiz A. Correction: scaffold-free threedimensional cell culturing using magnetic levitation. Biomater Sci. 2018;6(7):1996.
81. Haisler WL, Timm DM, Gage JA, Tseng H, Killian TC, Souza GR. Three-dimensional cell culturing by magnetic levitation. Nat Protoc. 2013;8(10):1940-9.
82. Jaganathan H, Gage J, Leonard F, Srinivasan S, Souza GR, Dave B, Godin B. Three-dimensional in vitro co-culture model of breast tumor using magnetic levitation. Sci Rep. 2014;4.
83. Caleffi JT, Aal MCE, de Gallindo H, Caxali GH, Crulhas BP, Ribeiro AO, Souza GR, Delella FK. Magnetic 3D cell culture: state of the art and current advances. Life Sci. 2021;286:120028.
84. Rogers M, Sobolik T, Schaffer DK, Samson PC, Johnson AC, Owens P, Codreanu SG, Sherrod SD, McLean JA, Wikswo JP, Richmond A. Engineered microfluidic bioreactor for examining the three-dimensional breast tumor microenvironment. Biomicrofluidics. 2018;12(3):34102.
85. Xu Z, Gao Y, Hao Y, Li E, Wang Y, Zhang J, Wang W, Gao Z, Wang Q. Application of a microfluidic chip-based 3D co-culture to test drug sensitivity for individualized treatment of lung cancer. Biomaterials. 2013;34(16):4109-17.
86. Ruedinger F, Lavrentieva A, Blume C, Pepelanova I, Scheper T. Hydrogels for 3D mammalian cell culture: a starting guide for laboratory practice. Appl Microbiol Biotechnol. 2015;99(2):623-36.
87. Zhang N, Milleret V, Thompson-Steckel G, Huang NP, Vörös J, Simona , Ehrbar M. Soft hydrogels featuring in-depth surface density gradients for the simple establishment of 3D tissue models for screening applications. SLAS Discovery. 2017;22(5):635-44.
88. Rijal G, Bathula C, Li W. Application of synthetic polymeric scaffolds in breast cancer 3D tissue cultures and animal tumor models. Int J Biomater. 2017;2017:9.
89. Unnikrishnan K, Thomas LV, Ram Kumar RM. Advancement of scaffoldbased 3D cellular models in cancer tissue engineering: an update. Front Oncol. 2021;11.
90. van Tienderen GS, Conboy J, Muntz I, Willemse J, Tieleman J, Monfils K, Schurink IJ, Demmers JAA, Doukas M, Koenderink GH, van der Laan LJW, Verstegen MMA. Tumor decellularization reveals proteomic and mechanical characteristics of the extracellular matrix of primary liver cancer. Biomater Adv. 2023;1(146): 213289.
91. Li X, Valadez AV, Zuo P, Nie Z. Microfluidic 3D cell culture: potential application for tissue-based bioassays. Bioanalysis. 2012;4(12):1509.
92. Zhong Q, Ding H, Gao B, He Z, Gu Z. Advances of microfluidics in biomedical engineering. Adv Mater Technol. 2019;4(6).
93. Santos SC, Custódio CA, Mano JF. Human protein-based porous scaffolds as platforms for xeno-free 3D cell culture. Adv Healthc Mater. 2022;11(12).
94. Afewerki S, Sheikhi A, Kannan S, Ahadian S, Khademhosseini A. Gelatin-polysaccharide composite scaffolds for 3D cell culture and tissue engineering: Towards natural therapeutics. Bioeng Transl Med. 2018;4(1):96-115.
95. Chen L, Xiao Z, Meng Y, Zhao Y, Han J, Su G, Chen B, Dai J. The enhancement of cancer stem cell properties of MCF-7 cells in 3D collagen scaffolds for modeling of cancer and anti-cancer drugs. Biomaterials. 2012;33(5):1437-44.
96. McGrath J, Panzica L, Ransom R, Withers HG, Gelman IH. Identification of genes regulating breast cancer dormancy in 3D bone endosteal niche cultures. Mol Cancer Res. 2019;17(4):860-9.
97. Arya N, Sardana V, Saxena M, Rangarajan A, Katti DS. Recapitulating tumour microenvironment in chitosan-gelatin three-dimensional scaffolds: an improved in vitro tumour model. J R Soc Interface. 2012;9(77):3288-302.
98. Bassi G, Panseri S, Dozio SM, Sandri M, Campodoni E, Dapporto M, Sprio S, Tampieri A, Montesi M. Scaffold-based 3D cellular models mimicking the heterogeneity of osteosarcoma stem cell niche. Sci Rep. 2020;10(1):22294.
99. Kievit FM, Wang K, Erickson AE, Lan Levengood SK, Ellenbogen RG, Zhang M. Modeling the tumor microenvironment using chitosanalginate scaffolds to control the stem-like state of glioblastoma cells. Biomater Sci. 2016;4(4):610.
100. Li W, Hu X, Wang S, Xing Y, Wang H, Nie Y, Liu T, Song K. Multiple comparisons of three different sources of biomaterials in the application of tumor tissue engineering in vitro and in vivo. Int J Biol Macromol. 2019;130:166-76.
101. Palomeras S, Rabionet M, Ferrer I, Sarrats A, Garcia-Romeu ML, Puig T, Ciurana J. Breast cancer stem cell culture and enrichment using Poly( Caprolactone) scaffolds. Molecules. 2016;21(4):537.
102. Pradhan S, Clary JM, Seliktar D, Lipke EA. A three-dimensional spheroidal cancer model based on PEG-fibrinogen hydrogel microspheres. Biomaterials. 2017;1(115):141-54.
103. Godugu C, Patel AR, Desai U, Andey T, Sams A, Singh M. AlgiMatrix based 3D cell culture system as an in-vitro tumor model for anticancer studies. PLoS ONE. 2013;8(1): e53708. https://doi.org/10.1371/journal. pone. 0053708.
104. Andersen T, Auk-Emblem P, Dornish M. 3D cell culture in alginate hydrogels. Microarrays. 2015;4(2):133-61.
105. Yang Z, Zhao X. A 3D model of ovarian cancer cell lines on peptide nanofiber scaffold to explore the cell-scaffold interaction and chemotherapeutic resistance of anticancer drugs. Int J Nanomed. 2011;6:310.
106. Song H, Cai GH, Liang J, Ao DS, Wang H, Yang ZH. Three-dimensional culture and clinical drug responses of a highly metastatic human ovarian cancer HO-8910PM cells in nanofibrous microenvironments of three hydrogel biomaterials. J Nanobiotechnol. 2020;18(1):90.
107. Suo A, Xu W, Wang Y, Sun T, Ji L, Qian J. Dual-degradable and injectable hyaluronic acid hydrogel mimicking extracellular matrix for 3D culture of breast cancer MCF-7 cells. Carbohydr Polym. 2019;211:336-48.
108. Wang J, Xu W, Qian J, Wang Y, Hou G, Suo A. Photo-crosslinked hyaluronic acid hydrogel as a biomimic extracellular matrix to recapitulate in vivo features of breast cancer cells. Colloids Surf B Biointerfaces. 2022;209:112159.
109. Kim MJ, Chi BH, Yoo JJ, Ju YM, Whang YM, Chang IH. Structure establishment of three-dimensional (3D) cell culture printing model for bladder cancer. PLoS ONE. 2019;14(10):e0223689.
110. Loessner D, Meinert C, Kaemmerer E, Martine LC, Yue K, Levett PA, Klein TJ, Melchels FPW, Khademhosseini A, Hutmacher DW. Functionalization, preparation and use of cell-laden gelatin methacryloyl-based hydrogels as modular tissue culture platforms. Nat Protoc. 2016;11(4):727-46.
111. Arya AD, Hallur PM, Karkisaval AG, Gudipati A, Rajendiran S, Dhavale V, Ramachandran B, Jayaprakash A, Gundiah N, Chaubey A. Gelatin methacrylate hydrogels as biomimetic three-dimensional matrixes for modeling breast cancer invasion and chemoresponse in vitro. ACS Appl Mater Interfaces. 2016;8(34):22005-17.
112. Curtis KJ, Schiavi J, Mc Garrigle MJ, Kumar V, McNamara LM, Niebur GL. Mechanical stimuli and matrix properties modulate cancer spheroid growth in three-dimensional gelatin culture. J R Soc Interface. 2020;17(173):20200568.
113. Cavo M, Fato M, Peñuela L, Beltrame F, Raiteri R, Scaglione S. Microenvironment complexity and matrix stiffness regulate breast cancer cell activity in a 3D in vitro model. Sci Rep. 2016;6(1):1-13.
114. VandenHeuvel SN, Farris HA, Noltensmeyer DA, Roy S, Donehoo DA, Kopetz S, Haricharan S, Walsh AJ, Raghavan S. Decellularized organ biomatrices facilitate quantifiable in vitro 3D cancer metastasis models. Soft Matter. 2022;18(31):5791-806.
115. Landberg G, Fitzpatrick P, Isakson P, Jonasson E, Karlsson J, Larsson E, Svanström A, Rafnsdottir S, Persson E, Gustafsson A, Andersson D, Rosendahl J, Petronis S, Ranji P, Gregersson P, Magnusson Y, Håkansson J, Ståhlberg A. Patient-derived scaffolds uncover breast cancer promoting properties of the microenvironment. Biomaterials. 2020;1(235): 119705.
116. Zhang , Chen , Hong , Hu R, Liu J, Liu C. Decellularized extracellular matrix scaffolds: recent trends and emerging strategies in tissue engineering. Bioact Mater. 2021;10:15-31.
117. D’angelo E, Natarajan D, Sensi F, Ajayi O, Fassan M, Mammano E, Pilati P, Pavan P, Bresolin S, Preziosi M, Miquel R, Zen Y, Chokshi S, Menon K, Heaton N, Spolverato G, Piccoli M, Williams R, Urbani L, Agostini M. Patientderived scaffolds of colorectal cancer metastases as an organotypic 3D model of the liver metastatic microenvironment. Cancers (Basel). 2020;12(2):364.
118. Varinelli L, Guaglio M, Brich S, Zanutto S, Belfiore A, Zanardi F, lannelli F, Oldani A, Costa E, Chighizola M, Lorenc E, Minardi SP, Fortuzzi S, Filugelli M, Garzone G, Pisati F, Vecchi M, Pruneri G, Kusamura S, Baratti D, Cattaneo L, Parazzoli D, Podestà A, Milione M, Deraco M, Pierotti MA, Gariboldi M. Decellularized extracellular matrix as scaffold for cancer organoid cultures of colorectal peritoneal metastases. J Mol Cell Biol. 2023;14(11).
119. Tian X, Werner ME, Roche KC, Hanson AD, Foote HP, Yu SK, Warner SB, Copp JA, Lara H, Wauthier EL, Caster JM, Herring LE, Zhang L, Tepper JE, Hsu DS, Zhang T, Reid LM, Wang AZ. Organ-specific metastases obtained by culturing colorectal cancer cells on tissue-specific decellularized scaffolds. Nat Biomed Eng. 2018;2(6):443-52.
120. Li H, Dai W, Xia X, Wang R, Zhao J, Han L, Mo S, Xiang W, Du L, Zhu G, Xie J, Yu J, Liu N, Huang M, Zhu J, Cai G. Modeling tumor development and metastasis using paired organoids derived from patients with colorectal cancer liver metastases. J Hematol Oncol. 2020;13(1):1-6. https://doi. org/10.1186/s13045-020-00957-4.
121. Parkinson GT, Salerno S, Ranji P, Håkansson J, Bogestål Y, Wettergren Y, Ståhlberg A, Bexe Lindskog E, Landberg G. Patient-derived scaffolds as a model of colorectal cancer. Cancer Med. 2021;10(3):867-82.
122. Jian M, Ren L, Ren L, He G, He G, Lin Q, Lin Q, Tang W, Tang W, Chen Y, Chen J, Chen J, Liu T, Ji M, Ji M, Wei Y, Wei Y, Chang W, Chang W, Xu J, Xu J. A novel patient-derived organoids-based xenografts model for preclinical drug response testing in patients with colorectal liver metastases. J Transl Med. 2020;18(1):1-17. https://doi.org/10.1186/ s12967-020-02407-8.
123. Pinto , Rios , Silva , Neves , Caires HR, Pinto AT, Durães C, Carvalho FA, Cardoso AP, Santos NC, Barrias CC, Nascimento DS, Pinto-do-Ó P, Barbosa MA, Carneiro F, Oliveira MJ. Decellularized human colorectal cancer matrices polarize macrophages towards an anti-inflammatory phenotype promoting cancer cell invasion via CCL18. Biomaterials. 2017;124:211-24.
124. Helal-Neto E, Brandão-Costa RM, Saldanha-Gama R, Ribeiro-Pereira C, Midlej V, Benchimol M, Morandi V, Barja-Fidalgo C. Priming endothelial cells with a melanoma-derived extracellular matrix triggers the activation of avß3/VEGFR2 axis. J Cell Physiol. 2016;231(11):2464-73.
125. Fontana F, Raimondi M, Marzagalli M, Sommariva M, Limonta P, Gagliano N. Epithelial-to-mesenchymal transition markers and CD44 isoforms are differently expressed in 2D and 3D cell cultures of prostate cancer cells. Cells. 2019;8(2):143.
126. Li GN, Livi LL, Gourd CM, Deweerd ES, Hoffman-Kim D. Genomic and morphological changes of neuroblastoma cells in response to threedimensional matrices. Tissue Eng. 2007;13(5):1035-47.
127. Sarwar M, Sykes PH, Chitcholtan K, Evans JJ. Collagen I dysregulation is pivotal for ovarian cancer progression. Tissue Cell. 2022;74.
128. Tsai S, McOlash L, Palen K, Johnson B, Duris C, Yang Q, Dwinell MB, Hunt , Evans DB, Gershan J, James MA. Development of primary human pancreatic cancer organoids, matched stromal and immune cells and 3D tumor microenvironment models. BMC Cancer. 2018;18(1):1-13. https://doi.org/10.1186/s12885-018-4238-4.
129. Sha H, Zou Z, Xin K, Bian X, Cai X, Lu W, Chen J, Chen G, Huang L, Blair AM, Cao P, Liu B. Tumor-penetrating peptide fused EGFR single-domain antibody enhances cancer drug penetration into 3D multicellular spheroids and facilitates effective gastric cancer therapy. J Control Release. 2015;28(200):188-200.
130. Monteiro MV, Gaspar VM, Ferreira LP, Mano JF. Hydrogel 3D in vitro tumor models for screening cell aggregation mediated drug response. Biomater Sci. 2020;8(7):1855-64.
131. Kundu B, Saha P, Datta K, Kundu SC. A silk fibroin based hepatocarcinoma model and the assessment of the drug response in hyaluronan-binding protein 1 overexpressed HepG2 cells. Biomaterials. 2013;34(37):9462-74.
132. Simon KA, Mosadegh B, Minn KT, Lockett MR, Mohammady MR, Boucher DM, Hall AB, Hillier SM, Udagawa T, Eustace BK, Whitesides GM. Metabolic response of lung cancer cells to radiation in a paper-based 3D cell culture system. Biomaterials. 2016;1(95):47-59.
133. Loessner D, Rizzi SC, Stok KS, Fuehrmann T, Hollier B, Magdolen V, Hutmacher DW, Clements JA. A bioengineered 3D ovarian cancer model for the assessment of peptidase-mediated enhancement of spheroid growth and intraperitoneal spread. Biomaterials. 2013;34(30):7389-400.
134. Stratmann AT, Fecher D, Wangorsch G, Göttlich C, Walles T, Walles H, Dandekar T, Dandekar G, Nietzer SL. Establishment of a human 3D lung cancer model based on a biological tissue matrix combined with a Boolean in silico model. Mol Oncol. 2014;8(2):351-65. https://doi.org/ 10.1016/j.molonc.2013.11.009.
135. Dunne LW, Huang Z, Meng W, Fan X, Zhang N, Zhang Q, An Z. Human decellularized adipose tissue scaffold as a model for breast cancer cell growth and drug treatments. Biomaterials. 2014;35(18):4940-9.
136. Çetin EA. Investigation of the viability of different cancer cells on decelIularized adipose tissue. Celal Bayar Univ J Sci. 2023;19(2):113-9.
137. Sensi F, D’angelo E, Piccoli M, Pavan P, Mastrotto F, Caliceti P, Biccari A, Corallo D, Urbani L, Fassan M, Spolverato G, Riello P, Pucciarelli S, Agostini M. Recellularized colorectal cancer patient-derived scaffolds as in vitro pre-clinical 3D model for drug screening. Cancers (Basel). 2020;12(3).
138. Mazza G, Telese A, Al-Akkad W, Frenguelli L, Levi A, Marrali M, Longato L, Thanapirom K, Vilia MG, Lombardi B, Crowley C, Crawford M, Karsdal MA, Leeming DJ, Marrone G, Bottcher K, Robinson B, Del Rio HA, Tamburrino D, Spoletini G, Malago M, Hall AR, Godovac-Zimmermann J, Luong TV, De Coppi P, Pinzani M, Rombouts K. Cirrhotic human liver extracellular matrix 3D scaffolds promote smad-dependent TGF- epithelial mesenchymal transition. Cells. 2019;9(1):83.
139. Zhao L, Huang L, Yu S, Zheng J, Wang H, Zhang Y. Decellularized tongue tissue as an in vitro model for studying tongue cancer and tongue regeneration. Acta Biomater. 2017;58:122-35.
140. Blanco-Fernandez B, Rey-Vinolas S, Bağcl G, Rubi-Sans G, Otero J, Navajas D, Perez-Amodio S, Engel E. Bioprinting decellularized breast tissue
for the development of three-dimensional breast cancer models. ACS Appl Mater Interfaces. 2022;14(26):29467-82. https://doi.org/10.1021/ acsami.2c00920.
141. Molla MDS, Katti DR, Katti KS. An in vitro model of prostate cancer bone metastasis for highly metastatic and non-metastatic prostate cancer using nanoclay bone-mimetic scaffolds. Springer Link. 2019;4(21):120713. https://doi.org/10.1557/adv.2018.682.
142. Bai G, Yuan P, Cai B, Qiu X, Jin R, Liu S, Li Y, Chen X. Stimuli-responsive scaffold for breast cancer treatment combining accurate photothermal therapy and adipose tissue regeneration. Adv Funct Mater. 2019. https://doi.org/10.1002/adfm.201904401.
143. Lee JH, Kim SK, Khawar IA, Jeong SY, Chung S, Kuh HJ. Microfluidic co-culture of pancreatic tumor spheroids with stellate cells as a novel 3D model for investigation of stroma-mediated cell motility and drug resistance. J Exp Clin Cancer Res. 2018;37(1):1-12. https://doi.org/10. 1186/s13046-017-0654-6.
144. Chen Y, Sun W, Kang L, Wang Y, Zhang M, Zhang H, Hu P. Microfluidic co-culture of liver tumor spheroids with stellate cells for the investigation of drug resistance and intercellular interactions. Analyst. 2019;144(14):4233-40.
145. Jeong SY, Lee JH, Shin Y, Chung S, Kuh HJ. Co-culture of tumor spheroids and fibroblasts in a collagen matrix-incorporated microfluidic chip mimics reciprocal activation in solid tumor microenvironment. PLoS ONE. 2016;11(7):e0159013.
146. Shin CS, Kwak B, Han B, Park K. Development of an in vitro 3D tumor model to study therapeutic efficiency of an anticancer drug. Mol Pharm. 2013;10(6):2167-75. https://doi.org/10.1021/mp300595a.
147. Hübner J, Raschke M, Rütschle I, Gräßle S, Hasenberg T, Schirrmann K, Lorenz A, Schnurre S, Lauster R, Maschmeyer I, Steger-Hartmann T, Marx U. Simultaneous evaluation of anti-EGFR-induced tumour and adverse skin effects in a microfluidic human 3D co-culture model. Sci Rep. 2018;8(1):1-12.
148. Dorayappan KDP, Gardner ML, Hisey CL, Zingarelli RA, Smith BQ, Lightfoot MDS, Gogna R, Flannery MM, Hays J, Hansford DJ, Freitas MA, Yu L, Cohn DE, Selvendiran K. A microfluidic chip enables isolation of exosomes and establishment of their protein profiles and associated signaling pathways in ovarian cancer. Cancer Res. 2019;79(13):3503-13.
149. Booij TH, Price LS, Danen EHJ. 3D cell-based assays for drug screens: challenges in imaging, image analysis, and high-content analysis. SLAS Discovery. 2019;24(6):615-27.
150. Eskes C, Boström AC, Bowe G, Coecke S, Hartung T, Hendriks G, Pamies D, Piton A, Rovida C. Good cell culture practices & in vitro toxicology. Toxicol In Vitro. 2017;1(45):272-7.
151. Coecke S, Balls M, Bowe G, Davis J, Gstraunthaler G, Hartung T, Hay R, Merten OW, Price A, Schechtman L, Stacey G, Stokes W. Guidance on good cell culture practice: a report of the Second ECVAM Task Force on good cell culture practice. Altern Lab Anim. 2005;33(3):261-87.
152. Kasendra M, Troutt M, Broda T, Bacon WC, Wang TC, Niland JC, Helmrath MA. The engineered gut: use of stem cells and tissue engineering to study physiological mechanisms and disease processes: intestinal organoids: roadmap to the clinic. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2021;321(1):G1.
153. Al-Ani A, Toms D, Kondro D, Thundathil J, Yu Y, Ungrin M. Oxygenation in cell culture: critical parameters for reproducibility are routinely not reported. PLoS ONE. 2018;13(10):e0204269.
154. Blatchley MR, Hall F, Ntekoumes D, Cho H, Kailash V, Vazquez-Duhalt R, Gerecht S. Discretizing three-dimensional oxygen gradients to modulate and investigate cellular processes. Adv Sci. 2021;8(14):2100190. https://doi.org/10.1002/advs. 202100190.
155. Martinez NJ, Titus SA, Wagner AK, Simeonov A. High-throughput fluorescence imaging approaches for drug discovery using in vitro and in vivo three-dimensional models. Expert Opin Drug Discov. 2015;10(12):1347-61.
156. Robertson FM, Ogasawara MA, Ye Z, Chu K, Pickei R, Debeb BG, Woodward WA, Hittelman WN, Cristofanilli M, Barsky SH. Imaging and analysis of 3D tumor spheroids enriched for a cancer stem cell phenotype. J Biomol Screen. 2010;15(7):820-9.
157. Wenzel C, Riefke B, Gründemann S, Krebs A, Christian S, Prinz F, Osterland M, Golfier S, Räse S, Ansari N, Esner M, Bickle M, Pampaloni F, Mattheyer C, Stelzer EH, Parczyk K, Prechtl S, Steigemann P. 3D high-content
screening for the identification of compounds that target cells in dormant tumor spheroid regions. Exp Cell Res. 2014;323(1):131-43.
158. Palacio-Castañeda V, Velthuijs N, Le Gac S, Verdurmen WPR. Oxygen control: the often overlooked but essential piece to create better in vitro systems. Lab Chip. 2022;22(6):1068-92.
159. Boyce MW, Simke WC, Kenney RM, Lockett MR. Generating linear oxygen gradients across 3D cell cultures with block-layered oxygen controlled chips (BLOCCs). Anal Methods. 2020;12(1):18.
160. Li Y, Yang HY, Lee DS. Biodegradable and injectable hydrogels in biomedical applications. Biomacromol. 2022;23(3):609-18. https://doi.org/ 10.1021/acs.biomac.1c01552.
161. Osaki T, Sivathanu V, Kamm RD. Engineered 3D vascular and neuronal networks in a microfluidic platform. Sci Rep. 2018;8(1):1-13.
162. Virumbrales-Muñoz M, Ayuso JM, Lacueva A, Randelovic T, Livingston MK, Beebe DJ, Oliván S, Pereboom D, Doblare M, Fernández L, Ochoa I. Enabling cell recovery from 3D cell culture microfluidic devices for tumour microenvironment biomarker profiling. Sci Rep. 2019;9(1):1-14.
163. Kyykallio H, Faria AVS, Hartmann R, Capra J, Rilla K, Siljander PRM. A quick pipeline for the isolation of 3D cell culture-derived extracellular vesicles. J Extracell Vesicles. 2022;11(10).
164. Hubbell JA. Materials as morphogenetic guides in tissue engineering. Curr Opin Biotechnol. 2003;14(5):551-8.
165. Bartnikowski M, Bartnikowski NJ, Woodruff MA, Schrobback K, Klein TJ. Protective effects of reactive functional groups on chondrocytes in photocrosslinkable hydrogel systems. Acta Biomater. 2015;1(27):66-76.
166. El-Sherbiny IM, Yacoub MH. Hydrogel scaffolds for tissue engineering: progress and challenges. Glob Cardiol Sci Pract. 2013;2013(3):316.
167. Bryant SJ, Nuttelman CR, Anseth KS. Cytocompatibility of UV and visible light photoinitiating systems on cultured NIH/3T3 fibroblasts in vitro. J Biomater Sci Polym Ed. 2000;11(5):439-57.
168. Liu S, Borjigin T, Schmitt M, Morlet-Savary F, Xiao P, Lalevée J. Highperformance photoinitiating systems for LED-induced photopolymerization. Polymers (Basel). 2023;15(2):342.
169. Fang Y, Eglen RM. Three-dimensional cell cultures in drug discovery and development. SLAS Discovery. 2017;22(5):456-72. https://doi.org/10. 1177/1087057117696795.
170. Sirenko O, Mitlo T, Hesley J, Luke S, Owens W, Cromwell EF. High-content assays for characterizing the viability and morphology of 3d cancer spheroid cultures. Assay Drug Dev Technol. 2015;13(7):402-14. https:// doi.org/10.1089/adt.2015.655.
171. Zustiak SP, Boukari H, Leach JB. Solute diffusion and interactions in cross-linked poly(ethylene glycol) hydrogels studied by Fluorescence Correlation Spectroscopy. Soft Matter. 2010;6(15):3609-18.
172. Shanbhag S, Woo Lee J, Kotov N. Diffusion in three-dimensionally ordered scaffolds with inverted colloidal crystal geometry. Biomaterials. 2005;26(27):5581-5.
173. Totti S, Allenby MC, Dos Santos SB, Mantalaris A, Velliou EG. A 3D bioinspired highly porous polymeric scaffolding system for in vitro simulation of pancreatic ductal adenocarcinoma. RSC Adv. 2018;8(37):20928-40.
174. Gupta P, Totti S, Pérez-Mancera PA, Dyke E, Nisbet A, Schettino G, Webb R, Velliou EG. Chemoradiotherapy screening in a novel biomimetic polymer based pancreatic cancer model. RSC Adv. 2019;9(71):41649-63.
175. Hamdi DH, Barbieri S, Chevalier F, Groetz JE, Legendre F, Demoor M, Galera P, Lefaix JL, Saintigny Y. In vitro engineering of human 3D chondrosarcoma: a preclinical model relevant for investigations of radiation quality impact. BMC Cancer. 2015;15(1):1-14. https://doi.org/10.1186/ s12885-015-1590-5.
176. Okere B, Alviano F, Costa R, Quaglino D, Ricci F, Dominici M, Paolucci P, Bonsi L, lughetti L. In vitro differentiation of human amniotic epithelial cells into insulinproducing 3D spheroids. Int J Immunopathol Pharmacol. 2015;28(3):390-402.
177. Paris F, Marrazzo P, Pizzuti V, Marchionni C, Rossi M, Michelotti M, Petrovic B, Ciani E, Simonazzi G, Pession A, Bonsi L, Alviano F. Characterization of perinatal stem cell spheroids for the development of cell therapy strategy. Bioengineering. 2023;10(2):189.
178. Kim W, Park E, Yoo HS, Park J, Jung YM, Park JH. Recent advances in monitoring stem cell status and differentiation using nano-biosensing technologies. Nanomaterials. 2022;12(17):2934.
179. Burdick JA, Vunjak-Novakovic G. Engineered microenvironments for controlled stem cell differentiation. Tissue Eng Part A. 2009;15(2):205-19.
180. De León SE, Pupovac A, McArthur SL. Three-Dimensional (3D) cell culture monitoring: opportunities and challenges for impedance spectroscopy. Biotechnol Bioeng. 2020;117(4):1230-40. https://doi.org/ 10.1002/bit.27270.
181. Sirenko O, Hancock MK, Hesley J, Hong D, Cohen A, Gentry J, Carlson CB, Mann DA. Phenotypic characterization of toxic compound effects on liver spheroids derived from ipsc using confocal imaging and threedimensional image analysis. Assay Drug Dev Technol. 2016;14(7):38194. https://doi.org/10.1089/adt.2016.729.
182. Jensen , Teng . Is it time to start transitioning from to cell culture? Front Mol Biosci. 2020;7:33.
183. Ajjarapu SM, Tiwari A, Kumar S. Applications and utility of threedimensional in vitro cell culture for therapeutics. Future Pharmacol. 2023;3(1):213-28.
184. Basu A, Dydowiczová A, Trosko JE, Bláha L, Babica P. Ready to go 3D? A semi-automated protocol for microwell spheroid arrays to increase scalability and throughput of 3D cell culture testing. Toxicol Mech Methods. 2020;30(8):590-604. https://doi.org/10.1080/15376516.2020.1800881.
185. Burdick JA, Murphy WL. Moving from static to dynamic complexity in hydrogel design. Nat Commun. 2012;3(1):1-8.
186. Nash ME, Healy D, Carroll WM, Elvira C, Rochev YA. Cell and cell sheet recovery from pNIPAm coatings; motivation and history to present day approaches. J Mater Chem. 2012;22(37):19376-89.
187. Abuwatfa WH, Awad NS, Pitt WG, Husseini GA. Thermosensitive polymers and thermo-responsive liposomal drug delivery systems. Polymers. 2022;14(5):925.
188. Young EWK, Beebe DJ. Fundamentals of microfluidic cell culture in controlled microenvironments. Chem Soc Rev. 2010;39(3):1036-48.
189. Guvendiren M, Burdick JA. Stiffening hydrogels to probe short- and long-term cellular responses to dynamic mechanics. Nat Commun. 2012;3.
190. Highley CB , Rodell CB , Burdick JA. Direct 3D printing of shear-thinning hydrogels into self-healing hydrogels. Adv Mater. 2015;27(34):5075-9.
191. Malda J, Visser J, Melchels FP, Jüngst T, Hennink WE, Dhert WJA, Groll J, Hutmacher DW. 25th anniversary article: engineering hydrogels for biofabrication. Adv Mater. 2013;25(36):5011-28.

Springer Nature remains neutral with regard to jurisdictional claims in published maps and institutional affiliations.