DOI: https://doi.org/10.1038/s44328-025-00066-7
تاريخ النشر: 2026-01-09
المؤلف: Erin Demek وآخرون
الموضوع الرئيسي: تقنيات الاستشعار الحيوي والتحليل الحيوي المتقدمة
نظرة عامة
تحدد هذه القسم منهجية عامة لتعزيز حساسية أجهزة الاستشعار المعتمدة على الأبتامير الكهروكيميائية عند تطبيقها على عينات بلازما الدم. ويؤكد على أهمية تحسين ظروف العازلة لتحسين قدرات الكشف لهذه الأجهزة. تسلط الأبحاث الضوء على استراتيجيات محددة لضبط القوة الأيونية ودرجة الحموضة للعازلة، والتي تعتبر حاسمة لتعظيم التفاعل بين الأبتامير والمحلل المستهدف.
تشير النتائج الرئيسية إلى أن تركيبات العازلة المصممة خصيصًا يمكن أن تؤثر بشكل كبير على أداء المستشعر، مما يؤدي إلى تحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء وتقليل حدود الكشف. تؤكد الدراسة على ضرورة التجارب المنهجية لتحديد ظروف العازلة المثلى التي تسهل الربط الفعال ونقل الإشارة في مصفوفات بيولوجية معقدة مثل بلازما الدم.
طرق
في هذا القسم، يوضح المؤلفون المواد الكيميائية والمواد المستخدمة في أبحاثهم. تشمل المواد الكيميائية الرئيسية 6-ميركابتو-1-هكسانول (MCH)، وثروبين الإنسان، وثلاثي (2-كربوكسي إيثيل) فوسفين هيدروكلوريد (TCEP)، جميعها من مصدر سيغما-ألدريتش. تم الحصول على مواد كيميائية إضافية مثل محلول ملحي معزز بالفوسفات (PBS)، وحمض الكبريتيك، وهيدروكسيد الصوديوم، وبروتيناز K المعاد تركيبه من فيشر-ساينتيفيك. كما استخدمت الدراسة ألبومين البقر وهيميسكسينات الكوليسترول، مع تحضير جميع المحاليل المائية باستخدام مياه منزوع الأيونات من نظام تنقية Milli-Q Direct.
شملت المكونات الكهروكيميائية أقطاب قرص الذهب، وأقطاب سلك البلاتين الملفوفة، وأقطاب مرجعية فضة/كلوريد الفضة، تم الحصول عليها من موردين مختلفين. تم استخدام معجون الماس وأقمشة للتلميع. كانت المواد البيولوجية تتكون من بلازما وسيروم إنسان مجمعة وغير محددة الهوية، إلى جانب مركبات صيدلانية مثل إمتريسيتابين وسلفات التوبراميسين، والتي تم الحصول عليها من Toronto Research Chemicals وSpectrum Chemical Manufacturing Group، على التوالي. تسلط هذه القائمة الشاملة للمواد الضوء على التحضير الدقيق والمنهجية المتبعة في الدراسة.
النتائج
تظهر نتائج هذه الدراسة أن البروتينات في السوائل البيولوجية تقلل بشكل كبير من حساسية وإنتاج الإشارة لأجهزة الاستشعار المعتمدة على الأبتامير الكهروكيميائية (E-AB)، خاصة عند قياس الدواء المضاد للفيروسات إمتريسيتابين (FTC). أظهر جهاز الاستشعار E-AB EC50 قدره 10.4 ± 0.6 ميكرومول في محلول ملحي معزز بالفوسفات (PBS)، والذي زاد إلى 89 ± 19 ميكرومول في السيروم و78 ± 16 ميكرومول في البلازما، مما يشير إلى فقدان الحساسية. كما انخفض الحد الأقصى لإنتاج الإشارة من حوالي 350% في PBS إلى 89% في البلازما، مما يشير إلى أن تفاعلات البروتين، وخاصة مع ألبومين السيروم، هي المسؤولة عن هذا التأثير المخفف. أكدت التجارب الإضافية أن إضافة ألبومين سيروم البقر (BSA) في PBS قللت من استجابة المستشعر لـ FTC، مما يثبت الفرضية بأن بروتينات السيروم تتداخل مع أداء المستشعر.
لمعالجة هذه المشكلة، طور المؤلفون استراتيجية لإزالة البروتين تتضمن تجلط الدم الناتج عن الثروبين متبوعًا بالطرد المركزي والترشيح، مما أعاد بنجاح حساسية المستشعر. حسنت هذه الطريقة EC50 إلى 11 ± 3 ميكرومول في السائل المصفى، مقارنة بالقيم التي تم الحصول عليها في PBS. تم التحقق من البروتوكول باستخدام عينات بلازما عشوائية، محققة توافقًا بنسبة 97% مع تركيزات FTC الفعلية. بالإضافة إلى ذلك، تم توسيع الطريقة لتشمل أجهزة الاستشعار E-AB الأخرى، مثل تلك المستهدفة للتوبراميسين والهيدروكسي كوينولين، مما يظهر عموميتها. بينما تعزز هذه الطريقة بشكل كبير أداء المستشعر في مصفوفات بيولوجية معقدة، إلا أنها تظل غير مناسبة للتطبيقات في الوقت الحقيقي بسبب خطوات معالجة العينات المطلوبة. يجب أن تتضمن التطورات المستقبلية للأبتامير ظروف تحاكي السوائل البيولوجية لتعزيز التوافق مع البيئات البيولوجية.
المناقشة
في قسم المناقشة، يتم تفصيل المنهجية لتحضير الحمض النووي وأجهزة الاستشعار للكشف الكهروكيميائي عن الأهداف مثل FTC، التوبراميسين، والهيدروكسي كوينولين. تم تقليل وتخفيف الحمض النووي أحادي السلسلة (ssDNA) لتفعيل أقطاب الذهب، والتي تم تلميعها وتنظيفها كهربائيًا. تم ترك الأقطاب ناعمة لـ FTC أو تم تجعيدها للتوبراميسين والهيدروكسي كوينولين لتعزيز الأداء. بعد حضانة الأبتامير، تم تنفيذ خطوة معالجة مسبقة لإزالة الربط غير المحدد، مما يضمن موثوقية القياسات اللاحقة.
شملت تحضيرات العينات إنشاء منحنيات معايرة باستخدام بلازما الإنسان، مع بروتوكولات حضانة محددة لكل هدف. تم إجراء القياسات الكهروكيميائية باستخدام إعداد ثلاثي الأقطاب، مع استخدام الفولتمتر الموجي المربع لتقييم تركيز الأهداف بناءً على التغيرات في التيار عند ترددات محددة. تم جمع عينات سريرية من المشاركين في دراستين، مع قياس تركيزات FTC باستخدام الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء-مطياف الكتلة (HPLC-MS/MS). تم إجراء تحليل البيانات باستخدام نص بايثون مخصص لمعالجة بيانات الفولتمتر بشكل فعال، مع استخدام الانحدار غير الخطي لتناسب النتائج مع معادلات هيل، مع معالجة السلوك الفريد لمنحنيات التوبراميسين والهيدروكسي كوينولين في البلازما.
DOI: https://doi.org/10.1038/s44328-025-00066-7
Publication Date: 2026-01-09
Author(s): Erin Demek et al.
Primary Topic: Advanced biosensing and bioanalysis techniques
Overview
The section outlines a general methodology for enhancing the sensitivity of electrochemical aptamer-based sensors when applied to blood plasma samples. It emphasizes the importance of optimizing the buffer conditions to improve the detection capabilities of these sensors. The research highlights specific strategies for adjusting the ionic strength and pH of the buffer, which are critical for maximizing the interaction between the aptamer and its target analyte.
Key findings suggest that tailored buffer compositions can significantly influence sensor performance, leading to improved signal-to-noise ratios and lower detection limits. The study underscores the necessity of systematic experimentation to identify optimal buffer conditions that facilitate effective binding and signal transduction in complex biological matrices like blood plasma.
Methods
In this section, the authors detail the chemicals and materials utilized in their research. Key reagents include 6-Mercapto-1-hexanol (MCH), Human Thrombin, and Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP), all sourced from Sigma-Aldrich. Additional chemicals such as phosphate-buffered saline (PBS), sulfuric acid, sodium hydroxide, and Recombinant Proteinase K were obtained from Fisher-Scientific. The study also employed bovine albumin and cholesteryl hemisuccinate, with all aqueous solutions prepared using deionized water from a Milli-Q Direct purification system.
Electrochemical components included gold disk electrodes, coiled platinum wire counter electrodes, and silver/silver chloride reference electrodes, procured from various suppliers. For electrode polishing, diamond slurry and cloth pads were used. The biological materials consisted of pooled, deidentified human plasma and serum, alongside pharmaceutical compounds like Emtricitabine and Tobramycin sulfate, which were sourced from Toronto Research Chemicals and Spectrum Chemical Manufacturing Group, respectively. This comprehensive list of materials underscores the rigorous preparation and methodological approach taken in the study.
Results
The results of this study demonstrate that proteins in biological fluids significantly diminish the sensitivity and signal output of electrochemical aptamer-based (E-AB) sensors, specifically when measuring the antiretroviral drug emtricitabine (FTC). The E-AB sensor exhibited an EC50 of 10.4 ± 0.6 µM in phosphate-buffered saline (PBS), which increased to 89 ± 19 µM in serum and 78 ± 16 µM in plasma, indicating a loss of sensitivity. The maximum signal output also decreased from approximately 350% in PBS to 89% in plasma, suggesting that protein interactions, particularly with serum albumin, are responsible for this dampening effect. Further experiments confirmed that the addition of bovine serum albumin (BSA) in PBS reduced the sensor’s response to FTC, corroborating the hypothesis that serum proteins interfere with sensor performance.
To address this issue, the authors developed a protein removal strategy involving thrombin-induced coagulation followed by centrifugation and filtration, which successfully restored the sensor’s sensitivity. This method improved the EC50 back to 11 ± 3 µM in the filtrate, comparable to the values obtained in PBS. The protocol was validated with randomized plasma samples, achieving a 97% agreement with actual FTC concentrations. Additionally, the method was extended to other E-AB sensors, such as those targeting tobramycin and hydroxyquinoline, demonstrating its generalizability. While the approach significantly enhances sensor performance in complex biological matrices, it remains unsuitable for real-time applications due to the required sample processing steps. Future aptamer development should incorporate biofluid-mimicking conditions to enhance compatibility with biological environments.
Discussion
In the discussion section, the methodology for preparing DNA and sensors for electrochemical detection of targets such as FTC, tobramycin, and hydroxyquinoline is detailed. Single-stranded DNA (ssDNA) was reduced and diluted for functionalization of gold electrodes, which were then polished and cleaned electrochemically. The electrodes were either left smooth for FTC or roughened for tobramycin and hydroxyquinoline to enhance performance. Following aptamer incubation, a pretreatment step was implemented to eliminate nonspecific binding, ensuring the reliability of subsequent measurements.
Sample preparation involved creating calibration curves using human plasma, with specific incubation protocols for each target. The electrochemical measurements were conducted using a three-electrode setup, employing square wave voltammetry to assess the concentration of targets based on current changes at designated frequencies. Clinical samples were collected from participants in two studies, with FTC concentrations measured using high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS). Data analysis was performed using a custom Python script for efficient processing of voltammetric data, employing nonlinear regression to fit the results to Hill equations, particularly addressing the unique behavior of the tobramycin and hydroxyquinoline curves in plasma.