DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-024-52691-x
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39333528
تاريخ النشر: 2024-09-27
المؤلف: Yi-Chuan Chen وآخرون
الموضوع الرئيسي: كريسبر والهندسة الوراثية
نظرة عامة
لقد تقدم نظام CRISPR-Cas12a بشكل كبير في اختبار الأحماض النووية (NAT) بسبب قدراته السريعة والدقيقة، على الرغم من أن الطرق التقليدية كانت تتطلب تضخيم RNA مسبق. تقدم هذه الدراسة نظام Cas12a المنقسم الجديد (SCas12a) الذي يجمع بين إنزيم Cas12a و crRNA المنقسم، مما يمكّن من الكشف عن miRNAs و RNAs الطويلة بدون تضخيم و بشكل متعدد. يظهر اختبار SCas12a حساسية وخصوصية عالية، مما يسمح بالتفريق بين miRNA الناضجة وسابقتها (pre-miRNA)، وهو أمر حاسم لتحديد العلامات الحيوية بدقة ومراقبة تقدم السرطان. بالإضافة إلى ذلك، يمكنه الكشف عن طفرات النقاط في DNA و miRNA وكمية علامة miR-21 الحيوية في بلازما مرضى سرطان عنق الرحم، محققًا الكشف بمستوى attomole عن HPV عند دمجه مع تضخيم بوليميراز إعادة التركيب (RPA).
تتناول هذه المنصة الجديدة القائمة على SCas12a قيود طرق تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي التقليدية (qPCR)، التي تستغرق وقتًا طويلاً وتتطلب معدات باهظة الثمن، مما يعيق تطبيقات الاختبار في نقطة الرعاية (POCT). تسلط الدراسة الضوء على مزايا استخدام إنزيمات CRISPR-Cas، وخاصة Cas12a، التي يمكن أن تقطع بشكل عشوائي DNA أحادي السلسلة غير المحدد بعد التعرف على الهدف. على عكس أنظمة CRISPR الأخرى، يسهل SCas12a الكشف المباشر عن miRNA دون الحاجة إلى النسخ العكسي، متجاوزًا التحديات المرتبطة بـ RNAs السابقة الأطول وتقليل خطر التلوث. بشكل عام، يمثل نظام SCas12a حلاً بسيطًا وفعالًا من حيث التكلفة لتطبيقات التشخيص المتنوعة في الصحة العامة، وتشخيص الأمراض، ورصد البيئة.
طرق
في هذا القسم، يوضح المؤلفون المواد المستخدمة في أبحاثهم، مع التركيز على المصادر وأنواع الكواشف والمواد البيولوجية. تم الحصول على كواشف الفلورسنت DNA و RNA، بما في ذلك DNA أحادي السلسلة المسمى بـ FAM و RNA، من Sangong Biotech، بينما تم الحصول على المواد الكيميائية العامة لتحضير العازلات من Sinopharm. تم الحصول على الكواشف الرئيسية مثل بروتيناز K، وعازلة NEB 2.1، وعازلة Cutsmart من New England Biolabs. لاستخراج RNA، تم استخدام مجموعة miRCURY LNA RT من Qiagen ومجموعة RNAprep Pure Blood من TIANGEN. تم الحصول على خط خلايا MCF-7، وهو خط خلايا سرطان الثدي المستخدم على نطاق واسع، من Pricella. تم تحضير جميع أوليغونوكليوتيدات DNA و RNA في ماء معالج بـ DEPC وتم تخزينها عند -20 درجة مئوية للتجارب المستقبلية، لضمان سلامة العينات.
النتائج
تظهر نتائج هذه الدراسة التطوير الناجح لنظام Cas12a المنقسم (SCas12a) لتطبيقات التشخيص. تم تشكيل بروتين ريبونوكليوبروتين (RNP) SCas12a عن طريق خلط بروتين Cas12a المنقى من Acidaminococcus sp. مع RNAs السقالة والفراغ بنسب محددة. أظهر النظام أنشطة قطع cis و trans بنسبة تقارب 100% عند اختباره مع بلازميدات dsDNA المستهدفة التي تحتوي على تسلسلات HPV16، مما يؤكد وظيفته. من الجدير بالذكر أن اختبار الفلورسنت الذي تم تطويره للكشف المباشر عن أهداف miRNA أظهر فلوريسنس “تشغيل” قوي فقط في وجود جميع المكونات الثلاثة (Cas12a، RNA السقالة، و RNA الفراغ)، مما يشير إلى أن كل منها ضروري للتفعيل الكامل للنظام.
كشفت التحقيقات الإضافية أن الركائز غير المستهدفة dsDNA ذات التسلسلات غير المتطابقة لم تحفز نشاط القطع العابر، مما يبرز خصوصية الاختبار. تم تفعيل نظام SCas12a بشكل فعال بواسطة كل من الأهداف dsDNA و ssDNA، حيث أظهر ssDNA كفاءة تفعيل متفوقة. أشارت الاختبارات الحركية إلى أن التفاعلات اكتملت في غضون 10 دقائق، بغض النظر عن تسلسل RNA الفراغ، مما يشير إلى أن طريقة الكشف القائمة على SCas12a لديها القدرة على العمل كمنصة اختبار للأحماض النووية (NAT) عالمية. تمهد هذه النتائج الطريق لتطبيقات مستقبلية لنظام SCas12a في البيئات التشخيصية.
المناقشة
تناقش البحث تطوير اختبار جديد قائم على SCas12a للكشف عن microRNAs (miRNAs) بدون تضخيم، خاصة في سياق تشخيص السرطان. يستخدم الاختبار استراتيجية “تفعيل عكسي”، حيث تقوم RNAs السقالة و DNA أحادي السلسلة (ssDNA) المحفزات المتكاملة مع miRNA المستهدف بتنشيط نشاط القطع العابر لـ Cas12a. تتيح هذه الطريقة الكشف المباشر عن miRNAs، مثل miR-21، miR-31، miR-17، و miR-let-7a، مع حدود الكشف (LoD) تتراوح من 21 fM إلى 294 fM، مما يظهر قوة الاختبار وحساسيته. من الجدير بالذكر أن نظام SCas12a تفوق على نظائر Cas12a البديلة في الحساسية والخصوصية، محققًا LoD قدره 10 fM في اختبارات التدفق الجانبي، وهو ما يُعزى إلى زيادة التركيزات المحلية لمكونات الاختبار.
تم التحقق من خصوصية الاختبار من خلال اختبارات مقارنة مع miRNAs غير المستهدفة، مما يؤكد قدرته على التمييز بين miRNAs الناضجة والسابقة، وهو أمر حاسم للتشخيص الجزيئي الدقيق. علاوة على ذلك، تم تطبيق اختبار SCas12a بنجاح على عينات سريرية، كاشفًا عن مستويات مرتفعة بشكل ملحوظ من miR-21 في مرضى سرطان عنق الرحم مقارنة بالضوابط الصحية، مع نتائج تتوافق بشكل جيد مع نتائج RT-qPCR. بشكل عام، يقدم اختبار SCas12a أداة واعدة للكشف المتعدد عن miRNA ويحتمل أن يعزز تطبيقات خزعة السائل في تشخيص السرطان وتوقعه، بينما يعالج أيضًا القيود المرتبطة بالهياكل الثانوية في أهداف RNA.
DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-024-52691-x
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39333528
Publication Date: 2024-09-27
Author(s): Yi-Chuan Chen et al.
Primary Topic: CRISPR and Genetic Engineering
Overview
The CRISPR-Cas12a system has significantly advanced nucleic acid testing (NAT) due to its rapid and precise capabilities, although traditional methods required RNA preamplification. This study introduces a novel split Cas12a system (SCas12a) that combines a Cas12a enzyme with a split crRNA, enabling amplification-free and multiplexed detection of miRNAs and long RNAs. The SCas12a assay demonstrates high sensitivity and specificity, allowing for the differentiation between mature miRNA and its precursor (pre-miRNA), which is crucial for accurate biomarker identification and monitoring cancer progression. Additionally, it can detect DNA and miRNA point mutations and quantify the miR-21 biomarker in plasma from cervical cancer patients, achieving attomole-level detection of HPV when combined with recombinase polymerase amplification (RPA).
This innovative SCas12a-based NAT platform addresses the limitations of traditional quantitative polymerase chain reaction (qPCR) methods, which are time-consuming and require expensive equipment, thus hindering point-of-care testing (POCT) applications. The study highlights the advantages of using CRISPR-Cas enzymes, particularly Cas12a, which can indiscriminately cleave non-specific single-stranded DNA after target recognition. Unlike other CRISPR systems, SCas12a facilitates direct detection of miRNA without the need for reverse transcription, overcoming challenges associated with longer precursor RNAs and reducing the risk of contamination. Overall, the SCas12a system represents a simple, cost-effective solution for diverse diagnostic applications in public health, disease diagnostics, and environmental monitoring.
Methods
In this section, the authors detail the materials utilized in their research, emphasizing the sources and types of reagents and biological materials. The DNA and RNA fluorescence reporters, including FAM-labeled single-stranded DNA and RNA, were procured from Sangong Biotech, while general chemicals for buffer preparation were sourced from Sinopharm. Key reagents such as proteinase K, NEB buffer 2.1, and Cutsmart buffer were obtained from New England Biolabs. For RNA extraction, the miRCURY LNA RT Kit from Qiagen and the RNAprep Pure Blood Kit from TIANGEN were employed. The MCF-7 cell line, a widely used breast cancer cell line, was acquired from Pricella. All DNA oligonucleotides and RNA were prepared in DEPC-treated water and stored at -20°C for future experiments, ensuring the integrity of the samples.
Results
The results of this study demonstrate the successful development of a split Cas12a (SCas12a) system for diagnostic applications. The SCas12a ribonucleoprotein (RNP) was formed by mixing purified Acidaminococcus sp. Cas12a protein with scaffold and spacer RNAs in a specific ratio. The system exhibited nearly 100% cis- and trans-cleavage activities when tested with targeted dsDNA plasmids containing HPV16 sequences, confirming its functionality. Notably, the fluorescence assay developed for direct detection of miRNA targets showed strong “turn-on” fluorescence only in the presence of all three components (Cas12a, scaffold RNA, and spacer RNA), indicating that each is essential for the complete activation of the system.
Further investigations revealed that non-target dsDNA substrates with mismatched sequences did not trigger trans-cleavage activity, underscoring the assay’s specificity. The SCas12a system was effectively activated by both dsDNA and ssDNA targets, with ssDNA demonstrating superior activation efficiency. Kinetic assays indicated that reactions were completed within 10 minutes, regardless of the spacer RNA sequence, suggesting that the SCas12a-based detection method has the potential to serve as a universal nucleic acid testing (NAT) platform. These findings pave the way for future applications of the SCas12a system in diagnostic settings.
Discussion
The research discusses the development of a novel SCas12a-based assay for the amplification-free detection of microRNAs (miRNAs), particularly in the context of cancer diagnostics. The assay utilizes a “reverse activation” strategy, where scaffold RNA and single-stranded DNA (ssDNA) activators complementary to the target miRNA activate the trans-cleavage activity of Cas12a. This method enables direct detection of miRNAs, such as miR-21, miR-31, miR-17, and miR-let-7a, with limits of detection (LoD) ranging from 21 fM to 294 fM, demonstrating the assay’s robustness and sensitivity. Notably, the SCas12a system outperformed alternative Cas12a orthologs in sensitivity and specificity, achieving a LoD of 10 fM in lateral flow assays, attributed to the increased local concentrations of assay components.
The assay’s specificity was validated through comparative tests with non-target miRNAs, confirming its ability to distinguish between mature and precursor miRNAs, which is critical for accurate molecular diagnostics. Furthermore, the SCas12a assay was successfully applied to clinical samples, revealing significantly elevated levels of miR-21 in cervical cancer patients compared to healthy controls, with results correlating well with RT-qPCR findings. Overall, the SCas12a assay presents a promising tool for multiplexed miRNA detection and holds potential for enhancing liquid biopsy applications in cancer diagnosis and prognosis, while also addressing limitations associated with secondary structures in RNA targets.